CN104313152A - 荧光定量pcr反应液及试剂盒和荧光定量pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液及试剂盒和荧光定量PCR方法。所述荧光定量PCR反应液，包括如下的原料制备而成：二甲亚砜，牛血清蛋白，DNTP，10×SYBR荧光染料，10×PCR buffer，溶质体积百分数为30％的甘油溶液和Ex-Taq酶。本发明优化了PCR实验的荧光定量PCR反应液，特别是加入一定比例的甘油溶液，以保证Ex-Taq酶的活性，加入BSA与DMSO的组合保证了Tag酶的稳定性及活性并减少引物二聚体的形成，减少荧光定量PCR反应液配置时间，所得PCR反应液可以长期保存在-20℃中，使用方便。

Description

荧光定量PCR反应液及试剂盒和荧光定量PCR方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液及试剂盒和荧光定量PCR方法。
背景技术
荧光定量PCR(realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量成比例，且会随扩增产物的增加而增加。
双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。
常规的荧光定量PCR扩增体系配置，往往是将DNTP、Buffer、Ex-Taq酶等试剂单独保存，待要进行PCR扩增时，将样品分别加到同一PCR管中，在操作过程中除了经常忘记加入个别试剂的缺点外，多次的取用会对试剂造成污染，影响后续使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种减少荧光定量PCR反应液配置时间的荧光定量PCR反应液及试剂盒和荧光定量PCR方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种荧光定量PCR反应液，包括如下的原料制备而成：二甲亚砜，牛血清蛋白，DNTP，10×SYBR荧光染料，10×PCR buffer，溶质体积百分数为30％的甘油溶液和Ex-Taq酶。
本发明的另一技术方案为提供一种荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的荧光定量PCR反应液。
本发明的又一技术方案为提供一种荧光定量PCR方法，包含使用上述的荧光定量PCR反应液的步骤。
本发明的有益效果在于：本发明优化了PCR实验的荧光定量PCR反应液，特别是加入一定比例的甘油溶液，以保证Ex-Taq酶的活性，加入BSA与DMSO的组合保证了Tag酶的稳定性及活性并减少引物二聚体的形成，减少荧光定量PCR反应液配置时间，所得PCR反应液可以在-20℃下，保存时间可长达2年，现有的配置方法是将PCR反应液所需要的药品如二甲亚砜，牛血清蛋白，DNTP，Ex-Taq酶等各自保存在其最适温度中，等要配置荧光定量PCR体系时在将其混合，每次配置体系时都是现配现用，相对麻烦。本发明通过研发一种可以一次性配置荧光定量PCR反应液的又不影响其扩增效率的试剂盒。便于商业生产。实现一次配置，随时取用，大大减轻了荧光定量PCR的准备时间。
附图说明
图1为AK109848基因扩增曲线图；
图2为AK109848基因扩增溶解曲图；
图3为AK070626基因荧光定量标准曲线图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：本发明在荧光定量PCR反应液中加入甘油、BSA与DMSO保证Ex-Taq酶及其他组分的稳定性及活性，使其可以长期保存在-20°C中，可随时取用提高PCR的扩增效率。
实施例1
一种荧光定量PCR反应液，包括如下的原料制备而成：5-10μl二甲亚砜，5-10μl质量体积百分数为0.1％牛血清蛋白溶液，5-20μl 10mM DNTP溶液，10-30μl 10×SYBR荧光染料，10-30μl 10×PCR buffer，10-50μl溶质体积百分数为30％甘油溶液和3-6μl Ex-Taq酶。
一种荧光定量PCR反应液，包括如下的原料混和而成：5-10μl二甲亚砜，5-10μl质量体积百分数为0.1％牛血清蛋白溶液，5-20μl 10mM DNTP溶液，10-30μl 10×SYBR荧光染料，10-30μl 10×PCR buffer，10-50μl溶质体积百分数为30％甘油溶液和3-6μl Ex-Taq酶。
一种荧光定量PCR反应液，包括如下的原料混合而成：5-10μl二甲亚砜，5-10μl质量体积百分数为0.1％牛血清蛋白溶液，5-20μl 10mM DNTP溶液，10-30μl 10×SYBR荧光染料，10-30μl 10×PCR buffer，10-50μl溶质体积百分数为30％甘油溶液和3-6μl Ex-Taq酶。
实施例2
一种荧光定量PCR反应液，由如下的原料混合而成：7.5μl二甲亚砜，7.5μl质量体积百分数为0.1％牛血清蛋白溶液，10μl 10mM DNTP溶液，20μl 10×SYBR荧光染料，20μl 10×PCR buffer，30μl溶质体积百分数为30％甘油溶液和5μl Ex-Taq酶。将配置好的溶液混匀后离心，存放于-20℃冰箱中。
进一步的，上述的荧光定量PCR反应液中，所述10×PCR buffer包含50-200mM的PH为8.3的Tris-Hcl缓冲液，200-800mM Kcl和10-20mM Mgcl2。
实施例3本发明荧光定量PCR反应液的使用
荧光定量PCR标准曲线的制作：以水稻AK070626基因为模板制作标准曲线，按以下表1对AK070626基因进行样品稀释。
表1
稀释倍数 配置方法
标准品1 原始溶度1 1μl AK070626基因PCR扩增产物
标准品2 10 1μl标准品1+9μl双蒸水
标准品3 100 1μl标准品2+9μl双蒸水
标准品4 1000 1μl标准品3+9μl双蒸水
标准品5 10000 1μl标准品4+9μl双蒸水
标准品6 100000 1μl标准品5+9μl双蒸水
从冰箱中取出实施例2荧光定量PCR反应液，配置qRT-PCR体系，配置过程中应避免强光照射。20μl的PCR体系配置如下：2×荧光定量PCR反应液10μl，引物R 1μl，引物F 1μl，模版1μl，灭菌水7μl。配置完后可进行荧光定量PCR检测
PCR扩增程序如下：
溶解曲线分析程序如下
95℃    15s
60℃    15s
在10min内从60℃逐步升温到95℃
95℃    15s
END
对实验结果进行分析并制作标准曲线，标准曲线的Y轴为各个标准品的CT值，标准曲线的X轴为个标准品对应的Log2(稀释倍数)，其中Log2(1)＝0，Log2(10)＝3.32，Log2(100)＝6.65，Log2(1000)＝9.97，Log2(10000)＝13.29，Log2(100000)＝16.61。
图1为AK109848基因扩增曲线图，图2为AK109848基因扩增溶解曲图，图3为AK070626基因荧光定量标准曲线图，表2为不同模板的CT值，从溶解曲线图可看出扩增的PCR产物为单一条带，无非特异性产物。从标准曲线图中可看出本试剂盒具有良好的扩增效果。
表2
模板 CT值
标准品1 23.69
标准品2 19.88
标准品3 15.75
标准品4 12.84
标准品5 8.81
标准品6 4.63
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种荧光定量PCR反应液，其特征在于，包括如下的原料制备而成：二甲亚砜，牛血清蛋白，DNTP，10×SYBR荧光染料，10×PCR buffer，溶质体积百分数为30％的甘油溶液和Ex-Taq酶。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应液，其特征在于，包括如下的原料制备而成：5-10μl二甲亚砜，5-10μl质量体积百分数为0.1％的牛血清蛋白溶液，5-20μl10mM DNTP溶液，10-30μl10×SYBR荧光染料，10-30μl10×PCRbuffer，10-50μl溶质体积百分数为30％甘油溶液和3-6μl Ex-Taq酶。
3.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应液，其特征在于，包括如下的原料制备而成：7.5μl二甲亚砜，7.5μl质量体积百分数为0.1％牛血清蛋白溶液，10μl10mM DNTP溶液，20μl10×SYBR荧光染料，20μl10×PCR buffer，30μl溶质体积百分数为30％甘油溶液和5μl Ex-Taq酶。
4.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应液，其特征在于，所述10×PCR buffer包含50-200mM的PH为8.3的Tris-Hcl缓冲液，200-800mM Kcl和10-20mM Mgcl2。
5.一种荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1-4任一项所述的荧光定量PCR反应液。
6.一种荧光定量PCR方法，其特征在于，包含使用权利要求1-4任一项所述的荧光定量PCR反应液的步骤。
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