KR100559489B1

KR100559489B1 - 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 유효성분으로함유하는 항암제 및 암전이 억제제

Info

Publication number: KR100559489B1
Application number: KR1020030061936A
Authority: KR
Inventors: 고영희; 이상명; 전효곤; 이호재
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-08-05
Filing date: 2003-09-04
Publication date: 2006-03-10
Also published as: KR20050018313A

Abstract

본 발명은 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제, 암전이 억제제 및 대추 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 대추 추출물로부터 분리된 11개의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제, 암전이 억제제 및 11개의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 11개의 화합물은 위암, 폐암, 간암 및 혈액암 등 각종 암질환과 종양의 치료에 사용될 수 있고, 외과적 적출 수술 후 이차암 전이를 억제하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제 및 암전이 억제제{Composition comprising ZiZyphy Fructus extract and compounds isolated from above extract for anti-cancer and anti-metastatic}

도 1은 본 발명에 따른 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물의 추출·분리방법을 나타낸 도식도이다.

도 2는 본 발명의 대추 추출물로부터 분리된 화합물 1 ~ 화합물 11의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명의 대추 추출물을 육종(sarcoma) 180 암세포를 이식한 ICR 생쥐에, 경구 투여하고 그의 생존연장율을 측정한 도이다.

도 4는 본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을, B16-F10 암세포를 BDF-1 생쥐의 꼬리정맥을 통하여 폐암을 유발한 생쥐에, 경구 투여한 후 폐암전이 억제율을 측정한 도이다.

본 발명은 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제 및 암전이 억제제에 관한 것이다.

암의 전이과정은 전이성 암세포가 최초 발생부위에서 이탈하여, 주변조직으로 침윤하여 다른 부위에서의 증식에 의해 2차 종양을 형성하게 되는 일련의 과정에 의해 이루어진다. 즉, 전이 과정은 이동, 접착, 침윤의 세가지 주요 단계로 구성되며, 이 과정에 있어서 MMP-2를 포함한 여러 매트릭스메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase, 이하 'MMP'라 함)들은 암세포가 세포외기질(extracellura matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 분해하여 암세포의 침윤을 유도하는데 중요한 역할을 하며, 현재까지 약 17종류가 분리 확인되었다.

MMP는 콜라겐, 프로테오글리칸 및 젤라틴과 같은 거대 생체 고분자들을 분해시킬 수 있는 아연을 함유한 엔도펩티다아제류로서, 콜라게나제(collagenase), 젤라티나제(gelatinase), 스트로멜리신(stromelysin) 및 막형 MMP(membrane type MMP; MT-MMP)로 크게 분류된다. 이들은 모두 전구효소(proenzyme)의 형태로 발현된 후 일부분이 자체적으로 잘려나감으로써 활성화 된다[Bond, J. S., et al., Int. J. Biochem., 75, 565~574(1985); Chen, J. M., Chen, W. T., Cell, 48, 193~203(1987); Harris, E. D. et al., Coll Rel Res, 4, 493~512(1984)].

콜라게나제는 삼중나선형 간질성 콜라겐과 젤라틴 등에 작용하며, 섬유아세포 콜라게나제(MMP-1), 호중구 콜라게나제(MMP-8) 및 콜라게나제-3(MMP-13)의 3종류가 알려져 있다. 제 I, II 및 III형의 콜라겐 소섬유(collagen fibrils)들을 3/4 과 1/4 크기의 두개 단편으로 절단하는 것으로 보고되어 있다[Goldberg, G. I., et al, J. Biol. Chem., 261, 6600~6605(1986); Fini, M. E., et al., Biochemistry, 26, 6156~6165(1987); Hasty, K. A., et al., T. Biol. Chem., 265, 11421~11424 (1990); Freije. et al., J. Biol. Chem., 269, 16766~16773(1994)]. 이들 세가지 콜라게나제들은 서로 약 50% 이상의 서열 동일성을 가지며, MMP-1과 MMP-8의 촉매성 부위에 대한 X선 결정구조 연구에 의하면 2개의 아연 이온 결합부위와 1 내지 2개의 칼슘이온 결합부위를 갖는 것으로 알려져 있다[Borkakoti, et al., Nature Struct. Biol., 1, 106~110(1994); Bode, et al., EMBO, J., 13, 1263~1269(1994); Lovejoy, et al., Science, 263, 375~377(1994)].

젤라티나제는 변성 콜라겐과 제 IV, V, VII, X형 콜라겐을 분해하는 효소로, 섬유아세포가 분비하는 72kDa 젤라티나제(젤라티나제 A, MMP-2)와 단핵 식세포가 방출하는 92kDa 젤라티나제(젤라티나제 B; MMP-9)의 두 종류가 있으며, 특히 기저막의 주성분인 제 IV형 콜라겐에 특이하게 작용하는 것으로 알려져 있다[Murphy, G., et al., Biochem. J., 258, 463~472(1989); Stetler-Stevenson, W. G., et al., J. Biol. Chem., 264, 1353~1356(1989)]. 특히 이 효소들은 암세포의 침윤과 전이에 있어서 가장 중요한 효소로, B16-F10과 같은 고전이성 암세포주에서 과다하게 분비되는 것으로 알려져 있다. MMP-9는 MMP-2에 비해 카복시 말단 부위와 촉매기능 부위 사이에 기능이 밝혀지지 않은 서열을 더 포함한다[Wilhelm, S. M. et al., J. Biol. Chem., 17213~17221(1989)].

스트로멜리신은 원래 프로테오글리카나제의 특징을 가지고 있지만 실제 더 넓은 단백질 분해 스펙트럼을 갖고 있으며, 스트로멜리신-1(MMP-3), 스트로멜리신-2(MMP-10), 스트로멜리신-3(MMP-11) 및 매트릴라이신(MMP-7)이 있으며, 피브로넥틴 (fibronectin)과 라미닌(laminin) 등에 작용한다[Chin, J. R., et al., J. Biol. Chem., 260, 12367(1985); Whitham, S. E. et al., Biochem J., 240, 913~916 (1986)].

이외에도 메탈로엘라스타제(MMP-12)와 막형 MMP에 속하는 MT1-MMP(MMP-14), MT2-MMP(MMP-15), MT3-MMP(MMP-16) 등이 알려져 있다.

MMP의 기저막 분해작용은 암의 침윤과 전이에 있어서 반드시 선행되어야 하는 필수적인 과정으로, MMP가 기저막을 분해하여야 상피세포에 생긴 암세포가 혈관으로 들어가거나 주위의 기질로 침윤할 수 있게 된다. MMP가 과다발현되거나 활성화되면 암의 침윤과 전이를 촉진시킬 수 있다. 따라서, MMP 활성을 억제하면 암세포 전이를 막을 수 있다.

1940년대 초 니트로젠 무스타드(nitrogen mustard)가 개발되어 악성 림프종환자에서 항암효과를 확인한 후, 항암제 개발연구가 계속되어 왔으나, 1990년대 말까지도 임상에 이용되는 항암제는 50종 내외에 불과하다. 악성림프종, 소아 백혈병 및 고환암 등에서는 병용화학요법에 의해 70~80% 내외의 환자에서 완치가 가능하나 아직도 대부분의 고형암에서 항암화학요법의 효과는 제한적이다. 그 동안 병용요법의 발달 및 용량강화요법이나 조혈모세포이식을 이용한 고용량 화학요법의 개발로 항암효과를 올리고 있으나 대부분의 화학요법제들은 그 효과에 상응하는 여러 가지 부작용을 일으키고 있으므로 궁극적으로 더욱 선택적이고 강력한 항암화학요법제의 개발이 시급하다.

따라서, 보다 효과가 뛰어나고 부작용이 적은 항암제를 개발하기 위하여 천연물로부터 분리한 물질에 대해 관심을 갖기 시작하였다.

이에, 본 발명자들은 항암 효과가 우수하고 부작용이 적은 유효성분을 찾던 중 대추 추출물에서 분리한 물질이 이러한 활성이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 및 암전이 억제제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 대추 추출물의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 대추 추출물로부터 분리된 11개의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제 및 암전이 억제제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 대추 추출물로부터 분리된 11개의 화합물의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 대추 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 및 암전이 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 대추 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 대추 추출물로부터 분리된 11개의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제 및 암전이 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 대추 추출물로부터 분리된 11개의 화합물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 대추 에틸아세테이트 추출물로부터 분리된 11개의 화합물 중 화합물 3(3-O-시스-p-쿠마로일 알피톨릭산), 화합물 4(3-O-트랜스-p-쿠마로일 알피톨릭산), 화합물 7(베튤리닉산), 화합물 9(베튤로닉산)에서 강한 항암활성이 나타난다.

또한, 본 발명의 조성물은 평균 수명을 연장시키는 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 조성물은 폐암전이를 억제한다.

본 발명의 대추 에틸아세테이트 추출물 및 그로부터 분리된 화합물은 급성독성 실험을 한 결과, MLD(mous lethal dosage)값이 1000 ㎎/㎏ 이상으로 비교적 안정하다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 사용된 대추과육(Zizyphy Fructus)은 갈매나무과 대추나무속에 속하는 교목성 과수로서 중국계 대추와 인도계 대추로 나뉘어진다. 대추는 비타민 C가 풍부하고 칼슘, 인, 철분 등 각종 미네랄을 다량으로 함유하고 있으며, 적은 양이지만 인체에 필요한 구리도 들어 있는 알칼리성 식품이다. 또한 다른 과일에 비해 섬유소가 많고 부드러워 위와 장을 자극하지 않으므로 위궤양이 있는 사람에게도 좋다. 또한 대추는 골다공증 예방, 노화방지와 피로회복, 진정·진경작용과 불면증 치료, 부인냉증 완화, 강장작용 및 이뇨작용, 간보호작용, 변비예방, 복통완 화작용, 조혈작용(빈혈완화), 혈압강하, 항염효과, 진해작용 등에 탁월한 효능이 있다.

본 발명의 대추 추출물의 제조방법은, 1) 대추를 물, 알콜 또는 물과 알콜의 혼합용매로 추출한다.

또한, 상기 1) 단계에 더하여 2) 단계를 진행시킬 수도 있다.

즉, 상기한 물, 알콜 또는 물과 알콜의 혼합용매로 추출하는 단계(단계 1)에서 얻은 추출물에 증류수를 가하고 알칼리 용액으로 염을 형성하고 에틸아세테이트로 진탕 추출하여 에틸아세테이트층을 제거하고 남은 수용액층에 산을 가하여 중화한 후 에틸아세테이트로 진탕 추출하고 감압농축하는 단계(단계 2)로 이루어진다.

상기와 같이하여 얻은 대추 추출물은 알칼리 용액으로 처리하여 얻은 수용액층에 산을 가한 후, 에틸아세테이트로 추출하였으므로, 산성 천연 복합물을 얻게 된다.

또한, 상기 2)단계 후, 대추 추출물을 메탄올에 용해시킨 후 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

제 1단계에서는, 대추의 과육을 쇄절하여 물, 알콜 또는 물과 알콜의 혼합용매로 추출로 환류·추출하여 감압여과한 후 그 여액을 감압농축하여 추출물을 얻는다. 추출용매는 메탄올이 바람직하다.

제 2단계에서는, 농축된 추출물을 과량의 물에 현탁하여 알칼리 용액을 적당량 가하여 염을 형성하고, 과량의 에틸아세테이트를 넣고 진탕추출하고 남은 수용 액에 산을 적당량 가하여 중화하고 과량의 에틸아세테이트를 넣고 진탕추출하고 에틸아세테이트층을 감압농축하여 추출물을 얻는다. 제 2단계에서 알칼리 용액은 0.1N 수산화나트륨이 바람직하고, 산은 0.1N 염산이 바람직하다.

상기 제 2단계 후, 농축된 추출물을 소량의 메탄올에 용해시킨 후 Sepack C18 카트리지에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 아세토니트릴 수용액으로 각각 분획한후 YMC 젤 ODS-A 칼럼 크로마토그래피 (YMC gel column chromatography)를 수행하여 화합물 1 ~ 화합물 11로 분리한다. 분리된 화합물은 하기 화학식 1 내지 화학식 4에 나타낸다.

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 11개의 화합물의 항암제로서의 활성을 측정하기 위하여 세포독성 실험을 하였으며, 그 결과 강한 항암활성이 있음을 확인하였다.

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 11개의 화합물의 암전이 억제제로서의 활성을 측정하기 위하여 생쥐의 꼬리정맥에 암세포주를 이식한 후 마우스의 폐를 적출하여 형성된 종양을 계산한 결과 폐전이가 60%나 감소되었다.

또한, 복수암이 유발된 쥐에 본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 11개의 화합물을 투여한 결과 생쥐의 생존일이 2배 이상 길어졌다.

본 발명의 조성물은 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물, 또는 그 혼합물에 추가로 다른 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 일일 투여량은 300~600㎎/㎏이고, 100~300㎎/㎏의 양을 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 11개의 화합물은 랫트에서 1000㎎/㎏ 까지 독성을 나타내지 아니하였으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 500㎎/㎏ 이상인 매우 안정한 물질이다.

본 발명의 조성물은 항암 및 암전이 억제 등의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 시럽제의 제조

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물, 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화합물 1의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

화합물 1 또는 화합물 2·염산염 ···········2.0 g

사카린 ······················· 0.8 g

당 ························ 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················ 0.04 g

에탄올 ·······················4.0 g

소르브산 ······················0.4 g

증류수 ·······················정량

제제예 2 : 정제의 제조

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 15㎎ 함유한 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

본 발명의 대추 추출물 250g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 제조하였다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

본 발명의 대추 추출물··············250 g

락토오스 ···················175.9 g

감자전분 ····················180 g

콜로이드성 규산 ················ 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ····················160 g

활석 ······················ 50 g

스테아르산 마그네슘 ··············· 5 g

제제예 3 : 주사액제의 제조

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 10㎎ 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

본 발명의 대추 추출물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

본 발명의 대추 추출물··············1 g

염화나트륨···················0.6 g

아스코르브산··················0.1 g

증류수·····················정량

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물의 제조

1. 대추 조추출물

1) 대추 물 추출물

생약시장에서 채취한 대추과육 5㎏를 쇄절하고 물로 24시간 동안 환류추출하 여 감압여과한 후 그 여액을 60℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 물 추출물을 얻었다.

2) 대추 알콜 추출물

생약시장에서 채취한 대추과육 5㎏를 쇄절하고 100% 메탄올로 24시간 동안 환류추출하여 감압여과한 후 그 여액을 60℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 메탄올 추출물을 얻었다.

3) 대추 물과 알콜의 혼합용매 추출물

생약시장에서 채취한 대추과육 5㎏를 쇄절하고 50% 물과 50% 메탄올의 혼합용매로 24시간 동안 환류추출하여 감압여과한 후 그 여액을 60℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 물과 알콜의 혼합용매 추출물을 얻었다.

2. 대추 추출물의 분리

상기 1의 2)에서 얻은 농축된 메탄올 추출물에 2L의 증류수를 부어 현탁시킨 후, 0.1 N 수산화나트륨을 적당량 가하여 산성화합물에 대한 염을 생성하고, 분액여두에서 2L의 에틸아세테이트로 진탕 추출하여 에틸아세테이트 가용부를 제거한 다음, 수용액층을 0.1 N 염산으로 중화시킨 후 2L의 에틸아세테이트로 분액여두에서 진탕추출하고, 추출액을 60℃의 수조에서 감압농축하여 에틸아세테이트 추출물을 얻었다.

상기 에틸아세테이트 추출물을 40㎖ 메탄올에 용해시킨 후, Sepack C18 카트리지에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 아세토니트릴 수용액으로 각각 분획하여, 60% 아세토니트릴 수용액 분획과 70% 아세토니트릴 수용액 분획을 얻었다.

상기 분획을 70% 아세토니트릴 수용액을 용출용매로 하여 YMC 젤 ODS-A 칼럼 크로마토그래피(YMC gel column chromatography)를 수행하여 활성물질을 분리하고, 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)에서 화학식 1에 해당하는 11개의 화합물을 얻었다.

본 발명에 따른 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물의 추출·분리방법은 도 1에 나타내었고, 분리한 화합물 1 ~ 화합물 11의 ¹H-NMR은 도 2에 나타내었다.

실험예 1 : 본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물의 실험관내 항암효과 측정

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물의 세포독성을 알아보기 위하여, SRB 시험법으로 세포독성을 측정하였다.

세포는 배양병(cell culture flask)에 균일(monolayer)하게 자라도록 세포농도를 조절하면서 키웠다. 실험 바로전 세포에 37℃의 트립신-EDTA(trypsin-EDTA) 용액을 적당량(약 5㎖) 넣고 37℃에서 1~2분간 방치하였다. 기벽에 부착된 세포가 떨어지면 원심분리하여 용액을 완전히 제거하고 RPMI-1640 배지를 넣고, 세포의 생장주기에 맞춰 일정수로 희석하였다. 이 세포희석액을 180㎕씩 96 웰 플레이트에 넣고 37℃, 5% CO₂ 대기하에서 24시간동안 배양하였다. 시료용액은 각 시료가 300, 100, 30, 10㎍/㎖이 되도록 배지(0.5% DMSO)에 희석한 후, 농도당 20㎕씩 취하여 세포희석액에 각각 가한 후 37℃, 5% CO₂ 대기하에서 48시간 배양한 후, 각 웰들의 배지를 제거하고 10%의 삼염화 초산(trichloroacetic acid, TCA)을 각 웰당 50㎕씩 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치하여 세포들을 바닥에 고정시킨 후 TCA를 버리고 상수로 수회 세척하여 TCA를 완전히 제거하였다. 실온에서 물기가 없도록 완전히 건조한 후, 1% 초산에 녹인 0.4% 설포로다민 B(sulforhodamine B, SRB) 염색용액을 가하여 30분간 세포를 염색하고 다시 1% 초산 용액으로 수회 세척하여 세포에 결합하지 않은 SRB를 모두 제거시킨 후 실온에서 완전히 건조하였다. 건조시킨 각 웰에 10mM 트리스[하이드록시메틸]아미노메탄(tris[hydroxymethyl]aminomethane) 용액 100㎕를 가해 염료를 녹여 낸 후, 520㎚에서 흡광도를 측정하였다.

실험은 3회 이상 반복하여 각각을 평균하여 ED₅₀ 값을 산출하였다.

ED₅₀ 값은 대조군의 50% 수준으로 각 세포의 성장을 억제하는 시료의 농도(μ㏖/㎖)로 주어지며, Thayer 등의 방법에 의해 결정하였다.

시험군의 각농도에 대한 성장률 Y(%)는 다음과 같이 계산하였다.

Y(%) = [(T-Co)/(C-Co)] × 100;

※ T = 시험군의 48시간 배양후 평균 세포수(cells/㎖),

C = 대조군의 48시간 배양후 평균 세포수(cells/㎖),

Co = 배양 시작시 평균 세포수(cells/㎖)이다.

각각 농도의 Y(%)값과 log10dose를 도식화하고 다음과 같은 식에 의해 회귀선을 구하였다. 이때 각각의 농도에 대하여 계산한 Y(%)값이 모두 55% 보다 크거나, 45% 보다 작으면 재실험을 실시하였다.

이렇게 구한 기울기와 절편을 이용하여 회귀선 Y = A+B+X 를 얻었다. 이 회귀선의 기울기와 절편으로부터 ED₅₀값을 계산하였다.

50 = A+B(log10ED₅₀)

log10ED₅₀= (50-A)/B

ED₅₀= 10^log10ED50 μ㏖(또는 ㎎/㎖)

결과는 표 1에 나타내었다.

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물들의 세포독성

암 세포주	ED₅₀ (μM)
암 세포주	대추 추출물	화합물 1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
폐암 세포주 (B16-F10)	12.5	>20	>20	10.2	7.3	>20	>20	14	>20	>20	>20	>20
피부암세포주(SK-Mel-2)	10.7	>20	>20	8.9	6.9	>20	>20	7.2	>20	>20	>20	>20
전립선암세포주 (PC-3)	12	>20	>20	7.3	4.0	>20	>20	15	15	19	>20	>20
피부암세포주(LOX-IMVI)	8.7	>20	>20	5.5	4.3	>20	>20	9.2	>20	16	>20	>20
폐암 세포주 (A549)	11.9	>20	>20	4.7	12	>20	>20	14	>20	8.9	>20	19.9
백혈병(K562)	12.2	>20	>20	10.7	9.4	>20	>20	13	>20	13	>20	15.0

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 대추 추출물로부터 분리된 화합물 중 화합물 3, 화합물 4, 화합물 7, 화합물 9 에서 강한 항암 활성이 나타남을 확인하였다.

실험예 2 : 본 발명의 대추 추출물에 의한 암이식 ICR 생쥐의 생존연장효과 측정

ICR계 마우스의 복강내에서 7일간 배양된 육종(sarcoma) 180 암세포를 취해 빙냉 멸균 생리식염수를 가해 1500rpm 으로 5분간 원심분리하여 세포침전물을 분리하였다. 분리된 세포침전물은 다시 빙냉 멸균 생리 식염수에 2~3회 세척하여 순수한 육종 180 세포를 취하였다. 얻어진 세포를 다시 빙냉 생리식염수로 세척 희석하여 10⁷ 세포/㎖가 되도록 세포현탁액을 만들고, 복수암을 유발시키기 위하여 치사량에 해당하는 세포현탁액 0.1㎖(1×10⁶ 세포) 씩을 복강내에 주사하였다.

상기 실시예에서 제조한 대추 추출물을 주사용 생리식염수에 용해시킨 후, 복수암이 유발된 쥐에 암세포 이식 24시간 후부터 매일 0.2㎖씩 300 ㎎/㎏/일의 농도로 경구투여하였다.

대조군으로는 생리 식염수만 사용하여 복수암이 유발된 쥐에 경구투여하였다.

생쥐는 각 실험군당 10마리씩 사용하였다.

항암효과의 평가는 대조군의 평균수명(C)에 대한 실험군의 평균수명(T)의 백분율(T/C %)로 계산하였으며, 125% 이상일 때를 유효하다고 평가하였다.

T/C(%) = T/C ×100

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 대조군의 평균 수명이 19일인데 반해, 본 발명의 대추 추출물이 투여된 실험군은 평균 수명이 40일 이상으로 대부분의 생쥐가 생존 하였다.

실험예 3 : 본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물의 폐암전이 억제 실험

소혈청(FBS) 4%를 함유한 RPMI-1640 배지에서 계대배양한 B16-F10 암세포주는 빙냉 생리 식염수로 2회 세척한 후 치사량 5×10⁶cell/mouse에 해당하는 세포희석액 0.2㎖씩 각 C57BL6 마우스의 꼬리정맥에 주사하였다.

시료의 투여는 대추 추출물의 경우 300 ㎎/㎏/일, 정제된 화합물 7의 경우는 100 ㎎/㎏/일의 농도로 주사용 식염수에 용해시켜, 암세포 이식 직후부터 매일 0.2㎖씩 15회 연속하여 경구 투여하였으며, 대조군은 주사용 식염수 0.2㎖로 하였다.

항암효과의 평가는 암세포 이식 15일 후 마우스의 가슴을 절개하고 폐를 적출한 후 형성된 종양을 계산하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 7(베튤리닉산)을 100 ㎎/㎏/일로 경구투여한 처리군에 있어서 흑색종양세포의 폐전이율은 대조군을 100%로 하였을 때 비하여 60% 억제하였고, 본 발명의 대추 추출물을 300 ㎎/㎏/일로 경구투여한 처리군에 있어서 흑색종양세포의 폐전이는 대조군을 100%로 하였을 때 비하여 15% 억제하였다.

실험예 4 : 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 치료제로서 임상적으로 활용하기 위하여 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원부재(SPF) SD 계 랫트를 실험군당 2마리씩 사용하였으며, 상기 실시예에서 제조한 대추 에틸아세테이트 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 주사용 증류수에 용해시켜 1g/㎏/㎖의 용량으로 랫트에 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

실험결과, 본 발명의 조성물을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

또한, 본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물은 랫트에서 1000 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소 치사량 (LD₅₀)은 500 ㎎/㎏ 이상인 안정한 물질로 판단되었다.

본 발명의 대추 추출물 및 그로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 하는 조성물은, 위암, 폐암, 간암 및 혈액암 등 각종 암질환과 종양의 치료에 사용될 수 있고, 외과적 적출 수술 후 이차암 전이를 억제하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

대추를 메탄올로 추출한 후 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻는 제 1단계;

상기 제 1단계에서 얻은 메탄올 추출물에 증류수를 가하고 알칼리 용액으로 염을 형성하고 에틸아세테이트로 진탕 추출하여 에틸아세테이트층을 제거하는 제 2단계;

상기 제 2단계에서 남은 수용액층에 산을 가하여 중화한 후 에틸아세테이트로 진탕 추출하고 감압농축하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 제 3단계; 및

상기 에틸아세테이트 추출물을 메탄올에 용해시킨 후 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 제 4단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 폐암, 전립선암 또는 백혈병 치료제용 대추 추출물.
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제 1항에 있어서, 상기 2 단계에서 알칼리는 수산화나트륨이고, 상기 제 3단계에서의 산은 염산인 것을 특징으로 하는, 폐암, 전립선암 또는 백혈병 치료제용 대추 추출물.
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하기 화학식 2'의 화합물을 유효성분으로 함유하는, 폐암, 전립선암 또는 백혈병 치료제:

<화학식 2'>

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