KR100595735B1

KR100595735B1 - 연골 재생 및 골관절염 치료용 생약 조성물

Info

Publication number: KR100595735B1
Application number: KR1020050100079A
Authority: KR
Inventors: 김시나; 남경숙; 황성완; 황성연
Original assignee: 주식회사 케이엠에스아이; 황성연
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2005-10-24
Publication date: 2006-06-30
Also published as: CN101282737A

Abstract

본 발명은 연골 재생 및 골관절염 치료용 생약 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 강활, 인진 및 소엽을 포함하는 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절 조직 분해 효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용, 발부종 억제, 관절활액의 증가 억제 작용, 관절활액의 총단백질 증가 억제 등의 치료 효능이 있어 연골 재생 및 골관절염 치료제로 이용가능하다.

강활 추출물, 인진 추출물, 소엽 추출물, 프로테오글리칸, 프로스타글란딘, MMP-9, COX-2, 연골 재생제, 골관절염.

Description

연골 재생 및 골관절염 치료용 생약 조성물{HERBAL PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR REGENERATIVE AGENT OF CARTILAGINOUS TISSUE AND TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS}

도 1은 LPS에 의해 유도된 골관절염에 대하여 실시예 1-1 내지 1-4, 2 및 3의 강활, 인진 및 소엽의 개별 추출물과 생약 조성물의 소염 억제 효과를 나타내는 것이다.

도 2a 내지 도 2c는 실험예 2에서 LPS에 의하여 골관절염이 유발된 마우스 대식세포에 실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/㎖로 처리한 후의 일산화탄소 생성 정도를 나타낸 것이며, LPS는 염증 유발 후 대조군의 생성된 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다.

도 3a 내지 3b는 실험예 3에서 LCM에 의하여 골관절염이 유발된 마우스 대식세포에 실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/㎖로 처리한 후 생성된 프로스타글란딘 E₂의 양을 나타낸 것이다. CM은 LCM에 의하여 골관절염 유발 후 생성된 대조군의 프로스타글란딘 E₂의 총량을 나타낸 것이다.

도 4a 내지 4c는 실험예 4에서 LCM에 의하여 골관절염이 유발된 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/㎖로 처리한 후, 생성된 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다. CM은 LCM에 의하여 골관절염 유발 후 생성된 대조군의 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다.

도 5a 내지 5c는 실험예 5에서 LCM에 의하여 골관절염이 유발된 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/㎖로 처리한 후, 생성된 프로스타글란딘 E₂의 총량을 나타낸 것이다. CM은 LCM에 의하여 골관절염 유발 후 생성된 대조군의 프로스타글란딘 E₂의 총량을 나타낸 것이다.

도 6a 내지 6c는 실험예 6에서 LCM에 의하여 골관절염이 유발된 연골 조직 세포에 실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/㎖로 처리한 후, 분해된 프로테오글리칸의 총량을 나타낸 것이다. CM은 LCM에 의하여 골관절염 유발 후 생성된 대조군의 프로테오글리칸의 총량을 나타낸 것이다.

도 7은 실험예 7에서 LCM에 의하여 골관절염이 유발된 연골 조직 세포에 실시예 1-4 및 2의 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/㎖로 처리한 후, 활성화된 MMP-9 및

MMP-2의 총량을 나타낸 것이다. CM은 LCM에 의하여 골관절염 유발 후 생성된 대조군의 MMP-9의 총량을 나타낸 것이다.

도 8은 실험예 8에서 LCM에 의하여 골관절염이 유발된 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/㎖로 처리한 후 발현되는 COX-2의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염 유발 후 발현된 COX-2의 총량을 의미한다.

도 9는 실험예 9에서 실시예 1-4 및 2의 생약 조성물이 랫드에서 발부종의 억제 정도를 나타낸 것이다.

도 10은 실험예 12에서 실시예 1-4 및 2의 생약 추출물에 의한 통증 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 11은 실시예 2의 생약 조성물이 골관절염이 유도된 동물 모델에서 연골 재생에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 12는 실시예 2의 생약 조성물이 골관절염이 유도된 동물 모델에서 관절 활액의 양적 변화에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 13은 실시예 2의 생약 조성물이 골관절염이 유도된 동물 모델에서 관절 활액 내의 프로테오글리칸에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 14는 실시예 2의 생약 조성물이 골관절염이 유도된 동물 모델에서 관절 활액 내의 총단백질에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 15는 실시예 2의 생약 조성물이 골관절염이 유도된 동물 모델에서 관절 활액 내의 프로스타글란딘 E₂에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 16은 실시예 2의 생약 조성물이 골관절염이 유도된 동물 모델에서 관절 조직의 사프라닌 염색 결과와 활액막 세포 분포 결과를 나타낸 것이다.

[산업상 이용분야]

본 발명은 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절 조직 분해 효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용, 발부종 억제, 관절활액의 증가 억제 작용, 관절활액의 총단백질 증가 억제 등의 치료 효능이 있는 연골 재생 및 골관절염 치료제에 관한 것이다.

[종래기술]

인간을 비롯한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용한 에너지 대사 과정에서 발생하는 활성 산소의 상해에 대하여 자기 방어기구를 구비하고 있지만, 조직의 방어능을 초월한 활성산소의 생성은 관절염 등 여러 질환의 원인이 되고 있다.

상기 활성산소는 가장 안정한 형태의 산소인 삼중항 산소(³O₂)가 산화, 환원과정에서 환원되어 생성되는 일중항 산소인 수퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion, ¹O₂-)과 과산화수소(H₂O₂), 아히드록시라디칼(·OH)과 같은 자유라디칼로서, 이들은 단백질, DNA, 효소 및 T 세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 각종 질병을 유발시킨다.

이러한 이유로 항산화제의 개발연구가 활발히 진행되어 예방적 항산화제인 수퍼옥사이드 디스무테이즈(Superoxide dismutase), 카탈레이즈(Catalase), 글루타티온 페록시데이즈(Glutathioneperoxidase)등과 같은 항산화 효소와 천연 항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 합성 항산화제인 부틸히드록시 아니졸(t-Butyl-4-hydroxyanisole; BHA) 디부틸 히드록시 톨루엔(3,5-(t-Butyl)-4-hydroxytoluene; BHT) 등 많은 항산화제가 알려져 있다. 그러나 천연 항산화 효소는 노화에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 저하되고 합성 항산화제는 돌연변이를 유발하거나 독성 등의 문제가 있어 안전하고 효과적인 천연 항산화제의 개발이 절실히 요청되고 있다.

염증성 질환이란 세균의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미한다. 염증을 유발하는 효소인 시클로옥시게나제(COX)는 2종류가 알려져 있다. 이중 COX-1는 염증부위 뿐만 아니라, 정상적인 인체 여러 장기와 조직, 즉, 위장관 또는 신장 등에서 프로스타글란딘(Prostaglandin; 이하 PG)의 물질을 생성하는데에도 관여한다. 이에 비하여 COX-2는 염증이 있는 부위에서만 작용하는 효소로 알려져 있다. 시판되고 있는 디클로페낙(diclofenac), 아스피린(aspirin) 및 이부프로펜(ibuprofen) 등의 비스테로이드성 항염증제(Nonseoidal anti-inflammatory drugs; 이하 NSAIDs)는 COX-1과 COX-2를 동시에 억제하거나 주로 COX-1을 억제하므로 염증이 있는 조직 뿐만 아니라, 장기 복용시, 간 위장관, 또는 신장 등의 기능 유지에 필수적인 PG를 동시에 억제하여 많은 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다(Isselbcher et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, (13th ed)2, pp1543-1711).

골관절염(Osteoarthritis, OA)은 전체 골근격계 질환의 40 내지 60%를 차지하고 있는 가장 흔한 운동기계의 질환이며, 평균 연령이 증가되면서 유병율이 꾸준히 증가되고 있다. 전세계 인구의 15%가 OA를 앓고 있는 것으로 진단되며, 그 중 60% 정도는 60 대 이상에 분포되어 있다(Haq Ⅰet al., J.Osteroarthritis, 79(993), pp377~383).

관절염은 관절의 연골이 닳아 없어져 관절뼈가 맞부딪히면서 심한 관절통을 유발하며 그로 인한 활동의 제한이 장애의 주된 원인이 된다. 만성적 경과를 밟는 질환의 특성에 의하여 장기적인 치료를 필요로 하는데, 장기적인 약물 복용으로 인한 합병증 및 부작용이 발생하게 된다. 따라서 관절염의 치료시 통증의 완화, 관절 연골의 기능 유지 및 회복은 물론 합병증도 함께 치료할 수 있는 치료제의 개발이 필요하다.

일반적으로 시행되는 관절염의 치료 방법으로는, 초기에 있어 통증만 있는 경우에는 단순 진통제를 복용하여 통증을 없애는데 초점이 맞춰 있으나, 좀 더 진행된 후 통증이 계속된 경우에는 항염 효과가 강한 소염 진통제를 사용하게 된다. 그러나 이러한 상기 소염 진통제는 코르티코스테로이드(Corticosteroid) 유형의 소염물질을 사용하게 된다. 예를 들어, 소염 진통제의 일종인 하이드로코르티존(Hydrocortisone) 및 베타메타손(betamethasone) 등을 장기간 사용하는 경우 위, 간, 신장의 기능을 저하시키고 연골 세포의 재생 능력을 저해시키는 등의 부작용이 있어 지속적인 관찰과 함께 경구투여가 아닌 관절 내 주사를 원칙으로 한다.

따라서 관절염 치료에 가장 일반적인 약물복용 방법에 있어 진통 억제 및 소염 효과를 가지며 상기 부작용을 낮추는 많은 약들이 개발되어 왔으며, 이들의 대표적인 예로는 디클로페낙(diclofenac), 아스피린(aspirin) 및 이부프로펜(ibuprofen) 등의 비스테로이드성 소염제(NSAID)가 이에 해당된다. 그러나 비스테 로이드성 소염제 역시 소화기, 특히 위장에 부작용을 일으키는 문제점을 가지고 있다.

또한 이들은 관절염의 근본적인 치료 없이 통증 및 염증만을 제거하는 효과를 가진다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절 조직 분해 효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용, 발부종 억제, 관절활액의 증가 억제 작용, 관절활액의 총단백질 증가 억제 등의 치료 효능이 있어 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 강활, 인진, 소엽을 포함하는 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 강활, 인진 및 소엽의 혼합물을 증류수 또는 에탄올 수용액으로 추출하거나, 상기 강활, 인진 및 소엽을 각각 증류수 또는 에탄올 수용액으로 추출하여 추출물을 얻고, 상기 추출물을 에틸 아세테이트로 층분리하여 농축시키는 공정을 포함하는 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물은 강활, 인진 및 소엽을 유효성분으로 포함한다.

본 발명에서 유효성분으로 사용되는 강활(羌活; Angelica koreana Max.)은 리모넨(limonene), o-크레졸, 알파-피넨(alpha-pinene) 등의 정유성분 및 오스테놀(osthenol), 베르갑틴(bergaptin) 등의 성분을 포함하고 있으며, 감기, 두통, 신경통 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

상기 인진(茵蔯, Artemisiae Capillaris Thunb)은 국화과 쑥속에 속하는 다년생 초본형 낙엽관목으로 생당쑥, 애당쑥, 사철쑥, 흰산쑥(Artemisa sacrorum subsp. Kitamura), 털산쑥(Artemisa sacrorum subsp. manshuria var. vestita Kitamura) 등으로 불리워지고 있다. 또한 특유의 향기와 약효로 인하여 많은 관심을 가져왔으며, 민간에서 식용, 약용, 단방약으로 애용하여 왔다. 동의보감과 본초강목에서 손상된 간회복, 지방간, 간암, 간염, 황달 등의 간질환의 치료, 예방, 식욕증진, 소화불량, 담낭염, 위장병 등의 위장질환의 치료, 중풍, 혈액순환, 청혈작용 등의 순환기계 기능의 개선 및 당뇨병의 치료에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 인진에 함유되어 있는 주성분은 배당체인 스코폴레틴(scopoletin)을 비롯한 정유성분과 쿠마린 (coumarin), 옥시카르본산(oxycarbonic acid), 사포닌(saponin), 탄닌(tannin), 시토스테린 수지(sitosterin resin) 등으로, 해독, 항균, 면역 등의 효과가 예상되며 혈청 지질의 감소효과로 고혈압, 당뇨, 비만, 뇌졸중 등의 치료와 예방에 효과가 있다.

소엽(蘇葉, Perilla sikokiana Nakai ) 은 꿀풀과(Labiatae)의 일년생 초본으로 한방에서는 잎을 소엽, 종자를 자소자라고 하며, 소엽 전체의 정유 성분에는 페릴알데하이드 약 55%, l-리몬넨(l-limonene) 20-30% 및 α-피넨(pinene) 소량 외 에 아르기닌, 쿠민산(cumic acid), 시아니딘-3-(6-p-쿠마로일-β-D-글루코사이드)-5-β-D-글루코사이드를 함유하고 있고, 잎의 정제된 유지성분에는 이소에고마 케톤(isoegoma ketone)등이 함유되어 있다. 발한, 진해, 건위, 이뇨, 진정 및 진통제로 사용한다. 소두(蘇頭)는 소엽의 뿌리 및 뿌리에 가까운 부분의 오래된 줄기로, 통풍을 물리치고, 발한, 거담에 효과가 있으며 기(氣)를 내리는데 효과가 있으며, 현기증과 신체의 통증 및 코막힘, 콧물을 치료하는데 효과가 있다(정보섭 및 신민교; 도해 향약(생약)대사전, 영림사, pp855-856, 1998).

상기 강활은 5 내지 50 중량부, 상기 인진은 3 내지 30 중량부, 상기 소엽은 2 내지 20 중량부로 사용되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 조성물은 강활, 인진 및 소엽이 1 내지 10: 1 내지 6: 1 내지 4의 조성비로 사용될 수 있다. 상기 함량 범위에서 사용하여야 우수한 생약 조성물의 효능을 얻을 수 있다. 상기 함량 범위를 벗어나는 경우 생약 조성물로부터 세포 독성이 발생될 우려가 있고, 원하는 효능을 발휘하지 아니하며, 경제적인 측면에서도 바람직하지 아니하다. 본 발명의 생약 조성물은 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절 조직 분해 효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용, 발부종 억제, 관절활액의 증가 억제 등의 치료 효능이 있어 연골 재생 및 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 염증성 질환의 예로는 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염 등이 있다. 본 발명의 조성물은 상기 관절염 중 골관절염 치료에 우수한 효능을 가진다.

상기 강활, 인진 및 소엽에서의 추출부위는 식물의 꽃, 엽, 줄기, 껍질, 꽃 봉오리, 뿌리, 열매, 종자 또는 식물체일 수 있으며, 바람직하기로는 강활은 뿌리이고, 인진은 경엽이며, 소엽은 잎이다.

추출물은 식물 또는 식물의 건조물을 분쇄하고, 분쇄물에 용매를 1: 5 내지 1: 10 중량비로 사용하여 초음파 또는 환류장치를 이용하여 추출한 후, 이를 여과 또는 원심분리하여 상등액을 수득하여 제조될 수 있다. 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 에틸아세테이트, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 초음파 추출시 2 내지 5시간인 것이 바람직하다. 상기 상등액을 에틸 아세테이트로 분획추출(층분리)하여 생약 조성물을 얻는다. 이 때 층분리는 3회 이상 실시하는 것이 바람직하다.

상기 생약 조성물은 액상으로 사용하거나, 감압농축 또는 동결건조하여 용매가 제거된 분말로 사용할 수 있다.

또한, 상기 생약 조성물은 약학적 효과를 갖는 제형화된 형태로 제공될 수 있다. 상기 생약 조성물의 적합한 제형으로는 산제, 액제, 환제, 정제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 좌약제 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출물을 약제학적으로 허용되는 염을 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토오스, 옥수수 전분 또는 그 유도체, 활석, 스테아린산 또는 그 염을 사용할 수 있다. 또한 제형이 연질 캡슐제의 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올이 사용가능하다. 용액 또는 시럽 형태의 경우에는 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등이 사용될 수 있다. 좌약용 담체로는 천연 오일 또는 경화된 오일, 왁스, 지방, 액체 폴리올 등이 사용가능하다.

본 발명의 약학적 효과를 갖는 제형화된 조성물은 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다. 투여 방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.

또한 각종 식품에 첨가되어 염증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 경우 및 연골 세포의 재생을 위한 기능성 식품에도 사용될 수 있다. 첨가될 식품은 시중에서 유통되고 있는 모든 식품이 될 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다.

골관절염을 유발하는 연골 파손 과정에서, 일부 염증이 유발될 수 있으며, 이로써 염증 관련 효소의 방출을 야기하여 연골 손상을 가속시킨다. 일반적으로 염증 부위에서는 과다한 양의 NO가 발생하여 세포 조직의 괴사를 촉진시킨다고 알려져 있다 [Moncada, S et al., Pharmacol. Rev. 43: 109-142 (1991)]. 이러한 NO를 발생시키는 iNOS(inducible nitric oxide synthetase)의 활성을 억제하거나 단백질 발현을 억제하는 것은 많은 염증성 질병에서 치료의 중요한 관건이 되고 있다. iNOS는 외부자극에 반응하여 생체를 방어하려는 목적으로 단시간에 과량의 NO를 생성하지만, 관절염과 같은 질환에서는 과잉 분비된 NO가 괴사, 통증 등의 2차적인 부작용을 일으키게 된다. 따라서, iNOS의 과잉발현 억제는 골관절염 치료에 중요한 것으로 알려져 있다.

또한, 골관절염이 유도되면, 관절내 염증 반응과 함께 통증이 증가하게 되는 데 이러한 통증은 활액내에서 이와 관련된 중요한 인자인 프로스타글란딘 E₂의 농도가 증가하기 때문이며, 따라서 활액내의 프로스타글란딘 E₂의 농도를 감소시키는 것이 또한 골관절염의 개선에 중요하다.

프로테오글리칸(proteoglycan)은 단백질, 당분으로 구성되어 있으며, 콜라겐 섬유와 엉겨붙어 연골 내에 빽빽하게 밀집된 구조 또는 틀을 형성하여 몸을 굽혔다 폈다 하는 운동을 가능하도록 연골에 탄력성을 부여하는 복합 분자이다. 또한 프로테오글리칸을 연골 조직 내로 수분을 감금시켜 스폰지 역할을 해 연골이 계속적인 관절운동을 가능하게 한다.

골관절염이 진행되면, 염증 반응과 함께 연골이 파괴되어 활액내로 상기 프로테오글리칸(proteoglycan)이 방출되어 활액량 및 활액내의 프로테오글리칸의 농도가 증가한다. 따라서 활액내의 프로테오글리칸 농도의 감소는 골관절염의 개선을 측정하는 중요한 마커가 된다. 또한, 프로테오글리칸의 활액내로의 방출을 억제되는 경우, 연골내의 프로테오글리칸이 생성되고, 이는 연골세포의 증식에도 영향을 미치므로 활액내의 프로테오글리칸의 방출억제로 인하여 연골재생의 효과도 측정할 수 있다(Ailson M.Badger et al., Inhibition of Interleukin-1-induced Proteoglycan Degradation and Nitric Oxide Production in Bovine Articular Cartilage/Chondrocyte Cultures by the Natural Product, Hymenialdisine. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. Vol.290 587-593).

또한 골관절염 발생된 연골조직은 MMP(매트릭스 메탈로프로테아제, matrix metalloproteinase) 합성 및 활성화에 의하여 파괴되고, MMP-1(collagenase-1), MMP-2, MMP-3(stromelysin-1), MMP-8(neutrophilcollagenase), MMP-9(gelatinase), MMP-13(collagenase-3) 등의 발현 및 활성이 증가한다. 따라서 활액내의 MMP-9의 농도의 감소 또한 골관절염의 개선정도를 측정하는 중요한 마커가 된다.

사이클로옥시게나제 2(cyclooxygenase 2; COX-2)는 통증 유발 물질인 프로스타글란딘E₂을 합성하는 효소이며, 이는 NO를 비롯한 기타 자극에 의해 합성이 촉진되기 때문에 COX-2의 발현을 억제하거나 활성을 억제하는 것은 또한 골관절염 치료에 중요한 마커가 된다.

또한 염증의 원인이 되는 활성산소는 항산화효소인 SOD(Super Oxide Dismutase,이하 'SOD'라함)에 의하여 제거되므로 세포내의 SOD 함유량은 골관절염 개선에 중요한 마커가 된다.

본 발명의 생약 조성물은 연골세포에서 프로테오글리칸과 프로스타글란딘E₂이 분리되는 것을 방지하여 활액내에서의 상기 물질의 농도를 감소시키고, 일산화질소의 생성, MMP-9 및 사이클로옥시게나제 2의 발현을 억제하며, 초산에 의한 롸이딩(Writhing) 증상을 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, 발 부종율을 감소시키며, 활성산소를 제거하는 역할을 하는 SOD를 증가시킨다.

본 발명의 생약 조성물은 골관절염의 정도에 따라 증가하는 활액의 양을 감소시키고, 연골 파열시 활액 내로 방출되는 총단백질의 양을 감소시키며, 프로테오글리칸의 활액 내의 함량을 감소시켜 발생된 골관절염의 진행을 방지하는 효과를 갖는다.

또한, 골관절염은 손상된 연골 세포가 재증식됨에 따라서 근본적인 치료가 가능하다. 이러한 연골 세포의 재증식은 관절 연골의 외관상 관찰 및 사프라닌-O(Safranin-O) 염색으로 활액막 세포의 분포 및 표면을 관찰함으로서 판단할 수 있다. 일반적으로 골관절염이 발생하였던 연골조직에 있어서, 연골세포가 증식되었는지 여부는 손상되었던 연골조직의 표면이 매끄러워짐에 따라서 판단할 수 있다. 또한, 사프라닌-O(Safranin-O) 염색에 있어서, 골관절염이 유도된 세포에서는 연골 조직이 파괴되어 연골 조직을 관찰할 수 없는데 반해, 연골 조직이 재생된 세포는 대조군에 비하여 붉은색으로 염색된 정도와 염색 부위 상부의 생성 정도를 통하여 골관절염의 완화 및 연골세포의 증식여부를 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 실제 임상투여시 경구 및 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과랍제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 혼합 생약제 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘(Magnesium stearate), 탈크(talc) 등과 같은 활택제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀(liquid paraffin) 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일(olive oil)과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1,2,3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명을 약제 조성물의 형태로 이용하는 경우, 본 발명의 유효성분의 용량은 1 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 50 내지 300 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 4 회 투여될 수 있다. 다만, 특정 환자에 대한 투여용량의 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 강활, 인진 및 소엽추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 유효성분을 식품으로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 함량은 식품조성물에 대하여 1 내지 99.9 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 70 중량%로 포함될 수 있다. 그러나 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있고, 상기 약제 조성물에 준하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에 한정되지 아니한다. 또한, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 생약 조성물의 제조

실시예 1-1: 강활 추출물의 제조

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고, 하루동안 건조시킨 강활 280g을 세절하여 70%(v/v) 에탄올 수용액 2ℓ을 가한 후, 2시간 동안 환류 추출 장치[Heating mantle(제조원: GLASS-COL), Flask(제조원: Corning), Condenser(제조원:Corning)]를 이용하여 추출하고 Whatman No.2에 여과한 후 감압농축하여 에탄올 추출물을 얻었다. 상기 에탄올 추출물에 250㎖의 수포화 에틸아세테이트를 첨가하여 3회 층 분리를 실시한 후, 에틸아세테이트 층만을 모아 60 내지 70℃ 온도에서 강활 건조물을 얻을때까지 감압 농축하여 12.75g의 강활건조물을 얻었다.

실시예 1-2: 인진 추출물의 제조

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고 하루동안 건조시킨 인진 85g에 대하여 실시예 1-1과 같은 방법으로 인진건조물 1.74g을 얻었다.

실시예 1-3 : 소엽 추출물의 제조

그늘에서 잘 말려진 소엽 85g에 대하여 실시예 1-1과 같은 방법으로 소엽건조물 2.45 g을 얻었다.

실시예 1-4 : 생약 조성물의 제조

실시예 1-1 내지 1-3로부터 얻은 강활 추출물, 인진 추출물, 소엽 추출물을 5:3:2의 중량비로 혼합하여 100g으로 제조한 후 수포화 에틸아세테이트 용액 250ml에 녹여 균질하게 하여 감압농축하였다. 감압농축하여 얻은 것에 증류수 50 ml를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말 상태의 생약 조성물 3g을 얻었다.

실시예 2: 생약 조성물의 제조

건조된 강활 50g, 인진 30g, 및 소엽 20g(중량비 5:3:2)을 준비하여 이를 70% 에탄올 수용액 2.5ℓ를 넣고 2시간 동안 환류 추출 장치(Heating mantle [제조원 : GLASS-COL], Flask [제조원 : Corning], Condenser [제조원 : Corning])를 실시하고 Whatman No.2에 여과한 후 여액을 감압농축하여 에탄올 추출물 24.46g 을 얻었다. 얻어진 에탄올 추출물 24.46g 에 수포화 에틸아세테이트 용액 250ml을 가하여 3회 층으로 분리한 후, 에틸아세테이트층만을 모아 60 내지 70℃로 생약 추출물이 건조될 때까지 감압농축하였다. 최종적으로 50ml 의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말 상태의 생약 조성물 3.88g 을 얻었다.

실시예 3: 생약 조성물의 제조

건조된 강활 30g, 인진 30g, 및 소엽 30g(중량비 1:1:1)을 준비하여 이를 70% 에탄올 수용액 2.5ℓ에 넣고 2시간 동안 환류 추출 장치(Heating mantle [제조원 : GLASS-COL], Flask [제조원 : Corning], Condenser [제조원 : Corning])을 사용하여 추출하고, Whatman No.2에 여과한 후 여액을 감압농축하여 에탄올 추출물 21.04g을 얻었다. 얻어진 에탄올 추출물 21.04g에 수포화 에틸아세테이트 용액 250 ml를 가하여 3회 층으로 분리한 후, 에틸아세테이트층만을 모아 60 내지 70℃로 생약 추출물이 건조될 때까지 감압농축하였다. 최종적으로 50ml 의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말 상태의 생약 조성물 4.02g을 얻었다.

실험예 1: 강활, 인진, 소엽의 개별 추출물 및 생약 조성물의 소염 효과

마우스 유래의 대식세포주인 Raw 264.7 세포를 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였으며, 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, 26140-079. 제조원: Gibco), 100U/ml 페니실린, 및 10㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지를 포함하는 24 well plate에 2 x 10⁶ 개의 세포를 접종하고 24 시간 동안 37 ℃, 5% CO₂, 습윤조건하에서 배양하였다.

RAW 264.7 세포에서 골관절염 유발시 발생하는 일산화질소를 유도하기 위하여 대장균의 세포벽 구성성분인 리포폴리사카라이드(LPS, Lipopolysaccharide)를 1 ㎍/ml의 농도로 투여하고 대조군에는 용매인 DMSO만을 처리하고 실험군에는 실시예 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 2 및 3의 조성물을 각각 20㎍/ml의 농도가 되도록 투여한 후, 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 배지와 그리스 시약을 1:1의 비율로 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후 흡광도 측정기로 파장 540nm에서 흡광도를 측정한 결과를 도1에 나타냈다.

실험예 2: 마우스 대식세포주에서 일산화질소(NO) 생성 억제 효과

실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물의 소염작용을 확인하기 위하여 마우스의 대식세포주에서 염증반응물질 일산화질소의 생성 억제 활성실험을 실시하였다. 마우스 유래의 대식세포주인 Raw 264.7 세포를 한국세포주 은행에서 구입하여 사용하였으며, 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, 26140-079. 제조원: Gibco), 100U/ml 페니실린, 및 10㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium) 배지를 포함하는 24 well plate에 2 x 10⁶개의 세포를 접종하고 24 시간 동안 37 ℃, 5% CO₂, 습윤조건하에서 배양하였다.

RAW 264.7 세포에서 골관절염 유발시 발생하는 일산화질소를 유도하기 위하여 대장균의 세포벽 구성성분인 리포폴리사카라이드(LPS, Lipopolysaccharide)를 1 ㎍/ml의 농도로 투여하고 대조군에는 용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide)만을 처리하고 실험군에는 실시예 1-4, 2 및 3의 조성물을 각각 0.8 ㎍/ml, 4㎍/ml, 20㎍/ml의 농도가 되도록 투여한 후, 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 배지와 그리스 시약을 1:1의 비율로 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후 흡광도 측정기로 파장 540nm에서 흡광도를 측정한 결과를 도 2a 내지 도 2c에 나타냈다.

도 2a 내지 도 2c에 나타나듯이, 본 발명과 같이 제조된 생약 조성물은 마우스 대식세포 Raw 264.7 세포에서 농도 의존적으로 일산화질소의 생성을 억제하는 것을 알 수 있다. 또한, 실시예 1-4 및 실시예 2의 경우 실시예 3의 경우보다 약 20% 정도 뛰어난 소염효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 3: 마우스 대식세포주에서 프로스타글란딘 E ₂ (prostaglandin E ₂ , PGE ₂ ) 생성 억제 효과

실시예 1-4, 2 및 3에서 얻은 생약 조성물의 소염작용을 확인하기 위하여 대식세포에서의 염증반응물질인 프로스타글란딘 E₂의 생성 억제 활성실험을 Cayman사의 PGE₂ 면역분석키트(NO.514010)를 사용하여 실시하였다.

실험예 2와 같은 방법으로 마우스 대식세포를 배양하여 2 x 10⁶ 개의 세포에 LPS를 1 ㎍/ml의 농도로 투여하고 실시예 1-4, 2 및 3에서 얻은 생약 조성물을 0.8, 4, 20㎍/ml의 농도로 처리하고 16시간동안 배양하였다. 효소 결합 면역 분석 키트에 배양한 배지 50㎍, PGE₂-AChE Tracer 50ul, PGE₂ Monoclonal Antibody 50㎍를 넣고 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 각 well을 세척하고 발색시약인 Ellman s reagent 200㎍를 각 well에 넣고 암실에서 60 내지 90 분동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 흡광도 측정기를 이용하여 파장 405nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 3a 내지 도 3c에 나타냈다. 이 때 도 3의 LPS는 대조군의 골관절염 유발 후 생성된 프로스타글란딘 E₂의 총량을 의미한다.

도 3a 내지 도 3c에 나타나듯이, 실시예 1-4의 생약조성물은 마우스 대식세 포에서 농도의존적으로 PGE₂ 생성을 억제하였다.

실험예 4: 토끼 연골조직에서 일산화질소 생성 억제 효과

실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물의 소염작용을 확인하기 위해 연골조직에서 염증반응물질 일산화질소의 생성 억제 활성실험을 실시하였다.

2-3 주령의 뉴질랜드 흰토끼의 양쪽 뒷다리 관절로부터 연골조직을 분리하여 조직 세포분리하였다. 10 %의 소태아혈청 (fetal bovine serum, 26140-079. 제조원: Gibco), 100 U/ml 페니실린, 및 10㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지를 포함한 24 well plate에 1 x 10⁶개의 토끼 연골조직세포를 접종하고 5-6일 동안 37 ℃, 5% CO₂, 습윤조건하에서 배양하였다. 연골조직세포가 80%정도 자랐을 때, 배지는 serum free DMEM으로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 well에 Lipopolysaccharide-Cytokine Mixture(이하 LCM)을 처리하여 20분간 반응시켰다. 그 후 대조군, 음성(Negative) 대조군에는 용매인 DMSO만 처리하고 실험군에는 실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물이 각각 0.8㎍/ml, 4㎍/ml, 20㎍/ml의 농도가 되도록 투여한 후, 16 시간동안 배양하였다. 그 다음 배지와 그리스 시약을 1:1의 비율로 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후 흡광도 측정기로 파장 540nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과는 다음 도 4a 내지 4c에 나타낸 바와 같다.

도 4a 내지 4c에서 보는 바와 같이 실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물은 토끼 연골조직에서 농도의존적으로 일산화질소 생성을 억제하였고, 이는 상기 추출물이 골관절염의 소염 효과가 있음을 확인할 수 있다.

실험예 5: 토끼 연골 조직에서 프로스타글란딘 E ₂ (prostaglandin E ₂ , PGE ₂ ) 생성 억제 효과

실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물의 소염작용을 확인하기 위해 토끼연골조직에서 염증반응물질 프로스타글란딘 E₂의 생성 억제 활성실험을 실시하기 위하여 Cayman사의 PGE₂ 면역분석키트를 사용하였다.

실험예 4과 같은 방법으로 1x10⁶개의 토끼 연골 조직세포에, 대조군을 제외한 모든 well에 LCM 을 처리하고 20분 반응시킨 후, 실시예 1-4, 2 및 3에 의해 제조된 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/ml의 농도로 처리하고 16시간 동안 배양하였다. 효소 결합 면역 분석 키트에 배양한 배지 50 ㎕, PGE₂-AchE2 Tracer 50ul, PGE₂ Monoclonal Antibody 50㎕ 를 넣고 4 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 발색시약인 Ellman s reagent 200ul 를 각 well에 넣고 암실에서 60 내지 90분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 흡광도 측정기를 이용하여 405nm 의 파장에서 흡광도를 측정한 결과를 도 5a 내지 5c에 나타냈다.

도 5a 내지 5c에서 나타나듯이, 실시예 1-4, 2 및 3에 따라 제조된 추출물은 토끼의 연골조직 세포에서 농도 의존적으로 프로스타글란딘 E₂의 생성을 억제하였다.

실험예 6: 토끼 연골 조직 세포에서의 프로테오글리칸 분해 억제효과

실시예 1-4, 2 및 3의 생약 조성물의 관절조직 보호효과를 실험하기 위하여, 프로테오글리칸 분해 억제 활성실험을 실시하였다.

토끼 연골 조직 세포의 배양은 실험예 3과 같이, 2 내지 3 주령의 토끼 관절로부터 연골 조직을 분리하였다. 분리한 조직 세포는 24 well에 10% 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 100U/ml Penicillin, 10 ㎍/ml Streptomycin을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 1 x 10⁶ 개로 접종한다. 접종 후 5 ~ 6일 동안 세포를 37℃에서 5% CO₂ 습윤 조건하에서 배양하였다. 토끼 연골 조직 세포가 80% 정도 자랐을 때, SFM(Serum Free Media)로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 well에 LCM(Lipopolysaccharide-Cytokine Mixture)을 처리하고 20분 동안 반응시킨 후, 실시예 1-4, 2 및3에 따른 생약 추출물을 0.8, 4, 20 ㎍/ml의 농도로 투여한 후 16시간 동안 배양하였다.

위의 실험 방법을 통하여 토끼 연골 조직의 구성 성분인 프로테오글리칸의 분해를 유발시켜 배양액 내의 프로테오글리칸의 분해 산물인 글루코스아미노글리칸(Glucosaminoglycan, GAG)을 1-9,-디메틸메틸블루 발색제(1-9,-Dimethylmethylene blue dye, DMB)에 의해 발색된 정도를 525 nm에서 흡광도를 측정한 후, Chondroitin sulfate로 표준 정량하였다. 그 결과는 다음의 도 6에 나타낸 바와 같다.

도 6a 내지 6c에서 보는 바와 같이 실시예 1-4, 2, 및 3에 따라 제조된 생약 추출물은 토끼의 연골 조직 세포에서 농도 의존적으로 연골세포로부터 프로테오글리칸의 분해 및 활액내의 프로테오글리칸의 농도 증가를 억제하였다.

실험예 7:토끼 연골 관절 조직세포에서의 분해효소 매트리스 메탈로프로테나 제-9 ( MMP -9)의 활성억제 효과

실시예 1-4 생약 조성물의 관절조직 분해효소 활성 억제효과를 확인하기 위하여 MMP-9의 활성실험을 하였다.

실험예 4와 같이 2-3 주령의 토끼 관절로부터 연골 조직을 분리하여 24 well에 10% 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 100U/ml 페니실린, 10㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 1 x 10⁶개의 세포를 접종하였다. 접종 후 5-6일 동안 세포를 37℃에서 5% CO₂ 습윤 조건하에서 배양하였다. 토끼 연골 조직 세포가 80% 정도 자랐을 때, serum Free DMEM으로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 well에 LCM을 처리하고 20분 동안 반응시킨 후, 실시예 1-4 생약 조성물을 0.8, 4, 20 ㎍/ml 의 농도로 투여한 후 16시간 동안 배양하였다.

16시간 동안 배양된 세포로부터 원심분리(centrifuge)하여 상등액을 얻고 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 상등액 샘플과 염료(dye)를 섞은 후, 37 ℃ 에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 10% Zymogram gel (Novex EC61752)을 이용하여 100 V, 3 시간 동안 SDS-PAGE를 실시하였다. Gel Renaturing 과정을 실온에서 흔들어 주며 30분씩 3회 세척하고, gel을 Developing buffer에 담근 후, 48 시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 전개(developing)시켰다. 반응 후 쿠마시 G 블루 염료를 이용하여 gel을 염색하고, 밴드를 제외한 나머지 부분을 탈색 시킨 후 92 kDda의 MMP-9 밴드를 확인하여 도 7에 나타냈다.

도 7에서 보는 바와 같이 실시예 1-4 생약 조성물은 관절조직 분해효소 MMP-9의 활성을 농도의존적으로 억제하였다.

실험예 8 : 토끼 연골 조직 세포에서의 급성염증유발인자 억제 효과

실시예 1-4 에 의해 제조된 생약 조성물이 통증 유발 물질인 프로스타글란딘을 합성하는 효소인 사이클로옥시게나제 2(Cyclooxygenase 2, 이하 'COX-2'라함)의 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿(western blot)방법을 이용하였다.

토끼 연골 조직 세포의 실험 조건은 실험예 4와 동일하게 수행하여 준비하였다. 실시예 1-4 생약 조성물 및 LCM을 처리하여 배양한 세포의 배지를 제거하고 추출완충용액 (0.32M 슈크로오스 [S0389,제조원:Sigma], 0.2M HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-dthanesulfonic acid) [H3375, 제조원:Sigma], 1mM EDTA(ethylenedia mintetraacetic acid) [808288, 제조원: BM], 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) [P7627, 제조원: Sigma], 10ug/ml 아프로티닌(Aprotinin) [A1153, 제조원: Sigma], 10ug/ml 류펩킨 [L0649, 제조원:Sigma])으로 세포를 분리하여 단백질을 정량한 후 20 ㎍의 단백질을 SDS (sodium dodecyl sulfate) 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 단백질을 PVDF (polyvinylidene difluoride, IPVH00010, 제조원: Millipore)막에 옮겨 5% NFDM (non fat dry milk)용액과 반응시키고 1차 항체, 2차 항체 순서대로 반응시킨 후 ECL 시약(Amersham Biosciences)으로 발색시켜 X-ray 필름에 노출시켰다. 1차 항체로는 COX-2 (sc-1745, 제조원: Santacruze) 2 ㎍/ml을 사용하였고, 2차 항 체로는 Anti-Rabbit-IgG-HRP (sc-2004, 제조원 : Santacruze) 80 ng/ml을 사용하여 결과를 도 8에 나타냈다.

도 8에서 보는 바와 같이, 실시예 1-4에 따라 제조된 생약 조성물은 토끼의 연골 조직 세포에서 정상 상태의 수준까지 COX-2의 발현이 억제되어 매우 좋은 효과를 보임을 알 수 있다.

실험예 9: 초산유발 마우스 롸이딩 신드롬 억제효과

실시예 1-4 및 2에 의해 제조된 생약 조성물의 진통 억제 효과를 확인하기 위하여 마우스에서 Whittle(1957)의 초산에 의한 롸이딩(Writhing) 증상을 관찰하였다.

생쥐(ICR계, Institute of Cancer Research)에 실시예 1-4및 2에 의해 제조된 생약 조성물을 생쥐 kg 당 100, 500, 1000 mg을 경구투여하고, 30분 후에 0.7% 초산-생리식염액을 0.1 ml/10 g 양으로 복강 주사하였다. 주사 후 10분 후부터 10분 동안의 롸이딩 증상 횟수를 관찰하였다. 결과는 표 1에 나타내었다. 대조군으로는 본 발명의 생약 조성물을 투여한 것을 제외하고 모든 실험을 동일하게 시행하였다.

Group	투여량(㎎/㎏)	평균 롸이딩 횟수	억제율(%))
대조군	-	20	-
실시예 1-4	200	15	25
실시예 1-4	400	8.3	58.3
실시예 2	200	15.7	22
실시예 2	400	8	60

표 1에서 나타나듯이, 실시예 1-4 및 2에 따라 제조된 생약 조성물은 마우스에서 롸이딩 횟수가 20 내지 60% 감소한 것으로 보아 진통효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 10: 랫드에서의 급성 염증에 대한 억제 효과

실시예 1-4 및 2에 의해 제조된 생약 조성물의 항염증에 대한 효과를 확인하기 위하여 랫드에 카라기난(carrageenan) 을 이용하여 염증을 유도한 후 발 부종율에 미치는 영향을 확인하였다.

하루 밤 절식시킨 SD(Spraque-Dawley)계 랫드에 생약 조성물 200, 400mg/kg 를 경구투여하고 1시간 후 생리식염수에 녹여 제조한 1 % 카라기난을 각 발 당 0.1 ml를 우측 뒷발바닥에 피하 주사한다. 이 후 5시간 동안 1시간 간격으로 우측 뒷발의 부종 정도를 플레시스모미터(Plethymometer)를 이용하여 측정하였다. 부종의 억제율 정도를 도 9에 나타내었다. 대조군의 랫드에는 생약 조성물을 경구투여하지 아니하였다.

도 9에서 보는 바와 같이 실시예 1-4 및 2에 따라 제조된 생약 조성물은 발 부종의 증가율을 감소시켜 염증 억제 효과가 우수하였다.

실험예 11 : 유해활성산소의 분해 효과 테스트

실시예 1-4 및 2에 의해 제조된 생약 조성물의 유해활성산소에 대한 분해 효과를 확인하기 위하여 잔틴-잔틴옥시다제(xanthine-xanthine oxidase)에 의해 발생된 활성산소를 제거하여 생체를 보호하는 SOD(Super Oxide Dismutase)를 Cayman 社의 Superoxide Dismutase Assay Kit(Cat No. 706002)를 이용하여 측정함으로써 유해활성산소의 분해 정도를 비교하여 보았다. 비교예(양성 대조군)로는 SK제약의 정제(상품명:조인스정)를 이용하였으며, 음성 대조군은 생약 조성물을 첨가하지 아니한 시료에 대하여 측정하였다.

각각의 well에 유해활성산소의 검출자(radical detector)를 200 ul 넣고, 실시예 1-4에 의해 제조된 생약 조성물 10ul 및 SOD standard 10㎕를 첨가한다. 그 후, 잔틴-잔틴 옥시다제(xanthine-xanthine oxidase)를 첨가하여 유해활성산소 라디칼을 발생시킨 후 20분 동안 실온에서 배양하여 540 nm에서 각각의 흡광도를 측정하여 그 기울기의 변화 정도로 유해활성산소의 분해 정도를 비교하여 표 2에 나타냈다. 이 때, 표 2는 음성대조군에서 측정된 0.7를 보정치로 두고, 측정된 SOD 값이다. 아래 표 2에서 보는 바와 같이 실시예 1-4 및 2에 따라 제조된 생약 조성물은 유해활성산소의 분해 효과가 우수함을 알 수 있다.

SOD(㎍/㎖)	실시예 1-4	실시예 2	비교예
20	0.59	0.48	0.69
40	0.98	1.02	0.92
80	1.55	1.51	1.15
100	2.18	2.42	1.47

실험예 12 : 포르말린 테스트

실시예 1-4 및 실시예 2에서 얻은 생약 추출물의 진통효과를 확인하기 위하여 포르말린 테스트를 시행하였다. 대조군으로는 생약 추출물을 투여하지 아니한 마우스에 대하여 테스트를 시행하였다.

마우스의 뒷발 중 왼쪽 발바닥에 SC injection을 하고 acrylic observation chamber(20㎝, high, 20㎝, diameter)안에 넣고 40분동안 행동을 관찰하여 주사된 발바닥을 타다닥 거리거나 핥는 등의 행동을 관찰하여 도 10에 기록하였다. 40분 중 처음 5분동안을 1^st phase, 1^st phase 후 15분부터 나머지 20분을 2^nd phase라고 한다.

도 10에 나타나듯이, 실시예 1-4 및 실시예 2의 생약 추출물은 진통효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 13: 연골 세포 증식 효과의 관찰

실시예 2에 의해 제조된 생약 조성물의 연골 재생 효과를 확인하기 위하여 뉴질랜드 흰토끼의 양쪽 뒷다리 관절 부위에 전십자인대 횡절단술(ACLT;Anteior Crucuate Ligament Tansection)을 시술하여 3일 후부터 2주 동안 5 x 5 ㎥ 의 공간에서 지속적으로 운동시켜 관절염을 유도한 후, 실시예 2를 한 달 동안 경구투여하였다. 실험이 종료된 후에 토끼의 관절 연골을 채취하여 연골 세포 증식 효과를 비교하여 보았다. 대조군으로는 생약 조성물을 투여하지 아니한 토끼의 관절 연골을 채취하여 관찰하였다.

도 11에 나타나듯이, 실시예 2를 경구 투여한 토끼에서는 외관상 관절 연골 부위의 표면이 매끄러운 반면, 대조군에서는 관절 연골 손상으로 인해 표면이 매우 불규칙하고 거칠어진 것을 확인할 수 있었다. 이를 보아, 실시예 2의 생약 추출물을 투여하는 경우, 손상된 연골 세포의 재생효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 14 : 관절염 유도된 실험동물에서 관절활액의 총량 측정

골관절염의 정도에 따라 활액 양의 변화가 보고되어 있어, 실험예 13과 같이 골관절염을 유도한 후, 실시예 2에 의한 활액 양의 변화를 알기 위해 경구 투여 2주, 4주에 각각 활액의 총량을 측정하였다. 대조군으로는 상기의 방법으로 골관절염을 유도한 후, 생약 조성물을 투여하지 아니한 토끼의 관절활액의 양을 측정하였다.

활액의 양은 활액의 Ca² ⁺의 농도를 비소아조 Ⅲ 착화 방법(Arsenazo Ⅲ complexion method)[Micaylova Ⅴ. Et al., Anal. Chim. Acta, 53(194), 1971]를 이용하여 측정하였고, 활약의 총량은 도난 평형 방정식(Donnan equilibrium equation)을 사용하여 계산하였다. 사용된 비소아조 Ⅲ 시약(Arsenazo Ⅲ reagent, [제조원 Sigma]) 1 ㎖과 관절활액 0.01 ㎖를 섞고, 실온에서 5분 동안 방치한 후 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험예의 결과는 도 12와 표 3에 나타냈다.

도 12와 표 3에서 나타나듯이, 대조군은 0.76 ㎖로 증가하였으나, 실시예 2를 경구 투여한 토끼에서는 대조군과 비교하여 보았을 때, 0.29 ㎖ 로 증가 폭이 감소하여 활액의 부피 증가를 억제하는 현저한 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

	0주(㎖)	2주(㎖)	4주(㎖)
정상군	0.23	-	-
대조군	0.58	0.39	0.76
실시예 2	0.36	0.38	0.29

실험예 15 : 관절염 유도된 실험동물에서 관절활액의 프로테오글리칸(Proteoglycan)양 측정

실험예 14에서 얻은 실시예 2의 생약 조성물을 투여한 경우 및 대조군의 관절활액을 이용하여, 관절 조직 보호 효과를 알아보기 위해 활액 내의 프로테오글리칸 농도를 실험예 6과 동일한 방법으로 측정하였다. 본 실험예에서 측정한 결과는 도 13과 표 4에 나타내었다.

도 13과 표 4에서 나타나듯이, 대조군에서는 16.38 ㎍/㎕로 60.12% 증가하였으나, 실시예 2를 4주 동안 경구 투여한 군에서는 7.33 ㎍/㎕ 로 활액 내 증가된 프로테오글리칸 함량이 35.98% 정도 감소하여 관절 조직의 보호에 좋은 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다.

	0주	2주	4주
정상군	8.20	-	-
대조군	10.23	11.96	16.38
실시예 2	11.45	10.65	7.33

실험예 16 : 관절염 유도된 실험동물에서 관절활액의 총단백질 (Total Protein) 양 측정

골관절염이 진행되면 연골이 파열되어 활액 내로 총단백질이 방출되므로 골관절염의 억제를 알아보기 위하여 활액 내의 총단백질 농도를 측정하였다. 실험예 14에서 얻은 실시예 2의 생약 조성물을 투여한 경우 및 대조군의 관절활액을 이용하였으며, 활액 내의 총 단백질의 농도는 브래드포드 방법(Bradford method)으로 595nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 본 실험예에서 측정한 결과는 도 14와 표 5에 나타냈다.

도 14와 표5에 나타나듯이, 대조군의 경우는 활액 내의 총단백질 농도가 25.67 ㎍/㎕의 정상 범위에서 52.71 ㎍/㎕로 24.99% 증가하였으나, 실시예 2를 4주 동안 경구 투여한 군에서는 38.62 ㎍/㎕로 26.68% 억제되어 큰 효과를 나타냈다.

	0주	2주	4주
정상군	25.67	-	-
대조군	42.17	46.96	52.71
실시예 2	52.67	41.68	38.62

실험예 17 : 관절염 유도된 실험동물에서 관절활액의 프로스타글란딘 E ₂ (Prostaglandin E ₂ , PGE ₂ ) 양 측정

실험예 14에서 얻은 실시예 2의 생약 조성물을 투여한 경우 및 대조군의 관절활액을 이용하여, 관절 조직 내의 소염 작용을 알아보기 위해 활액 내의 프로스타글란딘 E₂의 농도를 실험예 5와 같은 방법으로 측정하였다. 본 실험예에서 측정한 결과는 도 15와 표 6에 나타냈다.

도 15와 표 6에서 나타나듯이, 대조군에서는 활액 내의 프로스타글란딘 E₂의 농도가 0.65 ㎍/㎕ 에서 2.1 ㎍/㎕ 까지 무려 221.78% 증가하였으나, 실시예 2를 4주 동안 경구 투여한 군에서는 25.21% 증가하여 대조군에 비하여 매우 큰 억제 효과를 나타냈다.

	0주	2주	4주
정상군	0.33	-	-
대조군	0.65	0.96	2.10
실시예 2	0.63	0.44	0.79

실험예 18 : 관절 조직의 사프라닌 -O( Safranin -O) 염색 결과 및 활액막 세포의 분포 측정 결과

실험예 13과 같은 방법으로 골관절염을 유도한 후, 실시예 2의 생약조성물을 200 mg/kg의 농도로 한달 동안 경구투여하였다. 그 후, 토끼의 원위대퇴골을 채취하여 4% 포르말린(Sigma, F0507)에 24시간 이상 고정하고, 보고자 하는 면을 5mm 두께로 절편하여 5% 질산으로 24시간 이상 탈석회를 거쳐 파라핀 블록으로 제작하여, 4㎛의 박편을 연골 조직의 특이적 염색인 사프라닌-O(Sigma S2255) 염색하는 histochemistry analysis를 통하여 활액막 세포의 분포 및 표면을 조사하였다. 본 실험예에서 측정한 결과를 도 16에 나타내었다. 대조군으로는 생약 조성물을 투여하지 아니한 토끼의 원위대퇴골 활액막 세포를 측정하였다.

도 16에서 보는 바와 같이, 실시예 2를 4주 동안 경구 투여한 군에서는 대조군에 비해 붉은색으로 염색된 골관절염 발생시 세포위에 정상세포임을 나타내는 파란색으로 염색된 부위가 두터운 것을 관찰할 수 있으므로 본 발명의 생약 조성물이 연골 재생의 효과가 있음을 확인할 수 있다.

제제예 1: 정제의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물 100㎎, 옥수수 전분 90㎎, 유당 180㎎, 엘-하이드록시프로필셀룰로오스 18㎎, 폴리비닐피롤리돈 5㎎ 및 에탄올 적량을 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 1.8㎎을 가하여 혼합한 후, 1정이 400㎎이 되도록 타정하였다.

제제예 2: 연질캅셀의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물 100㎎, 콩기름 180㎎, 황납 40㎎, 야자경화유 128㎎, 대두인지질 20.5㎎, 젤라틴 212㎎, 글리세린(비중 1.24) 50㎎, d-소루비톨 76㎎, 파라옥시안식향산메칠 0.54㎎, 파라옥시안식향산프로필 0.90㎎, 메칠바닐린 0.56㎎ 및 황색 203호 적량을 약전 제제총칙 중 연질캅셀의 제법에 따라 1캅셀 중에 함유되도록 제조하였다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물 100㎎, 옥수수 전분 83㎎, 유당 175㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 균질하게 혼합하여 1캅셀에 360㎎이 함유되도록 충전하였다.

제제예 4: 건강 식품 및 음료의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물을 유효성분으로 함유하는 건강 식품 또는 음료 조성물을 하기와 같이 제조하였다.

제제예 4-1 건강식품의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물 1000 mg, 비타민 A 아세테이트 70 ug, 비타민 E 1 mg, 비타민 B₁ 0.13 mg, 비타민 B₂ 0.15 mg, 비타민 B₆ 0.5 mg, 비타민 B₁₂ 0.2 ug, 비타민 C 10 mg, 비오틴 10 ug, 니코틴산아미드 1.7 mg, 엽산 50 ug, 판토텐산 칼슘 0.5 mg, 황산제1철 1.75 mg, 산화아연 0.82 mg, 탄산마그네슘 25.3 mg, 제1인산칼륨 15 mg, 제2인산칼륨 55 mg, 구연산칼륨 90 mg, 탄산칼슘 100 mg, 염화마그네슘 24.8 mg의 조성 및 함량으로 통상적인 방법으로 건강 식품을 제조하였다.

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형실시하여도 무방하며, 통상의 건강 식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통산의 방법에 따라 건강 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 4-2 건강 음료의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물 100 mg, 비타민 C 15 g, 비타민 E(분말) 100 g, 젖산철 19.75 g, 니코틴산아미드 3.5 g, 산화 아연 3.5 g, 비타민 A 0.2 g, 비타민 B1 0.25 g, 비타민 B2 0.3 g, 물 정량을 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 건강 음료를 제조하였다.

통상의 건강 음료 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 4-3: 츄잉껌의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물 0.24~ 0.64%, 껌베이스 20%, 설탕 76.36~76.76%, 후르츠향 1% 및 물 2%의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

제제예 4-4: 아이스크림의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물 0.24~0.64%, 유지방 10.0%, 무지유고형분 10.8%, 설탕 12.0%, 물엿 3.0%, 유화안정제(스팬, span)0.5%, 향료(스트로베리) 0.15% 및 물 62.91~63.31%의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 아이스크림을 제조하였다.

제제예 4-5: 음료의 제조

실시예 2에 따라 제조된 생약 조성물 0.48~1.28㎎, 꿀 522㎎, 치옥토산아미드 5㎎, 니코틴산아미드 10㎎, 염산리보플라빈나트륨 3㎎,염산피리독신 2㎎, 이노시톨 30㎎, 오르트산 50㎎ 및 물 200㎖의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

본 발명의 강활, 인진 및 소엽의 생약성분을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항염증 작용, 소염 진통작용, 관절 조직 분해 효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용, 발부종 억제, 관절활액의 증가 억제 작용, 관절활액의 총단백질 증가 억제 등의 치료 효능이 있어 연골 재생 및 골관절염 예방 또는 치료제로 이용가능하다. 또한, 상기 유효성분을 함유하는 약제 또는 식품 조성물로 이용가능하다.

Claims

강활의 에탄올, 증류수, 또는 이들 혼합물의 추출물, 인진의 에탄올, 증류수 또는 이들 혼합물의 추출물, 및 소엽의 에탄올, 증류수 또는 이들 혼합물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 강활의 에탄올, 증류수, 또는 이들 혼합물의 추출물을 5 내지 50 중량부, 상기 인진의 에탄올, 증류수, 또는 이들 혼합물의 추출물을 3 내지 30 중량부 및 상기 소엽의 에탄올, 증류수, 또는 이들 혼합물의 추출물을 2 내지 20 중량부 포함하는 연골 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 연골 재생용 조성물은 강활, 인진 및 소엽의 혼합물 또는 각각을 증류수 또는 에탄올 수용액으로 추출한 후, 추가로 에틸 아세테이트로 분획 추출된 것인 연골 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 연골 재생용 조성물은 프로테오글리칸의 분해를 억제하는 것을 특징으로 하는 연골재생에 유용한 연골 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 연골 재생용 조성물을 경구용 정제, 경구용 연질캅셀제, 연고제, 주사제 또는 경피투여제로 이루어진 군으로부터 선택된 제형화된 것인 연골 재생용 조성물.
강활의 에탄올, 증류수, 또는 이들 혼합물의 추출물 5 내지 50 중량부, 인진의 에탄올, 증류수, 또는 이들 혼합물의 추출물 3 내지 30 중량부 및 소엽의 에탄올, 증류수, 또는 이들 혼합물의 추출물 2 내지 20 중량부를 유효성분으로 포함하는 골관절염 치료용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 골관절염 치료용 조성물은 강활, 인진 및 소엽의 혼합물 또는 각각을 증류수 또는 에탄올 수용액으로 추출한 후, 추가로 에틸 아세테이트로 분획추출된 것인 골관절염 치료용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 골관절염 치료용 조성물은 골관절염 발생의 마커가 되는 혈액내의 증가된 프로테오글리칸, 프로스타글란딘, 매트릭스 메탈로프로테아제-9(MMP-9), 사이클로옥시게나제 2의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 골관절염 치료용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 골관절염 치료제 조성물은 경구용 정제, 경구용 연질캅셀제, 연고제, 주사제 및 경피투여제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 골관절염 치료용 조성물.
강활, 인진 및 소엽을 각각 또는 혼합하여 증류수, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계; 및

상기 추출물을 에틸 아세테이트로 층분리하여 농축시키는 단계를 포함하는 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물의 제조방법.