KR100817444B1 - 5'-말단 ｘｉｓｔ 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도측정방법과 이를 이용한 암 진단 방법, 항암활성을측정하는 방법 및 메틸화 측정 키트 - Google Patents

5'-말단 ｘｉｓｔ 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도측정방법과 이를 이용한 암 진단 방법, 항암활성을측정하는 방법 및 메틸화 측정 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 5'-말단(end) XIST(X(Inactive)-Specific Transcription) 유전자 서열에 존재하는 메틸화(methylation) 정도 측정방법과 이를 이용한 암 진단 방법, 항암활성을 측정하는 방법 및 메틸화 측정 키트에 관한 것으로, 특히 DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법에 있어서, 상기 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하는 단계; 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻는 단계; 및 상기 PCR 생산물을 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법에 의하는 경우, 종양(tumor)이나 암(cancer)을 초기에 신속하고 간편하게 진단하여 적절한 치료를 가능하게 하며, 종양이나 암에 대한 진단 마커(marker)로써 유용하게 실용화할 수 있다.
5'-end XIST, 메틸화, 파이로시퀀싱

Description

5'-말단 ＸＩＳＴ 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법과 이를 이용한 암 진단 방법, 항암활성을 측정하는 방법 및 메틸화 측정 키트{Quantitating Method of XIST-5’end Methylation Status, Diagnostic Method of Tumor, Measuring Method for Antitumor Activities and Measuring Kit for Methylation Using The Same}
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 사용되는 5'-end XIST 유전자의 염기서열과 CpG-1, CpG-2, CpG-3 및 각종 프라이머(primer)를 나타내는 모식도이고,
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 사용되는 5'-end XIST 유전자의 염기서열의 중아황산염 처리 전과 후의 염기서열 변화를 나타내는 모식도이고,
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 의해 정상 남성과 정상 여성의 혈청(serum)에 존재하는 5'-end XIST 유전자, 특히 CpG-1, CpG-2, CpG-3 유전자 위치에 대한 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 결과를 나타낸 그래프이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 의해 정상 남성 과 정상 여성의 EBV-transformed B-cells, 여성 유방암 세포주(breast cancer cell line)(MCF7), 남성 전립선암 세포주(prostate cancer cell lines)(DU145)의 5'-end XIST 유전자, 특히 CpG-1, CpG-2, CpG-3 유전자 위치에 대한 파이로시퀀싱 결과를 나타낸 그래프이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 의해 혈청(serum)(XY-serum, XX-serum), EBV-tranformed B-cell(XX, XY), DU145, MCF7, 혈액(blood)(XY-blood, XX-blood)에서의 5'-end XIST 유전자, 특히 CpG-1, CpG-2, CpG-3 유전자 위치에 대한 파이로시퀀싱 결과를 정량화 하여 나타낸 그래프이고,
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 항암제의 항암활성을 측정하는 방법을 위해 5-아자시티딘(5-Azacytidine)을 처리한 정상 남성 세포주(cell line)에 대한 파이로시퀀싱 결과를 나타낸 그래프이고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 의해 정상 남성 DNA에 전립선암 세포주 DNA를 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%가 포함되도록 혼합하여, 5'-end XIST 유전자 대한 파이로시퀀싱 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 DNA 메틸화(methylation) 정도를 측정하는 방법에 관한 것으로, 특히 DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST(X(Inactive)-Specific Transcription) 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도를 측정하는 방법에 대한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명에 따라 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
유전자 조절 기작을 밝혀내는데 DNA 메틸화를 연구하는 학문을 후성학(epigenetics)이라고 한다. 게놈 프로젝트의 연구가 거의 마무리 되었고 그 뒤를 이어 프로테오놈 프로젝트가 시행되는 이른바 포스트 게놈 시대가 도래되었다. 과학자들은 이러한 연구에서 얻은 정보를 이용하여 의학에 적용하거나 신약개발에 활용하는 일에 최선을 다하고 있다. 그러나, 이를 위해서는 단백질을 만드는 유전자의 기능과 조절 기작이 우선 밝혀져야 한다.
현재까지는 DNA 염기서열의 변화와 재조합에 의해 형질이 변화가 발생한다고 알아왔다. 그러나, DNA의 염기서열이 변하지 않더라도 유전자 기능이 변하며 이 변화는 어버이로부터 자손에게 전해진다는 사실이 알려졌다. 후성학은 바로 이러한 현상, 즉 DNA 염기서열의 변화없이 유전발현과 같은 기능의 변화가 일어나는지를 알아내는 새로운 영역의 학문이다.
일반적인 유전학 관점에서 중요한 현상은 염기가 바뀌는 돌연변이가 있지만, 후성학에서는 염기에 메틸기가 붙는 메틸화 과정이다. 게놈의 염기서열에 C와 G의 두 염기가 나란히 존재하는 것을 CpG 라고 한다. 이 배열에서 시토신이 메틸화되는 경향이 많아 인간 게놈의 경우 전체 시토신 중 3~4%는 메틸화 되어 있다.
CpG는 진화 과정에서 점차 감소되어 왔다. 게놈에 존재하는 CpG의 메틸화 정도와 패턴은 포유동물의 종에 따라 다르고 조직에 따라서도 다른 매우 특이적인 양상을 보이고 있다. 포유동물의 염기서열에는 CpG가 밀집되어 있는 'CpG 아일랜드(island)'라는 부위가 존재한다. 이 부위는 0.5~4kb 정도로 게놈의 유전자와 밀접한 연관성을 가지고 있는 것으로 여겨지고 있다. 이 CpG 아일랜드는 유전자의 전사과정을 조절하는 프로모터 부근에 위치한다. 대부분 존재하는 CpG 아일랜드는 메틸화 되지 않았으며 따라서 CpG 아일랜드의 메틸화는 중요한 의미를 가지고 있다.
부모에서 물려받은 각 염색체의 유전자가 모두 기능할때 유전자 이상이 발생하는 유전자군이 수 십종이나 된다. 따라서 어느 한쪽이 유전자만 발현되어야만 한다. 이러한 과정을 유전체 각인(genomic imprinting)이라고 하며 이러한 조절을 받는 유전자를 각인 유전자라고 한다. 이러한 각인이 가능한 이유는 수정란의발생단계 초기에서 해당 유전자의 CpG 아일랜드가 선택적으로 메틸화되어 발현을 막기 때문이다. 메틸화되지 않은 대립 유전자 만이 발현됨으로써 유전자 용량(gene degree)이 조절되는 것이다. 또한 각인 현상은 X 염색체 2개를 가지고 있는 여성에서 볼 수 있는 바(bar)체에서도 볼 수 있다. 아울러 조직에서도 조직에 따라 특이적으로 CpG 아일랜드의 메틸화가 발생해 발현이 조절되는 것으로 알려졌다.
CpG 메틸화는 외부에서 유입되는 트랜스포존과 같은 이동성 유전자들의 기능을 무력화시키는 방어기작이 되기도 한다. 외부 유입유전자들의 프로모터 CpG 아일랜드가 메틸화되어 유전자 발현이 원천봉쇄되는 것이다. 시간이 경과함에 따라 메틸기가 붙은 시토신이 티민으로 전환되어 결국에는 이동성 유전자들이 점차 기능을 상실하는 것으로 생각된다. 아울러 암 발생 원인으로 암을 억제하는 유전자의 기능이 이들 유전자의 CpG 아일랜드에 메틸화라는 연구결과도 나오고 있다. 암억제 유전자의 기능 소실은 돌연변이, 결실, 그리고 프로코터 영역의 메틸화로 일어나게 되는 것이다. 최근, 정상 남성 체세포(somatic cell)의 XIST 유전자의 프로모터(promoter) 및 5-end 부분의 CpG 영역(sites)은 완벽히 메틸화 되어 있으나, 남성 생식 관련 암(TGCTs, prostate cancer)에서는 5'-end XIST 유전자의 CpG 영역이 비메틸화(unmethylation) 되어 있다고 보고되었다.
지금까지 거의 대부분의 DNA 메틸화 연구는 암세포 기능이 소실된 유전자를 발굴하는 일이었다. 최근에는 대규모의 검색시스템을 이용해 암 게놈에서 전체 메틸화 패턴을 분석해 미지의 유전자를 발굴하는 노력이 시도되고 있다. 이를 위해 다양한 검색 시스템이 개발되었다. 미국 등 선진국에서는 메틸화된 DNA를 찾는 여러 기술을 이용해 암 발생과 관련된 암 억제 유전자, 세포주기 관련 유전자, DNA 보수 유전자 등을 밝혀냈다. 국내에서도 여러 대학과연구소에서 cDNA 마이크로어레이 기술을 이용해 암세포에서 기능이 회복된 유전자를 찾는 연구를 진행하고 있다.
그 중에서도, DNA 메틸화를 분석하는 방법은 다양하게 발달되어 왔으며, 그 방법에는 직접적 염기서열 분석(direct sequencing), 제한 효소를 이용한 방법(restriction digestion), methylation specific PCR(MSP), amplified methylation polymorphism(AMP), nucleotide extension assays(Mn-SnuPE) 방법 등이 있다. 하지만, 이러한 방법들은 메틸화 정도를 정확하게 측정할 수 없고, 그 절차가 복잡해서 오랜 시간이 소요되며, 정량적인 정보를 시각적 검사(visual inspection)로 얻을 수 없다는 단점을 가지고 있다. 이에, DNA 메틸화 정도를 정확하고 간편하게 측정할 수 있는 새로운 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도를 측정하는 방법을 제공하기 위한 것이다. 특히, 본 발명에 따라 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하고자 하는 것이다.
이러한 본 발명에 의하여, 파이로시퀀싱에 적합한 특정한 시퀀싱프라이머를 이용함으로써, 종양(tumor)이나 암(cancer)을 초기에 신속하고 간편하게 진단하고, 이에 따라 적절한 치료를 가능하게 하며, 종양이나 암에 대한 진단 마커(marker)로써 유용하게 실용화하는 것을 본 발명의 목적으로 한다.
또한, 이러한 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화(methylation) 정도 측정방법과 이를 이용한 암 진단 방법, 항암활성을 측정하는 방법 및 메틸화 측정 키트를 이용하여, 5'-end XIST 의 비정상메틸화(aberrant methylation) 정도를 빠르고 정확하게 측정함으로써, 질병의 조기 진단(early disease detection), 질병 위험도 평가(assessment of disease risk) 및 새로운 진단 마커(novel prognosis marker)로 다양하게 활용하고자 함이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 특히 DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST(X(Inactive)-Specific Transcription) 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법에 있어서, 상기 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하는 단계; 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻는 단계; 및 상기 PCR 생산물을 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법이다.
이러한 본 발명은 DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도를 측정하기 위한 것으로, 특히 본 발명에 따라 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머를 이용하여 파이로시퀀싱하는 것을 특징으로 한다.
본 발명이 대상으로 하는 XIST 유전자는 X염색체 q13에 위치하고, XIC(X inactivation center) 지역에 있으며, 유전자 길이는 35 kb로써 19.3 kb의 XIST RNA로 전사되는 반면 해독(translation)은 되지 않는다. 두 개의 X 염색체를 가지는 여성의 경우, 이 가운데 하나는 X 염색체의 무작위적 선택에 의해 X염색체 불활성화(X chromosome inactivation) 과정을 거쳐 바체(Barr Body)라고 불리는 불활성화된 상태로 변한다. X 염색체의 불활성화 상태를 확실하게 하는 과정은 메틸화,아세틸화, 등 히스톤 단백질의 다양한 생화학적 변형과정이 관여하며, 이런 불활성화 개시 과정에서 XIST 유전자는 중요한 역할을 한다고 알려졌다.
불활성 X 염색체에서 XIST 의 RNA가 발현하며, 여성의 활성 X 염색체와 남성의 X 염색체는 XIST RNA가 발현하지 않는다. X 염색체 불활성은 XIST RNA가 불활성 X 염색체를 둘러싸면서 일어나게 되는데 XIST RNA가 염색체 불활성에 개시자 역할을 한다고 알려져 있다. XIST의 프로모터(promoter) 메틸화는 XIST의 RNA 발현과 직접적으로 연관 되어 있다. 최근 몇몇 고환암과 전립선암 등에서 XIST의 메틸화가 변화된다는 보고가 있었고, 따라서 XIST 염색체의 메틸화 여부는 암 진단제재로써의 가능성을 제시하였는바, 본 발명자들의 연구는 이로부터 출발하였다.
지금까지 이러한 XIST 유전자는 프로모터를 포함한 5’-end 부분이 Thymine과 Cytidine이 많은 유전자로써 중아황산염에 의해 개조(modify)되면 CpG 영역(site)을 제외한 모든 지역의 C는 T로 바뀌어서, 파이로시퀀싱을 위한 특정한 프라이머 제작시 G-C 함량(content)이 낮아 특정한 프라이머를 디자인하기가 매우 어려웠다. 그러나, 본 발명에 따라 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 특정한 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하면 XIST 유전자의 메틸화를 간편하고 정확하게 측정할 수 있는 것이다.
이러한 본 발명은 DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법에 있어서, 먼저 상기 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하는 단계를 거친다. 중아황산염을 처리하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 중아화산염 처리할 수 있는 키트를 이용할 수 있다. 이렇게 중아황산염을 처리하는 것은 상기 DNA 유전자 샘플에 있는 유전자 중에서 시토신(C)을 티민(T)으로 바꾸는 역할을 한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 사용되는 5'-end XIST 유전자의 염기서열과 CpG-1, CpG-2, CpG-3 및 각종 프라이머(primer) 를 나타내는 모식도이고, 도 2는 상기 5'-end XIST 유전자의 염기서열에 중아황산염 처리 전과 후의 염기서열을 나타내는 모식도이다. 여기에 도시된 바와 같이, 본 발명은 XIST 유전자, 특히 5'-end XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화를 측정하기 위한 것이고, 이를 위하여 중아황산염 처리를 함으로써 도 2에 나타난 바와 같이 5'-end XIST 유전자 중 시토신(C)이 티민(T)으로 전환되는 것이다.
중아황산염을 처리하여 개조(일명 modify라고 함)시키면, 5'end XIST 서열의 시토신(cytosine)은 모두 티민(thymine)으로 전환 되지만, 메틸화 되어 있는 시토신은 티민으로 전환되지 않고 그냥 시토신으로 남게 된다. 다시 말해서, 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플은 상기 DNA 유전자 중에서 메틸화되어 있지 않은 시토신(cytosine) 유전자는 티민(thymine)으로 전환되고, 메틸화되어 있는 시토신(C) 유전자는 티민(T)으로 전환되지 않은 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명은 이후 단계에서 이를 이용하여 메틸화 정도를 측정하는 것이다. 즉, 파이로시퀀싱으로 리딩(reading) 하여 나온 시토신 피크(Cytosine peak)를 측정하여 메틸화된 시토신의 양을 가늠하고, 티민 피크(Thymine peak)를 측정하여 비메틸화된 시토신을 가늠하기 위한 것이다.
본 발명은 먼저 상기 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하는 단계를 거치는 것이지만, 상기한 DNA 유전자 샘플을 얻기 위하여 인체 또는 동물의 세포주나 혈청 또는 혈액으로부터 DNA 유전자 샘플을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있 다. 그리하여, 상기 DNA 유전자 샘플은 인체의 세포주나 혈액 또는 혈청으로부터 채취된 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 혈청(serum)으로부터 DNA 유전자 샘플을 채취하는 경우, 혈청에 SDS와 프로티키나아제(proteinase) K를 처리하여 완전히 용해(lysis) 시킨 후, Phenol/Chloroform을 처리하고 ethanol precipitation 하여 gDNA를 추출(extraction)할 수 있다.
다음으로, 상기와 같이 중아황산염을 처리한 후에는 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻는 단계를 수행한다. PCR 방법을 수행하는 것은 DNA 유전자 샘플 중에서 우리가 원하는 5'-말단(end) XIST 유전자만을 증폭시키기 위한 것이다.
인체 또는 동물의 세포주나 혈청 또는 혈액으로부터 분리된 DNA 유전자 샘플은 중아황산염 처리를 거치었더라도, 특별한 유전자 서열 영역의 샘플이 아닌한 세포내 모든 gDNA로 분리되었을 것이고, 그렇기 때문에 우리가 원하는 5'-말단(end) XIST 유전자 영역을 특정한 프라이머를 이용하여 증폭시킴으로써 실험에 이용할 수 있는 것이다.
그리하여, 본 발명에 따른 메틸화 정도 측정방법은 DNA 유전자 샘플 중에서 5'-말단(end) XIST 유전자을 증폭시킬 수 있는 PCR 방법이면 가능하고, 그 중에서도 도 1에 나타난 바와 같은 5'-말단(end) XIST 유전자 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머로는 서열번호 2(5'-GTAGAGAATGATTTTGTAGTTAAGTTAAGG-3') 또는 서열번호 3(5'-ATCTTACCTCCCTAATTTAACTTAACAC-3')에 부합하는 유전자 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한 이후의 실험단계를 위한 정제과정의 효율 및 편리성을 높이기 위해, 비오틴(biotin)을 부착할 수 있다. 여기서, 서열번호 2는 정방향 프라이머(forward primer)를 나타낸 것이고, 서열번호 3은 역방향 프라이머(reverse primer)를 나타낸 것이며, 상기 서열번호에 부합한다고 하는 것은 도 2의 중아황산염이 처리된 염기서열에 나타난 바와 같이, 5' 방향으로부터 3'방향으로 염기서열 가닥을 복사 하기 위하여, 상기한 서열번호와 일치하거나 또는 상보적(complementary)인 염기서열을 가지는 것도 가능하다.
이를 통하여 증폭된 PCR 생산물은 5'-말단(end) XIST 유전자 서열을 포함하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 도 1에 나타난 바와 같이, 5'-말단(end) XIST 유전자 서열의 +871 위치부터 +1003 위치까지의 133개의 유전자 서열로 이루어진 것이 더욱 바람직하다. 이는 +871 위치부터 +1003 위치 사이에 존재하는 CpG-1, CpG-2 및 CpG-3를 포함하기 위함이다. 본 발명은 CpG-1, CpG-2 및 CpG-3에 존재하는 메틸화 정도를 측정하는 것이 가장 바람직하기 때문이다.
상기한 바와 같이, PCR 생산물을 얻은 후에는 상기 PCR 생산물을 서열번호 1 에 부합하는 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계;를 거치는 것이 특징이다.
본 발명에 따른 XIST 유전자는 프로모터를 포함한 5’-end 부분에 티민과 시토신을 많이 포함하고 있는 유전자이기 때문에, 중아황산염에 의해 개조(modify)되면 CpG 영역(site)을 제외한 모든 지역의 C는 T로 바뀌게 된다. 그래서, 파이로시퀀싱을 위한 특정한 프라이머 제작시 G-C 함량(content)이 매우 낮아 특정한 프라이머를 디자인하기가 매우 어려웠다. 이에, 본 발명은 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 특정한 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용함으로써, XIST 유전자의 메틸화를 간편하고 정확하게 측정하기 위한 것이다.
이를 위한 상기 서열번호 1(5'-GTTATTTTAGATTTGT-3')은 도 2에 나타난 바와 같이, 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플 중에서 5'-말단(end) XIST 유전자 서열의 +931 위치부터 +946 위치까지의 16bp로 이루어진 것이 바람직하다. 여기서, 상기 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 가진다고 하는 것은 상술한 바와 같이, 5' 방향으로부터 3'방향으로 염기서열 가닥을 복사 하기 위하여, 상기한 서열번호와 일치하거나 또는 상보적(complementary)인 염기서열을 가지는 것도 가능하다.
본 발명은 이러한 시퀀싱프라이머를 이용하여, 5'-말단(end) XIST 유전자 서열을 포함하는 PCR 생산물에 대해서 메틸화 정도를 측정하는 것이다. 상기 메틸화 정도를 측정하는 것은 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 CpG 아일랜드 부위의 메틸화 정도를 측정하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 상기 CpG 아일랜드 부위는 도 1과 도 2에 나타난 바와 같이, 5'-말단(end) XIST 유전자 서열의 +947 위치와 +948 위치(CpG-1) 또는 +956 위치와 +957 위치(CpG-2) 또는 +971 위치와 +972 위치(CpG-3)에 존재하는 것이 더욱 바람직하다.
왜냐하면, 5'-말단(end) XIST 유전자 서열 중 다른 위치(promoter를 포함한)의 CpG 부위(site)에 대한 메틸화 정도는 PCR 수행시 사용되는 PCR 프라이머와 파이로시퀀싱시에 사용되는 시퀀싱프라이머의 이차구조(secondary structure) 형성 등 PCR 조건의 제약 등으로 분석이 용이하지 않았기 때문이다. XIST 유전자가 중아황산염에 의해 개조(modify)되면 파이로시퀀싱을 위한 특정한 프라이머 제작시 G-C 함량(content)이 매우 낮아 특정한 프라이머를 디자인하기가 매우 어려워 진다. 본 발명자들은 수많은 실험과 연구의 노력 끝에, 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 특정한 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용함으로써, XIST 유전자의 메틸화를 간편하고 정확하게 측정할 수 있었다.
본 발명에 따르면, 5'-end XIST의 메틸화 분석 실험에서 중아황산염을 처리한 후(modified DNA) PCR된 생산물에 대해서만 파이로시퀀싱에의해 메틸화 정도를 측정할 수 있었으며, 중아황산염 처리를 하지 않은 PCR 생산물에 대해서는 파이로시퀀 싱에 의해 메틸화 정도를 측정 할 수 없었다. 중아황산염을 처리하여 개조(일명 modify라고 함)시키면, 5'end XIST 서열의 시토신(cytosine)은 모두 티민(thymine)으로 전환 되지만, 메틸화 되어 있는 시토신은 티민으로 전환되지 않고 그냥 시토신으로 남게 되기 때문에, 본 발명은 이를 이용하여 파이로시퀀싱으로 리딩(reading) 하여 나온 시토신 피크(Cytosine peak)를 통해 메틸화 정도를 측정할 수 있는 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 특정한 시퀀싱프라이머를 이용하여 파이로시퀀싱하는 것을 특징으로 하는바, 이러한 파이로시퀀싱은 상기 PCR 생산물을 정제(purify)하는 단계; 및 상기 정제된 PCR 생산물의 한가닥(single strand)을 주형으로 하여 상기 시퀀싱프라이머와 어닐링(annealing) 시킨 뒤, 중아황산염이 처리된 PCR 생산물의 염기서열을 리딩(reading)하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것이 특징이다.
이러한 파이로시퀀싱(pyrosequencing)은 DNA 시퀀싱(sequencing)에 이용되기도 하는 SNP 분석방법으로 DNA가 합성되는 동안 방출되는 무기인산(inorganic pysophosphate: PPi)의 빛(light)을 검출하는 방법이다. 중합반응(Polymerization)시 ４개의 dNTPs(deoxnucleotide triphosphates)를 한번에 하나씩 순차적으로 넣어서 반응시키면 중합되는 dNTP에 붙어 있는 무기인산(PPi)은 효소반응으로 빛을 방출한다.
이러한 파이로시퀀싱 방법은 종래의 디데옥시 뉴클레오티드 분석방법과 원리는 비슷하지만, 디데옥시 뉴클레오티드 분석방법은 32p로 표지된 dCTP와 TTP를 이용하여 PCR한 후 radiolabled products를 15% polyacrylamide gel에 loading 하여 autoradiadiographic film이나 phosphorimage 정량을 해야 하는 번거로움이 있다. 그러나, 본 발명에 따른 파이로시퀀싱 방법은 biotinylated PCR product를 bead를 이용하여 간단히 purify한 후 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 장치만으로 신속(25분 정도 소요)하고 정확하게 C 피크(peak)와 T 피크를 정량하고 수치화 하여 분석 해 주기 때문에 종래의 방법에 비해 빠르고 간편한 방법인 것이다. 방출된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 dNTP의 반응순서대로 신호 피크(signal peak)를 나타내고 그 신호 피크는 각각의 dNTP가 반응한 수에 비례하여 높아지고 낮아지는 경향(pattern)을 나타낸다.
이와 같이, 본 발명에 따라 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도를 측정하는 방법에 있어서, 상기 파이로시퀀싱은 PSQ(Pyrosequencing) 시스템에 의해 자동으로 시퀀싱되어 나온 시토신 피크를 이용하여 메틸화 백분율이 측정되는 것을 특징으로 하는 것도 가능하다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 메틸화 정도 측정방법을 이용하여, 암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 즉, 상기한 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법을 이용하여, 측정된 메틸화 정도에 따라 인간의 종양 또는 암의 존재 정도를 측정할 수 있는 암 진단 방법이다. 정상치와 비교하여 종양 또는 암의 존재하는 경우에는 XIST 유전자 서열에 나타나는 메틸화 정도가 다르기 때문이다.
예시적으로, 본 발명자들의 실험에 의해 확인된 바와 같이 상기 인간의 종양 또는 암의 존재 정도를 측정하는 것은 남성의 경우 정상 남성의 메틸화 정도보다 저메틸화(hypomethylation)되어 있으면 종양 또는 암이 존재하는 것이고, 여성의 경우 정상 여성의 메틸화 정도보다 고메틸화(hypermethylation)되어 있으면 종양 또는 암이 존재하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 윈한 또 다른 실시형태는 항암제의 항암활성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화(methylation) 정도를 측정하여 항암제의 항암활성을 측정하는 방법에 있어서, 상기 DNA 유전자 샘플에 항암제를 처리하는 단계; 상기 항암제가 처리된 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하는 단계; 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻는 단계; 및 상기 PCR 생산물을 서열번호 1에 상보적(complementary)인 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용 하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제의 항암활성을 측정하는 방법이다.
이렇게 항암제의 항암활성을 측정하는 방법은 DNA 유전자 샘플에 항암제를 처리하는 단계를 거치는 것을 특징으로 하여, 상술한 바와 같이 중아황산염 처리를 거친 후, 파이로시퀀싱을 수행하여 항암활성을 측정하는 것이다.
즉, 본 발명은 고메틸화(hypermethylation) 되어 있는 정상 남성 세포주(cell line)에 DNA methyltransferase(DNMT) inhibitor로 알려진 5-azaC(항암제)을 처리한 실험군 및 처리하지 않은 대조군의 XIST 5'-end DNA 유전자 영역을 분리하고, 상기 5'-end XIST 영역에 중아황산염 처리와 파이로시퀀싱을 수행하여, 5-azacytidine에 의한 5'-end XIST DNA의 비메틸화(unmethylation)로의 변화정도를 측정함으로써 파이로시퀀싱에 대한 정확성을 확인해 줄 수 있다. 동시에 이는 상기한 항암제의 항암활성을 측정하는 방법이기도 하다.
상기 항암제를 처리한 실험군 및 처리하지 않은 대조군의 5'-end XIST 유전자 영역을 분리하는 1 단계에서 5'-end XIST DNA 유전자 영역은 인간 정상 남성 세포주의 DNA를 주형으로 5'-end XIST DNA 유전자 영역에 특이적인 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 스크리닝(screening) 할 수 있다. 이 후 단계인 5'-end XIST DNA 에 중아황산염을 처리하고, 파이로시퀀싱을 수행하는 과정은 상기 메틸화 측정방법에서 상술한 방법과 동일한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 당업계에 잘 알려진 기존 방법 및 기술을 변형 또는 개량함으로써 수행가능하다.
상술한 바와 같이, 파이로시퀀싱으로써 메틸화 정도를 측정하여, 5'-end XIST DNA의 비메틸화(unmethylation)로의 변화정도를 계산함으로써, 항암제의 항암활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 있어서, 상기 항암제는 5-아자시티딘(5-Azacytidine), 5-데옥시-아자시티딘(5-deoxy-Azacytidine), 트리코스타틴 A(trichostatin A ; TSA), 데프시펩티드(depsipeptide), 발프로익산(valproic acid) 또는 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil)일 수 있고, 전혀 알려지지 않은 신규한 항암 후보 물질일 수도 있다. 어떠한 항암제로 처리하든지 메틸화 정도의 변화에 따라 상기 항암제의 항암활성을 가늠할 수 있기 때문이다.
실험결과, DNA 메틸화 inhibitor로 알려진 5-Azacytidine을 남성 세포주에 처리(10uM/ml)한 결과 DNA 메틸화는 5'-end XIST 부분의 3 CpG 부분 모두에서 평균 21.7% 감소하는 것을 정량 할 수 있었다. 즉, 상기한 항암제(5-Azacytidine)의 항암활성 정도를 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시형태는 인간의 종양 또는 암을 진단하기 위한 메틸화 측정 키트일 수 있다. 즉, DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화(methylation) 정도 측정하기 위한 것으 로, 상기 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하고, 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻으며, 상기 PCR 생산물에 대하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하기 위하여 서열번호 1에 상보적(complementary)인 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 포함하는 메틸화 측정 키트이다.
상기 서열번호 1에 상보적인 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 메틸화 측정 키트를 이용함으로써, 상술한 메틸화 측정방법에 따라 메틸화 정도를 측정하여, 인간의 종양 또는 암을 진단하기 위한 것이다. 이를 위하여, 본 발명에 따른 메틸화 측정 키트는 상기 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머로써 서열번호 2 또는 서열번호 3에 부합하는 유전자 서열을 가지는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
이렇게 본 발명은 종양 또는 암을 진단 할 수 있는 프라이머를 포함한 종양 또는 암 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 5'-end XIST 의 3개의 CpG 아일랜드를 포함하는 염기서열의 PCR(polymerase chain reaction)에 사용 할 수 있는 프라이머 세트를 포함한다. 본 발명의 조성물이 포함하는 프라이머 세트는 파이로시퀀싱 분석에 사용될 5'-end XIST 유전자의 일부분을 증폭하는데 사용된다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 사용하여 얻은 PCR 생성물의 파이로시퀀싱에 사용할 수 있는 시퀀싱프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하여, 상기 시퀀싱프라이머는 구체적으로 서열번호 1에 부합하는 염기서열을 가진다. 그리고, 상기한 PCR 방법을 위해 사용되는 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 구체적으로 서열번호의 2의 염기를 가지며, 역방향 프라이머는 구체적으로 서열번호 3의 염기서열을 가진다. 본 발명에서 프라이머는 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 증류수나 적절한 완충액에 용해된 상태로 제공될 수 있다. 또한 이후의 실험단계를 위한 정제과정의 효율 및 편리성을 높이기 위해, 비오틴(biotin)이 더 포함될 수 있다. 또한, 상기한 프라이머 이외에도, 필요에 따라 PCR 반응, 파이로시퀀싱 분석에 요구되는 성분들을 더 포함할 수 있다. 구체적으로 PCR 반응에 요구되는 성분은 dNTP(deoxynucleotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염 등이 될 수 있고, 시퀀싱에 요구되는 성분은 dNTP, sequenase 등이 될 수 있다.
이와 더불어서, 본 발명자들은 파이로시퀀싱의 정확성을 확인하기 위하여 5'-end XIST 부분이 고메틸화(hypermethylation) 된 DNA(male B-lymphoblastoid cells)와 저메틸화(hypomethylation) 된 DNA(prostate cancer cell line, DU145)를 농도별로 순차적혼합(serial mixing) 하여 파이로시퀀싱으로 의미있게 정량화 되는 것을 확인하였다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실험예 1: 혈청(Serum)으로부터 DNA 분리
남성 혈액(blood)을 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리(centrifugation) 한 후, 혈청(serum)을 분리하여 SDS와 proteinase K를 처리하고, 완전히 용해(lysis) 시킨 후, Phenol/Chloroform을 처리한 뒤, 에탄올 침전(ethanol precipitation)을 수행하여 gDNA를 분리, 추출(extraction) 하였다.
실험예 2: 세포(Cell)로부터 DNA 분리
정상 남성, 정상 여성, 여성 유방암 세포주(female breast cancer cell line:MCF7), 남성 전립선암 세포주(prostate cancer cell lines)를 5%의 이산화탄소, 37℃의 배양온도로 10% FBS, 1% 항생제를 포함한 RPMI-1640 배지에서 2일에 한 번씩 계대 배양하여 세포밀도가 70%에 도달했을 때, 세포를 수거(harvest)한 후, 키트(PUREGENETM Cell and Tissue kit. ; Gentra, Minneapolis, USA)를 사용하여 gDNA 를 분리, 추출하였다.
실시예 1: 중아황산염 처리와 PCR을 통한 변형된 XIST DNA 유전자 준비
상기한 실험예 1과 2에서 준비한 gDNA에 키트(EZ DNA methylation-Gold kit. ; Zymo Research, Orange, CA)를 이용하여 중아황산염(bisulfite)을 처리하였다.
그리고 난후, bioneer를 통해 제작한 서열번호 2와 서열번호 3에 부합하는 프라이머를 이용하여 당업계에서 통상적으로 이용되는 PCR(polymerase Chain reaction) 방법으로, 상기 중아황산염이 처리된 gDNA 유전자 샘플의 XIST 서열을 증폭하였다. 이 때, denature과정은 약 95℃의 온도에서 2분, annealing과정은 약 57℃의 온도에서 1분 30초, extension과정은 약 72℃의 온도에서 1분 동안 실시하고 이 과정을 50회 반복하였다. 이렇게 생산된 PCR 생산물(product)의 총부피는 50ul 로 하였으며 이 과정에서 사용한 polymerase는 AmpliTaq GoldTM)(Applied Biosystem, Roche)을 이용하였다. 또한 이후의 실험단계를 위한 정제과정의 효율 및 편리성을 높이기 위해, 비오틴(biotin)을 더 부착하였다.
본 실험에 사용한 정방향 프라이머(forward primer)는 하기와 같다.
서열번호 2: 5'-GTAGAGAATGATTTTGTAGTTAAGTTAAGG-3'
또한, 역방향 프라이머(reverse primer)는 하기와 같다.
서열번호 3: 5'-ATCTTACCTCCCTAATTTAACTTAACAC-3'
실시예 2: 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용한 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 수행
실시예 1에서 얻어진 PCR 생산물을 하기의 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 가진 시퀀싱프라이머를 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 이러한 시퀀싱프라이머는 본 발명자들의 오랜 연구와 노력끝에 발견한 것으로, CpG-1, CpG-2, CpG-3 부분을 보기에 최적으로 적합한 시퀀싱프라이머는 하기와 같다.
서열번호 1:5'-GTTATTTTAGATTTGT-3'
파이로시퀀싱은 PSQ 96MA 시스템(Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 자동적으로 시퀀싱하게 함으로써 메틸화 백분율을 측정하였다. 본 발명에서 사용한 메틸화 백분율은 하기 수학식 1과 같이 계산되었다.
[수학식 1]
메틸화 백분율 = cytosine(C) /(cytosine (C) + thymine (T) )× 100
본 발명자들은 남성과 여성의 혈청(serum)과 혈액(blood) 및 남성 전립선암 세포 (DU145), 여성 유방암 (MCF7)에서 5'-end XIST 안에 있는 3개의 CpG 영역의 메틸화 백분율(methylation percentage)을 파이로시퀀싱을 이용하여 정량하였다. 파이로시퀀싱에 대한 프라이머는 3개의 CpG 영역을 포함하여 증폭되도록 만들었다.
실시예 3: 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)의 결과
상기한 실시예 2에 따른 파이로시퀀싱 결과를 확인하였다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 의해 정상 남성과 정상 여성의 혈청(serum)에 존재하는 5'-end XIST 유전자, 특히 CpG-1, CpG-2, CpG-3 유전자 위치에 대한 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 정상 남성 혈청(N=14)의 3개 CpG 영역은 평균해서 87%, 97.4 %, 93.3%로 메틸화 되어 있으며, 여성 혈청(N=2)의 경우에는 도 3b에 나타난 바와 같이, 3개 CpG 영역 모두 평균 50%로 메틸화 된 것을 확인할 수 있었다. 도 3a 및 3b의 그래프에서 노란색 영역이 바로 3개 CpG 영역 즉, CpG-1, CpG-2, CpG-3 유전자 위치에 대응하는 것이고, 그래프 X 축 방향의 시퀀스 서열(C/TGTATAATTC/TGGTTTAGGGTTAGTC/TG)은 바로 도 2의 중아황산염이 처리된 후의 염기서열 중 CpG-1부터 CpG-3 유전자 위치까지의 결합을 의미하는 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 의해 정상 남성과 정상 여성의 EBV-transformed B-cells, 여성 유방암 세포주(breast cancer cell line)(MCF7), 남성 전립선암 세포주(prostate cancer cell lines)(DU145)의 5'-end XIST 유전자, 특히 CpG-1, CpG-2, CpG-3 유전자 위치에 대한 파이로시퀀싱 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에 도시된 바와 같이, 남성 EBV-trnasformed B-cells (n=3)에서 3개의 CpG sites의 메틸화 백분율은 각 각 83.3%, 97.2%, 89.6% 였지만 DU145 (남성 전립선암)은 60.6%, 84.8%, 75.8%로 남성 EBV-trnasformed B-cells보다 저메틸화(hypomethylation) 되어 있는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 여성 EBV-trnasformed B-cells(n=3)은 평균 48.7%, 54.7%, 54.3%로 메틸화 되었으나, 여성 유방암 세포(MCF7)는 각각 80.4%, 100%, 88.7%로 메틸화 됨으로써 정상 여성 EBV-trnasformed B-cells보다 고메틸화(hypermethylation) 되어 있음을 확인 할 수 있었다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 의해 혈청(serum)(XY-serum, XX-serum), EBV-tranformed B-cell(XX, XY), DU145, MCF7, 혈액(blood)(XY-blood, XX-blood)에서의 5'-end XIST 유전자, 특히 CpG-1, CpG-2, CpG-3 유전자 위치에 대한 파이로시퀀싱 결과를 정량화 하여 나타낸 그래프이다. 여기에 도시된 바와 같이, 특히 두 번째 CpG(CpG-2) 영역의 메틸화 백분율은 나머지 CpG(CpG-1 및 CpG-3) 영역보다 정상 남성 혈청(serum)과 정상 남성 혈액(blood)에서 높은 수치로 메틸화 되어 있는 것을 확인 할 수 있다.
실시예 4: 항암제의 항암활성 측정
상기한 실험예 1과 2에서와 같이 분리, 추출한 정상 남성 EBV-transfomed B-cell line(hypermethlyated XIST-5'end)에 5-azaC을 10uM/ml의 농도로 처리하고 24시간 동안 방치한 후, 실시예 2와 같은 방법으로 파이로시퀀싱을 동일하게 수행하였다. 실험의 유효성 및 반복재현성을 검증하기 위해서 5-azaC을 10uM/ml 처리한 실험을 세 번 반복하여 평균값을 계산하였다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 항암제의 항암활성을 측정하는 방법을 위해 5-아자시티딘(5-Azacytidine)을 처리한 정상 남성 세포주(cell line)에 대한 파이로시퀀싱 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에 도시된 바와 같이, 5-azaC를 처리하기 전 cell line의 CpG-1, CpG-2, CpG-3에 대한 메틸화 백분율은 92.7%, 92%, 80.4%이었고, 24 시간동안 5-azaC을 10uM/ml의 농도로 처리한 후의 CpG-1, CpG-2, CpG-3에 대한 메틸화 백분율은 69.5%, 71.2%, 59.2%로 감소하였다.
이러한 결과에 따라, DNA 메틸화 inhibitor로 알려진 5-Azacytidine을 처리하면, DNA 메틸화는 5'-end XIST 부분의 3 CpG 부분 모두에서 평균 21.7% 감소하는 것을 정량 할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 메틸화 측정방법은 유효하며, 상기한 항암제(5-Azacytidine)의 항암활성 정도를 확인할 수 있다.
실험예 3: 정상 남성 DNA와 전립선암 세포주의 DNA를 농도별로 섞어 파이로시퀀싱의 유효성을 확인
본 발명자들은 파이로시퀀싱을 이용한 5'-end XIST 의 CpG-1, CpG-2, CpG-3에 대한 메틸화 측정의 정확성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
실험은 5'-end XIST 부분이 고메틸화(hypermethylation) 된 DNA(male B- lymphoblastoid cells)와 저메틸화(hypomethylation) 된 DNA(prostate cancer cell line, DU145)를 농도별로 순차적혼합(serial mixing) 하면서 파이로시퀀싱을 수행하였다.
그 결과, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 메틸화 정도 측정방법에 의해 정상 남성 DNA에 전립선암 세포주 DNA를 0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%가 포함되도록 혼합하여, 5'-end XIST 유전자 대한 파이로시퀀싱 결과를 나타낸 그래프이다. 여기서, X 축은 Du145와 정상 XY의 순차적혼합 비율을 의미하고, Y 축은 XIST 5'-end의 메틸화 정도를 %로 표시한 것이다.
정상 남성(hypermethylation)의 CpG-1, CpG-2, CpG-3에 대한 메틸화 백분율은 73.6%, 100%, 91.7%이고, 전립선암 세포주(hypomethylation)의 CpG-1, CpG-2, CpG-3에 대한 메틸화 백분율은 60.6%, 84.3%, 75.8%로써, 두 샘플을 농도 별로 섞었을 때 유의성 있게 메틸화 정도가 변하는 것을 파이로시퀀싱 분석을 이용하여 확인 할 수 있었다. 즉, 두 샘플을 농도별로 섞어 메틸화의 변화정도를 측정함으로써 파이로시퀀싱의 정확도(accuracy)와 민감도(sensitivity)를 확인할 수 있었다.
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진에게 명백한 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법에 있어서, 상기 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하는 단계; 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻는 단계; 및 상기 PCR 생산물을 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법을 제공할 수 있다.
이러한 본 발명에 의하는 경우, 파이로시퀀싱에 적합한 특정한 시퀀싱프라이머를 이용함으로써, 종양(tumor)이나 암(cancer)을 초기에 신속하고 간편하게 진단하고, 이에 따라 적절한 치료를 가능하게 하며, 종양이나 암에 대한 진단 마커(marker)로써 유용하게 실용화할 수 있는 효과가 있다.
XIST 유전자는 프로모터를 포함한 5’-end 부분이 Thymine과 Cytidine이 많은 유전자로써 중아황산염에 의해 개조(modify)되면 CpG 영역(site)을 제외한 모든 지역의 C는 T로 바뀌어서, 파이로시퀀싱을 위한 특정한 프라이머 제작시 G-C 함량(content)이 낮아 특정한 프라이머를 디자인하기가 매우 어려웠다. 그러나, 본 발명에 따라 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 특정한 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하면 XIST 유전자의 메틸화를 간편하고 정확하게 측정할 수 있는 것이다.
또한, 이러한 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화(methylation) 정도 측정방법과 이를 이용한 암 진단 방법, 항암활성을 측정하는 방법 및 메틸화 측정 키트를 이용하여, 5'-end XIST 의 비정상메틸화(aberrant methylation) 정도를 빠르고 정확하게 측정함으로써, 질병의 조기 진단(early disease detection), 질병 위험도 평가(assessment of disease risk) 및 새로운 진단 마커(novel prognosis marker)로 다양하게 활용할 수 있다.
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Claims (19)

  1. DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST(X(Inactive)-Specific Transcription) 유전자 서열에 존재하는 메틸화(methylation) 정도 측정방법에 있어서,
    상기 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하는 단계;
    상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻는 단계; 및
    상기 PCR 생산물을 서열번호 1에 부합하는 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1은 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플 중에서 5'-말단(end) XIST 유전자 서열의 +931 위치부터 +946 위치까지의 16bp로 이루어진 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1에 부합하는 것은 서열번호 1과 일치하거나 상보적(complementary)인 것임을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 메틸화 정도를 측정하는 것은 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 CpG 아일랜드 부위의 메틸화 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 CpG 아일랜드 부위는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열의 +947 위치와 +948 위치(CpG-1) 또는 +956 위치와 +957 위치(CpG-2) 또는 +971 위치와 +972 위치(CpG-3)에 존재하는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 파이로시퀀싱은,
    상기 PCR 생산물을 정제(purify)하는 단계; 및
    상기 정제된 PCR 생산물의 한가닥(single strand)을 주형으로 하여 상기 시퀀싱프라이머와 어닐링(annealing) 시킨 뒤, 중아황산염이 처리된 PCR 생산물의 염 기서열을 리딩(reading)하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 파이로시퀀싱은 PSQ(Pyrosequencing) 시스템에 의해 자동으로 시퀀싱되어 나온 시토신 피크를 이용하여 메틸화 백분율이 측정되는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 부합하는 유전자 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 PCR 생산물은 5'-말단(end) XIST 유전자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 PCR 생산물은 5'-말단(end) XIST 유전자 서열의 +871 위치부터 +1003 위치까지의 133개의 유전자 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플은 상기 DNA 유전자 중에서 메틸화되어 있지 않은 시토신(cytosine) 유전자는 티민(thymine)으로 전환되고, 메틸화되어 있는 시토신(C) 유전자는 티민(T)으로 전환되지 않은 것을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 유전자 샘플은 인간의 혈액 또는 혈청으로부터 채취된 것임을 특징으로 하는 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화 정도 측정방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화(methylation) 정도를 측정하여 항암제의 항암활성을 측정하는 방법에 있어서,
    상기 DNA 유전자 샘플에 항암제를 처리하는 단계;
    상기 항암제가 처리된 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하는 단계;
    상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻는 단계; 및
    상기 PCR 생산물을 서열번호 1에 상보적(complementary)인 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)함으로써 메틸화 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제의 항암활성을 측정하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항암제는 5-아자시티딘(5-Azacytidine), 5-데옥시-아자시티딘(5-deoxy-Azacytidine), 트리코스타틴 A(trichostatin A ; TSA), 데프시펩티드(depsipeptide), 발프로익산(valproic acid) 또는 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil)인 것을 특징으로 하는 항암제의 항암활성을 측정하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 항암제는 신규한 항암 후보 물질임을 특징으로 하는 항암제의 항암활성을 측정하는 방법.
  18. DNA 유전자 샘플의 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 존재하는 메틸화(methylation) 정도 측정하기 위한 것으로, 상기 DNA 유전자 샘플에 중아황산염(bisulfite)을 처리하고, 상기 중아황산염이 처리된 DNA 유전자 샘플을 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킴으로써 PCR 생산물(product)을 얻으며, 상기 PCR 생산물에 대하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하기 위하여 서열번호 1에 상보적(complementary)인 유전자 서열을 갖는 시퀀싱프라이머(sequencing primer)를 포함하는 메틸화 측정 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 5'-말단(end) XIST 유전자 서열에 적합한 프라이머로써 서열번호 2 또는 서열번호 3에 부합하는 유전자 서열을 가지는 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 메틸화 측정 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20040015705A (ko) * 2000-09-01 2004-02-19 에피제노믹스 아게 게놈 디엔에이 시료의 서열 콘택스트 5'-씨피쥐-3'에서특정 시토신의 메틸화 정도 측정 방법

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