JPWO2008087998A1 - Rsisを用いた簡便な遺伝子発現抑制方法 - Google Patents
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Abstract
Description
第一の方法は変異体(表現型の異常)を探してその原因遺伝子を突き止めていく順遺伝学的手法である。変異体の作成には変異原処理やγ線の照射等が行われている。
本発明者らは、イネ胚乳中でRNAサイレンシングを誘導することができる配列(RSIS; RNA silencing inducible sequence)を見いだすことに成功した。この配列を標的遺伝子のプロモーターからmRNAの5'末端配列(約100 bp)および終止コドン以降のターミネーター配列の間に連結することによって標的遺伝子の発現を抑制することができた。
〔1〕 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNA、
(a)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAと機能的に同等なDNA
(c)配列番号:3に記載の塩基配列において1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加および/または挿入した塩基配列からなるDNA
〔2〕 標的遺伝子の発現を抑制するDNAであって、〔1〕に記載のDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAが機能的に連結した構造を有するDNA、
(a)〔1〕に記載のDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)〔1〕に記載のDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
〔3〕 複数個の標的遺伝子の発現を同時に抑制するDNAであって、〔1〕に記載のDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAが機能的に連結した構造を有するDNA、
(a)〔1〕に記載のDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)〔1〕に記載のDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、複数個の標的遺伝子それぞれのmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
〔4〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNAによってコードされるタンパク質、
〔5〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNAを含むベクター、
〔6〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNA、あるいは〔5〕に記載のベクターを含む組成物、
〔7〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNA、あるいは〔5〕に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞、
〔8〕 〔7〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
〔9〕 〔8〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
〔10〕 〔8〕または〔9〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔11〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNA、あるいは〔5〕に記載のベクターを用いることを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制する方法、
〔12〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNA、あるいは〔5〕に記載のベクターを用いることを特徴とする、標的遺伝子のサイレンシングを誘導する方法、
〔13〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNA、あるいは〔5〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法、
〔14〕 〔1〕〜〔3〕にいずれかに記載のDNA、あるいは〔5〕に記載のベクターを植物体の細胞内で発現させる工程を含む、標的遺伝子の発現が抑制された植物体もしくはその種子の製造方法、
〔15〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNA、あるいは〔5〕に記載のベクターを有効成分として含む、標的遺伝子の発現抑制剤、
〔16〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNA、あるいは〔5〕に記載のベクターを有効成分として含む、標的遺伝子のサイレンシング誘導剤、
〔17〕 以下の(1)および(2)の工程を含むことを特徴とする、siRNA発現ベクターの製造方法、
(1)〔1〕に記載のDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAを機能的に連結させる工程
(a)〔1〕に記載のDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)〔1〕に記載のDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
(2)前記DNAをベクターに組み込む工程
〔18〕 以下の(1)および(2)の工程を含むことを特徴とする、siRNA発現ベクターの製造方法、
(1)〔1〕に記載のDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAを機能的に連結させる工程
(a)〔1〕に記載のDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)〔1〕に記載のDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、複数個の標的遺伝子それぞれのmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
(2)前記DNAをベクターに組み込む工程
このようなDNAを単離するための生物としては、例えば植物や動物を挙げることができる。植物としては、例えば単子葉植物や双子葉植物が挙げられる。具体的には例えばイネ、アラビドプシス、タバコ等を挙げることができるが、これらに制限されない。
本発明の配列番号:3に記載の塩基配列と有意な相同性を有する塩基配列からなるDNAは、例えば、ハイブリダイゼーション技術 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.3-6.4)や遺伝子増幅技術(PCR)(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4)を利用して調製することができる。即ち、ハイブリダイゼーション技術を利用して、配列番号:3に記載の塩基配列またはその一部をもとに同種または異種生物由来のDNA試料から、これと相同性の高いDNAを単離することができる。また、遺伝子増幅技術を用いて、配列番号:3に記載の塩基配列の一部を基にプライマーを設計し、該DNAの塩基配列と相同性の高いDNAを単離することができる。従って、本発明には、配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが含まれる。
(a)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAと機能的に同等なDNA
(c)配列番号:3に記載の塩基配列において1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加および/または挿入した塩基配列からなるDNA
(a)RSISをコードするDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)RSISをコードするDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
しかし通常「ターミネーター配列」といえば、ストップコドンからポリ(A)結合部位までの3'非翻訳領域(3'UTR)およびその下流域を指し、即ちmRNAの一部を含むものであるが、本発明は上述のように区別する。なお本発明においてはターミネーター配列に用いられる遺伝子と、3'UTRに用いられる遺伝子は異なっていて構わない。
本発明で利用されるターミネーター配列には、任意の遺伝子のターミネーター配列が含まれる。本発明においては例えば、3'UTRを含むターミネーター配列(即ち、通常ターミネーター配列と呼ばれている配列)を挙げることができる。例えばA(アデニン)塩基が4つ以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列等の公知の3'UTRを含むターミネーター配列が含まれる。公知の3'UTRを含むターミネーター配列としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来の3'UTRを含むターミネーター配列、オクトピン合成酵素の3'UTRを含むターミネーター配列、ノパリン合成酵素遺伝子由来の3'UTRを含むターミネーター配列、アグロバクテリウム由来の3'UTRを含むターミネーター配列等を挙げることができるが、これらに特に制限されない。
また本発明のターミネーター配列は、勿論標的遺伝子のターミネーター配列を用いても構わない。
(a)RSISをコードするDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)RSISをコードするDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
・[プロモーター配列をコードするDNA]-[標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[RSISをコードするDNA]-[ターミネーター配列をコードするDNA]
・[プロモーター配列をコードするDNA]-[RSISをコードするDNA]-[標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[ターミネーター配列をコードするDNA]
<コンストラクト1>(図2A)
[2.3k GluB1プロモーター]-[5'UTR]-[SP]-[mGLP配列]-[GluB1 3'UTR-ターミネーター]
<コンストラクト2>(図4A)
[10kDaプロラミンプロモーター]-[5'UTR]-[SP]-[mGLP配列]-[10kDaプロラミン3'UTR-ターミネーター]
<コンストラクト3>(図4A)
[16kDaプロラミンプロモーター]-[5'UTR]-[SP]-[mGLP配列]-[16kDaプロラミン3'UTR-ターミネーター]
<コンストラクト6>(図8A)
[18kDaオレオシンプロモーター]-[5'UTR]-[mGLP配列]-[18kDaオレオシン3'UTR-ターミネーター]
<コンストラクト9>(図9A)
[33kDaアレルゲンプロモーター]-[5'UTR]-[RSIS配列]-[33kDaアレルゲン3'UTR-ターミネーター]
(a)RSISをコードするDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)RSISをコードするDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、複数個の標的遺伝子のそれぞれにmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
・[プロモーター配列をコードするDNA]-[標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[RSISをコードするDNA]-[ターミネーター配列をコードするDNA]
・[プロモーター配列をコードするDNA]-[A遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[RSISをコードするDNA]-[B遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[ターミネーター配列をコードするDNA]
・[プロモーター配列をコードするDNA]-[A遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[B遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[RSISをコードするDNA]-[ターミネーター配列をコードするDNA]
・[プロモーター配列をコードするDNA]-[RSISをコードするDNA]-[A遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[B遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA]-[ターミネーター配列をコードするDNA]
<コンストラクト4>(図6A)
[2.3k GluB1プロモーター]-[5'UTR]-[SP]-[mGLP配列]-[グロブリン3'UTR-ターミネーター]
<コンストラクト5>(図7A)
[RM1プロモーター]-[5'UTR]-[SP]-[RSISをコードするDNA]-[RM2 3'UTR-ターミネーター]
<コンストラクト7>(図8A)
[2.3k GluB1プロモーター]-[5'UTR]-[SP]-[mGLP配列]-[18kDaオレオシン3'UTR-ターミネーター]
<コンストラクト8>(図9A)
[35Sプロモーター]-[RSISをコードするDNA]-[CYP90D2 3'UTR-ターミネーター]
このようにして作出された植物体もしくはその種子は、標的遺伝子の発現が抑制されていることが期待される。
該植物体は、標的遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、遺伝子改変植物である。該遺伝子改変植物は、例えば、「ノックアウト植物」、「ノックダウン植物」あるいは「トランスジェニック植物」と呼ばれる場合もある。
標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する核酸の一態様として、標的遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNA(siRNA)を挙げることができる。なお、上記RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る一本鎖RNA分子もまた本発明に含まれる。
本発明では、上述の本発明のDNAを用いることにより、siRNAによる標的遺伝子のRNAサイレンシングを誘導することができる。
また本発明は、本発明のDNAあるいは本発明のベクターを有効成分として含む、標的遺伝子の発現抑制剤あるいは標的遺伝子のサイレンシング誘導剤を提供する。
(1)RSISをコードするDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAを機能的に連結させる工程
(a)RSISをコードするDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)RSISをコードするDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
(2)前記DNAをベクターに組み込む工程
(1)RSISをコードするDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAを機能的に連結させる工程
(a)RSISをコードするDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)RSISをコードするDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、複数個の標的遺伝子それぞれのmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
(2)前記DNAをベクターに組み込む工程
実験に使用した材料および方法は、下記(1)〜(4)のとおりである。
遺伝子断片の切断および結合は、制限酵素とDNA結合酵素を用いた従来の方法により行った。イネ(品種キタアケおよび日本晴)由来のゲノム配列(断片)は、すでにクローニングされていたもの以外は、それぞれの両端にプライマーを設計し、PCRを利用して増幅した遺伝子断片を新たにクローニングした。
イネ種子の総タンパク質はそれぞれの形質転換体の完熟種子1粒ずつをマルチビーズショッカーで粉砕後、500μlのタンパク質抽出緩衝液 [8 M urea, 4%(w/v) SDS, 5%(v/v) 2-mercaptoethanol, 20%(w/v) glycerol, 20 mM Tris-HCl (pH 6.8)] 中で、1時間激しく攪拌することにより行った。
SDS-PAGEは12%ゲルでLaemmuliの方法(Laemmuli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the heads of bacteriophase T4. Nature 227; 680-685.)に従って行い、タンパク質抽出液を2μlずつ供した。
総RNAの抽出は、開花後5, 7, 10, 15, 20, 25日目の種子からYasudaらの方法(Yasuda H., Tada Y., Hayashi Y., Jomori T. and Takaiwa F. (2005) Expression of the small peptide GLP-1 in transgenic plants. Transgenic Res. 14; 677-684.)に従って行った。
胚乳でRNAサイレンシングが誘導されているかどうかを評価する場合、その種子は世代が進んでいるためにヘテロな集団となっている。RSISを用いたRNAサイレンシングでは、その表現型が優勢となって現れることが分かっているので、形質転換体あたり最低4粒の種子を調べて1粒以上の個体でサイレンシングが確認された時、その個体でRNAサイレンシングが起こっていると判定した。RNAサイレンシングの効率は、調査したすべての再分化個体の数あたりのサイレンシングが誘導されていると判定された個体の数として評価した。
(1-1) コンストラクト1(2.3k pGluB1-5'UTR-SP-mGLP(KDEL)-GluB1 3'UTR-ターミネーター)によるRNAサイレンシング
胚乳特異的高発現プロモーターである2.3k GluB1プロモーターの下流にGluB1の5'UTR、シグナルペプチドおよびmGLP配列を連結し、さらにその下流にGluB1の3'UTRを含むターミネーター配列を連結したコンストラクト(図2A、コンストラクト1)をイネに遺伝子導入した。
コンストラクト1導入イネでGluB1遺伝子と相同性の高いGluBファミリーの発現が抑制されていることが示されたことから、GluB1遺伝子と相同性の高いGluA2遺伝子、および同じグルテリンファミリーであるがGluB1遺伝子と相同性はほとんど無いGluC遺伝子、種子貯蔵タンパク質の一つである13kDプロラミン遺伝子の発現をノーザン解析により調べた。
遺伝子の相同性により発現抑制が起こることから、この現象がRNAサイレンシングによる可能性がさらに高まった。よって更に、RNAサイレンシングの証拠となるsiRNA(small interfering RNA)の検出を行った。
次にmGLP配列によるRNAサイレンシングの誘導が、GluB1以外の遺伝子(10kDaプロラミンおよび16kDaプロラミン)でも起こるのかどうか確認するためのコンストラクト(図4A、コンストラクト2およびコンストラクト3)を作成し、イネに遺伝子導入した。得られたそれぞれの形質転換体の種子から総タンパク質を調製し、ウエスタン解析を行った。
mGLP配列がRNAサイレンシングを誘導しているのかどうかを確認するために、様々なコンストラクトを作成し(図5)、mGLP配列とRNAサイレンシングの関係について検討した。
(3-1) mGLP配列による、グルテリンおよびグロブリン遺伝子のRNAサイレンシング
次にmGLP配列を用いて複数遺伝子のRNAサイレンシングを試みた。GluB1プロモーターおよび5'UTR、シグナルペプチドの下流にmGLP配列を連結し、そのC末端にグロブリンの3'UTRを含むターミネーター配列を連結したコンストラクト(図6A、コンストラクト4)を作成した。そのコンストラクトを遺伝子導入したイネ種子から総タンパク質を抽出し、SDS-PAGEに供した。
13kDプロラミンはイネゲノム中に数十コピー以上あることが報告されている(Kim W. T. and Okita T. W. (1988) Structure, expression and heterogeneity of the rice seed prolamins. Plant Physiol. 88; 649-655.)。そこでコピー数の多い13kDプロラミン遺伝子の発現を抑制することを試みた。
次にmGLP配列によるRNAサイレンシングのシグナルが細胞間を移動し、効果が広がっていくのかどうか検討した。オレオシン遺伝子はイネ種子の胚およびアリューロン細胞で発現していることが報告されている(Wu L. S. H., Wang L.-D., Chen P.-W., Chen L.-J. and Tzen J. T. C. (1998) Genomic cloning of 18 kDa oleosin and detection of triacylglycerols and oleosin isoforms in maturing rice and postgerminative seedling. J. Biochem. 123; 386-391.)。そこでオレオシンプロモーターおよび5'UTRの下流にmGLP配列を連結し、そのC末端にオレオシンの3'UTRを含むターミネーター配列をつなげたコンストラクト(図8A、コンストラクト6)、およびGluB1プロモーターおよび5'UTR、シグナルペプチドの下流にmGLP配列およびオレオシンの3'UTRを含むターミネーター配列を連結したコンストラクト(図8A、コンストラクト7)を作成し、イネに遺伝子導入した。得られたそれぞれの形質転換体の胚および胚乳から総タンパク質を抽出し、抗オレオシン抗体を用いてウエスタン解析を行った。
これまではイネ種子でのサイレンシングの誘導について検討してきた。そこでRSISが他の組織でもRNAサイレンシングを誘導できるのかどうか検討した。
イネでは比較的恒常的に発現している33kDaアレルゲン遺伝子について、この遺伝子の発現を抑制するために、33kDaアレルゲン遺伝子のプロモーターの下流に、5'UTR、RSISおよび33kDaアレルゲンの3'UTRを含むターミネーター配列を連結させたコンストラクトを作成(図11A、コンストラクト9)し、イネに遺伝子導入した。得られた再分化個体の葉、茎、および種子から総RNAを抽出し、RT-PCR法によって33kDaアレルゲン遺伝子の発現を調べた。
上記mGLP配列およびRSISによるRNAサイレンシングの効率について、上記表2にまとめた。
その結果、mGLP配列によるRNAサイレンシングの誘導効率は40%以上であり、実際にRNAサイレンシングを用いた研究等で充分に使用できる効率であると考えられた。この効率はアンチセンス法やヘアピン構造によるサイレンシングの効率と遜色のない値といえる。
また恒常的に発現している遺伝子の抑制または制御したい遺伝子のコード領域に、本願発明のRSIS配列を置換して導入または挿入することで、抑制または制御したい遺伝子特異的に発現を抑制させることが可能になる。実際、葉、茎、あるいは種子で発現するゲノム1コピーの33kDaアレルゲン遺伝子のコード領域にRSIS配列を挿入・置換してイネに遺伝子導入したところ、33kDaアレルゲン遺伝子が発現している組織で、33kDaアレルゲン遺伝子特異的に発現を抑制することができた。
Claims (18)
- 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAと機能的に同等なDNA
(c)配列番号:3に記載の塩基配列において1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加および/または挿入した塩基配列からなるDNA - 標的遺伝子の発現を抑制するDNAであって、請求項1に記載のDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAが機能的に連結した構造を有するDNA。
(a)請求項1に記載のDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)請求項1に記載のDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA - 複数個の標的遺伝子の発現を同時に抑制するDNAであって、請求項1に記載のDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAが機能的に連結した構造を有するDNA。
(a)請求項1に記載のDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)請求項1に記載のDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、複数個の標的遺伝子それぞれのmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA - 請求項1〜3のいずれかに記載のDNAによってコードされるタンパク質。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA、あるいは請求項5に記載のベクターを含む組成物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA、あるいは請求項5に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
- 請求項7に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
- 請求項8に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
- 請求項8または9に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA、あるいは請求項5に記載のベクターを用いることを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA、あるいは請求項5に記載のベクターを用いることを特徴とする、標的遺伝子のサイレンシングを誘導する方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA、あるいは請求項5に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法。
- 請求項1〜3にいずれかに記載のDNA、あるいは請求項5に記載のベクターを植物体の細胞内で発現させる工程を含む、標的遺伝子の発現が抑制された植物体もしくはその種子の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA、あるいは請求項5に記載のベクターを有効成分として含む、標的遺伝子の発現抑制剤。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA、あるいは請求項5に記載のベクターを有効成分として含む、標的遺伝子のサイレンシング誘導剤。
- 以下の(1)および(2)の工程を含むことを特徴とする、siRNA発現ベクターの製造方法。
(1)請求項1に記載のDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAを機能的に連結させる工程
(a)請求項1に記載のDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)請求項1に記載のDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、標的遺伝子のmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
(2)前記DNAをベクターに組み込む工程 - 以下の(1)および(2)の工程を含むことを特徴とする、siRNA発現ベクターの製造方法。
(1)請求項1に記載のDNAに、さらに以下の(a)〜(c)に記載のDNAを機能的に連結させる工程
(a)請求項1に記載のDNAの上流に、プロモーター配列をコードするDNA
(b)請求項1に記載のDNAの下流に、ターミネーター配列をコードするDNA
(c)前記(a)のDNAの下流であり、さらに前記(b)のDNAの上流に、複数個の標的遺伝子それぞれのmRNAの全長もしくは部分配列をコードするDNA
(2)前記DNAをベクターに組み込む工程
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