CN103074328A

CN103074328A - 一种基于简易大规模pcr高效制备线性dna的方法

Info

Publication number: CN103074328A
Application number: CN2012105192761A
Authority: CN
Inventors: 余晓岚; 马立新; 卞璐; 廖峰; 金梅林; 王飞; 赵慧; 陈全娇
Original assignee: BEIJING VICAREN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Hubei University
Current assignee: BEIJING VICAREN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Hubei University
Priority date: 2012-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2013-05-01

Abstract

本发明提出了一种大规模PCR快速制备线性DNA的方法，它是在中国专利（ZL201010229160.5）低成本获得高特性DNA聚合酶RKOD的基础上，利用优化的PCR程序建立了高于常规PCR体积50-1200倍的大规模PCR方法，利用本发明获得PCR产物的浓度可达300μg/mL。在该发明中，PCR体系中的dNTPs、引物和PCRbuffer参照常规PCR浓度加样，质粒模板的浓度为1μg/mL，DNA聚合酶的用量为10U/mL，大规模PCR步骤为：(1)将反应体系置于98℃水浴0.5min；(2)72℃水浴1min；(3)将步骤(1)(2)进行40个循环，回收PCR产物。利用本发明能够实现线性DNA低成本、高速率、大规模的生产，可为进一步低成本、高效快速制备线性DNA疫苗应对新发传染病奠定基础。

Description

一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种大规模PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）低成本、高速率制备线性DNA的方法，属于工业微生物应用领域。

背景技术

PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）是Kary B.Mullis（Nobel Laureate for procedure to replicate DNA，science，1985）首次发明的体外扩增线性DNA的技术，是现代分子生物学最重要的基本研究手段之一。

PCR模拟于DNA的自然复制过程，它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应，引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基配对的原则从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性、退火、延伸等一次循环，DNA链的数量增加一倍，模板在以后进行的循环，新合成的DNA可再次成为模板。如此循环一次，DNA拷贝数便增加一倍。经多次循环，可以将目的DNA的量扩增10⁶-10⁷倍。PCR技术因其具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高等特点而广泛应用于分子生物学、免疫学、医学等领域。最近的研究表明，PCR方法不仅是一种分子生物学的研究手段，而且在生产实际中的应用越来越广泛，如利用PCR方法获得线性DNA疫苗的研究方法随着部分DNA疫苗的上市越来越受到研究者的亲睐。

随着研究的深入，PCR技术日趋完善，但若将传统的PCR方法应用于生产实际仍存在着极大的局限性，如生产成本高和生产规模小等问题，具体可归纳为：(1) 一般情况下，常规PCR扩增都是基于造价昂贵PCR仪和售价高的DNA聚合酶，因此，若通过常规PCR模式在短时间内获得大量的PCR产物，成本极高；（2）目前的常规PCR仪有以下几种规格：a、0.2mL×25孔，b、0.2mL×96孔，c、0.2mL×384孔，d、0.5 mL×20孔，e、0.5mL×60孔。其中单次PCR产量最大的仪器是0.2mL×384孔，在不计损耗的情况下进行一次PCR最多只可得到76.8mL产物。因此，若需要获得大量的PCR产物，需要将样品分装，逐个收集并纯化，操作繁琐且容易污染；（3）若制备大量线性DNA，需要进行反复多次PCR操作才能获得，周期长、效率低。

目前，鉴于DNA疫苗的相继上市以及线性DNA疫苗受到研究者亲睐的原因，世界科研机构和疫苗生产公司也相继把目光集中在线性DNA的生产方法上。但是，他们仍然主要采用传统的PCR方式生产线性DNA，如Vandalia公司研发出的一种大体系PCR平台可以达到每天12L的产量，但由于生产成本高和生产速率慢等原因仍然无法实现工业化生产的需要。

为此，本发明在低成本获得性能优异的DNA聚合酶（专利名称：一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，专利号：ZL201010229160.5)的基础上，建立了一种大规模PCR低成本、高效生产线性DNA的方法，为解决线性DNA疫苗工业生产的瓶颈问题奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为了改进上述常规PCR仪器设备和DNA聚合酶费用高、获得线性DNA产量少、效率低等缺点，提供了一种大规模PCR技术高效、低成本大量制备线性DNA的方法，拟为进一步利用该方法高效快速制备线性DNA疫苗应对新发传染病奠定基础。

本发明中大规模简易PCR制备大量的线性DNA的具体方法，包括以下步骤：

1）制备种子DNA聚合酶，简称RKOD

用专利（ZL201010229160.5)制备菌株，接种于50mLBMGY培养基中，以150-250r/min 的转速在25℃-30℃培养40-50小时，至OD₆₀₀为6-10，于室温3000-6000r/min离心5min，收集菌体。将菌体转移至25mLBMMY培养基中，以150-250r/min 的转速在25℃-30℃培养，每隔24小时补加一次甲醇（每次加培养基体积的0.5%），72小时收集上清，即为下步所需的DNA聚合酶；该聚合酶具有5’→3’和3’→5’核酸外切酶活性，其错配率为1.1×10^-6，具有每分钟延伸3kbp、耐高温特性；

所述的LBMMY培养基配方：2%Tryptone，1%Yeast Extract，0.34%YNB，1%（NH₄）₂SO₄，100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0，1%甘油；

2）设计正反引物

根据待扩增目的靶基因序列（实例中分别是流感病毒HIN1的HA基因和猪链球菌的sao基因，已构建到pcDNA3.1(+)载体中）利用Genetool分析软件按照碱基互补配对的原则设计获得目的基因两端20-50nt的正反向引物序列，并用化学方法合成；

3）配制反应体系

按照大小不同配制PCR反应体系，反应体系具体成分按下表选择

表1：大规模PCR反应体系具体成分

总体系	50μL	5mL	20mL	60mL	120mL
						10×Buffer	5μL	500μL	2mL	6mL	12mL
dNTPs(2.5mM)	4μL	400μL	1.6mL	4.8mL	9.6mL
						Primer F(10μM)	1μL	100μL	0.4mL	1.2mL	2.4mL
Primer R(10μM)	1μL	100μL	0.4mL	1.2mL	2.4mL
						质粒模板	0.05μg	5μg	20μg	60μg	120μg
H₂O	39μL	3.9mL	15.6mL	46.8mL	93.6mL
						RKOD酶	0.5U	50U	200U	600U	1200U

选择确定具体反应体系后，在聚乙烯封口袋中依次加入H₂O、PCR buffer、dNTPs、正反引物、质粒模板和DNA聚合酶等体系成分，然后用封口器将封口袋制备成一个简易的密闭容器；混匀PCR反应混合物，各成分的最终浓度分别为： dNTPs的浓度为0.2mM、正、反引物的浓度为0.2μM、质粒模板的浓度1μg/mL、包含2mM Mg²⁺的1×反应buffer反应缓冲液、DNA聚合酶10U/mL；反应体系的规模是按5mL、20 mL、60 mL、120 mL依次递增进行的，或者更多；

4）水浴PCR

事先调制好98℃和72℃两个恒温水浴锅，然后将装有PCR反应混合物的密闭聚乙烯封口袋顺次置于a) 98℃水浴0.5min， b ）72℃水浴1min，c) 将步骤 a)和b）依次进行40～45个循环，收集PCR产物；

5）检测PCR产物

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，线性DNA的浓度可达300μg/mL。

本发明的大规模PCR体系与常规PCR体系相同，包括DNA高温聚合酶、质粒模板、dNTPs、正反向寡聚核苷酸引物、包含2mM Mg²⁺的反应缓冲液。

本发明与普通的PCR方式相比具有的优势：

一、本发明的PCR反应体系中所用的DNA聚合酶为利用专利ZL201010229160.5制备的性能优异DNA聚合酶，确保了该方法生产成本低，同时该方法具备生产规模大、生产工艺简单的特点，为进一步大规模PCR方法的建立提供了有力的技术保障。使用普通PCR方法制备的线性DNA聚合酶，产量低、成本高、工艺繁琐。

二、本发明提出的利用聚丙烯材料制备的封口袋作为PCR反应容器，同时只需两台恒温水浴锅，避免了普通PCR所需的仪器费用高、存放空间大、收集困难、容易污染等一系列的问题。

三、本发明中提出的简易的两步循环法PCR（只需98℃和72℃两个步骤进行循环），可直接用于线性DNA现场制备，携带方便。

四、本发明提出的大规模PCR制备线性DNA的方法，便于进行规模化、工业化生产，如该方法可为针对新发传染病快速大规模制备线性DNA疫苗奠定坚实的基础。

附图说明：

图1为5mL体系PCR扩增猪链球菌表面膜蛋白（SAO）编码基因产物的琼脂糖凝胶电泳图。M：λ-EcoT14 I digest DNA Marker，上样体积为2μL；泳道1-5：上样体积依次为2μL，4μL，6μL，8μL，10μL；泳道6：常规PCR产物，上样体积为4μL。

图2为5mL大量扩增HA基因盒式表达单元DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

M：λ-EcoT14 I digest DNA Marker，上样体积为2μL；泳道1-5：上样体积依次为2μL，4μL，6μL，8μL，10μL；泳道6：常规PCR产物，上样体积为4μL。

图3为20mL大量扩增HA基因盒式表达单元DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

M：λ-EcoT14 I digest DNA Marker，上样体积为2μL；泳道1-5：上样体积依次为2μL，4μL，6μL，8μL，10μL；泳道6-7：常规PCR产物，上样体积依次为2μL ，4μL；泳道8为LA Taq酶扩增的PCR产物，上样体积为2μL。

图4为60mL大量扩增HA基因盒式表达单元DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为120mL大量扩增HA基因盒式表达单元DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

实施例1、大量扩增猪链球菌表面膜蛋白编码基因（sao）线性DNA

sao基因序列为：atgcaaccagatggcggtcaagctacttctaaggctgtgaacgtcaaaattccagccgttgttagattatttggcagagaattgttggaaaacgaatttaagttcgaattgagagaagctaacggtgaagaattgccagttttggatactgctcaaaacactaaggaaggtcaggttcgtttcaagaacttgtcttttgataagccaggaaagtactggtacactatttcagaagtgaaggatgaattgggtggtatagaatacgattctaagtacattgttgccaaaattacggtagaggataggaacggtcaattgcaagctatgattgagtttattgacaacgataacgtatttaacaacttttacactccagccccagctgctgcctctttgtctattaagaaggtcttggaaggtagaactttgaacactggtgagtttgaatttgttttaaagaacgagaagggtgatgaaattgaaaaggtctctaaccaagctgatggttctgttaacttttctgccttgactttcacaaaagagggtacctacacttacactgtttctgaagttgacggtggtttgggagatatcatttacgataagtctgatattaaggctactgtcacagtaaaggataacaaccatggacaattggtttctactgttacctacgaaaactcagaccagatttttgaaaacattttgaacccaggtaagttgattgctccaactactgattcagtaatcacggacaacgaagttagtaaggaggctatgtaa

采用本发明中的方法，将该基因线性DNA进行大量扩增，包括以下步骤：

a、利用专利ZL201010229160.5制备菌株，接种于50mLBMGY培养基中，制备耐高温特性的DNA聚合酶RKOD；

b、根据猪链球菌表面膜蛋白编码基因（sao）DNA特异性序列，利用Genetool 分析软件设计合成一对PCR引物, 两条引物的长度分别为28、42个碱基；

正反向寡核苷酸引物分别为：

SAO-F: 5' atgcaaccagatggcggtcaagctactt 3'

SAO-R: 5' ttacatagcctccttactaacttcgttgtccgtgattactga 3'

c、按5mLPCR体系选择PCR中各原料的成分进行加样，反应液装入聚乙烯封口袋中。各成分的终浓度为：0.2mM dNTPs、0.2μM 正反向寡核苷酸引物、1μg/mL质粒模板、1×反应缓冲液（包含2mM Mg²⁺）、RKOD DNA高温聚合酶10U/mL；

d、将装有反应液的聚乙烯封口袋，首先置于98℃水浴0.5min，72℃水浴1min，然后依次循环进行40次；

e、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，线性DNA的浓度可达到300μg/mL（图1）。

实施例2、大体系扩增流感病毒H1N1 HA蛋白编码基因的DNA

HA基因序列为：atgaaggcaaacctactggtcctgttatgtgcacttgcagctgcagatgcagacacaatatgtataggctaccatgcgaacaattcaaccgacactgttgacacagtactagagaagaatgtgacagtgacacactctgttaacctgctcgaagacagccacaacggaaaactatgtagattaaaaggaataaccccactacaattggggaattgtaacatcgccggatggctcttgggaaacccagaatgcgacccactgcttccagtgagatcatggtcctacattgtagaaacaccaaactctgagaatggaatatgttatccaggagatttcatcgactatgaagaactgagggagcaattgagctcagtgtcatcattcgaaagattcgaaatatttcccaaagaaagctcatggcccaaccacaacacaaacaaaggagtaacggcagcatgctcccatgcggggaaaagcagtttttacagaaatttgctatggctgacggagaaggagggctcatacccaaagctgaaaaattcttatgtgaacaagaaagggaaggaagtccttgtactgtggggtattcatcacccgtctaacagtaaggaacaacagaatctctatcagaatgaaaatgcttatgtctctgtagtgacttcaaattataacaggagatttaccccggaaatagcagaaagacccaaagtaagagatcaagctgggaggatgaactattactggaccttgctaaaacccggagacacaataatatttgaggcaaatggaaatctaatagcaccaaggtatgctttcgcactgagtagaggctttgggtccggcatcatcacctcaaacgcatcaatgcatgagtgtaacacgaagtgtcaaacacccctgggagctataaacagcagtctccctttccagaatatacacccagtcacaataggagagtgcccaaaatacgtcaggagtgccaaattgaggatggttacaggactaaggaacattccgtccattcaatccagaggtctatttggagccattgccggttttattgaaggtggatggactggaatgatagatggatggtatggttatcatcatcagaatgaacagggatcaggctatgcagcggatcaaaaaagcacacaaaatgccatttga

b、根据HA基因盒式表达单元DNA特异性序列，利用Genetool 分析软件设计合成一对PCR引物, 两条引物的长度分别为23、22个碱基；

正反向寡核苷酸引物分别为：

HA-F: 5' tgcttcgcgatgtacgggccaga 3'

HA-R: 5' agcccaccgcatccccagcat 3'

c、按5mL、20 mL、60 mL、120 mL分别选择PCR中各原料的成分进行加样，反应液装入聚乙烯封口袋中，每个聚乙烯封口袋体积为5mL、20 mL、60 mL、120 mL。各成分的终浓度分别为：0.2mM dNTPs、0.2μM 正反向寡核苷酸引物、1μg/mL质粒模板、1×反应缓冲液（包含2mM Mg²⁺）、RKOD DNA高温聚合酶10U/mL；；

e、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，线性DNA的浓度可达到300μg/Ml,电泳检测检测结果见图2、3、4、5。

Claims

1.一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法，其特征在于制备步骤为：

1）利用专利ZL201010229160.5制备菌株，接种于50mLBMGY培养基中，制备耐高温特性DNA聚合酶RKOD；

2）根据待扩增目的靶基因序列，利用Genetool 分析软件按照碱基互补配对的原则设计获得目的基因两端20-50nt的正反向引物序列，并用化学方法合成；

3）按下表配制大小不同反应体系

总体系 50μL 5mL 20mL 60mL 120mL 10×Buffer 5μL 500μL 2mL 6mL 12mL dNTPs(2.5mM) 4μL 400μL 1.6mL 4.8mL 9.6mL Primer F(10μM) 1μL 100μL 0.4mL 1.2mL 2.4mL Primer R(10μM) 1μL 100μL 0.4mL 1.2mL 2.4mL 质粒模板 0.05μg 5μg 20μg 60μg 120μg H₂O 39μL 3.9mL 15.6mL 46.8mL 93.6mL RKOD酶 0.5U 50U 200U 600U 1200U

确定反应体系后，在聚乙烯封口袋中依次加入H₂O、PCR buffer、dNTPs、正反引物、质粒模板和DNA聚合酶等体系成分，然后用封口器将封口袋制备成一个简易的密闭容器；混匀PCR反应混合物，各成分的最终浓度分别为：dNTPs的浓度为0.2mM、正、反引物的浓度为0.2μM、质粒模板的浓度1μg/mL、包含2mM Mg²⁺的1×反应buffer、DNA聚合酶10U/mL；

4）先调制好98℃和72℃两个恒温水浴锅，然后将装有PCR反应混合物的密闭聚乙烯封口袋顺次置于a) 98℃水浴0.5min， b）72℃水浴1min，c) 将步骤a)和b）依次进行40～45个循环，收集PCR产物并利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2.按照权利要求1所述一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法，其特征在于制备步骤2）为：待扩增目的靶基因序列是流感病毒HIN1的HA基因，利用Genetool 分析软件设计合成的正、反向寡核苷酸引物分别为：

HA-F: 5' tgcttcgcgatgtacgggccaga 3'

HA-R: 5' agcccaccgcatccccagcat 3' 。

3.按照权利要求1所述一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法，其特征在于制备步骤2）为：待扩增目的靶基因序列是猪链球菌的sao基因，利用Genetool 分析软件设计合成的正、反向寡核苷酸引物分别为：

SAO-F: 5' atgcaaccagatggcggtcaagctactt 3'

SAO-R: 5' ttacatagcctccttactaacttcgttgtccgtgattactga 3' 。

4.按照权利要求1所述一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法，其特征在于步骤4）中的PCR程序是简易的98℃、72℃两个温度循环水浴的PCR程序。