JP2004516821A - ゲノムＤＮＡ上の、配列コンテクスト５−ＣｐＧ−３内の特定シトシンのメチル化度の定量方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ゲノムＤＮＡ試料中の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’における、特定のシトシンのメチル化度の定量方法に関する。
【解決手段】ゲノムＤＮＡ試料の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’にある特定のシトシンのメチル化度を検出する方法である。第１段階ではゲノムＤＮＡが化学的に処理されるので、シトシン塩基はウラシルに変換されるが、５−メチルシトシン塩基は変換されない。次いで、前記特定のシトシンを含むゲノムＤＮＡの一部が増幅され、その際、増幅産物は実証し得る標識を施され、次の段階で、２種類のオリゴヌクレオチッドへの増幅産物のハイブリッド形成の程度が、増幅産物の標識検出によって決められ、ハイブリッド形成の結果、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合から、ゲノムＤＮＡにおける前記特定のシトシンのメチル化度を推定する。
【解決手段】ゲノムＤＮＡ試料の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’にある特定のシトシンのメチル化度を検出する方法である。第１段階ではゲノムＤＮＡが化学的に処理されるので、シトシン塩基はウラシルに変換されるが、５−メチルシトシン塩基は変換されない。次いで、前記特定のシトシンを含むゲノムＤＮＡの一部が増幅され、その際、増幅産物は実証し得る標識を施され、次の段階で、２種類のオリゴヌクレオチッドへの増幅産物のハイブリッド形成の程度が、増幅産物の標識検出によって決められ、ハイブリッド形成の結果、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合から、ゲノムＤＮＡにおける前記特定のシトシンのメチル化度を推定する。
Description
【０００１】
本発明は、ゲノムＤＮＡ試料中の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’における、特定のシトシンのメチル化度の検出方法に関する。
【０００２】
近年、分子生物学的方法が発達するにともない、遺伝子それ自体、ＲＮＡ内の遺伝子の翻訳、およびその結果生じる蛋白質などが、詳しく研究されている。個体が発達する間に、どの遺伝子が発現されているか、特定の細胞や組織のある遺伝子がどのように活性化され、あるいは抑制されているかは、遺伝子あるいはゲノムのメチル化の程度や特性と相関している。この意味で、病因となる状態は、個々の遺伝子あるいはゲノムのメチル化様式の変化に反映されているという仮説は説得力を持っている。
【０００３】
本発明は、与えられたＤＮＡ試料中の多数のシトシン塩基の５位がメチル基によって、どのように修飾されているかをハイブリッド形成（相補結合）を用いて同時に分析することを可能とする方法である。更に、本発明における発症している病気の診断や病気の前駆症状を発見する方法に核酸、オリゴヌクレオチド及びＰＮＡ―オリゴマーが有用である。
【０００４】
５−メチルシトシンは有核細胞のＤＮＡの中で、共有結合で修飾された塩基として、頻繁に存在する。例えば、転写の制御、ゲノム・インプリンティングや腫瘍発症に関与している。それゆえ、遺伝情報の現状としての５−メチルシトシンの把握には、多大の関心が寄せられている。しかし、５−メチルシトシンの位置はシーケンシング（配列解析）によっては同定できず、５−メチルシトシンはハイブリッド形成ではシトシンと同じ結果をもたらす。従って、どのシトシンが５−メチルシトシンとなっているかという発生機構的な情報はＰＣＲ増幅では完全に見落としてしまう。
【０００５】
ＣｐＧ島のメチル化は、しばしば転写不活性と同一視される。ＣｐＧ島が遺伝子のプロモーター中に存在するようにという、一義的指示が出されるが、全てのＣｐＧ島及びメチル化の部位は既知のプロモーター中に偏在しない。種々の、特異的な、印刷遺伝子ではＣｐＧ島は、かなりの距離を置いて、転写開始の方向に、上流に、偏在する。そして、多くの遺伝子は多段階プロモーターを有する。多数の発症例についてＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が原因であると指摘されている。古典的突然変異で、ＤＮＡのメチル化で、遺伝子のコードされた機能を変えることなしに塩基置換を書込む機能が問題となる。これら漸生説的修飾と古典的突然変異の間の交換は腫瘍遺伝子においては重要な役割を演ずる。例えば、病巣の過度のメチル化と一般的なゲノムメチル化は多くの異なる腫瘍の標識となる。腫瘍発生と腫瘍進行は過度のメチル化で誘発される変異原性及び他の、細胞増殖及び／または発生学的展開に必要な脱メチルにより制御される遺伝子の遮断、遺伝子の誘発される活性化、により惹起される。
【０００６】
遺伝性で、非ポリープ性のコロレクタール腫瘍では、例えば、変異陰性の大腸癌の大部分のケースは、ｈＭＬＨ１プロモーターの過剰なメチル化及びｈＭＬＨ１の接続的、非発現、一つの対の欠損の修復に起因する（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ ＲＡ，Ｓｉｍｐｓｏｎ ＡＪ，． Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｂｕｔ ｎｏ ｈＭＬＨ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｊｕｌ １５；８７（２）：２００〜３）。
肺癌の発症においては、発現の損失がＲＡＳ活性同族体の配列プロモーターにおけるＣｐＧ島のメチル化と相関している［Ｄａｍｍａｎｎ Ｒ，Ｌｉ Ｃ，Ｙｏｏｎ ＪＨ，Ｃｈｉｎ ＰＬ，Ｂａｔｅｓ Ｓ，Ｐｆｅｉｆｅｒ ＧＰ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＲＡＳ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｕｎｇｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｌｏｃｕｓ３ｐ２１．３．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ２０００ Ｊｕｌ；２５（３）：３１５〜９］。
ＬＫＢ１腫瘍抑制遺伝子の新生の、プロモーターの過度のメチル化を含む、不活性化はＰｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ 症候を含む［Ｅｓｔｅｌｌｅｒ Ｍ，Ａｖｉｚｉｅｎｙｔｅ Ｅ，Ｃｏｒｎ ＰＧ，Ｌｏｔｈｅ ＲＡ，Ｂａｙｌｉｎ ＳＢ，Ａａｌｔｏｎｅｎ ＬＡ，Ｈｅｒｍａｎ ＪＧ，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＫＢ１ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００ Ｊａｎ ６；１９（１）：１６４〜８］。
【０００７】
メチル化が関与する多くの発症は、その病因において、腫瘍抑制遺伝子ｐ１６またはｐ１５と密接な関係があることを示している。それで、マイコソポリープとｐ１６（ＩＮＫ４ａ）遺伝子の間の関係が認められている［Ｎａｖａｓ ＩＣ，Ｏｒｔｉｚ−Ｒｏｍｅｒｏ ＰＬ，Ｖｉｌｌｕｅｎｄａｓ Ｒ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｐ，Ｇａｒｃｉａ Ｃ，Ｇｏｍｅｚ Ｅ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＬ，Ｇａｒｃｉａ Ｄ，Ｖａｎａｃｌｏｃｈａ Ｆ，Ｉｇｌｅｓｉａｓ Ｌ，Ｐｉｒｉｓ ＭＡ，Ａｌｇａｒａ Ｐ，ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ．Ａｍ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０００ Ｍａｙ；１５６（５）：１５６５〜７２］。
胃癌のｐ１６遺伝子の転写の遮断と僅かな特殊なＣｐＧの位置の間の強い相関から出発している［Ｓｏｎｇ ＳＨ，Ｊｏｎｇ ＨＳ，Ｃｈｏｉ ＨＨ，Ｋａｎｇ ＳＨ，Ｒｙｕ ＭＨ，Ｋｉｍ ＮＫ，Ｋｉｍ ＷＨ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣｐＧ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｐ１６（ＩＮＫ４ａ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｊｕｌ １５；８７（２）：２３６〜４０］。
【０００８】
一次的硬化性の胆管炎と関連がある胆管癌の発症は、ｐ１６プロモーターに依存する、ｐ１６腫瘍抑制遺伝子の不活性化による。［Ａｈｒｅｎｄｔ ＳＡ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ＣＦ，Ｙｉｐ Ｌ，Ｒａｓｈｉｄ Ａ，Ｃｈｏｗ ＪＴ，Ｐｉｔｔ ＨＡ，Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ Ｄ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ９ｐ２１ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｐ１６ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ．１９９９ Ｊｕｎ １；８４（１）：８８〜９３］。
【０００９】
白血病遺伝子及び急性白血病の進行ではｐ１６遺伝子の過度メチル化による不活性化が一つの役割を演じる［Ｎａｋａｍｕｒａ Ｍ，Ｓｕｇｉｔａ Ｋ，Ｉｎｕｋａｉ Ｔ，Ｇｏｉ Ｋ，Ｉｉｊｉｍａ Ｋ，Ｔｅｚｕｋａ Ｔ，Ｋｏｊｉｋａ Ｓ，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ Ｋ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｎ，Ｋａｒａｋｉｄａ Ｎ，Ｋａｇａｍｉ Ｋ、Ｏ−Ｋｏｙａｍａ Ｔ，Ｍｏｒｉ Ｔ，Ｎａｋａｚａｗａ Ｓ，ｐ１６／ＭＴＳ１／ＩＮＫ４Ａ］遺伝子はしばしば、１１ｑ２３転位を伴う小児の急性白血病における過度のメチル化によって不活性化される。１９９９ Ｊｕｎ １３；（６）：８８４〜９０］。
【００１０】
更に、ｐ１６及びｐ１５遺伝子の過度のメチル化が骨髄性白血病の腫瘍遺伝子で決定的な役割を演じていることが自明のこととされている［Ｎｇ ＭＨ，Ｗｏｎｇ ＩＨ，Ｌｏ ＫＷ，ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９９Ａｕｇ；３４（５〜６）：４６３〜７２］。腎臓癌の発生原因に不活性ＶＨＬ−遺伝子のメチル化が重要な役割を演じている［Ｇｌａｖａｃ Ｄ，Ｒａｖｎｉｋ−Ｇｌａｖａｃ Ｍ，Ｏｖｃａｋ Ｚ，Ｍａｓｅｒａ Ａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＲＣＣ）．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．１９９６；４３１（６Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｒ１９３〜４］。
【００１１】
５’−ＣｐＧ島の異常なメチル化は鼻咽腔癌のｐ１６遺伝子転写不活性化に関与し得る［Ｌｏ ＫＷ，Ｃｈｅｕｎｇ ＳＴ，Ｌｅｕｎｇ ＳＦ，ｖａｎ Ｈａｓｓｅｌｔ Ａ，Ｔｓａｎｇ ＹＳ，Ｍａｋ ＫＦ，Ｃｈｕｎｇ ＹＦ，Ｗｏｏ ＪＫ，Ｌｅｅ ＪＣ，Ｈｕａｎｇ ＤＰ，Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ１６ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９６ Ｊｕｎ １５；５６（１２）：２７２１〜５］。肝細胞癌では、ｐ１６蛋白質の不活性化が指摘され、メチル化プロモーター及び同遺伝質欠失はここでは、よく起こるメカニズムである［Ｊｉｎ Ｍ，Ｐｉａｏ Ｚ，Ｋｉｍ ＮＧ，Ｐａｒｋ Ｃ，Ｓｈｉｎ ＥＣ，Ｐａｒｋ ＪＨ，Ｊｕｎｇ ＨＪ，Ｋｉｍ ＣＧ，Ｋｉｍ Ｈ，ｐ１６は肝細胞癌における主要な不活性化ターゲットである。Ｃａｎｃｅｒ ２０００ Ｊｕｌ １；８９（１）：６０〜８］。
【００１２】
遺伝子発現の制御としてのメチル化は乳癌のＢＲＣＡ１遺伝子であると報告されている［Ｍａｇｄｉｎｉｅｒ Ｆ，Ｂｉｌｌａｒｄ ＬＭ，Ｗｉｔｔｍａｎｎ Ｇ，Ｆｒａｐｐａｒｔ Ｌ，Ｂｅｎｃｈａｉｂ Ｍ，Ｌｅｎｏｉｒ ＧＭ，Ｇｕｅｒｉｎ ＪＦ，Ｄａｎｔｅ Ｒ，ＢＲＣＡ１の５’末端ＣｐＧ島の部分的メチル化は体細胞の遺伝子発現の抑制に関連する。ＦＡＳＥＢＪ．２０００ Ａｕｇ；１４（１１）：１５８５〜９４］。メチル化と非ホジキン氏リンパ腫との相関が認められている［Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｄｅｌｇａｄｏ Ｂ，Ｒｉｃｈａｒｔ Ａ，Ｇａｒｃｉａ ＭＪ，Ｒｏｂｌｅｄｏ Ｍ，Ｏｓｏｒｉｏ Ａ，Ｃｅｂｒｉａｎ Ａ，Ｒｉｖａｓ Ｃ，Ｂｅｎｉｔｅｚ Ｊ，非ホジキン氏リンパ腫の追跡における疾病標識としてのｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１５ｉｎｋ４ｂ遺伝子の過メチル化 、Ｂｒ Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００ Ａｐｒ；１０９（１）：９７〜１０３］。
【００１３】
ＣｐＧのメチル化はＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の発現低下に関連するＴ細胞白血病の進行を惹起する、［Ｎｏｓａｋａ Ｋ，Ｍａｅｄａ Ｍ，Ｔａｍｉｙａ Ｓ，Ｓａｋａｉ Ｔ，Ｍｉｔｓｕｙａ Ｈ，Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｍ，ＣＤＫＮ２Ａの遺伝子のメチル化の増加は成人Ｔ細胞白血病の進行に関連する。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ １５；６０（４）：１０４３〜８］。
【００１４】
［Ｓａｌｅｍ Ｃ，Ｌｉａｎｇ Ｇ，Ｔｓａｉ ＹＣ，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｊ，Ｋｎｏｗｌｅｓ ＭＡ，Ｆｅｎｇ ＡＣ，Ｇｒｏｓｈｅｎ Ｓ，Ｎｉｃｈｏｌｓ ＰＷ，Ｊｏｎｅｓ ＰＡ，膀胱癌のＣｐＧ島の新たなメチル化における進行的増加。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｍａｙ １；６０（９）：２４７３〜６］。食道扁平細胞癌の転移不活性化は、その疾病の進行に影響を与えるＦＨＩＴ遺伝子のメチル化と関連する［Ｓｈｉｍａｄａ Ｙ，Ｓａｔｏ Ｆ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｇ，Ｙａｍａｓａｋｉ Ｓ，Ｋａｔｏ Ｍ，Ｍａｅｄａ Ｍ，Ｉｍａｍｕｒａ Ｍ，壊れやすいヒスチジン３つ組遺伝子の発現ロスは食道扁平細胞癌の進行と関連するが、これは患者の予後や喫煙歴とは無関係である。Ｃａｎｃｅｒ． ２０００ Ｊｕｌ １；８９（１）：５〜１１］。
【００１５】
中性の蛋白質分解酵素２４．１１（ＮＥＰ）は男性ホルモンに依存しない前立腺癌の増殖に関与する神経蛋白質の増殖を不活性化する。ＮＥＰプロモーターの過メチル化による、ＮＥＰ発現のロスは神経蛋白質に刺激される男性ホルモンに依存しない前立腺癌の発生を助長する［Ｕｓｍａｎｉ ＢＡ，Ｓｈｅｎ Ｒ，Ｊａｎｅｃｚｋｏ Ｍ，Ｐａｐａｎｄｒｅｏｕ ＣＮ，Ｌｅｅ ＷＨ，Ｎｅｌｓｏｎ ＷＧ，Ｎｅｌｓｏｎ ＪＢ，Ｎａｎｕｓ ＤＭ，ヒトの前立腺癌の中性蛋白質分解酵素の遺伝子プロモーターのメチル化。Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｍａｙ；６（５）：１６６４〜７０］。
【００１６】
発生途上の副腎皮質癌は腫瘍ＤＮＡの異常構造を示す。この異常構造は、ＩＧＦ２遺伝子の過発現下で、この座で、ＤＮＡの脱メチル化と相関する［ＷｉｌｋｉｎＦ，Ｇａｇｎｅ Ｎ，Ｐａｑｕｅｔｔｅ Ｊ，Ｏｌｉｇｎｙ ＬＬ，Ｄｅａｌ Ｃ，小児性副腎皮質腫瘍：インシュリン類似成長因子ＩＩ遺伝子の過発現、ＪＣｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２０００ Ｍａｙ；８５（５）：２０４８〜５６．Ｒｅｖｉｅｗ］。網膜芽腫ＤＮＡで多くのポリヌクレオチッド配列のメチル化が発病に関与していることが認められている、［Ｍａｎｃｉｎｉ Ｄ，Ｓｉｎｇｈ Ｓ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ Ｐ，Ｒｏｄｅｎｈｉｓｅｒ Ｄ，網膜芽腫遺伝子（ＲＢ１）の突然変異としてのメチル化ＣｐＧジヌクレオチッド。Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９７ Ｊｕｌ；６１（１）：８０〜７］。
【００１７】
慢性骨髄性白血病の場合はｐ５３遺伝子とメチル化見本の間で、発病が速くなることとの関連が推定されている。［Ｇｕｉｎｎ ＢＡ，Ｍｉｌｌｓ ＫＩ，慢性骨髄性白血病進行における、ｐ５３突然変異、メチル化及びゲノム安定性。Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９７Ｊｕｌ；２６（３〜４）：２１１〜２６］。また、急性骨髄性白血病の場合はメチル化との関連性が実証されている［Ｍｅｌｋｉ ＪＲ，Ｖｉｎｃｅｎｔ ＰＣ，Ｃｌａｒｋ ＳＪ、急性骨髄性白血病における多段遺伝子のＤＮＡ過メチル化の現状、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９ Ａｕｇ１；５９（１５）：３７３０〜４０］。
【００１８】
ウィルムス腫瘍（幼児期の腎臓の腫瘍）のサプレッサー遺伝子における腫瘍特異性のメチル化の位置が同定された［Ｋｌｅｙｍｅｎｏｖａ ＥＶ，Ｙｕａｎ Ｘ，ＬａＢａｔｅ ＭＥ，Ｗａｌｋｅｒ ＣＬ，ウィルムス腫瘍のサプレッサー遺伝子における腫瘍特異性のメチル化の位置の同定、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９８ Ｆｅｂ １２；１６（６）：７１３〜２０］。バーキットリンパ種では２、３のプロモーターが完全なＣｐＧメチル化を示す［Ｔａｏ Ｑ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＫＤ，Ｍａｎｎｓ Ａ，Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ Ａ，Ａｍｂｉｎｄｅｒ ＲＦ，バーキットリンパ種におけるＥＢウィールス（ＥＢＶ）：初期腫瘍膜、血液の分子的分析。１９９８Ｆｅｂ．１５；９１（４）：１３７３〜８１］。甲状腺癌では、ＤＮＡメチル化がある役割を演じることが認められている［Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ ＧＭ，Ｙａｔｉｎ Ｍ．Ｍａｒｃｉｎｅｋ Ｒ，Ａｉｎ ＫＢ，：脱分化された甲状腺癌におけるヨード摂取の回復、ヒトＮａ＋／Ｉ−ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ遺伝子のメチル化状態ヘの関係、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，１９９９ Ｊｕｌ；８４（７）：２４４９〜５７］。
【００１９】
メチル化が関連するのは癌の発症だけではなく、多くの、癌以外の発症にも関連する。炎症性関節炎の研究では、この病気の発症が、ゲノムＤＮＡのメチル化と関連することが指摘されている［Ｋｉｍ ＹＩ，Ｌｏｇａｎ ＪＷ，Ｍａｓｏｎ ＪＢ，Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ Ｒ，炎症性関節炎におけるＤＮＡの低メチル化：ＪＬａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．１９９６ Ａｕｇ；１２８（２）：１６５〜７２］。ＩＣＦ症候にはメチル化の制御発現の関連が指摘されている［Ｋｏｎｄｏ Ｔ，Ｂｏｂｅｋ ＭＰ，Ｋｕｉｃｋ Ｒ，Ｌａｍｂ Ｂ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｎａｒａｙａｎ Ａ，Ｂｏｕｒｃ’ｈｉｓ Ｄ，Ｖｉｅｇａｓ−Ｐｅｑｕｉｇｎｏｔ Ｅ，Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｍ，ＨａｎａｓｈＳＭ，ＩＣＦ症候における全ゲノムメチル化スキャン：非附随体ＤＮＡリピートＤ４Ｚ４及び ＮＢＬ２の低メチル化］。全身の皮膚結核エリテマトースヘのメチル化の関与が推定され［Ｖａｌｌｉｎ Ｈ，Ｐｅｒｅｒｓ Ａ，Ａｌｍ ＧＶ，Ｒｏｎｎｂｌｏｍ Ｌ，全身の皮膚結核エリテマトースの偽ＩＦＮ−αインデユーサー結合における対二重鎖ＤＮＡ、対身及び免疫刺激性プラスミドＤＮＡ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９ Ｄｅｃ １；１６３（１１）：６３０６〜１３］、筋ジストロフィー症とＣｐＧ島の間の関連も推定されている［Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｓｉｎｇｈ ＰＢ，Ｒａｓｂｅｒｒｙ Ｃ， Ｃａｔｔａｎａｃｈ ＢＭ，Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｉｎｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｈ１９ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｐｅｒｍａｔｏｚａ．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ．２０００ Ｆｅｂ；９０（２）：２１７〜２６；Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ Ｍ ，Ｌｅｈｒａｃｈ Ｈ，Ｎａｔｕｒ １９８６ Ｄｅｃ；１７；３２４（６０９７）：５８２〜５］。
【００２０】
発症の形成に関与する、蛋白質前駆アミロイドメチル化の効果はアルツハイマーの発症によると推定される［Ｗｅｓｔ ＲＬ，Ｌｅｅ ＪＭ，Ｍａｒｏｕｎ ＬＥ Ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ａｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９５；６（２）：１４１〜６］。また、メチル化の状態は染色体レベルで重要な役割を演じる。例えば、染色体Ｘの脆弱性と結合する精神的遅延症候では、染色体の脆弱性の程度はメチル化によって決まる［ｄｅ Ｍｕｎｉａｉｎ ＡＬ，Ｃｏｂｏ ＡＭ，Ｐｏｚａ ＪＪ，Ｓａｅｎｚ Ａ，（ＤＮＡの不安定に起因する疾病）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉａ．１９９５， Ｄｅｃ；１０ 補巻１：１２〜９］。
【００２１】
ＤＮＡ上の５−メチルシトシンについて、比較的新しく、且つ、最も頻繁に応用されている確認方法は、重亜硫酸塩がシトシンに特異的に反応することに基づいている。シトシンは、アルカリ加水分解後にウラシルに転換されるが、ウラシルは、相補的塩基対をつくる際の骨格としてはチミジンと同様である。これに対して、５−メチルシトシンは、このような条件下では修飾されない。このため、元のＤＮＡが置換されても、相補的塩基対をつくる骨格としては、本来シトシンと区別されず、メチルシトシンは「従来」の分子生物学的技術、例えば増幅とハイブリッド形成あるいは配列解析によって、本来の、単一のシトシンとして検出される。これらの技法は全て、相補的塩基対に基づいており、今日広く活用されている。この技術の感度面での基準は次の方法で評価される。実験対象のＤＮＡをアガロース・マトリックスに包入し、こうして、ＤＮＡの拡散と再結合を防止する（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡとのみ反応する）。そして沈殿と洗浄処理を高速透析によって行う（Ｏｌｅｋ， Ａ．らＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６，２４，５０６４〜５０６６）。この方法によって、ひとつ、ひとつの細胞を調べることができ、その潜在的能力を評価できる。事実、現在までのところ、約３，０００塩基対ぐらいまでの個別領域しか調べられておらず、何千という細胞を全体的にメチル化分析することは不可能であった。また、この手法は微量の試料中の小さい断片について信頼できる分析結果を出すことができなかった。これは、マトリックスによる拡散防止にもかかわらず、その喪失がおきるためである。５−メチルシトシンを検出するという、一般的な課題の解決方法に関して、考察が次のレビューに掲載されている：Ｒｅｉｎ Ｔ．，ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ， Ｍ． Ｌ．， Ｚｏｒｂａｓ Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９８，２６，２２５５．
【００２２】
重亜硫酸塩法は、今日までのところ、数少ない例外（例：Ｚｅｃｈｎｉｇｋ， Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．１９９７，５，９４〜９８）を除いて研究には使用されなかった。既知の遺伝子の特定部分を増幅し、更に、完全に配列を解析する（Ｏｌｅｋ， Ａ．とＷａｌｔｅｒ Ｊ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１７，２７５〜２７６）とか、個別のシトシンの位置をプライマー伸張反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ， Ｍ． Ｌ．とＪｏｎｅｓ， Ｐ．Ａ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５， ２５２９〜２５３１， ＷＯ− Ｐａｔｅｎｔ９５００６６９）や、制限酵素切断法（Ｘｉｏｎｇ Ｚ． とＬａｉｒｄ Ｐ．Ｗ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７， ２５， ２５３２〜２５３４）で確認することは、ますます簡便になってきている。その上更に、ハイブリッド形成による確認も行われ、記述されている（Ｏｌｅｋ ら， ＷＯ−Ａ９９／２８４９８）。
【００２３】
重亜硫酸塩法を個別の遺伝子でのメチル化の確認に応用した例は、Ｘｉｏｎｇ ＺとＬａｉｒｄ Ｐ．Ｗ．（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５３２、Ｇｏｎｚａｌｇｏ， Ｍ．Ｌ．とＪｏｎｅｓ， Ｐ．Ａ．（１９９７）， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５２９； Ｇｒｉｇｇ， Ｓ．とＣｌａｒｋ，Ｓ．（１９９４），Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １６，４３１； Ｚｅｓｃｈｎｉｋ， Ｍ．ら（１９７７），Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，３８７； Ｔｅｉｌ， Ｒ．ら（１９９４）， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，６９５； Ｍａｒｔｉｎ， Ｖ．ら （１９９５），Ｇｅｎｅ １５７，２６１； ＷＯ−Ａ９７／４６７０５，ＷＯ−Ａ９５／１５３７３及びＷＯ−Ａ９５／４５５６０などで発表されている。
【００２４】
オリゴマー配列の合成における現在の技術水準についての概観は、１９９９年１月に、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓの別冊（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２１，１９９９年１月）、ならびにこの文献の中で引用されている文献に掲載されている。
【００２５】
固定されたＤＮＡ配列の解析のためには、種々の蛍光識別を施した試薬が用いられる。とりわけ、蛍光識別に適しているのは、各プローブの５’−ＯＨ基に色素のＣｙ３あるいはＣｙ５を単に結合させることである。ハイブリッド形成（相補結合）されたプローブの蛍光の検出は、例えば共焦点顕微鏡を用いて行われる。色素のＣｙ３とＣｙ５は、他の多くの色素と同様市販されている。
【００２６】
レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）が開発され、生体分子の分析効率が非常に高い［Ｋａｒａｓ， Ｍ．とＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ， Ｆ．（１９８８），分子量が１０，０００ダルトンを超えているタンパク質のレーザー脱着イオン化，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９〜２３０１］。分析対象が脱離を起こすマトリックスの中に混和される。短いレーザーパルスによってマトリックスは気化し、分析対象分子は気体相へと蒸散する。マトリックス分子の衝突によって分析対象物がイオン化する。加えられた電圧によってイオンは加速され、無電場の管へと送りこまれる。異なる質量に基づいて、イオンは異なった加速度を受ける。より小さなイオンは、より大きなイオンよりも早く検出部に到達する。
【００２７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 分析装置は、ペプチドや蛋白質の分析に、非常に適している。核酸の分析はそれよりやや難しい［Ｇｕｔ Ｉ．Ｇ．， とＢｅｃｋ， Ｓ．（１９９５），ＤＮＡ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ １：１４７〜１５７］。核酸の場合は、感度はペプチドの場合の約１００倍低く、断片が大きくなるに従って、更に、低下する。複雑な負電荷を持つ骨格を有する核酸にとっては、マトリックスを用いたイオン化法は極めて非効率的である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析装置ではマトリックスの選択が、非常に重要な役割を担っている。ペプチドからの放出に関しては、いくつかの効率のよいマトリックスが見つかっているが、それらは非常に微細な結晶化によって合成される。ＤＮＡに関しても、興味深いマトリックスが存在するのは事実であるが、感度の向上には到っていない。ＤＮＡを化学的に修飾し、ペプチドに似た形にすることによって、感度を向上させることができる。ホスホチオエート核酸では、骨格の通常のリン酸はチオリン酸によって置換されているが、これは単純なアルキル化反応によって中性電荷のＤＮＡに変換される［Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．とＢｅｃｋ， Ｓ．（１９９５）， Ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１３６７〜１３７３］。修飾されたＤＮＡに「電荷タグ」をカップリングすることにより感度はペプチドの場合に匹敵する程度にまで向上する。加えて、電荷タグの利点は、修飾されていない基質の検出を極めて難しくする異物混入を防ぎ、その安定性を向上させる点である。
【００２８】
ゲノムＤＮＡは、細胞、組織または他の検査試料のＤＮＡから定法により採集できる。この定法は、ＦｒｉｔｓｃｈとＭａｎｉａｔｉｓのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）といった参考文献に記載されている。
【００２９】
本発明は上記のような従来技術の問題点に鑑み、与えられたＤＮＡ試料中に存在する、多数のシトシン塩基の５位にメチル基が結合している状態を、ハイブリッド形成によって同時に検出することを可能とする、非常に高効率、且つ、信頼度の高い方法を提供することを課題とするものである。そのためには、オリゴヌクレオチッド及びＰＮＡオリゴマーが準備され、これらについては、発症及び疾病の素因の診断方法を実施するために、遺伝学上及び／または新生のパラメーターの解析によるのが特に好ましい。
【００３０】
本発明において遺伝学上のパラメーターとは、請求項に於ける核酸の突然変異及び同質異象（配列ＩＤ１から４０７１２まで）及びそれらの制御のために、更に必要な配列である。特に、突然変異、挿入、欠失、点・突然変異、逆位、及び同質異象、とりわけＳＮＰｓ（単独ヌクレオチッド同質異象）が挙げられる。同質異象は挿入、欠失または逆位でもあり得る。
【００３１】
本発明において新生のパラメーターとは、特に、シトシンのメチル化及び、更に、請求項に於ける核酸のＤＮＡ塩基の化学変化（配列ＩＤ１から４０７１２まで）及びそれらの制御のために更に必要な配列である。更に、新生のパラメーターは、例えば、前記方法で間接的に分析でき、再度のＤＮＡのメチル化とは関連しない、ヒストンのアセチル化である。
【００３２】
本発明は、ゲノムＤＮＡ試料中の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’ 内の少なくとも一つの特定シトシンのメチル化度を分析するのに役立ち、また、多数の異なるメチル化位置をも同時に分析する場合、特に有効である。
【００３３】
本発明の課題は、ゲノムＤＮＡ試料の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’における特定のシトシンのメチル化度の検出方法により解決される。
即ち、その方法は以下の通りである。ａ）ゲノムＤＮＡを処理して、シトシン塩基をウラシルに変換する一方、５−メチルシトシンは変換せず、ｂ）ゲノムＤＮＡ中、前記特定シトシンを含む部分を増幅し、この際、増幅産物には検出可能な標識を与え、ｃ）２種類のオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーの少なくとも１種類の配列上で増幅産物のハイブリッド形成が起きるようにし、ｄ）増幅産物が２種類のオリゴヌクレオチド上にハイブリッド形成している量を、増幅産物の標識を検出することで同定し、ｅ）ハイブリッド形成の結果、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合から、ゲノムＤＮＡにおける前記特定のシトシンのメチル化度を推定する。
【００３４】
特に、本発明のｃ）においては、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、第２のオリゴマーは前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成する。２種類のオリゴマーのうちの１種は、例えば、一つのＣＧを中央に含有するオリゴヌクレオチッドで形成することができ、他の１種は一つのＴＧ（または一つのＣＡ、対向する鎖に）を中央に含有するオリゴヌクレオチッドで形成される。オリゴマー配列の残りの部分は上記２種類の間で一致する。この場合、メチル化での亜硫酸塩による変換のように、第１のオリゴヌクレオチッド配列に（調べる特定のシトシンについて）、ハイブリッド形成される。逆に、第２のオリゴヌクレオチッド配列では非メチル化での亜硫酸塩による変換のように、ハイブリッド形成される。
【００３５】
特に、本発明のｃ）においては、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、配列には優先度を下げ、第２のオリゴマーは前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成され、第２のオリゴマーは増幅産物に本質的に、前記ゲノムＤＮＡ中の特定のシトシンのメチル化度に依存せずにハイブリッド形成される。
【００３６】
特に、本発明のｃ）においては、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、配列には優先度を下げ、第２のオリゴマーは前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成され、第２のオリゴマーは増幅産物に本質的に、前記ゲノムＤＮＡ中の特定のシトシンのメチル化度に依存せずにハイブリッド形成される。
【００３７】
この場合、第２のオリゴマーは増幅産物に本質的に、シトシンのメチル化度の特異性に依存することなく、増幅産物の一つの位置にメチル化され得ないシトシンの位置に対応してハイブリッド形成される。従って、最終的に増幅産物の濃度のみがハイブリッド形成の強さを決める。調べるべき特定のシトシンンのメチル化度によって、第１のオリゴヌクレオチッドへのハイブリッド形成が為される。
【００３８】
本発明はゲノムＤＮＡ試料に対してのみならず、同様にして前記特定のシトシンがメチル化されているのではなく、むしろメチル化されていない標準ＤＮＡに対してこれを用い、メチル化されていないＤＮＡを用いて測定した際に、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合をメチル化度０の標準値として用い、同様にして、メチル化されているＤＮＡを用いて測定することにより２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合をメチル化度１の標準値として用い、これらの標準値をゲノムＤＮＡ試料のメチル化度の同定に使用することが好ましい。
【００３９】
使用される標準ＤＮＡ試料及びゲノムＤＮＡから形成される増幅産物は区別できる標識を施されている。使用される標準ＤＮＡ試料は区別できる標識を再度施されている。
【００４０】
本発明においては、異なるゲノムＤＮＡ試料からの、異なる標識を含んでいる増幅産物について、この場合、それが２種類のオリゴヌクレオチッドを含んでいても、２種類のオリゴヌクレオチッドで同時に異なる試料を測定できる。
【００４１】
異なる検出方法から得られる値の伝達について測定精度の上昇を達成するために、同じゲノムＤＮＡ試料からの増幅産物に異なる標識を含有させる。これは例えば、異なるフルオレスセンス色素で標識することによって達成できる。この場合の測定は、個々のフルオレスセンス色素の放出波長用に多数の導管を備えたフルオレスセンススキャナにより行われる。
【００４２】
本発明においては、標識化はフルオレスセンスによる標識化である。
【００４３】
更に、前記標識として蛍光マーカーを用いることが非常に好ましい。これにより、前記標識を、化学発色、紫外線吸収あるいは蛍光分極によって同定する。
【００４４】
本発明においては重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）の溶液を用いて化学処理を施すことが非常に好ましい。
【００４５】
本発明においては増幅のためにオリゴヌクレオチッドを使用し、このオリゴヌクレオチッドは、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２までの、化学処理されたＤＮＡの、少なくとも、塩基長１８の断片である。重亜硫酸塩で処理したＤＮＡに相補的プライマーを使用し、相補的プライマーは、制御可能で、続いてメチル化について調べられ得る、領域（ＣｐＧ島）を増幅することが確実に行われる。
【００４６】
本発明におけるハイブリッド形成において、オリゴヌクレオチッド及び／またはペプチッド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ＝ＰＮＡ）オリゴマーが使用される。これらは、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２までの、化学処理されたＤＮＡの中の少なくとも塩基長９の配列断片にハイブリッド形成するか、または、これらに対応して、塩基配列が、少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含有し、ＣｐＧジヌクレオチッドがオリゴマー中の、約１／３の量存在する。これらオリゴヌクレオチッドは、本発明の方法に従って、特異的なＣｐＧのメチル化度を調べるのに好適である。これらオリゴヌクレオチッドは、適切なシトシンの位置にメチル化されたゲノムＤＮＡ試料由来の、処理済みＤＮＡの増幅産物に、結合させることが好ましい。
【００４７】
標識として放射性核種を使用することが好ましい。
【００４８】
更に、標識としてマススペクトル計で同定可能で、分離可能な、質量標識を使用することが好ましい。
【００４９】
本発明においては、ＰＣＲ産物全体またはその特徴ある断片をマススペクトル計で同定し、その質量によって一義的に特定することが好ましい。
【００５０】
本発明においては、オリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）が特に配列５’−ＣＧ−３’を含むことが好ましい。
【００５１】
本発明においては、オリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）が特に配列５’−ＴＧ−３’及び／または配列５’−ＣＡ−３’を含むことが好ましい。
【００５２】
更に、本発明においては、第１のオリゴヌクレオチドが５’−ＣＧ−３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドが５’−ＴＧ−３’配列、及び／または５’−ＣＡ−３’配列を含むことも、更に強く推奨される。第１と第２の種類のオリゴヌクレオチドが共通の固体相上に固定されていることが好ましい。更に、また、オリゴヌクレオチドが直角あるいは六角形の網目状の平坦な固体相上に配列されており、固体相上での特定のオリゴヌクレオチドの位置が、それぞれの配列と関連づけられていることが好ましい。
【００５３】
更に、本発明においては、第１及び第２の種類のオリゴヌクレオチドが、個別に、実証可能な標識のセットでコード化されるビーズ上に固定される。この標識はビーズの同定のために、即ち、適切なビーズに結合する配列に役立つ。ビーズに結合している増幅産物は、増幅産物に結合している他の標識により、同定される。ビーズによる上記測定を行うための器具は、例えば、ルミネックス社製がある。
【００５４】
本発明の方法においてはｂ）段階を以下に述べるように２つの段階に分けて実施することが特に好ましい。
ａ）請求項１に従って前処理されたＤＮＡ試料に非特異的にハイブリッド形成し、更に、ＰＣＲ段階で一つ以上の増幅産物を生ずる、異なる配列を有する、少なくとも、一対のプライマーを用いたＰＣＲ準備増幅、
ｂ）請求項１に従って前処理されたＤＮＡ試料［（＋）−鎖あるいは（−）−鎖］の一片と同じであるか、または逆に相補的であり、増幅されるＤＮＡに特異的にハイブリッド形成する、異なる配列のプライマーを有する、準備増幅において生じた産物のＰＣＲ増幅。
【００５５】
ハイブリッド形成過程で本発明との関連で、二つの、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（定律）Ｒｅｇｅｌｎに完全に反する相補的ＤＮＡ単独鎖が、塩基のない対の発生なしに理解される。この場合ウラシルはチミンとみなされる。
【００５６】
多数のＤＮＡ断片の増幅を、一つの反応容器内で実行することが、更に、好ましい。
【００５７】
増幅には耐熱性のＤＮＡ複製酵素（ポリメラーゼ）を使用することが、更に、好ましい。増幅に使用するプライマー・オリゴヌクレオチドはＴ、Ａ、Ｃ塩基のみか、あるいは、Ｔ、Ａ、Ｇ塩基のみを含むことが特に好ましい。
【００５８】
異なる配列コンテクスト中の少なくとも１０のＣｐＧ位置が同時に分析できることも、好ましい。異なる配列コンテクスト中の少なくとも５０のＣｐＧ位置が同時に分析できることが、特に好ましい。異なる配列コンテクスト中の少なくとも１００のＣｐＧ位置が同時に分析できることが非常に好ましい。異なる配列コンテクスト中の少なくとも５００のＣｐＧ位置が同時に分析できることが更に、好ましい。異なる配列コンテクスト中の少なくとも１，０００のＣｐＧ位置が同時に分析できることが最も好ましい。
【００５９】
細胞系列、血液、喀痰、糞便、尿、脳脊椎液、あるいは眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、***、肝臓などからとったパラフィンに封入された組織、組織学的標本、あるいはこれらの可能な混合物からゲノムＤＮＡ試料を得る手法が、好ましい。
【００６０】
患者あるいは各個人の身体にとって悪影響を与える症状の診断あるいは予後診断のために、本発明の方法の使用が望まれる。これらの悪影響を与える症状は以下のカテゴリーの少なくとも一つに含まれる、即ち、薬品の好ましくない副作用；ガン；中枢神経系の機能障害、損傷、疾病；攻撃性症状あるいは運動障害；脳損傷からくる臨床的、心理学的、社会学的結果；心理的障害および人格障害；痴呆及び／または関連する症候群；心臓循環器系疾患、機能障害、損傷；消化管の機能障害、損傷、疾患；呼吸器系の機能障害、損傷、疾患；外傷、炎症、感染、免疫及び／または回復；発達過程の異常としての身体の機能障害；損傷、疾患、皮膚、筋肉、結合組織、骨の機能障害；傷、疾患；内分泌、代謝の機能障害、損傷、疾患；頭痛あるいは性的機能障である。
【００６１】
複数種類の細胞あるいは組織の分離、あるいは細胞分化研究のための本発明の方法の使用が、更に、好ましい。
【００６２】
ここに提案する発明の対象は、重亜硫酸塩を含む試薬、増幅産物合成のためのプライマー・オリゴヌクレオチド及び／または主に固体相上に固定されたオリゴヌクレオチド及び本発明の方法を実行するための説明書である。プライマーオリゴヌクレオチッド及び固定されたオリゴヌクレオチッドは前記のように配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２である。
【００６３】
細胞系列、血液、喀痰、糞便、尿、脳脊椎液、あるいは眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、***、肝臓などからとったパラフィンに封入された組織、組織学的標本、あるいはこれらの可能な混合物からゲノムＤＮＡ試料を得ることが好ましい。
【００６４】
この方法により、第１の操作ではＤＮＡ試料が化学的に処理され、５−メチルシトシン塩基を除いて、全てのシトシン塩基がウラシルに変換される。この化学的処理は、重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）の溶液によって行われることが好ましい。
【００６５】
この操作方法は、ゲノムＤＮＡ試料だけでは実行できず、むしろ同様にして、前記の特定シトシン位置がメチル化されているか、されていないか既知であるような標準ＤＮＡを主に必要とする。
【００６６】
本発明の方法の第２の操作では、前記特定シトシンを含むゲノムＤＮＡの一部が増幅される。この操作は、以下の二段階の操作で実行するのが好ましい。
【００６７】
１．はじめに、異なる配列を有する、少なくとも一対のプライマーを用いて、ＰＣＲ準備増幅を実行し、化学的に前処理されたＤＮＡにハイブリッド形成する。この前処理では、シトシン塩基がウラシルに変換され、５−メチルシトシン塩基は変換されないように行う。
２．次に、前増幅で生産された産物のＰＣＲ増幅として、異なる配列のプライマーを用いて増幅を行う。プライマーは化学的に前処理されたＤＮＡ［（＋）−鎖あるいは（−）−鎖］の一片に同方向あるいは逆方向に相補的であって、増幅しようとするＤＮＡに特異的にハイブリッド形成し、増幅産物は、検出可能な標識を含む。
【００６８】
本発明の方法の下記の第３の操作では、増幅産物が二種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方にハイブリッド形成する。第１のオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＧ−３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧ−３’配列及び／または５’−ＣＡ−３’配列を含む。第１と第２の種類のオリゴヌクレオチドは、主として、共通の固体相上に固定される。オリゴヌクレオチドは直角あるいは六角形の網目上の平らな固体相に配列され、特定のオリゴヌクレオチドの固体相上の位置は、それぞれの配列と関連づけられている。
【００６９】
第１のオリゴヌクレオチドは、前記の特定シトシンがゲノムＤＮＡの中でメチル化されている場合ゲノムＤＮＡの化学的処理の結果として生ずる配列に優先的にハイブリッド形成する。第２のオリゴヌクレオチドは、前記の特定シトシンがゲノムＤＮＡの中でメチル化されていない場合、ゲノムＤＮＡの化学的処理の結果として生じる配列に優先的にハイブリッド形成する。
【００７０】
多数のＤＮＡ断片の増幅は、単一の反応容器内で実行することが好ましい。主に耐熱性のＤＮＡ複製酵素を用いてＰＣＲ反応による増幅を行うことが好ましい。
【００７１】
増幅に使用されるプライマー・オリゴヌクレオチドはＴ、Ａ、Ｃ塩基のみ、またはＴ、Ａ、Ｇ塩基のみを含むことが好ましい。
【００７２】
第４の操作は、増幅産物の２種類のオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成の程度は、増幅産物の標識を検出することで同定される。標識は、蛍光標識、放射性物質、あるいは質量分析装置で測定できる分離可能な質量標識を用いることが非常に好ましい。標識は主に化学発光、紫外線吸収あるいは蛍光分極によって検出される。ＰＣＲ産物は、全部同時に、あるいは、特徴的な断片が、質量分析装置で検出できる。これにより、ＰＣＲ産物はその質量によって明瞭に同定される。
【００７３】
最終操作では、ハイブリッド形成の結果、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合から、ゲノムＤＮＡ試料内の前記の特定シトシンのメチル化度が同定される。
【００７４】
メチル化されていない標準ＤＮＡを用いて測定された、２種類のオリゴヌクレオチドに検出される標識の割合が、主としてメチル化度０の標準値として使用される。
【００７５】
同様に、メチル化された標準ＤＮＡを用いて測定された、２種類のオリゴヌクレオチドに検出される標識の割合が、主としてメチル化度１の標準値として使用される。これらの標準値を、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化度の同定に使用することが好ましい。
【００７６】
標準値の同定には、多種類の既知の標準ＤＮＡも同様に使用可能であって、それら各々について、前記特定シトシンのメチル化度が知られている。
【００７７】
本発明の方法は、異なる配列コンテクストにおける少なくとも１０のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることを特徴とする。更に、異なる配列コンテクストにおける少なくとも５０のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることが好ましい。その上、異なる配列コンテクストにおける少なくとも１００のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることが好ましい。異なる配列コンテクストにおいて、少なくとも５００のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることが好ましい。最終的には、異なる配列コンテクストにおいて、少なくとも１，０００のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることが非常に好ましい。
【００７８】
ここに述べる手法は、患者あるいは各個人にとって有害な症状の診断あるいは予後診断に使用されることが望まれる。これらの有害な症状は以下のカテゴリーの少なくとも一つに含まれる、即ち、薬品の副作用；ガン；中枢神経性の機能障害、損傷、疾病；攻撃性症状あるいは運動障害；脳損傷からくる臨床的、心理学的、社会学的結果；心理的障害および人格障害；痴呆および／または関連する症候群；心臓循環器系疾患、機能障害、損傷；消化管の機能障害、損傷、疾；、呼吸器系の機能障害、損傷、疾患；外傷、炎症、感染、免疫および／または回復；発達過程の異常としての身体の機能障害、損傷、疾患；皮膚、筋肉、結合組織、骨の機能障損傷、疾患；内分泌、代謝の機能障害、損傷、疾患；頭痛あるいは性的機能障害である。
【００７９】
ここに述べる方法は、複数種類の細胞や組織の分別、細胞分化の研究に使用することが好ましい。
【００８０】
２種類の定義されたオリゴヌクレオチドの種類、例えばＣＧ／ＴＧを含む配列のハイブリッド形成の割合は、未知の組織試料全体のハイブリッド形成の程度とは別に同定することができる。
【００８１】
未知の組織試料に対する補正のため、メチル化されていない比較標本と、メチル化されている比較標本を標準として使用する。
【００８２】
本発明によれば、重亜硫酸塩を含む試薬、増幅産物合成のためのプライマーオリゴヌクレオチド、及び／または固体相上に固定されたオリゴヌクレオチドで構成される、ある種のキットとして実現される。第１のオリゴ・ヌクレオチドは５’−ＣＧ−３’配列を含む。第２のオリゴヌクレオチドは５’−ＴＧ−３’及び／または５’−ＣＡ−３’配列を含む。このキットには、本発明の方法の実行にあたっての説明書も含まれる。
【００８３】
本発明の対象として更に、核酸が好ましい。
【００８４】
本発明の対象として、化学的に前処理されたゲノムＤＮＡ（配列ＩＤ１から４０７１２）における、シトシンのメチル化度の検出に使用される、少なくとも１０のオリゴマーｓｏｎｄｅ（オリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマー）がある。遺伝及び／または新生パラメーターのデータ分析が、これらゾンデ（Ｓｏｎｄｅ）により疾病の診断や特定の疾病素質の診断に使用できる。
【００８５】
また、本発明の対象として、処理済みのＤＮＡで配列ＩＤ１から４０７１２のものであって、少なくとも１８塩基長の配列断片がある。この１８塩基対長の、配列ＩＤ１から４０７１２の配列断片は処理済みのゲノムＤＮＡの増幅に利用される。この断片の検出には少なくとも９ヌクレオチッド長のオリゴマーが使用される。
【００８６】
オリゴマーは少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む。対応するＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンは、オリゴマーの約１／３の量存在する。各ＣｐＧジヌクレオチッド毎に少なくとも配列ＩＤ１から４０７１２のオリゴヌクレオチッドが存在する。
【００８７】
オリゴマーは、好ましくは、担体上に固定された配列で作製される。このとき、少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合する。オリゴマーゾンデの固相への結合方法は専門家が承知している。
【００８８】
この関連の中で、重要なことは、請求項に記載されている核酸（配列ＩＤ１からＩＤ４０７１２）の遺伝及び／または新生のパラメーターの診断のために、個々のＣｐＧジヌクレオチッドではなく、配列中に存在する相当多数のＣｐＧジヌクレオチッドが分析されねばならぬということである。本発明の、特に好ましい他の方法において、配列中に存在する全てのＣｐＧジヌクレオチッドが調べられねばならぬ。
【００８９】
全てのオリゴマーゾンデは同じ鎖長を有する。好ましくは、全て１８オリゴマーで、これは、中央に一つのＣＧジヌクレオチッドを有し、配列ＩＤ１からＩＤ４０７１２の塩基対にハイブリッド形成する。
【００９０】
本発明の他の方法では、少なくとも１０個のオリゴマーがシトシンのメチル化度及び／または単独のヌクレオチッド−ポリモルフィスム（ＳＮＰｓ）によって化学処理されたゲノムＤＮＡの検知に使用される。
【００９１】
オリゴマーは、以下の諸症状の診断に使用される。即ち、薬品の副作用；ガン；中枢神経性の機能障害、損傷、疾病；攻撃性症状あるいは運動障害；脳損傷からくる臨床的、心理学的、社会学的結果；心理的障害および人格障害；痴呆および／または関連する症候群；心臓循環器系疾患、機能障害、損傷；消化管の機能障害、損傷、疾；、呼吸器系の機能障害、損傷、疾患；外傷、炎症、感染、免疫および／または回復；発達過程の異常としての身体の機能障害、損傷、疾患；皮膚、筋肉、結合組織、骨の機能障損傷、疾患；内分泌、代謝の機能障害、損傷、疾患；頭痛あるいは性的機能障害等がメチル化サンプルの分析により診断される。
【００９２】
発症の診断または特定の発症の疾病素因の診断に用いる遺伝及び／または新生のパラメーターのデータの分析のために、少なくとも一つが、配列記録にリストアップされた核酸またはその重要な部分（配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２）によって使用される。
【００９３】
オリゴマーの配列においてウラシルをチミンと交換するのは同様の目的を満たすものであるが、このことは専門家には理解できる。
【００９４】
分析されるゲノムＤＮＡは十分なＤＮＡの供給源を有する。即ち、細胞系列、血液、喀痰、糞便、尿、脳脊椎液、あるいは眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、***、肝臓などからとったパラフィンに封入された組織、組織学的標本、あるいはこれらの可能な混合物からゲノムＤＮＡ試料を得ることが好ましい。
【００９５】
本発明の対象は化学前処理された、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２のＤＮＡで、少なくとも１８塩基長の配列断片を有する核酸である。
【００９６】
本発明の対象は化学処理されるＤＮＡ中のメチル化度の検出用のオリゴマー［オリゴヌクレオチッドまたはＰｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）］であり、少なくとも９ヌクレオチッドの長さの塩基配列を少なくとも有し、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の化学処理されたＤＮＡにハイブリッド形成される。そのとき、本発明においては、塩基配列が少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含むことが好ましい。更に、好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンがオリゴマーの約１／３量存在する。
【００９７】
本発明の対象は、本発明におけるオリゴマーの、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドに、少なくとも一つのオリゴマーが含有されるというデータである。更に、オリゴマーの配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の一つのＣｐＧジヌクレオチッド毎に一つのオリゴマーが含有されるというデータである。
【００９８】
本発明の対象は、少なくとも二つの核酸のデータであって、二つの核酸は、本発明における、少なくとも配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の一つまたはその断片の増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチッドとして、投入される。その際、好ましくは、少なくとも一つのオリゴヌクレオチッドが固相に結合している。
【００９９】
本発明の対象は、シトシンのメチル化度及び／または化学的前処理された、ゲノムＤＮＡの、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の、単独ヌクレオチッド−ポリモルフィスム（ＳＮＰｓ）の検出用オリゴマーゾンデである。これは、少なくとも１０の本発明における前記オリゴマーである。
【０１００】
本発明の対象は、更に、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の、ＣｐＧジヌクレオチッドのメチル化度に関連する発症、分析用の各種オリゴマーの担体上の固定配列の方法であり、そこでは、少なくとも、本発明における一つのオリゴマーが固相に結合している。
【０１０１】
本発明の対象は、固相に結合する本発明における各種のオリゴマーの配列である（Ａｒｒａｙ）。
【０１０２】
本発明の対象は、異なるオリゴヌクレオチッドの配列及び／またはＰＮＡオリゴマー配列であり、このとき、これらは正方形または六角形の網目状の平坦な固相表面上に配列される。このとき、好ましくは、固相表面がシリカ、ガラス、ポリスチロール、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。
【０１０３】
本発明は発病の原因となる、少なくとも前記核酸と同じ内容の遺伝子のメチル化度に関連する分析用のＤＮＡ及び／またはＰＮＡ配列に関する。
【０１０４】
【実施例】
本発明を以下の実施例により更に詳しく説明する。
【０１０５】
［実施例１］
メチル化されていないＤＮＡと完全メチル化されたＤＮＡの合成、および重亜硫酸塩の処理の説明
【０１０６】
完全メチル化されたＤＮＡの合成のために、ヒトのゲノムＤＮＡをＳ−アデノシル・メチオニンとＣｐＧメチル化酵素（ＳｓｓＩ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を説明書に従って使用する。メチル化されていないＤＮＡの合成のために、遺伝子ＥＬＫ−１（受入れ番号ｅｐ５９０１１）をヒトのゲノムＤＮＡに由来するプライマー、ＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＡＡＣＣＧＴＡ及びＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧを用い、ＰＣＲ増幅する。こうして合成され、メチル化されたＤＮＡ、メチル化されていないＤＮＡは、ヒトのゲノムＤＮＡと同様に、重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）による変換処理を受け、５位でメチル化されていないシトシンが全て変換され、相補的結合骨格としては、異なる塩基が生じる。その一方、５位がメチル化されたシトシンは変換されずに残る。反応には、０．１Ｍから６Ｍの濃度範囲の重亜硫酸塩が使用され、メチル化されていないシトシン塩基上に付加される。その上、変性のための薬品、溶媒およびラジカル供与体が加えられる。続いておきるアルカリ加水分解の結果、メチル化されていないシトシン核酸塩基からウラシルへの変化がおきる。変化しなかったＤＮＡはメチル化されているシトシンの検出のために使用される。
【０１０７】
［実施例２］
Ｃｙ５で標識されたプローブの合成の説明
【０１０８】
重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡを基に、ＥＬＫ−１遺伝子のプロモーター領域上で５２９塩基対の長さを持つある特定の断片が増幅される（受入れ番号ｅｐ５９０１１）。増幅は、プライマー・オリゴヌクレオチドＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ とＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴを用いて行う。蛍光色素Ｃｙ５で標識されたプライマー・オリゴヌクレオチドを使用することで、断片はＰＣＲを行う際に標識される。マトリックスＤＮＡとして、重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）で処理された（１）メチル化されていないＤＮＡ、（２）完全メチル化されたＤＮＡ、（３）ヒトゲノムＤＮＡが変換される。続いて、これら３種類の異なるＤＮＡは、別々にハイブリッド形成され、特定のＣｐＧ位置のメチル化度が分析される。
【０１０９】
［実施例３］
ハイブリッド形成とハイブリッド形成されるＤＮＡチップの開発の説明。
【０１１０】
実施例２で合成されたプローブは、ＤＮＡチップ上でハイブリッド形成される。チップには、まずオリゴ・ヌクレオチドが固定されている。このオリゴ・ヌクレオチド配列は実施例２で述べたＥＬＫ−１遺伝子の増幅された断片の一部であり、ＣＧジヌクレオチドとその近傍の配列に相当する。オリゴヌクレオチドの長さは１４から２２ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド内のＣＧジヌクレオチドの位置は可変である。ハイブリッド形成後、ＤＮＡチップは走査され（図１を参照）、ハイブリッド形成信号が数値として読み取られる（データは示されていない）。オリゴヌクレオチドＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡとＣＴＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡを図１と図２に示す。増幅産物の位置１０３にあるＥＬＫ−１断片のシトシンがメチル化されている場合はＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡがハイブリッド形成し、このシトシンがメチル化されていない場合はＣＴＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡがハイブリッド形成することが好ましい。
【０１１１】
図１は、ＥＬＫ−１断片とハイブリッド形成を行った後のＤＮＡチップを示す。スキャンを行ったあとと同じような、疑似色の像が描画される。ここに示した白黒のコピーと異なり、スキャナーではカラー像が生み出される。異なる色の光強度がハイブリッド形成の程度を示す。ハイブリッド形成の程度は赤（図１では明るい点に見える）から青（図１では暗い点に見える）へと減少する。
【０１１２】
図２Ａは、図１の一部を切り出したものである。ハイブリッド形成の概要を明確にするために、スポットとして検出された一対のオリゴヌクレオチドに白く縁取りをつけたのがｃｔａｃｔｃａａｃａａａａａｃａａａ（左）とｃｔａｃｔｃａａｃｇａａａａｃａａａ（右）である。
図２Ｂの部分写真は、組織標本の未知のメチル化状態であり、部分写真図２Ｃは完全メチル化された比較標本のメチル化状態を示す。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
平均値は、それぞれ波長６３５ｎｍに対して求められている。表１に示すように、試料Ａ欄はメチル化されていない試料の値、試料Ｂ欄は組織標本の未知のメチル化状態、試料Ｃ欄は完全メチル化された比較標本の値を示す。ＣＧ／ＣＡの値はそれぞれの試料のメチル化度を表す。０．７４という値は、この試料が本質的には完全にメチル化されていることを意味する。
【０１１５】
［実施例４］
特定のＣＧ位置のメチル化を調べる遺伝性の非ポリープ性結腸・直腸癌に関連するｈＭＬＨ１遺伝子断片に関する。
【０１１６】
先ず第１段階で、遺伝配列が重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）等で処理され、塩基の５位置がメチル化されていない全てのシトシンが化学変化する。塩基対の状態が異なる塩基が生成する。一方、５位置がメチル化されているシトシンは変化しない。この反応には濃度範囲０．１〜６モルの重亜硫酸塩が使用され、非メチル化シトシン塩基に付加される。そこに変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤が添加される。続いて、アルカリ加水分解により非メチル化シトシン塩基がウラシルに変化する。これら変化したＤＮＡがメチル化シトシンの存在を証明するのに役立つ。
第２段階では、ＤＮＡ試料は水または水溶液で希釈される。続いて、ＤＮＡの脱スルフォン（１０〜３０分、９０〜１００℃）がアルカリ性のｐＨ値で行われる。
第３段階では、ＤＮＡ試料をポリメラーゼ鎖反応、好ましくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで増幅する。この実施例ではｈＭＬＨ１遺伝子のシトシンは、１５５１塩基対という大きな５’両側領域で、調べられる。これは特殊なプライマーオリゴヌクレオチッドＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧ及びＴＴＧＡＴＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＣで規定される、７１９塩基長の断片で増幅される。この増幅産物はこれまで固相に結合しているオリゴヌクレオチッドに、複製構造の形成下、ハイブリッド形成する試料として働く。例えば、ＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧ、実証すべきシトシンは増幅産物の５８８位置に存在する。ハイブリッド形成産物の検出はＣｙ３及びＣｙ５フルオレスセンス標識された、増幅に使用された、プライマーオリゴヌクレオチッドによる。もし、重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡがメチル化シトシン位置を提示するならば、増幅されたＤＮＡのハイブリッド形成へオリゴヌクレオチッドが作用する。調べるべきシトシンのメチル化度はハイブリッド形成産物で決定される。
【０１１７】
［実施例５］
アガロースビーズを使用した重亜硫酸塩処理ＤＮＡの作製
【０１１８】
この実施例で、重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡからの、ＥＬＫ−１遺伝子（受付番号ｅｐ５９０１１）のプロモーター領域の５２９塩基対の長さの、規定された断片が増幅される。フルオレスセンス色素ＡＬＥＸＡ４８８で標識されているプライマーオリゴヌクレオチッドのＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴ、の使用により断片は直接ＰＣＲで標識される。第１のオリゴヌクレオチッド（ここでは、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ）及び第２のオリゴヌクレオチッド（ここでは、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴ）は、ビーズの表面に固定され、これは個々の色素コードで区別される。次の段階で、前記プライマーオリゴヌクレオチッドで作製されたＥＬＫ−１遺伝子の増幅産物、両者の混合物がビーズに添加され、その際、増幅産物が固定されたオリゴヌクレオチッドに対して、ここでは、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ及びＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴが、その際、証明すべきＣまたはＴが増幅産物の４７６位置にあるが、ハイブリッド形成される。続いて、ビーズがばらばらにされ、色素コードによるフルオレスセンスの測定で同定され、フルオレスセンス色素ＡＬＥＸＡ４８８に固有のフルオレスセンス強度の測定により、ハイブリッド形成の程度が確認される。
【０１１９】
［実施例６］
内部補償用の多種類の色素の使用
【０１２０】
重亜硫酸塩で処理したＤＮＡにより、５２９塩基長で規定される、ＥＬＫ−１遺伝子プロモーター領域の断片が増幅される。フルオレスセンス標識されたプライマーオリゴヌクレオチッド、ＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴ、を使用することにより、この断片がＰＣＲで直接標識される。熱循環器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＧｍｂＨ製）上で行われるＰＣＲ反応では、１０ｎｇの重亜硫酸塩処理ＤＮＡ、６ｐｍｏｌづつのプライマー、２００μＭづつのｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ＵのＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ（Ｑｉａｇｅｎ ＡＧ製）が添加される。他の条件は製造者の指示により選択される。増幅については、変性が１４分、９６℃で行われ、それに続いて、６０秒、９６℃；４５秒、５５℃；７５秒、７２℃の条件で３０循環される。締めくくりは、１０分、７２℃で放置される。この実施例で試料は、健常者及び患者の組織をＣｙ２色素で標識する。メチル化度の内部補償には、試料増幅用の、フルオレスセンス色素Ｃｙ３及びＣｙ５で標識された、プライマーオリゴヌクレオチッドが使用される。補償用の試料の増幅産物はメチル化状態を代表して表す。即ち、１００％メチル化された状態及び他に、メチル化されていない状態である。この方法において、フルオレスセンス色素の色素強さの関係は、Ｓｃａｎ配列４０００ＸＬ、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ製Ｂｉｏ Ｃｈｉｐを使用して測定され、２種類のオリゴヌクレオチッド、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ及びＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴが、その際、証明すべきＣまたはＴが増幅産物の４７６位置にあるが、計算され、未知の試料のメチル化状態の非メチル化状態に対する比が確認される。
【０１２１】
［実施例７］
試料装入量及び分析複雑性を高めるための多種類の色素の使用
【０１２２】
この実施例は２、３のハイブリッド形成の過程で分析し、試料装入量を高めるのに役に立つ。それには、ＥＬＫ−１遺伝子プロモーター領域の、４個の個体によって、重亜硫酸塩で処理したＤＮＡの、５２９塩基長の、規定される、断片が、プライマーオリゴヌクレオチッド、ＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴで増幅される。この４個の個体に由来する断片は、４種類のフルオレスセンス色素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２及びＣｙ７で標識され、そして、固定されたヌクレオチッド、この場合、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ及びＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴに対し、このとき、証明すべきＣ及びＴが増幅産物の４７６の位置にあるが、ハイブリッド形成される。この、異なるフルオレスセンス標識された試料は、続いて、双方ではなく、一つのフルオレスセンス色素に基づく、異なる波長で分析される。
逆に、一つのＤＮＡ試料から、識別し得る、異なる色素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２、これは、ここでは標識された断片であるが、を得ることができる。６４の遺伝子（データ１）を有するオリゴヌクレオチッドゾンデの一つが、チップ上に固定されると、特殊性が十分になり、６４、例えば、Ｃｙ３を標識された、断片が相互に独立して分析できる。ここで、試料（データ１）がフルオレスセンス色素Ｃｙ３で、試料（データ２）がフルオレスセンス色素Ｃｙ５で、標識され（データ３はＣｙ２で）ることにより、メチル化度が増幅産物の６４増幅産物と同様に、高い複雑性にもかかわらず、信頼できるデータとして検出される。
【０１２３】
［実施例８］
実験的に複製の可能性を実証するための多種類色素の使用
【０１２４】
この実施例では同じＰＣＲ増幅産物が４種類のフルオレスセンス色素で標識され、４倍の過剰になることが実証されている。それには、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡからの、ＥＬＫ−１遺伝子の、プロモーター領域の塩基長５２９の断片がプライマーオリゴヌクレオチッド、ＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴ、で増幅され、固定されるオリゴヌクレオチッド、ここでは、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ及びＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴ、に対して、このとき、証明すべきＣ及びＴが増幅産物の４７６の位置にあるが、ハイブリッド形成される。色素Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２及びＣｙ７でフルオレスセンス標識されたプライマーオリゴヌクレオチッドを使用することにより、異なるフルオレスセンス標識された試料の関係が比較でき、この方法により、高い実験信頼性が得られる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＥＬＫ−１断片とハイブリッド形成した後のＤＮＡチップを示す。
【図２】
図２Ａは、図１の一部を切り出したものであり、図２Ｂは、組織標本の未知のメチル化状態を示す部分写真図であり、図２Ｃは、完全メチル化された比較標本のメチル化度を示す部分写真図である。
本発明は、ゲノムＤＮＡ試料中の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’における、特定のシトシンのメチル化度の検出方法に関する。
【０００２】
近年、分子生物学的方法が発達するにともない、遺伝子それ自体、ＲＮＡ内の遺伝子の翻訳、およびその結果生じる蛋白質などが、詳しく研究されている。個体が発達する間に、どの遺伝子が発現されているか、特定の細胞や組織のある遺伝子がどのように活性化され、あるいは抑制されているかは、遺伝子あるいはゲノムのメチル化の程度や特性と相関している。この意味で、病因となる状態は、個々の遺伝子あるいはゲノムのメチル化様式の変化に反映されているという仮説は説得力を持っている。
【０００３】
本発明は、与えられたＤＮＡ試料中の多数のシトシン塩基の５位がメチル基によって、どのように修飾されているかをハイブリッド形成（相補結合）を用いて同時に分析することを可能とする方法である。更に、本発明における発症している病気の診断や病気の前駆症状を発見する方法に核酸、オリゴヌクレオチド及びＰＮＡ―オリゴマーが有用である。
【０００４】
５−メチルシトシンは有核細胞のＤＮＡの中で、共有結合で修飾された塩基として、頻繁に存在する。例えば、転写の制御、ゲノム・インプリンティングや腫瘍発症に関与している。それゆえ、遺伝情報の現状としての５−メチルシトシンの把握には、多大の関心が寄せられている。しかし、５−メチルシトシンの位置はシーケンシング（配列解析）によっては同定できず、５−メチルシトシンはハイブリッド形成ではシトシンと同じ結果をもたらす。従って、どのシトシンが５−メチルシトシンとなっているかという発生機構的な情報はＰＣＲ増幅では完全に見落としてしまう。
【０００５】
ＣｐＧ島のメチル化は、しばしば転写不活性と同一視される。ＣｐＧ島が遺伝子のプロモーター中に存在するようにという、一義的指示が出されるが、全てのＣｐＧ島及びメチル化の部位は既知のプロモーター中に偏在しない。種々の、特異的な、印刷遺伝子ではＣｐＧ島は、かなりの距離を置いて、転写開始の方向に、上流に、偏在する。そして、多くの遺伝子は多段階プロモーターを有する。多数の発症例についてＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が原因であると指摘されている。古典的突然変異で、ＤＮＡのメチル化で、遺伝子のコードされた機能を変えることなしに塩基置換を書込む機能が問題となる。これら漸生説的修飾と古典的突然変異の間の交換は腫瘍遺伝子においては重要な役割を演ずる。例えば、病巣の過度のメチル化と一般的なゲノムメチル化は多くの異なる腫瘍の標識となる。腫瘍発生と腫瘍進行は過度のメチル化で誘発される変異原性及び他の、細胞増殖及び／または発生学的展開に必要な脱メチルにより制御される遺伝子の遮断、遺伝子の誘発される活性化、により惹起される。
【０００６】
遺伝性で、非ポリープ性のコロレクタール腫瘍では、例えば、変異陰性の大腸癌の大部分のケースは、ｈＭＬＨ１プロモーターの過剰なメチル化及びｈＭＬＨ１の接続的、非発現、一つの対の欠損の修復に起因する（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ ＲＡ，Ｓｉｍｐｓｏｎ ＡＪ，． Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＭＬＨ１ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｂｕｔ ｎｏ ｈＭＬＨ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｊｕｌ １５；８７（２）：２００〜３）。
肺癌の発症においては、発現の損失がＲＡＳ活性同族体の配列プロモーターにおけるＣｐＧ島のメチル化と相関している［Ｄａｍｍａｎｎ Ｒ，Ｌｉ Ｃ，Ｙｏｏｎ ＪＨ，Ｃｈｉｎ ＰＬ，Ｂａｔｅｓ Ｓ，Ｐｆｅｉｆｅｒ ＧＰ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＲＡＳ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｕｎｇｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｌｏｃｕｓ３ｐ２１．３．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ２０００ Ｊｕｌ；２５（３）：３１５〜９］。
ＬＫＢ１腫瘍抑制遺伝子の新生の、プロモーターの過度のメチル化を含む、不活性化はＰｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ 症候を含む［Ｅｓｔｅｌｌｅｒ Ｍ，Ａｖｉｚｉｅｎｙｔｅ Ｅ，Ｃｏｒｎ ＰＧ，Ｌｏｔｈｅ ＲＡ，Ｂａｙｌｉｎ ＳＢ，Ａａｌｔｏｎｅｎ ＬＡ，Ｈｅｒｍａｎ ＪＧ，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＫＢ１ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００ Ｊａｎ ６；１９（１）：１６４〜８］。
【０００７】
メチル化が関与する多くの発症は、その病因において、腫瘍抑制遺伝子ｐ１６またはｐ１５と密接な関係があることを示している。それで、マイコソポリープとｐ１６（ＩＮＫ４ａ）遺伝子の間の関係が認められている［Ｎａｖａｓ ＩＣ，Ｏｒｔｉｚ−Ｒｏｍｅｒｏ ＰＬ，Ｖｉｌｌｕｅｎｄａｓ Ｒ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｐ，Ｇａｒｃｉａ Ｃ，Ｇｏｍｅｚ Ｅ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＬ，Ｇａｒｃｉａ Ｄ，Ｖａｎａｃｌｏｃｈａ Ｆ，Ｉｇｌｅｓｉａｓ Ｌ，Ｐｉｒｉｓ ＭＡ，Ａｌｇａｒａ Ｐ，ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ．Ａｍ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０００ Ｍａｙ；１５６（５）：１５６５〜７２］。
胃癌のｐ１６遺伝子の転写の遮断と僅かな特殊なＣｐＧの位置の間の強い相関から出発している［Ｓｏｎｇ ＳＨ，Ｊｏｎｇ ＨＳ，Ｃｈｏｉ ＨＨ，Ｋａｎｇ ＳＨ，Ｒｙｕ ＭＨ，Ｋｉｍ ＮＫ，Ｋｉｍ ＷＨ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣｐＧ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｐ１６（ＩＮＫ４ａ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｊｕｌ １５；８７（２）：２３６〜４０］。
【０００８】
一次的硬化性の胆管炎と関連がある胆管癌の発症は、ｐ１６プロモーターに依存する、ｐ１６腫瘍抑制遺伝子の不活性化による。［Ａｈｒｅｎｄｔ ＳＡ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ＣＦ，Ｙｉｐ Ｌ，Ｒａｓｈｉｄ Ａ，Ｃｈｏｗ ＪＴ，Ｐｉｔｔ ＨＡ，Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ Ｄ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ９ｐ２１ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｐ１６ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ．１９９９ Ｊｕｎ １；８４（１）：８８〜９３］。
【０００９】
白血病遺伝子及び急性白血病の進行ではｐ１６遺伝子の過度メチル化による不活性化が一つの役割を演じる［Ｎａｋａｍｕｒａ Ｍ，Ｓｕｇｉｔａ Ｋ，Ｉｎｕｋａｉ Ｔ，Ｇｏｉ Ｋ，Ｉｉｊｉｍａ Ｋ，Ｔｅｚｕｋａ Ｔ，Ｋｏｊｉｋａ Ｓ，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ Ｋ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｎ，Ｋａｒａｋｉｄａ Ｎ，Ｋａｇａｍｉ Ｋ、Ｏ−Ｋｏｙａｍａ Ｔ，Ｍｏｒｉ Ｔ，Ｎａｋａｚａｗａ Ｓ，ｐ１６／ＭＴＳ１／ＩＮＫ４Ａ］遺伝子はしばしば、１１ｑ２３転位を伴う小児の急性白血病における過度のメチル化によって不活性化される。１９９９ Ｊｕｎ １３；（６）：８８４〜９０］。
【００１０】
更に、ｐ１６及びｐ１５遺伝子の過度のメチル化が骨髄性白血病の腫瘍遺伝子で決定的な役割を演じていることが自明のこととされている［Ｎｇ ＭＨ，Ｗｏｎｇ ＩＨ，Ｌｏ ＫＷ，ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９９Ａｕｇ；３４（５〜６）：４６３〜７２］。腎臓癌の発生原因に不活性ＶＨＬ−遺伝子のメチル化が重要な役割を演じている［Ｇｌａｖａｃ Ｄ，Ｒａｖｎｉｋ−Ｇｌａｖａｃ Ｍ，Ｏｖｃａｋ Ｚ，Ｍａｓｅｒａ Ａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＲＣＣ）．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．１９９６；４３１（６Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｒ１９３〜４］。
【００１１】
５’−ＣｐＧ島の異常なメチル化は鼻咽腔癌のｐ１６遺伝子転写不活性化に関与し得る［Ｌｏ ＫＷ，Ｃｈｅｕｎｇ ＳＴ，Ｌｅｕｎｇ ＳＦ，ｖａｎ Ｈａｓｓｅｌｔ Ａ，Ｔｓａｎｇ ＹＳ，Ｍａｋ ＫＦ，Ｃｈｕｎｇ ＹＦ，Ｗｏｏ ＪＫ，Ｌｅｅ ＪＣ，Ｈｕａｎｇ ＤＰ，Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ１６ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９６ Ｊｕｎ １５；５６（１２）：２７２１〜５］。肝細胞癌では、ｐ１６蛋白質の不活性化が指摘され、メチル化プロモーター及び同遺伝質欠失はここでは、よく起こるメカニズムである［Ｊｉｎ Ｍ，Ｐｉａｏ Ｚ，Ｋｉｍ ＮＧ，Ｐａｒｋ Ｃ，Ｓｈｉｎ ＥＣ，Ｐａｒｋ ＪＨ，Ｊｕｎｇ ＨＪ，Ｋｉｍ ＣＧ，Ｋｉｍ Ｈ，ｐ１６は肝細胞癌における主要な不活性化ターゲットである。Ｃａｎｃｅｒ ２０００ Ｊｕｌ １；８９（１）：６０〜８］。
【００１２】
遺伝子発現の制御としてのメチル化は乳癌のＢＲＣＡ１遺伝子であると報告されている［Ｍａｇｄｉｎｉｅｒ Ｆ，Ｂｉｌｌａｒｄ ＬＭ，Ｗｉｔｔｍａｎｎ Ｇ，Ｆｒａｐｐａｒｔ Ｌ，Ｂｅｎｃｈａｉｂ Ｍ，Ｌｅｎｏｉｒ ＧＭ，Ｇｕｅｒｉｎ ＪＦ，Ｄａｎｔｅ Ｒ，ＢＲＣＡ１の５’末端ＣｐＧ島の部分的メチル化は体細胞の遺伝子発現の抑制に関連する。ＦＡＳＥＢＪ．２０００ Ａｕｇ；１４（１１）：１５８５〜９４］。メチル化と非ホジキン氏リンパ腫との相関が認められている［Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｄｅｌｇａｄｏ Ｂ，Ｒｉｃｈａｒｔ Ａ，Ｇａｒｃｉａ ＭＪ，Ｒｏｂｌｅｄｏ Ｍ，Ｏｓｏｒｉｏ Ａ，Ｃｅｂｒｉａｎ Ａ，Ｒｉｖａｓ Ｃ，Ｂｅｎｉｔｅｚ Ｊ，非ホジキン氏リンパ腫の追跡における疾病標識としてのｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１５ｉｎｋ４ｂ遺伝子の過メチル化 、Ｂｒ Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００ Ａｐｒ；１０９（１）：９７〜１０３］。
【００１３】
ＣｐＧのメチル化はＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の発現低下に関連するＴ細胞白血病の進行を惹起する、［Ｎｏｓａｋａ Ｋ，Ｍａｅｄａ Ｍ，Ｔａｍｉｙａ Ｓ，Ｓａｋａｉ Ｔ，Ｍｉｔｓｕｙａ Ｈ，Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｍ，ＣＤＫＮ２Ａの遺伝子のメチル化の増加は成人Ｔ細胞白血病の進行に関連する。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ １５；６０（４）：１０４３〜８］。
【００１４】
［Ｓａｌｅｍ Ｃ，Ｌｉａｎｇ Ｇ，Ｔｓａｉ ＹＣ，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｊ，Ｋｎｏｗｌｅｓ ＭＡ，Ｆｅｎｇ ＡＣ，Ｇｒｏｓｈｅｎ Ｓ，Ｎｉｃｈｏｌｓ ＰＷ，Ｊｏｎｅｓ ＰＡ，膀胱癌のＣｐＧ島の新たなメチル化における進行的増加。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｍａｙ １；６０（９）：２４７３〜６］。食道扁平細胞癌の転移不活性化は、その疾病の進行に影響を与えるＦＨＩＴ遺伝子のメチル化と関連する［Ｓｈｉｍａｄａ Ｙ，Ｓａｔｏ Ｆ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｇ，Ｙａｍａｓａｋｉ Ｓ，Ｋａｔｏ Ｍ，Ｍａｅｄａ Ｍ，Ｉｍａｍｕｒａ Ｍ，壊れやすいヒスチジン３つ組遺伝子の発現ロスは食道扁平細胞癌の進行と関連するが、これは患者の予後や喫煙歴とは無関係である。Ｃａｎｃｅｒ． ２０００ Ｊｕｌ １；８９（１）：５〜１１］。
【００１５】
中性の蛋白質分解酵素２４．１１（ＮＥＰ）は男性ホルモンに依存しない前立腺癌の増殖に関与する神経蛋白質の増殖を不活性化する。ＮＥＰプロモーターの過メチル化による、ＮＥＰ発現のロスは神経蛋白質に刺激される男性ホルモンに依存しない前立腺癌の発生を助長する［Ｕｓｍａｎｉ ＢＡ，Ｓｈｅｎ Ｒ，Ｊａｎｅｃｚｋｏ Ｍ，Ｐａｐａｎｄｒｅｏｕ ＣＮ，Ｌｅｅ ＷＨ，Ｎｅｌｓｏｎ ＷＧ，Ｎｅｌｓｏｎ ＪＢ，Ｎａｎｕｓ ＤＭ，ヒトの前立腺癌の中性蛋白質分解酵素の遺伝子プロモーターのメチル化。Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｍａｙ；６（５）：１６６４〜７０］。
【００１６】
発生途上の副腎皮質癌は腫瘍ＤＮＡの異常構造を示す。この異常構造は、ＩＧＦ２遺伝子の過発現下で、この座で、ＤＮＡの脱メチル化と相関する［ＷｉｌｋｉｎＦ，Ｇａｇｎｅ Ｎ，Ｐａｑｕｅｔｔｅ Ｊ，Ｏｌｉｇｎｙ ＬＬ，Ｄｅａｌ Ｃ，小児性副腎皮質腫瘍：インシュリン類似成長因子ＩＩ遺伝子の過発現、ＪＣｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２０００ Ｍａｙ；８５（５）：２０４８〜５６．Ｒｅｖｉｅｗ］。網膜芽腫ＤＮＡで多くのポリヌクレオチッド配列のメチル化が発病に関与していることが認められている、［Ｍａｎｃｉｎｉ Ｄ，Ｓｉｎｇｈ Ｓ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ Ｐ，Ｒｏｄｅｎｈｉｓｅｒ Ｄ，網膜芽腫遺伝子（ＲＢ１）の突然変異としてのメチル化ＣｐＧジヌクレオチッド。Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９７ Ｊｕｌ；６１（１）：８０〜７］。
【００１７】
慢性骨髄性白血病の場合はｐ５３遺伝子とメチル化見本の間で、発病が速くなることとの関連が推定されている。［Ｇｕｉｎｎ ＢＡ，Ｍｉｌｌｓ ＫＩ，慢性骨髄性白血病進行における、ｐ５３突然変異、メチル化及びゲノム安定性。Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９７Ｊｕｌ；２６（３〜４）：２１１〜２６］。また、急性骨髄性白血病の場合はメチル化との関連性が実証されている［Ｍｅｌｋｉ ＪＲ，Ｖｉｎｃｅｎｔ ＰＣ，Ｃｌａｒｋ ＳＪ、急性骨髄性白血病における多段遺伝子のＤＮＡ過メチル化の現状、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９ Ａｕｇ１；５９（１５）：３７３０〜４０］。
【００１８】
ウィルムス腫瘍（幼児期の腎臓の腫瘍）のサプレッサー遺伝子における腫瘍特異性のメチル化の位置が同定された［Ｋｌｅｙｍｅｎｏｖａ ＥＶ，Ｙｕａｎ Ｘ，ＬａＢａｔｅ ＭＥ，Ｗａｌｋｅｒ ＣＬ，ウィルムス腫瘍のサプレッサー遺伝子における腫瘍特異性のメチル化の位置の同定、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９８ Ｆｅｂ １２；１６（６）：７１３〜２０］。バーキットリンパ種では２、３のプロモーターが完全なＣｐＧメチル化を示す［Ｔａｏ Ｑ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＫＤ，Ｍａｎｎｓ Ａ，Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ Ａ，Ａｍｂｉｎｄｅｒ ＲＦ，バーキットリンパ種におけるＥＢウィールス（ＥＢＶ）：初期腫瘍膜、血液の分子的分析。１９９８Ｆｅｂ．１５；９１（４）：１３７３〜８１］。甲状腺癌では、ＤＮＡメチル化がある役割を演じることが認められている［Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ ＧＭ，Ｙａｔｉｎ Ｍ．Ｍａｒｃｉｎｅｋ Ｒ，Ａｉｎ ＫＢ，：脱分化された甲状腺癌におけるヨード摂取の回復、ヒトＮａ＋／Ｉ−ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ遺伝子のメチル化状態ヘの関係、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，１９９９ Ｊｕｌ；８４（７）：２４４９〜５７］。
【００１９】
メチル化が関連するのは癌の発症だけではなく、多くの、癌以外の発症にも関連する。炎症性関節炎の研究では、この病気の発症が、ゲノムＤＮＡのメチル化と関連することが指摘されている［Ｋｉｍ ＹＩ，Ｌｏｇａｎ ＪＷ，Ｍａｓｏｎ ＪＢ，Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ Ｒ，炎症性関節炎におけるＤＮＡの低メチル化：ＪＬａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．１９９６ Ａｕｇ；１２８（２）：１６５〜７２］。ＩＣＦ症候にはメチル化の制御発現の関連が指摘されている［Ｋｏｎｄｏ Ｔ，Ｂｏｂｅｋ ＭＰ，Ｋｕｉｃｋ Ｒ，Ｌａｍｂ Ｂ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｎａｒａｙａｎ Ａ，Ｂｏｕｒｃ’ｈｉｓ Ｄ，Ｖｉｅｇａｓ−Ｐｅｑｕｉｇｎｏｔ Ｅ，Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｍ，ＨａｎａｓｈＳＭ，ＩＣＦ症候における全ゲノムメチル化スキャン：非附随体ＤＮＡリピートＤ４Ｚ４及び ＮＢＬ２の低メチル化］。全身の皮膚結核エリテマトースヘのメチル化の関与が推定され［Ｖａｌｌｉｎ Ｈ，Ｐｅｒｅｒｓ Ａ，Ａｌｍ ＧＶ，Ｒｏｎｎｂｌｏｍ Ｌ，全身の皮膚結核エリテマトースの偽ＩＦＮ−αインデユーサー結合における対二重鎖ＤＮＡ、対身及び免疫刺激性プラスミドＤＮＡ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９ Ｄｅｃ １；１６３（１１）：６３０６〜１３］、筋ジストロフィー症とＣｐＧ島の間の関連も推定されている［Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｓｉｎｇｈ ＰＢ，Ｒａｓｂｅｒｒｙ Ｃ， Ｃａｔｔａｎａｃｈ ＢＭ，Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｉｎｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｈ１９ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｐｅｒｍａｔｏｚａ．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ．２０００ Ｆｅｂ；９０（２）：２１７〜２６；Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ Ｍ ，Ｌｅｈｒａｃｈ Ｈ，Ｎａｔｕｒ １９８６ Ｄｅｃ；１７；３２４（６０９７）：５８２〜５］。
【００２０】
発症の形成に関与する、蛋白質前駆アミロイドメチル化の効果はアルツハイマーの発症によると推定される［Ｗｅｓｔ ＲＬ，Ｌｅｅ ＪＭ，Ｍａｒｏｕｎ ＬＥ Ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ａｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９５；６（２）：１４１〜６］。また、メチル化の状態は染色体レベルで重要な役割を演じる。例えば、染色体Ｘの脆弱性と結合する精神的遅延症候では、染色体の脆弱性の程度はメチル化によって決まる［ｄｅ Ｍｕｎｉａｉｎ ＡＬ，Ｃｏｂｏ ＡＭ，Ｐｏｚａ ＪＪ，Ｓａｅｎｚ Ａ，（ＤＮＡの不安定に起因する疾病）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉａ．１９９５， Ｄｅｃ；１０ 補巻１：１２〜９］。
【００２１】
ＤＮＡ上の５−メチルシトシンについて、比較的新しく、且つ、最も頻繁に応用されている確認方法は、重亜硫酸塩がシトシンに特異的に反応することに基づいている。シトシンは、アルカリ加水分解後にウラシルに転換されるが、ウラシルは、相補的塩基対をつくる際の骨格としてはチミジンと同様である。これに対して、５−メチルシトシンは、このような条件下では修飾されない。このため、元のＤＮＡが置換されても、相補的塩基対をつくる骨格としては、本来シトシンと区別されず、メチルシトシンは「従来」の分子生物学的技術、例えば増幅とハイブリッド形成あるいは配列解析によって、本来の、単一のシトシンとして検出される。これらの技法は全て、相補的塩基対に基づいており、今日広く活用されている。この技術の感度面での基準は次の方法で評価される。実験対象のＤＮＡをアガロース・マトリックスに包入し、こうして、ＤＮＡの拡散と再結合を防止する（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡとのみ反応する）。そして沈殿と洗浄処理を高速透析によって行う（Ｏｌｅｋ， Ａ．らＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６，２４，５０６４〜５０６６）。この方法によって、ひとつ、ひとつの細胞を調べることができ、その潜在的能力を評価できる。事実、現在までのところ、約３，０００塩基対ぐらいまでの個別領域しか調べられておらず、何千という細胞を全体的にメチル化分析することは不可能であった。また、この手法は微量の試料中の小さい断片について信頼できる分析結果を出すことができなかった。これは、マトリックスによる拡散防止にもかかわらず、その喪失がおきるためである。５−メチルシトシンを検出するという、一般的な課題の解決方法に関して、考察が次のレビューに掲載されている：Ｒｅｉｎ Ｔ．，ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ， Ｍ． Ｌ．， Ｚｏｒｂａｓ Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９８，２６，２２５５．
【００２２】
重亜硫酸塩法は、今日までのところ、数少ない例外（例：Ｚｅｃｈｎｉｇｋ， Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．１９９７，５，９４〜９８）を除いて研究には使用されなかった。既知の遺伝子の特定部分を増幅し、更に、完全に配列を解析する（Ｏｌｅｋ， Ａ．とＷａｌｔｅｒ Ｊ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１７，２７５〜２７６）とか、個別のシトシンの位置をプライマー伸張反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ， Ｍ． Ｌ．とＪｏｎｅｓ， Ｐ．Ａ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５， ２５２９〜２５３１， ＷＯ− Ｐａｔｅｎｔ９５００６６９）や、制限酵素切断法（Ｘｉｏｎｇ Ｚ． とＬａｉｒｄ Ｐ．Ｗ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７， ２５， ２５３２〜２５３４）で確認することは、ますます簡便になってきている。その上更に、ハイブリッド形成による確認も行われ、記述されている（Ｏｌｅｋ ら， ＷＯ−Ａ９９／２８４９８）。
【００２３】
重亜硫酸塩法を個別の遺伝子でのメチル化の確認に応用した例は、Ｘｉｏｎｇ ＺとＬａｉｒｄ Ｐ．Ｗ．（１９９７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５３２、Ｇｏｎｚａｌｇｏ， Ｍ．Ｌ．とＪｏｎｅｓ， Ｐ．Ａ．（１９９７）， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５２９； Ｇｒｉｇｇ， Ｓ．とＣｌａｒｋ，Ｓ．（１９９４），Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １６，４３１； Ｚｅｓｃｈｎｉｋ， Ｍ．ら（１９７７），Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，３８７； Ｔｅｉｌ， Ｒ．ら（１９９４）， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，６９５； Ｍａｒｔｉｎ， Ｖ．ら （１９９５），Ｇｅｎｅ １５７，２６１； ＷＯ−Ａ９７／４６７０５，ＷＯ−Ａ９５／１５３７３及びＷＯ−Ａ９５／４５５６０などで発表されている。
【００２４】
オリゴマー配列の合成における現在の技術水準についての概観は、１９９９年１月に、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓの別冊（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２１，１９９９年１月）、ならびにこの文献の中で引用されている文献に掲載されている。
【００２５】
固定されたＤＮＡ配列の解析のためには、種々の蛍光識別を施した試薬が用いられる。とりわけ、蛍光識別に適しているのは、各プローブの５’−ＯＨ基に色素のＣｙ３あるいはＣｙ５を単に結合させることである。ハイブリッド形成（相補結合）されたプローブの蛍光の検出は、例えば共焦点顕微鏡を用いて行われる。色素のＣｙ３とＣｙ５は、他の多くの色素と同様市販されている。
【００２６】
レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）が開発され、生体分子の分析効率が非常に高い［Ｋａｒａｓ， Ｍ．とＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ， Ｆ．（１９８８），分子量が１０，０００ダルトンを超えているタンパク質のレーザー脱着イオン化，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２２９９〜２３０１］。分析対象が脱離を起こすマトリックスの中に混和される。短いレーザーパルスによってマトリックスは気化し、分析対象分子は気体相へと蒸散する。マトリックス分子の衝突によって分析対象物がイオン化する。加えられた電圧によってイオンは加速され、無電場の管へと送りこまれる。異なる質量に基づいて、イオンは異なった加速度を受ける。より小さなイオンは、より大きなイオンよりも早く検出部に到達する。
【００２７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 分析装置は、ペプチドや蛋白質の分析に、非常に適している。核酸の分析はそれよりやや難しい［Ｇｕｔ Ｉ．Ｇ．， とＢｅｃｋ， Ｓ．（１９９５），ＤＮＡ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ １：１４７〜１５７］。核酸の場合は、感度はペプチドの場合の約１００倍低く、断片が大きくなるに従って、更に、低下する。複雑な負電荷を持つ骨格を有する核酸にとっては、マトリックスを用いたイオン化法は極めて非効率的である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析装置ではマトリックスの選択が、非常に重要な役割を担っている。ペプチドからの放出に関しては、いくつかの効率のよいマトリックスが見つかっているが、それらは非常に微細な結晶化によって合成される。ＤＮＡに関しても、興味深いマトリックスが存在するのは事実であるが、感度の向上には到っていない。ＤＮＡを化学的に修飾し、ペプチドに似た形にすることによって、感度を向上させることができる。ホスホチオエート核酸では、骨格の通常のリン酸はチオリン酸によって置換されているが、これは単純なアルキル化反応によって中性電荷のＤＮＡに変換される［Ｇｕｔ，Ｉ．Ｇ．とＢｅｃｋ， Ｓ．（１９９５）， Ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１３６７〜１３７３］。修飾されたＤＮＡに「電荷タグ」をカップリングすることにより感度はペプチドの場合に匹敵する程度にまで向上する。加えて、電荷タグの利点は、修飾されていない基質の検出を極めて難しくする異物混入を防ぎ、その安定性を向上させる点である。
【００２８】
ゲノムＤＮＡは、細胞、組織または他の検査試料のＤＮＡから定法により採集できる。この定法は、ＦｒｉｔｓｃｈとＭａｎｉａｔｉｓのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）といった参考文献に記載されている。
【００２９】
本発明は上記のような従来技術の問題点に鑑み、与えられたＤＮＡ試料中に存在する、多数のシトシン塩基の５位にメチル基が結合している状態を、ハイブリッド形成によって同時に検出することを可能とする、非常に高効率、且つ、信頼度の高い方法を提供することを課題とするものである。そのためには、オリゴヌクレオチッド及びＰＮＡオリゴマーが準備され、これらについては、発症及び疾病の素因の診断方法を実施するために、遺伝学上及び／または新生のパラメーターの解析によるのが特に好ましい。
【００３０】
本発明において遺伝学上のパラメーターとは、請求項に於ける核酸の突然変異及び同質異象（配列ＩＤ１から４０７１２まで）及びそれらの制御のために、更に必要な配列である。特に、突然変異、挿入、欠失、点・突然変異、逆位、及び同質異象、とりわけＳＮＰｓ（単独ヌクレオチッド同質異象）が挙げられる。同質異象は挿入、欠失または逆位でもあり得る。
【００３１】
本発明において新生のパラメーターとは、特に、シトシンのメチル化及び、更に、請求項に於ける核酸のＤＮＡ塩基の化学変化（配列ＩＤ１から４０７１２まで）及びそれらの制御のために更に必要な配列である。更に、新生のパラメーターは、例えば、前記方法で間接的に分析でき、再度のＤＮＡのメチル化とは関連しない、ヒストンのアセチル化である。
【００３２】
本発明は、ゲノムＤＮＡ試料中の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’ 内の少なくとも一つの特定シトシンのメチル化度を分析するのに役立ち、また、多数の異なるメチル化位置をも同時に分析する場合、特に有効である。
【００３３】
本発明の課題は、ゲノムＤＮＡ試料の配列コンテクスト５’−ＣｐＧ−３’における特定のシトシンのメチル化度の検出方法により解決される。
即ち、その方法は以下の通りである。ａ）ゲノムＤＮＡを処理して、シトシン塩基をウラシルに変換する一方、５−メチルシトシンは変換せず、ｂ）ゲノムＤＮＡ中、前記特定シトシンを含む部分を増幅し、この際、増幅産物には検出可能な標識を与え、ｃ）２種類のオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーの少なくとも１種類の配列上で増幅産物のハイブリッド形成が起きるようにし、ｄ）増幅産物が２種類のオリゴヌクレオチド上にハイブリッド形成している量を、増幅産物の標識を検出することで同定し、ｅ）ハイブリッド形成の結果、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合から、ゲノムＤＮＡにおける前記特定のシトシンのメチル化度を推定する。
【００３４】
特に、本発明のｃ）においては、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、第２のオリゴマーは前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成する。２種類のオリゴマーのうちの１種は、例えば、一つのＣＧを中央に含有するオリゴヌクレオチッドで形成することができ、他の１種は一つのＴＧ（または一つのＣＡ、対向する鎖に）を中央に含有するオリゴヌクレオチッドで形成される。オリゴマー配列の残りの部分は上記２種類の間で一致する。この場合、メチル化での亜硫酸塩による変換のように、第１のオリゴヌクレオチッド配列に（調べる特定のシトシンについて）、ハイブリッド形成される。逆に、第２のオリゴヌクレオチッド配列では非メチル化での亜硫酸塩による変換のように、ハイブリッド形成される。
【００３５】
特に、本発明のｃ）においては、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、配列には優先度を下げ、第２のオリゴマーは前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成され、第２のオリゴマーは増幅産物に本質的に、前記ゲノムＤＮＡ中の特定のシトシンのメチル化度に依存せずにハイブリッド形成される。
【００３６】
特に、本発明のｃ）においては、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、配列には優先度を下げ、第２のオリゴマーは前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成され、第２のオリゴマーは増幅産物に本質的に、前記ゲノムＤＮＡ中の特定のシトシンのメチル化度に依存せずにハイブリッド形成される。
【００３７】
この場合、第２のオリゴマーは増幅産物に本質的に、シトシンのメチル化度の特異性に依存することなく、増幅産物の一つの位置にメチル化され得ないシトシンの位置に対応してハイブリッド形成される。従って、最終的に増幅産物の濃度のみがハイブリッド形成の強さを決める。調べるべき特定のシトシンンのメチル化度によって、第１のオリゴヌクレオチッドへのハイブリッド形成が為される。
【００３８】
本発明はゲノムＤＮＡ試料に対してのみならず、同様にして前記特定のシトシンがメチル化されているのではなく、むしろメチル化されていない標準ＤＮＡに対してこれを用い、メチル化されていないＤＮＡを用いて測定した際に、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合をメチル化度０の標準値として用い、同様にして、メチル化されているＤＮＡを用いて測定することにより２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合をメチル化度１の標準値として用い、これらの標準値をゲノムＤＮＡ試料のメチル化度の同定に使用することが好ましい。
【００３９】
使用される標準ＤＮＡ試料及びゲノムＤＮＡから形成される増幅産物は区別できる標識を施されている。使用される標準ＤＮＡ試料は区別できる標識を再度施されている。
【００４０】
本発明においては、異なるゲノムＤＮＡ試料からの、異なる標識を含んでいる増幅産物について、この場合、それが２種類のオリゴヌクレオチッドを含んでいても、２種類のオリゴヌクレオチッドで同時に異なる試料を測定できる。
【００４１】
異なる検出方法から得られる値の伝達について測定精度の上昇を達成するために、同じゲノムＤＮＡ試料からの増幅産物に異なる標識を含有させる。これは例えば、異なるフルオレスセンス色素で標識することによって達成できる。この場合の測定は、個々のフルオレスセンス色素の放出波長用に多数の導管を備えたフルオレスセンススキャナにより行われる。
【００４２】
本発明においては、標識化はフルオレスセンスによる標識化である。
【００４３】
更に、前記標識として蛍光マーカーを用いることが非常に好ましい。これにより、前記標識を、化学発色、紫外線吸収あるいは蛍光分極によって同定する。
【００４４】
本発明においては重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）の溶液を用いて化学処理を施すことが非常に好ましい。
【００４５】
本発明においては増幅のためにオリゴヌクレオチッドを使用し、このオリゴヌクレオチッドは、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２までの、化学処理されたＤＮＡの、少なくとも、塩基長１８の断片である。重亜硫酸塩で処理したＤＮＡに相補的プライマーを使用し、相補的プライマーは、制御可能で、続いてメチル化について調べられ得る、領域（ＣｐＧ島）を増幅することが確実に行われる。
【００４６】
本発明におけるハイブリッド形成において、オリゴヌクレオチッド及び／またはペプチッド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ＝ＰＮＡ）オリゴマーが使用される。これらは、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２までの、化学処理されたＤＮＡの中の少なくとも塩基長９の配列断片にハイブリッド形成するか、または、これらに対応して、塩基配列が、少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含有し、ＣｐＧジヌクレオチッドがオリゴマー中の、約１／３の量存在する。これらオリゴヌクレオチッドは、本発明の方法に従って、特異的なＣｐＧのメチル化度を調べるのに好適である。これらオリゴヌクレオチッドは、適切なシトシンの位置にメチル化されたゲノムＤＮＡ試料由来の、処理済みＤＮＡの増幅産物に、結合させることが好ましい。
【００４７】
標識として放射性核種を使用することが好ましい。
【００４８】
更に、標識としてマススペクトル計で同定可能で、分離可能な、質量標識を使用することが好ましい。
【００４９】
本発明においては、ＰＣＲ産物全体またはその特徴ある断片をマススペクトル計で同定し、その質量によって一義的に特定することが好ましい。
【００５０】
本発明においては、オリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）が特に配列５’−ＣＧ−３’を含むことが好ましい。
【００５１】
本発明においては、オリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）が特に配列５’−ＴＧ−３’及び／または配列５’−ＣＡ−３’を含むことが好ましい。
【００５２】
更に、本発明においては、第１のオリゴヌクレオチドが５’−ＣＧ−３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドが５’−ＴＧ−３’配列、及び／または５’−ＣＡ−３’配列を含むことも、更に強く推奨される。第１と第２の種類のオリゴヌクレオチドが共通の固体相上に固定されていることが好ましい。更に、また、オリゴヌクレオチドが直角あるいは六角形の網目状の平坦な固体相上に配列されており、固体相上での特定のオリゴヌクレオチドの位置が、それぞれの配列と関連づけられていることが好ましい。
【００５３】
更に、本発明においては、第１及び第２の種類のオリゴヌクレオチドが、個別に、実証可能な標識のセットでコード化されるビーズ上に固定される。この標識はビーズの同定のために、即ち、適切なビーズに結合する配列に役立つ。ビーズに結合している増幅産物は、増幅産物に結合している他の標識により、同定される。ビーズによる上記測定を行うための器具は、例えば、ルミネックス社製がある。
【００５４】
本発明の方法においてはｂ）段階を以下に述べるように２つの段階に分けて実施することが特に好ましい。
ａ）請求項１に従って前処理されたＤＮＡ試料に非特異的にハイブリッド形成し、更に、ＰＣＲ段階で一つ以上の増幅産物を生ずる、異なる配列を有する、少なくとも、一対のプライマーを用いたＰＣＲ準備増幅、
ｂ）請求項１に従って前処理されたＤＮＡ試料［（＋）−鎖あるいは（−）−鎖］の一片と同じであるか、または逆に相補的であり、増幅されるＤＮＡに特異的にハイブリッド形成する、異なる配列のプライマーを有する、準備増幅において生じた産物のＰＣＲ増幅。
【００５５】
ハイブリッド形成過程で本発明との関連で、二つの、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（定律）Ｒｅｇｅｌｎに完全に反する相補的ＤＮＡ単独鎖が、塩基のない対の発生なしに理解される。この場合ウラシルはチミンとみなされる。
【００５６】
多数のＤＮＡ断片の増幅を、一つの反応容器内で実行することが、更に、好ましい。
【００５７】
増幅には耐熱性のＤＮＡ複製酵素（ポリメラーゼ）を使用することが、更に、好ましい。増幅に使用するプライマー・オリゴヌクレオチドはＴ、Ａ、Ｃ塩基のみか、あるいは、Ｔ、Ａ、Ｇ塩基のみを含むことが特に好ましい。
【００５８】
異なる配列コンテクスト中の少なくとも１０のＣｐＧ位置が同時に分析できることも、好ましい。異なる配列コンテクスト中の少なくとも５０のＣｐＧ位置が同時に分析できることが、特に好ましい。異なる配列コンテクスト中の少なくとも１００のＣｐＧ位置が同時に分析できることが非常に好ましい。異なる配列コンテクスト中の少なくとも５００のＣｐＧ位置が同時に分析できることが更に、好ましい。異なる配列コンテクスト中の少なくとも１，０００のＣｐＧ位置が同時に分析できることが最も好ましい。
【００５９】
細胞系列、血液、喀痰、糞便、尿、脳脊椎液、あるいは眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、***、肝臓などからとったパラフィンに封入された組織、組織学的標本、あるいはこれらの可能な混合物からゲノムＤＮＡ試料を得る手法が、好ましい。
【００６０】
患者あるいは各個人の身体にとって悪影響を与える症状の診断あるいは予後診断のために、本発明の方法の使用が望まれる。これらの悪影響を与える症状は以下のカテゴリーの少なくとも一つに含まれる、即ち、薬品の好ましくない副作用；ガン；中枢神経系の機能障害、損傷、疾病；攻撃性症状あるいは運動障害；脳損傷からくる臨床的、心理学的、社会学的結果；心理的障害および人格障害；痴呆及び／または関連する症候群；心臓循環器系疾患、機能障害、損傷；消化管の機能障害、損傷、疾患；呼吸器系の機能障害、損傷、疾患；外傷、炎症、感染、免疫及び／または回復；発達過程の異常としての身体の機能障害；損傷、疾患、皮膚、筋肉、結合組織、骨の機能障害；傷、疾患；内分泌、代謝の機能障害、損傷、疾患；頭痛あるいは性的機能障である。
【００６１】
複数種類の細胞あるいは組織の分離、あるいは細胞分化研究のための本発明の方法の使用が、更に、好ましい。
【００６２】
ここに提案する発明の対象は、重亜硫酸塩を含む試薬、増幅産物合成のためのプライマー・オリゴヌクレオチド及び／または主に固体相上に固定されたオリゴヌクレオチド及び本発明の方法を実行するための説明書である。プライマーオリゴヌクレオチッド及び固定されたオリゴヌクレオチッドは前記のように配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２である。
【００６３】
細胞系列、血液、喀痰、糞便、尿、脳脊椎液、あるいは眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、***、肝臓などからとったパラフィンに封入された組織、組織学的標本、あるいはこれらの可能な混合物からゲノムＤＮＡ試料を得ることが好ましい。
【００６４】
この方法により、第１の操作ではＤＮＡ試料が化学的に処理され、５−メチルシトシン塩基を除いて、全てのシトシン塩基がウラシルに変換される。この化学的処理は、重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）の溶液によって行われることが好ましい。
【００６５】
この操作方法は、ゲノムＤＮＡ試料だけでは実行できず、むしろ同様にして、前記の特定シトシン位置がメチル化されているか、されていないか既知であるような標準ＤＮＡを主に必要とする。
【００６６】
本発明の方法の第２の操作では、前記特定シトシンを含むゲノムＤＮＡの一部が増幅される。この操作は、以下の二段階の操作で実行するのが好ましい。
【００６７】
１．はじめに、異なる配列を有する、少なくとも一対のプライマーを用いて、ＰＣＲ準備増幅を実行し、化学的に前処理されたＤＮＡにハイブリッド形成する。この前処理では、シトシン塩基がウラシルに変換され、５−メチルシトシン塩基は変換されないように行う。
２．次に、前増幅で生産された産物のＰＣＲ増幅として、異なる配列のプライマーを用いて増幅を行う。プライマーは化学的に前処理されたＤＮＡ［（＋）−鎖あるいは（−）−鎖］の一片に同方向あるいは逆方向に相補的であって、増幅しようとするＤＮＡに特異的にハイブリッド形成し、増幅産物は、検出可能な標識を含む。
【００６８】
本発明の方法の下記の第３の操作では、増幅産物が二種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方にハイブリッド形成する。第１のオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＧ−３’配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧ−３’配列及び／または５’−ＣＡ−３’配列を含む。第１と第２の種類のオリゴヌクレオチドは、主として、共通の固体相上に固定される。オリゴヌクレオチドは直角あるいは六角形の網目上の平らな固体相に配列され、特定のオリゴヌクレオチドの固体相上の位置は、それぞれの配列と関連づけられている。
【００６９】
第１のオリゴヌクレオチドは、前記の特定シトシンがゲノムＤＮＡの中でメチル化されている場合ゲノムＤＮＡの化学的処理の結果として生ずる配列に優先的にハイブリッド形成する。第２のオリゴヌクレオチドは、前記の特定シトシンがゲノムＤＮＡの中でメチル化されていない場合、ゲノムＤＮＡの化学的処理の結果として生じる配列に優先的にハイブリッド形成する。
【００７０】
多数のＤＮＡ断片の増幅は、単一の反応容器内で実行することが好ましい。主に耐熱性のＤＮＡ複製酵素を用いてＰＣＲ反応による増幅を行うことが好ましい。
【００７１】
増幅に使用されるプライマー・オリゴヌクレオチドはＴ、Ａ、Ｃ塩基のみ、またはＴ、Ａ、Ｇ塩基のみを含むことが好ましい。
【００７２】
第４の操作は、増幅産物の２種類のオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成の程度は、増幅産物の標識を検出することで同定される。標識は、蛍光標識、放射性物質、あるいは質量分析装置で測定できる分離可能な質量標識を用いることが非常に好ましい。標識は主に化学発光、紫外線吸収あるいは蛍光分極によって検出される。ＰＣＲ産物は、全部同時に、あるいは、特徴的な断片が、質量分析装置で検出できる。これにより、ＰＣＲ産物はその質量によって明瞭に同定される。
【００７３】
最終操作では、ハイブリッド形成の結果、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合から、ゲノムＤＮＡ試料内の前記の特定シトシンのメチル化度が同定される。
【００７４】
メチル化されていない標準ＤＮＡを用いて測定された、２種類のオリゴヌクレオチドに検出される標識の割合が、主としてメチル化度０の標準値として使用される。
【００７５】
同様に、メチル化された標準ＤＮＡを用いて測定された、２種類のオリゴヌクレオチドに検出される標識の割合が、主としてメチル化度１の標準値として使用される。これらの標準値を、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化度の同定に使用することが好ましい。
【００７６】
標準値の同定には、多種類の既知の標準ＤＮＡも同様に使用可能であって、それら各々について、前記特定シトシンのメチル化度が知られている。
【００７７】
本発明の方法は、異なる配列コンテクストにおける少なくとも１０のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることを特徴とする。更に、異なる配列コンテクストにおける少なくとも５０のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることが好ましい。その上、異なる配列コンテクストにおける少なくとも１００のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることが好ましい。異なる配列コンテクストにおいて、少なくとも５００のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることが好ましい。最終的には、異なる配列コンテクストにおいて、少なくとも１，０００のＣｐＧ位置が同時に分析可能であることが非常に好ましい。
【００７８】
ここに述べる手法は、患者あるいは各個人にとって有害な症状の診断あるいは予後診断に使用されることが望まれる。これらの有害な症状は以下のカテゴリーの少なくとも一つに含まれる、即ち、薬品の副作用；ガン；中枢神経性の機能障害、損傷、疾病；攻撃性症状あるいは運動障害；脳損傷からくる臨床的、心理学的、社会学的結果；心理的障害および人格障害；痴呆および／または関連する症候群；心臓循環器系疾患、機能障害、損傷；消化管の機能障害、損傷、疾；、呼吸器系の機能障害、損傷、疾患；外傷、炎症、感染、免疫および／または回復；発達過程の異常としての身体の機能障害、損傷、疾患；皮膚、筋肉、結合組織、骨の機能障損傷、疾患；内分泌、代謝の機能障害、損傷、疾患；頭痛あるいは性的機能障害である。
【００７９】
ここに述べる方法は、複数種類の細胞や組織の分別、細胞分化の研究に使用することが好ましい。
【００８０】
２種類の定義されたオリゴヌクレオチドの種類、例えばＣＧ／ＴＧを含む配列のハイブリッド形成の割合は、未知の組織試料全体のハイブリッド形成の程度とは別に同定することができる。
【００８１】
未知の組織試料に対する補正のため、メチル化されていない比較標本と、メチル化されている比較標本を標準として使用する。
【００８２】
本発明によれば、重亜硫酸塩を含む試薬、増幅産物合成のためのプライマーオリゴヌクレオチド、及び／または固体相上に固定されたオリゴヌクレオチドで構成される、ある種のキットとして実現される。第１のオリゴ・ヌクレオチドは５’−ＣＧ−３’配列を含む。第２のオリゴヌクレオチドは５’−ＴＧ−３’及び／または５’−ＣＡ−３’配列を含む。このキットには、本発明の方法の実行にあたっての説明書も含まれる。
【００８３】
本発明の対象として更に、核酸が好ましい。
【００８４】
本発明の対象として、化学的に前処理されたゲノムＤＮＡ（配列ＩＤ１から４０７１２）における、シトシンのメチル化度の検出に使用される、少なくとも１０のオリゴマーｓｏｎｄｅ（オリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡオリゴマー）がある。遺伝及び／または新生パラメーターのデータ分析が、これらゾンデ（Ｓｏｎｄｅ）により疾病の診断や特定の疾病素質の診断に使用できる。
【００８５】
また、本発明の対象として、処理済みのＤＮＡで配列ＩＤ１から４０７１２のものであって、少なくとも１８塩基長の配列断片がある。この１８塩基対長の、配列ＩＤ１から４０７１２の配列断片は処理済みのゲノムＤＮＡの増幅に利用される。この断片の検出には少なくとも９ヌクレオチッド長のオリゴマーが使用される。
【００８６】
オリゴマーは少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含む。対応するＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンは、オリゴマーの約１／３の量存在する。各ＣｐＧジヌクレオチッド毎に少なくとも配列ＩＤ１から４０７１２のオリゴヌクレオチッドが存在する。
【００８７】
オリゴマーは、好ましくは、担体上に固定された配列で作製される。このとき、少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合する。オリゴマーゾンデの固相への結合方法は専門家が承知している。
【００８８】
この関連の中で、重要なことは、請求項に記載されている核酸（配列ＩＤ１からＩＤ４０７１２）の遺伝及び／または新生のパラメーターの診断のために、個々のＣｐＧジヌクレオチッドではなく、配列中に存在する相当多数のＣｐＧジヌクレオチッドが分析されねばならぬということである。本発明の、特に好ましい他の方法において、配列中に存在する全てのＣｐＧジヌクレオチッドが調べられねばならぬ。
【００８９】
全てのオリゴマーゾンデは同じ鎖長を有する。好ましくは、全て１８オリゴマーで、これは、中央に一つのＣＧジヌクレオチッドを有し、配列ＩＤ１からＩＤ４０７１２の塩基対にハイブリッド形成する。
【００９０】
本発明の他の方法では、少なくとも１０個のオリゴマーがシトシンのメチル化度及び／または単独のヌクレオチッド−ポリモルフィスム（ＳＮＰｓ）によって化学処理されたゲノムＤＮＡの検知に使用される。
【００９１】
オリゴマーは、以下の諸症状の診断に使用される。即ち、薬品の副作用；ガン；中枢神経性の機能障害、損傷、疾病；攻撃性症状あるいは運動障害；脳損傷からくる臨床的、心理学的、社会学的結果；心理的障害および人格障害；痴呆および／または関連する症候群；心臓循環器系疾患、機能障害、損傷；消化管の機能障害、損傷、疾；、呼吸器系の機能障害、損傷、疾患；外傷、炎症、感染、免疫および／または回復；発達過程の異常としての身体の機能障害、損傷、疾患；皮膚、筋肉、結合組織、骨の機能障損傷、疾患；内分泌、代謝の機能障害、損傷、疾患；頭痛あるいは性的機能障害等がメチル化サンプルの分析により診断される。
【００９２】
発症の診断または特定の発症の疾病素因の診断に用いる遺伝及び／または新生のパラメーターのデータの分析のために、少なくとも一つが、配列記録にリストアップされた核酸またはその重要な部分（配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２）によって使用される。
【００９３】
オリゴマーの配列においてウラシルをチミンと交換するのは同様の目的を満たすものであるが、このことは専門家には理解できる。
【００９４】
分析されるゲノムＤＮＡは十分なＤＮＡの供給源を有する。即ち、細胞系列、血液、喀痰、糞便、尿、脳脊椎液、あるいは眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、***、肝臓などからとったパラフィンに封入された組織、組織学的標本、あるいはこれらの可能な混合物からゲノムＤＮＡ試料を得ることが好ましい。
【００９５】
本発明の対象は化学前処理された、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２のＤＮＡで、少なくとも１８塩基長の配列断片を有する核酸である。
【００９６】
本発明の対象は化学処理されるＤＮＡ中のメチル化度の検出用のオリゴマー［オリゴヌクレオチッドまたはＰｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）］であり、少なくとも９ヌクレオチッドの長さの塩基配列を少なくとも有し、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の化学処理されたＤＮＡにハイブリッド形成される。そのとき、本発明においては、塩基配列が少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドを含むことが好ましい。更に、好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチッドのシトシンがオリゴマーの約１／３量存在する。
【００９７】
本発明の対象は、本発明におけるオリゴマーの、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチッドに、少なくとも一つのオリゴマーが含有されるというデータである。更に、オリゴマーの配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の一つのＣｐＧジヌクレオチッド毎に一つのオリゴマーが含有されるというデータである。
【００９８】
本発明の対象は、少なくとも二つの核酸のデータであって、二つの核酸は、本発明における、少なくとも配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の一つまたはその断片の増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチッドとして、投入される。その際、好ましくは、少なくとも一つのオリゴヌクレオチッドが固相に結合している。
【００９９】
本発明の対象は、シトシンのメチル化度及び／または化学的前処理された、ゲノムＤＮＡの、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の、単独ヌクレオチッド−ポリモルフィスム（ＳＮＰｓ）の検出用オリゴマーゾンデである。これは、少なくとも１０の本発明における前記オリゴマーである。
【０１００】
本発明の対象は、更に、配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２の配列の、ＣｐＧジヌクレオチッドのメチル化度に関連する発症、分析用の各種オリゴマーの担体上の固定配列の方法であり、そこでは、少なくとも、本発明における一つのオリゴマーが固相に結合している。
【０１０１】
本発明の対象は、固相に結合する本発明における各種のオリゴマーの配列である（Ａｒｒａｙ）。
【０１０２】
本発明の対象は、異なるオリゴヌクレオチッドの配列及び／またはＰＮＡオリゴマー配列であり、このとき、これらは正方形または六角形の網目状の平坦な固相表面上に配列される。このとき、好ましくは、固相表面がシリカ、ガラス、ポリスチロール、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。
【０１０３】
本発明は発病の原因となる、少なくとも前記核酸と同じ内容の遺伝子のメチル化度に関連する分析用のＤＮＡ及び／またはＰＮＡ配列に関する。
【０１０４】
【実施例】
本発明を以下の実施例により更に詳しく説明する。
【０１０５】
［実施例１］
メチル化されていないＤＮＡと完全メチル化されたＤＮＡの合成、および重亜硫酸塩の処理の説明
【０１０６】
完全メチル化されたＤＮＡの合成のために、ヒトのゲノムＤＮＡをＳ−アデノシル・メチオニンとＣｐＧメチル化酵素（ＳｓｓＩ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を説明書に従って使用する。メチル化されていないＤＮＡの合成のために、遺伝子ＥＬＫ−１（受入れ番号ｅｐ５９０１１）をヒトのゲノムＤＮＡに由来するプライマー、ＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＡＡＣＣＧＴＡ及びＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧを用い、ＰＣＲ増幅する。こうして合成され、メチル化されたＤＮＡ、メチル化されていないＤＮＡは、ヒトのゲノムＤＮＡと同様に、重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）による変換処理を受け、５位でメチル化されていないシトシンが全て変換され、相補的結合骨格としては、異なる塩基が生じる。その一方、５位がメチル化されたシトシンは変換されずに残る。反応には、０．１Ｍから６Ｍの濃度範囲の重亜硫酸塩が使用され、メチル化されていないシトシン塩基上に付加される。その上、変性のための薬品、溶媒およびラジカル供与体が加えられる。続いておきるアルカリ加水分解の結果、メチル化されていないシトシン核酸塩基からウラシルへの変化がおきる。変化しなかったＤＮＡはメチル化されているシトシンの検出のために使用される。
【０１０７】
［実施例２］
Ｃｙ５で標識されたプローブの合成の説明
【０１０８】
重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡを基に、ＥＬＫ−１遺伝子のプロモーター領域上で５２９塩基対の長さを持つある特定の断片が増幅される（受入れ番号ｅｐ５９０１１）。増幅は、プライマー・オリゴヌクレオチドＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ とＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴを用いて行う。蛍光色素Ｃｙ５で標識されたプライマー・オリゴヌクレオチドを使用することで、断片はＰＣＲを行う際に標識される。マトリックスＤＮＡとして、重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）で処理された（１）メチル化されていないＤＮＡ、（２）完全メチル化されたＤＮＡ、（３）ヒトゲノムＤＮＡが変換される。続いて、これら３種類の異なるＤＮＡは、別々にハイブリッド形成され、特定のＣｐＧ位置のメチル化度が分析される。
【０１０９】
［実施例３］
ハイブリッド形成とハイブリッド形成されるＤＮＡチップの開発の説明。
【０１１０】
実施例２で合成されたプローブは、ＤＮＡチップ上でハイブリッド形成される。チップには、まずオリゴ・ヌクレオチドが固定されている。このオリゴ・ヌクレオチド配列は実施例２で述べたＥＬＫ−１遺伝子の増幅された断片の一部であり、ＣＧジヌクレオチドとその近傍の配列に相当する。オリゴヌクレオチドの長さは１４から２２ヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド内のＣＧジヌクレオチドの位置は可変である。ハイブリッド形成後、ＤＮＡチップは走査され（図１を参照）、ハイブリッド形成信号が数値として読み取られる（データは示されていない）。オリゴヌクレオチドＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡとＣＴＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡを図１と図２に示す。増幅産物の位置１０３にあるＥＬＫ−１断片のシトシンがメチル化されている場合はＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡがハイブリッド形成し、このシトシンがメチル化されていない場合はＣＴＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡがハイブリッド形成することが好ましい。
【０１１１】
図１は、ＥＬＫ−１断片とハイブリッド形成を行った後のＤＮＡチップを示す。スキャンを行ったあとと同じような、疑似色の像が描画される。ここに示した白黒のコピーと異なり、スキャナーではカラー像が生み出される。異なる色の光強度がハイブリッド形成の程度を示す。ハイブリッド形成の程度は赤（図１では明るい点に見える）から青（図１では暗い点に見える）へと減少する。
【０１１２】
図２Ａは、図１の一部を切り出したものである。ハイブリッド形成の概要を明確にするために、スポットとして検出された一対のオリゴヌクレオチドに白く縁取りをつけたのがｃｔａｃｔｃａａｃａａａａａｃａａａ（左）とｃｔａｃｔｃａａｃｇａａａａｃａａａ（右）である。
図２Ｂの部分写真は、組織標本の未知のメチル化状態であり、部分写真図２Ｃは完全メチル化された比較標本のメチル化状態を示す。
【０１１３】
【表１】
平均値は、それぞれ波長６３５ｎｍに対して求められている。表１に示すように、試料Ａ欄はメチル化されていない試料の値、試料Ｂ欄は組織標本の未知のメチル化状態、試料Ｃ欄は完全メチル化された比較標本の値を示す。ＣＧ／ＣＡの値はそれぞれの試料のメチル化度を表す。０．７４という値は、この試料が本質的には完全にメチル化されていることを意味する。
【０１１５】
［実施例４］
特定のＣＧ位置のメチル化を調べる遺伝性の非ポリープ性結腸・直腸癌に関連するｈＭＬＨ１遺伝子断片に関する。
【０１１６】
先ず第１段階で、遺伝配列が重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）等で処理され、塩基の５位置がメチル化されていない全てのシトシンが化学変化する。塩基対の状態が異なる塩基が生成する。一方、５位置がメチル化されているシトシンは変化しない。この反応には濃度範囲０．１〜６モルの重亜硫酸塩が使用され、非メチル化シトシン塩基に付加される。そこに変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤が添加される。続いて、アルカリ加水分解により非メチル化シトシン塩基がウラシルに変化する。これら変化したＤＮＡがメチル化シトシンの存在を証明するのに役立つ。
第２段階では、ＤＮＡ試料は水または水溶液で希釈される。続いて、ＤＮＡの脱スルフォン（１０〜３０分、９０〜１００℃）がアルカリ性のｐＨ値で行われる。
第３段階では、ＤＮＡ試料をポリメラーゼ鎖反応、好ましくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで増幅する。この実施例ではｈＭＬＨ１遺伝子のシトシンは、１５５１塩基対という大きな５’両側領域で、調べられる。これは特殊なプライマーオリゴヌクレオチッドＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧ及びＴＴＧＡＴＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＣで規定される、７１９塩基長の断片で増幅される。この増幅産物はこれまで固相に結合しているオリゴヌクレオチッドに、複製構造の形成下、ハイブリッド形成する試料として働く。例えば、ＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧ、実証すべきシトシンは増幅産物の５８８位置に存在する。ハイブリッド形成産物の検出はＣｙ３及びＣｙ５フルオレスセンス標識された、増幅に使用された、プライマーオリゴヌクレオチッドによる。もし、重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡがメチル化シトシン位置を提示するならば、増幅されたＤＮＡのハイブリッド形成へオリゴヌクレオチッドが作用する。調べるべきシトシンのメチル化度はハイブリッド形成産物で決定される。
【０１１７】
［実施例５］
アガロースビーズを使用した重亜硫酸塩処理ＤＮＡの作製
【０１１８】
この実施例で、重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡからの、ＥＬＫ−１遺伝子（受付番号ｅｐ５９０１１）のプロモーター領域の５２９塩基対の長さの、規定された断片が増幅される。フルオレスセンス色素ＡＬＥＸＡ４８８で標識されているプライマーオリゴヌクレオチッドのＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴ、の使用により断片は直接ＰＣＲで標識される。第１のオリゴヌクレオチッド（ここでは、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ）及び第２のオリゴヌクレオチッド（ここでは、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴ）は、ビーズの表面に固定され、これは個々の色素コードで区別される。次の段階で、前記プライマーオリゴヌクレオチッドで作製されたＥＬＫ−１遺伝子の増幅産物、両者の混合物がビーズに添加され、その際、増幅産物が固定されたオリゴヌクレオチッドに対して、ここでは、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ及びＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴが、その際、証明すべきＣまたはＴが増幅産物の４７６位置にあるが、ハイブリッド形成される。続いて、ビーズがばらばらにされ、色素コードによるフルオレスセンスの測定で同定され、フルオレスセンス色素ＡＬＥＸＡ４８８に固有のフルオレスセンス強度の測定により、ハイブリッド形成の程度が確認される。
【０１１９】
［実施例６］
内部補償用の多種類の色素の使用
【０１２０】
重亜硫酸塩で処理したＤＮＡにより、５２９塩基長で規定される、ＥＬＫ−１遺伝子プロモーター領域の断片が増幅される。フルオレスセンス標識されたプライマーオリゴヌクレオチッド、ＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴ、を使用することにより、この断片がＰＣＲで直接標識される。熱循環器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＧｍｂＨ製）上で行われるＰＣＲ反応では、１０ｎｇの重亜硫酸塩処理ＤＮＡ、６ｐｍｏｌづつのプライマー、２００μＭづつのｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ＵのＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ（Ｑｉａｇｅｎ ＡＧ製）が添加される。他の条件は製造者の指示により選択される。増幅については、変性が１４分、９６℃で行われ、それに続いて、６０秒、９６℃；４５秒、５５℃；７５秒、７２℃の条件で３０循環される。締めくくりは、１０分、７２℃で放置される。この実施例で試料は、健常者及び患者の組織をＣｙ２色素で標識する。メチル化度の内部補償には、試料増幅用の、フルオレスセンス色素Ｃｙ３及びＣｙ５で標識された、プライマーオリゴヌクレオチッドが使用される。補償用の試料の増幅産物はメチル化状態を代表して表す。即ち、１００％メチル化された状態及び他に、メチル化されていない状態である。この方法において、フルオレスセンス色素の色素強さの関係は、Ｓｃａｎ配列４０００ＸＬ、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ製Ｂｉｏ Ｃｈｉｐを使用して測定され、２種類のオリゴヌクレオチッド、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ及びＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴが、その際、証明すべきＣまたはＴが増幅産物の４７６位置にあるが、計算され、未知の試料のメチル化状態の非メチル化状態に対する比が確認される。
【０１２１】
［実施例７］
試料装入量及び分析複雑性を高めるための多種類の色素の使用
【０１２２】
この実施例は２、３のハイブリッド形成の過程で分析し、試料装入量を高めるのに役に立つ。それには、ＥＬＫ−１遺伝子プロモーター領域の、４個の個体によって、重亜硫酸塩で処理したＤＮＡの、５２９塩基長の、規定される、断片が、プライマーオリゴヌクレオチッド、ＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴで増幅される。この４個の個体に由来する断片は、４種類のフルオレスセンス色素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２及びＣｙ７で標識され、そして、固定されたヌクレオチッド、この場合、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ及びＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴに対し、このとき、証明すべきＣ及びＴが増幅産物の４７６の位置にあるが、ハイブリッド形成される。この、異なるフルオレスセンス標識された試料は、続いて、双方ではなく、一つのフルオレスセンス色素に基づく、異なる波長で分析される。
逆に、一つのＤＮＡ試料から、識別し得る、異なる色素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２、これは、ここでは標識された断片であるが、を得ることができる。６４の遺伝子（データ１）を有するオリゴヌクレオチッドゾンデの一つが、チップ上に固定されると、特殊性が十分になり、６４、例えば、Ｃｙ３を標識された、断片が相互に独立して分析できる。ここで、試料（データ１）がフルオレスセンス色素Ｃｙ３で、試料（データ２）がフルオレスセンス色素Ｃｙ５で、標識され（データ３はＣｙ２で）ることにより、メチル化度が増幅産物の６４増幅産物と同様に、高い複雑性にもかかわらず、信頼できるデータとして検出される。
【０１２３】
［実施例８］
実験的に複製の可能性を実証するための多種類色素の使用
【０１２４】
この実施例では同じＰＣＲ増幅産物が４種類のフルオレスセンス色素で標識され、４倍の過剰になることが実証されている。それには、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡからの、ＥＬＫ−１遺伝子の、プロモーター領域の塩基長５２９の断片がプライマーオリゴヌクレオチッド、ＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＹＧＴＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴ及びＴＡＡＡＣＣＣＲＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴ、で増幅され、固定されるオリゴヌクレオチッド、ここでは、例えば、ＡＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ及びＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴ、に対して、このとき、証明すべきＣ及びＴが増幅産物の４７６の位置にあるが、ハイブリッド形成される。色素Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２及びＣｙ７でフルオレスセンス標識されたプライマーオリゴヌクレオチッドを使用することにより、異なるフルオレスセンス標識された試料の関係が比較でき、この方法により、高い実験信頼性が得られる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＥＬＫ−１断片とハイブリッド形成した後のＤＮＡチップを示す。
【図２】
図２Ａは、図１の一部を切り出したものであり、図２Ｂは、組織標本の未知のメチル化状態を示す部分写真図であり、図２Ｃは、完全メチル化された比較標本のメチル化度を示す部分写真図である。
Claims (50)
- ゲノムＤＮＡ試料の配列コンテクスト５−ＣｐＧ−３にある特定のシトシンのメチル化度を検出する方法であって、ａ）ゲノムＤＮＡを化学的に処理することにより、シトシン塩基をウラシルに変換する一方、５−メチルシトシン塩基を変換しない、ｂ）前記特定のシトシンを含むゲノムＤＮＡの一部を増幅し、増幅産物が実証可能な標識を含むようにし、ｃ）増幅産物を２種類のオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーの少なくとも１種類に結合するように、ハイブリッド形成させ、ｄ）増幅産物が２種類のオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー上にハイブリッド形成している量を、増幅産物の標識を検出することで同定し、ｅ）ハイブリッド形成の結果、２種類のオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー上に検出される標識の割合から、ゲノムＤＮＡにおける前記特定シトシンのメチル化度を推定することを特徴とする、メチル化度の検出方法。
- ｃ）において、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーが、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、第２のオリゴマーが、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成される請求項１に記載のメチル化度の検出方法。
- ｃ）において、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、配列には優先度を下げ、第２のオリゴマーは前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成され、第２のオリゴマーは、増幅産物に本質的に、前記ゲノムＤＮＡ中の特定のシトシンのメチル化度に依存せずに、ハイブリッド形成される請求項１に記載のメチル化度の検出方法。
- ｃ）において、増幅産物を２種類のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）の少なくとも１種類に結合するようにハイブリッド形成させ、第１のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されていないならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成するようにし、配列には優先度を下げ、第２のオリゴマーは、前記特定シトシンがゲノムＤＮＡ中でメチル化されているならば、ゲノムＤＮＡを化学的に処理して得られるＤＮＡ配列と優先的にハイブリッド形成され、第２のオリゴマーは増幅産物に本質的に、前記ゲノムＤＮＡ中の特定のシトシンのメチル化度に依存せずに、ハイブリッド形成される請求項１に記載のメチル化度の検出方法。
- ゲノムＤＮＡ試料に対してのみならず、同様にして、前記特定シトシンがメチル化されているのではなく、むしろメチル化されていない標準ＤＮＡに対して用い、請求項１記載のメチル化されていないＤＮＡを用いて測定した際に２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合をメチル化度０の標準値として用い、同様にして、請求項１記載のメチル化されている標準ＤＮＡを用いて測定することにより、２種類のオリゴヌクレオチド上に検出される標識の割合をメチル化度１の標準値として用い、これらの標準値をゲノムＤＮＡ試料のメチル化度の同定に採用することを特徴とする、請求項１乃至４の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 前記特定のシトシンのメチル化度として任意の、既知の値を示す多くの標準ＤＮＡ試料を、標準値の補正に使用することを特徴とする、請求項５に記載のメチル化度の検出方法。
- 標準として使用されるＤＮＡが、互いに異なる標識であり、試料（請求項１のゲノムＤＮＡからの増幅生産物により製造される）が異なる標識を備えた試料であることを特徴とする請求項５または６に記載のメチル化度の検出方法。
- 異なるゲノム試料から得られる増幅産物が異なる標識を備えていることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 同一のゲノム試料から得られる、区別された標識を備えた増幅産物が、異なる検出方法から得られる値の精度を高めることを達成するために、区別された標識を備えていることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 前記標識が蛍光標識であることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 化学的処理に重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素塩，酸性亜硫酸塩）の溶液を用いることを特徴とする、請求項１〜１０の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 増幅のために、オリゴヌクレオチドが使用され、このオリゴヌクレオチドは配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２に相当する化学前処理されたＤＮＡの少なくとも１８個の塩基配列片であることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- ハイブリッド形成の過程でオリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマーが使用され、これらは配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２に相当する化学前処理されたＤＮＡの少なくとも９個の塩基配列片にハイブリッド形成されるか、または、これらに対応しており、塩基配列は少なくとも１個のＣｐＧジヌクレオチドを含み、これはオリゴマーの約１／３の量、存在することを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 前記標識が化学発色、紫外線吸収、あるいは蛍光分極を用いて検出されることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 標識に放射性核種を用いることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 標識として、質量分析装置で検出可能な、分離可能な質量標識を用いることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- ＰＣＲ産物の全体を、あるいは、その特徴的な断片のみを質量分析装置で検出し、これにより、その質量を基に明確な結果を得る、請求項１から１３のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- オリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）が５’−ＣＧ−３’配列を含むことを特徴とする、請求項１から１７のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- オリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）が５’−ＴＧ−３’配列、及び／または５’−ＣＡ−３’配列を含むことを特徴とする、請求項１から１８のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 第１のオリゴマー（オリゴヌクレオチド及び／またはＰＮＡオリゴマー）が５’−ＣＧ−３’配列を含み、第２のオリゴマーが５’−ＴＧ−３’配列び／または５’−ＣＡ−３’配列を含むことを特徴とする、請求項１８または１９に記載のメチル化度の検出方法。
- 第１と第２の種類のオリゴヌクレオチドが共通の固体相に固定されていることを特徴とする、請求項１〜２０の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- オリゴヌクレオチドが直角または六角形の網目上の平らな固体相に配列され、特定のオリゴヌクレオチドの固体相上の位置が、それぞれの配列と関連づけられていることを特徴とする請求項１１に記載のメチル化度の検出方法。
- 第１と第２のオリゴマーが塩類から分離した、コード化された標識であるビーズ上に固定されている請求項１〜２０の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 請求項１のｂ）段階を以下に述べるように２つの段階に分けて実施することを特徴とする請求項１〜２３の何れか１項に記載のメチル化度の検出方法。
ａ）請求項１に従って前処理されたＤＮＡ試料に非特異的にハイブリッド形成し、更に、ＰＣＲ段階で一つ以上の増幅産物を生ずる、異なる配列を有する、少なくとも、一対のプライマーを用いたＰＣＲ準備増幅と
ｂ）請求項１に従って前処理されたＤＮＡ試料［（＋）−鎖あるいは（−）−鎖］の一片と同じであるか、または逆に相補的であり、増幅されるＤＮＡに特異的にハイブリッド形成する、異なる配列のプライマーを有する、準備増幅において生じた産物のＰＣＲ増幅。 - 多数のＤＮＡ断片の増幅を単一の反応容器内で実行することを特徴とする、請求項１から２４のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 増幅に耐熱性のＤＮＡ複製酵素を用いることを特徴とする、請求項１から２５のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 増幅に使用されるプライマー・オリゴヌクレオチドがＴ、Ａ、Ｃ塩基だけ、あるいはＴ、Ａ、Ｇ塩基だけを含むことを特徴とする、請求項１から２６のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 異なる配列コンテクスト上の少なくとも１０のＣｐＧ位置を同時に分析できることを特徴とする、請求項１から２７のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 異なる配列コンテクスト上の少なくとも５０のＣｐＧ位置を同時に分析できることを特徴とする、請求項１から２８のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 異なる配列コンテクスト上の少なくとも１００のＣｐＧ位置を同時に分析できることを特徴とする、請求項１から２９のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 異なる配列コンテクスト上の少なくとも５００のＣｐＧ位置を同時に分析できることを特徴とする、請求項１から３０のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 異なる配列コンテクスト上の少なくとも１０００のＣｐＧ位置を同時に分析できることを特徴とする、請求項１から３１のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、***、肝臓などから得て、これをパラフィンに封入した細胞系列、血液、喀痰、糞便、尿、脳−脊椎液などの、組織、組織学的標本、または、これらの可能な混合物から、ゲノムＤＮＡ試料を得る、請求項１から３２のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 少なくとも、下記の領域に属する患者及び通常の健常者の好ましくない症状についての診断及び／または推測のために、請求項１〜３３に記載の方法の使用であって、その領域が、薬害；癌；ＣＮＳ−機能欠陥、障害、疾患；侵害徴候または挙動錯乱；脳障害の臨床的、心理的、社会的徴候；精神障害、人格障害；老年性痴呆及び／または複合的徴候；心臓血管についての疾患、機能欠陥、障害；胃腸系統の疾患、機能欠陥、障害；呼吸器系統の疾患、機能欠陥、障害；傷害、炎症、感染、免疫及び／または病気回復期；発育期における生育の逸脱、偏向、遅滞などの身体の疾患、機能欠陥、障害；皮膚の疾患、障害；筋肉，結合組織または骨の機能欠陥、障害、疾患；内分泌、代謝の機能不全、障害、疾患；頭痛、性的機能不全である方法の使用。
- 細胞種別あるいは組織の識別のため、あるいは、細胞分化の研究のために、請求項１から３４のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法。
- 重亜硫酸塩を含有する試薬、増幅産物合成のためのプライマー・オリゴヌクレオチド、及び／または、請求項１０に従って固体相に固定されたオリゴヌクレオチド、更に、請求項１から３５のいずれか１項に記載のメチル化度の検出方法を行うための説明書、を含むキット。
- 配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２に相当する、化学前処理されたＤＮＡの少なくとも１８個の塩基配列片を含有することを特徴とする核酸。
- 化学的に前処理されたＤＮＡ（配列ＩＤ１から配列ＩＤ４０７１２）にハイブリッド形成される、少なくとも９個のヌクレオチドの塩基配列長を含有する、化学的に前処理されたＤＮＡにおけるシトシンメチル化状態を検出するオリゴマー（オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ―オリゴマー）。
- 少なくとも１個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する請求項３８に記載のオリゴマー。
- ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンがオリゴマーの約３分の１量であることを特徴とする請求項３９に記載のオリゴマー。
- ＩＤ１からＩＤ４０７１２の配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド毎に１つのオリゴマーを少なくとも含有する請求項３９に記載のオリゴマーの一組。
- ＩＤ１からＩＤ４０７１２の配列のＣｐＧジヌクレオチド毎に１つのオリゴマーを含有する請求項４１に記載のオリゴマーの一組。
- 請求項１に記載の増幅用原料のプライマー・オリゴヌクレオチドとして、ＩＤ１からＩＤ４０７１２の配列の少なくとも１つ、またはその断片として組み込まれるところの、少なくとも２つの核酸の組。
- 少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが１つの固体相に結合していることを特徴とする請求項４３に記載のオリゴヌクレオチドの組。
- シトシンのメチル化度及び／または、ＩＤ１からＩＤ４０７１２の配列の１つにあたる、化学的に前処理されたゲノムＤＮＡにおける単一ヌクレオチド−ポリモルフィスム（ＳＮＰｓ）の検出用の１組のオリゴマーが請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の少なくとも１０個のオリゴマーを含有すること。
- ＩＤ１からＩＤ４０７１２の配列のＣｐＧジヌクレオドの、それに起因して疾病が発生する―メチル化度の分析用の異なるオリゴマー（Ａｒｒａｙ）の担体上に固定された配列の整列法であって、請求項２〜４の何れか１項に記載の、少なくとも１つのオリゴマーが１つの固体相に接続される方法。
- 請求項３８〜４０の何れか１項に記載の、異なるオリゴマー（Ａｒｒａｙ）の配列が１つの固体相に結合される方法。
- 直角または六角形の網目上の平らな固体相上に配列されていることを特徴とする、請求項４７記載の互いに異なるオリゴマーの配列（Ａｒｒａｙ）及び／またはＰＮＡ―オリゴマー。
- 固体相表面がシリカ、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、金からなることを特徴とする請求項４７または請求項４８に記載の配列（Ａｒｒａｙ）。
- 遺伝子に起因する疾病に関連するメチル化度の分析用のＤＮＡ及び／またはＰＮＡ−Ａｒｒａｙ、である請求項３８〜４０の何れか１項に記載の、少なくとも１つの核酸。
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