KR100265385B1

KR100265385B1 - 순환기 질환의 예방 및 치료 효능을 갖는 홍경천 추출물

Info

Publication number: KR100265385B1
Application number: KR1019980006495A
Authority: KR
Inventors: 윤여표; 김영호; 안희열; 장해동
Original assignee: 윤여표; 김영호; 안희열; 장해동
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2000-11-01
Also published as: KR19990071183A

Abstract

본 발명은 순환기 질환의 예방 및 치료에 유용한 홍경천(Rhodiola sp.) 추출물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 홍경천의 뿌리를 메탄올, 디클로로메탄, 부탄올 및 물 등으로 순차적으로 분획하여 얻은 추출물 및 이로부터 분리·정제한 화합물을 유효 성분으로 하는 혈전 형성 억제, 혈관 평활근 세포의 증식 억제, 항산화, 지질과산화 억제 및 체력 증강 등의 효과가 있는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 이는 노화 방지와 더불어 혈전증 및 동맥경화증을 포함한 순환기 계통 질환의 예방 및 치료에 널리 이용될 수 있다.

Description

순환기 질환의 예방 및 치료 효능을 갖는 홍경천 추출물

본 발명은 순환기 질환의 예방 및 치료 효능을 가지는 홍경천(Rhodiolasp.) 추출물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 홍경천의 뿌리를 메탄올, 디클로로메탄, 부탄올 및 물 등으로 순차적으로 분획하여 얻은 추출물 및 이로부터 분리·정제한 화합물을 유효 성분으로 하는 혈전 형성 억제, 혈관 평활근 세포의 증식 억제, 항산화, 지질과산화 억제 및 체력 증강 등의 효과가 있는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 이는 노화 방지와 더불어 혈전증 및 동맥경화증을 포함한 순환기 계통 질환의 예방 및 치료에 널리 이용될 수 있다.

홍경천(Rhodiola sp.)은 다년생 초본식물로서 육질이 있는 근경이 있고 뿌리와 줄기가 중용한 약용 부위로 사용되고 있다. 홍경천은 분류상 피자식물문, 경천과, 홍경천속에 속하며 전 세계적으로 96종이 있는 것으로 보고되어 있는데, 특히 중국에 70종이 있고 서장에는 34종과 2가지 변종이 있어 전체 종의 50% 가량이 분포하고 있다.

또한, 홍경천은 온도가 낮고 건조하며 산소가 결핍되고 강한 자외선이 비취며 낮과 밤의 온도 차이가 심한 해발 2,000∼5,000m의 악조건에서도 그 적응력이 강한 독특한 식물이다. 따라서, 인삼, 가시오가피가 발견된 이후에 원기를 회복시키고 병과 독을 극복하여 장수하게 하는 가장 훌륭한 보건 약용식물의 일종으로 알려져 "고원 인삼"이라는 별칭도 가지고 있다.

최근 활성산소에 의한 지질과산화가 성인병의 발병과 노화의 주요한 원인으로 밝혀지고 있다(McCord, J. M., Surgery, 94, 412, 1983., Halliwell et al., Am. J. Medicine, 91, 14, 1991., Harman. D., J. Gerontol., 11, 298, 1956.).

생명체에 필수적인 산소의 1가 환원의 첫 번째 산물은 수퍼옥사이드 음이온 (superoxide anion)이고, 이것은 수소 과산화물(hydrogen peroxide)과 상호 작용하여 수산화 라디칼(hydroxyl radicals)을 발생시킨다. 수퍼옥사이드 등의 자유 라디칼은 연쇄반응(chain reaction)으로 지질과 반응하여 과산화물도 생성하고 이러한 과정을 통하여 노화, 암 및 기타 질병 등이 유발된다(Miquel, J. et al., "Handbook of free radicals and antioxidants in biomedicine", CRC Press Inc. Boca Ration, p177, 1989).

또한, 수산화 라디칼과 지질 과산화물(lipid peroxide)은 프로스타사이클린 (prostacyclin)의 발생을 억제하는 것으로 알려져 있고, 특히 지질 과산화물은 각종 효소 또는 지단백질(lipoprotein)을 변성시키고 세포막을 파괴하며 구성조직의 장애를 일으키거나 리포퓨신(lipofuscin)을 축적시켜 세포 노화를 유도하는 것으로 보고되어 있다(Gryglewski, R. J. et al., Prostaglandins, 12, 685, 1976; Tappel, A. L., Feb. Proc., 32, 1870, 1973; Roubal, W. T. et al., Arch. Biochem. Biophys., 113, 5, 1966). 그 외에도 혈소판에서 트롬복산 A₂(thromboxane A₂)의 생성을 촉진하여 혈관 폐색을 유발하는 등 많은 병태 반응들을 일으키는 것으로 알려져 있다.

그러나 대부분의 생물체 내에는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 글루타치온 과산화제(glutathione peroxidase), 카탈라제(catalase)와 같은 항산화 효소(antioxidant enzyme)들이 존재하여 상기 자유 라디칼들에 의해서 유발된 독소를 제거하는 작용을 한다(Weisberger, R. A. et al., J. Biol. Chem., 248, 3582, 1973; Pryor, W. A. et al., "Free radicals in Biology" Vol. I, Academic Press, Orando, 제6장, 1976). 따라서 이와 같은 효소와 관련된 방식으로 수퍼옥사이드 라디칼 또는 지질 과산화물을 효과적으로 저해할 수 있는 약물은 노화, 발암, 성인병 및 각종 혈관 질환등을 예방하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 혈관내피계의 분비기능도 산소에서 유래한 자유 라디칼(oxygen-derived free radical)에 의하여 영향을 받는다고 보고되어 있다. 이는 수퍼옥사이드 음이온이 내피세포 유래의 완화인자(endothelium-derived relaxing factor, EDRF)를 파괴하기 때문이다(Gryglewski, R. J. et al., Nature, 320, 454, 1986).

또한, 심혈관계 질환은 주로 혈관 평활근 세포의 증식으로 유발된다고 한다. 구체적으로 혈관 내피세포의 상해에 의하여 내피세포의 투과성이 항진되면 상해 부위에서 혈소판 응집이 일어나고, 응집한 혈소판에서는 혈소판 유래 성장인자 (platelet-derived growth factor, PDGF)가 방출되며 이 PDGF에 의하여 혈관 평활근 세포의 중막에서 내막으로의 주유가 일어나 혈관 평활근 세포의 증식이 촉진된다. 한편 혈액 중에 존재하는 단구 유래의 마크로파지는 내피세포의 상해 부위로부터 침입하여 대량의 지방을 탐식하고 포마세포가 됨으로 지방의 축적을 유발시켜 동맥경화증을 발생시킨다. 이와 같은 혈관 평활근 세포의 증식과 비대는 고혈압 환자의 중요한 특징 중 하나이다 (Owens, G. K., Circ. Rec., 56, 525, 1985). 또한 혈소판 응집은 혈액 응고 및 혈전 생성으로 이어지는 필수적인 단계로, 혈소판 자체의 생리적 활성이 증가되거나 혈장에서의 지질 대사가 변화하여도 쉽게 영향을 받는다.

이에 본 발명자들은 순환기 질환에 유용한 새로운 물질을 천연물로부터 분리하기 위하여 계속 연구한 결과, 홍경천(Rhodiola sp.)의 뿌리를 물 또는 메탄올로 추출하고, 디클로로메탄, 부탄올 및 물 등으로 순차적으로 분획하여 얻은 추출물 및 이로부터 분리ㆍ정제한 화합물이 혈전 형성 억제, 혈관 평활근 세포의 증식 억제, 항산화, 지질과산화 억제 및 체력 증강 등의 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 홍경천 추출물 및 이로부터 분리ㆍ정제한 화합물을 유효 성분으로 하는 노화 방지와 순환기 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.

제1도는 홍경천에서 분리·정제한 화학식 1의 로시리딘(rosiridin)의 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제2도는 상기 로시리딘의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제3도는 상기 로시리딘의 수소핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제4도는 상기 로시리딘의 탄소핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제5도는 홍경천 추출물서 분리·정제한 화학식 2의 로시리돌(rosiridol)의 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제6도는 상기 로시리돌의 수소핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제7도는 상기 로시리돌의 탄소핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제8도는 홍경천 추출물에서 분리·정제한 화학식 3의 신나밀 알코올 (cinnamyl alcohol)의 질량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제9도는 상기 신나밀 알코올의 수소핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제10도는 상기 신나밀 알코올의 탄소핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제11도는 상기 로시리딘에 의하여 안지오텐신 Ⅱ와 혈소판 유래 성장인자 (PDGF) 처리에 의한 3H-티미딘 유입의 저해 효과를 나타낸 것이고,

제12도는 상기 로시리딘에 의하여 상기 PDGF에 의한³H-티미딘 유입이 용량 의존적으로 저해됨을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍경천(Rhodiola sp.)을 저급 알코올 또는 물로 추출한 순환기 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 홍경천 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 홍경천 추출물을 다시 디클로로메탄, 부탄올 또는 물 등으로 분획한 홍경천 추출물도 제공한다.

상기 홍경천 추출물은 유효 성분으로 화학식 1의 화합물(로시리딘), 화학식 2의 화합물(로시리돌) 및 화학식 3의 화합물(신나밀 알코올)을 포함한다.

또한, 본 발명은 홍경천를 저급 알코올로 추출하여 알코올 추출물 또는 잔사를 얻고 홍경천 알코올 추출물을 다시 증류수에 현탁시켜 유기용매로 반복 분획함으로 다양한 용매 분획을 얻으며, 잔사는 다시 메탄올로 추출하여 침전물 분획과 수용성 분획을 얻는 상기 홍경천 추출물의 제조방법을 제공한다.

이 때 저급 알코올로는 메탄올 또는 에탄올을 사용하고, 유기용매로는 디클로로메탄 또는 부탄올을 순차적으로 사용하며, 잔사는 메탄올을 사용하여 추출한다.

본 발명의 홍경천 추출물은 혈전 형성 억제 및 혈관 평활근 세포 증식 억제 활성에 기인한 동맥경화증의 예방 및 치료 효과를 가진다.

또한, 본 발명의 홍경천 추출물은 항산화 활성에서 기인한 노화 방지 및 피로 회복 효과를 더 가진다.

또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물(로시리딘) 및 그의 유도체를 유효 성분으로 하는 순환기 질환 치료제용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 순환기 질환에 유용한 홍경천 추출물 및 그의 제조방법을 제공한다.

우선 본 발명은 홍경천 (Rhodiola sp.)을 세절하고 저급 알코올 또는 물로 추출하여 홍경천 알코올 추출물을 얻는다. 이 때 저급 알코올로는 메탄올 또는 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 홍경천으로는 장백산 홍경천(Rhodiola sachalinensis) 및 서장 홍경천을 포함하여 일반적으로 홍경천으로 통용되는 모든 식물을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 홍경천 알코올 추출물을 다시 유기 용매 또는 물로 분획한 홍경천 추출물을 제공한다. 이때 유기 용매로는 디클로로메탄 및 부탄올등을 사용하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 본 발명은 상기 메탄올 추출물을 증류수에 현탁하고 디클로로메탄으로 반복 분획하여 홍경천의 디클로로메탄 분획을 얻고, 이를 다시 부탄올로 분획하여 부탄올 분획과 물 분획을 얻는다. 또한, 상기에서 사용한 홍경천을 메탄올로 추출하고 남은 잔사에 50% 메탄올을 가하여 초음파 추출기 등으로 추출하고 여과함으로 50%메탄올 침전 분획과 50%메탄올 수용성 분획을 얻는다.

상기에서 얻은 홍경천 추출물은 활성 성분으로 하기 화학식 1의 화합물(로시리딘, rosiridin), 화학식 2의 화합물(로시리돌, rosiridol) 및 화학식 3의 화합물(신나밀 알코올, cinnamyl alcohol)을 포함한다.

[화학식1]

[화학식2]

[화학식3]

또한, 본 발명은 홍경천 추출물로부터 화학식 1의 화합물(로시리딘), 화학식 2의 화합물(로시리돌) 및 화학식 3의 화합물(신나밀 알코올)을 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 홍경천의 디클로로메탄 분획을 농축하고 헥산과 메탄올로 다시 분획하여 홍경천의 메탄올 분획을 얻은 다음 실리카겔 칼럼 크로마토그라피 및 분취 고속 액체 크로마토그라피 등을 수행하여 상기 화합물들(로시리딘, 로시리돌, 신나밀 알코올)을 분리ㆍ정제한다.

상기 홍경천 추출물 및 이로부터 정제한 화합물들은 혈전 형성 억제, 혈관 평활근 세포의 증식 억제 활성과 더불어 항산화, 지질과산화 억제, 체력 증강 활성등을 가지고 있다.

구체적으로 본 발명은 홍경천 추출물의 혈관 평활근세포 증식 억제 활성을 조사하기 위하여, 흰쥐 대동맥 평활근 초대배양 세포에서³H-티미딘 유입 정도를 측정하였다. 특히 이 때 홍경천에서 정제된 상기 화합물들을 이용하여 그의 용량 의존적인 효과를 함께 조사하였다.

그 결과, 화학식 2의 화합물 및 화학식 3의 화합물은 안지오텐신 Ⅱ 및 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)에 의한³H-티미딘의 유입을 억제하지 못하나 화학식 1의 화합물은 유의성이 있게 상기³H-티미딘의 유입을 용량 의존적으로 억제하였다(도 11 및 도 12 참조).

또한 본 발명은 홍경천 추출물의 혈소판 응집 억제 효과를 조사하기 위하여, 혈소판 응집측정기를 이용한 본(Born)의 탁도측정법 등에 따라 혈소판의 응집 정도를 측정하였다(Born, G. V. R. et al., J. Physiol., 168, 178, 1963).

그 결과 표 1에서 보는 바와 같이, 홍경천의 메탄올 추출물이 아데노신 디포스페이트(adenosine diphosphate)로 자극한 인체 혈소판의 응집을 현저하게 저하시켰고 이를 용매 분획한 경우 비극성 용매 분획보다는 극성이 높은 물 분획에 상기 활성물질이 존재함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 홍경천 추출물 및 이로부터 정제한 화합물 등은 혈전증 및 동맥경화증을 포함한 순환기 계통의 질환을 예방하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 홍경천 추출물의 항산화 활성을 조사하기 위하여, 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase, SOD) 활성을 프리도비치의 방법 및 생체내 방법등으로 측정하였다(Fridovich, I. et al., J. Biol. Chem., 243, 5753, 1968). 이 때 생체내의 항산화 활성은 사염화탄소를 사용하여 동물의 지질과 산화를 유도시킨 다음 마이크로좀 분획을 얻는 과정을 거쳐 조사하였다. 또한, 본 발명은 생체내에서 H₂O₂를 소모하는 속도를 조사하여 카탈라제(catalase)활성도 조사하였다.

그 결과 홍경천의 각 용매 분획에서 SOD 활성은 현재 시판중인 루이보스 차(Rooibos tea)보다 12∼18배 높은 것으로 나타났다. 또한, 생체내에서는 홍경천의 메탄올 추출물 등을 투여하는 경우(200㎎/㎏ 투여군)에 SOD 활성 및 카탈라제 활성이 유의성이 있게 증가하였다.

또한 본 발명은 홍경천 추출물의 지질과산화 저해 활성을 리놀레익산 (linoleic acid)를 기질로 사용한 노우즈의 방법 및 흰쥐를 이용한 생체내 방법 등으로 측정하였다(Nose, M. et al., Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 29, 507, 1982). 또한, 생체내에서 지질 과산화물의 함량을 마수기 등의 방법으로 측정하였다 (Masugi, F. et al., Vitamin, 51, 21, 1977).

그 결과 홍경천의 각 용매 분획의 과산화물 생성 억제는 대체로 각 용매 분획에서 고르게 40∼57%정도인 것으로 나타났다. 또한, 생체내에서는 홍경천의 메탄올 추출물 등을 투여하는 경우(200㎎/㎏ 투여군)에 지질 과산화물의 생성이 유의성이 있게 감소하였다.

본 발명은 홍경천 추출물의 피로 회복 효과를 조사하기 위하여, 마우스의 운동 수행능력 및 체력 증강에 미치는 영향을 리차드의 유영 시험방법을 약간 변형하여 사용하였다(Richard, H. B. et al., Am. J. Physiol., 168, 178, 1963).

그 결과, 홍경천 추출물 50㎎/㎏ 투여군에서도 수영시간이 유의성이 있게 증가되었다.

따라서, 본 발명의 홍경천 추출물 및 이로부터 정제한 화합물 등은 순환기 계통의 질환의 예방 및 치료와 더불어 노화를 방지하고 피로를 회복하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 홍경천 및 이로부터 정제한 화합물에 대하여 독성 실험을 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로 상기 조성물을 물에 녹여 이를 마우스(군당 5마리)에 각각 투여한 다음 14일 동안 관찰하여 사망률을 측정하였다. 이 때 농도 단계별로 상기 조성물을 투여한 경우 50% 치사량(LD50)은 5g/kg 이상인 것으로 나타났다.

상기 과정을 통하여 제조된 본 발명의 조성물이 치료용 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent)등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 유효 성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 30-300㎎ 정도를 투여하나 50-200㎎정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 단위투여형 제제는 전술한 유효량 범위를 고려하여 본 발명의 활성물질을 20-100㎎의 함량이 되도록 제조한다. 바람직하게는 10-50㎎을 함유하도록 제형화하는 것이 좋다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

홍경천 추출물의 제조

홍경천 뿌리 1kg을 세절하여 삼각 플라스크에 넣고 시료가 잠길 때까지 메탄올을 가하여 2일간 실온에서 추출하고 여과한 다음 감압 농축하여 홍경천 메탄올 추출물(RJ-1)을 얻었다. 다시 홍경천의 메탄올 추출물을 20배 양의 증류수에 현탁하고, 여기에 동량의 디클로로메탄을 가하여 3회 반복 분획함으로 디클로로메탄 분획(RJ-2)을 얻고, 이를 다시 부탄올로 분획함으로 부탄올 분획(RJ-3)과 물분획(RJ-4)을 얻었다. 또한, 홍경천을 메탄올로 추출하고 남은 잔사에 다시 50% 메탄올을 가하여 초음파 추출기로 추출하고 여과한 다음 방치하여 침전물 분획(RJ-5)과 50%의 메탄올 가용성 분획 (RJ-6)을 얻었다.

[실시예 2]

홍경천에서 생리 활성물질의 분리.ㆍ정제

상기 실시예에서 얻은 홍경천의 디클로로메탄 분획을 농축하여 헥산과 90%메탄올로 다시 분획하여 홍경천의 90% 메탄올 분획을 얻은 다음 디클로로메탄과 메탄올(30:1→1:1) 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그라피를 실시하고 이로부터 20개의 분획을 얻어 이중 하나의 분획을 분취 고속 액체 크로마토그라피(기기:Waters Model, 600 pump, 996 photodiode array detector, 600 controller; 칼럼 : Prep Nova-pak HR C18, 용매 : 25% 메탄올)하여 화학식 1의 화합물(로시리딘, rosiridin), 화학식 2의 화합물(로시리돌, rosiridol), 화학식 3의 화합물(신나밀 알코올, cinnamyl alcohol)을 얻었다.

[실시예 3]

홍경천에서 분리ㆍ정제한 화합물의 물리화학적 특성

(3-1) 화학식 1의 화합물 : 로시리딘(rosiridin)

3, 7-디메틸-2,6-옥타디엔-1,4-디올-1-o-β-D-글루코피라노시드

(3,7-dimethyl-2,6-octadien-1,4-diol-1-o-β-D-gulucopyranoside)

(1) 물질의 성상 : 백색 분말

(2) 분자량 : 332

(3) 분자식 : C₁₆H₂₈O₇

(4) 질량 분석치(m/z, rel. int.%):

EIMS 방법으로 측정한 질량 분석 스펙트럼은 도 1에 나타난 바와 같다.

315(1.3), 263(10.3), 69(100)

(5) 자외선 흡수 스펙트럼(UVmax mn) : 208

메탄올에서 측정한 자외선 흡수 스펙트럼은 도 2에 나타난 바와 같다.

(6) 수소핵자기 공명 스펙트럼 (NMR)

듀트로메탄올(CD₃OD)을 용매로 하여 측정한 수소핵자기 공명(¹H-NMR) 스펙트럼은 도 3에 나타난 바와 같다.

(7) 탄소핵자기 공명 스펙트럼 (NMR)

듀트로메탄올(CD₃OD)을 용매로 하여 측정한 탄소핵자기 공명(¹³C-NMR) 스펙트럼은 도4에 나타난 바와 같다.

(7) 화학구조식

(3-2) 화학식 2의 화합물 : 로시리돌(rosiridol)

3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1,4디올(3,7-dimethyl-2,6-octadien-1,4-diol)

(1) 물질의 성상 : 백색 분말

(2) 분자량 : 170

(3) 분자식 : C₁₀H₁₈O₂

(4) 질량분석치 (m/z, rel. int. %):

EIMS 방법으로 측정한 질량 분석 스펙트럼은 도 5에 나타난 바와 같다.

(5) 수소핵자기 공명 스텍트럼 (NMR)

듀트로메탄올(CD₃OD)을 용매로 하여 측정한 탄소핵자기 공명(¹H-NMR) 스펙트럼은 도 6에 나타난 바와 같다.

(6) 탄소핵자기 공명 스텍트럼 (NMR)

듀트로메탄올(CD₃OD)을 용매로 하여 측정한 탄소핵자기 공명(¹³C-NMR) 스펙트럼은 도7에 나타난 바와 같다.

(7) 화학구조식

(3-3) 화학식 3의 화합물 : 신나밀 알코올 (cinnamyl alcohol)

3-페닐-2-프로펜-1-올(3-phenyl-2-propen-1-ol)

(1) 물질의 성상 : 백색 분말

(2) 분자량 : 134

(3) 분자식 : C₉H₁₀O

(4) 질량분석치 (m/z, rel. int. %):

EIMS 방법으로 측정한 질량 분석 스펙트럼은 도 8에 나타난 바와 같다.

(5) 수소핵자기 공명 스텍트럼 (NMR)

듀트로디메틸설폭시드(DMSO-d₆)을 용매로 하여 측정한 수소핵자기 공명(¹H-NMR) 스펙트럼은 도 9에 나타난 바와 같다.

(6) 탄소핵자기 공명 스텍트럼 (NMR)

듀트로디메틸설폭시드(DMSO-d₆)을 용매로 하여 측정한 탄소핵자기 공명 (¹³C-NMR) 스펙트럼은 도 10에 나타난 바와 같다.

(7) 화학구조식

[실시예 4]

홍경천 추출물의 혈관 평활근 세포 증식 억제 활성 측정

(4-1) 혈관세포 초대 배양

흰쥐에 이산화탄소를 흡입시켜 치사시키고 절개 부위를 소독하여 절개한 다음 대동맥을 분리하고 곧바로 멸균된 생리적 염류용액(physiologic salt solution, PSS)으로 옮겨 지방조직을 떼어내고, 0.2% 콜라게나제(collagenase)로 20분간 37℃의 항온조에서 처리하여 내피세포를 제거하였다. 다음 내피와 외막을 제거하여 잘게 부수고 다시 콜라게나제 0.2%가 함유된 완전 세포배양액(10% FBS, 항생제, 글루타민이 포함된 DMEM 배지)을 가하여 4시간 동안 오비탈 진탕기(orbital shaker)에서 흔들어 주면서 반응시켰다. 다음 DMEM 용액을 원심분리하여 콜라게나제를 씻어내고 침전물을 적당량의 완전 DMEM 용액을 분주한 배양접시에서 섞어 곧 37℃의 CO₂배양기 안에 넣고 세포를 배양하였다. 이 때 생존 세포의 수는 배양액 일부를 취하여 동일 량의 트립판 블루(trypan blue)를 가하고 헤모사이토미터 (hemocytometer)에 올려 현미경으로 측정하며, 실험에 사용한 세포는 20 계대 이내의 세포로서 평활근에 특이적인 β-액틴을 항체를 사용하여 확인하였다.

(4-2)³H-티미딘 유입 측정

무혈청 배지에서 24시간 방치하여 성장이 정지된 흰쥐 대동맥의 혈관평활근 초대 배양 세포(rat arotic vascular smooth muscle cell, RVSMs)에 홍경천에서 분리된 화학식 1의 화합물(rosiridin), 화학식 2의 화합물(rosiridol) 및 화학식 3의 화합물(cinnamyl alcohol)을 각각 10ug/ml의 농도로 1시간 동안 전 처리하고 안지오텐신 Ⅱ(angiotensin Ⅱ) 10^-5M 및 PDGF 50 ng/ml을 20시간 동안 처리한 다음, 1μCi/ml의 [메틸-³H] 티미딘을 4시간 동안 표지하였다. 세포를 표지한 다음 찬 인산 완충용액(PBS; 1 mmol/L CaC_l2, 1mmol/L MgC_l2, 10% 트리클로로아세트산, 에탄올/에테르(2:1부피/부피))으로 씻어주고, 산에 불용성인³H-티미딘을 배양 접시 당 0.5M NaOH 250μl를 넣어서 추출하고, 추출액 0.1ml 에 5ml의 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail)을 넣어 β-선 측정기로 측정하였다. 홍경천에서 분리된 화합물 중 화학식 2의 화합물 및 화학식 3의 화합물은 안지오텐신 Ⅱ 및 PDGF(platelet-derived growth factor)에 의한³H-티미딘의 유입을 억제하지 못하였으나 화학식 1의 화합물은 유의성이 있게 상기 티미딘의 유입을 억제하는 것으로 나타났다 (도 11참조).

다음 PDGF에 의한³H-티미딘의 유입에 대한 화학식 1의 화합물의 용량 의존적 효과를 조사하기 위하여, 상기 화합물을 1, 10, 50 ug/ml의 농도로 처리한 결과 로시리딘이 PDGF에 의한³H-티미딘의 유입을 용량 의존적으로 억제함을 확인하였다 (도 12참조).

[실시예 5]

혈소판 응집 억제 효과

(5-1) 혈소판 풍부 혈장의 제조

혈액은 적어도 15일 정도 약물 투여를 받지 않은 건강한 지원자에서 3.8% 시트르산 나트륨(1:9 부피/부피)로 처리된 튜브를 사용하여 정맥으로부터 채혈하였다. 혈소판 풍부 혈장(PRP; platelet rich plasma)은 채혈된 혈액을 120g에서 10분간 원심분리하여 얻었고, 혈소판 결핍 혈장(PPP;platelet poor plasma)은 PRP 제조한 다음 이를 다시 1000g에서 25분간 원심분리하여 얻었다. PRP의 혈소판 수는 3×10⁸세포/ML 농도가 되도록 조절하였다.

(5-2) 혈소판 응집 억제능의 측정

혈소판 응집 억제능은 혈소판 응집측정기(platelet aggregometer; whole blood lumi-ionized calcium aggregometers, Chrono-Log Corp., USA)를 이용한 본(Born) 등의 탁도측정법에 따라 측정하였다. 상기 PRP 440μl를 취하고 먼저 37℃에서 3분간 배양하여 10μl의 시료를 가하고 2분 후에 5μl의 혈소판 응집촉진물질로 응집을 유도하였다. 응집 반응을 5분간 측정하고, 최대 응집점을 잡아 억제되는 정도를 계산하였다. 응집이 측정되는 동안 반응액의 교반은 1,000rpm으로 하였으며, 혈소판 응집 촉진물질로는 ADP(20μM, Sigma)를 사용하였다. 억제 정도는 다음의 식을 이용하여 구하였다.

[수학식 1]

억제율 %=[(A-B)/A]×100

A : 기준군의 응집 정도 %

B : 약물 처리시의 응집 정도 %

그 결과 표 1에서 보는 바와 같이, 홍경천의 메탄올 추출물이 ADP로 자극한 인체 혈소판 응집을 현저하게 저하시켰고 이를 용매 분획한 경우 비극성 용매 분획보다는 극성이 높은 물 분획에 상기 활성물질이 존재하는 것을 알 수 있었다.

[표 1]

홍경천 추출물의 ADP 자극에 의한 인체 혈소판 응집 저해 활성

[실시예 6]

홍경천 추출물의 수퍼옥사이드 디스뮤타제 활성에 미치는 영향 측정

본 발명은 상기 홍경천 추출물의 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase, SOD) 활성을 프리도비치의 방법에 따라서 측정하였다(Fridovich, I. et al., J. Biol. Chem., 243, 5753, 1968). 이 방법은 크산틴/크산틴 옥시다제 (xanthi ne/xanthine oxidase) 반응으로 생성된 수퍼옥사이드 음이온에 의한 시토크롬 c의 환원을 측정하는 것이다. 구체적으로 SOD에 의해 수퍼옥사이드 음이온의 양이 감소하여 시토크롬 c의 변화 속도가 감소하는 현상을 이용하여 SOD 활성을 측정하는데, 반응액의 조성은 시토크롬 c 24.8mg, 5μM크산틴 10ml(0.001NNaOH), 50mM인산나트륨 완충용액(pH 7.8, 0.1mM EDTA) 100ml를 넣고 혼합한 기질액 2ml에 희석한 홍경천 추출물 분획 50μl를 넣고 2분간 안정화시킨 다음 크산틴 옥시다제 (xanthine oxidase, 0.2U/ml, 0.1ㅡEDTA) 50μl를 큐벳(cuvette)에 넣고 혼합하여 550nm에서 2분간 흡광도를 측정하여 X-축에 시간(분)과 Y-축에 흡광도(OD)로 하여 일정하게 증가하는 (linear) 부분에서 분당 흡광도의 변화(△Abs/분)를 구하여 상대적인 SOD 활성을 측정하였다. 이 때 시토크롬 c의 환원을 50% 억제하는 양을 SOD 1U로 정의하는데, 기준군의 분당 흡광도(OD)를 50% 억제하는 양으로 실험에서 SOD역가(specific activity=mg당 U)를 구하였다.

그 결과 홍경천의 각 용매 분획의 SOD 활성은 표 2에서 보는 바와 같이, 홍경천 추출물의 용매 분획을 시중에 시판중인 루이보스 차(Rooibos tea)와 그 활성을 비교하였을 때, 디클로로메탄 분획을 제외하고 모든 분획의 SOD 활성이 12∼18배로 매우 높고 고르게 나타나며, 특히 부탄올 분획(RJ-3)은 18배로 가장 높게 나타났다.

[표 2]

홍경천 추출물의 용매 분획을 처리한 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)활성

[실시예 7]

홍경천 추출물의 지질과산화 저해 활성 측정

본 발명은 상기 홍경천 추출물의 지질과산화 저해 활성(Peroxide value, POV)을 리놀레익산(linoleic acid)을 기질로 사용한 노우즈의 방법(Nose, M. et al., Nippon shokuhin Kogyo Gakkaishi, 29, 507, 1982)으로 측정하였다. 리놀레익산 100μl와 각 시료(시료 5mg/ml 농도)5μl를 1.6㎝×6㎝의 시험관에 넣어 50℃ 항온기에서 24시간 동안 저장하여 산화를 촉진시킨 다음 클로로포름/초산(2:3, V/V)35ml에 용해시키고, 이 용액을 250ml 공전 삼각 플라스크에 넣어 공기를 질소로 치환시킨다. 여기에 요오드칼륨 포화수용액 1ml를 첨가하여 1분간 격렬하게 혼합하고 암소에서 5분간 방치시킨 다음 증류수 75㎖와 전분시액 1㎖를 첨가하고, 0.01N티오황산 나트륨 용액으로 요오드(Ⅰ2)를 역적정하여 POV를 측정하고 각 시료의 지질과산화 저해 효과를 측정하였다.

[수학식 2]

Tv : 시료별로 적정에 소비된 0.01N 티오황산 나트륨 용액의 소비량(㎖)

Bv : 리노레익산의 적정에 소비된 0.01N 티오황산 나트륨 용액의 소비량(㎖)

W : 실험에 사용된 기질의 양 (g)

그 결과 홍경천의 각 용매 분획의 리놀레익산 기질에 대한 과산화물 생성 억제 효과는 표 3에서 보는 바와 같이, 대체로 각 용매 분획에서 40∼57% 정도의 효과를 나타냈는데, 홍경천의 메탄올 분획이 가장 높은 57% 억제 효과를 나타내고, 디클로로메탄 분획과 부탄올 분획도 비교적 큰 억제 효과를 나타냈다.

[표 3]

홍경천 추출물 분획의 지질과산화 저해 효과

*저해율(%)=[1-(시료_POV/기준군_POV)]×100

[실시예 8]

홍경천 추출물의 세포 수준에서 지질과산화 저해 활성 측정

(8-1) 흰주 간 마이크로좀 분획의 조제

체중이 200-220g인 8주령의 흰쥐(rat) 암컷의 간을 0.15M 염화칼륨으로 퍼퓨젼(perfusion)하여 적출한 다음 잘게 잘라 미리 냉각시킨 4배 용량의 완충용액 (50mM 트리스-염산, pH 7.4)에 넣고 조직을 균일화시켰다. 이것을 8,000g로 15분간 원심분리하고 다시 여액을 10ㅡ000g로 20분간 원심분리하여 균질화되지 않은 조직 절편 및 미토콘드리아를 제거하였다. 다음 상등액을 100,000g로 1시간 동안 원심분리하고 침강한 펠렛을 균질화 용액에 현탁시켜 100,000g로 다시 한번 원심분리한 다음 침강한 펠렛을 마이크로좀 분획으로 분취하였다. 이 마이크로좀 분획을 뷰렛(Biuret) 방법(Ohnishi, S. T. et al., Anal Biochem., 86, 193, 1978)에 준하여 단백질을 정량하고 이를 -70℃에서 냉동 보관하였다.

(8-2) Fe/아스코빅산 시스템 반응액의 제조

50mM 트리스-염산 완충용액(pH 7.5) 1.6ml에 상기 시료 용액 0.1ml, 간 마이크로좀 분획(1ml 중 1mg의 단백질 포함) 0.1ml, 0.1mM 아스코빅산 0.1ml, 5mM FeSO₄, 0.1ml를 차례로 가하여 반응액을 제조하였다. 이 때, 시료의 농도는 반응계에서 200㎍이 되도록 맞추었다(Wong, S. F. et al., J. Inorg. Biochem., 14, 127, 1981).

(8-3) 지질과산화 저해 활성의 검정

상기에서 제조한 각 반응액을 잘 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 3M TCA와 2.5N염산의 혼합용액 0.5ml를 가한 다음 1,000g로 10분간 원심분리하였다. 다음 상등액 1ml를 0.67% TBA 용액 1ml와 혼합하고 끓는 물 속에서 30분간 가열하여 발색시킨 다음 실온으로 냉각시켜 532nm에서 흡광도를 측정하였다 (Esterbauer, H. et al., Methods in enzymology, Academic Press, New York, 150, 319, 1981). 대조 시료로는 시료 용액을 첨가하지 않은 것을 사용하였고, 반응액을 첨가하지 않은 것을 공시료로 사용하였으며, 테트라메톡시프로판(tetrametho xypropane)을 표준액으로 하여 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)를 정량하였다.

(8-4) 지질과산화 저해 활성의 효과

홍경천의 각 용매 분획을 이용하여 비효소적 지질과산화 억제 활성을 검정한 결과는 표 4에 나타난 바와 같다. 구체적으로 홍경천의 메탄올 분획의 경우 저해효과가 46.6%를 나타나고, 이를 다시 분획한 부탄올 분획 (RJ-3)은 55.4%로 대체로 높은 억제 효과를 나타내며, 홍경천을 메탄올로 추출하고 남은 잔사를 다시 50% 메탄올로 추출한 분획도 높은 저해 활성을 나타내었다.

[표 4]

홍경천 추출물 분획의 지질과산화 저해 활성(비효소적 Fe²⁺/아스코빅산 시스템)

*저해율(%)=[1-(시료_POV/기준군_POV)]×100

[실시예 9]

홍경천 추출물의 생체내에서의 항산화 활성

흰쥐 1군을 5마리로 하여 두 군에는 5일간 홍경천의 메탄올 추출물을 0.5% 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC)에 녹여서 50mg/kg, 200 mg/kg씩 경구 투여하고, 다른 두 군에는 검액 대신 0.5% CMC를 투여하였다. 상기 투여 마지막 날에 미리 6시간 동안 절식시키고 옥수수 오일에 용해시킨 25% 사염화탄소(CCl₄)를 4ml/kg씩 경구 투여하였다. 대조군은 검액 대신 CCl₄만 투여하였으며 정산군은 CCl₄및 검액을 투여하지 않고 옥수수 오일만 투여하였다. CCl₄를 투여하고 12시간이 경과하면 에테르로 마취하여 복부를 절개하고 간을 적출하여 빙냉시킨 0.9% 생리 식염수로 수 회 세척한 다음 간 마이크로좀 분획을 얻어 하기에 기술한 SOD, 카탈라제(catalase) 및 지질과산화 측정시의 기질로 사용하였다. 이때 마이크로좀 분획의 단백질 함량은 뷰렛 방법을 이용하여 측정하였다.

(9-1) 수퍼옥사이드 디스뮤타제 활성 측정

SOD 활성은 상기 프리도비치의 시토크롬 c방법에 준하여 측정하였다. 구체적으로 간 마이크로좀 분획을 희석하여 50μl를 효소로 사용하는데, 시트크롬 c 및 크산틴 혼합용액에 희석한 간 마이크로좀 분획을 넣고 크산틴 옥시다제를 첨가하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, CCl₄투여로 간 SOD 활성은 정상 대조군에 비해 35%나 감소한 것으로 나타났다. 홍경천의 메탄올 추출물 50mg/kg 투여군에서는 CCl₄튜여군에 비해서 29%나 증가하였으나 유의성은 없었고, 200mg/kg 투여군에서는 42%의 유의성이 있는 증가가 나타났다 (P＜0.05).

(9-2) 카탈라제 활성 측정

H₂O₂를 기질로 하여 H₂O₂를 소모하는 속도를 측정하여 간 마이크로좀의 카탈라제 활성을 측정하였다 (Luck, H. et al., Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press, New York, p885, 1971). 30% 수소 과산화물(Hydrogen peroxide)30μ1를 0.05M 인산칼륨 완충용액 5.0ml(ph 7.0)에 녹여서 기질로 사용하였다. 이 때 효소로는 간 마이크로좀 분획을 100배 농도로 희석하여 사용하였다. 0.05M 인산칼륨 완충용액(pH 7.0) 570μl, 기질 330μl와 효소원으로 간균질액(homogenate)의 희석액 100μl를 큐벳에 넣고 혼합하여 240nm에서 10초 간격으로 40초간 흡광도를 측정하였다.

[수학식 3]

활성 U/m1 = 22.94 × 흡광도의 변화량/분 × 희석 요소

활성 U/mg = 단배질 = (U/m1) / mg 단배질 / ml

그 결과, CCl₄투여로 간 카탈라제 활성은 정상 대조군에 비해 44%로 감소하였고, 홍경천의 메탄올 추출물 50mg/kg 투여군에서는 CCl₄투여군에 비해서 27%가 증가했으나 유의성은 없었으며, 200mg/kg 투여군에서는 50%의 유의성이 있는 증가가 나타났다 (P＜0.05).

(9-3) 지질과산화 함량 측정

지질 과산화물의 함량은 마수기 등의 방법으로 측정하였다(Masugi, F. et al., Vitamin, 51, 21, 1977). 상기의 간 마이크로좀 분획의 균질액에 10% 소듐 도데실 설페이트 용액을 첨가하고 실온에서 30분간 방치한 다음 0.1M 염산과 0.375% 티오바비튜릭산(thiobarbituric acid) 용액을 가하였다. 다음 이 혼합액을 끓는 물에서 45분간 반응시켜 냉각하고 부탄올을 가하여 혼합한 다음 1,000g에서 원심분리하여 상층의 부탄올 층을 취하여 532nm에서 흡광도를 측정하였고, 테트라메톡시프로판을 표준액으로 사용하여 MDA량을 정량하였다.

구체적으로 홍경천 추출물을 5일간 경구 투여하여 간 마이크로좀 분획의 지질과산화의 지표인 MDA의 생성에 미치는 영향을 조사하였다. CCl₄투여로 간 과산화물의 함량이 정상 대조군에 비하여 2.3배의 증가를 보였으며 홍경천의 메탄올 추출물 50mg/kg 투여군에서는 CCl₄투여군에 비해서 32.9%나 감소했으나 유의성은 없었고, 200mg/kg 투여군에서는 54%의 유의성이 있는 감소를 나타냈다 (P＜0.05).

[실시예 10]

홍경천 추출물의 운동 수행 및 체력 증강 효과 조사

홍경천 추출물이 마우스의 운동 수행능력 및 체력 증강에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 마우스에 CMC 투여군외 홍경천 추출물 50mg/kg 투여군과 200mg/kg 투여군등 3군으로 나누어 각 군당 12마리씩 배치하고 마우스에 7일간 매일 1회 경구 투여한 다음 8일째에 수영 시간을 측정하였다. 시험 방법은 리차드의 유영 시험방법을 약간 변형하여 사용하고, 시험 동물로는 체중 21-27g의 웅성 ICR계 마우스를 사용하였다(Richard. H. B. et al., Am. J. Physiol., 168, 178, 1963).

수영장은 가로×세로×깊이가 25×40×13cm이었으며 물의 온도는 25℃로 유지하였다. 수영 시간을 줄이고 개체간의 차이를 줄이기 위하여 시험일 오전에 계면활성제(트리오, 애경산업)을 0.2%의 농도가 되도록 포함시킨 수영장에서 마우스를 1분간 수영시키고 즉시 수돗물만 있는 보통의 수영장으로 옮겨 다시 1분간 수영시켜 마우스의 체모에 묻어 있는 지방을 제거하였다. 약 3시간의 체력 회복과 체모 건조기간을 거치고 마우스의 체중을 측정한 다음 시험 물질을 투여하였다. 시험물질은 0.5% CMC-Na 수용액에 균질하게 현탁시켜 10g당 0.1ml의 용적으로 마우스에 경구 투여하였고, 시험물질 투여 1시간 후에 계면활성제(트리오)를 0.01%의 농도가 되도록 포함시킨 수영장에서 마우스의 수영 시간을 측정하였다.

그 결과, 홍경천 추출물 50mg/kg 투여군에서의 수영시간은 135.9±15.5분으로 홍경천 추출물을 투여하지 않은 대조군의 95.5±6.2분보다 유의성이 있게 증가되었으며(p＜0.05), 200mg/kg 투여군에서는 136.6±11.6분으로 대조군보다 유의성이 있게 증가되었다(p＜0.01).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 홍경천(Rhodiola sp.)의 메탄올 추출물 뿐만 아니라 디클로로메탄, 부탄올 및 물 등으로 순차적으로 분획하여 얻은 추출물 및 이로부터 분리ㆍ정제한 화합물은 항산화, 지질과산화 억제, 체력 증강, 혈전 형성 억제 및 혈관 평활근 세포의 증식 억제 효과가 있어 앞으로 노화 방지 및 혈전증 및 동맥경화증을 포함한 순환기 계통의 질환 등을 예방 및 치료하는 뿐만 아니라 피로회복제 등으로 널리 사용될 수 있고, 다양한 건강식품 등에도 유용하게 응용될 수 있다.

Claims

홍경천(Rhodiola sp.)을 저급 알코올 또는 물로 추출하여 얻은 순환기 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 홍경천 추출물.
제1항에 있어서, 상기 과정에 더하여 디클로로메탄, 부탄올 또는 물로 다시 분획한 것을 특징으로 하는 홍경천 추출물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 성분으로 화학식 1의 화합물(로시리딘), 화학식 2의 화합물(로시리돌) 및 화학식 3의 화합물(신나밀 알코올)을 포함하는 홍경천 추출물.
홍경천을 저급 알코오로 추출하여 알코올 추출물 또는 잔사를 얻고 홍경천 알코올 추출물을 다시 증류수에 현탁시켜 유기용매로 반복 분획함으로 다양한 용매 분획을 얻으며, 잔사는 다시 메탄올로 추출하여 침전물 분획과 수용성 분획을 얻는 제1항의 홍경천 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 혈전 형성 억제 및 혈관 평활근 세포 증식 억제 활성에 기인한 동맥경화증의 예방 및 치료 효과를 가지는 홍경천 추출물.
제1항 또는 제5항에 있어서, 항상화 활성에서 기인한 노화 방지 및 피로 회복 효과를 더 가지는 홍경천 추출물.
화학식 1의 화합물(로시리딘) 및 그의 유도체를 유효 성분으로 하는 순환기 질환 치료제용 약학적 조성물.