JP2015063522A - Ebd及びhkd含有融合ペプチド及び当該ペプチドを発現する形質転換体 - Google Patents
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Abstract
Description
項1.植物由来のエチレンセンサードメイン及び糸状菌又は酵母由来のヒスチジンキナーゼドメインを含む融合ペプチド。
当該形質転換体にエチレン処理をして、前記形質転換体に物質を生産させる工程、及び得られた物質を回収する工程、
を含む、物質生産方法。
本発明は、植物由来のエチレンセンサードメイン及び糸状菌又は酵母由来のヒスチジンキナーゼドメインを含む融合ペプチドを提供する。
本発明は、上記融合ペプチドをコードする核酸分子を提供する。
本発明は、上記本発明の融合ペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも提供する。
本発明は、宿主である糸状菌又は酵母を上記ベクターを用いて形質転換されてなる形質転換体を提供する。
本発明は、糸状菌又は酵母の形質転換体を培養する工程、
当該形質転換体にエチレン処理をして、前記形質転換体に物質を生産させる工程、及び得られた物質を回収する工程、
を含む、物質生産方法を提供する。
本発明の方法は、上記糸状菌又は酵母の形質転換体を培養して、当該糸状菌又は酵母に物質を生成させる工程を含む。当該工程で用いる培地としては、特に限定されず、糸状菌又は酵母の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、CD最小培地、YPD培地、TSB培地、モルト培地、PDA培地等が挙げられる。また、当該工程には、上記培地に代えて、固体培養に用いる基質を用いることもできる。かかる基質としては、特に限定されないが、小麦フスマ、小麦、大豆、米などの固体の穀類、その類縁物等が挙げられる。これらの基質は、通常、加熱処理物が用いられる。これらの基質には糸状菌を固体培養する場合に好適である。上記培地又は基質には、炭素源として、グルコース、でんぷん、可溶性でんぷん等を添加してもよい。かかる炭素源の添加量としては特に限定されないが、例えば、0.5〜10%、より好ましくは1〜4%の範囲で適宜設定できる。培養温度は特に限定されず、20〜45℃、より好ましくは25〜37℃の範囲で適宜設定できる。培養時間も特に限定されないが、例えば、12〜72時間、より好ましくは24〜48時間の範囲で適宜設定できる。
培養培地からの有用物質の回収方法としては、特に限定されず、自体公知の方法(遠心分離、再結晶、蒸留法、溶媒抽出法、クロマトグラフィー等)を適宜用いることができる。
AtETR1 gene
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)の芽生えからRNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)を用いてRNAを抽出し、ReverTra Ace kit (TOYOBO)を用いてcomplementary DNA(cDNA)を合成した。このcDNAを鋳型とし、以下の制限酵素サイトを付加したプライマーセットを用いて、エチレンレセプター遺伝子AtETR1(At1g66340)を増幅した。AtETR1 BamHI F; 5'−CGGGATCCTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added BamH I)(配列番号31) と AtETR1 NotI R; 5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTACATGCCCTCGTACAGTAC−3'(added Not I) (配列番号32)。増幅したフラグメントはpZErOTM−2 vector (Invitrogen)にサブクローニングした(pZErO−AtETR1)。
pZErO−AtETR1からAtETR1をBamH IとNot Iで切り出し酵母発現ベクターpYES2 vector (Invitrogen)に導入した(pYES−AtETR1)。
pZErO−AtETR1を鋳型として、エチレン結合ドメインとその下流のGAFドメインを含む領域(EBD+GAF)を以下のプライマーセットを用いて増幅した。AtETR1 BamHI F1; 5'−CGGGATCCTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added BamH I) (配列番号31) と AtETR1 R2;5'−CTTTACATGCCCTCGTACAGTACCCGG−3'(配列番号33)。増幅したフラグメントは pZErOTM−2 vector (Invitrogen)にサブクローニングした(pYES−AtETR1(EBD+GAF))。
AtETR1 BamHI F1; 5'−CGGGATCCTAATGGAAGTCTGCAATTG−3'(配列番号31)(added BamH I)とAtETR1−ScSLN1 R1;
5'−TGTTAAATCGGAAAGTTCATCAGTGCTTCTAATCTCATGAGT−3'(配列番号34)AtETR1 BamHI F1; 5'−CGGGATCCTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added BamH I) (配列番号31)とAtETR1−ScSLN1 R2;
5’−TGTTAAATCGGAAAGTTCATCCTCCATGAGAAGGTCCCTAGC−3’ (配列番号35)AtETR1−ScSLN1 F1; 5'−ACTCATGAGATTAGAAGCACTGATGAACTTTCCGATTTAACA−3'(配列番号36)とScSLN1 NotI R;
5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCATTTGTTATTTTTCTTTCC−3' (added Not I) (配列番号37)AtETR1−ScSLN1 F2; 5'−GCTAGGGACCTTCTCATGGAGGATGAACTTTCCGATTTAACA−3'(配列番号38)とScSLN1 NotI R;
5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCATTTGTTATTTTTCTTTCC−3' (added Not I)(配列番号37)
増幅したフラグメントを精製し、これらを鋳型として以下の制限酵素を付加したプライマーを用いて Fusion PCRを行い、融合したフラグメントをpZErOTM−2 vector (Invitrogen)にサブクローニングした (pZErO−AtETR1(EBD)+ScSLN1(HKD))。
AtETR1 BamHI F1; 5'−CGGGATCCTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added BamH I) (配列番号31)とScSLN1 NotI R;
5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCATTTGTTATTTTTCTTTCC−3' (added Not I)(配列番号37)
pZErO−AtETR1(EBD)+ScSLN1(HKD)およびpZErO−AtETR1(EBD+GAF)+ScSLN1(HKD)から融合HKフラグメントをBamH IとNot Iで切り出し、酵母発現ベクターpYES2 vector (Invitrogen)に導入した(pYES−AtETR1(EBD)+ScSLN1(HKD)およびpYES−AtETR1(EBD+GAF)+ScSLN1(HKD))。AtETR1(EBD)+ScSLN1(HKD)の塩基配列を図21(配列番号10)に、AtETR1(EBD+GAF)+ScSLN1(HKD)の塩基配列を図23(配列番号12)に示す。上記融合フラグメントがベクターに導入されたことはDNAシークエンシングにより確認した。
pYES−AtETR1(EBD)+AntcsB(HKD)およびpYES−AtETR1(EBD+GAF)+ AntcsB (HKD)EBD融合AnTcsB発現系を構築するため、連結部分を重複した以下のプライマーを設計し、EBDフラグメントはpZErO−AtETR1(EBD)およびpZErO−AtETR1(EBD+GAF)を鋳型に、AntcsB (HKD)フラグメントはpYES−AntcsB(Furukawa et al, 2002)を鋳型に増幅した。AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAtETR1−AntcsB R1;
5'−CGTCAGGTCGGTTAGTTCATCAGTGCTTCTAATCTCATGAGT−3'(配列番号40)AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAtETR1−AntcsB R2;
5’−CGTCAGGTCGGTTAGTTCATCCTCCATGAGAAGGTCCCTAGC−3’ (配列番号41)AtETR1−AntcsB F1;5'−ACTCATGAGATTAGAAGCACTGATGAACTAACCGACCTGACG−3'(配列番号42)とAntcsB NotI R; 5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTACAGAGCAAAATTCACATC−3'(added Not I) (配列番号43)
AtETR1−AntcsB F2; 5'−GCTAGGGACCTTCTCATGGAGGATGAACTAACCGACCTGACG−3'(配列番号44)とAntcsB NotI R;
5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTACAGAGCAAAATTCACATC−3'(added Not I)(配列番号43) 増幅したフラグメントを精製し、これらを鋳型として以下の制限酵素を付加したプライマーを用いてFusion PCRを行い、融合したフラグメントをpZErOTM−2 vector (Invitrogen)にサブクローニングした(pZErO−AtETR1(EBD)+ AntcsB (HKD)およびpZErO−AtETR1(EBD+GAF)+ AntcsB (HKD))。
AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind
III) (配列番号39)とAntcsB NotI R; 5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTACAGAGCAAAATTCACATC−3'(added Not I) (配列番号43)
pZErO−AtETR1(EBD)+ AntcsB (HKD)およびpZErO−AtETR1(EBD+GAF)+ AntcsB (HKD)から融合HKフラグメン トをHind IIIとNot Iで切り出し、酵母発現ベクターpYES2 vector (Invitrogen)に導入した (pYES−AtETR1(EBD)+ AntcsB (HKD)およびpYES−AtETR1(EBD+GAF)+ AntcsB (HKD))。AtETR1(EBD)+ AntcsBの塩基配列を図27(配列番号16)に、AtETR1(EBD+GAF)+ AntcsB(HKD)の塩基配列を図29(配列番号18)に示す。上記融合フラグメントがベクターに導入されたことはDNAシークエンシングにより確認した。
AnnikA
糸状菌(Aspergills nidulans)genomic DNA は DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)を用いて抽出した。 HAMPドメインとヒスチジンキナーゼドメインを含むAnnikA (AN4479.3) 配列はA. nidulans genomic DNA をテンプレートとして次のプライマーセットで増幅した。
AnnikA F; 5'−GTATTCAACGAAACACGGCCGCCAGGGAA−3'(配列番号45)と AnnikA NotI R1;
5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCATGGTCTTACCCTATCTATG−3’ (配列番号46)増幅したフラグメントはpZErOTM−2 vector (Invitrogen)にサブクローニングした(pZErO−AnnikA(HAMP+HKD))。
AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAtETR1−AnnikA R1; 5'−TTCCCTGGCGGCCGTGTTTCGAGTGCTTCTAATCTCATGAGT−3' (配列番号47)
AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAtETR1−AnnikA R2; 5’−TTCCCTGGCGGCCGTGTTTCGCTCCATGAGAAGGTCCCTAGC−3’ (配列番号48)
AtETR1−AnnikA F1; 5'−ACTCATGAGATTAGAAGCACTCGAAACACGGCCGCCAGGGAA−3'(配列番号49)とAnnikA NotI R; 5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCATGGTCTTACCCTATCTATG−3' (added Not I) (配列番号46)
AtETR1−AnnikA F2; 5'−GCTAGGGACCTTCTCATGGAGCGAAACACGGCCGCCAGGGAA−3'(配列番号50)とAnnikA NotI R; 5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCATGGTCTTACCCTATCTATG−3' (added Not I)(配列番号46)
AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAnnikA NotI R; 5'−TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCATGGTCTTACCCTATCTATG−3' (added Not I)(配列番号46)
pZErO−AtETR1(EBD)+ AnnikA (HKD)およびpZErO−AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HKD)から融合HKフラグメン トをHind IIIとNot Iで切り出し、酵母発現ベクターpYES2 vector (Invitrogen)に導入した (pYES−AtETR1(EBD)+ AnnikA (HKD)およびpYES−AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HKD))。
AtETR1(EBD)+ AnnikA (HKD)の塩基配列を図34(配列番号22)に、AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HKD)の塩基配列を図36(配列番号24)に示す。上記融合フラグメントがベクターに導入されたことはDNAシークエンシングにより確認した。
pYES−AtETR1(EBD)+AnnikA(HKD)およびpYES−AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HKD)(HAMPドメイン含有)
HAMPドメインを含むEBD融合AnNikA発現系を構築するため、連結部分を重複した以下のプライマーを 設計し、EBDフラグメントはpZErO−AtETR1(EBD)およびpZErO−AtETR1(EBD+GAF)を鋳型に、AnnikA (HKD) フラグメントはpZErO−AnnikA(HAMP+HKD) (前記)を鋳型に増幅した。
AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAtETR1−AnnikA R3;
5'−TAGCTCTTCACGGACCTGGGTAGTGCTTCTAATCTCATGAGT−3'(配列番号51)
AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAtETR1−AnnikA R4;
5’−TAGCTCTTCACGGACCTGGGTCTCCATGAGAAGGTCCCTAGC−3’ (配列番号52)
AtETR1−AnnikA F3; 5'−ACTCATGAGATTAGAAGCACTACCCAGGTCCGTGAAGAGCTA−3'(配列番号53)とAnnikA R2;
5’−CATTACGCACGACCAACGGTTC−3'(配列番号54)
AtETR1−AnnikA F4; 5'−GCTAGGGACCTTCTCATGGAGACCCAGGTCCGTGAAGAGCTA−3'(配列番号55)とAnnikA R2;
5’−CATTACGCACGACCAACGGTTC−3'(配列番号54)
酵母Sln1p温度感受性変異株を用いたAtETR1と融合HKの機能相補試験 酵母 (S. cerevisiae) strain YHS−13 (MATa ura3 leu2 trp1 sln1−ts4) with a temperature−sensitive SLN1 allele (Maeda et al.(1994) Nature 369, 242-245) を機能相補解析に使用した。発現プラスミドはガラクトース誘導の GAL1 promoter を用いて発現調節可能なpYES2 vectorを用いた(Jonston (1987) Microbiol. Rev. 51, 458-476.) 。
1% w/v Yeast extract
2% w/v Peptone
2% w/v Glucose
2% w/v Agar
結果を図4に示す。図4に示すように、融合ヒスチジンキナーゼ導入株において37℃でガラクトース誘導時に酵母の生育が認められ、ヒスチジンキナーゼ機能の相補を確認した。
エチレン処理は容量が12 Lのアクリルチャンバー内を用いてエチレン濃度が50 μl/ Lとなるように設定した。SD培地に2%のガラクトースを添加したプレートに、上記の酵母形質転換体を、各試験区について1×106cell(左端)、1×105cell(左から2番目)、1×104cell(左から3番目)、1×103cell(右端)となるようにスポットし、エチレン処理無(−)又はエチレン処理有(+)の条件で、37°C(restrictive conditions)で3日間培養した。結果を図5に示す。37℃でガラクトース誘導時にHK機能相補を確認した融合HK導入株においてエチレン処理によって生育阻害が認められ、エチレン応答性を確認した。
Ctrl.は30℃で培養,相補酵母株はYP+Galプレートにおいて37℃で2days培養の後,上記と同様の条件で10分間エチレン処理し、定量PCRを行った。具体的には酵母のRNAはRNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出した。抽出したRNAはDNase処理の後、 iScriptTM One−Step RT−PCR Kit with SYBR Green(Bio−Rad)を用いて以下のプライマーセットでリアルタイム PCR解析を行った。18S rRNA ローデイングコントロールとして使用した。 5'−GGTTGGAAACATGTGGCTCT−3'(配列番号56)と 5'−GGCAGGTTCTTCATTGGGTA−3' (ScGPD1)(配列番号57)、 5'−TCACTACCTCCCTGAATTAGGATTG−3'(配列番号58)と 5'−AGAAACGGCTACCACATCCAA−3'(配列番号59)(18S rRNA)。
出芽酵母SLN1遺伝子条件発現株におけるFludioxonil感受性の確認 本試験においても酵母 (S. cerevisiae) strain YHS−13 (MATa ura3 leu2 trp1 sln1−ts4) with a temperature−sensitive SLN1 allele (Maeda et al.(1994) Nature 369, 242-245) を使用した(実施例3で作製したプラスミド(pYES−AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HKD))及び実施例4で作製したプラスミド(pYES−AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HKD)(HAMPドメイン含有))を用い、またpRS−ScSLN1をポジティブコントロールとして使用した。上記プラスミドを用いること以外、試験例1と同様にして酵母を形質転換した。
AnnikA(5’−UTR(promoter領域)および3’−UTR)
糸状菌(Aspergills nidulans)genomic DNA をテンプレートとしてAnnikAの上流および下流の配列を次の プライマーセットで増幅した。
5’−UTR
AnnikA pro HindIII F; 5'−CCCAAGCTTTATCGTGCAGCAGCAGTCGCCCATC−3'(added Hind III) (配列番号60)と AnnikA pro R; 5'−TCAATACAATTGCAGACTTCCATTTTGCCCTGGGATACTCAGTTAA−3’ (配列番号61)
3’−UTR
AnnikA 3’UTR F; 5'−CATAGATAGGGTAAGACCATGATAC−3'(配列番号62)と AnnikA 3’UTR R; 5'− ACATGCATGCCACGTACTCTTAAAGGTTGGG−3’ (added Sph I site) (配列番号63)
増幅したフラグメントはpZErOTM−2 vector (Invitrogen)にサブクローニングした(pZErO−AnnikAproおよびpZErO−AnnikA3’−UTR)。
糸状菌でのEBD融合AnNikA発現系を構築するため、酵母の系で使用した融合NikAフラグメントの上流にNikAの5’−UTR連結部分を重複した以下のプライマーを設計し、pYES−AtETR1(EBD)+AnnikA(HKD)、pYES−AtETR1(EBD+GAF)+AnnikA (HKD)、pYES−AtETR1(EBD)+AnnikA(HAMP+HKD)およびpYES−AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HAMP+HKD)をテンプレートとして以下のプライマーセットで増幅した。
AnnikA pro−AtETR1 F; 5'−TTAACTGAGTATCCCAGGGCAAAATGGAAGTCTGCAATTGTATTGA−3'(配列番号64)とAnnikA R2; 5'− CATTACGCACGACCAACGGTTC−3'(配列番号54) 増幅したフラグメントを精製し、それぞれのフラグメントと前記のAnnikAproフラグメントを鋳型として以下の制限酵素を付加したプライマーを用いてFusion PCRを行い、融合したフラグメントをpZErOTM−2 vector (Invitrogen)にサブクローニングした(pZErO−nikpro+AtETR1(EBD)+ AnnikA (HKD)、 pZErO−nikpro+AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HKD)、pZErO−nikpro+AtETR1(EBD)+ AnnikA (HAMP+HKD)およびpZErO−nikpro+AtETR1(EBD+GAF)+ AnnikA (HAMP+HKD))。
AnnikA pro HindIII F; 5'−CCCAAGCTTTATCGTGCAGCAGCAGTCGCCCATC−3' (added Hind III) (配列番号60) と AnnikA R2; 5'− CATTACGCACGACCAACGGTTC−3'(配列番号54) 酵母の系で使用した融合NikAフラグメントの下流にNikAの3’−UTR連結部分を重複した以下のプライマーを設計し、pYES−AtETR1(EBD)+AnnikA(HKD)をテンプレートとして以下のプライマーセットで増幅した。
AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAnnikA 3’UTR R; 5'− ACATGCATGCCACGTACTCTTAAAGGTTGGG−3’(added Sph I site) (配列番号63)
糸状菌における融合NIkAのHK機能相補試験
糸状菌(Aspergillus nidulans)ABPU1 ΔligD::ptrA(ビオチン(biA1)、アルギニン(argB2)、ウリジン (pyrG89)、ピリドキシン(pyroA4)要求性株を機能相補解析に使用した。上記のpUCpyroAシリーズのプラスミドを制限酵素処理により直線化し、プロトプラスト−PEG法によって 糸状菌を形質転換後、ピリドキシンを除く0.02μg/mlのビオチン、0.2mg/mlのアルギニン、5mMのウリジンおよび10mMのウラシルを添加したCzapek−Dox(CD)培地で分生子を形成するまで培養した。上記配合の形質 転換体の選抜は以下のプライマーセットで確認した。
AtETR1 HindIII F2; 5'−CCCAAGCTTTAATGGAAGTCTGCAATTG−3' (added Hind III) (配列番号39)とAtETR1−AnnikA R3; 5'−TAGCTCTTCACGGACCTGGGTAGTGCTTCTAATCTCATGAGT−3'(配列番号51)
プレート培養での応答試験
エチレン処理は容量が12 Lのアクリルチャンバー内を用いてエチレン濃度が100 μl/ Lとなるように設定し、上記の糸状菌形質転換体をCDプレートにおいて37°Cで2日間培養する。(エチレン濃度、50μl〜100ml/L)
エチレン応答性確認のためのHOG下流遺伝子の解析
上記の糸状菌形質転換体をCDプレートにおいて37°Cで2日間培養の後、容量が12 Lのアクリルチャン バー内(エチレン濃度が100 μl/ Lとなるように設定)に移し、10分〜24時間後糸状菌のRNAはRNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出する。抽出したRNAはDNase処理の後、iScriptTM One−Step RT−PCR Kit with SYBR Green(Bio−Rad)を用いて以下のプライマーセットでリアルタイムPCR解析を行う。(エチレン濃度50μl〜100ml/L)ヒストンをローディングコントロールとして用いる。
AncatA 5'−GCTACTAGGTATCACCGCCGG−3'(配列番号66)及び 5'−GCTGCTCCTGGTCTGTGTGG−3'(配列番号67)
AngfdB 5'−CAGGTCTCCGTCATCGGCTC−3'(配列番号68)及び 5'−CTGGAGTTTCGAAGGTGTCG−3'(配列番号69)
Anhiston 5’−CACCCGGACACTGGTATCTC−3’ (配列番号70)及び5’-GAATACTTCGTAACGGCCTTGG−3’ (配列番号71)
配列番号10 融合ペプチド
配列番号11 融合ペプチド
配列番号12 融合ペプチド
配列番号15 融合ペプチド
配列番号16 融合ペプチド
配列番号17 融合ペプチド
配列番号18 融合ペプチド
配列番号21 融合ペプチド
配列番号22 融合ペプチド
配列番号23 融合ペプチド
配列番号24 融合ペプチド
配列番号27 融合ペプチド
配列番号28 融合ペプチド
配列番号29 融合ペプチド
配列番号30 融合ペプチド
配列番号31 プライマー
配列番号32 プライマー
配列番号33 プライマー
配列番号34 プライマー
配列番号35 プライマー
配列番号36 プライマー
配列番号37 プライマー
配列番号38 プライマー
配列番号39 プライマー
配列番号40 プライマー
配列番号41 プライマー
配列番号42 プライマー
配列番号43 プライマー
配列番号44 プライマー
配列番号45 プライマー
配列番号46 プライマー
配列番号47 プライマー
配列番号48 プライマー
配列番号49 プライマー
配列番号50 プライマー
配列番号51 プライマー
配列番号52 プライマー
配列番号53 プライマー
配列番号54 プライマー
配列番号55 プライマー
配列番号56 プライマー
配列番号57 プライマー
配列番号58 プライマー
配列番号59 プライマー
配列番号60 プライマー
配列番号61 プライマー
配列番号62 プライマー
配列番号63 プライマー
配列番号64 プライマー
配列番号65 プライマー
配列番号66 プライマー
配列番号67 プライマー
配列番号68 プライマー
配列番号69 プライマー
配列番号70 プライマー
配列番号71 プライマー
Claims (8)
- 植物由来のエチレンセンサードメイン及び糸状菌又は酵母由来のヒスチジンキナーゼドメインを含む融合ペプチド。
- 前記ヒスチジンキナーゼドメインが、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、セファロスポリウム属、もしくはアクレモニウム属に属する糸状菌由来又はサッカロマイセス属、カンジダ属、トルロプシス属、ジゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピチア属、ヤロウィア属、ハンセヌラ属、クルイウェロマイセス属、デバリオマイセス属、ゲオトリクム属、ウィッケルハミア属もしくはフェロマイセス属に属する酵母由来である、請求項1に記載の融合ペプチド。
- 前記ヒスチジンキナーゼドメインがアスペルギルス ニドランス、アスペルギルス オリゼ、アスペルギルス ソーヤ、アスペルギルス ニガー、アスペルギルス フミガタス又はサッカロマイセス・セレビシエ由来である、請求項2に記載の融合ペプチド。
- 植物由来のエチレンセンサードメインが、シロイヌナズナ、トマト、ペチュニア、イネ、タバコ、キュウリ、バナナ又はリンゴ由来である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合ペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項5に記載の核酸分子を含むベクター。
- 宿主の糸状菌又は酵母を請求項6に記載のベクター、又は植物由来のエチレンセンサードメイン及び植物由来のヒスチジンキナーゼドメインを含むペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを用いて形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項7に記載の糸状菌又は酵母の形質転換体を培養する工程、
当該形質転換体にエチレン処理をして、前記形質転換体に物質を生産させる工程、及び得られた物質を回収する工程、
を含む、物質生産方法。
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---|---|---|---|
JP2014177524A JP2015063522A (ja) | 2013-08-30 | 2014-09-01 | Ebd及びhkd含有融合ペプチド及び当該ペプチドを発現する形質転換体 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2013180652 | 2013-08-30 | ||
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JP2014177524A JP2015063522A (ja) | 2013-08-30 | 2014-09-01 | Ebd及びhkd含有融合ペプチド及び当該ペプチドを発現する形質転換体 |
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CN112166180A (zh) * | 2018-06-06 | 2021-01-01 | 齐默尔根公司 | 操纵涉及信号转导的基因以控制发酵和生产期间的真菌形态 |
JP2022513352A (ja) * | 2018-10-15 | 2022-02-07 | イーティーエッチ チューリッヒ | タンパク質-タンパク質相互作用をトランスダクションするための新規の方法 |
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