JP3927580B2 - Ｄｎａ鎖伸長方法、ｄｎａ鎖増幅方法およびｄｎａ鎖伸長用マイクロアレイ - Google Patents

Ｄｎａ鎖伸長方法、ｄｎａ鎖増幅方法およびｄｎａ鎖伸長用マイクロアレイ Download PDF

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Description

本発明は、プライマーＤＮＡ鎖を所定のプラスチック基板表面に固定化してＤＮＡ鎖を伸長するＤＮＡ鎖伸長方法およびＤＮＡ鎖増幅方法、ならびにこれらの方法に用いられるＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイに関する。
非特許文献１には、所定のアミノ−シラン試薬を用いて修飾されたガラス基板の表面に、プライマーとなるＤＮＡ鎖を共有結合させたＤＮＡマイクロアレイにて固相ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によるＤＮＡ増幅を行う技術が開示されている。
また、非特許文献２には、ガラス基板の代わりにポリ（メチルメタクリレート）を用いて、表面にＤＮＡ断片を固定化させたＤＮＡマイクロアレイを用いて、所定のＤＮＡ鎖とのハイブリッド特性およびＰＣＲ様環境下における熱安定性が評価されており、新規のＰＣＲ技術に適用できるデバイスの可能性を示唆する記載がなされている。
Adessi, Celine et al, "Solid phase DNA amplification: Characterisation of primer attachment and amplification mechanisms", Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 20, No. 20, e87 Fixe, F. et al, "Functionalization of poly(methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays", Nucleic Acids Research, 2004, January 12, Vol. 32, No.1, e9
本発明者等は、非特許文献１，２などに代表される様々なＤＮＡマイクロアレイを用いてＭＰＥＣ法（Multiple Primer Extension on a Chip）によるＤＮＡ鎖伸長反応を行ったところ、プライマーに鋳型ＤＮＡ鎖を結合させて、すなわちアニール処理してＤＮＡ鎖を伸長させた後に、熱変性処理を行うと鋳型ＤＮＡと共にDNAマイクロアレイ基板に固定したプライマーが脱落するという現象を見出し、表面に所定の高分子物質を配した基板を用いることでこの問題を解決して本発明の完成に至った。
本発明に係るＤＮＡ鎖伸長方法は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体を最表面に有するプラスチック材料からなる基板に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させ、
所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、
前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げ、
前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、
全処理を同一の液相系で行うことを特徴としている。
このように、所定の基板にプライマーを固定化させて、このプライマーに鋳型ＤＮＡ断片をアニールさせて、あるいは鋳型ＲＮＡ断片をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ鎖伸長反応を行うと、反応後の熱変性処理にて基板上で二本鎖となっているＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片が外れて、プライマーから伸長した一本鎖ＤＮＡが基板上で残るようになる。
また、従来ではアニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を除くための洗浄処理が必要であったが、基板上に非特異的に吸着するＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片がないため、およびこのことがＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効に行われると推測され、伸長反応の前に基板の洗浄処理が不要になる。
また、従来において、ハイブリダイゼーション、洗浄、および酵素およびモノマー添加伸長の各処理を行っていたように、ハイブリダイゼーションと伸長反応とを別々の液相で行っていたのを、本発明においてはハイブリダイゼーションと伸長反応とを同じ液相で行うことが可能になる。
このＤＮＡ鎖伸長方法において、基板の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかにすることができる。
このように、基板の表面にリン脂質と同様の環境を設けることで、基板表面で起こるＤＮＡ鎖伸長反応が細胞内と同等の環境下で行うことが可能になる。したがって、ＤＮＡ鎖伸長を、よりマイルドな条件で行うことが可能になる。
前記のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記プライマーは、所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えたＤＮＡ断片であってもよい。
これにより、本発明のＤＮＡ鎖伸長方法を、一塩基置換多型（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphisms）解析に適用することができるようになる。
また、前記のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記プライマーは所定数の塩基配列からなり、各々のプライマーは全組合せのそれぞれの配列を有するＤＮＡ断片であってもよい。
これにより、本発明のＤＮＡ鎖伸長反応を、ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定（ＳＢＨ：sequencing by hybridization）解析に適用することができるようになる。
また、前記のＤＮＡ鎖伸長方法において、
前記鋳型ＤＮＡ断片は、所定のＲＮＡを逆転写酵素で処理して得られるｃＤＮＡ断片であってもよい。
これにより、本発明のＤＮＡ鎖伸長反応を、遺伝子発現プロファイル（gene expression profile）解析に適用して、通常の解析において手間と時間がかかるサンプル調製をほとんど行うことなく、ゲノムＤＮＡ又は全ＲＮＡからの逆転写産物ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用い簡便な操作で行うことができるようになる。
また、本発明に係るＤＮＡ鎖増幅方法は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体を最表面に有するプラスチック材料からなる基板に、ＤＮＡ増幅用のプライマーを固定化させ、
所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、
前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げ、
前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、
ＤＮＡ鎖の熱変性処理を行って、
および必要に応じてＤＮＡ鎖のアニール処理、伸長反応および熱変性処理を行い、
全処理を同一の液相系で行うことを特徴としている。
このように、所定の基板にプライマーを固定化させて、このプライマーに鋳型ＤＮＡ断片をアニールさせて、あるいは鋳型ＲＮＡ断片をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ鎖伸長反応を行うと、反応後の熱変性処理にて基板上で二本鎖となっているＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片が外れて、プライマーから伸長した一本鎖ＤＮＡが基板上で残るようになり、鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片は次のアニール処理で未反応のプライマーと二本鎖を形成して、次のＤＮＡ鎖伸長を行う。これを繰り返すことにより、ＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖増幅反応を行うことができるようになる。
また、従来ではアニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を除くための洗浄処理が必要であったが、基板上に非特異的に吸着するＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片がないため、およびこのことがＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効に行われると推測され、伸長反応の前に基板の洗浄処理が不要になる。
また、従来において、ハイブリダイゼーション、洗浄、および酵素およびモノマー添加伸長の各処理を行っていたように、ハイブリダイゼーションと伸長反応とを別々の液相で行っていたのを、本発明においてはハイブリダイゼーションと伸長反応とを同じ液相で行うことが可能になる。
このＤＮＡ鎖増幅方法において、基板の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかにすることができる。
このように、基板の表面にリン脂質と同様の環境を設けることで、基板表面で起こるＤＮＡ鎖増幅反応が細胞内と同等の環境下で行うことが可能になる。したがって、ＤＮＡ鎖増幅を、よりマイルドな条件で行うことが可能になる。
また、本発明に係るＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体を最表面に有するプラスチック材料からなる基板と、
前記基板の最表面に固定化されたＤＮＡ増幅用のプライマーとを含むものである。
このように、所定の基板にプライマーを固定化させて、このプライマーに鋳型ＤＮＡ断片をアニールさせて、あるいは鋳型ＲＮＡ断片をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ鎖伸長反応を行うと、反応後の熱変性処理にて基板上で二本鎖となっているＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片が外れて、プライマーから伸長した一本鎖ＤＮＡが基板上で残るようになる。
また、従来ではアニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を除くための洗浄処理が必要であったが、基板上に非特異的に吸着するＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片がないため、およびこのことがＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効に行われると推測され、伸長反応の前に基板の洗浄処理が不要になる。
また、従来において、ハイブリダイゼーション、洗浄、および酵素およびモノマー添加伸長の各処理を行っていたように、ハイブリダイゼーションと伸長反応とを別々の液相で行っていたのを、本発明においてはハイブリダイゼーションと伸長反応とを同じ液相で行うことが可能になる。
このＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、基板の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかにすることができる。
このように、基板の表面にリン脂質と同様の環境を設けることで、基板表面で起こるＤＮＡ鎖伸長反応が細胞内と同等の環境下で行うことが可能になるとともに、洗浄処理が不要であることにも寄与する。したがって、ＤＮＡ鎖伸長を、よりマイルドな条件で行うことが可能になる。
本発明によれば、ＤＮＡマイクロアレイ上でＤＮＡ鎖の伸長反応を行って二本鎖にした後に、熱変性処理にてＤＮＡマイクロアレイの基板上で一本鎖ＤＮＡを残すことができるようになる。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
（第一の実施形態）
図１は、第一の実施形態としてのＤＮＡ鎖増幅方法の手順を示すフローチャートである。
このＤＮＡ鎖増幅方法は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を最表面に有する基板に、ＤＮＡ増幅用のプライマー（以下、「プライマー」という）を固定化させ（ステップＳ１０）、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ（ステップＳ３０）、この反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げ（ステップＳ４０）、当該反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い（ステップＳ５０）、ＤＮＡ鎖の熱変性処理を行って（ステップＳ６０）、必要に応じてＤＮＡ鎖のアニール処理、伸長反応および熱変性処理を行う（ステップＳ４０〜ステップＳ６０の繰り返し）ものである。さらに、これら各処理を同一の液相系で行う。
ステップＳ１０では、図２に示したように、基板１２の表面にＤＮＡ増幅用のプライマー１４を固定させる。
ここで使用される基板の最表面には、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基板表面における鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
なお、ここでは基本骨格として下記式（ａ）に示すホスホリルコリン基である例を挙げたが、このホスホリルコリン基を下記式（ｂ）のホスホリルエタノールアミン基、下記式（ｃ）のホスホリルイノシトール基、下記式（ｄ）のホスホリルセリン基、下記式（ｅ）のホスホリルグリセロール基、下記式（ｆ）に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基などのリン酸基に置き換えてもよい（以下についても同様）。
Figure 0003927580
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
カルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
Figure 0003927580
 （ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
Figure 0003927580
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
Figure 0003927580
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
表面にプライマーが固定化される基板の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組合せとして、たとえば、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
また、本実施形態の基板のコーティング層に使用される高分子物質は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
Figure 0003927580
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＤＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基板表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基板上への鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して基板上に導入することができる。
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
また、基板として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
なお、基板の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
次に、基板の表面へのプライマーの固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを基板の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
上記工程（ｉ）において、鋳型ＤＮＡ断片とアニールするプライマーを基板上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
このプライマーを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
また、点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外のプラスチック基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
また、基板に固定化するプライマーには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
以上により、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を最表面に有する基板と、基板の最表面に固定化されたＤＮＡ増幅用のプライマーとを含むＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ、すなわち図２に示したような基板１２の最表面上にプライマー１４が固定化されたＤＮＡマイクロアレイ１０が得られる。
図１に戻り、ステップＳ２０では、ステップＳ１０で得られるＤＮＡマイクロアレイ１０の基板１２の表面に固定化されたプライマー１４にアニールさせるＤＮＡ鎖伸長用の鋳型ＤＮＡ断片１６およびＤＮＡ鎖伸長用酵素系、ヌクレオチドモノマーを含む試料が導入される。また、ＤＮＡ増幅用に用いる鋳型としてＤＮＡ断片の代わりに、鋳型ＲＮＡ断片を用いても同様の作用効果を有する。
この導入された試料からなる反応系としては、鋳型がＤＮＡ断片である場合には、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかを用い、また鋳型がＲＮＡ断片である場合には、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかの存在下で、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなど）を含有するＭＰＥＣ用バッファを用いることができる。
また、ＤＮＡポリメラーゼの中でも、特に耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどを用いることもできる。
また、これらヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡ断片のアデニン（Ａ）に対応する伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行うことができるようになる。
なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよく、また複数の種類のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ATP、P32-ｄATP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、biotin-dUTP、DIG-dUTP）を使用してプライマーを伸張させた後、蛍光標識化したアルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによってＤＮＡを検出することができる。
ステップＳ３０では、試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する鋳型ＤＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
続いて、ステップＳ４０では、反応系の温度をプライマーと鋳型ＤＮＡ断片とがアニールする温度（アニール温度）、例えば４℃〜６５℃、好ましくは５０℃〜６５℃まで下降させる。このアニール処理により、鋳型ＤＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するプライマーと、この鋳型ＤＮＡ断片とが二本鎖になる（図３）。この反応系に対して、洗浄処理を行わずにそのままステップＳ５０に進む。
ここで、従来では、アニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片（またはＲＮＡ断片）を除くため、の洗浄処理が必要であったが、本実施形態では、基板上に非特異的に吸着するＤＮＡ断片（またはＲＮＡ断片）がないため、およびこのことがＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効に行われると推測され、基板の洗浄処理が不要になる。このようにして、ハイブリダイゼーション、洗浄、および酵素およびモノマー添加伸長の各処理を行っていたように、ハイブリダイゼーションと伸長反応とを別々の液相で行っていたのを、本実施形態では、ハイブリダイゼーションと伸長反応とを同一の液相系、すなわち反応系をそのまま用いることができる。
ステップＳ５０では、アニール処理を行った反応系の温度を、前記アニール処理温度から前記熱変性処理温度まで徐々に上昇させるよう制御する。あるいは、当該反応系の温度を、前記アニール処理温度と前記熱変性処理温度との間の所定の温度、例えば６５℃〜７５℃に変化させるように制御する。このように反応系の温度を制御することにより、ＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖の伸長反応が起こる、すなわち鋳型ＤＮＡ断片１６に相補的なＤＮＡ断片が、基板上に形成され、ＤＮＡの二本鎖が得られるようになる（図４）。
ここでは、鋳型ＤＮＡ断片に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた例を示したが、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素であれば特に限定はされない。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片など）、α型ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９７／２４４４４号パンフレット記載のＤＮＡポリメラーゼ）等が挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ＤＮＡリガーゼを用いてもＤＮＡ鎖伸長反応を行うことができるため、ＤＮＡ鎖増幅を行うことが可能である。
また、鋳型ＲＮＡ断片を用いた場合、鋳型ＲＮＡ断片に直接基板上のプライマーを作用させて、逆転写酵素を用いて、プライマー側にＤＮＡ鎖伸長させることが可能である。また、鋳型ＲＮＡ断片に逆転写酵素を作用させて一旦ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を合成（第一鎖合成）してから、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼを作用させても、プライマー側にＤＮＡ鎖伸長させることが可能である。
図１に戻り、ステップＳ６０では、伸長反応後の反応系を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度、例えば９０℃〜９５℃で維持する。この熱変性処理により、基板１２の表面では二本鎖ＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片１６（図４）が脱離して、一本鎖ＤＮＡ断片１８が残された状態になる（図５）。
ステップＳ７０では、次の伸長反応を行うか否かが判別される。この判別は、温度調整装置（サーモサイクラー）などを用いて反応回数を指定してその回数に達したか否かを自動で行ってもよいし、毎回操作者の判断により行ってもよい。
この判別結果がＹＥＳ、すなわち次の伸長反応を行う場合にはステップＳ４０に戻り、アニール処理（ステップＳ４０）〜伸長反応（ステップＳ５０）〜熱変性処理（ステップＳ６０）が繰り返され、未反応のプライマーでＤＮＡ伸長反応が行われる。このサイクルを１〜５０回繰り返す結果、基板上でＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖増幅が行われる。
また、ステップＳ７０での判別結果がＮＯ、すなわち次の伸長反応を行わない場合には、ステップＳ８０に進み、反応液を捨てて、ＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了する。
このＤＮＡ鎖増幅のためには、基板上の一定の区画内に複数のスポットを設けておき、各スポットにプライマーを固定化しておき、マイクロアレイを形成しておくことが好ましい。
また、基板の表面に固定化させるＤＮＡ増幅用プライマーの長さを目的や用途に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
（第二の実施形態）
図６は、第二の実施形態としてのＤＮＡ鎖伸長方法の手順を示すフローチャートである。図６において、図１と手順が同様な部分については、図１と同様の符号を付して、説明を省略する。
このＤＮＡ鎖伸長方法は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を最表面に有する基板に、ＤＮＡ伸長用のプライマー（以下、「プライマー」という）を固定化させ（ステップＳ１０）、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ（ステップＳ３０）、この反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ（ステップＳ４０）、この反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い（ステップＳ５０）、ここまでの各処理を同一の液相系で行うものである。
前述したように、ステップＳ２０では、基板の表面に固定化されたプライマーにアニールさせるＤＮＡ伸長用の鋳型ＤＮＡ断片およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、この試料およびこの試料が導入されてなる反応系は、前述したのと同様のものを適用することができる。
また、ステップＳ５０での伸長反応の後に、ステップＳ５５にて反応液を捨てて、ＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了する。
以下に、本実施形態のＤＮＡ鎖伸長方法の適用例について説明する。
（ＳＮＰ解析）
所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列と相補的な配列を完全マッチ配列とするとき、プライマーをこの完全マッチ配列の一塩基を他の塩基に置き換えることで、ＳＮＰ解析を行うことが可能になる。なお、プライマーは２５塩基以内の長さを有するものを用いることが好ましい。
すなわち、ステップＳ１０にて、ある着目遺伝子の特徴配列と一塩基だけミスマッチとなるＤＮＡ断片をプライマーとして基板の表面に固定化する。このとき、例えば３８４穴（各穴２５６スポット）、９６穴（各穴１０２４スポット）のマイクロアレイを用いて、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、この特徴配列を含むＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかり、前記着目遺伝子の特徴配列を含む鋳型ＤＮＡ断片に対する一塩基多型を解析することが可能になる。
（ＳＢＨ解析）
所定数、例えば６〜１０ｍｅｒ、好ましくは８ｍｅｒの塩基配列を有するプライマーを、全組合せ、例えば８ｍｅｒのプライマーを用いた場合には、全組合せである４8＝６５５３６種類のプライマーを用意して、各々のプライマーがマイクロアレイのひとつのスポットに固定化させることにより、塩基配列決定（ＳＢＨ）解析を行うことが可能になる。
すなわち、ステップＳ１０にて前記の各プライマーをマイクロアレイの各スポットにそれぞれ固定化する。このとき、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、未知の塩基配列のＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかる。
ここで、図７に示したように、基板４１上で伸長反応が起こったスポットを検出した後、検出されたスポットに固定化されているプライマーのランダム配列群４５の各配列を取り出し、配列の前後で一塩基ずらしてオーバーラップするように順番付けして順番付け配列群４７が得られる。この順番付け配列群４７に示された順番にしたがって、各プライマーの先頭の塩基を読んで行き、最後のプライマーについては全塩基配列を読んで得られる塩基配列に基づいて、未知の塩基配列４３を有する鋳型ＤＮＡ断片の塩基配列４９を決定することができる。
なお、プライマーが６塩基長の場合は４０９６種類のプライマーを用意する必要があり、プライマーが７塩基長の場合は１６３８４種類のプライマーを用意する必要がある。これらのプライマーは、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡおよびマイクロ（ｍｉ）ＲＮＡなどの２０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒの比較的小分子の探索、遺伝子配列解析に用いることができる。
また、プライマーが８塩基長の場合は６５５３６種類のプライマーを用意する必要があり、プライマーが９塩基長の場合および１０塩基長の場合は、それぞれ２６２１４４および１０４８５７６種類のプライマーを用意する必要がある。これらのプライマーは、通常の遺伝子配列解析に用いることができる。
（遺伝子発現プロファイル解析）
図８は、遺伝子発現プロファイル用サンプルとして、ラベルを導入したサンプルを調整および発現プロファイル解析するための従来の方法を示す。
目的に応じた生体組織から全ＲＮＡ（totalＲＮＡ）を抽出する。さらに全ＲＮＡからは逆転写酵素を用いた反応によって、ｃＤＮＡを合成する（第一鎖合成）。逆転写酵素を用いた反応の際にはｄＮＴＰとアミノアリルｄＵＴＰを一定の割合で混合したものを加えて、アミノアリルｄＵＴＰを取り込んだｃＤＮＡを合成する。
なお、組織から得た全ＲＮＡ量が少ない場合は、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、2本鎖のｃＤＮＡ（転写鋳型ＤＮＡ断片）を合成し（第二鎖合成）、それを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを作用させてアンチセンス鎖のＲＮＡ（ａＲＮＡ）を増幅する。このＲＮＡ増幅の際にｄＮＴＰとアミノアリルｄＵＴＰとを一定の割合で混合したものを加えることで、アミノアリルｄＵＴＰを取り込んだａＲＮＡを合成することができる。
続いて、上記のｃＤＮＡまたはアンチセンスアミノアリルＲＮＡ（ａＲＮＡ）をエタノール沈殿した後、０．２Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（NaHCO3−Na2CO3（pH9．0））に溶解する。ＤＭＳＯに溶解しておいた蛍光色素（Ｃｙ３またはＣｙ５）を加えて、常法に従い、ｃＤＮＡまたはａＲＮＡに取り込ませておいたアミノアリルｄＵＴＰとカップリング反応させ、ｃＤＮＡまたはａＲＮＡを蛍光標識する。遊離の蛍光色素をゲルろ過カラムまたはフィルターなどを用い常法の精製により除去した後、ａＲＮＡについてはさらにフラグメンテーションバッファー（終濃度０．０４Ｍ酢酸トリアミノメタン（ｐＨ８．１）、０．１Ｍ酢酸カリウム、０．０３Ｍ酢酸マグネシウム）を加えて９５℃で１５分間反応後、クラッシュアイスで急冷してａＲＮＡを断片化する。ゲル電気泳動などの方法によりフラグメント化を確認した後、ゲルろ過フィルターで精製・濃縮する。
次に、調製したｃＤＮＡまたはａＲＮＡとマイクロアレイのプライマーとのハイブリダイゼーションを行う。ｃＤＮＡまたはａＲＮＡにハイブリダイゼーションバッファー（最終濃度５×ＳＳＣ、０．５（ｖ／ｖ）％ＳＤＳ、４×Denhardt's solution）及びホルムアミド（Formamide）を適宜混合し、ＤＮＡマイクロアレイと４５℃〜６０℃で一晩ハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ−０．１（ｖ／ｖ）％ＳＤＳ溶液、２×ＳＳＣ溶液、１×ＳＳＣ溶液で５分間ずつ洗浄したのち、蛍光読取装置(例えば、CRBIO(r) IIe；日立ソフトウエアーエンジニアリング製)を用いて画像をスキャンし、解析ソフト（例えば、DNASIS(r)Array；日立ソフトウエアーエンジニアリング製）を用いてシグナル強度を定量化する。
なお、図８においては、ａＲＮＡの合成を示しているが、途中の工程で得られるｃＤＮＡが解析に十分な量であれば、このｃＤＮＡを直接解析してもよい。
この方法では、複雑な前処理工程を行うため、それぞれの試料で条件選定など設定条件が多くなる上に、全工程で少なくとも５日〜一週間はかかってしまうのが迅速な遺伝子検査の上で問題であった。
そこで、本実施形態では、予め図１のステップＳ１０と同様の方法にて基板の表面に、解析対象となる遺伝子の特徴配列に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、各々のプライマーをマイクロアレイのひとつのスポットに固定化させておく。そこで、全ＲＮＡに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを得る第一鎖合成を行った後に、第一鎖合成により得られるｃＤＮＡ（または必要に応じて増幅させて得られるａＲＮＡ）を鋳型ＤＮＡ断片として用いて、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼの作用により基板上のプライマー側で伸長反応を行うことで、発現遺伝子を特定することが可能になる。
また、前述のように、全ＲＮＡを鋳型として、前記の基板上に設けられた所定の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせて、逆転写酵素を作用させることで、直接基板上のプライマー側で伸長反応を行うことが可能であり、これによっても発現遺伝子を特定することが可能になる。
すなわち、既知の遺伝子が有する特徴配列と相補的な塩基配列を有するプローブが、特定の細胞由来の全ＲＮＡから得られる鋳型ＤＮＡ断片中に存在するか否かが分かる。
すなわち、全ＲＮＡに対するｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用いる例をとって説明すると、ステップＳ１０にて前記の各プライマーをマイクロアレイの各スポットにそれぞれ固定化する。このとき、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、前述したようにして得られる所定の全ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかり、全ＲＮＡがどの遺伝子から発現されて得られたものであるか、すなわち遺伝子発現プロファイルを解析することが可能になる。
この方法によれば、遺伝子発現プロファイル（gene expression profile）解析を、通常の解析において手間と時間がかかるサンプル調製をほとんど行うことなく、ゲノムＤＮＡ又は全ＲＮＡからの逆転写産物ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用い簡便な操作で行うことができるようになる。
以上の用途のほかには、
マイクロサテライト解析、染色体異常解析（ＣＧＨ：Comparative Genomic Hybridization）、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡ探索などの遺伝子解析用基本ツールへの適用；
これらツールを使用した臓器・疾患別遺伝子発現解析チップ、変異原性試験キット（環境ホルモン）、遺伝子組換え食品検査キット、ミトコンドリア遺伝子配列解析キット、親子鑑定・犯罪捜査のための解析キット、先天性疾患解析キット、染色体・遺伝子異常解析キット、遺伝子診断（着床前・出生前）キット、薬物反応関連遺伝子多型解析キット、脂質代謝関連遺伝子多型解析キット、耳鼻科・眼科領域遺伝子多型解析キットなどの用途別カスタムチップへの適用；
ガン予後予測チップ、医薬品開発（臨床・創薬）用チップ、健康食品開発用チップなどの診断・臨床用カスタムチップへの適用；
微生物限度試験や食品飲料水中の微生物検査などの薬品・食品製造工程、およびう蝕・歯周病関連菌の検出、日和見感染菌の検出などの歯科領域の臨床検査、および食品工場・厨房施設環境検査、飲料・公衆浴場、井戸水などの水質検査における環境検査、および感染症・食中毒の予防、会社従業員の衛生管理などの保健衛生、および耐性菌を含む一般細菌同定、肝炎ウイルス、ヘリコバクターピロリ、肝炎クラミジア菌、エイズウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ウエストナイルウイルス、ノロウイルス（生カキ由来の食中毒）、インフルエンザウイルス、真菌・カビなどの臨床検査などの微生物同定検査キットへの適用
などが挙げられる。
（実験例１）
以下の手法にて、プライマーを、本実施形態に対応するプラスチックおよびガラス基板、および従来の基板に対応するアルデヒド基板の各基板の表面に固定化して、各基板上でＤＮＡ鎖伸長反応を行って、プライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を検出した。
（プラスチック基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
（ガラス基板の製造）
通常のガラス基板を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、ガラス基板を得た。
（アルデヒド基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドグラス形状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板が得られた。
（プライマー固定）
５'末端がアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡ（２０塩基鎖）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板およびガラス基板、およびアルデヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした各基板を、２００μｌの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中で一昼夜浸して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。
（ＤＮＡ鎖伸長反応）
図６のステップＳ２０で導入する鋳型ＤＮＡ断片として、所定の５０ｍｅｒの、予め５'末端をＣｙ５にて標識したＤＮＡ断片を用いて、鋳型ＤＮＡ断片の濃度が１００ｐＭとなるような反応系とした。また、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系として、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製Ex Taq）を用いた。
続いて、図６のステップＳ３０の熱変性処理、ステップＳ４０のアニール処理、ステップＳ５０の伸長反応をそれぞれ９５℃５分（変性）−９５℃１分（変性）−５０℃３分（アニール）−９５℃１分（変性）とした。
以下、サンプル中にＣｙ３−ｄＵＴＰを含めておいて各基板において行ったＤＮＡ鎖伸長反応検出におけるＣｙ３−ｄＵＴＰ由来の蛍光強度を測定した結果を表１に示す。
Figure 0003927580
本実施形態に対応するプラスチック基板およびガラス基板では、基板上でのＤＮＡ鎖伸長が検出された一方で、従来の基板に対応するアルデヒド基板ではＤＮＡ鎖伸長は検出されていないと考えられる。
（実験例２）
実験例１でＤＮＡ鎖伸長が検出されたプラスチック基板を用いて、２０ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、３０ｍｅｒの各プローブについてＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖伸長を１サイクル、５サイクル、１０サイクル、２０サイクルで行って、ＤＮＡ鎖増幅反応を行って、各区切りのサイクル終了後に蛍光強度を測定した。
なお、図１のステップＳ３０の熱変性処理、ステップＳ４０のアニール処理、ステップＳ５０の伸長反応、ステップＳ６０の熱変性処理をそれぞれ９５℃５分（変性；初回のみ）〜９５℃１分（変性）〜５０℃３分（アニール）〜９５℃１分（変性）とした。
以下に、結果を表２に示す。
Figure 0003927580
所定の高分子物質で表面処理したプラスチック基板では、いずれの長さのプローブであってもＤＮＡ鎖増幅が検出された。
（実験例３）
図９に示したように、5'-Cy5-AAGGCGGGAGGGAGCGCAATCCGGGAGTTTACAAATGGACAAACTTCTAT-3'の５'位から２１番目の塩基Ｃを変異部位としたＳＮＰタイピングを行う目的で、計５種類のプローブ（２１ｍｅｒ）を設計し、プラスチック基板上に固定化した。このマイクロアレイを用いて、ＭＰＥＣ（multiple primer extension on a chip）反応によるＳＮＰタイピング（伸張反応）を行う。
このＳＮＰタイピングは、ＤＮＡポリメラーゼ（０．０５Ｕ／ｍｌ）、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（０．０５ｍＭ）、５０μｌのＰＣＲバッファ中にｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（各０．２ｍＭ）の存在下で、９５℃（１分）〜５０℃（３分）の温度サイクルで行う。
この伸長反応の結果、上記の５０ｍｅｒのＤＮＡ断片をターゲットとして、このターゲットと相補的な配列を有する完全マッチ配列プローブのみが伸長し、その結果蛍光発色する。
（実験例４）
実験例１のＭＰＥＣ反応をｐ５３ガン抑制遺伝子の検出に応用する。
このｐ５３遺伝子の異常は大腸がんや肺がんで高頻度に求められており、ｐ５３遺伝子に異常（一塩基多型：ＳＮＰ）があると、抗がん剤が効きにくくなり、ガン細胞の細胞死（アポトーシス）を起こせずガン細胞が増殖することになる。
そこで、正常なｐ５３遺伝子およびがん細胞のｐ５３遺伝子を用いたＳＮＰタイピング（伸張反応）を行う。ｐ５３遺伝子の９９３番目と１０６９番目に変異があることは公知であり、この位置の塩基を３'末端とし、Ｔｍ値をほぼ一定となるようなプローブ設計を行い、プラスチック基板上に固定する。設計した計１６種のプローブ5'-ATGGGCGGCATGAACN-3', 5'-TGAGGATGGGCCTCCN-3', 5'-GGAACAGCTTTGAGGTGCN-3', 5'-CCAGGACAGGCACAAACAN-3' (N=A,G,C,T)を用い、ＭＰＥＣ反応によるＳＮＰタイピングを行う。
（実験例５）
ＳＢＨ法による塩基配列決定解析のシミュレーション実験を行う。
図１０に示したように、３'末端がＣｙ５でラベルされた５０塩基長のターゲットの塩基配列が決定できるように、一塩基ずつ３'末端方向にずらした８塩基（８ｍｅｒ）のプローブ（計５０）をプラスチック基板上に固定したマイクロアレイを用いて、ＭＰＥＣ反応によるＳＢＨを行う。各プローブの３'末端の一塩基にミスマッチを設定した８塩基（８ｍｅｒ）の５０種類のプローブも加え基板上に固定した。このＳＢＨシュミレーション用アレイを用いた塩基配列決定を行う。
本発明の第一の実施形態に係るＤＮＡ鎖増幅方法を示すフローチャートである。 第一の実施形態で用いるＤＮＡマイクロアレイの一部を模式的に示す図である。 ＤＮＡマイクロアレイのプライマーに鋳型ＤＮＡをアニールさせた状態を示す図である。 プライマー上でＤＮＡ鎖の伸長反応を行った状態を示す図である。 伸長反応後得られた二本鎖を変性した状態を示す図である。 本発明の第二の実施形態に係るＤＮＡ鎖伸長方法を示すフローチャートである。 第二の実施形態の一適用例を示す図である。 従来の遺伝子発現プロファイル解析の一例を示す図である。 第二の実施形態のその他の一適用例を示す図である。 第二の実施形態のその他の一適用例を示す図である。
符号の説明
１０ ＤＮＡマイクロアレイ
１２ 基板
１４ プライマー
１６ 鋳型ＤＮＡ断片
１８ 一本鎖ＤＮＡ断片

Claims (24)

  1. ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体を最表面に有するプラスチック材料からなる基板に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させ、
    所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、
    前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げ、
    前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、
    全処理を同一の液相系で行うことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  2. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記反応系で、アニール処理してＤＮＡ鎖の伸長反応を行うまでに洗浄処理が介在しないことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  3. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記鋳型がＤＮＡ断片である場合に、前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかであることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  4. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記鋳型がＲＮＡ断片である場合に、前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかであることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  5. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記ＤＮＡ鎖伸長反応は、前記反応系の温度を、前記アニール処理温度から前記熱変性処理温度まで徐々に上昇させて行われることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  6. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記ＤＮＡ鎖伸長反応は、前記反応系の温度を、前記アニール処理温度と前記熱変性処理温度との間の所定の温度に変化させて行われることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  7. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記プライマーは、所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えたＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  8. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記プライマーは所定数の塩基配列からなり、各々のプライマーは全組合せのそれぞれの配列を有するＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  9. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記鋳型ＤＮＡ断片は、所定のＲＮＡを逆転写酵素で処理して得られるｃＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  10. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記反応系に導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  11. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記プライマーが、前記基板の前記ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基のｐ−ニトロフェニル基の部位で共有結合して、当該基板の最表面に固定化されることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  12. 請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、
    前記基板が、飽和環状ポリオレフィン樹脂からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
  13. ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体を最表面に有するプラスチック材料からなる基板に、ＤＮＡ増幅用のプライマーを固定化させ、
    所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、
    前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げ、
    前記反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、
    ＤＮＡ鎖の熱変性処理を行って、
    および必要に応じてＤＮＡ鎖のアニール処理、伸長反応および熱変性処理を行い、
    全処理を同一の液相系で行うことを特徴とするＤＮＡ鎖増幅方法。
  14. 請求項１３に記載のＤＮＡ鎖増幅方法において、
    前記反応系で、アニール処理してＤＮＡ鎖の伸長反応を行うまでに洗浄処理が介在しないことを特徴とするＤＮＡ鎖増幅方法。
  15. 請求項１３に記載のＤＮＡ鎖増幅方法において、
    前記鋳型がＤＮＡ断片である場合に、前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかであることを特徴とするＤＮＡ鎖増幅方法。
  16. 請求項１３に記載のＤＮＡ鎖増幅方法において、
    前記鋳型がＲＮＡ断片である場合に、前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかであることを特徴とするＤＮＡ鎖増幅方法。
  17. 請求項１３に記載のＤＮＡ鎖増幅方法において、
    前記反応系に導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＤＮＡ鎖増幅方法。
  18. 請求項１３に記載のＤＮＡ鎖増幅方法において、
    前記プライマーが、前記基板の前記ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基のｐ−ニトロフェニル基の部位で共有結合して、当該基板の最表面に固定化されることを特徴とするＤＮＡ鎖増幅方法。
  19. 請求項１３に記載のＤＮＡ鎖増幅方法において、
    前記基板が、飽和環状ポリオレフィン樹脂からなることを特徴とするＤＮＡ鎖増幅方法。
  20. ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する第二単量体と、ブチルメタクリレート基を有する第三単量体との共重合体を最表面に有するプラスチック材料からなる基板と、
    前記基板の最表面に固定化されたＤＮＡ増幅用のプライマーとを含むＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
  21. 請求項２０に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
    前記基板が、飽和環状ポリオレフィン樹脂からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
  22. 請求項２０に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
    前記プライマーは、５〜５０個の塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
  23. 請求項２０に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
    前記プライマーが、前記基板の前記ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基のｐ−ニトロフェニル基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化されることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
  24. 請求項２０に記載のＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイにおいて、
    前記基板には一定の区画内に複数のスポットが設けられており、各スポットにプライマーが固定化されていることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
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