JPH0662847A

JPH0662847A - 古細菌由来の熱安定性リガーゼ

Info

Publication number: JPH0662847A
Application number: JP5121767A
Authority: JP
Inventors: Arnulf Dr Kletzin; ケレッツィンアルヌルフ; Ruediger Dr Rueger; ルーガールーディガー; Christoph Kessler; ケスラークリストフ; Cortina Kaletta; カレッタコルティナ; Michael Dr Jarsch; ヤルシュミハエル
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1992-05-23
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1994-03-08
Also published as: EP0571880A1; DE4217134A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】古細菌から得られる熱安定性ＤＮＡリガーゼ、
および核酸判定の分野でこのリガーゼを使用する方法。【構成】この発明の中で理解されるリガーゼは、２本の
ＤＮＡ一重鎖をフォスフォジエステル共有結合で連結す
る酸素であり、互いに隣接するＤＮＡ一重鎖は共通の一
本鎖にハイブリダイズされる。従って、リガーゼは、１
つの核酸の５′−フォスフェート基を別の核酸の３′−
ヒドロキシル基に連結することによって、核酸の二重鎖
中の一重鎖の切れ目（ニック）を修復する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明の課題は、古細菌（archae
bacteria）由来の熱安定性リガーゼ、このリガーゼをコ
ードする核酸、そしてこのリガーゼを使って核酸を検出
する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般に、リガーゼはポリヌクレオチドの
既存の末端を連結する酵素である（P.Higgins,N.R.cozz
arelli 1989 組換えＤＮＡ方法論（Recombinant DNA Me
tholo-gy) p.3-24 ）。リガーゼの作用は、ＤＮＡの二
重鎖分子中の同じ一本の鎖中の遊離５'-リン酸基と反対
側の遊離３'-ヒドロキシル基間のフォスフォジエステル
結合の形成を触媒するものである。フォスフォジエステ
ル結合の形成は、この反応に必須の補助因子中のピロフ
ォスフェート結合の切断と連合している。この過程は分
子内および分子間反応の両方が含まれる。リガーゼはＤ
ＮＡの複製およびＤＮＡの損傷の修復において、重要な
役割を演じる。ＤＮＡリガーゼは基本的に２つのタイプ
に大別される。第一のタイプは、真核生物およびＴ系列
のバクテリオファージのものが知られ、補助因子として
ＡＴＰを必要とする。これに対し、真性バクテリア由来
のリガーゼ（第二のタイプ）はＮＡＤ依存性である。バ
クテリアリガーゼの典型例がE.coliリガーゼであり、フ
ァージリガーゼの例として、バクテリオファージＴ４の
リガーゼが含まれる。

【０００３】リガーゼの作用は、主として次の３段階か
ら成り立っている。遊離酵素のアデニル化（補助因子が
ＮＡＤの場合はニコチンアミドモノヌクレオチドが放出
され、補助因子がＡＴＰの場合はピロフォスフェートが
放出される）。これらの例において、反応によって生成
するＡＭＰはリシン残基のε位に結合する。

【０００４】第二段階において、ＡＭＰ残基が酵素から
遊離ＤＮＡ末端の５'-フォスフェート基に転移し、高エ
ネルギーピロフォスフェート結合を形成する。リガーゼ
作用の第三段階において、反対側の３'-ヒドロキシル基
の求核攻撃によってフォスフォジエステル結合が形成さ
れ、ＡＭＰ基は除去される。サーマス・サーモフィラス
（Thermus thermophilus）由来の熱安定性リガーゼが知
られている（J.Biochem.(1986) 100,123-132）。この酵
素はおよそ79000 の分子量を有している（J.Biol.Chem.
(1984) Vol.259,16, pp.10041-10047 ）。この酵素は補
助因子としてMg²⁺またはMn²⁺およびＮＡＤを必要とする
が、ＡＴＰは必要としない。サーマス・サーモフィラス
ＨＢ８由来の酵素は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によ
り、オリゴヌクレオチドの連結のために使用することに
も成功している（ＷＯ91/17239）。熱安定性でＡＴＰ依
存性のＤＮＡリガーゼは、今のところ知られていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、熱安
定性でＡＴＰ依存性のリガーゼを供給することである。
好ましくは、そのリガーゼは先行技術で知られている不
都合な点を有すべきでない。ＡＴＰが熱安定性であるた
め、ＮＡＤ依存性よりもＡＴＰ依存性のほうが望まし
い。

【０００６】そこで、本発明の課題は、古細菌から得ら
れる熱安定性のリガーゼである。本発明の課題は、この
リガーゼをコードする核酸配列、リガーゼを使用して核
酸を検出する方法、そして酵素を単離する方法をも含ん
でいる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明の中で理解され
るリガーゼは、２本のＤＮＡ一重鎖をフォスフォジエス
テル共有結合で連結する酵素であり、互いに隣接するＤ
ＮＡ一重鎖は共通の一本鎖にハイブリダイズされる。従
って、リガーゼは、１つの核酸の５'-フォスフェート基
を別の核酸の３'-ヒドロキシル基に連結することによっ
て、核酸の二重鎖中の一重鎖の切れ目（ニック）を修復
する。

【０００８】本発明のＤＮＡリガーゼは、古細菌、中で
もスルフォロバール(Sulfolobales)目、特にデスルフロ
ロバス・アンビバレンス（Desulfurolobus ambivalens
）（Bergey's Manual (1984),Vol.3,2250-2253, Natur
e (1985) Vol.313,pp.789-791, System.Appl.Mikrobio
l.(1986) No8:197-203 ）中でコードされる。デスルフ
ロロバス・アンビバレンスおよび多くの他の高度好熱生
物は、ほぼ同時期に単離されたが、最近になって新しく
定義された第一次界である古細菌に属している（FEMS M
icrobiol.Rev.(1990) 75: 117-124 ）。1970年代の終わ
りに、数多くの実験データによって、“原核生物”は分
子判定基準によって、２種の基本的に異なる生物グルー
プに分けられることが示されるようになった。1977年
に、 C.R. Woese およびG.E.Fox は、１系統単位として
の原核生物を、相反する１点によって、古細菌に等しい
種と真正細菌と称する残りの種とに、分割することを提
唱した。今では、この３分類法がこれまでの系統学上重
要な原核生物と真核生物の２分類法に取って代わるよう
になった。それ以来、数多くのそれまで知られていなか
った古細菌について述べられ、そして古細菌の分子生物
学および生化学の分野での調査結果に基づいて、このグ
ループを生命体の単一系統単位とする考え方が強まった
（J.Mol.Evol.(1986) 24,167-173）。原初界の真核生
物、古細菌および真正細菌に代えて、オイカリア（euca
ria ）、アルカエア（archaea ）およびバクテリア（ba
cteria）に再定義することが、1990年に提案されたが、
これは連続した系統発生の説明になっている。

【０００９】スルフォロバール目のデスルフロロバス・
アンビバレンスは55-85 ℃、pH0.8−４で生育する（最
適条件は80℃、pH2.5 である）。このバクテリアは完全
に独立無機栄養性で、硫黄の還元または酸化によって二
酸化炭素同化作用を行い、純無機物培地上で生育するこ
とができる。デスルフロロバス・アンビバレンスはＤＳ
Ｍの公的コレクションから No.3772のもとに入手するこ
とができる。酵素の同定法に基づいて、デスルフロロバ
ス・アンビバレンスから固有の酵素を、既知の方法（例
えば、タンパク質の単離、分子量または電荷による分離
および活性試験）によって単離することができる。

【００１０】本発明のリガーゼの好ましい長さは、560
から750 アミノ酸数の間である。本発明の酵素の特に好
ましい長さは、およそ 600アミノ酸数である。本発明の
リガーゼは補助因子としてＡＴＰ依存性である。デスル
フロロバス・アンビバレンス由来のＤＮＡリガーゼのア
ミノ酸配列を図１および２に示す。このアミノ酸配列の
真核生物のＤＮＡリガーゼに対する相同性はわずかに約
30-35％である（図５および６）。ファージリガーゼに
対する相同性はもっと低い。真正細菌由来のＮＡＤ依存
性リガーゼに対し、（ＡＭＰ結合モチーフを除いて）有
意な相同性は見られなかった。ここで、本発明のＤＮＡ
リガーゼは、図１および２のアミノ酸配列を含むか、こ
のアミノ酸の50アミノ酸数以上の部分を含み、リガーゼ
活性を有するもの、または上記配列の１つに対し少なく
とも40％、好ましくは少なくとも60％、特に好ましくは
少なくとも90％の相同性を示し、かつリガーゼ活性を有
するもの、のいずれかである。さらに、本発明のＤＮＡ
リガーゼは、真核生物のＤＮＡリガーゼとのアミノ酸の
相同性が30％以下であることが望ましい。この酵素は好
ましい分子量が60から80kD、特に好ましくはおよそ67kD
である。Ｄ．アンビバレンス由来のタンパク質の等電点
は6.21である（計算はアミノ酸配列を基準としてい
る）。総荷電数は-6である。疎水性アミノ酸の含有量
（Ｉ＋Ｌ＋Ｖ＋Ｍ）は26.2％で、他の既知のＤＮＡリガ
ーゼ遺伝子（20.6−26.8％）の範囲内である。

【００１１】本発明の酵素は55℃以上、好ましくは75−
95℃、特に好ましくはおよそ80℃で安定である。特に、
この酵素は、核酸を熱変性条件下で繰り返し処理するよ
うな場合でも安定である。特に好ましい態様では、この
酵素はpH4 −pH8.5 、特に好ましくはpH6 −7.5 で酸安
定性である。本発明の酵素は少なくとも50−85℃、特に
50−60℃で活性を有する。

【００１２】遺伝子工学の手法によりこの酵素を大量に
得ることもできる。この目的のために、この酵素をコー
ドする核酸をベクター中に取り込ませ、適当な宿主中で
発現させる。遺伝子の分子クローニングに関する必要な
操作段階は、Sambrook, Maniatisら（1989）による分子
クローニグ：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A
Laboratory Manual）,Cold Spring Harbour Laboratory
Press により、基本的に知られている。リガーゼをコ
ードする核酸（ＤＮＡ）は、古細菌、特にスルフォロバ
ール中で、例えばオリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮ
ｏ．１−４によって同定することができる。

【００１３】本発明のリガーゼをコードする核酸を含む
ベクターに、例えばｐＤａｍ−Ｌ３がある。このベクタ
ーはＤ．アンビバレンスの857 bpのHindIII/EcoRI ＤＮ
Ａフラグメントをp ＵＣ18中でクローン化することによ
って得られた（宿主菌株Ｅ．coliＪＭ83, クローン pL8
/2）。これを行なうため、ゲノムＤＮＡを、標準方法
（Maniatisら（1989）分子クローニグ：実験室マニュア
ル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual ）,Cold
Spring Harbour Laboratory Press ）にしたがって、エ
ンドヌクレアーゼを用いて消化、サザントランスファー
およびハイブリッド形成を行った。続いて、このフラグ
メントを³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮ
ｏ．１を用いて同定した。オリゴヌクレオチドＳＥＱ
ＩＤＮｏ．２および３を、２つの異なったＰstI/Ｘba
I フラグメントの同定、そしてｐＵＣ18中でクローン化
するのに使用した（プラスミドｐＬ1/2 およびｐＬ2/4
）。このプラスミドはデスルフロロバス・アンビバレ
ンスのＤＮＡリガーゼ遺伝子のＮ末端およびＣ末端部分
を含んでいる（図３）。続いて、p-BluescriptIIＫＳ-
(Stratagene) 中でｐＬ2/4 のＥcoＲＩ/ ＸbaI フラグ
メントを連結、さらにｐＬ8/2 のＥcoＲ１-/HindIII フ
ラグメントおよびｐＬ1/2 のHindIII フラグメントを連
結することによって、これら３つのクローンからｐＤam
- Ｌ３を構築した（図４）。

【００１４】Ｅ．coli中で遺伝子を発現させるために、
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮ
ｏ．９およびＳＥＱＩＤＮｏ．10を使用してＰＣＲ
混合物中でコード配列を増幅させた。５' 域に、これら
のプライマーは BamHI制限酵素に特異的な付加配列を含
んでいる。 BamHI消化に続いて、ＰＣＲフラグメントは
BamHI によって切断された発現ベクター pＱＥ- ８中に
クローン化された(Diagen,QIAexpress Vector Kit SRF,
参照：The QIAexpressionist;Stuber ら（1990) ：免疫
学の手法(Immunological Methods) Ｉ.Lefkovits and
B.Pernis(eds.),Vol.IV,pp.121-152 ）。この新しく結
合したプラスミドを pＱＥ- Ｌ６と名づけた。Ｅ．coli
Ｍ15株中にトランスフォーメーション後、発現産物は実
施例８にしたがって精製された。この操作では、Ｍ15は
さらに、ネオマイシン・リントランスフェラーゼ遺伝子
（neo ）およびlacI遺伝子（＝lac リプレッサー）をコ
ードするプラスミド pＲＥＰ４を含む。この neo遺伝子
は、この菌株に、p ＱＥ- Ｌ６を通じて有していたアン
ピシリン耐性に加えて、カナマイシン耐性を与える。p
ＱＥ- Ｌ６をトランスフォームしたＭ15株はＤＳＭ（De
utsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulture
n＝ドイツ微生物および細胞培養物寄託所）に1992年５
月19日、No.7070 として寄託された。

【００１５】本発明の核酸は、スルフォロバス・アシド
カルダリウス（Sulfolobus acido-caldarius ）および
スルフォロバス・シバタ（Sulfolobus shibatae ）のＤ
ＮＡとのみハイブリッド形成する。古細菌に属さない生
物のリガーゼ遺伝子の遺伝子配列とは、緩やかな条件下
でもハイブリッド形成しなかった。このことは、このリ
ガーゼ遺伝子が既知のリガーゼ遺伝子と大きく異なった
ヌクレオチド配列を有していること、そして古細菌特に
スルフォロバキー（Sulfolobacae）のリガーゼ遺伝子同
士の類似性が高いことを意味している。

【００１６】pＤam-Ｌ３プラスミドは、リガーゼをコー
ドする配列に対応する、塩基対908-2710の配列で、３つ
の読み取り枠を有している（図１および２）。この配列
は、67619 Ｄ（計算値）、600 アミノ酸数のタンパク質
をコードする。本発明のＤＮＡリガーゼのコード領域の
ＧＣ含有率は、およそ36％で、デスルフロロバス・アン
ビバレンスＤＮＡの総ＧＣ含有率（31％）よりもわずか
に多い。図１および２は本発明の核酸のヌクレオチド配
列および対応するアミノ酸配列を示している。

【００１７】専門家であればアミノ酸配列を変えないで
ヌクレオチド配列を改変（遺伝暗号を縮重）することが
できる。アミノ酸の変化をもたらしても、ある程度まで
のヌクレオチド配列の改変では、本発明のリガーゼの活
性に影響を与えないものと考えられる。つまり、本発明
は図１および２に示す配列、または40％以上、好ましく
は70％以上、特に好ましくは90％以上の部分配列に相補
的な核酸を含むものである。リガーゼ遺伝子の長さに関
しては、デスルフロロバス・アンビバレンスの遺伝子長
からある程度までの偏差ならば、本発明のリガーゼをコ
ードする機能が大きく変化することはないことも予測で
きる。好ましい態様として、核酸は少なくとも長さ150
塩基対、特に1000から3000塩基対である。特に、ヌクレ
オチド配列が、アミノ酸配列Ｋ. ＤＧ. ＲのＡＴＰ結合
部位をコードするモチーフを含んでいる。

【００１８】本発明の核酸はまた、６×ＳＳＣ、50％ホ
ルムアミド中、室温またはより苛酷な条件下で、その相
補鎖が、ベクターに属さない配列、つまり図１および２
の核酸のデスルフロロバスに特異な配列、特に pＤＡＭ
- Ｌ３のヌクレオチド番号908 から2716、特に好ましく
は988 から2457、またはデスルフロロバス・アンビバレ
ンスからの3382 bp 長のＸbaI/HindIII とハイブリッド
形成するものと定義することもできる。

【００１９】このような核酸の例として、オリゴヌクレ
オチドＳＥＱＩＤＮｏ．１−４および７−10があ
る。これらは、例えば、鋳型依存性伸長（例えばＰＣ
Ｒ）のためのプライマーとして、または標識を取り込ま
せて、デスルフロロバス・アンビバレンスまたはそのリ
ガーゼ遺伝子の検出用プローブとして使用することがで
きる。

【００２０】本発明のもう１つの課題は、検出すべき核
酸に、隣接セグメントとしてハイブリダイズされる２つ
の核酸を連結させるために本発明のリガーゼを用いるこ
とによりその核酸を検出することである。リガーゼを用
いる検出の例が、ＥＰ- Ａ- Ｏ 320308 に記載されてい
る。リガーゼの連鎖反応の条件はこの文献から収集でき
るが、この文献中で使用されているリガーゼの代わりに
本発明のリガーゼを用いる。しかし、本発明のリガーゼ
のＡＴＰ依存性を考慮する必要がある。このために、リ
ガーゼ反応中、ＡＴＰを 0.1mmol/l以上、好ましくは0.
1 から20mmol/lの濃度で存在させるべきである。本発明
の方法において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃
度は０から20％、好ましくは５から10％である。

【００２１】本発明のリガーゼを隣接核酸の連結に使用
して、核酸を検出するもう１つの方法がＷＯ90/01069に
記載されている。この方法における最初の段階は、隣接
するハイブリダイズされたヌクレオチド間の２，３のヌ
クレオチドのすき間（ｇａｐ）をモノヌクレオシド・ト
リフォスフェートを取り込ませて埋め、リガーゼを使っ
てそのすき間（いわゆるニック）を閉じることである。

【００２２】図１および２は、ｐＤam- Ｌ３の核酸配列
を示している。これは、デスルフロロバス・アンビバレ
ンスのＤＮＡリガーゼおよびｐＤam- Ｌ３ＯＲＦ３の完
全配列、さらにｐＤam- Ｌ３ＯＲＦ２および４の部分配
列を含む。下線部はBox Ａ、太字は転写開始点を示す。
図３は、ｐＤam- Ｌ３プラスミドのクローン化および配
列決定パターンを示している。破線矢印は、連結の結果
を確認するためのオリゴヌクレオチドＬ１（ＳＥＱＩ
ＤＮｏ．２）およびＬ２（ＳＥＱＩＤＮｏ．３）
によって得られた配列を示す。実線矢印は、対応するフ
ラグメントのサブクローニングによって得られた残りの
配列を示す。長破線はＤＮＡリガーゼ遺伝子の位置を、
右端と左端の破線はｐＬ-1/2および2/4 プラスミドの連
続を示す。

【００２３】図４は制限部位を付けたｐＤam- Ｌ３のプ
ラスミド図を示す。これは読み取り枠の方向の指示をも
与えている。０マークはp-BluescriptIIＫＳ^-の０マー
クに対応し、ｌｉｇはＤＮＡリガーゼ遺伝子に対応す
る。図５および６は既知のＤＮＡリガーゼのアミノ酸配
列の比較である。右端は個々の配列のアミノ酸の番号で
ある。配列の上に、最も長いリガーゼ配列（Ｈ .サピエ
ンス (sapiens)）の番号および特に相同な位置（ａａ58
7-593 ）を示す。強く保存されている部分を太字で示
す。矢印はＡＴＰ結合部位（リシン）を示す。同一性が
50％を越える場合は、コンセンサス行（最下行、Kons）
に記入した。点は１：１分布に相当し、大文字は比較し
たすべての配列で一致していることを意味する。

【００２４】図７は既知のＤＮＡリガーゼ配列を２つず
つ、バクテリオファージＴ４のＲＮＡリガーゼおよび
Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）のｔＲＮＡリガーゼも含
んで、比較している。上右側の三角部には、ＧＡＰプロ
グラムにより決定された２つの同一性度（％）を示し、
下左側の三角部には、ＲＤＦ２プログラムによる配列相
同性の有意性分析を示す。ＲＤＦ２測定により得られた
値はすべてＳＤ単位、すなわち正確な２つずつの整合を
ランダム整合の標準偏差で割ったものである。中央の対
角線上には、照合のため互いに関してプロットした配列
のＲＤＦ２結果を示す。アミノ酸のそれぞれの配列の長
さを括弧内に示す。上記２つとも、偶然同一となる結果
を避けるため、配列の長い方を短い方に合わせている。

【００２５】図８はＤ．アンビバレンスに由来する全Ｒ
ＮＡの転写実験の結果を示す。太矢印は主開始シグナル
および終止シグナルを示し、下線部はBox A およびBox
B のモチーフを示す。図９はｐＱＥ- Ｌ６のプラスミド
図を示す。特徴的なリガーゼ遺伝子の制限部位が示され
ている。ベクター構築に関する詳細は“ＱＩＡ Express
ionist(DIA-GEN GmbH ,Dusseldorf,FRG) ”に示されて
いる。

【００２６】次に示す例により、本発明をさらに詳細に
説明する。

【００２７】

【実施例】実施例１デスルフロロバス・アンビバレンス中のＤＮＡリガーゼ
遺伝子の同定Ｄ．アンビバレンスの染色体ＤＮＡを、嫌気的に増殖さ
せた細胞から既知の方法によって調製した（ＳＤＳによ
る細胞の消化、フェノールおよびクロロホルム抽出、エ
タノール沈降、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離の繰り返し
（分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular Clo
ning,A Laboratory Manual) CSH Laboratory Press 19
89））。嫌気および好気増殖細胞からグアニジニウム・
チオシアネート法を使って全ＲＮＡを調製した（Anal.B
iochem.(1987) 162, 156-159）。適当な容量のキアゲン
（Quiagen ）カラムを使用し、製造業者の指示に従っ
て、プラスミドを調製した。

【００２８】オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮｏ．
1-4 および7-10をＤＮＡ合成装置 381（Applied Biosys
tems ,Weiterstadt ）によって合成した。オリゴヌクレ
オチドに、ＰＮＫ緩衝液（J.Mol.Evol.(1986).24:167-1
73）中室温で30分、濃度比10μCiに対しオリゴヌクレオ
チド1pmol で、５単位のＴ４−ポリヌクレオチドキナー
ゼを使用して、³²Ｐ−ＡＴＰ末端ラベルを導入した。６
×ＳＳＣ，１×Denhardt's, 0.5 ％ＳＤＳ，20μg/ml t
ＲＮＡ(E. coli) ，0.05％二リン酸四ナトリウム十水和
物中、65℃、30-120分間、フィルターのプレハイブリッ
ド形成を行なった。ハイブリッド形成は 0.1％ＳＤＳを
添加した外、上記の緩衝液中で行なった。ハイブリッド
形成の温度および時間は、経験的に定められた。ハイブ
リッド形成後、フィルターは、一般的に、室温で１×Ｓ
ＳＣ/0.5％ＳＤＳ中、15分間１回洗浄、さらに１回、最
適温度として決定されたハイブリッド形成温度で30分間
洗浄する。コロニーのハイブリッド形成（分子クローニ
ング、前掲）は一般的に同様に処理された。実施例２クローニング長さ 857 bp のHindIII/EcoRI フラグメントをゲノムＤ
ＮＡの切断、サザントランスファーそして³²Ｐで標識し
たオリゴヌクレオチド Soxi （ＳＥＱＩＤＮｏ．１）
とのハイブリッド形成により同定した後、ｐＵＣ18(Ame
rsham,Braunschweig) 中にクローン化した（ｐＬ8/2
）。

【００２９】ｐＬ-8/2の核酸配列から２つの別のオリゴ
ヌクレオチドを誘導した。これらのオリゴヌクレオチド
を、遺伝子の終端（ｐＬ-1/2, オリゴヌクレオチドＳＥ
ＱＩＤＮｏ．２）およびＣ末端（ｐＬ-2/4, オリゴヌ
クレオチドＳＥＱＩＤＮｏ．３）を含んでいる２つの
ＰstＩ／ＸbaＩフラグメントを同定およびクローン化す
るために使用した。後者は、二重連結または部分切断に
よって、もう１つの内部ＸbaＩ切断部位（図３）を含む
ことがわかった。３つの部分的に重複するクローンを基
礎に、ＤＮＡリガーゼの完全な遺伝情報を含む１つの p
Ｄam- Ｌ３プラスミドが作り上げられた。このため、初
めにｐＬ2/4のＥcoＲＩ／ＸbaＩフラグメントがｐBlues
criptIIＫＳ^-（Stratagene Cloning System La Jolla,
USA）中でクローン化され、続いてｐＬ8/2 のＥcoＲＩ
／HindIII フラグメントのクローン化およびｐＬ1/2 の
HindIII のクローン化を行なった。それぞれのクローン
化段階の結果はオリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮ
ｏ．２，３，13，14を用いる二重鎖配列決定により確認
された（図３参照）。

【００３０】この結果、ｐＤam- Ｌ３プラスミドはＤ．
アンビバレンスのＤＮＡリガーゼに関する完全な情報を
持つ、長さ3382 bp のＤＮＡフラグメントと、上流にお
よそ900 bpそして下流におよそ700 bpを含んでいた（図
４）。実施例３ｐＤam- Ｌ３のサブクローニングおよび配列決定適当な制限フラグメントをベクターＭ13mp10，Ｍ13tg13
1, Ｍ13mp18, Ｍ13mp19（Amersham,Brauschweig,FRG）
または４つのｐBluescriptベクター（StratageneClonin
g Systems,La Jolla,USA）中でクローン化した。配列決
定戦略は図３に示されている。配列決定反応は、必要に
応じて一重鎖でも二重鎖でも行なった。Ｍ13ベクター中
でサブクローン化されたフラグメントを用いた配列決定
反応は、普通のオリゴヌクレオチド（＝配列決定用キッ
ト(Sequenase Kit) -40-オリゴ，United States Bioche
mical Corporation,Cleveland,Ohio,USA, ＳＥＱＩＤ
Ｎo.11）を用いて開始した；ｐＵＣ中での反応は、普通
のまたは逆転 -40オリゴヌクレオチドを用いて開始し
（この逆転オリゴヌクレオチドに関しては、Nucl.Acids
Res.(1989)17:4897 のデータを使用した）、pBluescrip
t ベクター中での反応はオリゴヌクレオチドＳＥＱＩ
ＤＮo.13および14を、必要に応じて使用して、開始し
た。後者の反応は、フラグメントの方向によって、配列
決定のため、ヘルパーファージＶＰＳ13（Stratagene C
loning Systems）で感染後、一本鎖ベクターで行なう
か、またはフラグメントを二重鎖配列決定のために使用
した。さらに、二重鎖配列決定操作は、特別に合成され
たオリゴヌクレオチドまたは探査オリゴヌクレオチドを
用いて行なった（上記参照）。配列決定反応は Sequena
seKitを使用し、製造者（United States Biochemical C
orporation ）の指示の通りに行なった。Sequagel溶液
（National Diagnostics Corpolation,Manville,New Je
rsey,USA）を使用して調製した配列決定用のゲルを、Ma
krophor 配列決定チャンバー（Pharmacia,LKB,Freibur
g）に流し入れた。

【００３１】完全なヌクレオチド配列およびそのアミノ
酸配列への翻訳を図１および２に示す。配列決定セグメ
ント中の４つの読み取り枠（オープン・リーディング・
フレーム）をより詳細に分析した。最も長いもの（塩基
対 908 -2710、図３）は、アミノ酸数 600の想定 67617
Ｄａタンパク質の情報を含んでいた。分析された残り３
つの読み取り枠からは、１つは塩基対2961で始まり配列
決定領域の終わりまで続き（ｐＤam- Ｌ３- ＯＲＦ
２）、２番目は塩基対 771-250に一致し（ｐＤam-Ｌ３-
ＯＲＦ３、図４参照）、３番目の始まりはｐＬ1/2 の
配列決定セグメントにはなく、塩基対 273で終わってい
た（ｐＤam- Ｌ３- ＯＲＦ４）。実施例４原核／真核生物のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼとの配列整合決定された核酸配列を、ＵＷＧＣＧプログラムパッケー
ジ（Nucl.Acids Res.(1984).12:387-395,Version 7.0(1
991) ）を用いて分析した。読み取り枠と遺伝子バンク
Mipsx（Martinsried ）に保存された配列との比較を、
ＰＩＲＦＡＳＴＡと称されるプログラム（Meth.Enzymo
l.(1990) 183:63-99 ）に従って行った。入手できる以
下の生物由来のＤＮＡ、ＲＮＡおよびｔＲＮＡリガーゼ
のアミノ酸配列を使用して、２つずつの同一性を決定す
るためのＧＡＰプログラムに従って、配列の比較を行な
った；シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccaromyce
s pombe)(Enz.J.Biochem.(1987).162:659)、サッカロミ
セス・セレビシエ(Saccaromyces cerevisiae)(Nucl.Aci
ds Res.(1985).13:8323-8337) 、エシェリチア・コリ(E
scherichia coli)(Mol.Gen.Genet.(1986).204:1-7)、サ
ーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)(J.Bac
teriol.(1991).173:5047) 由来のＤＮＡリガーゼ、ヒト
ＤＮＡリガーゼＩ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990).87:6
679)、ワクシニアウィルスＤＮＡリガーゼ(Nucl.Acids
Res.(1989).17:9051-9062)、Ｅ．coliバクテリオファー
ジＴ３(J.Mol.Biol.(1987).479-495) 、Ｔ４(Nucl. Ac
ids Res.(1983).11:7145-7156)、Ｔ６(Dokl.Akad.Nank
SSSR(1988).299:737- 742)、およびＴ７(J.Mol.Biol.(1
981).148:303-330) 由来のリガーゼ、Ｔ４由来のＲＮＡ
リガーゼ(EMBO J.(1988).3:397-402) 、Ｓ．セレビシエ
由来のｔＲＮＡリガーゼ(J.Biol.Chem.(1988).263:3171
-3176)（図７）。完全に異なる作用を行なうアミノアシ
ル-tＲＮＡリガーゼは無視した。２つずつの配列整合の
有意性分析をＲＤＦ２プログラムに従って行った。この
プログラムは、２つずつの整合の結果を、２つの配列の
１つがランダムに切れて移し変えてできるたくさんの配
列（この場合1000）の結果と比較するものである。この
プログラムではつぎに標準偏差を計算する。図７に、標
準偏差で割った整合の結果の倍数（ＳＤ単位）を示す。
両方の配列を１回はそのままで、もう１回は移し変え
て、両方の結果を平均化した。ＡＴＰ依存性のＤＮＡリ
ガーゼはＣ末端において高い保存性を示すので、より長
い配列はＮ末端から始まって同じ長さで切断された。

【００３２】ＲＮＡリガーゼのアミノ酸配列の２つずつ
の比較から得られる同一性の百分率、および２つずつと
ランダム整合からの標準偏差の倍数（ＲＤＦ２）を図７
に示す。Ｄ．アンビバレンスのＤＮＡリガーゼが、すべ
ての差異を考慮しても、真核生物の既知の他の４つのＡ
ＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼすべてと30％以上の配列同一
性を有しており、ＲＤＦ２において標準偏差の46から86
倍である点は注目すべきである（図７）。照合のため、
それぞれの配列をそれ自体に対して試験した（同一性 1
00％）ＲＤＦ２結果は、200 から 450ＳＤの間であり、
主として配列の長さに依存していた。Ｅ．coliとＴｈ．
サーモフィラスのＮＡＤ依存性、細菌性、細胞質ＤＮＡ
リガーゼ間には、有意の類似性はなかった（配列同一性
＜20.4％；ＲＤＦ２では＜ 0.2ＳＤ）。Ｅ．coliファー
ジＴ４のＡＴＰ依存性ＲＮＡリガーゼとＳ．セレビシエ
のｔＲＮＡリガーゼの類似性も見いだされた。Ｔファー
ジリガーゼに関しては、結果は中間的であった。ＲＤＦ
２分析は何ら有意な結果をもたらさなかったが、同一性
の値は20.2から23.7％の間であった。図７において、次
の点が注意を引く。すなわち、真核生物のリガーゼと
Ｄ．アンビバレンス・リガーゼは近縁関係にあるグルー
プを形成する。Ｔ４とＴ６リガーゼも６つの位置を除い
て同一である。Ｔ３とＴ７は72％の同一性で近縁関係に
ある。これはＥ．coliとサーモス・サーモフィラスのＮ
ＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼ間にもあてはまる（46.7
％）。しかし、この２種はその他のものとは関連がな
い。ＲＮＡリガーゼは同種の酵素ともその他とも関連が
ない。Ｔファージの既知の４つのＤＮＡリガーゼはその
他のＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼと明らかに異なってい
る。２つずつの分析結果は他よりも 20.2 から26.0％高
い同一性を示す。しかし、有意性分析では、０付近の値
を示す。保存された特徴から、それらはＡＴＰ依存性Ｄ
ＮＡリガーゼの整合に含まれる（下記参照）。ワクシニ
アＤＮＡリガーゼは中間位置にあると推察される。これ
はＴファージリガーゼとのＲＤＦ２分析において 4.3か
ら 8.3の値を示すが、その他の真核生物の酵素に近縁で
ある。つまりこれは２つのリガーゼグループを結びつけ
ている。

【００３３】以下の議論はＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ
に限定する。それは、このタイプのみが共通の整合を可
能にする唯一のものであったからである。一致する整合
を除いて、配列比較は他のＤＮＡリガーゼに対し共通の
構造をもたらさなかった。ＤＮＡリガーゼは全長におい
て際立って異なっていて（アミノ酸残基数 346から 91
9）、一般に真核生物のリガーゼの方がＴファージリガ
ーゼよりも長い（アミノ酸残基数 346から 487に対し、
552 から 919）。真核生物のＤＮＡリガーゼのタンパク
質配列の整合では、、多数の保存セグメントがあり、そ
れらのいくつかはほとんど類似性を示さないセグメント
によって分断されている。初期の試験において、酵母と
ヒトのリガーゼが、特にＮ末端断片において、ほとんど
保存性を示さないことに着目して、これらの部分配列は
何ら関連性がないと結論された。すべてのリガーゼに３
つの高度に保存された構造が発見され、そのうちの一部
はすでに初期の試験で観察されていた。これらにはＡＴ
Ｐ結合部位が含まれるが、これは実験的にはウシのリガ
ーゼＩについてのみ決定された。おそらくこの部位に属
すると考えられる２つ以上の構造（ 560位：Ｔ３および
Ｔ７のＰＭＬＡまたはＰＦＫＡ， 610位：ＳＲ）が上記
の共通配列ＫＹＤＧＸＲ（ＫはＡＴＰ結合性である、 6
50位）の近傍に見いだされた。２番目に、その保存性の
ため Bakerら (1985) によりＡＴＰ結合中心と誤認され
た構造が、整合において 785から 813位に見いだされ
た。３番目に、もう１つの構造が 945から 960位のＣ末
端近傍に存在している。さらに、いくつかの低いながら
保存された構造は、Ｔファージと真核生物のリガーゼ間
で類似性が低いにもかかわらず、新しいＡＴＰ依存性Ｄ
ＮＡリガーゼの整合を可能にした。すべてのＡＴＰ依存
性リガーゼにおいて、ＡＴＰ結合部位が高度に保存され
ているので、配列相同性に基づく確実な整合が可能であ
ると考えられる。実施例５転写物の分析 in vivo での読み取り枠の転写開始はプライマー伸長分
析（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990).87:5851）の方法に
よって決定された。ＤＮＡリガーゼ遺伝子の in vivoで
の終止は、プローブとしてα- ³²Ｐ- ＡＴＰで標識され
たＮcoＩ／ＳnaＢＩフラグメント（塩基対2458から322
1）を用いたＳＩマッピングによって決定された。Ｄ．
アンビバレンスの好気および嫌気増殖細胞由来の全ＲＮ
Ａをリガーゼ遺伝子の転写分析に使用した。１つの例外
（静止細胞のＲＮＡ）を除いて、全ＲＮＡとのプライマ
ー伸長反応のシグナルは非常に低かったが、好気的にも
嫌気的にも同程度の強度で検出できた。転写は、翻訳の
ＡＴＧ開始コドンの最初の塩基またはその前のチミジン
残基上で始まった。ｐＤam- Ｌ３のその他の読み取り枠
は開始シグナルを形成しなかった。

【００３４】プライマー伸長分析の結果は、ＤＮＡリガ
ーゼ遺伝子が、シグナルの強度は小さいながら、in vio
で転写されることを、明確に示した。強いシグナルはた
だ１つの場合、すなわち静止細胞のＲＮＡでのみ見られ
た。プロモーターの配列は、古細菌に特徴的なBox A お
よびBox B を持つ構造を有していた。フラグメントのそ
の他の読み取り枠に関しては記載しないことにする。ｍ
ＲＮＡ開始シグナルがなかったという事実は、ある場合
にそれらが発現され得ることを意味するものではない。

【００３５】転写の終結は、強い開始シグナルを生成し
た、同じＲＮＡ調製品におけるＳＩマッピングによって
決定した。終結シグナルが関与する配列はＡＣＡＴＴＡ
ＴＧで、その前の塩基配列はＡＧＴＡＧＡＴＧＧであ
る。シグナルの対応する配列および位置を図８に示す。
開始および終結シグナルから誘導された転写物の長さ
は、1908-1914 ヌクレオチドであった。実施例６他の種との交叉ハイブリッド形成以下の生物由来のゲノムＤＮＡをＢglIIおよびＮcoI 、
そして括弧内に示す酵素で２回消化した：古細菌：スル
フォロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobusacidocald
arius) （ＥcoＲＩ），Ｓ．シバタ(D.shibatae)（Ｅco
ＲＩ）, デスルフォロコカス・ムコサス(Desulforococu
s mucosus)（ＥcoＲＩ），サーモプロテウス・テナック
ス(Thermoproteus tenax) （ＰstＩ），サーモコッカス
・セラー(Thermococcus celer)（ＰstＩ），サーモプラ
ズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)（Ｅ
coＲＩ），メタノサーマス・フェルビダス(Methanother
mus fervidus) （ＥcoＲＩ），メタノコッカス・バニエ
リ(Methanococcus vanielli)（ＥcoＲＩ）およびハロフ
ェラックス・ボルカネイ(Haloferax volcanei)（ＢamＨ
Ｉ／ＰstＩ）；バクテリア：エシェリチア・コリ(Esche
richia coli)（ＨindIII）およびバチルス・ステアロサ
ーモフィルス(Bacillus stearothermophilus) （ＥcoＲ
Ｉ）；真核生物：ボックス・プリミゲニウス・タウルス
(Box primigenius taurus)（ウシ、ＥcoＲＩ）およびサ
ッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
（酵母、ＥcoＲＩ）。混合物をアガロースゲル上で分離
し、続いてサザントランスファーおよび放射性標識した
ｐＤam- Ｌ３のＢglII／ＮcoIフラグメント（塩基対988
-2457、図４）（この遺伝子のおよそ82％を含む）を用
いたフィルターのハイブリッド形成を行った。条件は次
の通りであった：６ｘＳＳＣ，50％ホルムアミド，室
温；洗浄条件は２ｘＳＳＣ，室温。分離には、Ｄ．アン
ビバレンスのゲノムＤＮＡ（ＢglII／ＮcoI およびＥco
ＲＩにより切断）およびＢglII／ＮcoI によって切断さ
れたｐＤam- Ｌ３プラスミドが含まれていた。

【００３６】ハイブリッド形成の結果、Ｄ．アンビバレ
ンスはこの遺伝子を１コピーだけ担うらしいことがわか
った。さらに、スルフォロバス・アシドコルダリウス(S
ulfolobus acidocoldarius) およびＳ．シバタのＤＮＡ
中に明確なバンドを検知することができた。後者の２種
は、スルフォロバール目に含まれる最も離れた関係にあ
る生物である。他のすべての生物では、ハイブリッド形
成が起こらなかった。これらの結果から、スルフォロバ
ール目内ではこの遺伝子が高度に保存されていると結論
づけることができる。さらに、この方法を用いては、真
核生物の酵素とのＤＮＡレベルでの密接な関係を確立す
ることができなかった。

【００３７】スルフォロバール目は、現在次の種を含ん
でいる：スルフォロバス・アシドカルダリウスＳ．ソルファタリクス(solfataricus) Ｓ．シバタＳ．スリンギエンシス(thuringiensis) Ｓ．メタリクス(metallicus) アシジアヌス・インフェルヌス(Acidianus infernus) Ａ．ブリエレイ(brierleyi) デスルフォロロバス・アンビバレンススティギオロバス・アゾリクス(Stygiolobus azoricus) メタロスファエラ・セダラ(Metalosphaera sedula) 他の新しい単離物の発見も期待できる。上記種はすべて
形態学上および生息状況が類似し、系統発生学上も関係
がある。実施例７発現クローニングｐＱＥ- Ｌ６の発現プラスミドの構築：Ｅ．coli中でＤ
ＮＡリガーゼ遺伝子を発現させるために、ゲノムＤＮＡ
調製品からポリメラーゼ連鎖反応を使用して、この遺伝
子のコードセグメントを増幅させた。Ｎ末端にＢamＨＩ
切断部位を含み、次に制限プロテアーゼＸａ因子の切断
部位を、続いてＣ末端にＢamＨＩ切断部位を含むように
して、オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮｏ．９およ
び10を構築した。増幅条件は、以下の通りである：１ｘ反応用緩衝液（Boehringer Mannheim,Cat.No.11461
65） 100 μM ｄＮＴＰ 2.5 ＵのＴaq- ＤＮＡポリメラーゼ 40 pmol オリゴ類 500 ngゲノムＤＮＡ変性：94℃，60秒連結：51℃，120 秒重合：72℃，120 秒 40サイクルＢamＨＩで切断後、反応産物は、同じくＢamＨＩで切断
し、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化を行なった
Quia Express p ＱＥ- ８ベクター（ＤＩＡＧＥＮＧ
mbＨ，Dusseldorf,FRG）に連結した。

【００３８】Ｅ．coli中での発現：Ｅ．coliの形質転換
後、カナマイシンおよびアンピシリン含有２ｘＴＹ培地
で一晩、前培養物を増殖させた。これから取り出した主
培養物を、細胞密度ＯＤ₆₀₀＝0.8-1.0 になるまで同じ
培地で増殖させ、その後２mMのＩＰＴＧ濃度において誘
導した。タンパク質誘導の過程をＳＤＳゲルによりモニ
ターした。普通、細胞をインキュベート後３時間で回収
した。細胞をリゾチームで前処理した後、液体窒素で凍
結および融解を３回繰り返すことによって、消化した。
このＥ．coliタンパク質を75℃、15分インキュベートす
ることにより加熱沈殿させ、Eppendorf 遠心分離器で２
分間遠心した。

【００３９】タンパク質中にＸａ因子切断部位（ＩＥＧ
Ｒ）を組み込んでＤＮＡリガーゼ遺伝子を増幅させるオ
リゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応によって、アガロ
ースゲル中におよそ1900 bp の明確な単一バンドが生じ
た。ＤＮＡリガーゼのＮ末端に配列ＭＲＧＳＨＨＨＨＨ
ＨＧＳＩＥＧＲのオリゴペプチドが融合されるように、
これをｐＱＥ- ８中にクローン化した。［６ｘＨｉｓ］
配列の目的は、ニッケル（ニトロロ三酢酸とキレート化
される）を使って融合産物をアフィニティー精製できる
ようにするためである。コロニーハイブリッド形成での
同定のため、５つの異なる陽性クローンを増殖させ、生
成したプラスミドを、制限切断によって希望のサイズの
フラグメントが存在するかどうかを試験し、さらにＩＰ
ＴＧ誘導後の発現の過程をＳＤＳゲルでモニターした。
５つの内４つのクローンが、ＳＤＳゲルで、他に、見か
け分子量 65000のタンパク質バンドを示した。融合タン
パク質の分子量期待値は 69487である。誘導細胞の粗溶
解液の熱処理によって、誘導タンパク質は溶解したまま
で、細胞タンパク質の大部分が切断されてしまったもの
と考えられる。５番目のクローンとベクターコントロー
ルはこのバンドを示さなかった。このことから、ハイブ
リッド形成陽性であった５番目のクローンは逆方向で増
幅フラグメントを含んでいるものと推定された。実施例８Ｄ．アンビバレンス・リガーゼの精製ｐＱＥ−Ｌ６プラスミドを含んだバクテリアＥ．coli、
例えばＭ15- ｐＱＥ-Ｌ６を、２ＬのＤＹＴ培地（J.Sam
brook et al., Molecular cloning, 1989, CSH, vol.3,
p.A.3 ）中37℃で20μg/mlアンピシリンおよび20μg/m
lカナマイシンと共に増殖させた。ＯＤ₅₅₀＝0.8 にお
いて、１mMＩＰＴＧを使用して誘導を行い、37℃で３時
間から一晩インキュベートの後、産物を回収した。バク
テリアの細胞を 500mlビーカー中でSorvall 遠心分離機
のＧＳＡローターを使って6000rpm でペレット化し、20
mlのTris, 20mM,pH7.6; ＥＤＴＡ,1mMおよびβ- メルカ
プトエタノール,10mM 中に再懸濁した。このバクテリア
の細胞を超音波処理を用いて破壊した。これを行なうた
め、４×５mlのアリコートを、Branson Sonifier 450の
初期出力の50％で５×１分間、音波処理した。次に、懸
濁液をSorvall 遠心分離機のＳＳ34ローターを使って39
000gで遠心分離を行い、上澄液を２ＭのＫＣｌを使用し
て、最終塩濃度 300mMとした。

【００４０】混合物からバクテリアＤＮＡを精製するた
め、この溶液をＤＥＡＥカラム（５ml，300mM ＫＣｌで
平衡化）に通し、70mlの300mM ＫＣｌで溶出した。Ｅ．
coliタンパク質を変性させるため、カラム流出物を65
℃，20分間処理した。次に、得られた産物をＳＳ34ロー
ターで18500rpm, 15分間遠心し、上澄液を飽和硫酸アン
モニウムで沈殿させた（容量比１：１）。続いて、1800
0rpmで再び遠心し、Ｄ．スルフォロロバス由来のリガー
ゼを含有する、得られたペレットを４mlのＨ₂Ｏ中に入
れた。実施例９デスルフォロロバス・アンビバレンス・リガーゼの連結
活性活性検出のターゲットを得るために、ゲノムファージλ
−ＤＮＡを制限酵素ＳmaＩ（平滑末端）およびＳalＩ
（２ヌクレオチド５’重複末端）を用いて切断した。高
反応温度ではこれらの末端のハイブリッドは安定でない
ので、12ntの付着５’重複末端（いわゆる cos位）を持
つゲノムの２つの末端フラグメントのみがハイブリッド
体として存在する。このハイブリッド体はまた、12nt離
れたいわゆるニックを２つ含んでいる。この鋳型で、ニ
ックのあるＤＮＡを使用して、リガーゼの活性を試験す
ることができる：得られる産物は cos位を有する２つの
ゲノム末端フラグメントのフラグメントである。

【００４１】実施例８で述べたデスルフォロロバス・ア
ンビバレンス・リガーゼ調製品３μl をＴris ＨＣｌ,2
0mM,ｐＨ7.5 ；ＭｇＣｌ₂,10mM ；ジチオトレイトール
（ＤＴＴ）, 10mM；ＡＴＰ, １mM；ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）, ５％中で総容量50μl にて、56℃、１
−12時間インキュベートする。反応産物を１％アガロー
スゲルで分離し、エチジウムブロミド染料で可視化す
る。

【００４２】以下は連結反応条件の可能な変動範囲であ
る：容量： 10−200 μl 緩衝液： 10−50mM ＭｇＣｌ₂： 2−20mM ＤＴＴ： 0−20mM ＡＴＰ： 0.1mM −20mM ＰＥＧ： 0−20％温度：室温−85℃ 反応時間： 10分−１晩インキュベーションさらにアデノシン- ５'-Ｏ-(３- チオトリフォスフェー
ト)(ＡＴＰ- γ- Ｓ)，10mMまたは 100mMをこのリガー
ゼ反応に添加すると、２つのλ末端フラグメントの連結
はおこらない。これは、ＡＴＰ補助因子との明らかな競
合を示し、そしてこの酵素のＡＴＰ依存性を証明してい
る。実施例１０補助因子決定の比較この実施例では、本発明のリガーゼのＡＴＰ依存性とＮ
ＡＤ非依存性を調べる試験について述べる。比較のた
め、先行技術のリガーゼ（Ｔ４リガーゼ、Boehringer M
annheim ＧmbＨ）およびサーマス種のリガーゼ（アンプ
リガーゼ(Ampligase),Biozym製）の補助因子を調べた。

【００４３】補助因子の決定はアデニル化反応で行っ
た。これを行うため、連結用緩衝液中で、放射性標識さ
れた補助因子（³²ＰＡＴＰまたは³²ＰＮＡＤ）をリガー
ゼとともにインキュベートした。リガーゼをリン酸化
（共有結合）することにより、放射活性がこのタンパク
質に移る。ＳＤＳゲルで電気泳動後、リガーゼはオート
ラジオグラフィー操作で可視化できる。

【００４４】この手順は、Ｔ４リガーゼ緩衝液およびア
ンプリガーゼ緩衝液を使用するものであった。インキュ
ベーションは、それぞれ１時間ずつ行なった。インキュ
ベーション温度は、Ｔ４リガーゼでは37℃、アンプリガ
ーゼでは65℃、デスルフォロロバス・リガーゼでは45℃
および65℃とした。反応混合物には、Ｔ４リガーゼ１
Ｕ、アンプリガーゼ 100Ｕ、デスルフォロロバス・リガ
ーゼ10から1000ngを使用した。最初の容量は20μl とし
た。高温の場合は、混合物をオイルでカバーした。Ｔ４リガーゼ緩衝液：66mM Tris／ＨＣｌ，５mM Ｍｇ
Ｃｌ₂,１mM ＤＴＴ，ｐＨ7.5 ，20℃ アンプリガーゼ緩衝液：20mM Tris ／ＨＣｌ，50mM Ｋ
Ｃｌ，10mM ＭｇＣｌ₂１mM ＥＤＴＡ，10mM ＤＴ
Ｔ，ｐＨ7.6 ，65℃ 放射活性：Amersham³² ＰＡＴＰ，比活性：15ＴＢｑ／mmol，0.37ＭＢｑ／混
合物³² ＰＮＡＤ，比活性：37ＴＢｑ／mmol，0.37ＭＢｑ／混
合物アンプリガーゼは、予測されたようにＮＡＤ依存性であ
った。デスルフォロロバス・リガーゼは、ＡＴＰによっ
て明らかにアデニル化された。これは、補助因子として
ＮＡＤを使用したときにも、弱いシグナルを示した。し
かし、これはＮＡＤにＡＴＰが混入したためである。な
ぜならば、明らかにＡＴＰ依存性であるＴ４リガーゼも
ＮＡＤに弱いシグナルを示したからである。

【００４５】上に述べた試験によって、本発明のリガー
ゼが、既知の好熱性真正バクテリア由来のリガーゼと異
なって、ＡＴＰ依存性であることが、明確に示された。配列表（１）一般情報（ｉ）出願人（Ａ）名称：ベーリンガーマンハイムゲーエムベー
ハー（Ｂ）通り：サンジホファーシュトラーセ１１６（Ｃ）都市：マンハイム（Ｅ）国：ドイツ連邦共和国（Ｆ）郵便番号(ZIP)：6800 （Ｇ）電話：＋621 759 4348 （ii）発明の名称：古細菌由来の熱安定性リガーゼ（iii）配列の数：１４（iv）コンピュータ読取り可能形態：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリーズ＃１．
０，バージョン＃１．２５（ＥＰＡ）（vi）先行出願データ：（Ａ）出願番号：ＤＥ４２１７１３４．２（Ｂ）出願日：２３−ＭＡＹ−１９９２（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ゲノムＤＮＡ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１：

【００４６】

【化１】

【００４７】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：２：

【００４８】

【化２】

【００４９】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：３：

【００５０】

【化３】

【００５１】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：４：

【００５２】

【化４】

【００５３】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３３８２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（ix）特徴：（Ａ）特徴を表す記号：プロモーター（Ｂ）存在位置：８７８．．８８３（ix）特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：９０８．．２７０７（ix）特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ターミネーター（Ｂ）存在位置：２７１３．．２７２２（Ｄ）他の情報：／note＝"potential" （ix）特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ターミネーター（Ｂ）存在位置：２８０４．．２８１１（Ｄ）他の情報：／note＝"experimentell" （xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：５：

【００５４】

【化５】

【００５５】

【００５６】

【００５７】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６００アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：６：

【００６２】

【化６】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：７

【００６７】

【化７】

【００６８】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：８

【００６９】

【化８】

【００７０】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：９の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：９

【００７１】

【化９】

【００７２】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０

【００７３】

【化１０】

【００７４】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１

【００７５】

【化１１】

【００７６】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２

【００７７】

【化１２】

【００７８】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３

【００７９】

【化１３】

【００８０】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＳ（xi）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４

【００８１】

【化１４】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＤａｍ−Ｌ３の核酸配列を示す図である。

【図２】図１の続き。

【図３】ｐＤａｍ−Ｌ３プラスミドのクローン化および
配列決定パターンを示す図である。

【図４】制限部位を加入したｐＤａｍ−Ｌ３のプラスミ
ドを示す図である。

【図５】既知ＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列の比較を示
す図である。

【図６】図５の続き。

【図７】既知ＤＮＡリガーゼ配列を２つずつ比較したと
きの同一性（％）および配列相同性の有意性を示す図で
ある。

【図８】Ｄ．アンビバレンスに由来する全ＲＮＡの転写
実験結果を示す図である。

【図９】ｐＱＥ−Ｌ６のプラスミドを示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者ルーディガールーガードイツ連邦共和国Ｄ−8124 セーシャオプトチュトツィンガーシュトラーセ２ (72)発明者クリストフケスラードイツ連邦共和国Ｄ−8021 ドルフェンシュロスベルクウェク 11 (72)発明者コルティナカレッタドイツ連邦共和国Ｄ−8000 ミュンヘン 70 セーハオサーシュトラーセ 14 (72)発明者ミハエルヤルシュドイツ連邦共和国Ｄ−8173 バッドハイルブルン，ウンターカルプフェンセー 11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】古細菌（archaebacteria）のグループか
ら得られる熱安定性リガーゼ。
【請求項２】スルフォロバール（Sulfolobales）目の
バクテリアから得られる、請求項１のリガーゼ。
【請求項３】次のアミノ酸配列： a) 図１のアミノ酸配列、または b) 長さが５０アミノ酸以上で、リガーゼ活性を示す図
１のアミノ酸配列の一部、もしくは c) 上記配列の１つと少なくとも４０％相同であって、
リガーゼ活性を示すアミノ酸配列を含むリガーゼ。
【請求項４】ＡＴＰ依存性リガーゼであることを特徴
とする、請求項１のリガーゼ。
【請求項５】組換えプラスミドから生産されることを
特徴とする、請求項１−４のいずれかのリガーゼ。
【請求項６】デスルフロロバス・アンビバレンス（De
sulfurolobus ambivalens ）から得られる、請求項２の
リガーゼ。
【請求項７】古細菌由来の熱安定性リガーゼをコード
する核酸配列。
【請求項８】核酸の隣接した配列に２つのオリゴヌク
レオチドをハイブリダイズさせ、連結させ、そして連結
産物を検出することによって核酸を検出する方法であっ
て、請求項１のリガーゼによる連結反応を、補助因子と
してＡＴＰを使用して行うことを特徴とする方法。