CN102465120B - 一种荧光定量pcr反应液及荧光定量pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液，其特征在于包含PCR反应增强剂，所述PCR反应增强剂选自二甲亚砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵和甜菜碱中的一种或多种，例如二甲亚砜、牛血清白蛋白和甜菜碱。本发明的荧光定量PCR反应液还包含具有5′-3′聚合酶活性和5′-3′外切酶活性的耐热DNA聚合酶，优选为同时具有3′-5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶和热启动耐热DNA聚合酶。本发明还涉及包含所述反应液的试剂盒以及利用所述反应液进行荧光定量PCR的方法。

Description

一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法，特别是用于长核苷酸片段的定量PCR反应液和方法。
背景技术
荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，也称为定量PCR，简称为QPCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
荧光定量PCR根据化学原理的不同可分为探针法和染料法。其中Taqman荧光定量技术以Taqman荧光探针为基础。Taqman荧光探针，也称为水解探针，为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测***就可以接收到荧光信号。具体地，当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；在进行延伸反应时，Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生，随着扩增产物的增加，荧光增强(Heid，C.A.，J.Stevens，K.J.Livak，et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Res，1996，6：986-994.)。
Taqman水解探针由于其特异性较高而广范地应用于荧光定量PCR实验。一般情况下，为了保证理想的扩增效率(90％～110％)，要求荧光定量PCR实验的扩增产物长度不宜超过400bp，更理想的最好能在50-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。而扩增效率低会影响实验的精确性、重复性和灵敏度。正是由于实验对扩增产物大小这种特殊的要求，导致荧光定量PCR实验用于长片段扩增产物的定量受到很大的限制。
举个例子来说，按照illumina公司solexa测序平台提供的《Preparing 2-5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing》(Part#1005363Rev.B)构建Pair End文库，在制备DNA簇(Clusters)前需要对Pair End文库进行浓度测定，然后选择合适的文库上机浓度，期望得到预期的DNA簇密度(Meyer，M.，A.W.Briggs，T.Maricic，et al.From micrograms to picograms：quantitative PCR reduces the materialdemands of high-throughput sequencing[J].Nucleic Acids Res，2008，36：e5；Quail，MA.，I.Kozarewa，F.Smith，et al.A large genomecenter′s improvements to the Illumina sequencing system[J].NatMethods，2008，5(12)：1005-1010.)。Pair End文库的片段长度为300～600bp，部分文库达800bp。有文献与参考资料报道(Smith S.，L.Vigilant，P.A.Morin.The effects of sequence length and oligonucleotidemismatches on 5′exonuclease assay efficiency[J].Nucleic Acids Res，2002，30：e111；Applied Biosystems，Primer Express Software Version3.0Getting Started Guide[EB/OL].2005)在文库定量的荧光定量PCR实验中扩增效率会随着扩增产物长度的增加而降低，为保证较好的扩增效率(90％～110％)，荧光定量PCR实验Taqman水解探针法的扩增产物大小最好保持在50bp～150bp。因此文库的片段长度是影响扩增效率的主要因素。例如，使用某Taqman PCR反应液对一定数量片段长度为300～600bp的Pair End文库进行定量，其扩增效率在85％左右。根据扩增产物遵循理论方程：Y＝X(1+E)n(其中Y＝扩增产物，X＝起始浓度，E＝扩增效率，n＝循环数)，对于同一个样品，假设扩增效率分别为85％与90％，经过20个循环后，Y1＝X1(1+0.85)20，Y2＝X2(1+0.90)20，由于其扩增效率的不同，结果相差1.7倍。
因此，为了使荧光定量PCR能更好地应用于长核苷酸片段的定量，需要解决扩增效率偏低的问题。
发明内容
为了提高荧光定量PCR Taqman水解探针法扩增长核苷酸片段的效率，发明人进行了大量的实验，针对可能的影响因素采取相应的措施对反应液进行了优化，由此完成了本发明。
本发明的一个方面涉及一种荧光定量PCR反应液，其特征在于所述反应液中包含PCR反应增强剂。
所述PCR反应增强剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)、甲酰胺、非离子去污剂、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵和甜菜碱(Betaine)中的一种或多种，例如二甲亚砜、牛血清白蛋白或甜菜碱中的一种或多种，在本发明的一个实施方案中，所述PCR反应增强剂为二甲亚砜、牛血清白蛋白和甜菜碱。
二甲亚砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、非离子去污剂、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵或甜菜碱等在荧光定量PCR中，作为反应增强剂能够促进各种耐热DNA聚合酶对许多复杂结构DNA模板(如高GC含量)的有效扩增，增加PCR反应的灵敏度和特异性。其原理包括通过提高DNA聚合酶的热稳定性，降低模板DNA的二级结构等机制提高目的片段的产量。
其中，1％-10％二甲亚砜能改变引物模板配对反应的熔解温度，从而改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸。5％-20％甘油可提高产量，增加酶的稳定性。0.1μg/μl-1μg/μl牛血清白蛋白能提高PCR反应的效率，同时减少体系中PCR抑制物对反应的影响。1.25％-10％甲酰胺可促进某些“引物-模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。硫酸铵能增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。0.5-2M甜菜碱有助于高GC含量和长DNA片段的PCR反应。可以根据实际需要，选择其中的一种或多种。
在本发明的一个实施方案中，二甲亚砜的浓度为5％，BSA的浓度为0.1μg/μl，甜菜碱的浓度为1M。
所述荧光定量PCR反应液，其特征在于还包含耐热DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5′-3′聚合酶活性和5′-3′外切酶活性。优选为所述DNA聚合酶还同时具有3′-5′外切酶活性，以增加反应的灵敏度和特异性等等，如Ex TaqTM DNA聚合酶，LA TaqTM DNA聚合酶。更优选为所述DNA聚合酶为热启动(hot start)DNA聚合酶。
热启动DNA聚合酶是指在高热状况下才会活化的聚合酶，以避免在未达到设定温度前就开始反应。利用热启动DNA聚合酶可防止在PCR反应第一步因引物错配或引物二聚体的形成而导致的非特异性扩增，从而提高目的DNA片段的扩增效率。
所述热启动DNA聚合酶可以为经过化学分子修饰的聚合酶，高热下结构改变而启动；或者带有针对聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体分离而启动；或者改良自抗体型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下分离而启动。在本发明的一个实施方案中，所述热启动DNA聚合酶为Ex TaqTM热启动DNA聚合酶(Ex TaqTM DNAPolymerase Hot Start Version)。
本发明的另一方面涉及一种荧光定量PCR反应液，其特征在于反应液的成份包含10-67mM pH 8.2-9.0Tris-HCl、25-50mM KCl、1.5-5.0mM Mg2+、0.2-0.4mM dNTP、0.05％-0.1％Tween 20、1％-10％二甲亚砜、0.1μg/μl-1μg/μl牛血清白蛋白、0.5-2M甜菜碱和0.04-0.2U/μl热启动DNA聚合酶。
在本发明的实施方案中，其中所述的Mg2+为2.5-3mM，二甲亚砜为1.2％-5％，牛血清白蛋白为0.1-0.8μg/μl，甜菜碱为1-1.2M，热启动DNA聚合酶为0.05-0.07U/μl。
本发明的还一方面涉及一种荧光定量PCR试剂盒，其包含本发明所述的荧光定量PCR反应液。
本发明的还一方面涉及一种荧光定量PCR方法，其特征在于所述方法包含使用本发明所述的荧光定量PCR反应液的步骤。
发明的有益效果
本发明优化了荧光定量PCR实验的反应液，特别是在反应液中加入PCR反应增强剂，选择热启动DNA聚合酶，解决了长片段定量PCR扩增效率偏低的问题，把扩增效率从85％提高到95％以上。本方法既可以应用于一般的长核苷酸片段的定量，也可以应用于长片段文库的定量。
附图说明
图1荧光定量PCR实验的扩增曲线图
A：用商品化反应体系进行荧光定量PCR实验的扩增曲线
B：优化的反应体系1的荧光定量PCR实验的扩增曲线
C：优化的反应体系2的荧光定量PCR实验的扩增曲线
D：优化的反应体系3的荧光定量PCR实验的扩增曲线
其中横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度。
图2荧光定量PCR实验的标准曲线图
A：用商品化反应体系进行荧光定量PCR实验的标准曲线
B：优化的反应体系1的荧光定量PCR实验的标准曲线
C：优化的反应体系2的荧光定量PCR实验的标准曲线
D：优化的反应体系3的荧光定量PCR实验的标准曲线
其中横坐标为样品起始浓度(单位是pM)，纵坐标为CT值。
图3标准差与CT的关系
其中σ为标准差，X为样品的某浓度，Y为X的1/10。
标准差越小，反映出测量的准确度越高。具体来说，如果定量PCR的扩增效率是100％，那么10倍稀释点(X与Y浓度)之间的平均CT间隔应该恰为3.32个CT值(见图3)。要以99.7％的几率分辨10倍稀释的浓度，标准差就必须小于等于3.32/6＝0.553。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中涉及的各实验材料：
1)模板、探针和引物
模板的制备：从一名男性黄种人的血液中提取基因组DNA，按照《Preparing 2-5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing Part#1005363Rev.B》(Part#1005363Rev.B)构建文库，其中含有不同片段大小的DNA经Agilent 2100Bioanalyzer测定浓度，浓度为18.7nM，脱氧核糖核酸片段大小平均为557bp，其脱氧核糖核酸片段大小范围为391bp-637bp。以此构建好的DNA文库作为标准品，用去离子水将1nM标准品稀释为5个浓度：0.1pM、1pM、10pM、100pM和1000pM，作为反应模板。其中1nM＝10-9mol/L，1pM＝10-12mol/L。
水解探针序列：5’CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3’(SEQID NO：1)，在其5’端带有荧光基团5-FAM(5-羧基荧光素)，3’端带有淬灭基团6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)。
引物1.1：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATC 3’(SEQ IDNO：2)
引物2.1：5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT 3’(SEQ IDNO：3)
2)试剂
其中10×PCR Buffer(Takara公司)含100mM Tris-HCl、500mMKCl和15mM MgCl2，Ex Taq hot start version DNA聚合酶为5U/μL，购自Takara，dNTP购自Takara，MgSO4和BSA购自New EnglandBiolabs，DMSO购自上海生工，Betaine购自Sigma，50×ROX参比染料(6-carboxyl-X-rhodamine)购自Invitrogen，引物和探针由上海生工合成。商品化试剂的反应预混液，购自Applied Biosystems，货号为4304473，成分为AmpliTaq Gold DNA聚合酶、AmpErase UNG、dNTPs、Rox参比荧光及优化的缓冲液组分(具体可参见产品说明书)。
实施例1反应体系优化和商品化反应体系的荧光定量PCR比较
1.优化的反应体系为：
1)优化的反应体系1：
10×PCR Buffer                        2.5μL
2.5mM dNTP                            2μL
100mM MgSO4                           0.25μL
10mg/mL BSA                           0.25μL
10％Tween-20                          0.25μL
100％DMSO                             1.25μL
5M Betaine(甜菜碱)                    5μL
10μM引物1.1                          0.75μL
10μM引物2.1                          0.75μL
10μM水解探针                         0.625μL
50×ROX参比染料                       0.5μL
DNA聚合酶                             0.25μL
模板                                  1μL
去离子水                              9.625μL
合计                                  25μL
5个标准品浓度均参与反应，每个标准品浓度重复2次。
2)优化的反应体系2：
10×PCR Buffer                        2.5μL
2.5mM dNTP                            2μL
100mM MgSO4                           0.25μL
10mg/mL BSA                           2μL
10％Tween-20                          0.25μL
100％DMSO                             0.3μL
5M Betaine(甜菜碱)                6μL
10μM引物1.1                      0.75μL
10μM引物2.1                      0.75μL
10μM水解探针                     0.625μL
50×ROX参比染料                   0.5μL
DNA聚合酶                         0.25μL
模板                              1μL
去离子水                          7.825μL
合计                              25μL
5个标准品浓度均参与反应，每个标准品浓度重复2次。
3)优化的反应体系3：
10×PCR Buffer                    2.5μL
2.5mM dNTP                        2μL
100mM MgSO4                       0.375μL
10mg/mL BSA                       0.25μL
10％Tween-20                      0.25μL
100％DMSO                         1.25μL
5M Betaine(甜菜碱)                5μL
10μM引物1.1                      0.75μL
10μM引物2.1                      0.75μL
10μM水解探针                     0.625μL
50×ROX参比染料                   0.5μL
DNA聚合酶                         0.35μL
模板                              1μL
去离子水                          9.4μL
合计                              25μL
5个标准品浓度均参与反应，每个标准品浓度重复2次。
2.商品化的反应体系为：
反应预混液                      12.5μL
10μM引物1.1                    0.75μL
10μM引物2.1                    0.75μL
10μM水解探针                   0.625μL
模板                            1μL
去离子水                        9.375μL
合计                            25μL
5个标准品浓度均参与反应，每个标准品浓度重复2次。
3.反应条件
将以上四种反应体系在荧光定量PCR仪StepOne Plus(ABI公司)中进行反应。
本发明优化的反应体系的反应条件为：
95℃预变性10S；95℃变性30S、60℃退火30S、72℃延伸45S，共40个循环。
商品化试剂体系的反应条件为：
95℃预变性10min；95℃变性30S、60℃退火30S、72℃延伸45S，共40个循环。
4.实验结果
反应结束后，经StepOne v2.0软件分析，本发明优化反应体系1的扩增效率为99.31％，优化反应体系2的扩增效率为97.96％，优化反应体系3的扩增效率为99.49％，而商品化体系的扩增效率为86.73％。
具体实验结果见表1-表4，以及图1、图2和图3。
表1使用商品化反应体系的荧光定量PCR结果
Figure BSA00000340342300101
表2优化的反应体系1的荧光定量PCR结果
Figure BSA00000340342300102
表3优化的反应体系2的荧光定量PCR结果
Figure BSA00000340342300103
表4优化的反应体系3的荧光定量PCR结果
5.结果分析
根据表1-表4并结合图3的结果可以看出，使用商品化反应体系和本发明优化的反应体系的Ct值(或表示为CT值，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。)标准差均较小，反映出测量的准确度较高。具体来说，如果定量PCR的扩增效率是100％，那么10倍稀释点(X与Y浓度)之间的平均CT间隔应该恰为3.32个CT值(图3)。要以99.7％的几率分辨10倍稀释的浓度，标准差就必须小于等于3.32/6＝0.553。标准差越大，分辨10倍稀释的能力就越低。表1-表4中的标准差均小于0.5，说明分辨10倍稀释浓度的能力很强，反映出定量PCR反应的效果较好。
从图1可以看出，扩增曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性很好，基线平稳。但是，图1B、C、D扩增曲线指数期的斜率比图1A扩增曲线指数期的斜率要大。曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高，扩增曲线从侧面反映了优化后反应体系的效果。
图2表示各反应体系的标准曲线，其中A为商品化反应体系的标准曲线，B、C、D为本发明优化的反应体系的标准曲线。经过软件StepOnePlus(ABI公司)计算，商品化反应体系的扩增效率为86.73％，优化反应体系1、2和3的扩增效率分别为99.31％、97.96％和99.49％，接近100％。说明经优化后的反应体系能有效地提高扩增效率。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Figure ISA00000340342500011

Claims (3)

1.一种荧光定量PCR反应液，其特征在于反应液的成份包含10-67mM pH8.2-9.0Tris-HCl、25-50mM KCl、2.5-3mM Mg2+、0.2-0.4mM dNTP、0.05％-0.1％Tween20、1.2％-5％二甲亚砜、0.1-0.8μg/μl牛血清白蛋白、1-1.2M甜菜碱和0.05-0.07U/μl热启动DNA聚合酶。
2.一种荧光定量PCR试剂盒，其包含权利要求1所述的反应液。
3.一种荧光定量PCR方法，其特征在于所述方法包含使用权利要求1所述的反应液的步骤。
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