JPWO2014073674A1 - 糸状菌の高密度培養株を用いた有用物質生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年11月9日に出願された、日本国特許出願第2012−247276号明細書(その開示全体が参照により本明細書中に援用される)に基づく優先権を主張する。
本発明は、糸状菌を用いた有用物質の生産方法に関する。
項1.α−1,3−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。
α−1,3−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法
を提供する。
本発明において、「α−1,3−グルカンを発現しない変異型の糸状菌」とは、糸状菌の変異株であって、α−1,3−グルカンを全く発現しないものだけでなく、α−1,3−グルカンを実質的に発現しないものも包含する。より具体的には、α−1,3−グルカンを実質的に発現しない変異株とは、ごくわずかにα−1,3−グルカンを発現するにとどまり、本発明の効果である菌体の凝集が有意に抑制されている変異株を示し、例えば、α−1,3−グルカンの発現量が野生株の30%以下、より好ましくは野生株の10%以下である株等が挙げられる。
本発明の方法は、α−1,3−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程を含む。当該工程で用いる培地としては、特に限定されず、糸状菌の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、CD最小培地、YPD培地、TSB培地、モルト培地、PDA培地等が挙げられる。上記培地には、炭素源として、グルコース、でんぷん、可溶性でんぷん等を添加してもよい。かかる炭素源の添加量としては特に限定されないが、例えば、0.5〜10%、より好ましくは1〜4%の範囲で適宜設定できる。培養温度は特に限定されず、20〜45℃、より好ましくは25〜37℃の範囲で適宜設定できる。培養時間も特に限定されないが、例えば、12〜72時間、より好ましくは24〜48時間の範囲で適宜設定できる。
agsA遺伝子の破壊カセットを構築するために、第1ラウンドのPCRで、5’非コード領域(アンプリコン1)及びコード領域(アンプリコン2)を含む遺伝子断片をA.nidulans ABPU1ゲノムDNAテンプレートから増幅し、pyrG遺伝子(アンプリコン3)をA.oryzaeゲノムDNAテンプレートから増幅した。アンプリコン1は、プライマーagsA−LU(5’-AGTGGAGGAGTTAGGGAGTGAT-3’(配列番号5))及びagsA−LL(5’-CACAGGGTACGTCTGTTGTGAAAGAGTAAGGTAGAAGCCCC-3’(配列番号6))を用いて増幅し、アンプリコン2は、agsA−RU(5’-TTCTTCTGAGGTGCAGTTCAGCAGATTATTACGCACCGGA-3’(配列番号7))及びagsA−RL(5’-AACCGTGGTTTTGGTGGCAAAG-3’(配列番号8))を用いて増幅し、アンプリコン3は、agsA−PU(5’-TACCTTACTCTTTCACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3’(配列番号9))及びagsA−PL(5’-GTAATAATCTGCTGAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3’(配列番号10))を用いて増幅した。プライマーagsA−LU、agsA−RU、agsA−PU及びagsA−PLは、それぞれPCRフュージョンの逆相補的配列を含む、キメラオリゴヌクレオチドである。得られた3つのPCR産物をゲル精製し、agsA−LU及びagsA−RLを用いる第2ラウンドのPCRの基質として使用した。当該第2ラウンドのPCRにより、第1ラウンドで得られた3つのフラグメントを融合して、破壊カセットを作製した。全てのPCR反応は、Gene Amp PCR System 9700(Appied Biosystems、CA、USA)及びPrimeSTAR HS DNA polymerase(タカラバイオ株式会社製)を用いて行った。得られたPCR産物をゲル精製し、ABPU1株の形質転換に用いた。
第1ラウンドのPCRで、プライマーagsB−LU(5’-GCAATGAGAGCTGGAATCAGTG-3’ (配列番号11))及びagsB−LL(5’-TGAGTCGGCCACAGCGGATGGAATTCGTCGTCTGGCTGTGAGTGTAAC-3’ (配列番号12))(アプリコン1用)、agsB−RU(5’-TCTTCCAGTTACTCCGTCGGTACCCAGCAACATGCTGGCCATACGAC-3’ (配列番号13))及びagsB−RL(5’-AAAGTCCTGGGTCTCTTCGTTC-3’ (配列番号14))(アプリコン2用)、及びagrB−F(5’-GAATTCCATCCGCTGTGGCCGACTCA-3’ (配列番号15))及びagrB−R(5’-GGTACCGACGGAGTAACTGGAAAGATACGA-3’ (配列番号16))(アプリコン3用)を用い、第2ラウンドのPCRで、プライマーagsB−LU及びagsB−RLを用いる以外、上記製造例1と同様にして、agsB遺伝子の破壊カセットを構築した。
agsAおよびagsB遺伝子欠失破壊のための形質転換はプロトプラスト-PEG法を改良した方法を用い、形質転換するDNA断片は、上記で作製したagsAおよびagsB遺伝子欠失破壊用DNA断片を用いた。アスペルギルス ニドランスABPU1 ΔligD::ptrA(ビオチン(biA1)、アルギニン(argB2)、ウリジン(pyrG89)、ピリドキシン(pyroA4)要求性株(東北大学大学院農学研究科・藤岡智則博士より供与))の分生子懸濁液をYPD培地に植菌し、37℃、20時間振盪培養した。17G1滅菌済ガラスフィルターを用いて集菌後、菌体を50 ml容の遠心チューブに移し、滅菌水で洗浄した。その後、菌体を30 mlのプロトプラスト化溶液(0.8M NaCl、10mM NaH2PO4、10mg/ml Lysingenzyme (Sigma Chemical社製)、5mg/ml Cellulase Onozuka R-10 (Yakult Pharmaceutical Ind.社製)、2.5mg/ml Yatalase (タカラバイオ社製)を加え懸濁し、30℃、90rpm、3時間振盪しプロトプラスト化反応を行った。滅菌したMIRACLOTH(CALBIOCHEM社製)にて濾過し、濾液中のプロトプラストを3,000×g、4℃、5分間遠心分離して沈澱として得た。0.8M NaClにて1回プロトプラストを洗浄し、3,000×g、4℃、5分間遠心分離して沈澱させた。このプロトプラストをSolution 1(0.8M NaCl、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH8.0)で懸濁した。プロトプラスト懸濁液を200μlずつ15ml容の遠心チューブに移し、それぞれにSolution 2(40%(w/v) PEG♯4000、 50mM CaCl2、50mM Tris-HCl、pH8.0)40μlと前述の形質転換用DNA溶液各5μl(DNA量として5μg)を加えよく混合し、氷中で30分間放置した。1 mlのSol.2を加え混合し、室温で20分間放置した。5mlのSol.1で2回洗浄し、Sol.2をなるべく取り除いた。agsA破壊株の選抜の場合は、50℃に温めておいた終濃度0.02μg/mlのビオチン、0.2mg/mlのアルギニン、0.5μg/mlのピリドキシンを添加したCzapek-Dox(CD)軟寒天培地にプロトプラスト縣濁液を加え混合し、終濃度0.02μg/mlのビオチン、0.2mg/mlのアルギニン、0.5μg/mlのピリドキシンを添加したCD寒天培地に重層した。その後、30℃で分生子を形成するまで培養した。形質転換体からのagsA破壊株の選択は以下のプライマー(5’- GTACGGTGTAAGCTGCTCGCTGGAC-3’(配列番号17)、5’- TCCTGGATCTTGTAAACTGAGTCTC-3’(配列番号18))を用いて形質転換体のゲノムDNAに対してPCRを行い、約6,200bpの増幅断片のみがみられたものをagsA破壊候補株とし、最終的に定量RT-PCRによりagsA遺伝子が発現していないことを確認した(図1)。agsB破壊株の選抜の場合は、50℃に温めておいた終濃度0.02μg/mlのビオチン、5mMのウリジン、10mMのウラシル、0.5μg/mlのピリドキシンを添加したCzapek-Dox(CD)軟寒天培地にプロトプラスト縣濁液を加え混合し、終濃度0.02μg/mlのビオチン、5mMのウリジン、10mMのウラシル、0.5μg/mlのピリドキシンを添加したCD寒天培地に重層した。その後、30℃で分生子を形成するまで培養した。形質転換体からのagsB破壊株の選択は以下のプライマー(5’-AGGAAAGACTGTTGGATGAG-3’(配列番号19)、5’-GACTTATTCGTGTTGACGTTGTA-3’(配列番号20))を用いて形質転換体のゲノムDNAに対してPCRを行い、約5,150bpの増幅断片のみがみられたものをagsB破壊候補株とし、最終的に定量RT-PCRによりagsB遺伝子が発現していないことを確認した(図1)。
上記製造例で得られたΔagsB株を下記培養条件で培養し、培養後12時間毎に、培養液中の菌体量、グルコース残量及びpHを測定し、培養後の乾燥菌体重量を測定した(実施例1)。ΔagsB株の代わりに野生株を用いる以外、同様にして、培養後の乾燥菌体重を測定した(比較例1):
培養条件
・培地: CD最小培地 200ml ( 500 ml バッフル付フラスコ )
・培養温度: 37.0 ℃
・培養時間: 72hr
・回転数: 160 rpm
・分生子数: 108 個/L
・炭素源:グルコース濃度 2% または 4%
・試行回数: 5 回。
結果を図2〜図4に示す。
上記製造例で得られたΔagsB株(実施例2)及び野生株(比較例2)をそれぞれ、ジャー型培養装置により下記培養条件で培養し、培養後の乾燥菌体重量を測定した:
培養条件
・培地: CD培地 3 L
・培養温度: 37.0 ℃
・培養時間:48hr
・回転数 : 300 rpm
・分生子数: 108 個/L
・炭素源:グルコース濃度 2%
・加圧量: 0.3 MPa
・試行回数: 各5 回
結果を図5に示す。図5に示されるように、ジャー型培養装置においても、野生株よりΔagsB 株の菌体量は大幅に増加する。
低分子化合物の生産能の評価として、ペニシリン生産量を測定した。
培養条件
・培地: YPD培地 100mL(200mL フラスコ)
・培養温度: 37 ℃
・培養時間:48hr
・回転数 : 160 rpm
・分生子数: 107 個/100mL
・炭素源:グルコース濃度 2%
培養液を遠心分離し、培養上清をペーパーディスクに塗布し、ペニシリンアッセイ用標準菌体に対する阻止円の直径を測定することにより、ペニシリン生産量を測定した。具体的には、ペニシリンアッセイ用標準菌株であるBacillus stearothermophilusvar. calidolactis(NBRC 100862:独立行政法人 製品評価技術基盤機構より分譲を受けた)を最終濁度O.D.=0.1となるように3%の Tryptic soy broth(Becton, Dickinson and Company社製)寒天培地に混ぜ込み、シャーレ中央に置いた滅菌済ペーパーディスクに100μlの培養上清をしみ込ませた。シャーレを55℃で16時間培養し、ペニシリンアッセイ用標準菌株が生育できない阻止円の直径を計測した。ペニシリンの定量は、市販のペニシリンG(SIGMA社製)を0.01、0.025、0.05、0.1μg/mlに調整し、同様にペーパーディスクに塗布して得られた阻止円の直径から算出した。ペニシリン生産量は、野生株で15.9ng/mlであったのに対し、ΔagsB株で58.6ng/mlと大幅にペニシリンの生産量が増加した(図6)。
高分子化合物の生産能の評価として、アミラーゼ生産量を測定した。
培養条件
・培地: CD最小培地 200mL(500mL フラスコ)
・培養温度: 37 ℃
・培養時間:48hr or 36hr
・回転数 : 160 rpm
・分生子数: 107 個/100mL
・炭素源:でんぷん2% or 可溶性でんぷん2%
培養液から菌体を濾過し、培養上清のアミラーゼ活性を測定した。具体的には、培養開始24時間、36時間、48時間(でんぷん添加条件のみ)経過時の菌体をMIRACLOTH(CALBIOCHEM社製)にて濾過し、培養濾液のアミラーゼ活性をα-アミラーゼ測定キット(キッコーマンバイオケミファ株式会社製)にて測定した。測定法は付属の取扱説明書に従い、培養上清中のアミラーゼ活性を1U = N3-G5-β-CNP から 1 分間に1 μ molのCNPが遊離する力価として評価した。また、濾過した菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体重量測定を行った。結果を図7に示す。
麹菌アミラーゼ高発現ベクターの作製法(図8)
麹菌ゲノムDNAより、PCR反応によりアミラーゼ遺伝子を増幅し、アスペルギルス ニドランスのagdA遺伝子のターミネーターと接続し、このDNA断片をAoamyB-agdAtとした。アミラーゼ遺伝子の増幅には、PCRプライマーとしてAoamyB-Not I-F(配列:5’- TGAATTCGCGGCCGCTATTTATGATGGTCGCGTGGTG-3’(配列番号21))およびAoamyB-R+(配列: 5’-CTTCTTGAGTGAGCTCACGAGCTACTACAGATCT-3’(配列番号22))を用い、agdA遺伝子のターミネーターの増幅には、PCRプライマーとしてTagdA-Xx-F(配列: 5’-TGTAGTAGCTCGTGAGCTCACTCAAGAAGCGTAACAGGATAGCCT-3’ (配列番号23))およびTagdA-XbaI-R(配列: 5’-GCTATCTAGAGGCCTGCAGGAGATC-3’ (配列番号24))を使用した。AoamyB-Not I-Fには制限酵素のNot Iの認識配列が付加されている(下線部)。また、TagdA-Xx-FにはAoamyB遺伝子の配列の一部とオーバーラップする配列が付加されており(下線部)、TagdA-XbaI-Rには制限酵素のXba Iの認識配列が付加されている(下線部)。AoamyB-Not I-FおよびAoamyB-R+を用いて増幅した遺伝子断片(AoamyB断片)とTagdA-Xx-FおよびTagdA-XbaI-Rを用いて増幅した遺伝子断片(agdAt断片)の接続にはヒュージョンPCR法を用いた。これはAoamyB断片およびagdAt断片の混合物をテンプレートとし、AoamyB-Not I-FおよびTagdA-XbaI-Rを用いてPCR反応を行う方法で、両遺伝子断片を接続することができる方法である。接続したDNA断片AoamyB-agdAtは、制限酵素のNot IおよびXba Iで消化し、pNA(N)EGFP(Furukawa et al. Biosci. Biothechnol. Biochem.,71(7), 1724-1730, 2007)のNot I、Xba Iサイトに導入した。pNA(N)EGFPは、アスペルギルス ニドランス内での選択マーカーとしてオーレオバシジン耐性遺伝子(auAr)を持つベクターであり、これをNot IおよびXba Iで消化したものを遺伝子導入に用いた。DNA断片AoamyB-agdAtを導入したプラスミドpNA(N)AoamyBは制限酵素のNot Iで消化した後、Bacterial alkaline phosphatase(BAP)(Takara社製)処理を行い、アスペルギルス ニドランスで強発現するプロモーターAnenoApを導入した。AnenoApはアスペルギルス ニドランスのゲノムDNAから、PCRプライマーPenoA-F(配列:5’-TGGTAAGAGTCGTCATATCGAG-3’ (配列番号25))およびPenoA-Not I-R(配列:5’-TAGCGGCCGCGAATTCGATGAACTAGAAGGATAGAG-3’ (配列番号26))を用いて増幅した。PenoA-Not I-Rには制限酵素のNot Iの認識配列が付加されており(下線部)、AnenoApの断片を一旦、プラスミドpZErOTM-2(Invitrogen社製)のEcoRVサイトに導入し、Not Iで切り出すことにより断片の両端にNot Iサイトが付加されたAnenoApの断片を得た。このAnenoApの断片をpNA(N)AoamyBのNot Iサイトに導入し、麹菌のアミラーゼを高発現するベクターpNAenoA::AoamyBとした。このベクターをアスペルギルス ニドランスのΔagsB株に導入することにより、異種タンパク質を高発現するΔagsB株を作製することができる。
アミラーゼ高発現株においてアミラーゼ活性を測定した。具体的には、実施例5、比較例5に記載の方法で作製した麹菌のアミラーゼを高発現するベクターpNAenoA::AoamyBをAspergillus nidulans の野生株およびα-1,3-グルカンが欠損株した株(AG欠損株)に導入し、異種タンパク質を高発現する野生株およびAG欠損株を作製した。これらの株について、培養上清に分泌されるアミラーゼの量を測定した。
具体的には、AG欠損株及び野生株、アミラーゼ高発現AG欠損株及びアミラーゼ高発現野生株を下記培養条件で培養した:
培養条件
・培地: CD最小培地 50mL(200mL フラスコ)
・培養温度: 37 ℃
・培養時間:24 hr
・回転数 : 160 rpm
・分生子数: 107 個/100mL
・炭素源:2% マルトース培養液から菌体を濾過し、培養上清のアミラーゼ活性を測定した。具体的には、培養開始24時間経過時の菌体をMIRACLOTH(CALBIOCHEM社製)にて濾過し、培養濾液のアミラーゼ活性をα-アミラーゼ測定キット(キッコーマンバイオケミファ株式会社製)にて測定した。測定法は付属の取扱説明書に従い、培養上清中のアミラーゼ活性を1U = N3-G5-β-CNP から1 分間に1 μ molのCNPが遊離する力価として評価した。結果を下記表1に示す。
麹菌アスペルギルス オリゼ(Aspergillus oryzae)においてα-1,3-グルカン合成酵素(AGS)遺伝子の三重破壊株を造成し、培養性状を比較した。
具体的には、麹菌AGS三重破壊株及び野生株を下記培養条件で培養した:
培養条件
・培地: CD最小培地 50mL(200mL フラスコ)
・培養温度: 30 ℃
・培養時間:48 hr
・回転数 : 160 rpm
・分生子数: 107 個/100mL
・炭素源:2% グルコース または 2% マルトース
結果を図19及び表4に示す。
Claims (4)
- α−1,3−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。 - 前記変異型糸状菌がα−1,3−グルカン合成酵素agsの少なくとも一つを欠損している、請求項1に記載の方法。
- 糸状菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、セファロスポリウム属、又はアクレモニウム属に属する、請求項1又は2に記載の方法。
- 糸状菌が、アスペルギルス ニドランス、アスペルギルス オリゼ、アスペルギルス ニガー、又はアスペルギルス フミガタスである、請求項3に記載の方法。
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