ES2633111T3 - Métodos y materiales para detectar neoplasia colorrectal - Google Patents

Abstract

Un método para detectar la presencia de una neoplasia colorrectal en un mamífero, comprendiendo dicho método: a) detectar la presencia de marcadores epiteliales exfoliados en una muestra de heces obtenida de dicho mamífero, en donde dichos marcadores epiteliales exfoliados específicos para una neoplasia colorrectal comprenden marcadores de ácidos nucleicos específicos de neoplasia colorrectal que comprenden un gen que tiene una mutación puntual y genes que tienen metilación aberrante; y b) detectar la presencia de un marcador de sangre oculta fecal en dicha muestra de heces; c) identificar dicho mamífero que tiene una neoplasia colorrectal cuando se detecta la presencia de ambos marcadores epiteliales exfoliados en dicha muestra de heces y el marcador de sangre oculta fecal en dicha muestra de heces.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y materiales para detectar neoplasia colorrectal Referencia cruzada a la solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica prioridad a la Solicitud de Patente Provisional pendiente de EEUU No. 61/318077, presentada el 26 de marzo de 2010.

Campo de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo relacionado con la deteccion de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal en la muestra de heces de un sujeto. En particular, la presente invencion proporciona un metodo para identificar mairnferos que tienen una neoplasia colorrectal detectando la presencia de marcadores epiteliales exfoliados (p. ej., ADN humano, alteraciones de genes asociadas a tumores, protemas asociadas a tumores) y marcadores de sangre (p. ej., homoglobina, protemas del suero) en una muestra de heces obtenida del mai^ero.

Antecedentes de la invencion

El cancer colorrectal permanece como causa principal de muerte entre los tipos de cancer (vease, p. ej., Jemal A, et al., CA Cancer J Clin. 2007, 57:43-66; incorporado en la presente memoria por referencia en su totalidad). Aunque el cribado reduce la mortalidad por cancer colorrectal (vease, p. ej., Mandel JS, et al., N Engl J Med. 1993, 328:136571; Hardcastle JD, et al., Lancet. 1996, 348:1472-7; Kronborg O, et al., Scand J Gastroenterol. 2004, 39: 846-51; Winawer SJ, et al., J Natl Cancer Inst. 1993, 85:1311-8; Singh H, et al., JAMA. 2006, 295:2366-73), las reducciones observadas han sido leves (vease, p. ej., Singh H, et al., JAMA. 2006;295, 2366-73; Heresbach D, et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 2006, 18:427-33) y mas de la mitad de los adultos en Estados Unidos no han recibido cribado (vease, p. ej., Meissner HI, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006, 15:389-94). Se necesitan herramientas mas precisas, faciles de usar y ampliamente distribuibles para mejorar la eficacia, la aceptabilidad y el acceso al cribado.

Compendio

El ADN largo fecal se origina o de la exfoliacion de celulas displasicas o de la hemorragia luminal o la exudacion de leucocitos. Informes anteriores han supuesto que el ADN largo y la sangre oculta en heces eran el resultado del desangrado, y como tal, supusieron que los ensayos de ADN largo fecal podnan ser una alternativa de ensayo de sangre oculta fecal (vease, p. ej., Kok JB, Clin Chem. 2003; 49:2112-2113). Sin embargo, los experimentos llevados a cabo durante la preparacion de las realizaciones para la presente invencion demostraron que el ADN largo era un marcador medible continuamente en heces y que la sangre oculta era detectable solo intermitentemente (vease, p. ej., Osborn NK, et al., Gastroenterology 2005; 128:192-206, Ahlquist DA, Cancer 1989; 63:1826-1830) indicando asf que el ADN largo y la sangre oculta eran de diferentes fuentes y, como tales, eran marcadores complementarios para la deteccion de CRC. Los experimentos demostraron ademas que el ADN largo y la sangre oculta en heces proporcionan un enfoque sensible para la deteccion del cancer colorrectal.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona un metodo para detectar la presencia de una neoplasia colorrectal en un mamffero. El metodo implica detectar la presencia o ausencia de marcadores epiteliales exfoliados espedficos para una neoplasia colorrectal en una muestra de heces obtenida de un mamffero y detectar la presencia o ausencia de uno o mas marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., espedfico para una neoplasia colorrectal) en la muestra de heces. La deteccion de la presencia de marcadores epiteliales exfoliados en la muestra de heces en combinacion con la presencia de uno o mas marcadores de sangre oculta fecal en la muestra de heces es indicativa de una neoplasia colorrectal en el mam^era.

En algunas realizaciones, el mamffero es un ser humano. En algunas realizaciones, la neoplasia colorrectal es premaligna. En algunas realizaciones, la neoplasia colorrectal es maligna.

Los marcadores de acidos nucleicos espedficos de neoplasia colorrectal incluyen un gen que tiene una mutacion puntual y un gen que tiene metilacion anormal.

En algunas realizaciones, un gen que tiene una mutacion puntual incluye a K-ras. En algunas realizaciones, un gen que tiene metilacion anormal incluye a bmp-3 y NDRG4.

El metodo no se limita a marcadores particulares de sangre oculta fecal espedficos para una neoplasia colorrectal. En algunas realizaciones, los marcadores de sangre oculta fecal espedficos para una neoplasia colorrectal incluyen hemoglobina.

La presente solicitud describe kits para detectar la presencia de una neoplasia colorrectal en un mamffero. Dichos kits pueden incluir reactivos utiles, suficientes o necesarios para detectar y/o caracterizar uno o mas marcadores epiteliales exfoliados espedficos para una neoplasia colorrectal y reactivos utiles, suficientes o necesarios para detectar y/o caracterizar uno o mas marcadores de sangre oculta fecal espedficos para una neoplasia colorrectal. Los kits pueden contener los reactivos necesarios para realizar en tiempo real la Alu PCR. Los kits pueden contener los reactivos necesarios para realizar el ensayo de hemoporfirina HemoQuant. Los kits pueden contener los

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ingredientes y reactivos necesarios para obtener y almacenar una muestra de heces de un sujeto.

La presente solicitud describe metodos para la monitorizacion del tratamiento del cancer colorrectal. Por ejemplo, los metodos se pueden realizar inmediatamente antes, durante y/o despues de un tratamiento para monitorizar el exito del tratamiento. Los metodos se pueden realizar a intervalos en pacientes libres de enfermedad para asegurar o monitorizar el exito del tratamiento.

La presente solicitud describe metodos para obtener el perfil de riesgo de un sujeto para desarrollar cancer colorrectal. Tales metodos pueden implicar obtener una muestra de heces de un sujeto (p. ej., un ser humano en riesgo para desarrollar cancer colorrectal, un ser humano sometido a un examen ffsico de rutina), para detectar la presencia o ausencia de uno o mas marcadores epiteliales exfoliados espedficos para una neoplasia colorrectal en o asociado con la muestra de heces, detectar la presencia o ausencia de uno o mas marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., espedficos para una neoplasia colorrectal) en o asociados con la muestra de heces y generar un perfil de riesgo para desarrollar cancer colorrectal basado en la presencia o ausencia detectada de marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal. Por ejemplo, un perfil de riesgo generado puede cambiar dependiendo de los marcadores epiteliales exfoliados espedficos y los marcadores de sangre oculta fecal detectados como presentes o ausentes. El metodo no se limita a una manera particular de generar el perfil de riesgo. Se puede utilizar un procesador (p. ej., un ordenador) para generar tal perfil de riesgo. El procesador utiliza un algoritmo espedfico (p. ej., un software) para interpretar la presencia y ausencia de marcadores epiteliales exfoliados espedficos y marcadores de sangre oculta fecal como se determina con el metodo de la presente invencion. La presencia y ausencia de marcadores epiteliales exfoliados espedficos y marcadores de sangre oculta fecal como se determina con el metodo de la presente invencion se puede introducir en tal algoritmo y el perfil de riesgo se refiere basado en una comparacion de dicha entrada con normas establecidas (p. ej., norma establecida para la afeccion precancerosa, norma establecida para diversos niveles de riesgo para desarrollar cancer colorrectal, norma establecida para sujetos diagnosticados con diversos estadios de cancer colorrectal). El perfil de riesgo puede indicar el riesgo de un sujeto para desarrollar cancer colorrectal o el riesgo de un sujeto para volver a desarrollar cancer colorrectal. El perfil de riesgo puede indicar que un sujeto tiene, por ejemplo, una probabilidad muy baja, baja, moderada, alta y muy alta de desarrollar o volver a desarrollar cancer colorrectal. El perfil de riesgo puede indicar el riesgo basado en una poblacion media a un nivel deseado de especificidad (p. ej., 90%). Un proveedor de servicios medicos (p. ej., un oncologo) puede utilizar dicho perfil de riesgo para determinar un plan de tratamiento o intervencion (p. ej., colonoscopia, esperar a ver que pasa, derivar a un oncologo, derivar a un cirujano, etc.).

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra los niveles de ADN largo y sangre oculta en heces de pacientes con CRC o adenomas avanzados y de individuos normales representados en escala logantmica. Cada drculo representa una muestra de heces.

La Figura 2 muestra la correlacion del ADN largo con los niveles de sangre oculta en las muestras de heces que se representan en un grafico de diagrama de dispersion. Se dibuja una tendencia negra para mostrar que el ADN largo fecal no esta correlacionado con niveles de sangre oculta (R2= 0,0001). Ya que el cero no se puede trazar en escala logantmica, se representa aqu el nivel de ADN largo mas 1 y el nivel de sangre oculta mas 0,1.

La Figura 3 muestra las curvas operativas del receptor para el ADN largo en heces y los niveles de sangre oculta en pacientes con cancer colorrectal o adenomas avanzados frente a controles normales. Para los canceres frente a los controles normales, los valores de AUC fueron 0,82, 0,78 y 0,90 para el ADN largo fecal, la sangre oculta y el ensayo de combinacion, respectivamente; para los adenomas avanzados frente a los controles normales, los valores de AUC fueron 0,72, 0,50 y 0,72 para el ADN fecal, la sangre oculta y el ensayo de combinacion, respectivamente. A, B y C representan las curvas operativas del receptor para el ADN largo fecal, la sangre oculta y el ensayo de combinacion, respectivamente.

Definiciones

Para facilitar la comprension de la presente invencion, se definen a continuacion un numero de terminos y frases

Como se emplea en esta memoria, el termino “cancer colorrectal” se quiere decir que incluye la definicion medica bien aceptada que define el cancer colorrectal como un estado de salud caracterizado por cancer de las celulas del tracto intestinal por debajo del intestino delgado (p. ej., el intestino grueso (colon), que incluye el ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, y colon sigmoide y recto). Ademas, como se emplea en esta memoria, el termino “cancer colorrectal” se quiere decir que incluye ademas estados de salud que se caracterizan por cancer de las celulas del duodeno y del intestino delgado (yeyuno e Aeon).

Como se emplea en esta memoria, el termino "metastasis" se quiere decir que se refiere al procedimiento en el que las celulas cancerosas originarias de un organo o parte del cuerpo se trasladan a otra parte del cuerpo y continuan replicandose. Las celulas metastatizadas forman posteriormente tumores que pueden metastatizar mas. Por lo tanto, la metastasis se refiere a la extension del cancer desde la parte del cuerpo donde aparecen originalmente a otras partes del cuerpo. Como se emplea en esta memoria, el termino "celulas de cancer colorrectal metastatizadas" se quiere decir que se refiere a celulas de cancer colorrectal que han metastatizado; celulas de cancer colorrectal

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localizadas en una parte del cuerpo aparte del duodeno, intestino delgado (yeyuno e Aeon), intestino grueso (colon), que incluye el ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, y colon sigmoide y recto.

Como se emplea en esta memoria, "se sospecha que un individuo es susceptible al cancer colorrectal metastatizado" se quiere decir que se refiere a un individuo que esta en un riesgo por encima de la media de desarrollar cancer colorrectal metastatizado. Ejemplos de individuos con un riesgo particular de desarrollar cancer colorrectal metastatizado son aquellos cuyos antecedentes familiares indican una incidencia por encima de la media de cancer colorrectal entre los miembros de la familia y/o aquellos que ya han desarrollado cancer colorrectal y han sido tratados eficazmente y que por lo tanto afrontan un riesgo de recafda y recurrencia. Otros factores que pueden contribuir a un riesgo por encima de la media de desarrollar cancer colorrectal metastatizado que conducina de este modo a la clasificacion de un individuo como sospechoso de ser susceptible al cancer colorrectal metastatizado, se pueden basar en unos antecedentes y caractensticas geneticas, medicas y/o de comportamiento espedficos de un individuo.

El termino "neoplasia" como se emplea en esta memoria se refiere a cualquier crecimiento nuevo y anormal de tejido. Asf, una neoplasia puede ser una neoplasia premaligna o una neoplasia maligna. El termino “marcador especifico de neoplasia” se refiere a cualquier material biologico que se pueda utilizar para indicar la presencia de una neoplasia. Ejemplos de materiales biologicos incluyen, sin limitacion, acidos nucleicos, polipeptidos, carbohidratos, acidos grasos, componentes celulares (p. ej., membranas celulares y mitocondrias) y celulas enteras. El termino "marcador espedfico de neoplasia colorrectal" se refiere a cualquier material biologico que se pueda utilizar para indicar la presencia de una neoplasia colorrectal (p. ej., una neoplasia colorrectal premaligna, una neoplasia colorrectal maligna). Ejemplos de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal incluyen, pero no se limitan a, marcadores epiteliales exfoliados (p. ej., bmp-3, bmp-4, SFRP2, vimentina, septin9, ALX4, EYA4, TFPI2, NDRG4, FOXE1, DNA largo, BAT-26, K-ras, ApC, gen del antfgeno del melanoma, p53, BRAF y PIK3CA) y marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., hemoglobina, alfa-defensina, calprotectina, a1-antitripsina, albumina, MCM2, transferrina, lactoferrina y lisozima) .

Como se emplea en esta memoria, el termino "adenoma" se refiere a un tumor benigno de origen glandular. Aunque estos crecimientos son benignos, con el tiempo pueden avanzar hasta convertirse en malignos. Como se emplea en esta memoria, el termino “adenoma colorrectal” se refiere a un tumor colorrectal benigno en el que las celulas forman estructuras glandulares reconocibles o en las que las celulas se derivan claramente del epitelio glandular.

Como se emplea en esta memoria, el termino "amplicon" se refiere a un acido nucleico generado utilizando pares de cebadores. El amplicon es tfpicamente ADN de una sola cadena (p. ej., el resultado de la amplificacion asimetrica), sin embargo, puede ser ARN o ADNbc.

El termino “que amplifica” o “amplificacion” en el contexto de acidos nucleicos se refiere a la produccion de copias multiples de un polinucleotido, o una parte del polinucleotido, tfpicamente partiendo de una pequena cantidad de polinucleotido (p.ej, una sola molecula de polinucleotido), donde los productos de amplificacion o amplicones son generalmente detectables. La amplificacion de polinucleotidos abarca una variedad de procedimientos qrnmicos y enzimaticos. La generacion de multiples copias de ADN a partir de una o pocas copias de una molecula de ADN objetivo o molde durante una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, en ingles polymerase chain reaction) o una reaccion en cadena de la ligasa (LCR, en ingles a ligase chain reaction; vease, p. ej., la patente de EE.UU. No. 5,494,810) son formas de amplificacion. Tipos adicionales de amplificacion incluyen, pero no se limitan a, PCR espedfica de alelo (vease, p. ej., la patente de EE.UU. No. 5,639,611), PCR de ensamblaje (vease, p. ej., la patente de EE.UU. No. 5,965,408), amplificacion dependiente de helicasa (vease, p. ej., la patente de EE.UU. No. 7,662,594), PCR de inicio en caliente (vease, p. ej., las patentes de EE.UU. Nos. 5,773,258 y 5,338,671), PCR especifica de intersecuencia, PCR inversa (vease, p. ej., Triglia, et al. (1988) Nucleic Acids Res., 16: 8186), PCR mediada por ligacion (vease, p. ej., Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997); patente de EE.UU. No. 5,508,169), PCR espedfica de metilacion (vease, p. ej., Herman, et al., (1996) PNAS 93(13) 98219826), PCR Minicebador, amplificacion de sondas dependientes de ligandos multiples (vease, p. ej., Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57), PCR multiple (vease, p. ej., Chamberlain et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156; Ballabio, et al., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden, et al., (2008) BMC Genetics 9:80), PCR anidada, PCR de superposicion-extension (vease, p. ej., Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7376), PCR en tiempo real (vease, p. ej., Higuchi et al., (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi, et al., (1993) Biotechnology 11:1026-1030), PCR de transcripcion inversa (vease, p. ej., Bustin, S.A. (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193), PCR en fase solida, PCR termal de entrelazado asimetrico y PCR con rampa decreciente de temperaturas (vease, p. ej., Don, et al., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker et al., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485). La amplificacion de polinucleotidos tambien se puede lograr utilizando la PCR digital (vease, p. ej., Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein y Kinzler, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 96; 9236-41, (1999); publicacion de la patente internacional No. WO05023091A2; publicacion de la solicitud de la patente de EE.UU. No. 20070202525).

Como se emplea en esta memoria, los terminos “complementario” o “complementariedad” se utilizan en referencia a polinucleotidos (es decir, una secuencia de nucleotidos) relacionados con las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "5'-A-G-T-3',"es complementaria a la secuencia "3'-T-C-A-5'."La complementariedad

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puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los acidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O, puede ser complementariedad "completa" o "total" entre los acidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de acido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficacia y la resistencia de la hibridacion entre cadenas de acido nucleico. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificacion, asf como en los metodos de deteccion que dependen de la union entre acidos nucleicos.

Como se emplea en esta memoria, el termino "cebador" se refiere a un oligonucleotido, ya sea de origen natural como en una digestion de restriccion purificada o producido sinteticamente, que es capaz de actuar como punto de inicio de la smtesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la smtesis de un producto de extension del cebador que es complementario a una cadena de acido nucleico (p.ej., en presencia de nucleotidos y un agente inductor tal como un biocatalizador (p.ej., una ADN polimerasa o similar) y a una temperatura y pH adecuados). El cebador es tfpicamente de una sola cadena para una maxima eficiencia en la amplificacion, pero puede ser alternativamente de doble cadena. Si es de doble cadena, el cebador generalmente se trata primero para separar sus cadenas antes de ser utilizado para preparar los productos de extension. En algunas realizaciones, el cebador es un oligodesoxirribonucleotido. El cebador es suficientemente largo para cebar la smtesis de productos de extension en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependeran de muchos factores, que incluyen temperatura, fuente de cebador y el uso del metodo. En ciertas realizaciones, el cebador es un cebador de captura.

Como se emplea en esta memoria, el termino "molecula de acido nucleico" se refiere a cualquier molecula que contiene acido nucleico, que incluye pero no se limita a, ADN o ARN. El termino abarca secuencias que incluyen cualquiera de los analogos de base conocidos de ADN y ARN que incluyen, pero no se limitan a, 4 acetilcitosina, 8- hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5- bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6- isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2- metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5- metoxiuracilo, 2-metiltio-N-isopenteniladenina, ester metflico del acido uracil-5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo , 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metilico del acido N-uracil-5-oxiacetico, acido uracil 5-oxiacetico, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6- diaminopurina.

Como se emplea en esta memoria, el termino "nucleobase" es sinonimo de otros terminos en uso en la tecnica que incluyen "nucleotido", "desoxinucleotido", "residuo de nucleotido", "residuo de desoxinucleotido", "nucleotido trifosfato (NTP)" o desoxinucleotido trifosfato dNTP).

Un "oligonucleotido" se refiere a un acido nucleico que incluye al menos dos unidades de monomero de acido nucleico (p.ej, nucleotidos), tfpicamente mas de tres unidades de monomero, y mas tfpicamente mayor que diez unidades de monomero. El tamano exacto de un oligonucleotido depende generalmente de diversos factores, que incluyen la funcion o uso final del oligonucleotido. Ademas para ilustrar, los oligonucleotidos tienen tfpicamente menos de 200 residuos largos (p. ej., entre 15 y 100), sin embargo, como se emplea en esta memoria, el termino tambien pretende abarcar cadenas de polinucleotidos mas largas. Los oligonucleotidos a menudo se denominan por su longitud. Por ejemplo, un oligonucleotido de 24 residuos se denomina "24-mer". Tfpicamente, los monomeros nucleosidos estan unidos por enlaces fosfodiester o sus analogos, que incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenato, fosforodiselenato, fosforoaniltioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares, que incluyen contraiones asociados, p. ej., H+, NH4+, Na+, y similares, si tales contraiones estan presentes. Ademas, los oligonucleotidos son tfpicamente de una sola cadena. Los oligonucleotidos se preparan opcionalmente por cualquier metodo adecuado, que incluye, pero no se limita a, el aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicacion o amplificacion del ADN, la transcripcion inversa, la clonacion y la digestion de restriccion de secuencias apropiadas, o la smtesis qrnmica directa mediante un metodo tal como el metodo del fosfotriester de Narang et al. (1979) Meth Enzymol. 68:90-99; el metodo del fosfodiester de Brown et al. (1979) Meth Enzymol. 68:109-151; el metodo de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; el metodo del triester de Matteucci et al. (1981) J Am Chem Soc. 103:3185-3191; metodos de smtesis automatizados; o el metodo de soporte solido de la patente de EE.UU. No. 4,458,066, titulada "PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES", expedida el 3 de julio de 1984 a Caruthers et al., u otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica.

Una "secuencia" de un biopolfmero se refiere al orden y la identidad de unidades monomericas (p. ej., nucleotidos, etc.) en el biopolfmero. La secuencia (p. ej., la secuencia de bases) de un acido nucleico se lee tfpicamente en la direccion 5 'a 3'.

Descripcion detallada de la invencion

Una manera eficaz de detectar el cancer colorrectal (CRC, del ingles colorectal cancer) en los primeros estadios es el cribado de la poblacion. La colonoscopia y los ensayos de sangre oculta fecal (FOBT, del ingles fecal occult blood testing) son herramientas comunmente utilizadas para el cribado de CRC, pero las tasas adherentes de ambos enfoques son bajas debido a la invasividad y el coste de la colonoscopia y la baja sensibilidad de FOBT (vease, p.

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ej., Osborn NK, et al., Gastroenterology 2005; 128:192-206; Levin B, et al., CA Cancer J Clin 2008; 58:130-160). Por ejemplo, el ADN largo fecal cuantificado en tiempo real con Alu PCR es un enfoque simple para la deteccion de CRC, pero su sensibilidad es menos optima cuando se ensaya solo (vease, p. ej., Zou H, et al., Cancer Epidemiol Biomarcadores Prev 2006; 15:1115-1119).

El ADN largo fecal se origina o de la exfoliacion de celulas displasicas o de la hemorragia luminal o la exudacion de leucocitos. Informes anteriores han supuesto que el ADN largo y la sangre oculta en heces resultaron de la perdida de sangre, y como tal, supusieron que los ensayos de ADN largo fecal podnan ser una alternativa de ensayo de sangre oculta fecal (vease, p. ej., Kok JB, Clin Chem. 2003; 49:2112-2111). Sin embargo, los experimentos llevados a cabo durante la preparacion de las realizaciones para la presente invencion demostraron que el ADN largo era un marcador medible continuamente en heces y la sangre oculta era detectable solo intermitentemente (vease, p. ej., Osborn NK, et al., Gastroenterology 2005; 128:192-206, Ahlquist DA, Cancer 1989; 63:1826-1830) indicando asf que el ADN largo y la sangre oculta eran de diferentes fuentes y, como tales, eran marcadores complementarios para la deteccion de CRC. Los experimentos demostraron ademas que el ADN largo y la sangre oculta en heces proporcionan un enfoque sensible para la deteccion del cancer colorrectal.

Idealmente, los enfoques para el cribado del cancer colorrectal deben ser precisos, faciles de usar y economicos. Tanto el ADN largo fecal como las pruebas de sangre oculta son enfoques no invasivos simples, pero sus sensibilidades para la deteccion de CRC son menos optimas cuando se ensayan solos (vease, p. ej., Zou H, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15:1115-1119; Mandel JS, et al., N Engl J Med 1993; 328:1365-1371; Kronborg O, et al., Lancet 1996; 348:1467-1471; Hardcastle JD, et al., Lancet 1996; 348:1472-1477; Ahlquist DA, et al., JAMA 1993; 269:1262-1267; Imperiale TF, et al., N Engl J Med 2004; 351:2704-2714; Ahlquist DA, Ann Intern Med 2008; 149: 441-450; Ahlquist DA, Gastroenterology 2000; 119:1219-1227). Zou et al. (2009), Gastroentology 136: A-625, describen un estudio que apunta a cuantificar y correlacionar el ADN humano y la hemoglobina en muestras de heces de pacientes con cancer colorrectal y considerar un simple ensayo de heces para el cribado del cancer. Zou et al. (2009), Gastroentology 136:459-470, describen un ensayo de la curva de fusion digital (DMC, del ingles digital melt curve) para cuantificar mutaciones de baja abundancia en muestras de heces para detectar cancer colorrectal. Como experimentos llevados a cabo durante la preparacion de las realizaciones para la presente invencion demostraron que el ADN largo basado en heces y la sangre oculta fecal son marcadores complementarios procedentes de diferentes fuentes, la presente invencion, en algunas realizaciones, proporciona un ensayo cuantitativo que combina marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., la hemoglobina), produciendo un enfoque economico para la deteccion sensible de CRC.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona un metodo relacionado con la deteccion de marcadores espedficos de cancer colorrectal en la muestra de heces de un sujeto. En particular, la presente invencion proporciona un metodo para identificar mairnferos que tienen un cancer colorrectal detectando la presencia de marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., hemoglobina) en una muestra de heces obtenida del mamffero.

Un marcador, como se emplea en esta memoria, incluye, por ejemplo, cualquier molecula protemica (o gen correspondiente) cuya produccion o falta de produccion es caractenstica de una celula de cancer colorrectal. El analisis estadfstico variara dependiendo del conjunto particular de marcadores empleados en un analisis dado. Por ejemplo, cuando una combinacion particular de marcadores es altamente espedfica para el cancer colorrectal, la significacion estadfstica de un resultado positivo sera alta. Sin embargo, puede ser que dicha especificidad se logre a costa de la sensibilidad (p. ej., puede aparecer un resultado negativo incluso en presencia de cancer colorrectal). Por la misma razon, una combinacion diferente puede ser muy sensible (p. ej., pocos falsos negativos, pero tiene una especificidad inferior).

Se pueden utilizar combinaciones particulares de marcadores que muestren una funcion optima con diferentes grupos etnicos o sexo, diferentes distribuciones geograficas, diferentes estadios de la enfermedad, diferentes grados de especificidad o diferentes grados de sensibilidad. Se pueden desarrollar tambien combinaciones particulares que son particularmente sensibles al efecto de los regfmenes terapeuticos sobre la progresion de la enfermedad. Los sujetos pueden ser monitoreados despues de una terapia y/o curso de accion para determinar la efectividad de esa terapia y/o curso de accion espedficos.

Como se observa, los experimentos llevados a cabo durante el curso del desarrollo de las realizaciones para la presente invencion determinaron un metodo y sistema mejorados para detectar cancer colorrectal a traves de la deteccion y evaluacion tanto de la presencia como de la ausencia de marcadores epiteliales exfoliados (p. ej., ADN humano, alteraciones geneticas asociadas a tumores, protemas asociadas a tumores) y marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., hemoglobina) en una muestra de heces obtenida del mam^era.

Los marcadores epiteliales exfoliados espedficos para detectar cancer colorrectal incluyen acido nucleico. Los marcadores de acidos nucleicos espedficos del cancer colorrectal son acidos nucleicos que tienen una mutacion puntual, acidos nucleicos que tienen una metilacion anormal.

El acido nucleico que tiene una mutacion puntual puede codificar un polipeptido o regular la expresion de un polipeptido (p. ej., promotores, potenciadores y silenciadores). Ejemplos de acidos nucleicos que pueden contener

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una mutacion puntual indicativa de un cancer colorrectal incluyen a K-ras.

El acido nucleico que tiene metilacion anormal se puede utilizar para indicar la presencia de cancer colorrectal (vease, p. ej., Muller et al., Lancet 2004 363:1283-1285). Ejemplos de acidos nucleicos que tienen metilacion anormal indicativa de cancer colorrectal incluyen a bmp-3 y NDRG4.

La presente invencion no se limita a detectar marcadores particulares de sangre oculta fecal espedficos para cancer colorrectal. En unas realizaciones, los marcadores de sangre oculta fecal espedficos para detectar neoplasia colorrectal incluyen hemoglobina.

Cualquier metodo de ensayo de sangre oculta fecal se puede utilizar para detectar marcadores de sangre oculta fecal espedficos del cancer colorrectal. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos espedficos para un marcador polipeptidico en un inmunoensayo (p. ej., ELISA, del ingles Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) para detectar la presencia o ausencia del polipeptido en una muestra de heces que es indicativa de la presencia de cancer colorrectal. Para evaluar con exactitud la perdida de sangre en el tracto digestivo, es importante que los ensayos de sangre oculta fecal actuen sobre los analitos que son estables durante el transito enterico. Los datos disponibles indican que tanto el metodo del guayaco como la FOBT inmunoqmmica son insensibles para la deteccion de la perdida de sangre del colon proximal (vease, p. ej., Imperiale, et al., N Engl J Med 2004, 351:2704-2714; Ahlquist, et al., Ann Intern Med 2008, 149:441-450; Harewood, et al., Mayo Clin Proc 2002, 77:23-28; Allison, et al., J Natl Cancer Inst 2007, 99:1462-1470). Por el contrario, el ensayo de la hemoporfirina HemoQuant es sensible tanto para las fuentes proximales como distales de la perdida de sangre oculta (vease, p. ej., Harewood, et al., Mayo Clin Proc 2002, 77:23-28; Ahlquist, et al., N Engl J Med 1985, 312:1422-1428; Harewood, et al., Dig Dis. 2000,18(2):75-82). Por consiguiente, en algunas realizaciones, el ensayo de la hemoporfirina HemoQuant se utiliza para detectar y/o cuantificar el marcador de hemoglobina de sangre oculta fecal espedfica de cancer colorrectal.

La presente invencion no se limita a una combinacion particular de marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal en la deteccion de cancer colorrectal en un sujeto. En algunas realizaciones, se utilizan uno o mas marcadores epiteliales exfoliados (p. ej., bmp-3, K-ras. En algunas realizaciones, se utilizan uno o mas marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., hemoglobina).

Se observa que se puede analizar una unica muestra de heces para un marcador espedfico de neoplasia colorrectal o para multiples marcadores espedficos de neoplasia colorrectal. Por ejemplo, se puede analizar una muestra de heces utilizando ensayos que detectan una serie de diferentes marcadores espedficos de neoplasia colorrectal. Ademas, se pueden recoger multiples muestras de heces para un solo mairnfero y se analizan como se describe en la presente memoria. De hecho, las patentes de EE.UU. Nos. 5,670,325, 5,741,650, 5,928,870, 5,952,178, y 6,020,137 por ejemplo, describen diversos metodos que se pueden utilizar para preparar y analizar muestras de heces. La muestra de heces se puede descomponer en una primera y segunda porciones, donde la primera porcion se somete a analisis para marcadores epiteliales exfoliados y la segunda porcion se somete a analisis para marcadores de sangre oculta fecal. La muestra de heces puede experimentar una o mas etapas de preprocesamiento antes de ser descompuesta en porciones.

La presente invencion no se limita a una manera particular de detectar marcadores de acidos nucleicos correspondientes a neoplasia colorrectal a partir de una muestra de heces. El acido nucleico se puede amplificar. Generalmente, el acido nucleico utilizado como molde para la amplificacion se afsla de las celulas contenidas en la muestra biologica de acuerdo con metodologfas estandar (vease, p. ej., Sambrook, J., et al., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (ed.). MOLECULAR CLONING. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). El acido nucleico puede ser ADN genomico o ARN celular total o fraccionado. Cuando se utiliza ARN, se puede desear convertir el ARN en un ADNc complementario. El ARN puede ser ARN celular total y se utiliza directamente como molde para la amplificacion. Los pares de cebadores que hibridan selectivamente con los genes correspondientes a marcadores espedficos se ponen en contacto con el acido nucleico aislado bajo condiciones que permiten la hibridacion selectiva. Una vez hibridado, el complejo cebador de acido nucleico se pone en contacto con una o mas enzimas que facilitan la smtesis de acido nucleico dependiente del molde. Se llevan a cabo multiples rondas de amplificacion, tambien denominadas como "ciclos", hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificacion. A continuacion, se detecta el producto de amplificacion. En algunas solicitudes, la deteccion se puede realizar por medios visuales. Alternativamente, la deteccion puede implicar la identificacion indirecta del producto mediante quimioluminiscencia, gammagraffa radiactiva de radiomarcador incorporado o marcador fluorescente o incluso mediante un sistema que utiliza senales de impulsos electricos o termicos. Generalmente, el procedimiento anterior se lleva a cabo al menos dos veces en una muestra dada utilizando al menos dos pares de cebadores espedficos diferentes para dos marcadores espedficos diferentes. Despues de la deteccion, los resultados observados en un sujeto dado se pueden comparar con un grupo de referencia estadfsticamente significativo de sujetos diagnosticados que no tienen cancer colorrectal.

El termino cebador, como se define en la presente memoria, se quiere decir que abarque cualquier acido nucleico que sea capaz de cebar la smtesis de un acido nucleico naciente en un procedimiento dependiente de molde. Tfpicamente, los cebadores son oligonucleotidos de diez a veinte pares de bases de longitud, pero se pueden emplear secuencias mas largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma de doble cadena o de una sola cadena, aunque se prefiere la forma de una sola cadena.

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En la mayona de los casos, sera preferible sintetizar los oligonucleotidos deseados. Los cebadores adecuados se pueden sintetizar utilizando sintetizadores comerciales utilizando metodos bien conocidos por el experto ordinario en la tecnica. Cuando se desean cebadores de doble cadena, la smtesis de cebadores complementarios se realiza por separado y los cebadores se mezclan bajo condiciones que permiten su hibridacion.

La seleccion de cebadores se basa en una variedad de factores diferentes, que dependen del metodo de amplificacion y del marcador espedfico implicado. Por ejemplo, la eleccion del cebador determinara la especificidad de la reaccion de amplificacion. El cebador necesita ser suficientemente largo para hibridar espedficamente con el acido nucleico marcador y permitir la smtesis de productos de amplificacion en presencia del agente de polimerizacion y bajo condiciones de temperatura apropiadas. Las moleculas de cebador mas cortas generalmente requieren temperaturas mas fnas para formar complejos hnbridos suficientemente estables con el acido nucleico marcador y pueden ser mas susceptibles a hibridacion y amplificacion no espedficas.

Las secuencias de los cebadores no necesitan corresponderse exactamente a la secuencia marcadora espedfica. Los fragmentos de nucleotidos no complementarios pueden estar fijos al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia cebadora complementaria al molde. Alternativamente, las bases no complementarias pueden intercalarse en el cebador, siempre que la secuencia cebadora tenga suficiente complementariedad, en particular en el extremo 3', con el molde para que se produzca la reasociacion y permita la smtesis de una cadena de ADN complementaria.

Los cebadores se pueden disenar para hibridarse con regiones espedficas de la secuencia del acido nucleico marcador. Por ejemplo, se prefieren las regiones ricas en GC porque que forman complejos de hibridacion mas fuertes que las regiones ricas en AT. En otro ejemplo, los cebadores estan disenados, unicamente, para hibridarse con un par de secuencias de exones, con al menos un intron entre ellas. Esto permite que se detecte la actividad de un gen marcador frente a su presencia minimizando la amplificacion de fondo de las secuencias genomicas y distingue facilmente la amplificacion diana por tamano.

Los cebadores tambien pueden estar disenados para amplificar un segmento particular de acido nucleico marcador que codifica sitios de restriccion. Un sitio de restriccion en el producto final de amplificacion permitina la digestion en ese sitio particular por la enzima de restriccion relevante para producir dos productos de un tamano espedfico. En este aspecto se puede utilizar cualquier enzima de restriccion. Este perfeccionamiento anadido al procedimiento de amplificacion puede ser necesario cuando se amplifica una secuencia de acido nucleico marcador con semejanza a la secuencia cercana a otros acidos nucleicos. Alternativamente, se puede utilizar como una confirmacion anadida de la especificidad del producto de amplificacion.

Estan disponibles un numero de procedimientos dependientes del molde para amplificar las secuencias marcadoras presentes en una muestra de molde dada. Uno de los metodos de amplificacion mas conocidos es la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (vease, p. ej., las patentes de EE.UU. Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, y Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1990)). Brevemente, en la PCR, se preparan dos secuencias cebadoras que son complementarias a regiones de cadenas opuestamente complementarias de la secuencia marcadora. Se anade un exceso de desoxinucleosido trifosfato a una mezcla de reaccion junto con una ADN polimerasa, p. ej., Taq polimerasa. Si la secuencia marcadora esta presente en una muestra, los cebadores se uniran al marcador y la polimerasa inducira a que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia marcadora anadiendo nucleotidos. Mediante el aumento y la disminucion de la temperatura de la mezcla de reaccion, los cebadores extendidos se separaran del marcador para formar los productos de reaccion, los cebadores en exceso se uniran al marcador y a los productos de reaccion y se repetira el proceso. En algunas realizaciones, se realiza un procedimiento de amplificacion por PCR con transcriptasa inversa para cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Son bien conocidos los metodos de transcripcion inversa de ARN en ADNc (vease, p. ej., Sambrook, J., et al., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (ed.). MOLECULAR CLONING. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Alternativamente, los metodos para la transcripcion inversa utilizan ADN polimerasas termoestables (vease, p. ej., WO 90/07641).

La presente invencion no se limita a una tecnica de PCR particular. Los ejemplos de PCR incluyen, pero no se limitan a, PCR estandar, PCR de alelo espedfico, PCR de ensamblaje, PCR asimetrica, PCR digital, amplificacion dependiente de helicasa, PCR de inicio en caliente, PCR espedfica de intersecuencia, PCR inversa, PCR mediada por ligacion, PCR espedfica de metilacion, PCR minicebador, amplificacion de sondas dependientes de ligandos multiples, PCR anidada, PCR de superposicion-extension, PCR en tiempo real, PCR de transcripcion inversa, PCR en fase solida, PCR termal de entrelazado asimetrico y PCR con rampa decreciente de temperaturas.

Otro metodo para la amplificacion es la reaccion en cadena de la ligasa ("LCR") (vease, p. ej., las patentes de EE.UU. Nos. 4,883,750 y 5,494,810; incorporado en la presente memoria por referencia en su totalidad). En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de la secuencia marcadora, cada par se unira a las cadenas opuestamente complementarias del marcador de manera que queden contiguas. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se enlazaran para formar una unica unidad. Mediante una variacion dclica de la temperatura, como en la PCR, las unidades ligadas enlazadas se disocian del marcador y luego sirven como "secuencias diana" para la ligacion de pares de sondas en exceso.

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Despues de la amplificacion, puede ser deseable separar el producto de amplificacion del molde y el exceso de cebador para el objeto de determinar si se produjo una amplificacion espedfica. Los productos de amplificacion se pueden separar mediante electroforesis en agarosa, agarosa-acrilamida o gel de poliacrilamida utilizando metodos estandar (vease, p. ej., Sambrook, J., et al., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (ed.). MOLECULAR CLONING. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

Alternativamente, se pueden emplear tecnicas cromatograficas para efectuar la separacion. Hay muchos tipos de cromatograffa que se pueden utilizar en la presente invencion: adsorcion, particion, intercambio ionico y tamiz molecular, y muchas tecnicas especializadas para utilizarlas que incluyen cromatograffa en columna, papel, capa fina y de gases (vease, p. ej., Freifelder, D. Phpysical Biochemistry Applications to Biochemistry y Molecular Biology. 2nd ed. Wm. Freeman & Co., New York, N.Y. 1982).

Los productos de amplificacion deben visualizarse para confirmar la amplificacion de las secuencias marcadoras. Un metodo de visualizacion tfpico implica la tincion de un gel con bromuro de etidio y la visualizacion bajo luz UV. Alternativamente, si los productos de amplificacion estan marcados integralmente con nucleotidos radio-marcados o fluorometricamente marcados, los productos de amplificacion se pueden exponer entonces a pelmula de rayos X o visualizarse bajo espectros estimulantes apropiados, tras la separacion.

La visualizacion se puede lograr indirectamente. Por ejemplo, tras la separacion de productos de amplificacion, se pone en contacto una sonda de acido nucleico con la secuencia marcadora amplificada. La sonda se conjuga preferiblemente con un cromoforo pero puede ser radio-marcada. La sonda tambien se puede conjugar con un componente de union, tal como un anticuerpo o biotina, donde el otro miembro del par de union lleva un resto detectable.

La deteccion puede ser por transferencia Southern e hibridacion con una sonda marcada. Las tecnicas implicadas en la transferencia Southern son bien conocidas por aquellos expertos en la tecnica y se pueden encontrar en muchos libros estandar sobre protocolos moleculares (vease, p. ej., Sambrook, J., et al., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (ed.). MOLECULAR CLONING. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Brevemente, se separan los productos de amplificacion por electroforesis en gel. El gel se pone entonces en contacto con una membrana, tal como nitrocelulosa, que permite la transferencia del acido nucleico y la union no covalente. Posteriormente, la membrana se incuba con una sonda conjugada con cromoforo que es capaz de hibridarse con un producto de amplificacion diana. La deteccion es mediante la exposicion de la membrana a pelmula de rayos X o dispositivos de deteccion que emiten iones.

Se pueden reunir juntos en un kit todos los materiales esenciales basicos y reactivos necesarios para detectar el cancer colorrectal a traves de la deteccion tanto de la presencia como de la ausencia de marcadores epiteliales exfoliados (p. ej., ADN humano, alteracion de genes asociados a tumores, protemas asociadas a tumores) y marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., hemoglobina, protemas del suero) en una muestra de heces obtenida del mairnfero. Tales kits comprenden generalmente, por ejemplo, los reactivos utiles, suficientes o necesarios para detectar y/o caracterizar uno o mas marcadores epiteliales exfoliados espedficos para una neoplasia colorrectal (p. ej., bmp-3, NDRG4, K-ras y los reactivos utiles, suficientes o necesarios para detectar y/o caracterizar uno o mas marcadores de sangre oculta fecal espedficos para una neoplasia colorrectal (p. ej., hemoglobina). Los kits pueden contener las enzimas adecuadas para amplificar acidos nucleicos que incluyen diversas polimerasas, desoxinucleotidos y tampones para proporcionar la mezcla de reaccion necesaria para la amplificacion. Los kits pueden contener los reactivos necesarios para realizar en tiempo real la Alu PCR. Los kits pueden contener los reactivos necesarios para realizar el ensayo de la hemoporfirina HemoQuant. Los kits de la presente invencion pueden incluir un medio para contener los reactivos en un compartimento cerrado para la venta comercial tal como, p. ej., recipientes de plastico moldeados por soplado o inyeccion en los que se retiene el reactivo deseado. Tambien se pueden proporcionar otros recipientes adecuados para llevar a cabo ciertas etapas de los metodos descritos.

Los metodos descritos en la presente memoria son utiles en la monitorizacion del tratamiento del cancer colorrectal. Por ejemplo, los metodos se pueden realizar inmediatamente antes, durante y/o despues de un tratamiento para monitorizar el exito del tratamiento. En algunas realizaciones, los metodos se realizan a intervalos en pacientes sin enfermedad para asegurar el exito del tratamiento.

La presente solicitud tambien proporciona una variedad de variantes relacionadas con el ordenador. Espedficamente, la solicitud proporciona la programacion de ordenadores para analizar y comparar un patron de resultados de deteccion de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal (p. ej., marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal) en una muestra de heces obtenida de un sujeto con, por ejemplo, una biblioteca de tales patrones de marcadores conocidos que son indicativos de la presencia o ausencia de un cancer colorrectal, o de un estadio particular o de cancer colorrectal.

La presente solicitud proporciona la programacion de ordenadores para analizar y comparar un primer y un segundo patron de resultados de deteccion de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal (p. ej., marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal) de una muestra de heces tomada al menos en dos momentos diferentes. El primer patron puede ser indicativo de una afeccion precancerosa y/o afeccion de bajo riesgo para el cancer colorrectal y/o la progresion desde una afeccion precancerosa a una afeccion cancerosa. La comparacion

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proporciona la monitorizacion de la progresion de la afeccion desde el primer momento hasta el segundo momento.

La solicitud proporciona la programacion de ordenadores para analizar y comparar un patron de resultados de deteccion de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal (p. ej., marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal) de una muestra de heces con una biblioteca de patrones de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal conocidos que son indicativos de la presencia o ausencia de un cancer colorrectal, en donde la comparacion proporciona, por ejemplo, un diagnostico diferencial entre una neoplasia colorrectal benigna y una neoplasia colorrectal agresivamente maligna (p. ej., el patron marcador proporciona la estadificacion y/o clasificacion de la afeccion cancerosa).

Los metodos y sistemas descritos en la presente memoria se pueden implementar de numerosas maneras. Los metodos pueden implicar el uso de una infraestructura de comunicaciones, por ejemplo internet. A continuacion se tratan varias realizaciones de la invencion. Tambien se entiende que la presente invencion se puede implementar en diversas formas de hardware, software, firmware, procesadores o una combinacion de los mismos. Los metodos y sistemas descritos en la presente memoria se pueden implementar como una combinacion del hardware y el software. El software se puede implementar como un programa de aplicacion incorporado de forma tangible en un dispositivo de almacenamiento de programas o en diferentes partes del software implementadas en el entorno informatico del usuario (p. ej., como una miniaplicacion) y en el entorno informatico del revisor, donde el revisor puede estar ubicado en un sitio remoto (p. ej., en las instalaciones de un proveedor de servicios).

Por ejemplo, durante o despues de la entrada de datos por el usuario, partes del procesamiento de datos se pueden realizar en el entorno informatico del usuario. Por ejemplo, se puede programar el entorno informatico del usuario para proporcionar codigos de ensayo definidos para indicar la plataforma, veldculo/ensayo de diagnostico o ambos; procesamiento de datos utilizando banderas definidas y/o generacion de configuraciones de banderas, donde las respuestas se transmiten como respuestas procesadas o parcialmente procesadas al entorno informatico del revisor en forma de codigo de ensayo y configuraciones de banderas para la ejecucion posterior de uno o mas algoritmos para proporcionar resultados y/o generar un informe en el entorno informatico del revisor.

El programa de aplicacion para ejecutar los algoritmos descritos en la presente memoria se puede cargar a y ejecutar por una maquina que comprende cualquier arquitectura adecuada. En general, la maquina implica una plataforma informatica que tiene hardware como una o mas unidades centrales de procesamiento (CPU, en ingles central processing units), una memoria de acceso aleatorio (RAM, en ingles random access memory), y una interfaz (interfaces) de entrada/salida de datos (I/O, en ingles input/output). La plataforma informatica tambien incluye un sistema operativo y un codigo de microinstruccion. Los diversos procedimientos y funciones descritos en la presente memoria o pueden ser parte del codigo de microinstruccion o parte del programa de aplicacion (o una combinacion de los mismos) que se ejecuta a traves del sistema operativo. Ademas, se pueden conectar otros diversos dispositivos perifericos a la plataforma informatica, tal como un dispositivo adicional de almacenamiento de datos y un dispositivo de impresion.

Como sistema informatico, el sistema incluye generalmente una unidad de procesamiento. La unidad de procesamiento funciona para recibir informacion, que generalmente incluye los datos de ensayo (p. ej., los productos geneticos espedficos analizados) y los datos del resultado del ensayo (p. ej., el patron de resultados de deteccion de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal (p. ej., marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal) de una muestra de heces). Esta informacion recibida se puede almacenar al menos temporalmente en una base de datos y los datos analizados en comparacion con una biblioteca de patrones marcadores conocidos que son indicativos de la presencia o ausencia de una afeccion precancerosa o que se sabe que son indicativos de un estadio y/o grado de cancer colorrectal.

Parte o todos de los datos de entrada y salida tambien se pueden enviar electronicamente; ciertos datos de salida (p. ej., informes) se pueden enviar electronicamente o via telefonica (p. ej., por facsfmil, p. ej., utilizando dispositivos tales como el fax). Los dispositivos receptores de salida ejemplares pueden incluir un elemento de visualizacion, una impresora, un dispositivo facsfmil y similares. Las formas electronicas de transmision y/o visualizacion pueden incluir correo electronico, television interactiva y similares. En algunas variantes, todos o una parte de los datos de entrada y/o todos o una parte de los datos de salida (p. ej., normalmente al menos la biblioteca del patron de resultados de deteccion de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal (p. ej., marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal) se sabe que son indicativos de la presencia o ausencia de una afeccion precancerosa) se mantienen en un servidor para el acceso, p. ej., acceso confidencial. Se puede acceder a los resultados o se pueden enviar a los profesionales como se desee.

Un sistema para su uso en los metodos descritos en la presente memoria incluye generalmente al menos un procesador informatico (p. ej., cuando el metodo se lleva a cabo en su totalidad en un unico sitio) o al menos dos procesadores informaticos conectados en red (p. ej., cuando se detectan datos del marcador para una muestra de heces obtenida de un sujeto se deben introducir por un usuario (p. ej., un tecnico o alguien que realice los ensayos de la actividad) y se transmite a un sitio remoto a un segundo procesador informatico para el analisis (p. ej., cuando el patron de resultados de deteccion de marcadores espedficos de neoplasia colorrectal (p. ej., marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal) se compara con una biblioteca de patrones que se sabe que son indicativos de la presencia o ausencia de una afeccion precancerosa), donde los procesadores informaticos

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primero y segundo estan conectados por una red, p. ej., a traves de una intranet o internet). El sistema tambien puede incluir un(os) componente(s) de usuario para la entrada; y un(os) componente(s) de revisor para la revision de datos, y la generacion de informes, que incluye la deteccion de una afeccion precancerosa, estadificacion y/o clasificacion de una neoplasia colorrectal, o la monitorizacion de la progresion de una afeccion precancerosa o una neoplasia colorrectal. Los componentes adicionales del sistema pueden incluir un(os) componente(s) de un servidor; y una o mas bases de datos para almacenar datos (p. ej., como en una base de datos de elementos de informe, p. ej., una biblioteca de patrones de marcadores conocidos que son indicativos de la presencia o ausencia de una condicion precancerosa y/o se sabe que son indicativos de un grado y/o un estadio de una neoplasia colorrectal, o una base de datos relacional (RDB, del ingles relational database) que puede incluir la entrada de datos por el usuario y salida de datos. Los procesadores informaticos pueden ser procesadores que se encuentran tfpicamente en ordenadores de sobremesa personales (p. ej., IBM, Dell, Macintosh), ordenadores portatiles, ordenadores centrales, miniordenadores u otros dispositivos de computacion.

Los componentes de entrada pueden ser ordenadores personales independientes, completos que ofrecen una gama completa de potencia y caractensticas para ejecutar aplicaciones. El componente de usuario funciona normalmente bajo cualquier sistema operativo deseado e incluye un elemento de comunicacion (p. ej., un modem u otro hardware para conectarse a una red), uno o mas dispositivos de entrada (p. ej., un teclado, raton, teclado numerico u otro dispositivo utilizado para transferir informacion o comandos), un elemento de almacenamiento (p. ej., un disco duro u otro medio de almacenamiento legible por ordenador, grabable por ordenador), y un elemento de visualizacion (p. ej., un monitor, television, LCD, LED u otro dispositivo de visualizacion que transmita informacion al usuario). El usuario introduce los comandos de entrada en el procesador informatico a traves de un dispositivo de entrada. Generalmente, la interfaz de usuario es una interfaz grafica de usuario (GUI, en ingles graphical user interface) escrita para aplicaciones de navegador web.

El/los componente(s) del servidor puede(n) ser un ordenador personal, un miniordenador o un ordenador central y ofrece(n) gestion de datos, intercambio de informacion entre clientes, seguridad y administracion de red. La aplicacion y cualquier base de datos utilizada pueden estar en el mismo o en diferentes servidores.

Se contemplan otras configuraciones informaticas para el usuario y el/los servidor(es), que incluye(n) el procesamiento en una unica maquina tal como un ordenador central, una coleccion de maquinas u otra configuracion adecuada. En general, las maquinas del usuario y del servidor funcionan juntas para lograr el procesamiento.

Cuando se utiliza(n), la(s) base(s) de datos normalmente esta(n) conectada(s) al componente del servidor de base de datos y puede ser cualquier dispositivo que contenga los datos. Por ejemplo, la base de datos puede ser cualquier dispositivo de almacenamiento optico o magnetico para un ordenador (p. ej., CDROM, disco duro interno, unidad de cinta). La base de datos puede estar ubicada de forma remota al componente del servidor (con acceso a traves de una red, modem, etc.) o localmente al componente del servidor.

Cuando se utiliza en el sistema y los metodos, la base de datos puede ser una base de datos relacional que se organiza y se accede segun relaciones entre elementos de datos. La base de datos relacional se compone generalmente de una pluralidad de tablas (entidades). Las filas de una tabla representan registros (colecciones de informacion sobre elementos separados) y las columnas representan campos (atributos particulares de un registro). En su concepcion mas simple, la base de datos relacional es una coleccion de entradas de datos que “se relacionan" entre sf a traves de al menos un campo comun.

Se pueden utilizar estaciones de trabajo adicionales equipadas con ordenadores e impresoras en el punto de servicio para introducir datos y, si se desea, generar informes adecuados. El/los ordenador(es) puede(n) tener un acceso directo (p. ej., en el escritorio) para iniciar la aplicacion para facilitar el inicio de la entrada, la transmision, el analisis, la recepcion del informe, etc., segun se desee

La presente solicitud proporciona metodos para obtener el perfil de riesgo de un sujeto para desarrollar cancer colorrectal. Tales metodos pueden implicar obtener una muestra de heces de un sujeto (p. ej., un ser humano en riesgo para desarrollar cancer colorrectal, un ser humano sometido a un examen ffsico de rutina), detectar la presencia o ausencia de uno o mas marcadores epiteliales exfoliados espedficos para una neoplasia colorrectal en o asociado con la muestra de heces, detectar la presencia o ausencia de uno o mas marcadores de sangre oculta fecal (p. ej., espedficos para una neoplasia colorrectal) en o asociados con la muestra de heces y generar un perfil de riesgo para desarrollar cancer colorrectal basado en la presencia o ausencia detectada de marcadores epiteliales exfoliados y marcadores de sangre oculta fecal. Por ejemplo, un perfil de riesgo generado cambiara dependiendo de los marcadores epiteliales exfoliados espedficos y los marcadores de sangre oculta fecal detectados como presentes o ausentes. Este metodo no se limita a una forma particular de generar el perfil de riesgo. Se puede utilizar un procesador (p. ej., un ordenador) para generar tal perfil de riesgo. El procesador puede utilizar un algoritmo (p. ej., un software) espedfico para interpretar la presencia y ausencia de marcadores epiteliales exfoliados espedficos y marcadores de sangre oculta fecal como se determina con los metodos de la presente invencion. La presencia y ausencia de marcadores epiteliales exfoliados espedficos y marcadores de sangre oculta fecal se puede determinar con los metodos de la presente invencion se introducen en tal algoritmo y se describe el perfil de riesgo basado en una comparacion de dicha entrada con normas establecidas (p. ej., norma establecida

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para la condicion precancerosa, norma establecida para diversos niveles de riesgo para desarrollar cancer colorrectal, norma establecida para sujetos diagnosticados con diversos estadios de cancer colorrectal). En algunas variantes, el perfil de riesgo indica el riesgo de un sujeto para desarrollar cancer colorrectal o el riesgo de un sujeto para volver a desarrollar cancer colorrectal. En algunas variantes, el perfil de riesgo indica que un sujeto tiene, por ejemplo, una probabilidad muy baja, baja, moderada, alta y muy alta de desarrollar o volver a desarrollar cancer colorrectal. En algunas variantes, el perfil de riesgo indica el riesgo basado en la media de poblacion a un nivel de especificidad deseado (p. ej., 90%). En algunas variantes, un proveedor de atencion medica (p. ej., un oncologo) utilizara tal perfil de riesgo en la determinacion de un ciclo de tratamiento o intervencion (p. ej., colonoscopia, esperar a ver que pasa, remision a un oncologo, remision a un cirujano, etc.)

Ejemplos

La invencion que ahora se describe en general se entendera mas facilmente por referencia al siguiente ejemplo, que se incluye simplemente para los fines de la ilustracion de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invencion, y no pretende limitar la invencion.

Ejemplo 1

Sujetos

Se reclutaron un total de doscientos un sujetos, que incluyen 74 pacientes con CRC, 27 con adenoma avanzado (>1 cm) y 100 individuos colonoscopicamente normales. Sus caractensticas demograficas y clmicas se describen en la Tabla 1.

Tabla 1. Caractensticas demograficas y clmicas de los sujetos

Cancer Colorrectal Adenoma avanzado Control normal

Numero

74 27 100

Media de edad (Rango)

61 (40-87) anos 67 (50-82) anos 59(28-81) anos

Sexo (Hombre/Mujer)

52/22 15/12 37/63

Localizacion (Derecho/Izquierdo)

29/45 17/10

Estadio (I/M/IM/IV) Grado (1/2/3/4) o Displasia (Baja/Alta)

13/16/27/18 0/4/55/5 20/5

Recogida de heces

Las heces se recogieron mas de 2 semanas despues de cualquier procedimiento de diagnostico colorrectal o preparacion catartica y antes o de la reseccion endoscopica o quirurgica de la neoplasia. Los pacientes recogieron heces enteras en un tampon conservante (0,5 mol/L de Tris, 10 mmol/L de NaCl, 150 mmol/L de EDTA, pH 9,0) como se describe (vease, p. ej. Olson J, et al., Diagn Mol Pathol 2005; 14:183-191; incorporado en la presente memoria por referencia en su totalidad) y enviado por correo a un laboratorio en 48 horas. Una vez que las heces llegaron al laboratorio, se pesaron y se homogeneizaron. Se utilizo una almuota equivalente a 10g de heces para la extraccion de ADN de heces y el resto se almaceno a 80°C en almuotas.

Cuantificacion de ADN largo con Alu-PCR en tiempo real

Se extrajo ADN crudo de heces con isopropanol, se precipito con etanol y se eluyo en 7,5 ml de tampon 1xTE. El ADN humano en el ADN crudo de heces se cuantifico utilizando el metodo Alu-PCR en tiempo real (vease, p. ej., Zou H, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15:1115-1119; incorporado en la presente memoria por referencia en su totalidad). Se utilizaron los cebadores espedficos para las secuencias Alu humanas, sentido: 5'- ACG CCT GTA ATC CCA GCA CTT-3'; y antisentido: 5'-TCG CCC AGG CTG GAG TGC A-3' para amplificar secuencias de aproximadamente 245 pb dentro de las repeticiones Alu (vease, p. ej., Zou H, et al., Cancer Epidemiol Biomarkes Prev 2006; 15:1115-1119; Zijlstra A, et al., Cancer Res 2002; 62:7083-7092; cada uno incorporado en la presente memoria por referencia en sus totalidades). El ADN crudo de heces se diluyo de 1 a 100 con agua libre de nucleasa para la amplificacion por PCR. Un pL de ADN de heces diluido en agua se amplifico en un volumen total de 25 pL que contema 1*iQ™ SYBR® Green Supermix (BioRad), 200 nM de cada cebador en las siguientes condiciones: 95°C durante 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 40 segundos en tiempo real en un ICycler® (BioRad). Se creo una curva estandar para cada placa amplificando muestras de ADN genomico humano diluidas en serie 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

veces (Novagen, Madison, WI). Se hizo despues la curva de fusion de cada reaccion de PCR para confirmar que solo se amplifico un producto para todas las muestras. La amplificacion se llevo a cabo en placas de 96 pocillos. Cada placa consistfa en muestras de ADN de heces y multiples controles positivos y negativos. Se realizo cada ensayo por duplicado.

Cuantificacion de sangre oculta fecal con HemoQuant

Se cuantifico la sangre oculta fecal con el ensayo HemoQuant (vease, p. ej., Harewood GC, et al., Mayo Clin Proc 2002; 77:23-28; Ahlquist DA, et al., JAMA 1993; 269:1262-1267; Ahlquist DA, et al., N Engl J Med 1985; 312:14221428; Ahlquist DA, et al., Ann Intern Med 1984; 101:297-302; Schwartz S, et al., Clin Chem 1983, 29:2061-2067; Schwartz S, et al., Gastroenterology 1985; 89:19-26). Tampon (0,5 mol/L de Tris, 10 mmol/L de NaCl, 150 mmol/L de EDTA, pH 9,0) (vease, p. ej., Olson J, et al., Diagn Mol Pathol 2005; 14:183-191) Se utilizo una suspension de heces conservada congelada equivalente a 8 mg de heces para realizar el ensayo HemoQuant con un sistema automatizado en un laboratorio clmico. El hemo no fluorescente en la muestra de heces se convirtio en porfirinas fluorescentes por eliminacion del hierro con 2 ml de acido oxalico caliente (60°C) y 0,2 ml de sulfato ferroso. Se extrajo despues la mezcla de reaccion con 3 ml de acetato de etilo: isobutil alcohol (11,1:1, v/v), seguido de lavado con 3 ml de disolucion acuosa alcalina de acetato de potasio y se extrajo adicionalmente con 2,5 ml de acido acetico/acido fosforico. Las porfirinas extrafdas, en su mayona protoporfirina, se cuantifican basandose en la intensidad de emision de fluorescencia a 652 nm utilizando 405 nm como longitud de onda de excitacion en un lector de microplacas Infinite®200 (Tecan, Mannedorf, Suiza). Cada placa consistfa en muestras de heces, patrones y controles negativos y positivos. Se hicieron patrones con cantidades conocidas de hemoglobina de sangre humana.

Analisis estadfstico

Se utilizo un procedimiento logfstico para calcular la correlacion de los niveles de ADN largo y hemoglobina en heces. Se utilizo el ensayo de Wilcoxon Rank Sum para comparar los niveles de ADN largo o hemoglobina entre cada uno de los tres grupos de heces diferentes y evaluar la asociacion de los niveles de marcadores con la localizacion del tumor, el sexo, el estadio de Dukes y el grado de diferenciacion. Se calculo la correlacion de los niveles de marcadores con el tamano del tumor y la edad del paciente con el procedimiento Logfstico. Se utilizaron los ensayos de Chi-cuadrado y el ensayo exacto de Fisher para evaluar la asociacion de la tasa de deteccion del panel marcador con las caractensticas clmicas. Se calculo la combinacion de los niveles de ADN largo y hemoglobina con un modelo logfstico. Se construyo la Curva Operativa del Receptor (ROC, del ingles Receiver Operating Curve)) para comparar los niveles de ADN largo y hemoglobina en los canceres o adenomas versus sujetos normales, y se calculo tambien el valor del area bajo la curva (AUC, del ingles area under the curve) para cada curva. Se calcularon las sensibilidades al 90% de especificidad para los marcadores individuales y su combinacion. El analisis estadfstico se llevo a cabo con el software SAS (SAS Institute, Cary, NC).

Resultados

Los niveles medios de ADN humano fueron 421 (rango: 0-19.140), 86 (0-6.260) y 11 (0-30.000) ng por g de heces de pacientes con CRC o adenomas, o de controles normales, respectivamente (p=0,0001, cRc vs normal, p=0,0005, adenoma vs normal, p=0,007, CRC vs adenoma, Figura 1A). Los niveles medios de hemoglobina fueron 3,4 (0,1-36,1), 1,5 (0,1-10,9) y 1,1 (0,3-11,0) mg por g de heces de pacientes con CRC o adenomas, o de controles normales, respectivamente (p=0,0001, CRC vs normal o adenoma; p=1,0, adenoma vs normal; Figura 1B). El ADN largo fecal y los niveles de sangre oculta no se correlacionaron (R2= 0,0001; Figura 2).

Al 90% de especificidad, los ensayos de ADN largo detectaron un 70% de canceres colorrectales y un 46% de adenomas, mientras que los ensayos de sangre oculta detectaron un 50% y un 12% (Figuras 1 y 3). La combinacion de estos ensayos detecto un 80% de canceres colorrectales y un 46% de adenomas al 90% de especificidad (Figura 3). Para la deteccion del cancer colorrectal, los valores de AUC fueron 0,82, 0,78 y 0,90 para el ADN largo fecal, la sangre oculta y la combinacion de ensayos, respectivamente (p=0,02, ADN largo vs combinacion; p=0,0001, sangre oculta vs combinacion; Figura 3). Para la deteccion del adenoma avanzado, los valores de AUC fueron de 0,72, 0,50 y 0,72 para los ensayos de ADN fecal, sangre oculta y combinacion, respectivamente (p=0,8, ADN largo vs combinacion; p=0,03, sangre oculta vs combinacion; Figura 3).

El nivel medio (rango) de ADN largo fecal fue de 181 (0-7.120) ng/g de heces con canceres en estadio 1-2 y 910 (019.140) ng/g de heces con canceres en estadio 3-4, p=0,001; y 112 (0-4.780) ng/g de heces con cancer proximal y 1.006 (0-19.140) ng/g de heces con cancer distal, p=0,0001. El nivel medio de sangre oculta fecal fue de 7,0 mg Hb/g (0,2-26,4 mg/g) con canceres proximales y 2,5 mg/g (0,13-36,1 mg/g) con distales, p=0,04. Los niveles medios de ADN largo fecal y de sangre oculta en heces de pacientes con CRC y adenomas avanzados no se asociaron con otras caractensticas clmicas. El tamano medio fue de 4,0 cm (1,0-15,0) para las neoplasias detectadas por los ensayos combinados y de 3,7 cm (1,0-7,0) para las neoplasias no detectadas, p=0,02. Las tasas de deteccion de neoplasias por los ensayos combinados no se vieron afectadas ni por el sitio ni por el estadio del tumor.

Equivalentes

La invencion se puede realizar en otras formas espedficas. Por lo tanto, las realizaciones anteriores se deben considerar en todos los aspectos ilustrativas en lugar de limitar la invencion descrita en la presente memoria.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para detectar la presencia de una neoplasia colorrectal en un mairnfero, comprendiendo dicho metodo:

   a) detectar la presencia de marcadores epiteliales exfoliados en una muestra de heces obtenida de dicho mamffero, en donde dichos marcadores epiteliales exfoliados espedficos para una neoplasia colorrectal comprenden

   5 marcadores de acidos nucleicos espedficos de neoplasia colorrectal que comprenden un gen que tiene una mutacion puntual y genes que tienen metilacion aberrante; y

   b) detectar la presencia de un marcador de sangre oculta fecal en dicha muestra de heces;

   c) identificar dicho marnffero que tiene una neoplasia colorrectal cuando se detecta la presencia de ambos marcadores epiteliales exfoliados en dicha muestra de heces y el marcador de sangre oculta fecal en dicha muestra

   10 de heces.
2. 2. El metodo
3. 3. El metodo
4. 4. El metodo
5. 5. El metodo

   15 6. El metodo
6. 7. El metodo

   de la reivindicacion 1, en donde dicha neoplasia colorrectal es premaligna.

   de la reivindicacion 1, en donde dicha neoplasia colorrectal es maligna.

   de la reivindicacion 1, en donde dicho gen que tiene una mutacion puntual es K-ras.

   de la reivindicacion 1, en donde dichos genes que tienen metilacion aberrante son bmp-3 y NDRG4.

   de la reivindicacion 1, en donde dicho marcador de sangre oculta fecal es hemoglobina.

   de la reivindicacion 1, en donde dicho mamffero es un ser humano.