KR100443780B1 - 신규 dna 폴리머라제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1) 1본쇄 주형 DNA 에 프라이머를 아닐링시켜 생성된 복합체를 기질로 사용하여 측정할 경우, 활성화 DNA 를 기질로 사용한 경우와 비교하여, 보다 높은 폴리머라제 활성을 나타내며; 2) 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고있고; 3) 하기 조건에서 λ-DNA 를 주형으로 사용하여 폴리머라제 사슬반응 (PCR) 이 수행되는 경우, 약 20 kbp 의 DNA 절편을 증폭시킬 수 있는 성질을 갖는 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 DNA 폴리머라제-구성 단백질; 그를 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA; 및 상기 DNA 폴리머라제의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 높은 프라이머 신장 활성 및 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성 모두를 갖는 신규 DNA 폴리머라제를 제공한다.

Description

신규 ＤＮＡ 폴리머라제 {NOVEL DNA POLYMERASE}

DNA 폴리머라제는 유전자공학용 시약에 유용한 효소이며, DNA 폴리머라제는 DNA 염기서열 결정법, 표지화, 부위특이적 변이도입법 등에 널리 이용된다. 또한, 최근에는 내열성 DNA 폴리머라제가 폴리머라제 사슬반응 (PCR) 법이 개발됨에 따라 주목받고 있으며, PCR 법에 적합한 다양한 DNA 폴리머라제가 개발되어 상품화되고 있다.

현재까지 알려진 DNA 폴리머라제는 아미노산 서열 공통성에 따라 크게 4 군으로 분류될 수 있으며, 이중 A 군 (pol I 형 효소) 및 B 군 (α형 효소) 이 대다수를 차지하고 있다. 비록 각군에 속해있는 DNA 폴리머라제가 일반적으로 서로 유사한 생화학적 특성을 갖고 있다 할지라도, 상세히 비교할 경우, 각 DNA 폴리머라제 효소가 기질특이성, 기질 아나로그의 취입, 프라이머 신장성의 강도 및 속도, DNA 합성양식, 엑소뉴클레아제 활성의 관련, 온도 및 pH 등의 최적 반응조건, 및 저해제에 대한 민감성과 관련하여 서로 상이함을 알 수 있다. 따라서, 모든 수득가능한 DNA 폴리머라제들중, 각 실험조작에 대해 특히 적합한 성질을 갖는 것들을선별적으로 사용해 왔다.

본 발명은 유전자공학용 시약에 유용한 DNA 폴리머라제, 이의 제조방법 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 상기 군중 어디에도 속해있지 않으며 현존하는 어떠한 DNA 폴리머라제도 갖고 있지 않는 생화학적 특성을 갖고 있는 신규 DNA 폴리머라제를 제공하는 것이다. 예를 들어, 프라이머 신장 활성 및 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성은 서로 상반되는 성질로 생각되며, 강력한 프라이머 신장 활성을 갖고 있는 현존하는 DNA 폴리머라제 효소중에는 DNA 합성 정확성에서 중요한 교정기능 (proofreading function) 인 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 있는 것은 없다. 또한, 탁월한 교정기능을 갖는 현존 DNA 폴리머라제는 프라이머 신장 활성이 열악하다. 따라서, 강력한 프라이머 신장 활성 및 강력한 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성 모두를 갖고 있는 DNA 폴리머라제의 개발은 시험관내 DNA 합성에 크게 기여할 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 언급된 신규 DNA 폴리머라제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

집중적인 연구결과, 본 발명자들은 초호열성(超好熱性: hyperthermophilic) 고세균(古細菌:arcaeobacterium) 인 파이로코커스 푸리우스 (Pyrrococcus furious) 로부터 신규 DNA 폴리머라제 유전자들을 발견하였고, 이후 상기 유전자들을 클로닝하였으며, 2 종류의 신규 단백질이 상기 2 종류 단백질의 공존하에 활성을 나타내는 신규 DNA 폴리머라제 활성을 나타낸다는 것을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자들은 상기 유전자가 도입된 형질전환체를 작제하였으며, 상기 복합형 DNA 폴리머라제의 대량생산에 성공하였다.

따라서, 본 발명의 요지는 하기와 같다:

[1] 하기 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라제:

1) 1본쇄 주형 DNA 에 프라이머를 아닐링시켜 생성된 복합체를 기질로 사용하여 측정할 경우, 활성화 DNA 를 기질로 사용한 경우와 비교하여, 보다 높은 폴리머라제 활성을 나타내며;

2) 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 있고;

3) 하기 조건에서 λ-DNA 를 주형으로 사용하여 폴리머라제 사슬반응 (PCR) 이 수행되는 경우, 약 20 kbp 의 DNA 절편을 증폭시킬 수 있음:

PCR 조건:

(a) 반응혼합물의 조성: 10 mM Tris-HCl (pH 9.2), 3.5 mM MgCl₂, 75 mM KCl, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 400 μM 씩, 0.01% 소 혈청 알부민, 0.1% 트라이톤 X-100, 5.0 ng/50 ㎕ 의 λ-DNA, 10 pmole/50 ㎕ 의 프라이머 λ1 (서열목록중 서열번호: 8) 및 프라이머 λ11 (서열목록중 서열번호: 9), 및 3.7 유니트/50 ㎕ 의 DNA 폴리머라제 함유;

(b) 반응조건: 30-주기의 PCR 수행 (1 주기는 98℃ 에서 10 초간 및 68℃ 에서 10 분간으로 정의됨);

[2] Taq DNA 폴리머라제와 비교하여 DNA 합성에서의 오류비율이 낮게 나타나는 것을 특징으로 하는 상기 항목 [1] 의 DNA 폴리머라제;

[3] 겔 여과법에 의해 측정된 분자량이 약 220 kDa 또는 약 385 kDa 인, 상기 항목 [1] 또는 [2] 의 DNA 폴리머라제;

[4] 2 종류의 DNA 폴리머라제-구성 단백질 (제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질) 의 공존하에 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 상기 항목 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 DNA 폴리머라제;

[5] SDS-PAGE 에 의해 측정된 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 분자량이 각각 약 90,000 Da 및 약 140,000 Da 인 것을 특징으로 하는 상기 항목 [4] 의 DNA 폴리머라제;

[6] 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질이 서열목록중 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 상기 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 결과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 기능적 동등물 (functional equivalent) 인 것을 특징으로 하는 상기 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제;

[7] 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질이 서열목록중 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 상기 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 결과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 기능적 동등물인 것을 특징으로 하는 상기 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제;

[8] 상기 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질이 서열목록중 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 상기 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 결과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 기능적 동등물이고, 상기 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질이 서열목록중 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 상기 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 결과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 기능적 동등물인 것을 특징으로 하는 상기 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제;

[9] 서열목록중 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 기능적 동등물로서, 상기 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환되어 생성된 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질;

[10] 서열목록중 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열, 또는 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 기능적 동등물로서, 상기 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환되어 생성된 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 [4] 또는 [5] 의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질;

[11] 서열목록중 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 전부또는 그의 일부를 함유하거나, 또는 상기 서열번호: l 의 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환되어 생성된 아미노산 서열을 갖고 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질로서의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 [9] 의 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA;

[12] 서열목록중 서열번호: 2 에 나타낸 염기서열 전부 또는 그의 일부를 함유하거나, 또는 엄격한 조건하에 거기에 혼성화가능한 염기서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 [9] 의 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA;

[13] 서열목록중 서열번호: 3 에 나타낸 염기서열 전부 또는 그의 일부를 함유하거나, 또는 상기 서열번호: 3 의 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환되어 생성된 아미노산 서열을 갖고 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질로서의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 [10] 의 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA;

[14] 서열목록중 서열번호: 4 에 나타낸 염기서열 전부 또는 그의 일부를 함유하거나, 또는 엄격한 조건하에 거기에 혼성화가능한 염기서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 항목 [10] 의 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA;

[15] 상기 항목 [11] 또는 [12] 의 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 항목 [13] 또는 [14] 의 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자 모두를 함유하는 형질전환체을 배양하고, 상기 배양물로부터 DNA 폴리머라제를 채취하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라제의 제조방법;

[16] 상기 항목 [11] 또는 [12] 의 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 형질전환체 및 상기 항목 [13] 또는 [14] 의 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 형질전환체를 따로 배양하고; 상기 배양물들중 포함되어 있는 DNA 폴리머라제-구성 단백질들을 혼합하고; 상기 DNA 폴리머라제를 채취하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라제의 제조방법.

도면의 간단한 설명

도 1 은 실시예 1 에서 수득된 코스미드 클론번호 264 및 코스미드 클론번호 491 내에 삽입된 DNA 절편의 제한효소지도를 나타낸다.

도 2 는 플라스미드 pFU1001 내로 삽입된 XbaI-XbaI DNA 절편의 제한효소지도를 나타낸다.

도 3 은 본 발명의 DNA 폴리머라제의 최적 pH 에 대한 그래프이다.

도 4 는 본 발명의 DNA 폴리머라제의 열안정성에 대한 그래프이다.

도 5 는 본 발명의 DNA 폴리머라제의 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 그래프이다.

도 6 은 본 발명의 DNA 폴리머라제의 프라이머 신장 활성에 대한 오토라디오그램이다.

발명의 실시를 위한 최량의 형태

(1) 본 발명의 DNA 폴리머라제 및 그의 구성 단백질

본 발명의 DNA 폴리머라제의 일례는 이하의 성질을 갖는다:

1) 프라이머를 1본쇄 주형 DNA 에 아닐링시켜 생성된 복합체를 기질로 사용하여 측정되는 경우, 활성화 DNA (DNase I-처리 송아지 흉선 DNA)를 기질로 사용한 경우와 비교하여, 보다 높은 폴리머라제 활성을 나타내고;

2) 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고;

3) 최적 pH 가 6.5 내지 7.0 (인산칼륨 완충액중, 75℃) 이고;

4) 80℃ 에서 30 분간 열처리한 후의 잔류활성이 약 80% 이고;

5) 하기 조건하에 λ-DNA 를 주형으로 사용하여 폴리머라제 사슬반응 (PCR) 을 수행하는 경우, 약 20 kbp 의 DNA 절편을 증폭시킬 수 있고:

PCR 조건:

(a) 반응혼합물의 조성: 10 mM Tris-HCl (pH 9.2), 3.5 mM MgCl₂, 75 mM KCl, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 400 μM 씩, 0.01% 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1% 트라이톤 X-100, 5.0 ng/50 ㎕ 의 λ-DNA, 10 pmole/50 ㎕ 의 프라이머 λ1 (서열목록중 서열번호:8), 프라이머 λ11 (서열목록중 서열번호:9), 및 3.7 유니트/50 ㎕ DNA 폴리머라제 함유. 여기에서, DNA 폴리머라제 1 유니트는 다음과 같이 정의된다: 활성 검정용 시료를 함유하는 반응혼합물 50㎕ [20 mM Tris-HCl (pH 7.7), 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-머캡토에탄올, 0.2 mg/ml 활성화 DNA, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 40 μM 씩, 60 nM [³H]-dTTP (애머샴사 제조)] 를 75℃ 에서 15 분간 반응시킨다. 상기 반응혼합물중 40 ㎕ 를 DE 페이퍼 (와트만사 제조) 상에 스포팅하고, 5% Na₂HP0₄로 5회 세정한다. 이후, DE 페이퍼상의 잔류 방사능활성을 액체 신틸레이션 카운터 (liquid scintillation counter) 를 이용하여 측정하여, 30분당 10 nmol 의 [³H]-dTMP 를 기질 DNA 내에 도입시킬 수 있는 효소의 양을 효소 1 유니트로 정의한다;

(b) PCR 조건: 30-주기의 PCR 수행 (1 주기는 98℃ 에서 10 초간 및 68℃ 에서 10 분간으로 정의됨);

6) 본 발명의 DNA 폴리머라제는 프라이머 신장 활성 및 DNA 합성의 정확성 양쪽면에서 Taq DNA 폴리머라제보다 우수하다. 특히, 본 발명의 DNA 폴리머라제는, 대표적인 내열성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, TaKaRa Taq, 다까라슈조사 제조) 인 Taq DNA 폴리머라제보다, DNA 합성반응의 프라이머 신장성, 예를 들어, PCR 법에 의해 DNA 가 증폭될 수 있는 DNA 나선의 길이 및 DNA 합성반응의 정확성 (DNA 합성시 발생하는 오차비율이 낮음) 면에서 우수하다.

본 발명의 DNA 폴리머라제는 2 종류의 단백질로 구성되어 있는 효소로서, 본 발명 DNA 폴리머라제의 분자량은, 겔 여과법에 의해 측정된 바, 약 220 kDa 또는 약 385 kDa 이고, 또한 SDS-PAGE 상에서 각각 약 90,000 Da 및 약 140,000 Da 에 해당하는 2 개의 밴드로 나타내어진다. 약 90,000 Da 의 단백질 (하기 기재된 ORF3 에 해당) 은 여기에서 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질이라 칭해지고, 약 140,000 Da 의 단백질 (하기 기재된 ORF4 에 해당) 은 여기에서 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질이라 칭해진다. 본 발명의 DNA 폴리머라제에서, 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질은 비공유결합적으로 결합되어 몰비 1:1 또는 1:2 의 복합체를 형성하는 것으로 추정된다.

본 발명의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질은 서열목록중 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 실질적으로 동일한 활성을 갖는 기능적 동등물일 수 있다. 또한, 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질는 서열목록중 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 실질적으로 동일한 활성을 갖는 기능적 동등물일 수 있다.

본 명세서에서 기재된 "기능적 동등물" 이라는 용어는 하기와 같이 정의된다. 천연상태로 존재하는 단백질은, 단백질을 코딩하는 유전자의 다형성 (polymorphism) 및 변이와 같은 원인외에도, 단백질 자체의 시험관내 또는 정제중 변형반응 (modification reaction) 등에 의한 결실, 삽입, 부가 및 치환과 같은 그의 아미노산 서열내 아미노산의 변이가 생길 수 있다. 그러나, 일부 단백질들은 변이가 없는 단백질과 실질적으로 동일한 물리학적 활성 또는 생물학적 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 상기 기재된 바와 같이 그의 기능 및 활성에 현저한 변화가 인지되지 않고 구조적으로 차이를 갖는 단백질들을 "기능적 동등물" 이라 칭한다. 여기에서, 생성된 단백질이 변이가 없는 단백질과 실질적으로 동일한 물리학적 활성 또는 생물학적 활성을 나타내는 한, 변이된 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않는다. 그의 예로는 하나 이상의 변이, 예를 들어, 하나 또는 수개의 변이, 보다 구체적으로는 하나 내지 10 개의 변이 (예를 들어 결실, 삽입, 부가 및 치환) 등이 있다.

이는 상기 변이가 단백질의 아미노산 서열내에 인위적으로 도입된 단백질의 경우에도 동일하게 적용된다. 이 경우, 보다 다양한 변이체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 비록 대장균내에서 발현되는 특정 단백질의 N-말단의 메티오닌 잔기가 메티오닌 아미노펩티다제의 작용에 의해 자주 제거되는 것으로 알려져 있다 하더라도, 단백질의 종류에 따라서는 메티오닌 잔기가 완전히 제거되지는 않기 때문에, 메티오닌 잔기가 있는 단백질 및 메티오닌 잔기가 없는 단백질이 모두 제조될 수 있다. 그러나, 메티오닌 잔기의 유무는 대부분의 경우 단백질 활성에 영향을 주지 않는다. 또한, 인간 인터루킨 2 (IL-2) 의 아미노산 서열중 특정 시스테인 잔기를 세린으로 치환시켜 생성된 폴리펩티드가 IL-2 활성을 보유한다는 것이 알려져 있다 [Science, 224, 1431 (1984)].

또한, 유전자공학에 의한 단백질의 제조에서, 목적 단백질은 종종 융합 단백질 형태로 발현된다. 예를 들어, 목적 단백질의 정제는, 목적 단백질의 발현양을 증가시키기 위하여, 목적 단백질의 N-말단에 다른 단백질에서 유래된 N-말단 펩티드를 첨가시켜 촉진되거나, 또는 목적 단백질의 N- 또는 C-말단에 적절한 펩티드 사슬을 첨가시키고, 상기 단백질을 발현시키고, 첨가된 펩티드 사슬에 친화성을 갖는 담체를 사용함으로써 촉진되어진다. 따라서, 본 발명의 DNA 폴리머라제의 아미노산 서열과 부분적으로 상이한 아미노산 서열을 갖는 DNA 폴리머라제는, 본 발명의 DNA 폴리머라제와 실질적으로 동일한 활성을 나타내는 한, "기능적 동등물" 로서 본 발명의 범위내에 있다.

(2) 본 발명의 DNA 폴리머라제의 유전자

본 발명의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열목록중 서열번호: 2 에 나타낸 염기서열 전부 또는 그의 일부를 함유하는 DNA 를 포함하여, 서열목록중 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 전부 또는 그의 일부를 함유하는 DNA 가 있다. 구체적으로, 예를 들어, 서열목록중 서열번호: 2 에 나타낸 염기서열 일부를 함유하는 DNA를 포함하여, 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열인, 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 일부를 함유하는 DNA 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 또한, 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열에서, 상기 DNA 는 또한, 하나 또는 수개 아미노산의 결실, 삽입, 부가, 치환 등에 의해 생성된 아미노산 서열을 함유하며. 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 도 포함한다. 더욱이, 엄격한 조건하에 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열로서, 상기 염기서열과 혼성화할 수 있는 염기서열 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 또한, 본 발명의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 DNA 는, 예를 들어, 서열목록중 서열번호: 4 에 나타낸 염기서열 전부 또는 그의 일부를 함유하는 DNA 를 포함하여, 서열목록중 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 전부 또는 그의 일부를 함유하는 DNA 를 포함한다. 구체적으로, 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 일부를 함유하는 DNA, 예를 들어, 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열인 서열목록중 서열번호: 4 에 나타낸 염기서열 일부를 함유하는 DNA 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 또한, 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열에서, 상기 DNA 는 또한, 하나 또는 수개 아미노산의 결실, 삽입, 부가, 치환 등의 결과로 생성된 아미노산 서열을 함유하며, 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함한다. 더욱이, 엄격한 조건하에 상기 염기서열에 혼성화할 수 있는 염기서열로서, 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 염기서열 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.

여기에서 "제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 기능을 갖는 단백질" 또는 "제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 기능을 갖는 단백질" 이라는 용어는 상기 항목 1) 내지 6) 에 나타낸 다양한 물리화학적 성질과 함께 DNA 폴리머라제 활성을 나타내는 성질을 갖는 단백질을 지칭한다.

여기에서, "엄격한 조건하에 혼성화할 수 있는" 이라는 용어는 0.5% SDS, 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1% 폴리비닐 피롤리돈, 0.1% Ficol 400, 및 프로브로서 0.01% 변성 연어 정자 DNA 를 함유하는 6 x SSC (1 x SSC 는 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0 을 나타낸다) 에서 50℃, 12 내지 20 시간동안 항온배양시킨 후 프로브에 혼성화되는 것을 지칭한다.

본 명세서에 기재된 "아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA" 라는 용어는 설명되어질 것이다. 유전자상의 특정 아미노산을 나타내기 위한 코돈 (트리플렛 염기 조합) 에 관해서는, 각 아미노산에 대해 1 내지 6 종류가 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 아미노산 서열에 따른다 할지라도 특정 아미노산 서열을 코딩하는 다수의 DNA 가 존재할 수 있다. 자연계에서, 유전자는 항상 안정한 형태로 존재하지는 않으며, 유전자의 염기서열상에 변이가 일어나는 것은 드문 일이 아니다. 염기서열상의 변이가 코딩될 아미노산 서열에 아무런 변화를 일으키지 않는 경우가 있을 수 있다 (사일런트 변이라 칭함). 이 경우, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 상이한 종류의 유전자가 만들어진다. 따라서, 특정 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 분리한 경우라도 이를 함유하는 생물체가 많은 세대를 지난 후에는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 유전자가 만들어질 가능성을 무시할 수 없다.

더욱이, 다양한 유전자공학 기술을 이용하여 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 유전자를 인위적으로 제조하는 것이 어렵지 않다. 예를 들어, 목적 단백질을 코딩하는 천연 유전자에서 사용된 코돈이 유전자공학에 의한 단백질의 제조시 숙주내에서 낮은 빈도로 사용되는 경우, 때때로 발현되는 단백질의 양이 낮다. 이 경우, 목적 단백질의 높은 발현은 인위적으로 특정 코돈을 , 코딩되는 아미노산 서열의 변화없이, 숙주내에서 높은 빈도로 사용되는 다른 코돈으로 전환시켜 달성된다 (예를 들어, 일본특공평 7-102146 호 공보). 상기 기재된 바와 같이, 특정 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 유전자를 인위적으로 제조하는 것도 물론 가능하다. 따라서, 이렇게 인위적으로 제조된 상이한 폴리뉴클레오티드는, 상기 유전자가 본 발명중에 개시된 아미노산 서열을 코딩하는 한, 본 발명의 범위내에 포함된다.

(3) 본 발명 DNA 폴리머라제의 제조방법

본 발명자들은 초호열성 고세균인 파이로코커스 푸리오수스로부터 신규 DNA 폴리머라제 유전자들을 발견하여, 상기 유전자들이 유전자상에 2 종류의 단백질을 공존시켜 그의 활성을 나타내는 신규 DNA 폴리머라제를 코딩하는 것을 확인하기 위하여 이를 클로닝하였다. 본 발명에서는, 상기 유전자를 도입시킨 형질전환체를 제조함으로써 본 발명의 DNA 폴리머라제를 대량으로 제조할 수 있다. 이를 위하여, 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질를 코딩하는 유전자 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질를 코딩하는 유전자 모두를 함유하는 형질전환체를 배양하고, 배양액으로부터 DNA 폴리머라제를 채취하는 것을 포합하는 방법에 의해 상기 형질전환체를 제조할 수 있다. 선택적으로, 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질를 코딩하는 유전자를 함유하는 형질전환체 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 형질전환체를 각각 배양하고, 생성된 배양액에 포함되어 있는 DNA 폴리머라제-구성 단백질들을 혼합하고, 여기에서 DNA 폴리머라제를 채취하는 것을 포함하는 방법에 의해 상기 형질전환체를 제조할 수 있다.

여기에서, "제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질를 코딩하는 유전자 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자 모두를 함유하는 형질전환체" 는 각 유전자를 함유하는 2 개의 발현벡터로 동시형질전환시켜 생성된 형질전환체이거나, 또는 2 개의 유전자 모두를 하나의 발현벡터에 재조합시켜 각 단백질이 발현되도록 하여 제조된 형질전환체일 수 있다.

(4) 본 발명 DNA 폴리머라제 유전자의 클로닝, 수득된 클론의 분석, 발현생성물인 DNA 폴리머라제의 물리화학적 성질, 활성, PCR 법에의 적용 등이 이하에 상세히 설명되어 있다.

본 발명에 사용되는 균주는 특별히 제한되지 않는다. 그의 예로는 파이로코커스 속에 속하는 균주인 파이로코커스 푸리오수스 DSM3638 이 있다. 상기 균주는 독일의 삼룽 폰 미크로로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌사 (Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 로부터 구입할 수 있다. 상기 균주를 적당한 배양액에서 배양하고, 배양액으로부터 조추출물을 제조하고, 조추출물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시키는 경우, 겔내에 DNA 폴리머라제 활성을 나타내는 몇종류의 단백질 밴드가 존재하는 것을 발견하였기 때문에, 본 발명자들은 상기 각 밴드에 해당하는 유전자들이 존재한다는 것을 예상했었다. 구체적으로, 신규 DNA 폴리머라제 유전자 및 그의 생성물은 하기에 예시된 방법에 의해 클로닝될 수 있다.

1) 파이로코커스 푸리오수스로부터 DNA 를 추출하고;

2) 1) 에서 수득된 DNA 를 적당한 제한효소로 절단하여, 플라스미드, 코스미드등의 벡터로 DNA 라이브러리를 제조하고;

3) 2) 에서 제조된 라이브러리를 대장균에 도입시키고, 외래 유전자를 발현시켜 생성된 클론의 조추출액을 모은 단백질 라이브러리를 제조하고;

4) 3) 에서 제조된 단백질 라이브러리를 이용하여 DNA 폴리머라제 활성을 측정하고, 활성을 갖는 조추출액을 제공하는 대장균 클론으로부터 외래 DNA 를 채취하고;

5) 채취한 플라스미드 또는 코스미드내에 포함되어 있는 파이로코커스 푸리오수스 DNA 절편을 분석하여 DNA 폴리머라제 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자영역을 좁히고;

6) DNA 폴리머라제 활성을 나타내는 단백질이 코딩될 것으로 예상되는 영역의 염기서열을 결정하여 단백질의 1차 구조를 추정하고;

7) 6) 에서 추정된 단백질의 대장균내 발현을 보다 용이하게 하기 위한 형태로 발현 플라스미드를 작제하고, 제조된 단백질을 정제하여 그의 성질을 분석한다.

파이로코커스 푸리오수스 DSM3638 인 상기 DNA 공여체는 초호열성 고세균으로, 혐기조건하에 95℃에서 배양되어진다. 증식된 세포를 파쇄시키고, DNA 를 추출 및 정제하는 방법, 수득된 DNA 를 제한효소로 절단시키는 방법 및 기타 방법으로는 공지의 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법들은 문헌 [Molecular Cloning: Laboratory Manual, 75-178, Cold Spring Harbor Laboratory 출판, 1982, T. Maniatis 등 편저] 에 상세히 기재되어 있다.

DNA 라이브러리 제조시, 예를 들어, 트리플 헬릭스 코스미드 벡터 (스트라타진사 제조) 를 사용할 수 있다. 파이로코커스 푸리오수스의 DNA 를 Sau3AI (다까라슈조사 제조) 으로 부분절단시키고, 절단된 DNA 를 밀도구배원심분리하여 긴 DNA 절편을 수득한다. 이를 상기 벡터의 BamHI 부위에 결찰시킨 후, 시험관내에서 패키징시킨다. 상기 제조된 DNA 라이브러리로부터 수득된 각 형질전환체를 따로 배양한다. 세포를 수집한 후, 이를 초음파처리하여 파괴시키고, 생성된 파쇄액을 열처리하여 숙주 대장균의 DNA 폴리머라제를 불활성화시킨다. 이후, 원심분리에 의해 내열성 단백질을 함유하는 상청액을 수득할 수 있다. 상기 상청액을 코스미드 단백질 라이브러리라 명명한다. 상청액 일부를 사용하여 DNA 폴리머라제 활성을측정함으로써, 파이로코커스 푸리오수스 유래의 DNA 폴리머라제를 발현하는 클론을 수득할 수 있다. DNA 폴리머라제 활성은 문헌 [DNA Polymerase from Escherichia coli , Harpar and Row 출판, D.R. Davis 편저, 263-276 (C.C. Richardson 저)] 에 기재된 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다.

파이로코커스 푸리오수스의 DNA 폴리머라제 유전자중 하나는 이미 클로닝되어 본 발명자들에 의해 그의 구조가 밝혀졌다 [Nucleic Acids Research, 21, 259-265 (1993)]. 상기 유전자의 번역산물은 분자량 약 90,000 Da 의 폴리펩티드로, 775 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 그의 아미노산 서열은 분명히 α형 DNA 폴리머라제의 보존서열을 함유하고 있다. 사실, 상기 유전자산물에 의해 나타나는 DNA 폴리머라제 활성이 α형 DNA 폴리머라제의 특이적 저해제인 아피디콜린에 의해 저해되기 때문에, 상기 DNA 폴리머라제는 본 발명의 DNA 폴리머라제와는 구별된다. 따라서, 내열성 DNA 폴리머라제 활성을 나타내는 수득된 클론 중 상기 공지된 유전자들은 각 클론에 함유되어 있는 코스미드를 절단하고, 상기 유전자를 프로브로 사용하는 혼성화를 실시하고, 혼성화되지 않는 클론을 선별하는 것을 포함하는 방법에 의해 제거될 수 있다. 신규 DNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 클론과 함께 절단된 코스미드에 대해 DNA 삽입단편의 제한효소지도가 작제될 수 있다. 다음으로, 수득된 제한효소지도를 기초로 하여 상기 DNA 절편을 다양한 영역으로 분할하고, 각 영역을 플라스미드 벡터내에 서브클로닝하고, 생성된 벡터를 대장균에 도입시키고, 그 안에서 나타나는 내열성 DNA 폴리머라제 활성을 검정하는 것을 포함하는 방법에 의해 상기 DNA 절편상 DNA 폴리머라제 유전자의 위치를 결정할 수 있다. 이렇게 하여, DNA 폴리머라제 유전자를 포함하는 약 10 kbp 의 XbaI-XbaI DNA 절편을 수득할 수 있다.

상기 DNA 절편을 끼워넣은 플라스미드를 함유하는 재조합 대장균은 90℃ 에서 20 분간 처리한 후에도 조추출액 내에서 충분한 수준의 DNA 합성 활성을 나타내는 반면, 상기 DNA 절편을 끼워넣지 않은 임의의 플라스미드에서는 이러한 활성이 나타나지 않았다. 따라서, 상기 DNA 절편상에 내열성 폴리머라제의 생산 정보가 존재하고, 상기 정보를 갖는 유전자가 상기 대장균내에서 발현된다는 것으로 결론지을 수 있다. 상기 DNA 절편을 pTV118N 벡터 (다까라슈조사 제조) 내로 재조합시켜 만들어진 플라스미드를 pFU1OO1 이라 명명한다. 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109 를 대장균 JM109/pFU1OO1 이라 명명 및 표시하고, 부다페스트 조약에 의거 1995년 8월 11일자(원기탁일)로 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (주소: 일본 305 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1-쵸메 1-3) 에 수탁번호 FERM BP-5579 로 기탁하였다.

플라스미드 pFU1OO1 에 삽입된 DNA 절편의 염기서열은 통상적인 방법, 예를 들어, 디데옥시 방법에 의해 해석될 수 있다. 더욱이, 염기서열중 단백질을 코딩할 수 있는 영역, 즉, 오픈 리딩 프레임 (ORF) 은 상기 염기서열을 분석함으로써 추정될 수 있다.

플라스미드 pFU1OO1 내에 삽입된 약 10 kbp 의 XbaI-XbaI DNA 절편의 염기서열중 8,450 bp 의 서열을 서열목록중 서열번호: 5 에 나타낸다. 상기 염기서열에는, 5' 말단측으로부터 각각 ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, 및 ORF6 이라 명명된6 개의 연속적인 ORF 가 존재한다. 도. 2 는 상기 XbaI-XbaI 절편의 제한효소지도 및 절편상 ORF 의 위치를 보여주고 있다 (도면 좌측으로부터 ORF1 내지 ORF6).

임의의 공지된 DNA 폴리머라제와 상동성을 나타내는 서열은 상기 6 개의 ORF 중 어느 하나에서도 발견되지 않았다. 그러나, ORF1 및 ORF2 상에는 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 에서 발견되는 CDC6 단백질과 상동성을 갖는 서열, 또는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 에서 발견되는 CDC18 단백질과 상동성을 갖는 서열이 존재한다는 것을 주목해야 한다. CDC6 및 CDC18 은 효모에서 DNA 합성기 (S 기) 로의 세포 주기 이행 (cell cycle shift) 에 필요한 단백질로서, DNA 복제개시를 조절하는 단백질로 생각된다. 또한, ORF6 은 효모에서 DNA 상해회복 및 효모에서 체세포분열기 및 감수분열기에서의 재조합에 작용한다고 알려져 있는 RAD51 단백질과 상동성을 갖는 서열 및 RAD51 단백질과 감수분열기-특이적 상동물인 Dmc1 단백질과 상동성을 갖는 서열을 갖고 있다. RAD51 단백질을 코딩하는 유전자 또한 G1 에서 S 기로의 세포 주기 이행시 발현된다고 알려져 있다. 기타 ORF, 즉 ORF3, ORF4, 및 ORF5 에 대해서는, 상동성을 갖는 서열을 갖는다고 밝혀진 단백질이 알려져 있지 않다.

다양한 영역을 삭제한 각각의 DNA 절편들을 삽입시킨 재조합 플라스미드를 작제하고, 상기 플라스미드를 숙주에 형질전환시키고, 수득된 각 형질전환체의 내열성 폴리머라제 활성을 검정하는 것을 포함하는 방법에 의해 상기 ORF 들중 어느 것으로부터 내열성 DNA 폴리머라제 활성이 유래되는 가를 결정할 수 있다. 상기 약 10 kbp 의 XbaI-XbaI DNA 절편에서 ORF1 또는 ORF2 를 삭제하거나, 또는 ORF5또는 ORF6 를 삭제하여 제조된 DNA 절편으로 삽입된 재조합 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 형질전환체는 내열성 DNA 폴리머라제 활성을 유지하는 반면, ORF3 또는 ORF4 를 삭제하여 제조된 DNA 절편으로 삽입된 재조합 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 형질전환체는 그 활성을 잃는다. 이러한 사실은 DNA 폴리머라제 활성이 ORF3 또는 ORF4 에 의해 코딩되고 있음을 시사한다.

각각의 ORF 를 따로 삽입시킨 재조합 플라스미드를 재조하고, 각각의 재조합 플라스미드로 숙주를 형질전화시키고, 수득된 각 형질전환체에서 내열성 DNA 폴리머라제 활성의 발현을 검정하는 것을 포함하는 방법에 의해 ORF3 및 ORF4 중 어느 것에 의해 DNA 폴리머라제가 코딩되는 가를 결정할 수 있다. 의외로, ORF3 또는 ORF4를 단독으로 함유하는 형질전환체로부터 수득된 조추출액에서는 매우 약한 DNA 폴리머라제 활성만이 검출된다. 그러나, ORF3 및 ORF4 모두를 함유하는 형질전환체의 내열성 DNA 폴리머라제 활성과 동일한 수준의 활성이 2 개의 추출액을 혼합할 경우 수득될 수 있으며, 이는 본 발명의 신규 DNA 폴리머라제가 2 개의 ORF 번역산물의 작용을 필요로 함을 낸다. DNA 폴리머라제의 분자량을 측정함으로써, 2 개의 단백질이 복합체를 형성하여 DNA 폴리머라제 활성을 나타내는지, 또는 하나가 다른 하나를 변형시켜 활성을 갖는 효소로 전환시키는지를 알 수 있다. 겔 여과법에 의해 상기 DNA 폴리머라제의 분자량을 측정한 결과는 상기 두 단백질이 복합체를 형성함을 보여준다.

ORF3 의 염기서열은 서열목록중 서열번호: 2 에 나타나 있고, ORF3-유래 번역산물, 즉 상기 염기서열로부터 추정되는 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: l 에 나타나 있다. ORF4 의 염기서열은 서열목록중 서열번호: 4 에 나타나 있고, ORF4-유래 번역산물, 즉 상기 염기서열로부터 추정되는 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 3 에 나타나 있다.

본 발명의 DNA 폴리머라제는, ORF3 및 ORF4 가 모두 도입된 재조합 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 형질전환체, 예를 들어, 대장균 JM109/pFUlOO1 을 통상적인 배양조건, 예를 들어, 100 ㎍/ml 앰피실린을 함유하는 LB 배지 (10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모추출물, 5 g/ℓ NaCl, pH 7.2) 에서 배양함으로써 세포내에서 발현될 수 있다. 상기 폴리머라제는 상기 배양된 세포로 초음파분쇄, 열처리, 및 음이온 교환 칼럼 (RESOURCE Q 칼럼, 파마시아사 제조), 헤파린 세파로스 칼럼 (HiTrap 헤파린, 파마시아사 제조), 겔여과 칼럼 (슈퍼로스 6HR, 파마시아사 제조) 등을 이용한 크로마토그래피를 수행하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 에서 거의 2 종류의 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 2 종류 밴드만이 수득될 정도로 정제될 수 있다. 또한, 상기 기재된 ORF3 또는 ORF4 를 각각 단독으로 함유하는 형질전환체를 따로 배양하고, 이어서 수득된 배양세포, 그들의 조추출액, 또는 정제된 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 목적 DNA 폴리머라제를 수득할 수 있다. 2 종류의 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 혼합할 때, 특별한 방법이 필요하지는 않으며, 단순히 각 형질전환체의 조추출액 또는 그로부터 정제된 2 종의 단백질을 적당한 양으로 혼합함으로써 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 수득할 수 있다.

상기 수득된 본 발명의 DNA 폴리머라제는 SDS-PAGE 상에서 약 90,000 Da 및약 140,000 Da 의 분자량에 해당하는 위치에 각각 제 1 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질에 해당하는 2 개의 밴드를 나타낸다.

도 3 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 75℃ 인산칼륨 완충액중 6.5 내지 7.0 근처에서 최적의 pH 를 나타낸다. 상기 DNA 폴리머라제의 효소 활성을 다양한 온도에서 검정할 경우, 상기 효소는 75℃ 내지 80℃에서 높은 활성을 나타낸다. 그러나, 활성검정용 기질로 사용된 활성화 DNA 의 2본쇄 구조가 보다 높은 온도에서는 파괴되기 때문에, 상기 효소 활성에 대한 정확한 최적온도는 검정되지 않았다. 도 4 에 나타난 바와 같이, 상기 DNA 폴리머라제는 80℃ 에서 30 분간 열처리한후에도 80% 이상의 잔류활성을 유지하는 높은 내열성을 갖고있다. 이러한 수준의 내열성은 상기 효소를 PCR 법에 사용가능하게 한다. 또한, α형 DNA 폴리머라제의 특이적 저해제인 아피디콜린의 영향을 평가할 경우, 상기 DNA 폴리머라제의 활성이 2 mM 아피디콜린의 존재하에서도 저해되지 않음이 밝혀졌다.

상기 정제 DNA 폴리머라제의 생화학적 성질을 분석한 결과, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 시험관내에서 매우 탁월한 프라이머 신장 활성을 갖고있다. 표 1 에 나타낸 바와 같이, 프라이머를 1본쇄 DNA (M13-HT 프라이머) 에 아닐링시킨 형태의 기질을 사용하여 상기 DNA 폴리머라제 활성을 검정하는 경우, 통상의 활성 검정용으로 사용되는 활성화 DNA (DNase I-처리 송아지 흉선 DNA) 의 활성과 비교하여 보다 높은 뉴클레오티드 도입 활성이 나타날 수 있다. 본 발명 DNA 폴리머라제의 프라이머 신장능을 상기 M13-HT 프라이머 기질을 사용하는 다른 DNA 폴리머라제의 프라이머 신장능과 비교할 경우, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 파이로코커스 푸리오수스에서 유래된 공지된 DNA 폴리머라제 (Pfu DNA 폴리머라제, 스트라타진사 제조) 및 더모스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) 에서 유래된 Taq DNA 폴리머라제 (TaKaRa Taq, 다까라슈조사 제조) 보다 우수한 신장 활성을 나타낸다. 더욱이, 상기 반응 시스템에 경쟁자 기질로서 활성화 DNA 를 첨가하는 경우, 상기 2 종류의 DNA 폴리머라제의 프라이머 신장 활성이 크게 저해되는 반면, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 낮은 수준으로 저해되며, 이는 본 발명의 DNA 폴리머라제가 프라이머 신장형 기질에 대해 높은 친화성을 갖고 있음을 나타낸다 (도 6).

기질	상대적 활성
	본 발명의 DNA 폴리머라제	Pfu DNA 폴리머라제	Taq DNA 폴리머라제
활성화 DNA	100	100	100
열변성된 DNA	340	87	130
M13-HT 프라이머	170	23	90
M13-RNA 프라이머	52	0.49	38
폴리 dA-올리고 dT	94	390	290
폴리 A-올리고 dT	0.085	-	0.063

또한, 본 발명의 DNA 폴리머라제는, PCR 법에 사용할 경우, 탁월한 성능을 나타낸다. 일반적으로 PCR 법에 사용되는 더모스 아쿠아티스에서 유래된 DNA 폴리머라제에서는, 상기 DNA 폴리머라제만을 이용하여 10 kbp 이상의 DNA 절편을 증폭시키는 것이 곤란하며, 20 kbp 이상의 DNA 절편은 다른 DNA 폴리머라제와 병합하여 사용되는 경우에 증폭될 수 있다 [Proceedings of National Academy of Sciences of USA, 91, 2216-2220 (1994)]. 또한, 보고된 바에 따르면 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 증폭시킬 수 있는 DNA 의 나선길이는 약 3 kbp 이내이다. 대조적으로, 본 발명의 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우, 임의의 다른 효소를 첨가하지 않고 단독으로 사용되는 경우에도, 20 kbp 길이를 갖는 DNA 절편의 증폭이 가능하다.

더욱이, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성도 보유하고 있는 본 발명의 DNA 폴리머라제는, 엑소뉴클레아제 활성 대 DNA 폴리머라제 활성의 비율과 관련한 그의 높은 활성으로 인하여, DNA 합성시 매우 높은 정확성을 보증한다고 알려져 있는 Pfu DNA 폴리머라제와 필적한다 (도 5). 또한, 본 발명의 DNA 폴리머라제의 경우 DNA 합성반응중 오차율이 Taq DNA 폴리머라제의 오차율 보다 낮다. 상기 다양한 성질들은 본 발명의 DNA 폴리머라제가 PCR 법과 같은 유전자공학 기법용 시약으로 매우 탁월하게 사용됨을 나타낸다.

본 발명의 신규 DNA 폴리머라제 유전자의 발견은 또한 하기와 같은 흥미있는 견지를 제공한다. 신규 DNA 폴리머라제를 코딩하는 ORF3 및 ORF4 에 대한 유전자를 함유하는 영역이 세포내에서 전사되는 방식을 검증하기 위하여, 본 발명자들은 파이로코커스 푸리오수스 세포로부터 제조된 RNA 분획을 노던 블롯팅 방법, RT-PCR 법 및 프라이머 신장 방법에 의해 분석하였다. 그 결과, ORF1 내지 ORF6 이 ORF1 의 바로 상류에서 단일 메신저 RNA (mRNA) 형태로 전사되는 것이 확인되었다. 이러한 발견으로부터, 세포내에서 ORF1 및 ORF2 의 생성은 ORF3 및 ORF4 와 동일하게 제어될 것으로 예상된다. ORF1, ORF2, ORF5 및 ORF6 의 서열이 효모에서 DNA 복제개시의 조절에 관련되어 있는 CDC6 및 CDC18 (CDC6 및 DCD18 은 효모에서 DNA 복제의 개시를 조절하는 것에 관여한다)의 서열과 상동성이 있다는 것을 고려하면, 상기 예측은 본 발명의 신규 DNA 폴리머라제가 DNA 복제에 중요한 DNA 폴리머라제일 가능성이 매우 높음을 시사한다. 파이로코커스 푸리오수스가 속해있는 고세균의DNA 복제 시스템이 진핵세포의 DNA 복제 시스템과 밀접하게 관련되어 있을 것으로 예상되기 때문에, 이제까지 진핵생물에서 발견되지 않은 복제에 중요한 DNA 폴리머라제로서 본 발명의 DNA 폴리머라제와 유사한 효소가 존재할 가능성이 있다.

본 발명의 DNA 폴리머라제와 유사한 내열성 DNA 폴리머라제가 파이로코커스 푸리오수스와 같은 초호열성 고세균에 속하는 다른 세균, 예를 들어, 파이로코커스 푸리오수스 이외의 파이로코커스속에 속하는 세균; 파이로딕티움속; 더모코커스속, 스태필로더무스속, 및 기타 속에 속하는 세균에서 생성될 것으로 예상된다. 상기 효소들이, 본 발명의 DNA 폴리머라제와 같이, 2 개의 DNA 폴리머라제-구성 단백질로 구성되는 경우, 2 개의 DNA 폴리머라제-구성 단백질중 하나와 나머지 DNA 폴리머라제-구성 단백질에 해당하는 본 발명의 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 조합함으로써 유사한 DNA 폴리머라제 활성이 나타날 것으로 예상된다.

상기 초호열성 고세균에 의해 생성된 본 발명의 DNA 폴리머라제와 유사한 내열성 DNA 폴리머라제는 이를 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 및 염기서열과 관련하여 본 발명의 DNA 폴리머라제와 상동성을 가질 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명에 의해 분리된 유전자 또는 상기 염기서열의 일부를 프로브로 사용하는 혼성화반응에 의해 상기 초호열성 고세균중 하나로부터 수득된 DNA 절편을 적당한 미생물에 도입시키고, 적당한 방법에 의해 상기 코스미드의 단백질 라이브러리와 동일한 방식으로 제조된 열처리 분해물의 DNA 폴리머라제 활성을 검정하는 것을 포함하는 방법에 의해, 염기서열은 본 발명의 DNA 폴리머라제와 동일하지 않으나 유사한 효소 활성을 가지며, 본 발명의 DNA 폴리머라제와 유사한 내열성 DNA 폴리머라제의유전자를 수득할 수 있다.

상기 혼성화반응은 하기 조건하에서 수행될 수 있다. 구체적으로, DNA-고정 멤브레인을 프로브와 함께 50℃, 0.5% SDS, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐 피롤리돈, 0.1% 피콜 400, 및 0.01% 변성 연어정자 DNA 를 함유하는 6 x SSC (1 x SSC 는 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0 을 나타냄) 에서 12 내지 20 시간동안 항온배양시킨다. 항온배양 종료후, 37℃ 에서 0.5% SDS 를 함유하는 2 x SSC 로 시작하여, SSC 농도를 출발농도에서 0.1 x SSC 로 바꾸고, 고정된 DNA 의 시그날이 백그라운드와 구별될 때까지 SSC 온도를 50℃ 까지 변화시키면서 멤브레인을 세정한다.

따라서, 상기 초호열성 고세균중 하나로부터 수득된 DNA 를 주형으로 사용하고 본 발명에 의해 분리된 유전자 또는 상기 유전자 염기서열의 일부를 프라이머로 사용하는 유전자 증폭반응에 의해 수득된 DNA 절편, 또는 유전자 증폭반응에 의해 수득된 절편을 프로브로 하는 혼성화반응에 의해 초호열성 고세균으로부터 생성된 DNA 절편을 적당한 미생물에 도입시키고, 상기와 동일한 방식으로 DNA 폴리머라제 활성을 검정함으로써, 그의 DNA 폴리머라제 활성이 동일하지 않으나 본 발명의 DNA 폴리머라제의 DNA 폴리머라제 활성과 동일한 수준인 본 발명의 DNA 폴리머라제와 유사한 내열성 DNA 폴리머라제의 유전자를 수득할 수 있다.

이하에 본 발명은 하기 실시예들을 이용하여 설명되나, 본 발명의 범위는 하기 실시예에만 한정되지는 않는다. 하기 실시예에서 % 값은 중량% 를 의미한다.

실시예 1

(1) 파이로코커스 푸리오수스 게놈 DNA 의 제조

파이로코커스 푸리오수스 DSM3638 을 하기 방법으로 배양하였다:

1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 수용성전분, 3.5% Jamarin S 고형물 (Jamarin Laboratory), 0.5% Jamarin S 액체 (Jamarin Laboratory), 0.003% MgSO₄, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO₄·7H₂0, 0.0001% CoS0₄, 0.0001% CaCl₂·7H₂0, 0.0001% ZnSO₄, 0.1 ppm CuS0₄·5H₂0, 0.1 ppm KAl(SO₄)₂, 0.1 ppm H₃BO₃, 0.1 PPM Na₂MoO₄·2H₂0, 및 0.25 ppm NiCl₂·6H₂0 를 함유하는 조성물을 갖는 배지를 2-리터 배지병에 넣고 120℃ 에서 20 분간 멸균하였다. 질소가스를 불어넣어 용존산소를 제거한 후, 상기 균주를 생성된 배지에 접종하였다. 그 후, 95℃에서 16 시간동안 정치배양하였다. 배양종료후, 원심분리에 의해 세포를 수집하였다.

그 후, 수집된 세포를 25% 수크로스를 함유하는 0.05 M Tris-HCl (pH 8.0) 4 ml 에 현탁하였다. 상기 현탁액에, 리소자임 0.8 ml [5 mg/ml, 0.25 M Tris-HCl (pH 8.0)] 및 0.2 M EDTA 2 ml 을 첨가하고, 20℃ 에서 1 시간동안 항온배양하였다. SET 용액 24 ml [150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)] 을 첨가한 후, 상기 혼합물에 5% SDS 4 ml 및 단백질분해효소 K (10 mg/ml) 400 ㎕ 를 첨가하였다. 그 후, 생성된 혼합물을 37℃ 에서 1 시간동안 반응시켰다. 반응종료후, 페놀-클로로포름 추출 및 이후에 에탄올 침전을 수행하여 약 3.2 mg 의 게놈 DNA 를 제조하였다.

(2) 코스미드 단백질 라이브러리의 제조

파이로코커스 푸리오수스 DSM3638 게놈 DNA 400 ㎍ 을 Sau3A1 으로 부분절단시키고, 밀도구배 초원심분리 방법에 의해 크기별로 35 내지 50 kb 분획을 분별하였다. 1 ㎍ 의 트리플 헬릭스 코스미드 벡터 (스트라타진사 제조) 를 XbaI 으로 절단하고, 알칼리 포스파타제 (다까라슈조사 제조)를 사용하여 탈인산화시키고, BamHI 으로 더 절단하였다. 절단된 벡터에 상기 35 내지 50 kb DNA 분획 140 ㎍ 을 혼합한 후 결찰을 실시하였다. "기가팩 골드" (스트라타진사 제조) 를 사용한 시험관내 패키징 방법에 의해 파이로코커스 푸리오수스의 게놈 DNA 절편을 람다 파아지 입자내에 패키지시켜 라이브러리를 제조하였다. 그 후, 수득된 라이브러리의 일부를 대장균 DH5αMCR 에 형질도입하였다. 수득된 형질전환체중 몇 개를 선별하여 코스미드 DNA 를 제조하였다. 적당한 크기의 삽입편의 존재를 확인한 후, 상기 라이브러리로부터 약 500 개의 형질전환체를 다시 선별하고, 각각을 100 ㎍/ml 앰피실린을 함유하는 LB 배지 (10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모추출물, 5 g/ℓ NaCl, pH 7.2) 150 ml 에 따로 배양하였다. 생성된 배양액을 원심분리하고, 수집된 세포를 pH 8.0 의 20 mM Tris-HCl 1 ml 에 현탁하고, 이후 수득된 현탁액을 100℃ 에서 10 분간 열처리하였다. 다음에, 초음파분쇄를 수행하고, 다시 100℃ 에서 10 분간 열처리하였다. 원심분리후 상청액 형태로 수득된 분해물을 코스미드 단백질 라이브러리로 사용하였다.

(3) DNA 폴리머라제 활성의 검정

DNase I 처리에 의해 활성화된 송아지 흉선 DNA (워딩톤사 제조) (활성화DNA) 를 기질로 사용하여 DNA 폴리머라제 활성을 검정하였다. DNA 활성화 및 DNA 폴리머라제 활성의 검정은 문헌 [DNA Polymerase from Escherichia coli, 263-276 (C.C. Richardson 저), Harper & Row 출판, D.R. Davis 편저] 에 기재된 방법에 의해 수행되었다.

효소 활성의 검정은 하기 방법에 의해 수행되었다. 구체적으로, 그의 활성 검정용 시료를 함유하는 반응액 50 ㎕ [20 mM Tris-HCl (pH 7.7), 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-머캡토에탄올, 0.2 mg/ml 활성화 DNA, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 40 μM, 60 nM [³H]-dTTP (애머샴사 제조)] 을 제조하여 75℃ 에서 15 분간 반응시켰다. 그 후, 상기 반응혼합물의 일부인 40 ㎕ 를 DE 페이퍼 (와트만사 제조) 상에 스폿팅하고, 5% Na₂HP0₄로 5회 세정하였다. 액체 신틸레이션 카운터를 이용하여 DE 페이퍼상의 잔류 방사능활성을 검정하였다. 상기 기재된 효소 활성 검정법에 의해 검정시, 30 분당 10 nmol 의 [³H]-dTMP 를 기질 DNA 에 도입시키는 효소의 양을 효소 1 유니트로 정의하였다.

(4) DNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 코스미드 클론의 선별

20 mM Tris-HCl (pH 7.7), 2 mM MgCl₂, 2 mM 2-머캡토에탄올, 0.2 mg/ml 활성화 DNA, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 40 μM, 60 nM [³H]-dTTP (애머샴사 제조) 를 함유하는 반응혼합물을 제조하였다. 코스미드 단백질 라이브러리의 각 추출액중 5 개 클론에서 각각 1 ㎕, 즉 한 반응당 추출액 5 ㎕ 씩을 상기 혼합물 45㎕ 에 첨가하였다. 상기 혼합물을 75℃ 에서 15 분간 반응시킨 후, 상기 반응혼합물의 일부인 40 ㎕ 를 DE 페이퍼 (와트만사 제조) 상에 스폿팅하고, 5% Na₂HP0₄로 5회 세정하였다. 액체 신틸레이션 카운터를 이용하여 DE 페이퍼상의 잔류 방사능활성을 검정하였다. 1차 검정에 의해 약간의 활성을 갖는 것으로 밝혀진 군 (1 군은 5 개의 클론으로 구성된) 을 5 개의 클론에서 각각의 클론으로 분리한 후, 각 클론에 대해 2차 검정을 수행하였다. 클론번호 57, 154, 162 및 363 으로 지정된 유전자를 프로브로 이용한 혼성화반응에 의해 코스미드 DNA 라이브러리가 공지된 DNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 클론을 포함한다는 것이 이미 알려져 있기 때문에, 상기 클론을 제외하고 DNA 합성 활성을 함유하는 5 개의 클론, 클론번호 41, 153, 264, 462 및 491 이 발견되었다.

(5) 제한효소지도의 제작

상기 5 개의 클론으로부터 코스미드를 분리하고, 각각의 코스미드를 BamHI 으로 절단하였다. 수득된 이동패턴을 조산한 결과 수개의 상호공통인 밴드가 나타났으며, 상기 5 개의 클론이 오버랩 및 슬라이트 쉬프트(slight shift)를 갖는 영역을 조입시키는 것으로 예상되었다. 이같은 발견을 염두에 두고, 클론번호 264 및 491 내의 DNA 삽입편을 처리하여 제한효소지도를 제작하였다. 양 클론으로부터 제조된 코스미드를 다양한 제한효소로 절단하였다. 적당한 크기의 절편으로 절단되는 KpnI, NotI, PstI, SmaI, XbaI, 및 XhoI (모두 다까라슈조사 제조) 각각의 절개위치를 결정한 결과, 도 1 에 나타낸 바와 같은 지도를 수득하였다.

(6) DNA 폴리머라제 유전자의 서브클로닝

도 1 에 나타낸 제한효소지도를 기초로 하여, 길이가 약 10 kbp 인 각종 DNA 절편을 클론번호 264 또는 491 로부터 유래된 코스미드로부터 잘라내었다. 이후, 상기 절편을 pTV118N 또는 pTV119N 벡터 (다까라슈조사 제조) 에 서브클로닝하였다. 이후, 각 재조합 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 형질전환체의 내열성 DNA 폴리머라제 활성을 검정하여, 고 내열성 DNA 폴리머라제를 생성하는 유전자가 약 10 kbp 의 XbaI-XbaI 절편상에 존재함을 확인하였다. 이후, XbaI-XbaI 절편을 pTV118N 벡터에 조입시켜 생성된 플라스미드를 플라스미드 pFU1OO1 이라 명명하고, 및 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균 JM109 를 대장균 JM109/pFU1OO1 이라 명명하였다.

실시예 2

신규 DNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 DNA 절편 염기서열의 결정

XbaI 을 사용하여 실시예 1 에서 수득된 플라스미드 pFU1OO1 로부터 DNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 상기 XbaI-XbaI 절편을 다시 잘라내고, DNA 블런팅 키트 (다까라슈조사 제조) 를 이용하여 평골말단화(平滑末端化)하였다. 이후, 생성물을 미리 SmaI 으로 개환시킨 새로운 pTV118N 벡터에 상이한 방향으로 결찰시켜 결실 변이체 제작용 플라스미드를 제조하였다. 수득된 플라스미드를 각각 pFU1OO2 및 pFU1OO3 이라 명명하였다. 상기 플라스미드를 이용하여 DNA 삽입체의 양 말단으로부터 순차적으로 결실 변이체를 제조하였다. 상기 제조에는 Henikoff 방법 (Gene, 28, 351-359) 을 응용한 킬로-서열 결실 키트 (다까라슈조사 제조) 를 사용하였다. 사용된 3'-돌출형 및 5'-돌출형 제한효소는 각각 PstI 및 XbaI 이었다. 각종 결실 변이체를 주형으로 사용하여 삽입체의 염기서열을 BcaBEST 디데옥시 염기서열분석 키트 (다까라슈조사 제조) 를 이용한 디데옥시 방법에 의해 결정하였다.

결정된 염기서열중 8,450 bp 서열을 서열목록중 서열번호: 5 에 나타낸다. 염기서열을 분석한 결과, 서열목록중 서열번호: 5 에 나타낸 염기서열에서 염기번호 123-614 (ORFl), 611-1381 (ORF2), 1384-3222 (ORF3), 3225-7013 (ORF4), 7068-7697 (ORF5), 및 7711-8385 (ORF6) 에 해당하는 위치에 존재하는, 단백질을 코딩할 수 있는 6 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 이 있었다. 플라스미드 pFU1001 에 조입된 약 10 kbp XbaI-XbaI DNA 절편의 제한효소지도 및 그 위의 상기 언급된 ORF 의 위치가 도 2 에 나타나 있다.

또한, 상기 각종 결실 변이체를 이용하여 내열성 DNA 폴리머라제 활성을 검정하였다. 그 결과, 결실이 ORF3 및 ORF4 영역을 포함하는 경우, 결실이 상류에서 또는 하류에서 시작되는 지에 관계없이, DNA 폴리머라제 활성을 잃는다. 이러한 발견은 ORF3 및 ORF4 의 번역산물이 DNA 폴리머라제 활성의 발현에 중요함을 나타낸다. ORF3 의 염기서열은 서열목록중 서열번호: 2 에, 상기 염기서열로부터 추정되는 ORF3 번역산물의 아미노산 서열은 서열목록중 서열번호: l 에 각각 나타나 있다. 또한, ORF4 의 염기서열은 서열목록중 서열번호: 4 에, 상기 염기서열로부터 추정되는 ORF4 번역산물의 아미노산 서열은 서열목록중 서열번호: 3 에 각각 나타나 있다.

실시예 3

정제된 DNA 폴리머라제 표준 제조물의 제조

실시예 1 에서 수득된 대장균 JM109/pFU1OO1 을 100 ㎍/ml 농도의 앰피실린을 함유하는 500 ml 의 LB 배지 (10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모추출물, 5 g/ℓ NaCl, pH 7.2)에서 배양하였다. 배양액의 탁도가 A₆₀₀에서 0.6 에 이르렀을 때, 유도물질인 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG) 를 첨가하고, 16 시간동안 배양하였다. 이를 수집한 후, 수집된 세포를 37 ml 의 초음파분쇄 완충액 [50 mM Tris-HC1, pH 8.0, 0.2 mM 2-머캡토에탄올, 10% 글리세롤, 2.4 mM PMSF (페닐메탄술포닐 플루오리드)] 에 현탁시키고, 초음파분쇄기로 분쇄하였다. 12,000 rpm 에서 10 분간 원심분리에 의해 상청액으로 42 ml 의 조추출액을 회수한 후, 80℃ 에서 15 분간 열처리하였다. 12,000 rpm 에서 10 분간 다시 원심분리하여 33 ml 의 열처리된 효소 용액을 수득하였다. 이후, 상기 용액을 800 ml 완충액 A [50 mM 인산칼륨, pH 6.5, 2 mM 2-머캡토에탄올, 10% 글리세롤] 을 외부 투석액으로 하여 2 시간동안 4 회에 걸쳐 투석하였다. 투석후, 32 ml 의 효소용액을 미리 완충액 A 로 평형화시킨 RESOURCE Q 칼럼 (파마시아사 제조) 에 적용시켜, FPLC 시스템 (파마시아사 제조) 을 이용한 크로마토그래피를 실시하였다. 크로마토그램의 전개는 0 내지 500 mM NaCl 의 직선농도구배상에서 수행되었다. DNA 폴리머라제 활성을 갖는 분획은 340 mM NaCl 에서 용출되었다.

활성이 있는 분획을 모아 수득된 10 ml 의 효소용액을 탈염시키고, 한외여과(ultrafiltration)에 의해 농축시키고, 완충액 A + 150 mM NaCl 에 용해시켜 3.5 ml 의 효소용액을 수득하였다. 이후, 생성된 효소용액을 동일한 완충액으로 미리 평형화시킨 Hi Trap 헤파린 칼럼 (파마시아사 제조) 에 적용시켰다. FPLC 시스템을 이용하여 150 내지 650 mM NaCl 의 직선농도구배상에서 크로마토그램을 전개하여, 400 mM NaCl 에서 용출되는 활성분획을 수득하였다. 반복적인 탈염화 및 한외여과를 이용한 농축화에 의해 상기 분획 5 ml 을 50 mM 인산칼륨, pH 6.5, 2 mM 2-머캡토에탄올, 및 75 mM NaCl 을 함유하는 120 ㎕ 의 용액으로 농축시켰다. 이후, 생성된 농축액을 동일한 완충액으로 미리 평형화시킨 슈퍼로스 6 (파마시아사 제조) 겔 여과 칼럼에 적용시키고, 동일한 완충액을 이용하여 용출하였다. 그 결과, DNA 폴리머라제 활성을 갖는 분획이 보유시간 (retention time) 34.7 분 및 38.3 분에 해당하는 위치에서 용출되었다. 동일한 조건하에서 분자량 마커의 용출위치를 비교한 결과, 상기 활성 피크는 각각 분자량 약 385 kDa 및 약 220 kDa 을 갖는 것으로 예상되었다. 상기 분자량은 각각 몰비 1:2 의 ORF3 번역산물 및 ORF4 번역산물에 의해, 다른 하나는 몰비 1:1 의 상기 번역산물들에 의해 형성된 복합체에 해당하였다. 그러나, 전자의 피크에 대해서는, 복합체가 몰비 2:2 로 상기 2 개의 번역산물들에 의해 형성될 가능성을 무시할 수 없기 때문에, 분자량이 증가할수록 분자량 측정오차가 증가한다.

실시예 4

(1) DNA 폴리머라제의 생화학적 성질

먼저, 실시예 3 에서 수득된 ORF3 및 ORF4 의 번역산물, 즉 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 1:1 비율의 복합체를 형성하는 DNA 폴리머라제 제조물에 대한 최적 MgCl₂및 KCl 농도를 구하였다. 20 mM Tris-HC1, pH 7.7, 2 mM 2-머캡토에탄올, 0.2 mg/ml 활성화 DNA, 및 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 40 μM 를 함유하는 반응 시스템내에서 2 mM MgCl₂의 존재하에 KCl 농도를 0 내지 200 mM KCl 로 20 mM 씩 단계적으로 증가시키면서 DNA 폴리머라제 활성을 검정하였다. 그 결과, 최대 활성은 KCl 농도 60 mM 에서 나타났다. 다음으로, 이번에는 60 mM KCl 의 존재하에, 각각의 농도에서 비교하기 위해 MgCl₂농도를 0.5 내지 25 mM MgCl₂로 2.5 mM 씩 단계적으로 증가시키는 것을 제외하고는 동일한 반응 시스템내에서 DNA 폴리머라제 활성을 검정하였다. 이 경우, 최대 활성은 MgCl₂농도 10 mM 에서 나타났으며, 선택적으로, KCl 이 없는 경우, 최대 활성은 MgCl₂농도 17.5 mM 에서 나타났다.

이후, 최적 pH를 검정하였다. 다양한 pH 수준의 인산칼륨 완충액을 사용하고, 20 mM 인산칼륨, 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-머캡토에탄올, 0.2 mg/ml 활성화 DNA, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 40 μM 씩, 및 60 nM [³H]-dTTP 를 함유하는 반응혼합물을 제조하여 75℃ 에서 DNA 폴리머라제 활성을 검정하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다 (횡축은 pH 를 나타내고, 종축은 고분자 DNA 에 포함되어 있는 방사능활성을 나타낸다). 도면에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 pH 6.5내지 7.0 에서 최대 활성을 나타낸다. 인산칼륨 대신에 Tris-HCl을 사용하는 경우, 알칼리성과 함께 활성이 증가하였으며, 최대 활성은 검정에서 사용된 가장 높은 pH 수준인 pH 8.02 에서 나타났다.

본 발명 DNA 폴리머라제의 열안정성을 하기와 같이 검정하였다: 정제된 DNA 폴리머라제를 제조하여, 20 mM Tris-HCl (pH 7.7), 2 mM 2-머캡토에탄올, 10% 글리세롤, 및 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 혼합물을 수득하고, 생성된 혼합물을 다양한 온도에서 30 분간 항온배양하였다. 잔류 DNA 폴리머라제 활성을 검정하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다 (횡축은 항온배양온도를 나타내고, 종축은 잔류 활성을 나타낸다). 도면에 나타낸 바와 같이, 본 효소는 열처리 80℃ 에서 30 분간 열처리한 후에도 80% 이상의 잔류 활성을 유지하였다.

저해제에 의한 저해양식을 비교하기 위하여, α형 DNA 폴리머라제의 특이적 저해제인 아피디콜린을 사용하여 본 발명의 DNA 폴리머라제 및 공지된 DNA 폴리머라제인 파이로코커스 푸리오수스에서 유래된 α형 DNA 폴리머라제 (Pfu DNA 폴리머라제, 스트라타진사 제조) 의 저해양식을 비교하였다. 20 mM Tris-HC1, pH 7.7, 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-머캡토에탄올, 0.2 mg/ml 활성화 DNA, 및 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 40 μM 씩의 존재하에 아피디콜린 농도를 0 에서 2.0 mM 로 증가시키면서 활성변화를 조사하였다. 그 결과, Pfu DNA 폴리머라제의 활성은 1.0 mM 에서 최초 활성의 20% 로 감소한 반면, 본 발명의 신규 DNA 폴리머라제는 2.0 mM 에서도 전혀 저해되지 않았다.

(2) 프라이머 신장반응

다음으로, 본 발명의 DNA 폴리머라제의 상이한 형태의 기질 DNA 에 대한 선별성을 비교하기 위하여, 하기 주형-프라이머를 조사하였다. 통상적인 활성검정용으로 사용되는 활성화 DNA 외에, 기질로 제조된 것들로는 활성화 DNA 를 85℃ 에서 5 분간 처리하여 제조된 열변성 DNA; 프라이머로서 서열목록중 서열번호: 6 에 나타낸 서열인 45-염기의 합성 데옥시리보올리고뉴클레오티드를 M13 파아지 1본쇄 DNA (Ml3mpl8 ssDNA, 다까라슈조사 제조) 에 아닐링시켜 제조된 M13-HT 프라이머; 프라이머로서 서열목록중 서열번호: 7 에 나타낸 서열인 17-염기의 합성 리보올리고뉴클레오티드를 M13 파아지 1본쇄 DNA 에 아닐링시켜 제조된 M13-RNA 프라이머; 폴리데옥시아데노신 (폴리 dA, 파마시아사 제조) 및 올리고데옥시티미딘 (올리고 dT, 파마시아사 제조) 를 20:1 몰비로 혼합하여 제조된 폴리 dA-올리고 dT; 및 폴리아데노신 (폴리 A, 파마시아사 제조) 및 올리고데옥시티미딘을 20:1 몰비로 혼합하여 제조된 폴리 A-올리고 dT 가 있다.

활성화 DNA 대신에 상기 기질들을 사용하여 DNA 폴리머라제 활성을 검정하였다. 활성화 DNA 를 기질로 사용한 경우 수득되는 활성을 100 으로 정의한 경우 각 기질의 상대적인 활성이 표 1 에 나타나 있다. 비교를 위하여, Pfu DNA 폴리머라제 및 더무스 아쿠아티쿠스에서 유래된 Taq DNA 폴리머라제 (TaKaRa Taq, 다까라슈조사 제조) 또한 동일한 방식으로 조사하였다. 표 1 에 나타내 바와 같이, 다른 DNA 폴리머라제와 비교하여, 본 발명의 신규 DNA 폴리머라제는, 사용된 기질이 활성화 DNA 가 아니고 M13-HT 프라이머일 경우, 보다 높은 활성을 나타내었으며, 이는 본 발명의 신규 DNA 폴리머라제가 프라이머 신장반응에 특히 적합하다는 것을 나타낸다.

프라이머 신장 활성을 더 집중적으로 연구하였다. 미리 [γ-³²P]-ATP (애머샴사 제조) 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (다까라슈조사 제조) 을 이용하여 5'-말단이 표지된 M13-HT 프라이머를 기질로 사용하였다. 최종농도 0.05 ㎍/㎕ 의 상기 기질 및 활성화 DNA 를 기질로 사용하여 검정하였을 경우 0.05 유니트의 활성을 제공하는 양의 다양한 DNA 폴리머라제를 함유하는 10 ㎕ 의 반응혼합물 [20 mM Tris-HCl (pH 7.7), 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-머캡토에탄올, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 270 μM 씩] 을 75℃ 에서 1, 2, 3 또는 4 분간 반응시켰다. 반응종료후, 2 ㎕ 의 반응정지액 (95% 포름알데히드, 20 mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루우, 0.05% 자일렌시아놀) 을 첨가하고, 95℃ 에서 3 분간 열변성처리하였다. 그 후, 2 ㎕ 의 반응혼합물을 8 M 우레아를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동시키고, 이어서 오토라디오그램을 제작하였다. 또한, 경합 기질로서 활성화 DNA 의 존재하에 신장 활성을 조사하기 위하여, 상기 반응혼합물에 최종농도 0.4 ㎍/ml 의 활성화 DNA 를 첨가하고, 및 상기 기재된 바와 동일한 방법에 의해 오토라디오그램을 제작하였다. 수득된 오토라디오그램은 도 6 에 나타나 있다.

상기 도면에서, Pol, Pfu, 및 Taq 은 각각 본 발명의 DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제 및 Taq DNA 폴리머라제의 결과를 나타낸다. 또한, 1, 2, 3 및 4 각각은 반응시간 (분) 을 나타낸다. 상기 도면에서, 표시 "-" 및 "+" 는 각각 활성화 DNA 의 부재 또는 존재하에 수득된 결과를 나타낸다. 도면 좌측말단의 레인 G, A, T, 및 C 또한 의해 상기와 동일한 기질을 사용하는 디데옥시 방법에 의한 사슬정지반응에 의해 수득된 반응생성물의 전기영동 결과를 나타내며, 이는 각 신장생성물의 길이를 추정하기 위하여 사용된다. 상기 도면에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 Pfu DNA 폴리머라제 및 Taq DNA 폴리머라제의 프라이머 신장 활성보다 우수한 프라이머 신장 활성을 나타내었다. 또한, 활성화 DNA 부재하에 비교적 높은 프라이머 신장 활성을 나타내는 Taq DNA 폴리머라제가 과량의 활성화 DNA 첨가에 의해 현저하게 저해되는 것과 대조적으로, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 활성화 DNA 에 의해 저해되는 것 같지 않는 것을 나타내고 있다. 상기 발견으로부터, 본 발명의 DNA 폴리머라제가 단일 프라이머를 1본쇄 주형 DNA 에 아닐링시킨 형태의 프라이머 신장형 기질에 특히 높은 친화성을 나타내는 것이 확인되었다.

(3) 보유 엑소뉴클레아제 활성의 유무

본 발명 DNA 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성을 하기에 따라 검정하였다: 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성 검정용 기질로서, 5'-말단이³²P 로 표지된 DNA 절편을 pUC119 벡터 (다까라슈조사 제조) 를 SspI (다까라슈조사 제조) 으로 절단하고, 생성된 386 bp DNA 절편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 상기 절편을 정제하고, [γ-³²P]-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나제로 표지하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조하였다. 또한, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성 검정용 기질로서, 3'-말단이³²P 로 표지된 DNA 절편을 pUC119 벡터를 Sau3AI 으로 절단하고, 생성된 341 bp DNA 절편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 상기 절편을 정제하고, [γ-³²P]-CTP (애머샴사 제조) 및 클레나우 절편 (다까라슈조사 제조) 을 이용한 필-인(fill-in) 반응을 수행하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조하였다. 표지된 DNA 를 NlCK 칼럼 (파마시아사 제조) 을 이용한 겔 여과에 의해 정제하여 이후의 반응에 사용하였다. 상기 표지된 DNA 1 ng 을 함유하는 반응액 [20 mM Tris-HCl (pH 7.7), 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-머캡토에탄올] 에 0.015 유니트의 DNA 폴리머라제를 첨가하고, 생성된 혼합물을 75℃ 에서 2.5, 5 및 7.5 분간 반응시켰다. 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 액체 신틸레이션 카운터를 사용하여 상청액에서 나타나는 방사능활성을 측정하여 엑소뉴클레아제 활성에 의해 분해된 양을 계산하였다. 본 발명의 DNA 폴리머라제는 강력한 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 반면, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성은 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 또한, 강력한 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 것으로 알려져 있는 Pfu DNA 폴리머라제의 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 상기와 동일한 방식으로 검정하였다. 결과는 함께 도 5 에 나타나 있다.

상기 도면에서, 횡축은 반응시간을 나타내고, 종축은 전체 반응혼합물에 포함되어 있는 방사능활성에 대한 상청액으로 유리된 방사능활성의 비율을 나타낸다. 또한, 중백환 (open circle) 은 본 발명의 DNA 폴리머라제에 대한 결과를 나타내고, 흑환 (solid circle) 은 Pfu DNA 폴리머라제에 대한 결과를 나타낸다. 상기도면에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 DNA 폴리머라제는 높은 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성에 기인하여 높은 충실도를 갖는 것으로 알려져 있는 Pfu DNA 폴리머라제의 활성과 동일한 수준의 강력한 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타냈다.

(4) DNA 합성반응의 정확성 비교

부분적으로 1본쇄화된 (갭형성 이본쇄 플라스미드: gapped duplex plasmid) pUC118 벡터 (다까라슈조사 제조) 를 주형으로 사용하여 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성반응의 정확성을 조사하였다. 문헌 [Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd ed., 4.44-4.48, Cold Spring Harbor Laboratory 출판, 1989, T. Maniatis 등 편저s] 에 기재된 방법에 의해, 숙주로서 대장균 MV1184 (다까라슈조사 제조) 를 사용하고 헬퍼 파아지 M13KO7 (다까라슈조사 제조) 를 이용하여, 1본쇄 pUC118 벡터를 제조하였다. pUC118 벡터를 PvuII (다까라슈조사 제조) 로 절단하고, 절단된 벡터로 아가로스 겔 전기영동을 실시하고, 약 2.8 kbp 의 DNA 절편을 회수하여 2본쇄 DNA 를 제조하였다.

상기 1본쇄 DNA 1 ㎍ 및 2본쇄 DNA 2 pg 을 혼합하여 멸균증류수로 180 ㎕ 의 혼합물을 만든 후, 상기 용액을 70℃ 에서 10 분간 항온배양하였다. 이후, 생성된 혼합물에 20 x SSC 20 ㎕ 를 첨가하고, 상기 혼합물을 60℃ 에서 10 분간 더 방치하였다. 에탄올 침전법을 실시하여 DNA 를 회수하였다. 그의 일부로 아가로스 겔 전기영동을 실시하여, 갭형성 이본쇄 플라스미드가 수득된 것을 확인하였다. 생성된 갭형성 이본쇄 플라스미드의 1/10 양을 함유하는 30 ㎕ 의 반응혼합물 [10mM Tris-HC1, pH 8.5, 50 mM KC1, 10 mM MgCl₂, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 1 mM 씩] 을 70℃ 에서 3 분간 항온배양한 후, 거기에 0.5 유니트의 DNA 폴리머라제를 첨가하고, 70℃ 에서 10 분간 DNA 합성반응을 실시하였다. 반응종료후, 10 ㎕ 의 반응혼합물을 사용하여 대장균 DH5α (BRL사 제조) 를 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체를 37℃ 에서 18 시간동안 100 ㎍/ml 앰피실린, 0.1 mM IPTG, 및 40 ㎍/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드를 함유하는 LB 플레이트상에서 배양하였다. 플레이트상에 형성된 백색 또는 청색 콜로니의 수를 세고, DNA 합성 오류의 결과로 만들어진 백색 콜로니의 형성비율을 계산하였다. 그 결과, 백색 콜로니 형성율(%)은 DNA 폴리머라제로 Taq DNA 폴리머라제가 사용된 경우 3.18% 였고, 대조적으로 본 발명의 DNA 폴리머라제가 사용된 경우 보다 낮은 1.61% 의 형성율이었다.

(5) PCR 에의 이용

PCR 에서 본 발명의 DNA 폴리머라제의 성능을 Taq DNA 폴리머라제와 비교하기 위하여, λ-DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하였다. 본 발명 DNA 폴리머라제의 반응혼합물은 하기 조성을 갖는다: 10 mM Tris-HCl (pH 9.2), 3.5 mM MgCl₂, 75 mM KC1, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 400 μM 씩, 0.01% 소 혈청 알부민 (BSA), 및 0.1% 트라이톤 X-100. Taq DNA 폴리머라제용 반응액은 하기 조성을 갖는다: 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KC1, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 400 μM 씩. λ-DNA (다까라슈조사 제조) 5.0 ng/50 ㎕ , 프라이머 λ1및 프라이머 λ11 각각 10 pmol/50 ㎕ 씩, 및 3.7 유니트/50 ㎕ DNA 폴리머라제를 함유하는 50 ㎕ 의 반응혼합물을 제조하였다. 프라이머 λ1 및 프라이머 λ11 의 염기서열은 각각 서열목록중 서열번호: 8 및 서열번호: 9 에 나타나 있다. 그후, 상기 반응혼합물로 30-주기 PCR 을 수행하였으며, 여기서 1 주기는 98℃ 에서 10 초간 및 68℃ 에서 10 초간으로 정의된다. 5 ㎕ 의 반응혼합물로 아가로스 겔 전기영동을 실시하고, 에티듐 브로마이드로 염색하여 증폭된 DNA 절편을 확인하였다. 그 결과, Taq DNA 폴리머라제를 사용한 경우 DNA 절편의 증폭이 나타나지 않는 것으로 밝혀진 반면, 본 발명의 DNA 폴리머라제를 사용한 경우 약 20 kbp 의 DNA 절편 증폭이 확인되었다.

그후, 프라이머를 프라이머 λ1 및 프라이머 λ10 으로 바꾸어 실험을 수행하였다. 프라이머 λ10 의 염기서열은 서열목록중 서열번호:10 에 나타나 있다. 상기 나타낸 것과 유사한 조성을 갖고 λ-DNA 2.5 ng, 프라이머 λ1 및 프라이머 λ10 각각 10 pmol, 및 DNA 폴리머라제 3.7 유니트를 함유하는 20 ㎕ 의 반응혼합물을 제조하였다. 상기 반응혼합물을 상기 기재된 바와 동일한 반응조건하에 5 주기 반응시키고, 5 ㎕ 의 반응혼합물로 아가로스 겔 전기영동을 실시하고, 에티듐 브로마이드로 염색하였다. Taq DNA 폴리머라제를 사용한 경우 아무런 특이적 증폭이 관찰되지 않는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 DNA 폴리머라제를 사용한 경우 약 15 kbp 의 DNA 절편이 증폭되었다.

실시예 5

(1) ORF3 번역산물 단독 발현용 플라스미드의 구축

실시예 2 에 기재된 플라스미드 pFU1OO2 (ORF1 내지 ORF6 가 상기 벡터의lac프로모터의 하류에 위치) 의 DNA 삽입체로부터 ORF3 바로 하류부분을 결실시킴으로써 제조된 변이체 플라스미드 6-82 를 주형으로 사용하고, 또한 서열목록중 서열번호:11 에 그의 염기서열이 나타나 있는 프라이머 M4 (다까라 슈조사 제조) 및 프라이머 N03 를 사용하여 PCR 을 수행하였다. PCR 용으로 사용된 DNA 폴리머라제는 합성반응의 정확성이 높은 Pfu DNA 폴리머라제 (스트라타진사 제조) 였다. 주형 DNA 1 ng, 각 프라이머 25 pmol, 및 Pfu DNA 폴리머라제 2.5 유니트를 함유하는 100 ㎕ 의 PCR 용 반응혼합물 [20 mM Tris-HC1, pH 8.2, 10 mM KC1, 20 mM MgCl₂, 6 mM (NH₄)₂SO₄, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 0.2 mM 씩, 1% 트라이톤 X-100, 0.01% BSA] 로 25-주기 반응을 수행하였으며, 여기에서 1 주기는 94℃ 에서 0.5 분간, 55℃ 에서 0.5 분간, 및 72℃ 에서 2 분간으로 정의된다. 약 2 kbp 의 증폭된 DNA 절편을 NcoI 및 SphI (각각 다까라슈조사 제조) 으로 절단하고, pTV118N 벡터 (다까라슈조사 제조) 의 NcoI-SphI 부위에 삽입시켜 플라스미드 pFU-ORF3 를 제조하였다. 상기 플라스미드중 DNA 삽입체는 ORF3 만을 번역가능 상태로 함유한다.

(2) ORF4 번역산물 단독 발현용 플라스미드의 구축

상기 기재된 플라스미드 pFU1OO2 의 DNA 삽입체로부터 ORF4 중앙부의 하류부분을 결실시킴으로써 제조된 변이체 플라스미드 6-2 를 주형으로 사용하고, 또한 서열목록중 서열번호:12 에 그의 염기서열이 나타나 있는 프라이머 M4 및 프라이머 N04 를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 주형 DNA 를 플라스미드 6-2 로 대치하고,프라이머 N03 을 프라이머 N04 로 대치하는 것을 제외하고는 상기 기재된 실시예 5-(l) 의 조건과 동일한 조건하에 반응을 수행하였다. 상기 증폭된 DNA 절편을 NcoI 및 NheI (다까라슈조사 제조) 로 절단하여 수득된 약 1.6 의 DNA 절편을, ORF4 의 후반부분을 함유하고, 상기 플라스미드 pFU1OO2 로부터 분리된 약 3.3 kbp 의 NheI-Sal 절편과 함께, pET15b 벡터 (노바겐사 제조) 의 NcoI-XhoI 부위에 삽입하여 플라스미드 pFU-ORF4 를 제조하였다. 상기 플라스미드중 DNA 삽입체는 ORF4 만을 번역가능한 상태로 함유한다.

(3) ORF3 및 ORF4 번역산물을 이용한 DNA 폴리머라제의 재구성

상기-기재된 플라스미드 pFU-ORF3 로 형질전환된 대장균 JM109 인 대장균 JM109/pFU-ORF3 및 상기-기재된 플라스미드 pFU-ORF4 로 형질전환된 대장균 HMS174 인 대장균 HMS174/pFU-ORF4를 따로 배양한 후, 세포내에 발현된 2 ORF 의 번역산물을 정제하였다. 형질전환체의 배양 및 조추출액의 제조는 실시예 3 에 기재된 방법에 의해 수행되었다. 두 번역산물의 정제는 RESOURCE Q, HiTrap 헤파린, 및 슈퍼로스 6 와 같은 칼럼들을 사용하여 SDS-PAGE 상에서 번역산물의 거동을 모니터하면서 수행되었다. 비록 상기 정제된 ORF 번역산물 어느 쪽도 단독으로 검정할 경우 DNA 폴리머라제 활성을 나타내지 않는다 할지라도, 이들을 함께 혼합할 경우 내열성 DNA 폴리머라제 활성이 나타나는 것을 확인하였다.

본 발명은 높은 프라이머 신장능 및 높은 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성 모두를 갖는 신규 DNA 폴리머라제를 제공할 수 있다. 본 효소는 PCR 법에 이용하기 적합하며, 유전자공학 연구용 시약에 유용하다. 또한, 본 발명의 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자를 이용한 유전자공학에 의해 상기 효소를 제조할 수도 있다.

서열 목록

서열번호: 1

서열의 길이: 613

서열의 타입: 아미노산

쇄의 수: 단일

토폴로지: 선형

분자의 타입: 펩티드

서열의 기재방법:

[서열 1a]

[서열 1b]

[서열 1c]

서열번호: 2

서열의 길이: 1839

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 2본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 게놈 DNA

서열의 기재방법:

[서열 2]

서열번호: 3

서열의 길이: 1263

서열의 타입: 아미노산

쇄의 수: 단일

토폴로지: 선형

분자의 타입: 펩티드

서열의 기재방법:

[서열 3a]

[서열 3b]

[서열 3c]

[서열 3d]

[서열 3e]

서열번호: 4

서열의 길이: 3789

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 2본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 게놈 DNA

서열의 기재방법:

[서열 4a]

[서열 4b]

[서열 4c]

서열번호: 5

서열의 길이: 8450

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 2본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 게놈 DNA

서열의 기재방법:

[서열 5a]

[서열 5b]

[서열 5c]

[서열 5d]

[서열 5e]

서열번호: 6

서열의 길이: 45

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 기타 핵산 (합성 DNA)

서열의 기재방법:

[서열 6]

서열번호: 7

서열의 길이: 17

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 기타 핵산 (합성 RNA)

서열의 기재방법:

[서열 7]

서열번호: 8

서열의 길이: 23

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 기타 핵산 (합성 DNA)

서열의 기재방법:

[서열 8]

서열번호: 9

서열의 길이: 22

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 기타 핵산 (합성 DNA)

서열의 기재방법:

[서열 9]

서열번호: 10

서열의 길이: 22

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 기타 핵산 (합성 DNA)

서열의 기재방법:

[서열 10]

서열번호: 11

서열의 길이: 32

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 기타 핵산 (합성 DNA)

서열의 기재방법:

[서열 11]

서열번호: 12

서열의 길이: 32

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 기타 핵산 (합성 DNA)

서열의 기재방법:

[서열 12]

Claims (11)

1. 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질 및 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질의 공존하에 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라제로서, 상기 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질이 서열목록중 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 상기 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질이 서열목록중 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 DNA 폴리머라제.
2. 제 1 항에 있어서, 하기 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라제:

   1) 1본쇄 주형 DNA 에 프라이머를 어닐링시켜 생성된 복합체를 기질로 사용하여 측정할 경우, 활성화 DNA 를 기질로 사용한 경우와 비교하여, 보다 높은 폴리머라제 활성을 나타내고;

   2) 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고;

   3) 하기 조건에서 λ-DNA 를 주형으로 사용하여 폴리머라제 사슬반응 (PCR) 이 수행되는 경우, 약 20 kbp 의 DNA 절편을 증폭시킬 수 있다:

   PCR 조건:

   (a) 반응혼합물의 조성: 10 mM Tris-HCl (pH 9.2), 3.5 mM MgCl2, 75 mM KCl, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 400 μM 씩, 0.01% 소 혈청 알부민, 0.1% 트라이톤 X-100, 5.0 ng/50 ㎕ 의 λ-DNA, 10 pmole/50 ㎕ 의 프라이머 λ1 (서열목록중 서열번호: 8) 및 프라이머 λ11 (서열목록중 서열번호: 9), 및 3.7 유니트/50㎕ 의 DNA 폴리머라제 함유;

   (b) 반응조건: 30-주기의 PCR 수행 (1 주기는 98℃ 에서 10 초간 및 68℃ 에서 10 분간으로 정의됨).
3. 제 1 항에 있어서, 겔 여과법에 의해 측정된 분자량이 약 220 kDa 또는 약 385 kDa 인 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라제.
4. 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 청구항 1 의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질.
5. 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 청구항 1 의 DNA 폴리머라제를 구성하는 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질.
6. 서열목록중 서열번호: l 에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 청구항 4 의 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA.
7. 서열목록중 서열번호: 2 에 나타낸 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 청구항 4 의 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA.
8. 서열번호: 3 에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 청구항 5 의 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA.
9. 서열목록중 서열번호: 4 에 나타낸 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 청구항 5 의 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA.
10. 청구항 6 또는 7 의 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자 및 청구항 8 또는 9 의 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자 모두를 함유하는 형질전환체를 배양하고, 상기 배양물로부터 DNA 폴리머라제를 채취하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라제의 제조방법.
11. 청구항 6 또는 7 의 제 1 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 형질전환체 및 청구항 8 또는 9 의 제 2 DNA 폴리머라제-구성 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 형질전환체를 따로 배양하고; 상기 배양물들중 포함되어 있는 DNA 폴리머라제-구성 단백질들을 혼합하고; 상기 DNA 폴리머라제를 채취하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라제의 제조방법.