DE112010005958T5 - Expressionskassetten für die Embryo-spezifische Expression in Pflanzen - Google Patents

Expressionskassetten für die Embryo-spezifische Expression in Pflanzen Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Expressionskassette für die Regulierung einer embryospezifischen Expresssion eines Polynukleotids von Interesse, wobei die Expressionskassette eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz umfasst, einen Vektor, der die Expressionskassette umfasst, Wirtszellen und transgene Pflanzen, die die Expressionskassette umfassen, und Verfahren zur Herstellung der transgenen Pflanzen.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Expressionskassetten, die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen mit Gesamtsamen- und/oder Embryo-spezifischen Expressionsprofilen in Pflanzen umfassen, welche aus Zea mays erhältlich sind. Die transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen zeigen vorzugsweise eine starke Expressionsaktivität speziell in Gesamtsamen und insbesondere im Endosperm.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Manipulation von Pflanzen zur Veränderung und/oder Verbesserung von phänotypischen Charakteristika (wie Produktivität oder Qualität) erfordert die Expression von heterologen Genen in Pflanzengeweben. Eine derartige genetische Manipulation beruht auf der Verfügbarkeit eines Mittels, um die Genexpression nach Bedarf anzutreiben und zu steuern. Zum Beispiel beruht die genetische Manipulation auf der Verfügbarkeit und Verwendung geeigneter Promotoren, die in Pflanzen wirksam sind und die die Genexpression regulieren, um die gewünschte(n) Auswirkung(en) in der transgenen Pflanze zu ergeben.
  • Eine fruchtbare Maispflanze enthält sowohl männliche als auch weibliche Reproduktionsgewebe, die üblicherweise jeweils als Quaste und Kolben/Ähre bekannt sind. Die Quastengewebe bilden die haploiden Pollenkörner mit zwei Zellkernen in jedem Korn, die, wenn sie bei der Anthese abgeworfen werden, mit den Seidenfäden einer weiblichen Ähre in Berührung kommen. Die Ähre kann sich auf der gleichen Pflanze wie diejenige, die den Pollen abgeworfen hat, oder auf einer anderen Pflanze befinden. Die Pollenzelle entwickelt eine als Pollenschlauch bekannte Struktur, die sich abwärts durch einen einzelnen weiblichen Seidenfaden zur Eizelle bzw. Samenanlage erstreckt. Die zwei männlichen Zellkerne wandern durch diesen Schlauch, um das haploide weibliche Ei an der Basis des Seidenfadens zu erreichen. Einer der männlichen Zellkerne verschmilzt mit den weiblichen haploiden Eizellkernen und befruchtet diese, um die Zygote zu bilden, die diploid bezüglich der Chromosomenanzahl ist und zum Embryo innerhalb des Korns wird. Der übrige männliche Zellkern verschmilzt mit einem zweiten weiblichen Zellkern und befruchtet diesen unter Bildung des primären Endospermzellkerns, welcher zahlenmäßig triploid ist und zum Endosperm des Korns, oder Samens, der Maispflanze wird. Nicht befruchtete Eizellen produzieren keine Körner, und die unbefruchteten Gewebe degenerieren schließlich.
  • Das Korn besteht aus einer Reihe von Teilen, einige abgeleitet aus mütterlichem Gewebe und andere aus dem Befruchtungsvorgang. Mütterlicherseits ererbt das Korn eine Reihe von Geweben, darin eingeschlossen ein schützendes umgebendes Pericarp und einen Pedicellus. Der Pedicellus ist eine Art kurzstieliges Gewebe, das das Korn an den Kolben anhängt und für die Nährstoffübertragung vom mütterlichen Gewebe in das Korn hinein sorgt. Das Korn enthält Gewebe, die aus den Befruchtungsaktivitäten resultieren, darin eingeschlossen den neuen Embryon sowie das Endosperm. Der Embryo umfasst die Zellen, die sich zu den Wurzeln und Trieben der Maispflanze der nächsten Generation entwickeln. Er ist auch das Gewebe, in dem Öle und hochwertige Proteine im Samenkorn gespeichert sind. Das Endosperm fungiert als ein Nährgewebe und liefert in der Form von gespeicherter Stärke und Proteinen die Energie, welche für die Keimung und das Anfangswachstum des Embryos benötigt wird.
  • In Anbetracht der komplexen Regulation, die während der Embryo- und Kornentwicklung bei höheren Pflanzen auftritt, und wenn man bedenkt, dass Getreide häufig als eine Primärquelle von Nahrung für Tiere und Menschen verwendet wird, ist es wichtig, Schlüsseltools zu entwickeln, die zur Verbesserung dieser Gewebe vom Nährwertstandpunkt betrachtet verwendet werden können. Eine Klasse solcher Tools wären transkriptionale Promotoren, die die Expression der den Nährwert verbessernden Gene spezifisch in diesen Geweben antreiben können. Leider sind relativ wenige Promotoren, welche spezifisch dieses Expressionsmuster steuern, identifiziert worden. Folglich besteht ein Bedarf im Fachbereich an neuen Promotorsequenzen, welche die Expression während der Kornentwicklung, und insbesondere der Embryoentwicklung antreiben.
  • Die embryospezifischen Promotoren sind für das Exprimieren von Genen sowie für die Produktion von großen Mengen an Protein, für das Exprimieren von Genen, die an der Synthese von interessierenden Ölen oder Proteinen, z. B. Antikörpern, beteiligt sind, Genen zur Erhöhung des Nährwerts des Gesamtsamens und insbesondere des Embryos und dergleichen nützlich. Es ist von Vorteil, die Wahl aus einer Vielzahl an unterschiedlichen Promotoren zu haben, so dass der geeignetste Promotor für ein(e) spezielle(s) Gen, Konstrukt, Zelle, Gewebe, Pflanze oder Umgebung gewählt werden kann. Außerdem machen es das zunehmende Interesse an der Cotransformation von Pflanzen mit mehrfachen Pflanzentranskriptionseinheiten (PTU) und die potentiellen Probleme, die mit der Verwendung der üblichen regulatorischen Sequenzen für diese Zwecke zusammenhängen, lohnend., dass man eine Vielfalt an Promotorsequenzen zur Verfügung hat.
  • Nur wenige Embryo- oder Gesamtsamen-spezifische Promotoren sind kloniert und im Detail untersucht worden; diese schließen Promotoren für Samenspeicherproteingene ein, wie einen Globulinpromotor (Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885–889), Phaseolinpromotor ( US-Patent Nr. 5 504 200 ) und einen Napinpromotor ( US-Patent Nr. 5 608 152 ). Speicherproteine sind in der Regel in großen Mengen vorhanden, was es relativ einfach macht, Speicherproteingene und die Genpromotoren zu isolieren. Trotzdem ist die Zahl an verfügbaren samenspezifischen Promotoren immer noch begrenzt. Darüber hinaus sind die meisten dieser Promotoren mit mehreren Nachteilen behaftet; sie können die Expression nur in einem beschränkten Zeitraum während der Samenentwicklung antreiben und sie können ebenso in anderen Geweben exprimiert werden. Zum Beispiel werden Speicherproteingen-Promotoren hauptsächlich im mittleren bis späten Embryoentwicklungsstadium exprimiert (Chen et al., Dev. Genet., 10(2): 112–122 (1989); Keddie et al., Plant Mol. Biol., 19(3): 443–53 (1992); Sjodahl et al., Planta., 197(2): 264–71 (1995); Reidt et al., Plant J., 21(5): 401–8 (2000)) und können auch Aktivität in anderen Geweben, wie Pollen, Staubgefäßen und/oder Staubbeuteln, besitzen (zum Beispiel der Phaseolinpromotor, wie von Ahm, V, et al. Plant Phys 109: 1151-1158 (1995), berichtet; oder der zmHyPRP-Promotor, wie in Gene 356 (2005), 146–152, beschrieben; oder Promotoren, die im US-Patent 5 912 414 beschrieben sind).
  • Aus diesem Grund besteht im Fachbereich ein großer Bedarf an der Identifizierung von neuen Sequenzen, die für die Expression ausgewählter Transgene in wirtschaftlich bedeutenden Pflanzen benutzt werden können. Somit besteht das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem darin, neue und alternative Expressionskassetten zur Embryo-Expression von Transgenen in Pflanzen bereitzustellen. Das Problem wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Demgemäßt betrifft eine erste Ausführungsform der Erfindung eine Expressionskassette für die Regulierung von samenspezifischer Expression eines Polynukleotids von Interesse, wobei die Expressionskassette eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe von Sequenzen gewählt ist, welche aus Folgenden besteht:
    • (a) einer Nukleinsäuresequenz von der SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18, oder einer Variante davon;
    • (b) einer Nukleinsäuresequenz, die zu mindestens 80% identisch ist mit einer Nukleinsäuresequenz, die in einer beliebigen der SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18 gezeigt ist;
    • (c) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18 hybridisiert, oder einer Variante davon;
    • (d) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz der SEQ ID NRn.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 befindet, oder einer Variante davon;
    • (e) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz befindet; welche eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NRn.: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 codiert, oder einer Variante davon;
    • (f) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz befindet, welche zu mindestens 80% identisch ist zu einer Offenen-Leseraster-Sequenz der SEQ ID NRn.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert;
    • (g) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts eines offenen Leserasters befindet, codierend eine Aminosäuresequenz, welche zu mindestens 80% identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NRn.: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert;
    • (h) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder durch thermische asymmetrische verschachtelte Polymerasekettenreaktion (TAIL-PCR) auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz, wie in den SEQ ID NRn.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt, erhältlich ist; und
    • (i) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz erhältlich ist, welche zu mindestens 80% mit einem offenen Leseraster identisch ist, wie in SEQ ID NRn.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35 oder 36 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert; und
    • (j) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz erhältlich ist, die eine Aminosäuresequenz codiert, welche zu mindestens 80% mit einer durch ein offenes Leseraster codierten Aminosäuresequenz identisch ist, wie in einer beliebigen der SEQ ID NRn.: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Expressionskassette ferner mindestens ein Polynukleotid von Interesse, das in funktionsfähiger Weise an die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz verknüpft ist, welches vorzugsweise heterolog in Bezug auf die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz ist.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein(e) transgenes(n) Pflanzengewebe, Pflanzenorgan, Pflanze oder Samen, umfassend die Expressionskassette oder den Vektor der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise ist die transgene Pflanze eine Monokotyle.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines(r) transgenen Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens, umfassend
    • (a) das Einführen der Expressionskassette oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle; und
    • (b) das Regenerieren der Pflanzenzelle zur Bildung eines(r) Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines(r) transgenen Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens, umfassend
    • (a) das Integrieren der Expressionskassette oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in das Genom einer Pflanzenzelle;
    • (b) das Regenerieren der Pflanzenzelle zur Bildung eines(r) Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens, und
    • (c) das Selektieren der Pflanzenzelle zur Bildung eines(r) Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens bezüglich der Anwesenheit der Expressionskassette oder des Vektors der vorliegenden Erfindung.
  • Andere Ausführungsformen der Erfindung betreffen Vektoren, die eine Expressionskassette der Erfindung umfassen, und transgene Wirtszellen oder transgene Pflanze(n), die eine Expressionskassette oder einen Vektor der Erfindung umfassen, und Verfahren zur Herstellung derselben.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1: q-RT-PCR-Ergebnisse der KG-Kandidaten, welche das Gesamtsamen- oder Embryospezifische oder -präferierende Expressionsmuster zeigen [Root_dv: eine Mischung von Wurzeln bei 5, 15, 30 Tagen nach Bestäubung(DAP); Leaf_dv: eine Mischung von Blättern bei 5, 15, 30 DAP; Ähre: eine Mischung von Ähren bzw. Kolben bei 5 und 10 DAP; Gesamtsamen: eine Mischung von ganzen Samen bei 15, 20, 30 DAP; Endosperm: eine Mischung von Endosperm bei 15, 20, 30 DAP; Embryo: eine Mischung von Embryo bei 15, 20, 30 DAP; Root_V2+V4: eine Mischung von Wurzel bei den V2- und V4-Stadien; Shoot/leaf_V2+V4: eine Mischung von V2-Spross und V4-Blättern; Flower_GS: eine Mischung von Blüte(n) und keimenden Samen].
  • 2(A) und (B) Diagramme von binären KG-Vektoren
  • 3: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG24 in transgenem Mais mit RHF155
  • 4: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG37 in transgenem Mais mit RKF109
  • 5: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG45 in transgenem Mais mit RKF106
  • 6: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG46 in transgenem Mais mit RKF107
  • 7: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG49 in transgenem Mais mit RKF108
  • 8: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG56 in transgenem Mais mit RKF125
  • 9: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG103 in transgenem Mais mit RHF128
  • 10: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG119 in transgenem Mais mit RHF138
  • 11: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG129 in transgenem Mais mit RTP1047
  • 12: q-RT-PCR-Ergebnisse der MA-Kandidaten [Root_dv: eine Mischung von Wurzeln bei 5, 15; 30 Tagen nach Bestäubung(DAP); Leaf_dv: eine Mischung von Blättern bei 5, 15, 30 DAP; Ähre: eine Mischung von Ähren bzw. Kolben bei 5 und 10 DAP; Gesamtsamen: eine Mischung von ganzen Samen bei 15, 20, 30 DAP; Endosperm: eine Mischung von Endosperm bei 15, 20, 30 DAP; Embryo: eine Mischung von Embryo bei 15, 20, 30 DAP; Root_V2+V4: eine Mischung von Wurzel bei den V2- und V4-Stadien; Shoot/leaf_V2+V4: eine Mischung von V2-Spross und V4-Blättern; Flower_GS: eine Mischung von Blüte(n) und keimenden Samen].
  • 13: Vektor RCB 1006 für MAWS-Promotoren
  • 14: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAWS23 in transgenem Mais mit RTP1060
  • 15: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAWS27 in transgenem Mais mit RTP1059
  • 16: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAWS30 in transgenem Mais mit RTP1053
  • 17: GUS-Expression, in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAWS57 in transgenem Mais mit RTP1049
  • 18: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAWS60 in transgenem Mais mit RTP1056
  • 19: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAWS63 in transgenem Mais mit RTP1048
  • 20: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAEM1 in transgenem Mais mit RTP1061
  • 21: GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAEM20 in transgenem Mais mit RTP1064
  • 22: qRT-PCR-Ergebnisse von dem Zm.8705.1.S1_at
  • 23: Digitalbild des GenomWalk (GW), aufgetrennt auf einem 1% w/v Agarosegel und angefärbt mit Ethidiumbromid. Die Spuren (L) bedeuten Folgendes: (L1)1kb plus-Leitern (Promega, Madison, WI, USA), (L2) keine DNA (GW-Bibliothek wurde durch steriles ddH2O ersetzt) als Negativkontrolle; (L3) Humane PvuII-GW-Bibliothek und die Primer aus ”Human-Gewebe-Typ”-Plasminogenaktivator, bereitgestellt vom Kit als eine Positivkontrolle, (L4)B73 PvuII-GW-Bibliothek, (L5)B73 EcoRV-GW-Bibliothek, (L6)B73 DraI-GW-Bibliothek, (7)B73 StuI-GW-Bibliothek. L3 unter Verwendung von Primern aus ”Human-Gewebe-Typ”-Plasminogenaktivator (tPA), wie vom Kit bereitgestellt. 12 und 14 bis einschließlich L7) unter Verwendung von ZmNP28-spezifischen Primern.
  • 24: Finale Binärvektoren RLN 90 (A) und RLN 93 (B); 24(C) ist ein Diagramm von RHF160, und 24(D) ist ein Diagramm von RHF158.
  • 25: (A) GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien, angetrieben durch pZmNP28_655 in transgenem Mais mit RLN90; (B) GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien, angetrieben durch pZmNP28_507 in transgenem Mais mit RLN93; (C) GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien, angetrieben durch pZmNP28_1706 in transgenem Mais mit RHF158; (D) GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien, angetrieben durch pZmNP28_2070 in transgenem Mais mit RHF160. BESCHREIBUNG DER SEQUENZIDENTIFIKATIONSNUMMERN BEZÜGLICH DER PROMOTOREN
    Name Promotor CDS Aminosäure Vektor Gen ESTs Variante 1 Variante 2 Fragmente
    MAWS60 1 19 37 55 73 91 109 127
    MAEM1 2 20 38 56 74 92 110 128
    KG_56 3 21 39 57 75 93 111 129 145
    KG_129 4 22 40 58 76 94 112 130 146
    MAEM20 5 23 41 59 77 95 113 131
    MAWS27 6 24 42 60 78 96 114 132
    MAWS63 7 25 43 61 79 97 115 133
    KG_49 8 26 44 62 80 98 116 134 147
    KG_24 9 27 45 63 81 99 117 135 148
    KG_37 10 28 46 64 82 100 118 136 149
    KG_45 11 29 47 65 83 101 119 137 150
    KG_46 12 30 48 66 84 102 120 138 151
    KG_103 13 31 49 67 85 103 121 139 152
    KG_119 14 32 50 68 86 104 122 140 153
    MAWS23 15 33 51 69 87 105 123 141
    MAWS30 16 34 52 70 88 106 124 142
    MAWS57 17 35 53 71 89 107 125 143
    ZmNP28 18 36 54 72 90 108 126 144
  • ALLGEMEINE DEFINITIONEN
  • Es versteht sich, dass diese Erfindung nicht auf (eine) spezielle Methodik, Protokolle, Zelllinien, Pflanzenspezies oder -gattungen, Konstrukte und Reagenzien, die als solche beschrieben sind, beschränkt ist. Es versteht sich ebenfalls, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich dem Zwecke der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken soll, die nur durch die anhängigen Ansprüche beschränkt ist. Es ist darauf hinzuweisen, dass, wie hierin und in den anhängigen Ansprüchen verwendet, die Singularformen ”ein(e)” ”und” und ”der, die, das” die Bezugnahme auf den Plural einschließen, wenn der Kontext nicht eindeutig etwas anderes besagt. So ist zum Beispiel die Bezugnahme auf einen ”Vektor” eine Bezugnahme auf einen oder mehrere Vektoren und schließt Äquivalente davon, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, etc. ein.
  • Der Begriff ”etwa” wird hierin in der Bedeutung von ungefähr, in etwa, circa oder im Bereich von verwendet. Wenn der Begriff ”etwa” in Verbindung mit einem Zahlenbereich verwendet wird, modifiziert er diesen Bereich durch Erweitern der Grenzen auf oberhalb und unterhalb der angeführten Zahlenwerte. Im Allgemeinen wird der Begriff ”etwa” hierin verwendet, um einen Zahlenwert oberhalb und unterhalb des angegebenen Werts mit einer Abweichung von 20 Prozent, vorzugsweise 10 Prozent nach oben oder unten zu verändern (höher oder niedriger).
  • Wie hierin verwendet, bedeutet das Wort ”oder” jedes beliebige Mitglied aus einer speziellen Liste und schließt auch jegliche Kombination von Mitgliedern dieser Liste ein.
  • ”Expressionskassette”, wie hierin verwendet, bedeutet ein lineares oder ringförmiges Nukleinsäuremolekül. Sie umfasst DNA- sowie RNA-Sequenzen, die in der Lage sind, die Expression einer speziellen Nukleotidsequenz in einer geeigneten Wirtszelle zu steuern. Im Allgemeinen umfasst sie einen Promotor, der funktionell mit mit einem Polynukleotid von Interesse verbunden ist, das – gegebenenfalls – mit Terminierungssignalen und/oder anderen regulatorischen Elementen funktionell verknüpft ist. Die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, wie im Folgenden definiert, umfassen soll. Eine Expressionskassette kann auch Sequenzen umfassen, die für die richtige Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. Die Codierungsregion codiert in der Regel für ein Protein von Interesse, kann aber auch für eine funktionelle RNA von Interesse codieren, zum Beispiel Antisinn- bzw. Antisense-RNA oder eine nicht-translatierte RNA in der Sinn- oder Antisinn-Richtung. Die Expressionskassette, welche die Polynukleotidsequenz von Interesse umfasst, kann chimär sein, was bedeutet, dass mindestens eine ihrer Komponenten bezüglich mindestens einer ihrer anderen Komponenten heterolog ist. Die Expressionskassette kann auch eine solche sein, die natürlich vorkommend ist, aber in einer rekombinanten Form erhalten wurde, die für die heterologe Expression nützlich ist. Eine Expressionskassette kann zur Gänze extrazellulär assembliert werden (z. B. durch rekombinante Klonierungstechniken). Allerdings kann eine Expressionskassette auch unter Verwendung von zum Teil endogenen Komponenten assembliert werden. Zum Beispiel kann eine Expressionskassette durch Platzieren (oder Inserieren) einer Promotorsequenz stromaufwärts einer endogenen Sequenz erhalten werden, die dadurch funktionsfähig an die Promotorsequenzen verknüpft wird und unter deren Kontolle gerät. Desgleichen kann eine Nukleinsäuresequenz, die exprimiert werden soll, stromabwärts von einer endogenen Promotorsequenz platziert (oder inseriert) werden, wodurch eine Expressionskassette gebildet wird. Die Expression der Nukleotidsequenz in der Expressionskassette kann unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors stehen, welcher die Transkription nur initiiert, wenn die Wirtszelle irgendeinem speziellen externen Reiz ausgesetzt wird. Im Falle eines mehrzelligen Organismus kann der Promotor auch für ein spezielles Gewebe oder Organ oder Entwicklungsstadium spezifisch sein (z. B. die Embryo-präferentiellen oder Embryo-spezifischen Promotoren der Erfindung). In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen solche Expressionskassetten die Transkriptionsinitiierungsregion der Erfindung, die mit einer Nukleotidsequenz von Interesse verknüpft ist. Eine solche Expressionskassette ist vorzugsweise mit einer Vielzahl an Restriktionsstellen für die Insertion des Gens von Interesse versehen, um unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen Regionen zu stehen. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene enthalten. Die Kassette schließt in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsinitierungsregion, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine Transkriptions- und Translationsterminierungsregion, die in Pflanzen funktionell ist, ein. Die Terminierungsregion kann bezüglich der Transkriptionsinitiierungsregion nativ sein, kann bezüglich der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann von einer anderen Quelle abgeleitet sein. Herkömmliche Terminierungsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens verfügbar, wie etwa die Octopin-Synthase- und Nopalin-Synthase-Terminierungsregionen und andere, die weiter unten beschrieben sind (siehe auch Guerineau 1991; Proudfoot 1991; Sanfacon 1991; Mogen 1990; Munroe 1990; Ballas 1989; Joshi 1987). Die Expressionskassette kann auch eine Mehrfachklonierungsstelle umfassen. In einem solchen Fall ist die Mehrfachklonierungsstelle vorzugsweise in einer Weise angeordnet, um die funktionelle Verknüpfung eines in der Mehrfachklonierungsstelle einzuführenden Polynukleotids mit der transkriptionsregulierenden Sequenz zu ermöglichen. Zusätzlich zu den vorgenannten Komponenten könnte die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Komponenten umfassen, die für eine homologe Rekombination erforderlich sind, d. h. flankierende genomische Sequenzen von einem Ziel-Locus. Jedoch wird auch eine Expressionskassette in Betracht gezogen, die im Wesentlichen aus der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz, wie im Folgenden definiert, besteht.
  • ”Promotor” bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die für gewöhnlich stromaufwärts (5') zu ihrer codierenden Sequenz liegt, welche die Expression der codierenden Sequenz kontrolliert durch Vorsehen der Erkennung für RNA-Polymerase und andere Faktoren, die für eine ordnungsgemäße Transkription erforderlich sind. ”Promotor” schließt einen Minimalpromotor ein, bei dem es sich um eine kurze DNA-Sequenz handelt, die sich in manchen Fällen aus einer TATA-Box und anderen Sequenzen, die zur Spezifizierung der Trankriptionsinitiierungsstelle dienen, zusammensetzt, zu welchem regulatorische Elemente für die Steigerung der Expression hinzugezählt werden. ”Promotor” bezieht sich auch auf eine Nukleotidsequenz, die einen Minimalpromotor plus regulatorische Elemente einschließt und die in der Lage ist, die Expression einer Codiersequenz oder funktionellen RNA zu kontrollieren. Dieser Typ von Promotorsequenz besteht aus proximalen und mehr distalen stromaufwärts gelegenen Elementen, wobei die letztgenannten Elemente häufig als Enhancer bezeichnet werden. Demzufolge ist ein ”Enhancer” eine DNA-Sequenz, die Promotoraktivität stimulieren kann und ein von Natur aus zugehöriges Element des Promotors oder ein heterologes Element sein kann, das zur Steigerung des Spiegels oder der Gewebespezifität eines Promotors inseriert wird. Er ist in der Lage, in beiden Orientierungen (normal oder umgedreht) zu operieren, und ist in der Lage, selbst dann zu funktionieren, wenn man ihn entweder nach stromaufwärts oder stromabwärts vom Promotor verschiebt. Sowohl Enhancer als auch andere stromaufwärts gelegene Promotorelemente binden sequenzspezifische DNA-Bindungsproteine, die ihre Wirkungen vermitteln. Promotoren können in ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen abgeleitet sein oder sich aus verschiedenen Elementen zusammensetzen, die aus unterschiedlichen Promotoren abgeleitet sind, wie sie in der Natur zu finden sind, oder sich gar aus synthetischen DNA-Segmenten zusammensetzen. Ein Promotor kann auch DNA-Sequenzen enthalten, die an der Bindung von Proteinfaktoren beteiligt sind, welche die Wirksamkeit der Transkriptionsinitiierung in Reaktion auf physiologische oder Entwicklungszustände kontrollieren. Die ”Initiierungsstelle” ist die Position, die das erste Nukleotid umgibt, das Teil der transkribierten Sequenz ist, die auch als die ”Position +1” definiert ist. In Bezug auf diese Stelle werden alle anderen Sequenzen des Gens und dessen Steuerungsregionen nummeriert. Stromabwärts gelegene Sequenzen (d. h. weitere Protein-codierende Sequenzen in der 3'-Richtung) werden positiv angegeben, während stromaufwärts gelegene Sequenzen (meistens von den Steuerungsregionen in der 5'-Richtung) negativ angegeben werden. Promotorelemente, wie ein TATA-Element, die inaktiv sind oder eine stark reduzierte Promotoraktivität in Abwesenheit einer von Stromaufwärts ausgehenden Aktivierung aufweisen, werden als ”Minimal”- oder ”Kern”-Promotoren bezeichnet. In Gegenwart eines geeigneten Transkriptionsfaktors hat der Minimalpromotor die Funktion, Transkription zuzulassen. Ein ”Minimal”- oder ”Kern”-Promotor besteht somit lediglich aus allen basalen Elementen, die für die Transkriptionsinitiierung benötigt werden, z. B. einer TATA-Box und/oder einem Initiator.
  • ”Konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der in der Lage ist, das offene Leseraster (ORF) in allen oder nahezu allen Pflanzengeweben während aller oder nahezu aller Entwicklungsstadien der Pflanze zu exprimieren. Jedes der transkriptionsaktivierenden Elemente zeigt keine absolute Gewebespezifität, sondern vermittelt eine Transkriptionsaktivierung in den meisten Pflanzengeweben bei einem Spiegel von zumindest 1% von jenem, der in dem Pflanzengewebe erzielt wird, in dem die Transkription am aktivsten ist. ”Konstitutive Expression” bezieht sich auf Expression unter Verwendung eines konstitutiven Promotors.
  • ”Regulierter Promotor” bezieht sich auf Promotoren, welche die Genexpression nicht konstitutiv, sondern in einer zeitlich und räumlich regulierten Weise steuern und schließt sowohl gewebespezifische als auch induzierbare Promotoren ein. Dieser schließt natürliche und synthetische Sequenzen sowie Sequenzen, die eine Kombination von synthetischen und natürlichen Sequenzen sein können, ein. Unterschiedliche Promotoren können die Expression eines Gens in verschiedenen Geweben oder Zelltypen oder in unterschiedlichen Entwicklungsstadien, oder in Reaktion auf unterschiedliche Umweltbedingungen steuern. Neue Promotoren verschiedener Typen, die in Pflanzenzellen nützlich sind, werden ständig gefunden, und zahlreiche Beispiele sind in der Zusammensetellung von Okamuro et al. (1989) zu finden. Typische regulierte Promotoren, die in Pflanzen nützlich sind, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Safener-induzierbare Promotoren, Promotoren, die vom Tetracyclin-induzierbaren System abgeleitet sind, Promotoren, die von Salicylat-induzierbaren Systemen abgeleitet sind, Promotoren, die von Alkohol-induzierbaren Systemen abgeleitet sind, Promotoren, die vom Glucocorticoid-induzierbaren System abgeleitet sind, Promotoren, die von Pathogen-induzierbaren Systemen abgeleitet sind, und Promotoren, die von Ekdyson-induzierbaren Systemen abgeleitet sind, ein. ”Konditionale” und ”regulierte Expression” beziehen sich auf eine Expression, die durch einen regulierten Promotor gesteuert wird.
  • ”Induzierbarer Promotor” bezieht sich auf jene regulierten Promotoren, die in einem oder mehreren Zelltyp(en) durch einen externen Reiz, wie eine Chemikalie, Licht, ein Hormon, Stress oder ein Pathogen angeschaltet werden können.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich ”transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz” auf Nukleotidsequenzen, welche die Transkription, RNA-Prozessierung oder -Stabilität, oder die Translation der assoziierten (oder funktionell verknüpften) Nukleotidsequenz, die transkribiert werden soll, beeinflussen. Die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz kann verschiedene Lokalisationen hinsichtlich der zu transkribierenden Nukleotidsequenzen besitzen. Die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz kann stromaufwärts (5'-Nicht-Codiersequenzen) innerhalb oder stromabwärts (3'-Nicht-Codiersequenzen) der zu transkribierenden Sequenz (z. B. einer Codiersequenz) lokalisiert sein. Die transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen können aus der Gruppe gewählt werden, die Enhancer, Promotoren, Translations-Leader-Sequenzen, Introns, 5'-untranslatierte Sequenzen, 3'-untranslatierte Sequenzen und Polyadenylierungssignal-Sequenzen umfasst. Sie schließen natürliche und synthetische Sequenzen sowie Sequenzen, die eine Kombination von synthetischen und natürlichen Sequenzen sein können,. ein. Wie oben erwähnt, ist der Ausdruck ”transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz” nicht auf Promotoren beschränkt. Jedoch umfasst eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz der Erfindung vorzugsweise mindestens eine Promotorsequenz (z. B. eine Sequenz, die stromaufwärts des Transkriptionsstart eines Gens gelegen ist, die in der Lage ist, eine Transkription der stromabwärts gelegenen Sequenzen zu induzieren). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz der Erfindung die Promotorsequenz des entsprechenden Gens und – gegebenenfalls und vorzugsweise – die native 5'-untranslatierte Region des Gens. Darüber hinaus kann auch die 3'-untranslatierte Region und/oder die Polyadenylierungsregion des Gens verwendet werden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”cis-regulatorisches Element” oder ”Promotormotiv” auf ein cis-wirkendes transkriptionales regulatorisches Element, das einen Aspekt der insgesamten Steuerung der Genexpression vermittelt. Ein cis-Element kann zum Binden von Transkriptionsfaktoren, trans-wirkenden Proteinfaktoren, welche die Transkription regulieren, fungieren. Manche cis-Elemente binden mehr als einen Transkriptionsfaktor, und Transkriptionsfaktoren können bei unterschiedlichen Affinitäten mit mehr als einem cis-Element Wechselwirken. Die Promotoren der vorliegenden Erfindung enthalten erwünschtermaßen cis-Elemente, welche Genexpression herbeiführen oder modulieren können. Cis-Elemente können durch eine Reihe von Techniken identifiziert werden, einschließlich Deletionsanalyse, d. h. Deletieren von einem oder mehreren Nukleotiden vom 5'-Ende oder intern aus einem Promotor; DNA-Bindungsprotein-Analyse mit Hilfe von DNase I-Footprinting, Methylierungs-Störung, Elektrophorese-Mobilitäts-Verschiebungstests, In-vivo-genomischem Footprinting durch Ligations-vermittelte PCR, und anderen herkömmlichen Testverfahren; oder durch Analyse der DNA-Sequenzähnlichkeit zu bekannten cis-Element-Motiven mittels herkömmlicher DNA-Sequenzvergleichsmethoden. Die Feinstruktur eines cis-Elements kann ferner durch Mutagenese (oder Substitution) von einem oder mehreren Nukleotiden oder durch andere herkömmliche Methoden untersucht werden. Cis-Elemente können durch chemische Synthese oder durch isolieren aus Promotoren, welche solche Elemente umfassen, erhalten werden, und sie können mit zusätzlichen flankierenden Nukleotiden synthetisiert werden, welche nützliche Restriktionsenzymstellen zum Erleichtern einer Teilsequenz-Manipulation enthalten.
  • Das ”Expressionsmuster” eines Promotors (mit oder ohne Enhancer) ist das Muster der Expressionsspiegel, welches zeigt, wo in der Pflanze und in welchen Entwicklungsstadium die Transkription durch den Promotor initiiert wird. Von Expressionsmustern eines Satzes von Promotoren sagt man, komplementär zu sein, wenn das Expressionsmuster eines Promotors wenig Überlappung mit dem Expressionsmuster des anderen Promotors zeigt. Der Spiegel der Expression eines Promotors kann durch Messung der Gleichgewichts- bzw. 'steady state'-Konzentration einer standardmäßigen transkribierten Reporter-mRNA bestimmt werden. Diese Messung ist indirekt, da die Konzentration der Reporter-mRNA nicht nur von ihrer Syntheserate abhängt, sondern auch von der Rate, mit welcher die mRNA abgebaut wird. Deshalb ist der Gleichgewichts-Spiegel das Produkt der Syntheseraten und der Abbauraten. Die Abbaurate kann jedoch so angesehen werden, als ob sie bei einer festen Rate abläuft, wenn die transkribierten Sequenzen identisch sind, und somit kann dieser Wert als Maß für die Synthese-Raten dienen. Wenn Promotoren auf diese Weise verglichen werden, sind Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet zur Verfügung stehen, die Hybridisierungs-S1-RNAse-Analyse, Northern-Blots und kompetitive RT-PCR. Diese Liste von Techniken repräsentiert keineswegs alle verfügbaren Techniken, sondern beschreibt vielmehr häufig angewandte Verfahrensweisen, die angewandt werden, um Transkriptions-Aktivität. und Expressionsspiegel von mRNA zu analysieren. Die Analyse von Transkriptionsstartpunkten in praktisch allen Promotoren hat ergeben, dass es in der Regel keine einzelne Base gibt, an der die Transkription beginnt, sondern eher einen mehr oder weniger gruppierten Satz von Initiationsstellen, von denen jede für manche Startpunkte der mRNA verantwortlich ist. Da diese Verteilung von Promotor zu Promotor variiert, unterscheiden sich die Sequenzen der Reporter-mRNA in jeder der Populationen voneinander. Weil jede mRNA-Spezies mehr oder weniger anfällig für einen Abbau ist, darf man keine einheitliche Abbaurate für verschiedene Reporter-mRNAs erwarten. Es ist für verschiedene eukaryotische Promotorsequenzen gezeigt worden, dass die Sequenz um die Initiationsstelle herum (”Initiator”) eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des Spiegels der RNA-Expression, die von diesem speziellen Promotor gesteuert wird, spielt. Dies schließt auch einen Teil der transkribierten Sequenzen ein. Die direkte Fusion eines Promotors an Reportersequenzen würde daher zu suboptimalen Spiegeln der Transkription führen. Ein häufig verwendetes Vorgehen, um Expressionsmuster und -spiegel zu analysieren, erfolgt durch die Bestimmung des ”steady state”-Spiegels der Proteinakkumulation in einer Zelle. Häufig verwendete Kandidaten für das Reportergen, die dem Fachmann im Gebiet bekannt sind, sind beta-Glucuronidase (GUS), Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) und Proteine mit fluoreszierenden Eigenschaften, wie z. B. Grün-Fluoreszierendes-Protein (GFP) aus Aequora victoria. Grundsätzlich sind jedoch viele andere Proteine für diesen Zweck geeignet, sofern das Protein nicht essentielle Pflanzenfunktionen beeinträchtigt. Für die Quantifizierung und Bestimmung der Lokalisation ist eine Reihe von Werkzeugen geeignet. Nachweissysteme, die z. B. auf der immunchemischen, enzymatischen, fluoreszierenden Detektion und Quantifizierung basieren, können leicht erstellt werden oder stehen zur Verfügung. Proteinspiegel können in Extrakten aus Pflanzengewebe oder im intakten Gewebe mithilfe einer In-situ-Analyse der Proteinexpression bestimmt werden. Im Allgemeinen können individuelle transformierte Linien mit einem chimären Promotor-Reporter-Konstrukt bezüglich ihrer Spiegel der Expression des Reportergens variieren. Ebenfalls häufig zu beobachten ist das Phänomen, dass solche Transformanten keinerlei nachweisbares Produkt (RNA oder Protein) exprimieren. Die Variabilität der Expression wird gemeinhin 'Positions-Effekten' zugeschrieben, obwohl die molekularen Mechanismen, die dieser Inaktivität zu Grunde liegen, in der Regel nicht klar sind.
  • ”Gewebespezifischer Promotor” bezieht sich auf regulierte Promotoren, die nicht in allen Pflanzenzellen, sondern nur in einem oder mehreren Zelltypen in spezifischen Organen (wie etwa Blättern oder Samen), spezifischen Geweben (wie Embryo oder Kotyledon) oder spezifischen Zelltypen (wie Blattparenchym- oder Samenspeicherzellen), exprimiert werden. Zu ihnen zählen auch Promotoren, die zeitlich reguliert werden, wie in der frühen oder späten Embryogenese, während der Fruchtreifung, bei der Entwicklung von Samen oder Früchten, im voll ausdifferenzierten Blatt oder beim Einsetzen der Seneszenz. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich ”gewebespezifisch” vorzugsweise auf ”Samenspezifisch” oder ”Samen-präferentiell” oder Embryo-spezifisch oder Embryo-präferentiell.
  • ”Samen” wie hierin verwendet, bezieht sich vorzugsweise auf ganze Samen, Endosperm und embryonale Gewebe, stärker bevorzugt auf embryonales Gewebe. ”Spezifisch” im Sinne der Erfindung bedeutet, dass das Polynukleotid von Interesse, das mit der hierin umschriebenen transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz funktionsfähig verknüpft ist, vorwiegend in den angegebenen Geweben oder Zellen, wenn in einer Pflanze vorhanden, exprimiert wird. Eine vorwiegende Expression, wie hierin gemeint, ist durch eine statistisch signifikant höhere Menge an nachweisbarer Transkription in dem Gewebe oder den Zellen im Vergleich zu anderen Pflanzengeweben gekennzeichnet. Eine statistisch signifikante höhere Menge an Transkription ist vorzugsweise ein Betrag, der mindestens das Zweifache, Dreifache, Vierfache, Fünffache, Zehnfache, Hundertfache, Fünfhundertfache oder Tausendfache der Menge ist, welche in mindestens einem der anderen Geweben mit nachweisbarer Transkription gefunden wird. Alternativ ist sie eine Expression in dem angegebenen Gewebe oder der angegebenen Zelle, wobei der Betrag der Transkription in anderen Geweben oder Zellen sich auf weniger als 1%, 2%, 3%, 4% oder am meisten bevorzugt 5% der gesamten (ganze Pflanze) Menge der Expression beläuft. Die Menge der Transkription korreliert direkt mit der Menge an Transkripten (d. h. RNA) oder an von den Transkripten codierten Polypeptiden, die in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden sind. Geeignete Techniken zur Messung der Transkription, die entweder auf RNA oder Polypeptiden basieren, sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Gewebe- oder Zell-Spezifität bedeutet, alternativ und vorzugsweise zusätzlich zu dem oben Genannten, dass die Expression auf das/die angegebene(n) Gewebe oder Zellen beschränkt ist oder fast beschränkt ist, d. h. es im Wesentlichen keine nachweisbare Transkription in anderen Geweben gibt. Fast beschränkt, wie hierin gemeint, bedeutet, dass unspezifische Expression in weniger als zehn, weniger als fünf, weniger als vier, weniger als drei, weniger als zwei oder einem anderen Gewebe(n) nachweisbar ist. ”Samen-präferentiell” oder ”Embryo-präferentiell” im Kontext dieser Erfindung bedeutet die Transkription einer Nukleinsäuresequenz durch ein Transkriptions-regulierendes Element in einer Weise, so dass die Transkription der Nukleinsäuresequenz in Samen zu mehr als 50%, vorzugsweise mehr als 70%, stärker bevorzugt mehr als 80% der Gesamtmenge der RNA beiträgt, welche von der Nukleinsäuresequenz in der gesamten Pflanze während jedweder ihrer Entwicklungsstadien transkribiert wird.
  • ”Expression” bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation eines endogenen Gens, ORFs oder eines Abschnitts davon, oder eines Transgens in Pflanzen. Zum Beispiel, im Fall von Antisense-Konstrukten, kann Expression sich nur auf die Transkription der Antisense-DNA beziehen. Darüber hinaus bezieht sich Expression auf die Transkription und stabile Akkumulation von Sinn bzw. Sense (mRNA) oder funktioneller RNA. Die Expression kann sich auch auf die Herstellung von Protein beziehen.
  • Samenspezifische Expression kann durch Vergleichen der Expression einer Nukleinsäure von Interesse, z. B. eines Reportergens, wie GUS, das funktionsfähig mit der Expressionssteuerungssequenz verbunden ist, in den folgenden Geweben und Stadien bestimmt werden: 1) Wurzeln und Blätter im 5-Blatt-Stadium, 2) Stengel im V-7-Stadium, 3) Blattwerk, Hüllblatt und Griffelfäden im Blühstadium beim ersten Auftreten von Maisgriffelfäden, 4) Ährchen/Quaste bei Bestäubung, 5) Kolben oder Körner bei 5, 10, 15, 20 und 25 Tagen nach der Bestäubung. Vorzugsweise kann die Expression der Nukleinsäure von Interesse nur im Kolben oder den Körnern bei 5, 10, 15, 20 und 25 Tagen nach der Bestäubung in dem Assay festgestellt werden, wie in den beigefügten Figuren gezeigt. Die Expression des Polynukleotids von Interesse kann durch verschiedene gut bekannte Techniken, z. B. durch Northern-Blot- oder In-situ-Hybridisierungstechniken, wie in der WO 02/102970 beschrieben, und vorzugsweise durch histochemische GUS-Analyse, wie in den begleitenden Beispielen beschrieben, bestimmt werden. Transgene Pflanzen für die Analyse von samenspezifischer Expression können auch durch Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, und wie an anderer Stelle in dieser Beschreibung erörtert, erzeugt werden.
  • Der Ausdruck ”Nukleinsäure” bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und ihre Polymere davon entweder in einzel- oder doppelsträngiger Form, zusammengesetzt aus Monomeren (Nukleotiden), die einen Zucker, Phosphat und eine Base enthalten, welche entweder ein Purin oder Pyrimidin ist. Wenn nicht spezifisch eingeschränkt, umfasst der Begriff Nukleinsäuren, die bekannte Analoge von natürlichen Nukleotiden enthalten, welche ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure aufweisen und in einer Weise ähnlich zu natürlich vorkommenden Nukleotiden metabolisiert werden. Wenn nicht anders angegeben, umfasst eine bestimmte Nukleinsäuresequenz ebenfalls implizit konservativ modifizierte Varianten davon (z. B. degenerierte Codon-Substitutionen) und komplementäre Sequenzen ebenso wie die explizit angegebene Sequenz. Im Besonderen können degenerierte Codon-Substitutionen durch die Erzeugung von Sequenzen erhalten werden, in denen die dritte Position von einem oder mehreren ausgewählten (oder allen) Codons mit gemischtbasigen und/oder Desoxyinosin-Resten (Batzer 1991; Ohtsuka 1985; Rossolini 1994) substituiert ist. Ein ”Nukleinsäurefragment” ist ein Bruchteil eines gegebenen Nukleinsäuremoleküls. In höheren Pflanzen ist Desoxyribonukleinsäure (DNA) das genetische Material, während Ribonukleinsäure (RNA) an der Überführung von Information, die innerhalb der DNA enthalten ist, in Proteine beteiligt ist. Der Ausdruck ”Nukleotidsequenz” bezieht sich auf ein Polymer von DNA oder RNA, welches einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann, gegebenenfalls enthaltend synthetische, nichtnatürliche oder veränderte Nukleotidbasen, die imstande sind, in DNA- oder RNA-Polymere eingebaut zu werden. Die Ausdrücke ”Nukleinsäure” oder ”Nukleinsäuresequenz” können auch austauschbar mit Gen, cDNA, DNA und von einem Gen codierte RNA verwendet werden.
  • Die Erfindung umfasst isolierte oder im Wesentlichen gereinigte Nukleinsäure- oder Protein-Zusammensetzungen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, ist ein' ”isoliertes” oder ”gereinigtes” DNA-Molekül oder ein ”isoliertes” oder ”gereinigtes” Polypeptid ein DNA-Molekül oder Polypeptid, das, durch Menschenhand, abgesondert von seiner naturgegebenen Umgebung vorliegt und daher kein Produkt der Natur ist. Ein isoliertes DNA-Molekül oder Polypeptid kann in einer gereinigten Form vorliegen oder kann in einer nicht-natürlichen Umgebung, wie zum Beispiel einer transgenen Wirtszelle, vorliegen. Zum Beispiel ist ein ”isoliertes” oder ”gereinigtes” Nukleinsäuremolekül oder Protein, oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon, im Wesentlichen frei von anderem Zellmaterial, oder Nährmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt worden ist, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch sythetisiert worden ist. Vorzugsweise ist eine ”isolierte” Nukleinsäure frei von Sequenzen (vorzugsweise Proteincodierenden Sequenzen), die natürlicherweise die Nukleinsäure flankieren (d. h. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden) und zwar in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure abgeleitet ist. Zum Beispiel, in verschiedenen Ausführungsformen, kann das isolierte Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure abgeleitet ist, natürlicherweise flankieren. Ein Protein, das im Wesentlichen frei von Zellmaterial ist, schließt Zubereitungen von Protein oder Polypeptid ein, die weniger als etwa 30%, 20%, 10%, 5% (bezogen auf Trockengewicht) an verunreinigendem Protein enthalten. Wenn das Protein der Erfindung, oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon, rekombinant hergestellt wird, repräsentiert das Kulturmedium vorzugsweise weniger als etwa 30%, 20%, 10% oder 5% (bezogen auf Trockengewicht) an chemischen Vorläufern oder Chemikalien, die nicht das Protein von Interesse sind. Die Nukleotidsequenzen der Erfindung schließen sowohl die natürlich auftretenden Sequenzen als auch mutierte Formen (Varianten) ein. Solche Varianten werden weiterhin die gewünschte Aktivität besitzen, d. h., entweder Promotoraktivität oder die Aktivität des Produkts, das durch das offene Leseraster der Nicht-Varianten-Nukleotidsequenz codiert wird.
  • Der Ausdruck ”Variante” soll im Bezug auf eine Sequenz (z. B. ein Polypeptid' oder eine Nukleinsäuresequenz wie – zum Beispiel – eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz der Erfindung) im Wesentlichen ähnliche Sequenzen bedeuten. Für Nukleotidsequenzen, die ein offenes Leseraster umfassen, schließen Varianten solche Sequenzen ein, die, aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes, die identische Aminosäuresequenz des nativen Proteins codieren. Natürlich vorkommende allelische Varianten, wie diese, können durch die Anwendung von allgemein bekannten Techniken der Molekularbiologie, wie zum Beispiel mit Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken, identifiziert werden. Variante Nukleotidsequenzen schließen auch synthetisch abgeleitete Nukleotidsequenzen, wie jene, die beispielsweise unter Anwendung von ortsspezifischer Mutagenese hergestellt werden und, für offene Leseraster, das natürliche Protein codieren, sowie jene, die ein Polypeptid mit Aminosäuresubstitutionen im Vergleich zum natürlichen Protein codieren, ein. Im Allgemeinen werden Nukleotidsequenz-Varianten der Erfindung mindestens 40, 50, 60, bis 70%, z. B. vorzugsweise 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, bis 79%, im Allgemeinen mindestens 80%, z. B. 81%–84%, mindestens 85%, z. B. 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, bis 98% und 99% Nukleotidsequenzidentität zu der natürlichen (Wildtyp- oder endogenen) Nukleotidsequenz, d. h. zum Beispiel zu den SEQ-ID NRn.: 1 bis 18 oder 19 bis 36, aufweisen.
  • Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können für gesteigerte Expression in Pflanzen von Interesse ”optimiert” werden (siehe zum Beispiel WO 91/16432 ; Perlak 1991; Murray 1989). Auf diese Weise können die offenen Leseraster in Genen oder Genfragmenten unter Verwendung von pflanzlicherseits bevorzugten Codons synthetisiert werden (siehe zum Beispiel Campbell & Gowri, 1990 für eine Erörterung der vom Wirt bevorzugten Codon-Verwendung). Daher können die Nukleotidsequenzen für die Expression in jeder beliebigen Pflanze optimiert werden. Es wird anerkannt, dass alle Teile oder jeder beliebige Teil der Gensequenz optimiert oder synthetisch sein können. Dies bedeutet, dass sythetische oder teilweise optimierte Sequenzen ebenfalls verwendet werden können. Variante Nukleotidsequenzen und Proteine umfassen ebenfalls Sequenzen und Protein(e), die aus einer mutagenen und rekombinogenen Prozedur, wie etwa DNA-Shuffling; abgeleitet sind. Mit einer solchen Prozedur können eine oder mehrere verschiedene Codiersequenzen manipuliert werden, um ein neues Polypeptid zu erzeugen, das die gewünschten Eigenschaften besitzt. Auf diese Weise werden Bibliotheken von rekombinanten Polynukleotiden aus einer Population von Polynukleotiden verwandter Sequenz erstellt, welche Sequenzregionen umfassen, die substantielle Sequenzidentität aufweisen und in vitro oder in vivo homolog rekombiniert werden können. Strategien für derartiges DNA-Shuffling sind im Fachbereich bekannt (siehe zum Beispiel Stemmer 1994; Stemmer 1994; Crameri 1997; Moore 1997; Zhang 1997; Crameri 1998; und US 5 605 794 , 6, 8, 10 und 12 837 458 ).
  • Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzverwandtschaften zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polynukleotiden zu beschreiben: (a) ”Referenzsequenz”, (b) ”Vergleichsfenster”, (c) ”Sequenzidentität”, (d) ”Prozentsatz der Sequenzidentität”, und (e) ”wesentliche Identität”.
    • (a) Wie hierin verwendet, bedeutet ”Referenzsequenz” eine definierte Sequenz, die als eine Basis für den Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein; zum Beispiel wie ein Segment einer Volllängen-cDNA oder einer Gensequenz, oder die komplette cDNA oder Gensequenz.
    • (b) Wie hierin verwendet, bezieht sich ”Vergleichsfenster” auf ein zusammenhängendes und spezifiziertes Segment einer Polynukleotidsequenz, wobei die Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz (welche keine Additionen oder Deletionen umfasst) zum optimalen Alignment der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster mindestens 20 zusammenhängende Nukleotide lang, und kann wahlweise 30, 40, 50, 100 oder länger sein. Der Fachmann auf dem Gebiet versteht, dass zur Vermeidung von hoher Ähnlichkeit zu einer Referenzsequenz aufgrund der Einbeziehung von Lücken in der Polynukleotidsequenz typischerweise ein Lücken-Strafwert eingeführt und von der Anzahl an Übereinstimmungen abgezogen wird. Verfahren zum Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachbereich allgemein bekannt. Daher kann die Bestimmung eines Prozentsatzes der Identität zwischen zwei beliebigen Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Bevorzugte, nicht einschränkende Beispiele für solche mathematischen Algorithmen sind der Algorithmus von Myers und Miller, 1988; der Lokale-Homologie-Algorithmus von Smith et al. 1981; der Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch 1970; die Suche-nach-Ähnlichkeit-Methode von Pearson und Lipman 1988; der Algorithmus von Karlin und Altschul, 1990, der wie in Karlin und Altschul, 1993, modifiziert ist. Computerimplementationen von diesen mathematischen Algorithmen können für den Vergleich von Sequenzen verwendet werden, um Sequenzidentität zu bestimmen. Derartige Implementierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: CLUSTAL im PC/Gene-Programm (erhältlich von Intelligenetics, Mountain View, Calif.); das ALIGN-Programm (Version 2.0) und GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software-Paket, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USA). Alignments mit Hilfe von diesen Programmen können unter Verwendung der Vorgabe-Parameter erfolgen. Das CLUSTAL-Programm ist gut beschrieben (Higgins 1988, 1989; Corpet 1988; Huang 1992; Pearson 1994). Das ALIGN-Programm basiert auf dem Algorithmus von Myers und Miller, siehe oben. Die BLAST-Programme von Altschul et al., 1990, basieren auf dem Algorithmus von Karlin und Altschul, siehe oben. Mehrfachaligments (d. h. von mehr als 2 Sequenzen) werden vorzugsweise mit Hilfe des Algorithmus Clustal W (Thompson 1994; z. B. in der Software VektorNTITM, Version 9; Invitrogen Inc.) mit der Wertungsmatrix BLOSUM62MT2 bei den Vorgabeeinstelllungen (Lückenöffnungs-Strafwert 15/19, Lückenerweiterungs-Strafwert 6,66/0,05; Lückentrennungs-Strafbereich 8;%-Identität für Alignment-Verzögerung 40; unter Verwendung von Reste-spezifischen Lücken und hydrophilen Reste-Lücken) durchgeführt. Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich durch das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) zugänglich. Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren von hoch bewerteten bzw. ”high scoring” Sequenzpaaren (HSPs) durch Identifizieren von kurzen Wörtern der Länge W in der Abfragesequenz, die einem gewissen positiv bewerteten Schwellenwert T entweder entsprechen oder genügen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz aligniert werden. T wird als die Nachbarschafts-Wort-Wertungsschwelle (Altschul 1990) bezeichnet. Diese anfänglichen Nachbarschafts-Wort-Treffer wirken als Ankerkeime für den Beginn von Suchläufen, um längere HSPs, die diese enthalten, zu finden. Die Wort-Übereinstimmungstreffer werden dann in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz so weit erweitert, wie der kumulative Alignment-Punktwert erhöht werden kann. Kumulative Punktwerte werden, für Nukleotidsequenzen, unter Verwendung der Parameter M (Belohnungspunkte für ein Paar von übereinstimmenden Resten; stets > 0) und N. (Strafpunktzahl für nicht übereinstimmende Reste; stets < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Wertungsmatrix verwendet, um den kumulativen Punktwert zu berechnen. Die Erweiterung der Wort-Übereinstimmungstreffer in jede Richtung wird angehalten, wenn die kumulative Alignment-Punktzahl um den Betrag X von ihrem maximal erreichten Wert abfällt, die kumulative Punktzahl wegen der Ansammlung von einem oder mehreren negativ-bewerteten Reste-Alignments auf Null oder darunter geht, oder das Ende einer jeden Sequenz erreicht ist. Zusätzlich zur Berechnung der prozentualen Sequenzidentität führt der BLAST-Algorithmus auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul (1993)). Ein Maß der Ähnlichkeit, das durch den BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit liefert, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen rein zufällig auftreten würde. Zum Beispiel wird eine Test-Nukleinsäuresequenz als ähnlich zu einer Referenzsequenz angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Test-Nukleinsäuresequenz zu der Referenz-Nukleinsäuresequenz weniger als etwa 0,1, stärker bevorzugt weniger als etwa 0,01 und am meisten bevorzugt weniger als etwa 0,001 beträgt. Um lückenhaltige Alignments zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, wie in Altschul et al. 1997 beschrieben. Alternativ kann PSI-BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, um eine wiederholte Suche, die entfernte Verwandtschaften zwischen Molekülen detektiert, durchzuführen; siehe Altschul et al., supra. Bei Anwendung von BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST können die Vorgabeparameter der jeweiligen Programme (z. B. BLASTN für Nukleotidsequenzen, BLASTX für Proteine) benutzt werden. Das BLASTN-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, einen Cutoff von 100, M = 5, N = –4, und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10, und die BLOSUM62-Wertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, 1989). Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Das Alignment kann auch manuell durch Inspektion durchgeführt werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wird der Vergleich von Nukleotidsequenzen zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität zu spezifischen Nukleotidsequenzen (z. B. den hierin offenbarten Promotorsequenzen) vorzugsweise mit Hilfe des BlastN-Programms (version 1.4.7 oder höher) mit seinen Standardvorgabe-Parametern (Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, ein Cutoff von 100, M = 5, N = –4, und Vergleich beider Stränge) oder jedwedem äquivalenten Programm vorgenommen. Mit ”äquivalentes Programm” ist ein beliebiges Sequenzvergleichprogramm gemeint, das, für beliebige zwei betreffende Sequenzen, ein Alignment mit identischen Nukleotid- oder Aminosäure-Reste-Übereinstimmungen bzw. -Paarungen und einem identischen Prozentsatz der Sequenzidentität erstellt, wenn es mit dem entsprechenden durch das bevorzugte Programm erstellten Alignment verglichen wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein Vergleich von Polypeptid- oder Aminosäuresequenzen für die Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität/Homologie zu spezifischen Polypeptid- oder Aminosäuresequenzen vorzugsweise unter Verwendung des BlastP-Programms (Version 1.4.7 oder höher) mit seinen Standard-Parametern (Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10, und die BLOSUM62-Wertungsmatrix (Henikoff & Henikoff, 1989); siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov) oder jedwedem äquivalenten Programm vorgenommen. Mit ”äquivalentes Programm” ist ein beliebiges Sequenzvergleichprogramm gemeint, das, für jedwede zwei betreffenden Sequenzen, ein Alignment mit identischen Nukleotid- oder Aminosäure-Reste-Übereinstimmungen und einem identischen Prozentsatz an Sequenzidentität erstellt, wenn es mit dem entsprechenden durch das bevorzugte Programm erstellten Alignment verglichen wird.
    • (c) Wie hierin verwendet, bezieht sich ”Sequenzidentität” oder ”Identität” im Kontext von zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen auf die Reste in den zwei Sequenzen, die gleich sind, wenn sie für eine maximale Übereinstimmung über ein spezifiziertes Vergleichsfenster hinweg aliginiert werden. Wenn Prozentsatz der Sequenzidentität in Bezug auf Proteine verwendet wird, erkennt man, dass Restepositionen, die nicht identisch sind, sich häufig durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, in denen Aminosäurereste für andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z. B. Ladung oder Hydrophobizität) substituiert sind und daher die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht verändern. Wenn sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben angepasst werden, um eine Korrektur bezüglich der konservativen Art der Substitution vorzunehmen. Von Sequenzen, die sich durch solche konservativen Substitutionen unterscheiden, wird gesagt, eine ”Sequenzähnlichkeit” oder ”Ähnlichkeit” zu besitzen. Mittel zur Ausführung dieser Anpassung sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Typischerweise umfasst dies die Wertung einer konservativen Substitution eher als partielle denn als eine vollständige Fehlpaarung, wodurch der Prozentsatz der Sequenzidentität erhöht wird. So wird beispielsweise, wenn einer identischen Aminosäure ein Punktwert von 1 gegeben wird und einer nicht-konservativen Substitution ein Punktwert von Null gegeben wird, einer konservativen Substitution ein Punktwert zwischen Null und 1 gegeben. Die Wertung von konservativen Substitutionen wird berechnet, z. B. wie es im Programm PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.) implementiert ist.
    • (d) Wie hierin verwendet, bedeutet ”Prozentsatz der Sequenzidentität” den Wert, der durch Vergleichen von zwei optimal alignierten Sequenzen über ein Vergleichsfenster hinweg bestimmt wird, wobei der Abschnitt der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für ein optimales Alignment der zwei Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz wird durch Bestimmen der Anzahl der Positionen, an denen der identische Nukleinsäurebase- oder Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, zum Erhalt der Anzahl übereinstimmender Positionen, Dividieren der Anzahl übereinstimmender Positionen durch die Gesamtzahl an Positionen im Vergleichsfenster und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 berechnet, wodurch sich der Prozentsatz der Sequenzidentität ergibt.
    • (e) (i) Der Begriff ”wesentliche Identität” von Polynukleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynukleotid eine Sequenz umfasst, welche mindestens 38%, z. B. 39%, 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, oder 79%, vorzugsweise mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% oder 89%, stärker bevorzugt mindestens 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, und am meisten bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität im Vergleich zu einer Referenzsequenz unter Verwendung eines der beschriebenen Alignment-Programme unter Anwendung von Standardparametern aufweist. Ein Fachmann im Fachbereich wird erkennen, dass diese Werte in geeigneter Weise eingestellt werden können, um die entsprechende Identität von Proteinen, die durch zwei Nukleotidsequenzen codiert sind, zu bestimmen, und zwar unter Berücksichtigung der Codon-Degeneriertheit, der Aminosäureähnlichkeit, der Leserasterpositionierung und dergleichen. Eine substantielle bzw. wesentliche Identität von Aminosäuresequenzen für diese Zwecke bedeutet normalerweise eine Sequenzidentität von mindestens 38%, 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90%, 95%, und am meisten bevorzugt mindestens 98%. Ein weiterer Hinweis, dass Nukleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, besteht, wenn zwei Moleküle miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren (siehe unten). Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH liegen. Allerdings umfassen stringente Bedingungen Temperaturen im Bereich von etwa 1°C bis etwa 20°C, je nach dem gewünschten Grad an Stringenz, wie hierin anderweitig dargelegt ist. Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind immer noch im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, die sie codieren, im wesentlichen identisch sind. Dies kann auftreten, z. B., wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Codon-Degeneration erzeugt wird, welche vom genetischen Code erlaubt wird. Ein Hinweis, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn das von der ersten Nukleinsäure codierte Polypeptid immunologisch kreuzreaktiv mit dem Polypeptid ist, das von der zweiten Nukleinsäure codiert wird. (ii) Der Ausdruck ”wesentliche Identität” im Kontext eines Peptids gibt an, dass ein Peptid eine Sequenz mit mindestens 38%, z. B. 39%, 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, vorzugsweise 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, oder 89%, stärker bevorzugt mindestens 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, oder noch mehr bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Referenzsequenz über ein spezifiziertes Vergleichsfenster hinweg umfasst. Vorzugsweise wird ein optimales Alignment unter Verwendung des Homologie-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) durchgeführt. Ein Hinweis, dass zwei Peptidsequenzen im wesentlichen identisch sind, ist, dass ein Peptid immunologisch reaktiv mit Antikörpern ist, die gegen das zweite Peptid herangezüchtet wurden. Somit ist ein Peptid im wesentlichen identisch mit einem zweiten Peptid, wenn die beiden Peptide sich zum Beispiel nur durch eine konservative Substitution unterscheiden.
  • Für einen Sequenzvergleich wirkt eine Sequenz typischerweise als Referenzsequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, Subsequenzkoordinaten werden nach Bedarf vorgegeben, und die Sequenzalgorithmus-Programmparameter werden vorgegeben. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann die prozentuale Sequenzidentität für die Testsequenz(en) im Verhältnis zur Referenzsequenz auf Grundlage der vorgegebenen Programmparameter.
  • Wie oben erwähnt, ist ein weiterer Hinweis, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, dass die zwei Moleküle unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren. Der Ausdruck ”spezifisch hybridisierend an” bezieht sich auf die Bindung, Duplex-Bildung oder Hybridisierung eines Moleküls nur an eine bestimmte Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von (z. B. zellulärer gesamter) DNA oder RNA vorhanden ist. ”Bind(et) im wesentlichen” bezieht sich auf komplementäre Hybridisierung zwischen einer Sonden-Nukleinsäure und einer Ziel-Nukleinsäure und umfasst geringfügige Fehlpaarungen, die durch Reduzieren der Stringenz der Hybridisierungsmedien mit aufgenommen werden können, um die gewünschte Detektion der Ziel-Nukleinsäuresequenz zu erreichen.
  • ”Stringente Hybridisierungsbedingungen” und ”stringente Hybridisierungs-Waschbedingungen” im Kontext von Nukleinsäure-Hybridisierungsexperimenten, wie Southern- und Northern-Hybridisierung, sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umweltbedingungs-Parametern unterschiedlich. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Die Spezifität ist typischerweise die Funktion von Waschungen nach der Hybridisierung, wobei die kritischen Faktoren die Ionenstärke und die Temperatur der letzten Waschlösung sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die Tm aus der Gleichung von Meinkoth und Wahl, 1984, angenähert werden: Tm = 81,5°C + 16,6 (log10M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% Form.) – 500/L wobei M die Molarität einwertiger Kationen ist,% GC der prozentuale Anteil an Guanosin- und Cytosin-Nukleotiden in der DNA ist,% Form. der Anteil an Formamid in der Hybridisierungslösung ist, und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Die Tm wird um etwa 1°C pro jedem 1% Fehlpaarung verringert; daher können Tm, Hybridisierung und/oder Wasch-Bedingungen justiert werden, um an Sequenzen der gewünschten Identität zu hybridisieren. Wenn zum Beispiel Sequenzen mit > 90% Identität gesucht werden, kann die Tm um 10°C verringert werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt I für die spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH liegen. Jedoch können stark stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 1, 2, 3, oder 4°C unterhalb des thermischen Schmelzpunkts I verwenden; moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder Waschen bei 6, 7, 8, 9, oder 10°C unterhalb des thermischen Schmelzpunkts I verwenden; Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unterhalb des thermischen Schmelzpunkts I verwenden. Bei Verwendung der Gleichung, Hybridisierung und Waschzusammensetzungen, und der gewünschten T, wird der Durchschnittsfachmann verstehen, dass Variationen in der Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschlösungen inhärent mit beschrieben sind. Wenn der gewünschte Grad an Fehlpaarung zu einem T von weniger als 45°C (wässrige Lösung) oder 32°C (Formamid-Lösung) führt, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration zu erhöhen, so dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann. Eine umfangreiche Anleitung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren wird in Tijssen, 1993 gefunden. Im Allgemeinen werden hochstringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen gewählt, um etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt Tm für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH zu liegen.
  • Ein Beispiel hochstringenter Waschbedingungen ist 0,15 M NaCl bei 72°C für etwa 15 Minuten. Ein Beispiel für stringente Waschbedingungen ist ein 0,2 × SSC-Waschschritt bei 65°C für 15 Minuten (siehe Sambrook, siehe unten, für eine Beschreibung von SSC-Puffer). Oft geht einer Hochstringenzwaschung eine Niedrigstringenzwaschung voraus, um Hintergrund-Sondensignal zu entfernen. Ein Beispiel für ein Waschen bei mittlerer Stringenz für einen Duplex von z. B. mehr als 100 Nukleotiden ist 1 × SSC bei 45°C während 15 Minuten. Ein Beispiel von Niedrigstringenzwaschung für einen Duplex von z. B. mehr als 100 Nukleotiden ist 4 bis 6 × SSC bei 40°C während 15 Minuten. Für kurze Sonden (z. B. etwa 10 bis 50 Nukleotide) beinhalten stringente Bedingungen typischerweise Salzkonzentrationen von weniger als etwa 1,5 M, weiter bevorzugt etwa 0,01 bis 1,0 M, Na-Ionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3, und die Temperatur beträgt typischerweise mindestens etwa 30°C und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (z. B. > 50 Nukleotide). Stringente Bedingungen können auch durch Zugabe von destabilisierenden Mitteln, wie Formamid, erreicht werden. Im Allgemeinen zeigt ein Signal-zu-Rauschen-Verhältnis von 2 × (oder höher) als jenes, das für eine nichtverwandte Sonde in dem besonderen Hybridisierungsassay beobachtet wird, die Detektion einer spezifischen Hybridisierung an. Nukleinsäuren, die nicht unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren, sind immer noch im wesentlichen identisch, wenn die Proteine, die sie codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies geschieht, wenn z. B. eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Codon-Degeneration, die durch den genetischen Code erlaubt ist, erzeugt wird.
  • Sehr stringente Bedingungen werden so ausgewählt, dass sie gleich zur Tm für eine jeweilige Sonde sind. Ein Beispiel hochstringenter Bedingungen für die Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuren, die mehr als 100 komplementäre Reste aufweisen, auf einem Filter in einem Southern- oder Northern-Blot sind 50% Formamid, z. B. Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 0,1 × SSC bei 60 bis 65°C. Beispielhafte Bedingungen niedriger Stringenz umfassen Hybridisierung mit einer Pufferlösung von 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und Waschen in 1 × bis 2 × SSC (20 × SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte Bedingungen mäßiger Stringenz umfassen Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid, 1,0 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 0,5 × bis 1 × SSC bei 55 bis 60°C.
  • Das folgende sind Beispiele für Sätze von Hybridisierungs-/Waschbedingungen, welche angewendet werden können, um Nukleotidsequenzen zu klonieren, welche im wesentlichen identisch zu den Referenz-Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung sind: eine Referenz-Nukleotidsequenz hybridisiert vorzugsweise an die Referenz-Nukleotidsequenz in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C unter Waschen in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C (Bedingungen mit sehr niedriger Stringenz), noch erwünschter in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C unter Waschen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C (Bedingungen mit niedriger Stringenz), noch stärker erwünscht in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C unter Waschen in 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C (Bedingungen mit mäßiger Stringenz), vorzugsweise in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C unter Waschen in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C (Bedingungen mit hoher Stringenz), stärker bevorzugt in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA bei 50°C unter Waschen in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C (Bedingungen mit sehr hoher Stringenz).
  • Die Ausdrücke ”offenes Leseraster” und ”ORF” beziehen sich auf die Aminosäuresequenzen, die zwischen dem Translations-Initiationscodon und -Terminationscodon einer codierenden Sequenz codiert sind. Die Ausdrücke ”Initiationscodon” und ”Terminationscodon” beziehen sich auf eine Einheit von drei aneinandergrenzenden Nukleotiden ('Codon') in einer codierenden Sequenz, welche die Initiation bzw. Kettentermination der Proteinsynthese (mRNA-Translation) vorgibt.
  • ”Codierende” oder ”Codier-Sequenz” bezieht sich auf eine DNA oder RNA-Sequenz, welche für eine spezifische Aminosäuresequenz codiert, und schließt die nicht-codierenden Sequenzen aus. Sie kann eine ”ununterbrochene codierende Sequenz”, d. h. ohne ein Intron, wie in einer cDNA, bilden oder sie kann ein oder mehrere Introns einschließen, die durch geeignete Spleiß-Verbindungsstellen begrenzt sind. Ein ”Intron” ist eine Sequenz von RNA, welche im primären Transkript enthalten ist, aber welche durch die Spaltung und Religation der RNA innerhalb der Zelle entfernt wird, wodurch die reife mRNA erzeugt wird, welche in ein Protein translatiert werden kann.
  • ”Operativ verknüpft” oder ”funktionell verknüpft” bezieht sich vorzugsweise auf die Assoziation von Nukleinsäuresequenzen auf einem einzelnen Nukleinsäurefragment, so dass die Funktion von einer durch die andere beeinflusst wird. Zum Beispiel sagt man, dass eine regulatorische DNA-Sequenz ”funktionell verknüpft an” oder ”assoziiert mit” einer für eine RNA oder ein Polypeptid codierenden DNA-Sequenz ist, wenn die beiden Sequenzen so angeordnet sind, dass die regulatorische DNA-Sequenz die Expression der codierenden DNA-Sequenz beeinflußt (d. h., dass die codierende Sequenz oder funktionelle RNA unter der transkriptionellen Steuerung bzw. Kontrolle des Promotors steht). Codierende Sequenzen können mit regulatorischen Sequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung funktionell verknüpft sein.
  • Die Begriffe ”heterologe DNA-Sequenz”, ”exogenes DNA-Segment” oder ”heterologe Nukleinsäure”, wie hierin verwendet, beziehen sich jeweils auf eine Sequenz, die aus einer Quelle, die fremd bezüglich der jeweiligen Wirtszelle ist, stammt oder, falls aus der gleichen Quelle, von ihrer ursprünglichen Form modifiziert ist. So schließt ein heterologes Gen in einer Wirtszelle ein Gen ein, das endogen bezüglich der jeweiligen Wirtszelle ist, aber zum Beispiel durch Anwendung von DNA-Shuffling modifiziert worden ist. Die Begrifflichkeiten schließen auch nicht-natürlich vorkommende Mehrfachkopien einer natürlich vorkommenden DNA-Sequenz ein. Die Begriffe beziehen sich somit auf ein DNA-Segment, das fremdartig bzw. heterolog bezüglich der Zelle ist, oder homolog bezüglich der Zelle ist aber innerhalb der Wirtszell-Nukleinsäure an einer Position vorliegt, bei der das Element für gewöhnlich nicht gefunden wird. Exogene DNA-Segmente werden exprimiert, um exogene Polypeptide zu erhalten. Eine ”homologe” DNA-Sequenz ist eine DNA-Sequenz, die von Natur aus mit einer Wirtszelle, in die sie eingeführt wird, assoziiert ist.
  • ”Homolog zu”, im Kontext von Nukleotidsequenzidentität, bezieht sich auf die Ähnlichkeit zwischen den Nukleotidsequenzen von zwei Nukleinsäuremolekülen oder zwischen den Aminosäuresequenzen von zwei Proteinmolekülen. Schätzungen einer solchen Homologie werden entweder durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung unter Bedingungen mit einer Stringenz, wie es von Fachleuten auf dem Gebiet gut verstanden wird (wie in Haines und Higgins (Hrsg.), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, Großbritannien, beschrieben), oder durch den Vergleich der Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäuren oder Proteinen bereitgestellt.
  • ”Vektor” ist so definiert, dass unter anderem ein beliebiges Plasmid-, Cosmid-, Phage- oder binäres Agrobacterium-Nukleinsäuremolekül in doppel- oder einzelsträngiger, linearer oder zirkulärer Form eingeschlossen sind, das selbst-überträgbar oder -mobilisierbar sein kann oder nicht, und das einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder durch Integration in das zelluläre Genom transformieren kann, oder aber extrachromosomal existieren kann (z. B. autonom replizierendes Plasmid mit einem Replikationsursprung).
  • Speziell eingeschlossen sind Shuttle-Vektoren, mit denen ein DNA-Vehikel gemeint ist, das, natürlich oder durch Design, zur Replikation in zwei verschiedenen Wirtsorganismen in der Lage ist, welche aus Actinomyceten und verwandten Arten, Bakterien und Eukaryoten (z. B. höhere Pflanzen-, Säugetier-, Hefe- oder Pilzzellen) ausgewählt werden können.
  • Vorzugsweise steht die Nukleinsäure in dem Vektor unter der Steuerung von einem angemessenen Promotor oder anderen regulatorischen Elementen für die Transkription in einer Wirtszelle, wie etwa in einer mikrobiellen, z. B. bakteriellen oder pflanzlichen Zelle, und ist funktionsfähig daran verknüpft. Der Vektor kann ein bifunktioneller Expressionsvektor sein, der in mehreren Wirten funktioniert. Im Fall von genomischer DNA, kann diese ihren eigenen Promotor oder ihre eigenen sonstigen regulatorischen Elemente enthalten, und im Falle von cDNA kann diese unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder sonstiger regulatorischer Elemente zur Expression in der Wirtszelle stehen.
  • ”Klonierungsvektoren” enthalten typischerweise eine oder eine kleine Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, an denen Fremd-DNA-Sequenzen in einer vorbestimmbaren Weise ohne Verlust der wesentlichen biologischen Funktion des Vektors, eingeführt werden können, ebensowie ein Markergen, das zur Verwendung bei der Identifikation und Selektion von Zellen, die mit dem Klonierungsvektor transformiert wurden, geeignet ist. Markergene schließen typischerweise Gene ein, die Tetracyclin-Resistenz, Hygromycin-Resistenz, Kanamycin-Resistenz, Streptomycin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz bereitstellen.
  • Ein ”Transgen” oder ”transgen” bezieht sich auf ein Gen, das durch Transformation in das Genom eingeführt worden ist und stabil oder transient gehalten wird. Transgene können zum Beispiel Gene einschließen, die entweder heterolog oder homolog bezüglich der Gene einer bestimmten zu transformierenden Pflanze sind. Darüber hinaus können Transgene native Gene, die in einen nicht-nativen Organismus eingeführt wurden, oder chimäre Gene umfassen. Der Begriff ”endogenes Gen” bezieht sich auf ein natives Gen an seinem natürlichen Ort im Genom eines Organismus. Ein ”Fremd”-Gen bezieht sich auf ein Gen, das normalerweise nicht im Wirtsorganismus gefunden wird, das aber durch Gentransfer eingebracht wird.
  • Der Begriff ”Transformation” bezieht sich auf den Transfer eines Nukleinsäurefragments in das Genom einer Wirtszelle. Wirtszellen, die die transformierten Nukleinsäurefragmente enthalten, werden als ”transgene” Zellen bezeichnet, und Organismen, die transgene Zellen umfassen werden als ”transgene Organismen” bezeichnet. Zu Beispielen für Verfahren zur Transformation von Pflanzen und pflanzlichen Zellen zählen Agrobacterium-vermittelte Transformation (De Blaere 1987) und Partikelbeschuss-Technologie ( US 4 945 050 ). Vollständige Pflanzen können aus transgenen Zellen durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind (siehe z. B. Fromm 1990), regeneriert werden.
  • ”Transformiert”, ”transgen” und rekombinant” beziehen sich auf einen Wirtsorganismus, wie ein Bakterium oder eine Pflanze, in den ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingebracht worden ist. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom integriert werden, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt und beschrieben ist (Sambrook 1989; Innis 1995; Gelfand 1995; Innis & Gelfand 1999). Zum Beispiel sind ”transformierte”, ”transformante” und. ”transgene” Pflanzen oder Calli durch das Transformationsverfahren behandelt worden und enthalten ein Fremdgen integriert in ihrem Chromosom. Der Ausdruck ”untransformiert” bezieht sich auf normale Pflanzen, die nicht durch das Transformationsverfahren behandelt wurden.
  • ”Transient transformiert” bezieht sich auf Zellen, in welchen Transgene und Fremd-DNA eingeführt worden sind (zum Beispiel durch solche Verfahren, wie Agrobacterium-vermittelte Transformation oder biolistischen Beschuss), die aber nicht für eine stabile Aufrechterhaltung selektiert wurden.
  • ”Stabil transformiert” bezieht sich auf Zellen, welche im Anschluss an die Transformation auf einem Selektionsmedium selektiert und regeneriert wurden.
  • ”Chromosomal integriert” bezieht sich auf die Integration eines fremden Gens oder DNA-Konstrukt in das Wirtsgenom mittels kovalenter Bindungen. Falls Gene nicht ”chromosomal integriert” sind, können sie ”transient exprimiert” werden. Transiente Expression eines Gens bezieht sich auf die Expression eines Gens, das nicht in das Wirtschromosom integriert ist, sondern unabhängig fungiert, beispielsweise entweder als Teil von einem autonom replizierenden Plasmid oder einer Expressionskassette, oder als Teil eines anderen biologischen Systems, wie einem Virus. ”Genetisch stabil” und ”vererbbar” beziehen sich auf chromosomal-integrierte genetische Elemente, welche stabil in der Pflanze beibehalten und stabil von Nachkommen über sukzessive Genrationen vererbt werden.
  • Eine ”transgene Pflanze” ist eine Pflanze mit einer oder mehreren Pflanzenzellen, die einen Expressionsvektor enthalten, wie hierin nachstehend in der detaillierten Beschreibung definiert.
  • ”Primärtransformante” und ”T0-Generation” beziehen sich auf transgene Pflanzen, die aus der gleichen genetischen Generation sind wie das Gewebe, das anfänglich transformiert wurde (d. h. seit der Transformation nicht eine Meiose und Befruchtung durchlaufen haben).
  • ”Sekundäre Transformanten” und die ”T1-, T2-, T3- etc. Generationen” beziehen sich auf transgene Pflanzen, die aus primären Transformanten abgeleitet werden durch einen oder mehrere meiotische und Befruchtungszyklen. Sie können durch Selbstbefruchtung von primären oder sekundären Transformanten oder durch Kreuzungen von primären oder sekundären Transformanten mit anderen transformierten oder nicht-transformierten Pflanzen abgeleitet werden.
  • ”Pflanzengewebe” schließt differenzierte und undifferenzierte Gewebe oder Pflanzen ein, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Wurzeln, Stengel, Triebe bzw. Sprosse, Blätter, Pollen, Samen, Tumorgewebe und verschiedene Formen von Zellen und Kultur, wie einzelne Zellen, Protoplasten, Embryonen und Callus-Gewebe. Das Pflanzengewebe kann in Pflanzen oder in einer Organ-, Gewebe- oder Zellkultur vorliegen.
  • Der Ausdruck ”veränderte Pflanzeneigenschaft” bedeutet jedwede phänotypische oder genotypische Änderung in einer transgenen Pflanze im Vergleich zum Wildtyp- oder nicht-transgenen Pflanzenwirt.
  • Das Wort ”Pflanze” bezieht sich auf jedwede Pflanze, insbesondere auf landwirtschaftlich nützliche Pflanzen (z. B. Samenpflanzen), und ”Pflanzenzelle” ist eine strukturelle und physiologische Einheit der Pflanze, die eine Zellwand umfasst, kann sich aber auch auf einen Protoplasten beziehen. Die Pflanzenzelle kann in Form einer isolierten einzelnen Zelle oder einer kultivierten Zelle, oder als Teil einer höher organisierten Einheit, wie zum Beispiel einem Pflanzengewebe oder einem Pflanzenorgan, ausdifferenziert zu einer Struktur, die in jedem Stadium der Entwicklung einer Pflanze vorhanden ist, vorliegen. Zu solchen Strukturen zählen ein oder mehrere pflanzliche Organe, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Frucht, Spross, Stengel, Blatt, Blütenblatt, etc. Vorzugsweise schließt der Begriff ”Pflanze” ganze Pflanzen, vegetative Sprossorgane/strukturen (z. B. Blätter, Stengel und Knollen), Wurzeln, Blüten und Blütenorgane/strukturen (z. B. Deckblätter, Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter, Fruchtblätter, Staubbeutel bzw. Antheren und Samenanlagen), Samen (einschließlich Embryo, Endosperm und Samenhülle) und Früchte (den reifen Fruchtknoten), Pflanzengewebe (z. B. Gefäßgewebe, zermahlenes Gewebe, und dergleichen) und Zellen (z. B. Schließzellen; Eizellen, Trichome und dergleichen) und Abkömmlinge derselben ein. Die Klasse von Pflanzen, welche im Verfahren der Erfindung verwendet werden können, ist im Allgemeinen so breitgefasst wie die Klasse von höheren und niederen Pflanzen, welche Transformationstechniken zuführbar sind, einschließlich Angiospermen (monokotyle und dikotyle Pflanzen), Gymnospermen, Farnen und mehrzelligen Algen. Sie schließt Pflanzen einer Vielzahl von Ploidie-Niveaus, einschließlich aneuploid, polyploid, diploid, haploid und hemizygot, ein. Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind alle Gattungen und Spezies von höheren und niederen Pflanzen des Pflanzenreichs eingeschlossen. Ferner sind die reifen Pflanzen, Samen, Schößlinge und Sämlinge sowie Teile, Fortpflanzungsmaterial (zum Beispiel Samen und Frucht) und Kulturen, zum Beispiel ZelLkulturen, welche davon abgeleitet sind, eingeschlossen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, die eine pflanzliche Nukleotidsequenz umfassen, welche die Samen-präferenzielle oder Samen-spezifische Transkription eines funktionsfähig verknüpften Nukleinsäurefragments in einer Pflanzenzelle steuert.
  • Spezifisch sieht die vorliegende Erfindung eine Expressionskassette für die Regulierung der samenspezifischen Expression eines Polynukleotids von Interesse vor, wobei die Expressionskassette eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe von Sequenzen gewählt ist, welche aus Folgenden besteht:
    • (a) einer Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18, oder einer Variante davon;
    • (b) einer Nukleinsäuresequenz, die zu mindestens 80% identisch ist mit einer Nukleinsäuresequenz, die in einer beliebigen der SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,.14, 15, 16, 17 oder 18 gezeigt ist;
    • (c) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 170 oder 18 hybridisiert;
    • (d) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz der SEQ ID NRn.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 befindet;
    • (e) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz befindet, welche eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NRn.: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 codiert;
    • (f) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz befindet, welche zu mindestens 80% identisch ist mit einer Offenen-Leseraster-Sequenz der SEQ ID NRn.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert;
    • (g) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts eines offenen Leserasters befindet, codierend eine Aminosäuresequenz, welche zu mindestens 80% identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NRn:: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert;
    • (h) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder durch thermische asymmetrische verschachtelte Polymerasekettenreaktion (TAIL-PCR) auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz, wie in der SEQ ID NRn.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt, erhältlich ist; und
    • (i) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz erhältlich ist, welche zu mindestens 80% mit einem offenen Leseraster identisch ist, wie in SEQ D NRn.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert; und
    • (j) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz erhältlich ist, die eine Aminosäuresequenz codiert, welche zu mindestens 80% mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, welche durch ein offenes Leseraster codiert wird, wie in SEQ ID NRn.: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49; 50, 51, 52, 53 oder 54 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert.
  • Vorzugsweise beinhalten transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden,. z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1507, 125 bis etwa 1507, 250 bis etwa 1507, 400 bis etwa 1507, 600 bis etwa 1507, stromaufwärts des ATG (1610–1612), lokalisiert an der Position 106 bis 1612 der SEQ ID NR.: 81, welche die Minimalpromotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1507, 125 bis etwa 1507, 250 bis etwa 1507, 400 bis etwa 1507, 600 bis etwa 1507, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1507, 125 bis etwa 1507, 250 bis etwa 1507, 400 bis etwa 1507, 600 bis etwa 1507, stromaufwärts des ATG, lokalisiert an der Position 1610 bis 1612 von SEQ ID NR.: 81, welche die minimale Promotorregion einschließt. Die oben erwähnte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in Tabelle 22 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in einer Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie der in SEQ ID NR.: 9 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 910, 125 bis etwa 910, 250 bis etwa 910, 400 bis etwa 910, 600 bis etwa 910, stromaufwärts des ATG (1748–1750), lokalisiert an der Position 825 bis 1735 der SEQ ID NR.: 82, welche die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat die fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 910, 125 bis etwa 910, 250 bis etwa 910, 400 bis etwa 910, 600 bis etwa 910, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 910,. 125 bis etwa 910, 250 bis etwa 910, 400 bis etwa 910, 600 bis etwa 910, stromaufwärts des ATG (1748–1750), lokalisiert an der Position 825 bis 1735 der SEQ ID NR.: 82, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben erwähnte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 23 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 10 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1131, 125 bis etwa 1131, 250 bis etwa 1131, 400 bis etwa 1131, 600 bis etwa 1131, stromaufwärts des ATG (1185–1160), lokalisiert an der Position 44 bis 1174 der SEQ ID NR.: 83, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat die fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1131, 125 bis etwa 1131, 250 bis etwa 1131, 400 bis etwa 1131, 600 bis etwa 1131, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1131, 125 bis etwa 1131, 250 bis etwa 1131, 400 bis etwa 1131, 600 bis etwa 1131, stromaufwärts des ATG (1185–1160), lokalisiert an der Position 44 bis 1174 der SEQ ID NR.: 83, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 24 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 11 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 563, 125 bis etwa 563, 250 bis etwa 563, 400 bis etwa 563, stromaufwärts des ATG (624–626), lokalisiert an der Position 52 bis 614 der SEQ ID NR.: 84, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat die fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 563, 125 bis etwa 563, 250 bis etwa 563, 400 bis etwa 563, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 563, 125 bis etwa 563, 250 bis etwa 563, 400 bis etwa 563, stromaufwärts des ATG (624–626), lokalisiert an der Position 52 bis 614 der. SEQ ID NR.: 84, was die. minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden. Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 25 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR.: 12 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1188, 125 bis etwa 1188, 250 bis etwa 1188, 400 bis etwa 1188, 600 bis etwa 1188, stromaufwärts des ATG (1234–1236), lokalisiert an der Position 46 bis 1233 der SEQ ID NR.: 80, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat die besagte fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1188, 125 bis etwa 1188, 250 bis etwa 1188, 400 bis etwa 1188, 600 bis etwa 1188, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden. fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 öder 100 bis 500, und bis zu 1000 öder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1188, 125 bis etwa 1188, 250 bis etwa 1188, 400 bis etwa 1188, 600 bis etwa 1188, stromaufwärts des ATG (1234–1236), lokalisiert an der Position 46 bis 1233 der SEQ ID NR.: 80, was die Minimalpromotorregion einschließt. Die oben erwähnte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 26 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 8 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1945, 125 bis etwa 1945, 250 bis etwa 1945, 400 bis etwa 1945, 600 bis etwa 1945, stromaufwärts des ATG (2428 bis 2430), lokalisiert an der Position 435 bis 2379 der SEQ ID NR.: 75, welche die Minimalpromotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat besagte fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1945, 125 bis etwa 1945, 250 bis etwa 1945, 400 bis etwa 1945, 600 bis etwa 1945, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1945, 125 bis etwa 1945, 250 bis etwa 1945, 400 bis etwa 1945, 600 bis etwa 1945, stromaufwärts des ATG (2428 bis 2430), lokalisiert an der Position 435 bis 2379 der SEQ ID NR.: 75, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 27 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR.: 3 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 991, 125 bis etwa 991, 250 bis etwa 991, 400 bis etwa 991, 600 bis etwa 991, stromaufwärts des ATG (996 bis 998), lokalisiert an der Position 4 bis 994 der SEQ ID NR.: 85, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 991, 125 bis etwa 991, 250 bis etwa 991, 400 bis etwa 991, 600 bis etwa 991, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 991, 125 bis etwa 991, 250 bis etwa 991, 400 bis etwa 991, 600 bis etwa 991, stromaufwärts des ATG (996 bis 998), lokalisiert an der Position 4 bis 994 der SEQ ID NR.: 85, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie gezeigt in der Tabelle 28, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 13 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 2519, 125 bis etwa 2519, 250 bis etwa 2519, 400 bis etwa 2519, 600 bis etwa 2519, 5 Basenpaare stromabwärts des ATG (2511 bis 2513), lokalisiert an der Position 1 bis 2519 der SEQ ID NR.: 86, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat die fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 2519, 125 bis etwa 2519, 250 bis etwa 2519, 400 bis etwa 2519, 600 bis etwa 2519, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 2519, 125 bis etwa 2519, 250 bis etwa 2519, 400 bis etwa 2519, 600 bis etwa 2519, stromaufwärts des ATG (2511 bis 2513), lokalisiert an der Position 1 bis 2519 der SEQ ID NR.: 86, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben erwähnte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie' in der Tabelle 29 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR.: 14 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 512, 125 bis etwa 512, 250 bis etwa 512, 400 bis etwa 512, stromaufwärts des ATG (678 bis 680), lokalisiert an der Position 47 bis 558 der SEQ ID NR.: 76, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat die fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 512, 125 bis etwa 512, 250 bis etwa 512, 400 bis etwa 512, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 512, 125 bis etwa 512, 250 bis etwa 512, 400 bis etwa 512, 600 bis etwa 512, stromaufwärts des ATG (678 bis 680), lokalisiert an der Position 47 bis 558 der SEQ ID NR.: 76, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 30 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 4 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1264, 125 bis etwa 1264, 250 bis etwa 1264, 400 bis etwa 1264, 600 bis etwa 1264, stromaufwärts des ATG (1341 bis 1343), lokalisiert an der Position 1 bis 1264 der SEQ ID NR.: 87, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1264, 125 bis etwa 1264, 250 bis etwa 1264, 400 bis etwa 1264, 600 bis etwa 1264, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1264, 125 bis etwa 1264, 250 bis etwa 1264, 400 bis etwa 1264, 600 bis etwa 1264, stromaufwärts des ATG (1341 bis 1343), lokalisiert an der Position 1 bis 1264 der SEQ ID NR.: 87, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 49 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 15 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1355, 125 bis etwa 1355, 250 bis etwa 1355, 400 bis etwa 1355, 600 bis etwa 1355, stromaufwärts des ATG (1357 bis 1359), lokalisiert an der Position 1 bis 1355 der SEQ ID NR.: 78, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1355, 125 bis etwa 1355, 250 bis etwa 1355, 400 bis etwa 1355, 600 bis etwa 1355, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1355, 125 bis etwa 1355, 250 bis etwa 1355, 400 bis etwa 1355, 600 bis etwa 1355, stromaufwärts des ATG (1357 bis 1359), lokalisiert an der Position 1 bis 1355 der SEQ ID NR.: 78, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 50 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 6 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 623, 125 bis etwa 623, 250 bis etwa 623, 400 bis etwa 623, 500 bis etwa 623, stromaufwärts des ATG (695 bis 697), lokalisiert an der Position 1 bis 623 von SEQ ID NR.: 88, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 623, 125 bis etwa 623, 250 bis etwa 623, 400 bis etwa 623, 500 bis etwa 623, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 623, 125 bis etwa 623, 250 bis etwa 623, 400 bis etwa 623, 500 bis etwa 1355, stromaufwärts des ATG (695 bis 697), lokalisiert, an der Position 1 bis 623 der SEQ. ID NR.: 88, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 51 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 16 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1950, 125 bis etwa 1950, 250 bis etwa 1950, 400 bis etwa 1950, 600 bis etwa 1950, stromaufwärts des ATG (2700 bis 2702), lokalisiert an der Position 700 bis 2649 der SEQ ID NR.: 89, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat die fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 öder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1950, 125 bis etwa 1950, 250 bis etwa 1950, 400 bis etwa 1950, 600 bis etwa 1950, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1950, 125 bis etwa 1950, 250 bis etwa 1950, 400 bis etwa 1950, 600 bis etwa 1355, stromaufwärts des ATG (2700 bis 2702), lokalisiert an der Position 700 bis 2649 der SEQ ID NR.: 89, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 52 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 17 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängende Nukleotide, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1106, 125 bis etwa 1106, 250 bis etwa 1106, 400 bis etwa 1106, 600 bis etwa 1106, stromaufwärts des ATG (1220 bis 1222), lokalisiert an der Position 1 bis 1106 von SEQ ID NR.: 73, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat die fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1106, 125 bis etwa 1106, 250 bis etwa 1106, 400 bis etwa 1106, 600 bis etwa 1106, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1106, 125 bis etwa 1106, 250 bis etwa 1106, 400 bis etwa 1106, 600 bis etwa 1355, stromaufwärts des ATG (1220 bis 1222), lokalisiert an der Position 1 bis 1106 von SEQ ID NR.: 73, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 53 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 1 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1941, 125 bis etwa 1941, 250 bis etwa 1941, 400 bis etwa 1941, 600 bis etwa 1941, stromaufwärts des ATG (2303 bis 2305), lokalisiert an der Position 302 bis 2242 der SEQ ID NR.: 79, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1941, 125 bis etwa 1941, 250 bis etwa 1941, 400 bis etwa 1941, 600 bis etwa 1941, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 1941, 125 bis etwa 1941, 250 bis etwa 1941: 400 bis etwa 1941, 600 bis etwa 1355, stromaufwärts des ATG (2303 bis 2305), lokalisiert an der Position 302 bis 2242 der SEQ ID NR.: 79, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 54 gezeigt, die vorzugsweise aus der. Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 7 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 922, 125 bis etwa 922, 250 bis etwa 922, 400 bis etwa 922, 600 bis etwa 922, stromaufwärts des ATG (923 bis 925), lokalisiert an der Position 1 bis 922 der SEQ ID NR.: 74, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 922, 125 bis etwa 922, 250 bis etwa 922, 400 bis etwa 922, 600 bis etwa 922, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 922, 125 bis etwa 922, 250 bis etwa 922, 400 bis etwa 922, 600 bis etwa 1355, stromaufwärts des ATG (923 bis 925), lokalisiert an der Position 1 bis 922 der SEQ ID NR.: 74, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 55 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 2 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 698, 125 bis etwa 698, 250 bis etwa 698, 400 bis etwa 698, 500 bis etwa 698, stromaufwärts des ATG (699 bis 671), lokalisiert an der Position 1 bis 698 der SEQ ID NR.: 77, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 698, 125 bis etwa 698, 250 bis etwa 698, 400 bis etwa 698, 500 bis etwa 698, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 698, 125 bis etwa 698, 250 bis etwa 698, 400 bis etwa 698, 500 bis etwa 1355, stromaufwärts des ATG (699 bis 671), lokalisiert an der Position 1 bis 698 der SEQ ID NR.: 77, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst. vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 56 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in der SEQ ID NR.: 5 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • Vorzugsweise beinhalten die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz und Promotoren der Erfindung eine fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3500, einschließlich 50 bis 3000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 3500, 60 bis etwa 3000, 125 bis etwa 2500, 250 bis etwa 2300, 400 bis etwa 2000, 600 bis etwa 1700, stromaufwärts des ATG, lokalisiert an der Position 656 bis 658 der SEQ ID NR.: 196, was die minimale Promotorregion einschließt.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung hat diese fortlaufende Strecke von etwa 25 bis 3000, einschließlich 50 bis 2000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 2500, 60 bis etwa 922, 125 bis etwa 922, 250 bis etwa 922, 400 bis etwa 922, 600 bis etwa 922, mindestens 50% oder 60%, vorzugsweise mindestens 70% oder 80%, stärker bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95%, Nukleinsäuresequenzidentität mit einer entsprechenden fortlaufenden Strecke von etwa 25 bis 3500, einschließlich 50 bis 3000 oder 100 bis 500, und bis zu 1000 oder 1500, zusammenhängenden Nukleotiden, z. B. 40 bis etwa 3500, 60 bis etwa 3000, 125 bis etwa 2500, 250 bis etwa 2300, 400 bis etwa 2000, 600 bis etwa 1700, stromaufwärts des ATG, lokalisiert an der Position 656 bis 658 der SEQ ID NR.: 196, was die minimale Promotorregion einschließt. Die oben definierte Strecke von zusammenhängenden Nukleotiden umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Promotormotive, wie in der Tabelle 61 gezeigt, die vorzugsweise aus der Gruppe gewählt sind, die aus TATA-Box, GC-Box, CAAT-Box und einer Transkriptionsstartstelle besteht. Eine bevorzugte transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, die in eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung einzuschließen ist, hat eine Nukleinsäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR.: 18 gezeigt ist, oder eine Variante davon.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst diese fortlaufende Strecke von Nukleotiden das Nukleotid 1440 bis 2112 von SEQ ID NR.: 18, Nukleotid 1600 bis 2112 von SEQ ID NR.: 18, noch stärker bevorzugt Nukleotid 1740 bis 2112 von SEQ ID NR.: 18 und am meisten bevorzugt Nukleotid 1740 bis 1999 der SEQ ID NR.: 18.
  • Die vorliegende Erfindung zieht ebenfalls (eine) transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen in Betracht, welche von einer transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz, die in der SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18 gezeigt ist, abgeleitet werden können. Diese transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen sind in der Lage, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, an den stromaufwärts liegenden Sequenzen des offenes Leserasters, gezeigt in der SEQ ID NR.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36, oder einer Variante davon, zu hybridisieren, d. h. an die transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen, welche in der SEQ ID NRn: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18 gezeigt sind, oder eine Variante davon.
  • Stringente Hybridisierungsbedingungen, wie hierin gemeint, sind vorzugsweise Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 53 bis 65°C, vorzugsweise bei 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C oder 65°C. Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen je nach der Art der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, im Hinblick auf die Temperatur und die Konzentration des Puffers abweichen. Beispiele für stringente Hybridisierungsbedingungen sind im Abschnitt ”Allgemeine Definitionen” angegeben.
  • Darüber hinaus können transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung nicht nur stromaufwärts der oben erwähnten offenen Leseraster mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in der SEQ ID NR.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt, gefunden werden. Vielmehr können transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen auch stromaufwärts von orthologen, paralogen oder homologen Genen (d. h. offenen Leserastern) gefunden werden. Somit besitzt, ebenfalls bevorzugterweise, eine variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, enthalten von einer Expressionskassette der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäuresequenz, die an (eine) Nukleinsäure-Sequenz(en) hybridisiert, welche stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz lokalisiert sind, die mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94% mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch zu einer Sequenz ist, wie in SEQ ID NRn: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt. Diese variante offene Leseraster soll ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von dem entsprechenden Polypeptid, das codiert wird von dem in SEQ ID NRn: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigten offenen Leseraster, codieren. In diesem Zusammenhang sollte es erwähnt werden, dass das in SEQ ID NRn: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigte offene Leseraster für ein Polypeptid codiert, das die in SEQ ID NRn: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, und vorzugsweise ein Samenprotein codiert.
  • Ebenfalls bevorzugt, ist eine variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung (i) erhältlich durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR von einer Offenen-Leseraster-Sequenz, wie in SEQ ID NRn: 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt, oder (ii) erhältlich durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR von einer Offenen-Leseraster-Sequenz, die zu mindestens 80% identisch mit einem offenen Leseraster ist, wie in SEQ ID NRn: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt. Variante Expressionssteuerungssequenzen sind ohne Weiteres erhältlich durch die Genom-Walking-Technologie oder durch thermische asymmetrische verschachtelte Polymerasekettenreaktion (TAIL-PCR), welche, wie bei Liu und Huang, Plant Molecular Biology Reporter, 1998, Bd. 16, Seiten 175 bis 181, sowie Zitatstellen darin, oder Liu et al., The Plant Journal, 1995, Bd. 8, Seiten 457–463, und Zitatstellen darin, beschrieben, unter Verwendung von z. B. kommerziell erhältlichen Kits durchgeführt werden kann.
  • Geeignete Oligonukleotide, entsprechend einer Nukleotidsequenz der Erfindung, z. B. zur Verwendung als Primer in Sonden- oder Amplifikations-Reaktionen, wie der oben beschriebenen PCR-Reaktion, können etwa 30 oder weniger Nukleotide (z. B. 9, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23 oder 24, oder jedwede Anzahl zwischen 9 und 30) lang sein. Im Allgemeinen sind spezifische Primer mehr als 14 Nukleotide lang. Für eine optimale Spezifität und Wirtschaftlichkeit können Primer von 16 bis 24 Nukleotiden Länge bevorzugt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet ist gut vertraut mit dem Design von Primern zur Anwendung in Verfahren, wie PCR. Bei Bedarf kann ein Sondieren mit gesamten Restriktionsfragmenten des hierin offenbarten Gens durchgeführt werden kann, welche eine Länge von 100-en oder sogar 1000-en Nukleotiden besitzen können.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in der SEQ ID NR.: 9, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 22 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 10, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 23 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 11, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 24 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 12, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10; mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 25 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 8, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 26 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 3, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 27 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 13, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 28 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 14, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 29 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 4, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 30 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 15, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 49 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 6, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive; die in der Tabelle 50 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 16, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 51 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 17, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 52 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 1, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 53 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 7, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 54 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 2, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 55 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 5, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 56 aufgeführt sind.
  • Variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, auf die in dieser Patentbeschreibung für die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NR.: 18, Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, oder alle der Sequenzmotive, die in der Tabelle 61 aufgeführt sind.
  • Beispiele für bevorzugte variante transkriptionsregulierende Sequenzen sind in den SEQ ID NRn. 109 bis 126 sowie 127 bis 144 gezeigt.
  • Im Vergleich zu den entsprechenden transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen, umfassen die oben erwähnten Varianten (wie gezeigt in SEQ ID NRn: 109 bis 144) keine Startcodons (ATG). Die Startcodons werden entweder durch BVH (SEQ ID NRn: 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126) oder durch BVH plus Stopcodons (SEQ ID NRn: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144) zwischen jedweden zwei Startcodons ersetzt (gemäß der IUPAC-Nomenklatur: B steht für C oder G oder T, V steht für A oder C oder G, und H steht für A oder C oder T). Somit können variante Transkriptions-regulierende Sequenzen durch Mutieren von vermeintlichen bzw. putativen Startcodons, wie oben beschrieben, erhalten werden.
  • Ohne die erwähnten Eigenschaften erheblich zu beeinträchtigen, können nicht-essentielle Sequenzen der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz der Erfindung deletiert werden. Die Eingrenzung der Expressionskontrollsequenz auf besondere essentielle regulatorische Regionen kann auch mit Hilfe eines Computerprogramms, wie dem PLACE-Programm (”Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements”) (Higo K et al. (1999) Nucleic Acids Res 27:1, 297–300), siehe Tabelle 5, oder der BIOBASE-Datenbank ”Transfac” (Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig) vorgenommen werden. Durch diese Maßnahmen können variante transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen, wie oben beschrieben, künstlich erzeugt werden. Darüber hinaus sind dem Fachmann Verfahren zum Mutagenisieren von Nukleinsäuresequenzen bekannt und schließen z. B. die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehreren Mutationen im Vergleich zur der zu mutierenden Region (z. B. innerhalb des Rahmens einer ortsspezifischen Mutagenese) ein. Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden, oder mehr, werden typischerweise verwendet, wobei vorzugsweise etwa 10 bis etwa 25 oder mehr Nukleotidreste auf beiden Seiten einer zu modifizierenden Sequenz lokalisiert sind. Details und Vorgehensweise für die Mutageneseverfahren sind dem Fachmann geläufig (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154:367–382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12:1656; Upender et al. (1995) Biotechniques 18(1):29–30; U.S.-Pat. Nr. 4 237 224 ). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von zum Beispiel Vektoren, welche die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz der Erfindung umfassen, mit mutagenisierenden Mitteln, wie Hydroxylamin, erreicht werden. Die Mutagenese ergibt ebenfalls variante Expressionskassetten der Erfindung, wie oben angegeben.
  • Im Allgemeinen können die transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen und Promotoren der Erfindung verwendet werden, um ein Nukleinsäuresegment, das funktionsfähig an den Promotor verknüpft ist, wie zum Beispiel ein offenes Leseraster oder einen Teil davon, eine Antisense-Sequenz, eine Sequenz, die für eine doppelsträngige RNA-Sequenz codiert, oder ein Transgen, in Pflanzen zu exprimieren.
  • Folglich umfasst, in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung mindestens ein Polynukleotid von Interesse, das funktionsfähig mit der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz und/oder mindestens einer Terminationssequenz oder Transkription verbunden ist. Somit umfasst die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz für die Expression von mindestens einem Polynukleotid von Interesse. Jedoch werden Expressionskassetten, die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen mit mindestens zwei, drei, vier oder fünf oder sogar mehr transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen für Polynukleotide von Interesse umfassen, ebenfalls von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
  • Der Ausdruck ”Polynukleotid von Interesse” bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die unter der Kontrolle der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz, auf die hierin Bezug genommen wird, exprimiert werden soll. Vorzugsweise codiert ein Polynukleotid von Interesse ein Polypeptid, dessen Vorhandensein in einer Zelle oder einem Pflanzesamen, wie hierin darauf Bezug genommen wird, erwünscht ist. Ein solches Polypeptid kann ein Enzym sein, das für die Synthese von Samenspeicher-Verbindungen erforderlich ist, oder kann ein Samenspeicherprotein sein. Es versteht sich, dass wenn das Polynukleotid von Interesse ein Polypeptid codiert, eine Transkription der Nukleinsäure in RNA und eine Translation der transkribierten RNA in das Polypeptid erforderlich sein kann. Ein Polynukleotid von Interesse schließt außerdem vorzugsweise biologisch aktive RNA-Moleküle und, stärker bevorzugt, Antisense-RNAs, Ribozyme, Mikro-RNAs oder siRNAs, ein. Zum Beispiel kann eine unerwünschte enzymatische Aktivität in einem Samen vermittels der samenspezifischen Expression von (einer) Antisense-RNAs, Ribozymen, Mikro-RNAs oder siRNAs verringert werden. Die zugrunde liegenden biologischen Wirkprinzipien der zuvor genannten biologisch aktiven RNA-Moleküle sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Darüber hinaus weiß der Fachmann auf dem Gebiet durchaus, wie man Nukleinsäuren erhält, die solche biologisch aktiven RNA-Moleküle codieren. Es versteht sich, dass die biologisch aktiven RNA-Moleküle direkt durch Transkription der Nukleinsäure von Interesse, d. h. ohne Translation in ein Polypeptid, erhalten werden können. Vorzugsweise ist mindestens ein Polynukleotid von Interesse, das unter der Steuerung der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung exprimiert werden soll, heterolog in Bezug auf die Expressionssteuerungssequenz, d. h. es steht nicht von Natur aus unter der Steuerung von dieser, sondern die Steuerung ist auf eine nicht-natürliche Weise (zum Beispiel durch gentechnische Verfahren) herbeigeführt worden.
  • Eine funktionsfähige Verknüpfung kann – zum Beispiel – eine sequentielle Anordnung der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz der Erfindung (zum Beispiel einer Sequenz, wie durch SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18 beschrieben) mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz, und – gegebenenfalls – weiteren regulatorischen Elementen, wie zum Beispiel Polyadenylierungs- oder Transkriptionsterminations-Elementen, Enhancern, Introns etc., in einer Weise umfassen, so dass die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz ihre Funktion in dem Verfahren zur Expression der Nukleinsäuresequenz von Interesse unter den passenden Bedingungen erfüllen kann. Der Ausdruck ”passende Bedingungen” bedeutet vorzugsweise das Vorhandensein der Expressionskassette in einer Pflanzenzelle. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz von Interesse stromabwärts (d. h. in 3'-Richtung) von der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz der Erfindung in einer Weise platziert ist, so dass beide Sequenzen kovalent verbunden sind. Wahlweise können zusätzliche Sequenzen zwischen den zwei Sequenzen eingefügt sein. Solche Sequenzen können zum Beispiel Linker oder Mehrfachklonierungsstellen sein: Darüber hinaus können Sequenzen, die für Teile von Fusionsproteinen codieren, eingefügt sein (falls beabsichtigtermaßen ein Fusionsprotein von dem, durch die Nukleinsäure von Interesse codierten, Protein exprimiert werden soll). Vorzugsweise beträgt der Abstand zwischen dem zu exprimierenden Polynukleotid von Interesse und der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz der Erfindung nicht mehr als 200 Basenpaare, vorzugsweise nicht mehr als 100 Basenpaare, stärker bevorzugt nicht mehr als 50 Basenpaare.
  • Eine funktionsfähige Verknüpfung in Bezug auf jedwede Expressionskassette oder der Erfindung kann durch diverse im Fachgebiet bekannte Verfahren realisiert werden, welche sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Prozeduren umfassen. So kann eine Expressionskassette der Erfindung oder ein Vektor, der eine solche Expressionskassette umfasst, unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten standardmäßigen Rekombinations- und Klonierungstechniken erzeugt werden (siehe z. B. Maniatis 1989; Silhavy 1984; Ausubel 1987).
  • Eine Expressionskassette kann ebenfalls durch Inserieren einer transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz der Erfindung (zum Beispiel einer Sequenz, wie durch SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18 beschrieben) in das Pflanzengenom assembliert bzw. zusammengefügt werden. Eine solche Insertion resultiert in einer funktionsfähigen Verknüpfung an eine Nukleinsäuresequenz von Interesse, welche als solche bereits im Genom existierte. Durch die Insertion wird die Nukleinsäure von Interesse wegen der transkriptionsregulierenden Eigenschaften der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz in einer Samen-präferentiellen oder Samen-spezifischen Weise exprimiert. Die Insertion kann gerichtet oder zufallsmäßig stattfinden. Vorzugsweise ist die Insertion gerichtet und wird zum Beispiel durch homologe Rekombination bewerkstelligt. Durch dieses Vorgehen kann ein natürlicher Promotor gegen die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz der Erfindung ausgetauscht werden, wodurch das Expressionsprofil eines endogenen Gens modifiziert wird. Die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz kann auch in einer Weise inseriert werden, so dass Antisense-mRNA von einem endogenen Gen exprimiert wird, wodurch Gensilencing induziert wird.
  • In ähnlicher Art kann ein zu exprimierendes Polynukleotid von Interesse in ein Pflanzengenom, das die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz in ihrer natürlichen genomischen Umgebung (d. h. verknüpft an ihr natürliches Gen) umfasst, in einer Weise inseriert werden, so dass die inserierte Sequenz funktionsfähig an die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz verknüpft wird, wodurch eine Expressionskassette der Erfindung gebildet wird.
  • Die Expressionskassette kann für zahlreiche Expressionszwecke angewandt werden, wie zum Beispiel Expression eines Proteins oder Expression einer Antisense-RNA, Sense- oder doppelsträngigen RNA. Vorzugsweise verleiht die Expression der Nukleinsäuresequenz der Pflanze eine landwirtschaftlich wertvolle Eigenschaft.
  • Das an die transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz der Erfindung zu verknüpfende Polynukleotid von Interesse kann aus einem Insektenresistenzgen, einem Krankheitsresistenzgen, wie zum Beispiel einem Bakterienkrankheits-Resistenzgen, einem Pilz-Krankheitsresistenzgen, einem Viruskrankheits-Resistenzgen, einem Nematodenkrankheit-Resistenzgen, einem Herbizid-Resistenzgen, einem Gen, das die Kornzusammensetzung oder -qualität beeinflußt, einem Nahrstoffverwertungs-Gen, einem Mycotoxin-Reduktions-Gen, einem Männliche-Sterilität-Gen, einem selektierbaren Markergen, einem screenbaren Markergen, einem negativ-selektierbaren Marker, einem positiv-selektierbareren Marker, einem Gen, das landwirtschaftliche Pflanzencharakteristika, d. h. Ertrag, Standfähigkeit und dergleichen, beeinflußt, oder einem Umwelt- oder Stress-Resistenzgen, d. h. einem oder mehreren Gen(en), welche Herbizidresistenz oder -toleranz, Insektenresistenz oder -toleranz, Krankheitsresistenz oder -toleranz (Viren, Bakterien, Pilze, Oomyceten oder Nematoden), Stresstoleranz oder -resistenz (wie veranschaulicht durch Resistenz oder Toleranz gegenüber Dürre, Hitze, Abkühlung, Frost, übermäßige Feuchtigkeit, Salzstress, oder oxidativen Stress); erhöhte Erträge, Lebensmittelgehalt und -zusammensetzung, physikalisches Aussehen, männliche Sterilität, Eintrocknen, Standfähigkeit, Proliferationsvermögen, Stärkeeigenschaften oder -quantität, Ölquantität und -qualität, Aminosäure- oder Proteinzusammensetzung und dergleichen vermitteln, erhalten werden. Mit ”resistent” ist eine Pflanze gemeint, welche im Wesentlichen keine phänotypischen Veränderungen als Folge der Verabreichung eines Agens, der Infektion mit einem Pathogen, oder der Exposition an Stress zeigt. Mit ”tolerant” ist eine Pflanze gemeint, welche, obwohl sie gewisse phänotypische Veränderungen als Folge einer Infektion bzw. eines Befalls zeigen kann, keine im Wesentlichen verringerte Reproduktionskapazität oder keinen im Wesentlichen veränderten Metabolismus aufweist.
  • Samen-spezifische transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen (z. B. Promotoren) sind nützlich zum Exprimieren einer breiten Vielzahl von Genen, einschließlich jenen, welche Stoffwechselwege verändern, Krankheitsresistenz verleihen, jenen für Proteinproduktion, z. B. Antikörperproduktion, oder jenen zur Verbesserung der Nährstoffaufnahme und dergleichen. Samenspezifische transkriptionsregulierende Nukleotidsequenzen (z. B. Promotoren) können so modifiziert werden, dass sie regulierbar, z. B. induzierbar sind. Die hierin oben stehend beschriebenen Gene und transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen (z. B. Promotoren) können zum Identifizieren von orthologen Genen und deren transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen (z. B. Promotoren) verwendet werden, welche wahrscheinlich ebenfalls in einer bestimmten Gewebe- und/oder Entwicklungs-Weise exprimiert werden. Darüber hinaus sind die orthologen transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen (z. B. Promotoren) nützlich, um verknüpfte offene Leseraster zu exprimieren. Außerdem kann man durch Alignieren der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenzen (z. B. Promotoren) dieser Orthologe neue cis-Elemente identifizieren, welche zum Erzeugen synthetischer transkriptionsregulierender Nukleotidsequenzen (z. B. Promotoren) brauchbar sind.
  • Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Der Ausdruck ”Vektor” beinhaltet vorzugsweise Phagen-, Plasmid-, virale oder retrovirale Vektoren sowie künstliche Chromosomen, wie etwa künstliche Bakterien- oder Hefe-Chromosomen. Außerdem betrifft der Begriff auch Targeting-Konstrukte, welche die zufallsmäßige oder ortsgerichtete Integration des Targeting-Konstrukts in genomische DNA erlauben. Derartige Targeting-Konstrukte umfassen vorzugsweise DNA von ausreichender Länge für entweder homologe oder heterologe Rekombination, wie nachstehend ausführlich beschrieben. Der Vektor, welcher die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung beinhaltet, umfasst vorzugsweise ferner selektierbare Marker für die Vermehrung und/oder Selektion in einem Wirt. Der Vektor kann durch verschiedene im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren in eine Wirtszelle eingebracht werden. Wenn er in eine Wirtszelle eingebracht wurde, kann der Vektor im Cytoplasma vorliegen oder kann in das Genom eingebaut werden. Im letztgenannten Fall versteht es sich, dass der Vektor ferner Nukleinsäuresequenzen umfassen kann, welche eine. homologe Rekombination oder eine heterologe Insertion erlauben. Vektoren können in prokaryotische oder eukaryotische Zellen durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingebracht werden. Die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion”, Konjugation und Transduktion, wie im vorliegenden Kontext verwendet, umfassen beabsichtigtermaßen eine Vielzahl von Verfahren des Stands der Technik zur Einbringung von Fremdnukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat-, Rubidiumchlorid- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion, natürlicher Kompetenz, Kohlenstoff-basierten Clustern, chemisch vermitteltem Transfer, Elektroporation oder Partikelbeschuß (z. B. ”Gen-Kanone”). Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laboratoriums-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium Protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, gefunden werden. Alternativ dazu kann ein Plasmidvektor durch Hitzeschock- oder Elektroporationstechniken eingebracht werden. Sollte der Vektor ein Virus sein, kann er in vitro unter Verwendung einer passenden Verpackungs-Zelllinie vor der Anwendung auf Wirtszellen verpackt werden. Retrovirale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefekt sein. Im letzteren Fall findet eine Viruspropagation im Allgemeinen nur im/in komplementierenden Wirt/Zellen statt.
  • Vorzugsweise ist der Vektor, auf den hierin Bezug genommen wird, als ein Klonierungsvektor geeignet, d. h. in mikrobiellen Systemen replizierbar. Derartige Vektoren gewähren eine effiziente Klonierung in Bakterien und, vorzugsweise, Hefen oder Pilzen und machen die stabile Transformation von Pflanzen möglich. Diejenigen, die erwähnt werden müssen, sind insbesondere verschiedene binäre und co-integrierte Vektorsysteme, welche für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Solche Vektorsysteme sind, in der Regel, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene, welche für the Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, und die Sequenzen, welche die T-DNA umgrenzen (T-DNA-Border), enthalten. Diese Vektorsysteme umfassen vorzugsweise ebenfalls weitere cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren, und/oder Selektionsmarker, mit denen geeignete transformierte Wirtszellen oder -organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf mindestens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene aber keine T-DNA trägt, während ein zweiter T-DNA aber kein vir-Gen trägt. Als Konsequenz sind die zuletzt erwähnten Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium repliziert werden. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Anwendung kann in Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451, gefunden werden. Ferner kann durch Verwenden passender Klonierungsvektoren die Expressionskassette der Erfindung in Wirtszellen oder Organismen, wie Pflanzen oder Tieren, eingebracht werden und, somit bei der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie jenen, die veröffentlicht und zitiert sind in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225.
  • Stärker bevorzugt ist der Vektor der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor. In einem derartigen Expressionsvektor umfasst die Expressionskassette eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz, wie oben beschrieben, welche die Expression in eukaryotischen Zellen oder isolierten Fraktionen davon erlaubt. Ein Expressionsvektor kann, zusätzlich zu der Expressionskassette der Erfindung, auch weitere regulatorische Elemente umfassen, einschließlich transkriptionellen sowie translationalen Enhancern. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor auch ein Gentransfer- oder Targeting-Vektor. Expressionsvektoren, die aus Viren, wie Retroviren, Vacciniavirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpes-Viren oder Rinder-Papillom-Virus, abgeleitet sind, können für die Zuführung der Expressionskassetten oder des Vektors der Erfindung in eine angezielte Zellpopulation verwendet werden. Verfahren, welche dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, können angewandt werden, um rekombinante virale Vektoren zu konstruieren; siehe zum Beispiel die Techniken, welche in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1994), beschrieben sind.
  • Geeignete Expressionsvektor-Grundgerüste sind, vorzugsweise, abgeleitet aus Expressionsvektoren, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Okayama-Berg cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (InvitroGen) oder pSPORT1 (GIBCO BRL). Weitere Beispiele für typische Fusionsexpressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., und Johnson, K.S. (1988) Gen 67:31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), worin Glutathion-S-transferase (GST), Maltose E-Bindungsprotein bzw. Protein A jeweils mit der Nukleinsäure von Interesse fusioniert sind, die ein zu exprimierendes Protein codiert. Die Zielgen-Expression von dem pTrc-Vektor basiert auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem hybriden trp-lac-Fusionspromotor aus. Die Zielgen-Expression aus dem pET 11d-Vektor basiert auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusionspromotor, welche vermittelt wird durch eine coexprimerte virale RNA-Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird durch die Wirtsstämme BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) aus einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Steuerung des lacUV 5-Promotors enthält. Beispiele für Vektoren für die Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren für die Konstruktion von Vektoren, welche für die Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, geeignet sind, umfassen jene, welche im Detail in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J.W. Bennett & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego) beschrieben sind. Weitere geeignete Hefevektoren sind zum Beispiel pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23.
  • Der Vektor der vorliegenden Erfindung, welcher die Expressionskassette umfasst, muss in einem geeigneten Organismus, d. h. Expressionswirt, propagiert bzw. vermehrt und amplifiziert werden.
  • Demzufolge betrifft eine andere Ausführungsform der Erfindung transgene Wirtszellen oder nicht-humane, transgene Organismen, die eine Expressionskassette der Erfindung umfassen. Bevorzugt sind prokaryotische und eukaryotische Organismen. Sowohl Mikroorganismen als auch höhere Organismen sind eingeschlossen. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefe, Algen und Pilze. Bevorzugte Bakterien sind jene der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes, Pseudomonas, Bacillus oder Cyanobacterim, wie – zum Beispiel – Synechocystis und andere Bakterien, die in Brock Biology of Microorganisms, achte Auflage (Seiten A-8, A-9, A10 und A11) beschrieben sind. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei den transgenen Zellen oder nicht-humanen transgenen Organismen, die eine Expressionskassette der Erfindung umfassen, um eine Pflanzenzelle oder Pflanze (wie oben definiert), stärker bevorzugt um eine zur Ölerzeugung verwendete Pflanze wie – zum Beispiel – Brassica napus, Bassica juncea, Linum usitatissimum, Soja, Camelina oder Sonnenblume.
  • Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen, die fähig zum Infizieren von Pflanzen und zum Übertragen von DNA in deren Genom sind, speziell Bakterien der Gattung Agrobacterium, vorzugsweise Agrobacterium tumefaciens und rhizogenes. Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula und Pichia. Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium und Beauveria.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich die Wirtszelle auf eine Pflanzenzelle, Pflanze, einen Pflanzensamen, ein nicht-humanes Tier oder einen vielzelligen Mikroorganismus..
  • Demgemäß bezieht sich die vorliegende Erfindung ferner auf ein(e) transgene(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzenorgan oder Pflanzensamen, welche die Expressionskassette oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfassen.
  • Die Expressionskassette oder der Vektor können im Zytoplasma des Organismus vorliegen oder können in das Genom entweder heterolog oder durch homologe Rekombination eingebunden werden. Wirtszellen, insbesondere jene, die aus Pflanzen oder Tieren erhalten wurden, können in einen sich entwickelnden Embryo eingebracht werden, um Mosaik- oder chimäre Organismen, d. h. transgene Organismen, d. h. Pflanzen, die die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung umfassen, zu erhalten. Geeignete transgene Organismen sind, vorzugsweise, alle Organismen, welche für die Expression von rekombinanten Genen geeignet sind.
  • Die Natur der transgenen Pflanzenzellen ist nicht eingeschränkt; zum Beispiel kann die Pflanzenzelle eine monokotyle Pflanzenzelle oder eine dikotyle Pflanzenzelle sein. Vorzugsweise ihandelt es sich bei der transgenen Pflanze, dem/der transgenen Pflanzengewebe, Pflanzenorgan, Pflanze oder Samen um eine monokotyle Pflanze oder um eine Pflanzenzelle, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan, einen Pflanzensamen aus einer monokotylen Pflanze.
  • Beispiele für transgene Pflanzenzellen, die mit der Erfindung Anwendung finden, schließen Zellen (oder vollständige Pflanzen oder Pflanzenteile ein), die aus folgenden Gattungen abgeleitet sind: Ananas, Musa, Vitis, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Carica, Persea, Prunus, Syragrus, Theobroma, Coffea, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Mangifera, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucurbita, Cucumis, Browaalia, Lolium, Malus, Apium, Gossypium, Vicia, Lathyrus, Lupinus, Pachyrhizus, Wisteria, Stizolobium, Agrostis, Phleum, Dactylis, Sorghum, Setaria, Zea, Oryza, Triticum, Secale, Avena, Hordeum, Saccharum, Poa, Festuca, Stenotaphrum, Cynodon, Coix, Olyreae, Phareae, Glycine, Pisum, Psidium, Passiflora, Cicer, Phaseolus, Lens und Arachis Vorzugsweise schließen die transgenen Pflanzenzellen, die Anwendung bei der Erfindung finden, Zellen (oder vollständige Pflanzen oder Pflanzenteile) aus der Familie der Poaceae, wie den Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum, zum Beispiel der Gattungen und Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum, Secale cereale, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida, Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum, Oryza sativa, Oryza latifolia, Zea mays, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare ein.
  • Insbesondere sind bevorzugte Pflanzen, die als transgene Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, Ölfrucht-Nutzpflanzen, welche große Mengen an Lipidverbindungen umfassen, wie Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Castoröl-Pflanze, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avokado, Lorbeer, Kürbis/Gartenkürbis, Leinsamen, Sojabohne, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss) oder Nutzpflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Cassava, Paprika bzw. Pfeffer, Tagetes, Nachtschattengewächse, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa oder buschartige Pflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies und mehrjährige Gräser und Futterpflanzen. Bevorzugte Pflanzen gemäß der Erfindung sind Ölnutzpflanzen, wie Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Castoröl-Pflanze, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis/Gartenkürbis, Leinsamen, Sojabohne, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss).
  • In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines/einer transgenen Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens, umfassend:
    • (a) Einführen der Expressionskassette oder des Vektors der Erfindung in eine Pflanzenzelle; und
    • (b) Regenerieren der Pflanzenzelle zur Bildung eines/einer Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens.
  • Expressionskassetten können auf zahlreichen im Stand der Technik anerkannten Wegen in Pflanzenzellen eingebracht werden. Pflanzenspezies können mit dem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung durch die DNA-vermittelte Transformation von Pflanzenzellenprotoplasten und die anschließende Regeneration der Pflanze aus den transformierten Protoplasten gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Prozeduren transformiert werden.
  • Jedwedes Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Propagation fähig ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem Vektor der vorliegenden Erfindung transformiert werden. Der Ausdruck ”Organogenese”, wie hierin verwendet, bedeutet ein Verfahren durch das Sprosse und Wurzeln sequentiell aus meristematischen Zentren entwickelt werden; der Ausdruck ”Embryogenese,” wie hierin verwendet, bedeutet ein Verfahren, bei dem Sprosse und Wurzeln sich zusammen in einer konzertierten Weise (nicht sequentiell), ungeachtet dessen, ob aus somatischen Zellen oder Gameten, entwickeln. Das jeweilige gewählte Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen, die verfügbar und am besten geeignet sind für die jeweilige Spezies, die transformiert wird, variieren. Exemplarische Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryos, Kotyledone, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristeme, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Ultilane-Meristem) ein.
  • Pflanzen der vorliegenden Erfindung können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Die Pflanzen können Chimäre von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen sein; die Pflanzen können klonale Transformanten sein (z. B. sind alle Zellen transformiert, um die Expressionskassette zu enthalten); die Pflanzen können Pfropfungen von transformierten und untransformierten Geweben umfassen (wobei z. B. ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross in Citrus-Spezies gepropft wird). Die transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. Zum Beispiel können transformierte Pflanzen der ersten Generation (oder T1) geselbstet werden, um homozygote transformierte Pflanzen der zweiten Generation (oder T2) zu ergeben, und die T2-Pflanzen können durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Ein dominanter selektierbar Marker (wie npt II) kann mit der Expressionskassette assoziiert werden, um die Züchtung zu unterstützen.
  • Die Transformation von Pflanzen kann mit einem einzelnen DNA-Molekül oder mehreren DNA-Molekülen (d. h. Cotransformation) vorgenommen werden, und beide diese Techniken sind zur Anwendung mit den Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung geeignet. Zahlreiche Transformationsvektoren sind für die Pflanzentransformation verfügbar, und die Expressionskassetten dieser Erfindung können in Verbindung mit beliebigen solchen Vektoren verwendet werden. Die Auswahl des Vektors hängt von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielspezies für die Transformation ab.
  • Eine Vielzahl von Techniken zur Einbringung von Konstrukten in einen Pflanzenzellen-Wirt sind dem Fachmann auf dem Gebiet zugänglich und bekannt. Diese Techniken beinhalten im Allgemeinen Transformation mit DNA unter Verwendung von A. tumefaciens oder A. rhizogenes als dem transformierenden Agens, Liposomen, PEG-Präzipitation, Elektroporation, DNA-Injektion, direkte DNA-Aufnahme, Mikroprojektil-Beschuß, Partikelbeschleunigung und dergleichen (siehe zum Beispiel EP 295959 und EP 138341 ) (siehe unten). Allerdings können andere Zellen als Pflanzenzellen mit den Expressionskassetten der Erfindung transformiert werden. Die allgemeinen Beschreibungen von pflanzlichen Expressionsvektoren und Reportergenen, und von Agrobacterium und Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer, können in Gruber et al. (1993) gefunden werden.
  • Expressionsvektoren, die genomische oder synthetische Fragmente enthalten, können in Protoplasten oder in intakte Gewebe oder isolierte Zellen eingebracht werden. Vorzugsweise werden Expressionsvektoren in intakte Gewebe eingebracht. Allgemeine Verfahren zum Kultivieren von Pflanzengeweben sind zum Beispiel bei Maki et al. (1993); und bei Phillips et al. (1988) angegeben. Vorzugsweise werden Expressionsvektoren in Mais oder andere Pflanzengewebe unter Anwendung einer direkten Gentransfermethode, wie Mikroprojektilvermittelte Zuführung, DNA-Injektion, Elektroporation und dergleichen, eingebracht. Stärker bevorzugte Expressionsvektoren werden unter Verwendung der Mikroprojektil-Mittel-Zuführung mit der Biolistik-Vorrichtung in Pflanzengewebe eingebracht. Siehe zum Beispiel Tomes et al. (1995). Die Vektoren der Erfindung können nicht nur für die Expression von Strukturgenen verwendet werden, sondern können auch in einer Exon-Trap-Klonierung, oder in Promotor-Trap-Prozeduren, verwendet werden, um differentielle Genexpression in Varietäten von Geweben nachzuweisen (Lindsey 1993; Auch & Reth 1990).
  • Es wird insbesondere bevorzugt, die Binär-Typ-Vektoren von Ti- und Ri-Plasmiden von Agrobacterium spp. zu verwenden. Ti-abgeleitete Vektoren transformieren eine weite Vielzahl von höheren Pflanzen, einschließlich monokotylen und dikotylen Pflanzen, wie Soja, Baumwolle, Raps, Tabak und Reis (Pacciotti 1985: Byrne 1987; Sukhapinda 1987; Lorz 1985; Potrykus, 1985; Park 1985: Hiei 1994). Die Verwendung von T-DNA zum Transformieren von Pflanzenzellen wurde intensiv erforscht und ist eingehend beschrieben ( EP 120516 ; Hoekema, 1985; Knauf, 1983; und An 1985). Zur Einbringung in Pflanzen, können die chimären Gene der Erfindung in Binärvektoren, wie in den Beispielen beschrieben, inseriert werden.
  • Andere Transformationsmethoden sind für den Fachmann verfügbar, wie direkte Aufnahme von Fremd-DNA-Konstrukten (siehe EP 295959 ), Techniken der Elektroporation (Fromm 1986) oder Hochgeschwindigkeits-Ballistik-Beschuß mit Metallteilchen, die mit den Nukleinsäurekonstrukten beschichtet sind (Kline 1987, und US 4 945 050 ). Sobald transformiert, können die Zellen vom Fachmann regeneriert werden. Von besonderen Bedeutung sind die kürzlich beschriebenen Verfahren zum Transformieren von Fremdgenen in kommerziell wichtige Nutzpflanzen, wie Raps (De Block 1989), Sonnenblume (Everett 1987), Soja (McCabe 1988; Hinchee 1988; Chee 1989; Christou 1989; EP 301749 ), Reis (Hiei 1994) und Mais (Gordon-Kamm 1990; Fromm 1990).
  • Der Fachmann auf dem Gebiet wird es richtig einschätzen, dass die Wahl des Verfahrens vom Typ der Pflanze, d. h. monokotyl oder dikotyl, die zur Transformation vorgesehen ist, abhängen könnte. Zu geeigneten Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen zählen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Mikroinjektion (Crossway 1986), Elektroporation (Riggs 1986), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee 1988), direkter Gentransfer (Paszkowski 1984), und Ballistik-Teilchen-Beschleunigung unter Verwendung von seitens Agracetus, Inc., Madison, Wis., und BioRad, Hercules, Calif., erhältlichen Vorrichtungen (siehe zum Beispiel US 4 945 050 ; und McCabe 1988). Siehe auch Weissinger 1988; Sanford 1987 (Zwiebel); Christou 1988 (Soja); McCabe 1988 (Soja); Datta 1990 (Reis); Klein 1988 (Mais); Klein 1988 (Mais); Klein 1988 (Mais); Fromm 1990 (Mais); und Gordon-Kamm 1990 (Mais); Svab 1990 (Tabak-Chloroplast); Koziel 1993 (Mais); Shimamoto 1989 (Reis); Christou 1991 (Reis); europäische Patentanmeldung EP 0 332 581 (Wiesen-Knäuelgras und andere Pooideae); Vasil 1993 (Weizen); Weeks 1993 (Weizen).
  • In einer anderen Ausführungsform wird eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung direkt in das Plastidengenom hinein transformiert. Die Plastiden-Transformationstechnologie wird ausführlich in der US 5 451 513 , 5 545 817 und 5 545 818 , in der PCT-Anmeldung Nr. WO 95/16783 und in McBride et al., 1994, beschrieben. Die grundlegende Technik für die Chloroplastentransformation beinhaltet das Einbringen von Regionen von klonierter Plastiden-DNA, die einen selektierban Marker zusammen mit dem Gen von Interesse flankiert, in ein geeignetes Zielgewebe, z. B. unter Verwendung von Biolistik oder Protoplastentransformation (z. B. Calciumchlorid- oder PEG-vermittelte Transformation). Die 1 bis 1,5 kb großen flankierenden Regionen, genannt Targeting-Sequenzen, erleichtern die orthologe Rekombination mit dem Plastidengenom und erlauben somit die Ersetzung oder Modifikation von spezifischen Regionen des Plastoms. Zu Anfang werden Punktmutationen in der Chloroplasten-16S rRNA und den Resistenz gegen Spectinomycin und/oder Streptomycin verleihenden rps12-Genen als selektierbare Marker für die Transformation verwendet (Svab 1990; Staub 1992). Dies führte zu stabilen homoplasmischen Transformanten bei einer Frequenz von ungefähr eins pro 100 Bombardierungen der Zielblätter. Das Vorhandensein von Klonierungsstellen zwischen diesen Markern erlaubte die Erzeugung eines Plastid-Targeting-Vektors zur Einbringung von Fremdgenen (Staub 1993). Erhebliche Erhöhungen in der Transformationsfrequenz erhält man durch das Ersetzen der rezessiven rRNA oder des r-Protein-Antibiotikumresistenz-Gens mit einem dominanten selektierbaren Marker, dem bakteriellen aadA-Gen, welches das Spectinomycin-detoxifizierende Enzym Aminoglycosid-3N-Adenyltransferase codiert (Svab 1993). Andere selektierbare Marker, die nützlich für Plastidentransformation sind, sind im Stand der Technik bekannt und innerhalb des Umfangs der Erfindung inbegriffen. In der Regel sind ungefähr 15–20 Zellteilungszyklen im Anschluss an eine Transformation erforderlich, um einen homoplastidischen Zustand zu erreichen. Die Plastiden-Expression, in welcher Gene durch homologe Rekombination in alle der mehreren tausend Kopien des zirkulären Plastidengenoms, die in jeder Pflanzenzelle vorhanden sind, inseriert werden, zieht einen Nutzen aus dem enormen Kopienzahl-Vorteil gegenüber nukleär exprimierten Genen, wodurch Expressionsspiegel ermöglicht werden, welche mit Leichtigkeit 10% des gesamten löslichen Pflanzenproteins übersteigen können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in einen Plastiden-Targeting-Vektor inseriert und in das Plastidengenom eines gewünschten Pflanzenwirts transformiert. Pflanzen, die homoplastisch bezüglich der Plastidengenome, die eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung enthalten, sind, werden erhalten und sind präferentiell zu einer hohen Expression der Nukleotidsequenz in der Lage.
  • Agrobacterium tumefaciens-Zellen, die einen Vektor enthalten, der eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei der Vektor ein Ti-Plasmid umfasst, sind in Verfahren zur Herstellung transformierter Pflanzen nützlich. Pflanzenzellen werden mit einem Agrobacterium tumefaciens, wie oben beschrieben, infiziert, um eine transformierte Pflanzenzelle zu erzeugen, und dann wird eine Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle regeneriert. Es sind zahlreiche Agrobacterium-Vektorsysteme, die in – Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, bekannt.
  • Es können diverse Agrobacterium-Stämme angewandt werden, vorzugsweise entschärfte Agrobacterium tumefaciens- oder rhizogenes-Stämme. In einer bevorzugten Ausführungsform schließen Agrobacterium-Stämme zur Verwendung in der Praxis der Erfindung Octopin-Stämme, z. B. LBA4404, oder Agrogin-Stämme, z. B. EHA101 oder EHA105, ein. Geeignete Stämme von A. tumefaciens für den DNA-Transfer sind zum Beispiel EHA101[pEHA101] (Hood 1986), EHA105[pEHA105] (Li 1992), LBA4404[pAL4404] (Hoekema 1983), C58C1[pMP90] (Koncz & Schell 1986) und C58C1[pGV2260] (Deblaere 1985). Andere geeignete Stämme sind Agrobacterium tumefaciens C58, ein Nopalin-Stamm. Andere geeignete Stämme sind A.tumefaciens C58C1 (Van Larebeke 1974), A136 (Watson 1975) oder LBA4011 (Klapwijk 1980). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das im Erdreich vorkommende Bakterium eine entschärfte Variante von Agrobacterium rhizogenes-Stamm K599 (NCPPB 2659). Vorzugsweise umfassen diese Stämme entschärfte Plasmidvarianten eines Ti- oder Ri-Plasmids, welche die Funktionen bereitstellen, die für den T-DNA-Transfer in Pflanzenzellen erforderlich sind (z. B. die vir-Gene). In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Agrobacterium-Stamm, der zum Transformieren des mit der pflanzlichen Phenolverbindung vorkultivierten Pflanzengewebes verwendet wird, ein L,L-Succinamopin-Typ-Ti-Plasmid, das vorzugsweise entschärft ist, wie etwa pEHA101. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält der Agrobacterium-Stamm, der zum Transformieren des mit der pflanzlichen Phenolverbindung vorkultivierten Pflanzengewebes verwendet wird, ein Octopin-Typ-Ti-Plasmid, das vorzugsweise entschärft ist, wie etwa pAL4404. Im Allgemeinen wird es, bei Verwendung von Octopin-Typ-Ti-Plasmiden oder Helferplasmiden, bevorzugt, dass das virF-Gen deletiert oder inaktiviert ist (Jarschow 1991).
  • Das Verfahren der Erfindung kann in Kombination mit bestimmten Agrobacterium-Stämmen angewandt werden, um die Transformationseffizienz weiter zu erhöhen, wie Agrobacterium-Stämmen, deren vir-Genexpression und/oder Induktion wegen des Vorhandenseins von mutanten oder chimären virA- oder virG-Genen verändert ist (z. B. Hansen 1994; Chen und Winans 1991; Scheeren-Groot, 1994). Bevorzugt sind weiterhin Kombinationen von Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 (Hiei 1994) mit super-virulenten Plasmiden. Diese sind vorzugsweise pTOK246-basierende Vektoren (Ishida 1996).
  • Ein Binärvektor oder ein beliebiger anderer Vektor kann durch gängige DNA-Rekombinationstechniken modifiziert werden, in E. coli vervielfältigt werden und in Agrobacterium mittels z. B. Elektroporation oder anderen Transformationstechniken (Mozo & Hooykaas 1991) eingeführt werden.
  • Agrobacterium wird auf eine Weise wachsen gelassen und angewandt, ähnliche zu jener, die in Ishida (1996) beschrieben ist. Der den Vektor umfassende Agrobacterium-Stamm kann zum Beispiel während 3 Tagen auf YP-Medium wachsen gelassen werden (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Pepton, 5 g/l NaCl, 15 g/l Agar, pH 6,8), das mit dem passendem Antibiotikum (z. B. 50 mg/l Spectinomycin) ergänzt ist. Bakterien werden mit einer Öse vom Festmedium abgesammelt und resuspendiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Agrobacterium-Kulturen durch Verwendung von bei –80°C gefrorenen Aliquots begonnen.
  • Die Transformation des Zielgewebes (z. B. eines unreifen Embryos) durch das Agrobacterium kann durch bloßes Inkontaktbringen des Zielgewebes mit dem Agrobacterium durchgeführt werden. Die Konzentration von für Infektion und Co-Kultivierung verwendetem Agrobacterium muss gegebenenfalls variiert werden. Zum Beispiel wird eine Zellsuspension des Agrobacterium mit einer Populationsdichte von ungefähr 105–1011, vorzugsweise 106 bis 1010, stärker bevorzugt etwa 108 Zellen oder cfu/ml hergestellt, und das Zielgewebe wird in dieser Suspension etwa 3 bis 10 Minuten lang eingetaucht. Das resultierende Zielgewebe wird danach auf einem Festmedium mehrere Tage lang zusammen mit dem Agrobacterium kultiviert.
  • Vorzugsweise wird das Bakterium in einer Konzentration von 106 bis 1010 cfu/ml verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden für den Co-Kultivierungsschritt etwa 1 bis 10 μl einer Suspension des im Erdboden vorkommenden Bakteriums (z. B. Agrobacteria) in dem Co-Kultivierungsmedium direkt auf jedes Zielgewebe-Explantat angewandt und an Luft getrocknet. Dies spart Arbeit und Zeit und verringert unbeabsichtigten Agrobacterium-vermittelten Schaden durch übermäßige Verwendung von Agrobacterium.
  • Für Agrobacterium-Behandlung werden die Bakterien sind in einem Pflanzen-kompatiblen Co-Kultivierungsmedium resuspendiert. Die Ergänzung des Co-Kulturmediums mit Antioxidantien (z. B. Silbernitrat), Phenol-absorbierenden Verbindungen (wie Polyvinylpyrrolidon, Perl 1996) oder Thiolverbindungen (z. B. Dithiothreitol, L-Cystein, Olhoft 2001), welche Gewebenekrose wegen pflanzlicher Abwehrreaktionen verringern kann (wie phenolische Oxidation), kann die Effizienz einer Agrobacterium-vermittelten Transformation weiter verbessern. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Co-Kultivierungsmedium mindestens eine Thiolverbindung, welche vorzugsweise aus der Gruppe gewählt wird, die aus Natriumthiolsulfat, Dithiotrietol (DTT) und Cystein besteht. Vorzugsweise liegt die Konzentration zwischen etwa 1 mM und 10 mM L-Cystein, 0,1 mM bis 5 mM DTT und/oder 0,1 mM bis 5 mM Natriumthiolsulfat. Vorzugsweise umfasst das Medium, welches während der Co-Kultivierung zur Anwendung kommt, etwa 1 μM bis etwa 10 μM Silbernitrat und etwa 50 mg/l bis etwa 1000 mg/l L-Cystein. Dies führt zu einer stark reduzierten Verletztlichkeit des Zielgewebes gegenüber Agrobacterium-vermittelter Schädigung (wie induzierter Nekrose) und verbessert in starkem Maße die Transformations-Gesamteffizienz.
  • Verschiedene Vektorsysteme können in Kombination mit Agrobakterien verwendet werden. Binärvektorsysteme sind bevorzugt. Übliche binäre Vektoren basieren auf ”Breit-Wirtsspektrum”-Plasmiden, wie pRK252 (Bevan 1984) oder pTJS75 (Watson 1985), die aus dem P-Typ-Plasmid RK2 abgeleitet sind. Die meisten dieser Vektoren sind Derivate von pBIN19 (Bevan 1984). Mannigfaltige Binärvektoren sind bekannt, wobei einige davon im Handel verfügbar sind, wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laborstories, Inc. USA). Zusätzliche Vektoren wurden in Bezug auf die Größe und Handhabung verbessert (z. B. pPZP; Hajdukiewicz 1994). Verbesserte Vektorsysteme sind ebenfalls in der WO 02/00900 beschrieben.
  • Verfahren unter Verwendung entweder einer Form von direktem Gentransfer oder Agrobacterium-vermittelten Transfer werden üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, mit einem selektierbaren Marker durchgeführt, der Resistenz gegen ein Antibiotikum (z. B. Kanamycin, Hygromycin oder Methotrexat) oder ein Herbizid (z. B. Phosphinothricin) vorsehen kann. Die Auswahl des selektierbaren Markers für die Pflanzentransformation ist jedoch nicht kritisch für die Erfindung.
  • Für gewisse Pflanzenspezies, können verschiedene Antibiotikum- oder Herbizid-Selektionsmarker bevorzugt werden. Selektionsmarker, die routinemäßig in der Transformation verwendet werden, schließen das nptII-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandte Antibiotika verleiht (Messing & Vierra, 1982; Bevan 1983), das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White 1990, Spencer 1990), das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochlinger & Diggelmann), und das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis 1983), ein.
  • Verfahren zur Herstellung und weiteren Charakterisierung von stabil transformierten Pflanzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Als Beispiel werden transgene Pflanzenzellen in einem passenden Selektivmedium für die Selektion von transgenen Zellen platziert, welche dann zum Kallus heranwachsen gelassen werden. Sprosse werden aus dem Kallus austreiben gelassen. Aus dem Spross werden Pflänzchen durch Wachsenlassen in Bewurzelungsmedium erzeugt. Die diversen Konstrukte werden normalerweise an einen Marker für Selektion in Pflanzenzellen gekoppelt. Zweckmäßigerweise kann der Marker eine Resistenz gegen ein Biozid (insbesondere ein Antibiotikum, wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol, Herbizid, oder dergleichen) sein. Der jeweilige verwendete Marker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen im Vergleich zu Zellen ohne die DNA, die eingebracht wurde. Komponenten von DNA-Konstrukten, einschließlich Transkriptionskassetten dieser Erfindung, können aus Sequenzen hergestellt werden, die nativ (endogen) oder fremd (exogen) bezüglich des Wirts sind. Mit ”fremd” ist gemeint, dass die Sequenz nicht im Wildtypwirt gefunden wird, in den das Konstrukt eingebracht wird. Heterologe Konstrukte enthalten mindestens eine Region, die nicht nativ bezüglich des Gens ist, aus dem die Transkriptionsinitiationsregion abgeleitet ist.
  • Zur Bestätigung des Vorhandenseins der Transgene in transgenen Zellen und Pflanzen, kann eine Vielzahl an Testverfahren durchgeführt werden. Zu solchen Assays zählen zum Beispiel ”molekularbiologische” Assays, die dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, wie Southern- und Northern-Blotting, In-situ-Hybridisierung und Nukleinsäure-basierte Amplifikationsmethoden, wie PCR oder RT-PCR oder TaqMan; ”biochemische” Assays, wie Nachweisen des Vorhandenseins eines Proteinprodukts, z. B. durch immunologische Mittel (ELISAs und Western-Blots) oder durch enzymatische Funktion; Pflanzenteil-Assays, wie Samenassays; und ebenfalls das Analysieren des Phänotyps der gesamten regenerierten Pflanze, z. B. bezüglich Krankheits- oder Schädlingsresistenz.
  • DNA kann aus Zelllinien oder jedweden Pflanzenteilen isoliert werden, um das Vorhandensein des vorausgewählten Nukleinsäuresegments durch Anwenden von dem Fachmann allgemein bekannten Techniken zu bestimmen. Man bemerke, dass intakte Sequenzen nicht immer vorhanden sein werden, vermutlich wegen des Rearrangements oder der Deletion von Sequenzen in der Zelle.
  • Das Vorhandensein von Nukleinsäureelementen, die durch die Verfahren dieser Erfindung eingebracht wurden, kann durch Polymerasekettenreaktion (PCR) bestimmt werden. Unter Anwendung dieser Technik werden diskrete Fragmente von Nukleinsäure amplifiziert und durch Gelelektrophorese nachgewiesen. Dieser Typ von Analyse erlaubt es, zu bestimmen, ob ein vorausgewähltes Nukleinsäuresegment in einer stabilen Transformante vorhanden ist, aber beweist nicht die Integration des eingebrachten vorausgewählten Nukleinsäuresegments in das Wirtszellgenom. Darüber hinaus ist es unter Verwendung von PCR-Techniken nicht möglich, zu bestimmen, ob bei den Transformanten die exogenen Gene in unterschiedlichen Stellen im Genom eingebaut sind, d. h. ob Transformanten von unabhängiger Herkunft sind. Es wird in Betracht gezogen, dass es unter Verwendung von PCR-Techniken möglich wäre, Fragmente der genomischen Wirts-DNA benachbart zu einem eingebrachten vorausgewählten DNA-Segment zu klonieren. Zu bekannten Verfahren der PCR zählen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Verfahren unter Verwendung von gepaarten Primern, verschachtelten Primern, einzelspezifischen Primern, degenerierten Primern, Gen-spezifischen Primern, Vektor-spezifischen Primern, teilweise fehlgepaarten Primern und dergleichen.
  • Positive Beweise der DNA-Integration in das Wirtsgenom und der unabhängigen Identitäten von Transformanten können unter Anwendung der Technik der Southern-Hybridisierung ermittelt werden. Mit Hilfe dieser Technik können spezifische DNA-Sequenzen, die in das Wirtsgenom eingebracht wurden, sowie flankierende Wirts-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Somit dient das Southern-Hybridisierungsmuster einer gegebenen Transformante als eine Identifizierungs-Charakteristik dieser Transformante. Darüber hinaus ist es durch Southern-Hybridisierung möglich, das Vorhandensein von eingeführten vorausgewählten DNA-Segmenten in Hoch-Molekulargewicht-DNA zu zeigen, d. h. zu bestätigen, dass das eingebrachte vorausgewählte DNA-Segment in das Wirtszellgenom integriert worden ist. Die Technik der Southern-Hybridisierung liefert Information, welche unter Verwendung von PCR erhalten wird, z. B. das Vorhandensein eines vorausgewählten DNA-Segments, aber weist außerdem die Integration in das Genom nach und charakterisiert jede individuelle Transformante.
  • Es wird davon ausgegangen, dass man unter Verwendung der Techniken der Dot- oder Slot-Blot-Hybridisierung, welche Modifikationen von Southern-Hybridisierungstechniken sind, die gleiche Information, die aus PCR abgeleitet wird, z. B. das Vorhandensein eines vorausgewählten DNA-Segments, erlangen könnte.
  • Sowohl PCR- und Southern-Hybridisierungs-Techniken können angewandt werden, um die Weitergabe eines vorausgewählten DNA-Segments auf Nachkommen zu beweisen. In den meisten Fällen wird das charakteristische Southern-Hybridisierungsmuster für eine gegebene Transformante in den Nachkommen als ein oder mehrere Mendel'sche Gene segregieren (Spencer 1992); Laursen 1994), was die stabile Vererbung des Gens anzeigt. Die nicht-chimäre Natur des Kallus und der parentalen Transformanten (R0) wurde durch Keimbahn-Übertragung und die identischen Southern-Blot-Hybridisierungsmuster und Intensitäten der transformierenden DNA in Kallus, R0-Pflanzen und R1-Nachkommen, welche bezüglich das transformierten Gens segregierten, nahegelegt.
  • Während DNA-Analysetechniken unter Verwendung von DNA, die aus einem beliebigen Teil einer Pflanze isoliert wurde, durchgeführt werden können, kann RNA nur in besonderen Zellen oder Gewebetypen exprimiert werden, und daher wird es erforderlich sein, RNA zur Analyse aus diesen Geweben zu präparieren. Auch PCR-Techniken können zum Nachweisen und Quantifizieren von RNA verwendet werden, die aus eingebrachten vorausgewählten DNA-Segmenten erzeugt wurde. In dieser Anwendung von PCR ist es zunächst erforderlich, RNA revers in DNA zu transkribieren, und zwar unter Verwendung von Enzymen, wie ”Reverser Transkriptase”, und dann durch Verwendung herkömmlicher PCR-Techniken zum Amplifizieren der DNA. In den meisten Fällen werden PCR-Techniken, obwohl nützlich, nicht die Integrität des RNA-Produkts aufzeigen. Weitere Informationen über die Natur des RNA-Produkts kann man aber durch Northern-Blotting gewinnen. Diese Technik zeigt das Vorhandensein einer RNA-Spezies an und gibt auch Auskunft über die Integrität dieser RNA. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer RNA-Spezies kann außerdem unter Anwendung von Dot- oder Slot-Blot-Northern-Hybridisierungen bestimmt werden. Diese Techniken sind Abwandlungen des Northern-Blotting und werden lediglich das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer RNA-Spezies aufdecken.
  • Obgleich Southern-Blotting und PCR angewandt werden können, um das betreffende vorausgewählte DNA-Segment nachzuweisen, liefern sie keine Auskunft darüber, ob das vorausgewählte DNA-Segment exprimiert wird. Die Expression kann durch spezifisches Identifizieren der Proteinprodukte der eingebrachten vorausgewählten DNA-Segmente oder durch Evaluieren der phänotypischen Änderungen, die durch deren Expression bewirkt werden, ausgewertet werden.
  • Assays zur Herstellung und Identifikation von spezifischen Proteinen können von physikalischchemischen, strukturellen, funktionellen oder sonstigen Eigenschaften der Proteine Gebrauch machen. Einzigartige physikalisch-chemische oder strukturelle Eigenschaften gestatten, dass die Proteine durch elektrophoretische Prozeduren, wie etwa native oder denaturierende Gelelektrophorese oder isoelektrische Fokusierung, oder durch chromatographische Techniken, wie etwa Ionenaustausch- oder Gel-Ausschlusschromatographie, getrennt und identifiziert werden. Die einzigartigen Strukturen von individuellen Proteinen bieten Möglichkeiten zur Verwendung von spezifischen Antikörpern zum Nachweisen ihres Vorhandenseins in Formaten, wie etwa einem ELISA-Assay. Kombinationen von Vorgehensweisen können mit noch größerer Spezifität angewandt werden, wie etwa Western-Blotting, in welchem Antikörper verwendet werden, um individuelle Genprodukte zu lokalisieren, die durch elektrophoretische Techniken aufgetrennt worden sind. Zusätzliche Techniken können angewandt werden, um die Identität des Produkts von Interesse absolut zu bestätigen, wie etwa Evaluierung durch Aminosäuresequenzierung im Anschluss an die Reinigung. Obwohl diese zu den am häufigsten angewandten Verfahren zählen, können zusätzlich andere Prozeduren zur Anwendung kommen.
  • Außerdem können Assay-Prozeduren angewandt werden, um die Expression von Proteinen durch ihre Funktionalität, insbesondere der Fähigkeit von Enzymen, spezifische chemische Reaktionen unter Beteiligung spezifischer Substrate und Produkte zu katalysieren, zu identifizieren. Diese Reaktionen können durch Bereitstellung und Verlust-Quantifizierung von Substraten oder durch die Entstehung von Produkten der Reaktionen mittels physikalischer oder chemischer Prozeduren verfolgt werden Beispiele hierfür sind so vielfältig wie die zu analysierenden Enzyme.
  • Sehr häufig wird die Expression eines Genprodukts durch Auswerten der phänotypischen Folgen seiner Expression bestimmt. Diese Assays können ebenfalls viele Formen annehmen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Analysieren von Änderungen in der chemischen Zusammensetzung, der Morphologie oder den physiologischen Eigenschaften der Pflanze. Morphologische Veränderungen können größeren Wuchs oder dickere Stengel einschließen. Am häufigsten werden Veränderungen in der Antwort von Pflanzen oder Pflanzenteilen auf ausgeübte Behandlungen unter sorgfältig kontollierten Bedingungen ausgewertet, was man als Bioassays bezeichnet.
  • Der folgende Abschnitt liefert Beispiele für besondere Polynukleotide von Interesse, die funktionsfähig an die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung verknüpft werden können.
  • 1. Exemplarische Transgene
  • 1.1. Herbizidresistenz
  • Die Phosphinothricin-Acetyltransferase codierenden Gene (bar und pat), Glyphosat-Toleranz-EPSP-Synthase-Gene, das Glyphosat-abbauende Enzym-Gen gox, das Glyphosat-Oxidoreductase codiert, deh (codierend ein Dehalogenase-Enzym, das Dalapon inaktiviert), Herbizidresistenz(z. B. Sulfonylharnstoff und Imidazolinon)-Acetolactatsynthase und bxn-Gene (codierend für ein Nitrilase-Enzym, das Bromoxynil abbaut) sind gute Beispiele für Herbizidresistenz-Gene zur Verwendung in einer Transformation. Die bar- und pat-Gene codieren für ein Enzym, Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT), das das Herbizid Phosphinothricin inaktiviert und diese Verbindung an der Hemmung von Glutaminsynthetase-Enzymen hindert. Das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSP-Synthase) wird normalerweise durch das Herbizid N-(Phosphonomethyl)glycin (Glyphosat) inhibiert. Allerdings sind Gene bekannt, welche Glyphosatresistenz-EPSP-Synthase-Enzyme codieren. Das deh-Gen codiert das Enzym Dalapon-Dehalogenase und verleiht Resistenz gegenüber dem Herbizid Dalapon. Das bxn-Gen codiert ein spezifisches Nitrilase-Enzym, das Bromoxynil in ein nicht-herbizides Abbauprodukt umwandelt.
  • 1.2 Insektenresistenz
  • Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Einbringung von Insektenresistenzverleihenden Genen in Pflanzen. Zu potentiellen Insektenresistenzgenen, welche eingebracht werden können, zählen Bacillus thuringiensis-Kristalltoxin-Gene oder Bt-Gene (Watrud 1985). Bt-Gene können Resistenz gegen schmetterlings- oder käferartige Schädlinge, wie etwa dem Maiszünsler bzw. ”European Corn Borer” (ECB) und dem Maiswurzelbohrer bzw. ”Corn rootworm” (CRW) gewähren. Bevorzugte Bt-Toxingene zur Verwendung in solchen Ausführungsformen schließen die CryIA(b)- und CryIA(c)-Gene ein. Endotoxingene aus anderen Spezies von B. thuringiensis, welche das Insektenwachstum oder -entwicklung beeinflußen, können ebenfalls in dieser Hinsicht angewandt werden. Proteaseinhibitoren können ebenfalls eine Insektenresistenz bereitstellen (Johnson 1989), und finden daher Anwendbarkeit bei der Pflanzentransformation. Die Verwendung eines Proteaseinhibitor II-Gens, pinII, aus der Tomate oder Kartoffel wird als besonders nützlich erachtet. Noch vorteilhafter ist die Verwendung eines pinII-Gens in Kombination mit einem Bt-Toxin-Gen, deren kombinierter Effekt seitens der vorliegenden Erfinder als synergistische insektizide Aktivität hervorrufend befunden wurde. Andere Gene, welche Inhibitoren des Verdauungssystems von Insekten codieren, oder solche, welche Enzyme oder Cofaktoren codieren, die die Produktion von Inhibitoren erleichtern, können ebenfalls nützlich sein. Cystatin und Amylase-Inhibitoren, wie jene aus Weizen und Gerste, können als Beispiele für diese Gruppe dienen.
  • Des Weiteren können Lektine codierende Gene zusätzliche oder alternative insektizide Eigenschaften vermitteln. Lektine (ursprünglich als Phythämagglutinine bezeichnet) sind mehrwertige Kohlenhydrat-bindende Proteine, welche die Fähigkeit aufweisen, rote Blutzellen aus einer Reihe von Spezies zu agglutinieren. Lektine sind vor Kurzem als insektizide Agentien mit Aktivität gegen Rüssel- bzw. Kornkäfer, ECB und Maiswurzelbohrer identifiziert worden (Murdock 1990; Czapla & Lang, 1990). Lektin-Gene, die als nützlich erachtet werden, schließen zum Beispiel Gerste- und Weizenkeimagglutinin (WGA) sowie Reis-Lektine (Gatehouse 1984) ein, wobei WGA bevorzugt wird.
  • Gene, welche die Herstellung von großen oder kleinen Polypeptiden steuern, die gegen Insekten wirksam sind, wenn sie in die Insekten-Schädlinge eingebracht werden, wie z. B. lytische Peptide, Peptidhormone und Toxine und Gifte, bilden einen anderen Aspekt der Erfindung. Zum Beispiel, wird es in Betracht gezogen, dass die Expression von Juvenilhormon-Esterase, die gegen spezifische Insektenschädlinge gerichtet ist, ebenfalls zu insektizider Aktivität führen kann, oder vielleicht einen Stillstand der Metamorphose verursachen kann (Hammock 1990).
  • Transgene Pflanzen, die Gene exprimieren, welche Enzyme codieren, die die Integrität der Insekten-Kutikula beeinflußen, bilden noch einen weiteren Aspekt der Erfindung. Zu solchen Genen zählen jene, welche z. B. Chitinase, Proteasen, Lipasen codieren, und auch Gene für die Produktion von Nikkomycin, einer Verbindung, welche die Chitinsynthese hemmt, wobei man annimmt, dass die Einbringung von jedweden davon zu insektenresistenten Maispflanzen führt. Gene, welche Aktivitäten codieren, die die Insektenhäutung beeinflußen, wie etwa jene, die die Produktion von Ekdysteroid-UDP-glucosyl-Transferase beeinflußen, liegen ebenfalls im Umfang der nützlichen Transgene der vorliegenden Erfindung.
  • Gene, die für Enzyme codieren, welche die Herstellung von Verbindungen erleichtern, welche die Nährstoffqualität der Wirtspflanze für Insektenschädlinge verringern, sind gleichfalls in der vorliegenden Erfindung inbegriffen. Es kann beispielsweise möglich sein, insektizide Aktivität an eine Pflanze zu verleihen, indem man ihre Sterolzusammensetzung verändert. Sterole werden von Insekten aus ihrer Nahrung erhalten und werden für die Hormonsynthese und Membranstabilität genutzt. Deshalb könnten Veränderungen in der pflanzlichen Sterolzusammensetzung durch Expression neuer Gene, z. B. jenen, welche direkt die Herstellung von unerwünschten Sterolen fördern, oder jenen, welche erwünschte Sterole in unerwünschte Formen umwandeln, einen negativen Effekt auf Insektenwachstum und/oder -entwicklung aufweisen und die Pflanze dadurch mit insektizider Aktivität versehen. Lipoxygenasen sind natürlich vorkommende Pflanzenenzyme, von denen gezeigt wurde, dass sie anti-nutritionale Wirkungen auf Insekten aufweisen und die Nährwertqualität von deren Nahrung verringern. Deshalb betreffen weitere Ausführungsformen der Erfindung transgene Pflanzen mit gesteigerter Lipoxygenaseaktivität, welche resistent gegen Insektenfraß sein können.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch Verfahren und Zusammensetzungen, durch die qualitative oder quantitative Veränderungen in pflanzlichen Sekundärmetaboliten erzielt werden. Ein Beispiel betrifft das Transformieren von Pflanzen, damit sie DIMBOA herstellen, welches, so nimmt man an, Resistenz gegen Maiszünsler, Maiswurzelbohrer und einige andere Mais-Insektenschädlinge vermitteln wird. Zu Kandidatengenen, die zur Verwendung in diesem Aspekt ganz besonders in Betracht gezogen werden, zählen jene Gene am bx-Locus, die bekanntermaßen am synthetischen Weg zu DIMBOA beteiligt sind (Dunn 1981). Von der Einbringung von Genen, welche die Herstellung von Maysin regulieren können, bzw. von Genen, die an der Herstellung von Dhurrin in Sorghum beteiligt sind, wird gleichfalls angenommen, dass sie zur Erleichterung einer Resistenz gegen Baumwollkapselbohrer bzw. Maiswurzelbohrer nützlich ist.
  • Tripsacum dactyloides ist eine Grasart, welche resistent gegenüber bestimmten Insekten, einschließlich Maiswurzelbohrer, ist. Es wird vorhergesehen,. dass Gene, die Proteine, welche für Insekten giftig sind oder in der Biosynthese von für Insekten toxischen Verbindungen involviert sind, codieren, aus Tripsacum isoliert werden, und dass diese neuen Gene nützlich bei der Herbeiführung von Resistenz gegen Insekten sein werden. Es ist bekannt, dass die Grundlage für Insektenresistenz in Tripsacum genetisch ist, weil die Resistenz durch sexuelle Kreuzungen auf Zea mays übertragen worden ist (Branson & Guss, 1972).
  • Weitere Gene, die Proteine codieren, die als eine potentielle insektizide Aktivität aufweisend gekennzeichnet sind, können ebenfalls als Transgene gemäß dem hier gesagten verwendet werden. Zu derartigen Genen zählen zum Beispiel der Kuhbohnen- bzw. Catjangbohnen-Trypsininhibitor (CpTI; Hilder 1987), der als ein Wurzelbohrer-Abschreckmittel verwendet werden kann; Gene, die für Avermectin codieren (Campbell 1989; Ikeda 1987), das sich besonders nützlich als ein Maiswurzelbohrer-Abschreckstoff erweisen kann; Ribosomen inaktivierende Protein-Gene; und sogar Gene, welche Pflanzenstrukturen regulieren. Transgener Mais, enthaltend Anti-Insekten-Antikörper-Gene und Gene, welche Enzyme codieren, die ein nicht toxisches Insektizid (Pro-Insektizid), aufgebracht auf die Außenseite der Pflanze, in ein Insektizid innerhalb der Pflanze umwandeln können, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • 1.3 Umwelt- oder Stressresistenz
  • Die Verbesserung des Vermögens einer Pflanze, diverse umweltbedingte Stressformen zu tolerieren, wie etwa, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Dürre, übermäßige Feuchtigkeit, Abkühlung, Gefrieren, Stress durch hohe Temperatur, Salz und oxidativer Stress, kann ebenfalls durch die Expression von heterologen, oder die Überexpression von homologen Genen bewirkt werden. Vorteile können in Bezug auf eine erhöhte Resistenz gegen Frosttemperaturen durch das Einbringen eines ”Gefrierschutz”-Proteins realisiert werden, wie etwa jenem der Winterflunder (Cutler 1989) oder synthetischen Genderivativen davon. Verbesserte Abkühlungstoleranz kann auch durch die erhöhte Expression von Glycerol-3-phosphat-Acetyltransferase in Chloroplasten vermittelt werden (Murata 1992; Wolter 1992). Resistenz gegen oxidativen Stress (oft verschärft durch Bedingungen, wie Abkühlungstemperaturen in Kombination mit hohen Lichtintensitäten) kann durch Expression von Superoxiddismutase (Gupta 1993) herbeigeführt werden, und kann durch Glutathion-Reduktase verbessert werden (Bowler 1992). Solche Strategien können eine Toleranz gegen Frost in neu ausgetriebenen Feldern sowie die Ausdehnung von später reifenden Hochertragsvärietäten auf frühere relative Reifezonen erlauben.
  • Die Expression von neuen Genen, welche Pflanzen-Wassergehalt, Gesamt-Wasserpotential, osmotisches Potential und Turgor günstig beeinflussen, kann die Fähigkeit der Pflanze steigern, eine Dürre auszuhalten. Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke ”Dürre-Resistenz” und. ”Dürretoleranz” verwendet, um auf eine erhöhte Resistenz oder Toleranz von Pflanzen gegenüber Stress, induziert durch eine Verringerung der Wasserverfügbarkeit im Vergleich zu normalen Bedingungen, und die Fähigkeit der Pflanze, in Umgebungen mit weniger Wasser zu funktionieren und zu überleben und eine Leistung in einer verhältnismäßig überlegenen Weise zu zeigen, Bezug zu nehmen. In diesem Aspekt der Erfindung wird zum Beispiel vorgeschlagen, dass die Expression eines Gens, das die Biosynthese von osmotisch aktiven Gelöststoffen codiert, einen Schutz gegen Dürre verleihen kann. Innerhalb dieser Klasse von Genen sind DNAs, die für Mannitoldehydrogenase (Lee und Saier, 1982) und Trehalose-6-phosphat-Synthase (Kassen 1992) codieren. Durch die anschließende Wirkung nativer Phosphatasen in der Zelle oder durch die Einbringung und Coexpression einer spezifischen Phosphatase, führen diese eingebrachten Gene zur jeweiligen Akkumulation entweder von Mannitol oder Trehalose, welche beide als schützende Verbindungen gut dokumentiert wurden, die in der Lage sind, die Effekte von Stress zu lindern. Eine Mannitolakkumulation in transgenem Tabak ist bestätigt worden, und vorläufige Ergebnisse zeigen, dass Pflanzen, die hohe Spiegel dieses Metaboliten exprimieren, in der Lage sind, einen angelegten osmotischen Stress auszuhalten (Tarczynski 1992).
  • In ähnlicher Weise wurde die Wirksamkeit von anderen Metaboliten zum Schutz entweder der Enzymfunktion (z. B. Alanopin oder Propionsäure) oder Membranintegrität (z. B. Alanopin) dokumentiert (Loomis 1989), und daher kann eine Expression eines die Biosynthese von diesen Verbindungen codierenden Gens eine Dürreresistenz auf ähnliche Weise zu oder ergänzend zu Mannitol verleihen. Zu anderen Beispielen für natürlich vorkommende, Metabolite, die osmotisch aktiv sind und/oder irgendeinen direkten schützenden Effekt während Dürre und/oder Austrocknung vorsehen, zählen Zucker und Zuckerderivate, wie Fructose, Erythritol (Coxson 1992), Sorbitol, Dulcitol (Karsten 1992), Glucosylglycerol (Reed 1984; Erdmann 1992), Saccharose, Stachyose (Koster & Leopold 1988; Blackman 1992), Ononitol und Pinitol (Vernon & Bohnert 1992) sowie Raffinose (Bernal-Lugo & Leopold 1992). Andere osmotisch aktive Gelöststoffe, welche keine Zucker sind, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Prolin- und Glycin-Betain ein (Wyn-Jones und Storey, 1981). Fortgesetztes Scheitel- bzw. Laubkronenwachstum und erhöhte reproduktive Fitness während Stresszeiten können erhöht werden durch Einbringen und Expression von Genen, wie etwa jenen, welche die oben erörterten osmotisch aktiven Verbindungen und andere solche Verbindungen steuern, wie in einer beispielsweisen Ausführungsform durch das Enzym Myoinositol-O-methyltransferase repräsentiert.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die Expression von spezifischen Proteinen auch die Dürre-Toleranz erhöhen kann. Drei Klassen von ”Späten Embryogenen Proteinen” sind basierend auf Strukturähnlichkeiten unterteilt worden (siehe Dure 1989). Alle drei Klassen dieser Proteine sind in reifenden (d. h. austrocknenden) Samen nachgewiesen worden. Innerhalb dieser 3 Typen von Proteinen, hat man den Typ-II (Dehydrin-Typ) allgemein mit Dürre- und/oder Austrocknungstoleranz in vegetativen Pflanzenteilen in Zusammenhang gebracht (z. B. Mundy und Chua, 1988; Piatkowski 1990; Yamaguchi-Shinozaki 1992). Vor Kurzem wurde von der Expression eines Typ-III LEA (HVA-1) in Tabak gefunden, die Pflanzenhöhe, Reife und Dürretoleranz zu beeinflußen (Fitzpatrick, 1993). Die Expression von Strukturgenen aus allen drei Gruppen kann daher eine Dürretoleranz vermitteln. Andere Typen von Proteinen, die während Wasserstress induziert werden, schließen Thiolproteasen, Aldolasen und Transmembran-Transporter (Guerrero 1990) ein, welche diverse schützende und/oder Reparatur-Typ-Funktionen während Dürrestress vermitteln können. Die Expression eines Gens, welches Lipidbiosynthese und daher die Membranzusammensetzung beeinflußt, kann bei der Verleihung von Dürreresistenz an die Pflanze ebenfalls nützlich sein.
  • Viele Gene, welche die Dürreresistenz verbessern, besitzen komplementäre Wirkmodi. Daher könnten Kombinationen von diesen Genen additive und/oder synergistische Effekte bei der Verbesserung der Dürreresistenz in Mais aufweisen. Viele dieser Gene verbessern auch die Frost-Toleranz (oder -Resistenz); die physikalischen Stressarten, die bei Frost und Dürre herrschen, sind von ähnlicher Natur und können auf ähnliche Weise gelindert werden. Der Nutzen kann herbeigeführt werden durch konstitutive oder gewebespezifische Expression dieser Gene, aber die bevorzugten Wege zum Exprimieren dieser neuen Gene können über die Verwendung eines Turgor-induzierten Promotors arbeiten (wie die Promotoren für die Turgor-induzierten Gene, die in Guerrero et al. 1990 und Shagan 1993 beschrieben sind). Räumliche und zeitliche Expressionsmuster dieser Gene können Mais in die Lage versetzen, Stress besser auszuhalten.
  • Die Expression von Genen, welche an spezifischen morphologischen Merkmalen beteiligt sind, die erhöhte Wasserextraktion aus austrocknendem Erdboden gestatten, wäre von Nutzen. Zum Beispiel können Einbringung und Expression von Genen, welche Wurzelcharakteristika ändern, die Wasseraufnahme steigern. Die Expression von Genen, welche die reproduktive Fitness während Stresszeiten steigern, wäre von erheblichem Nutzen. Zum Beispiel wäre eine Expression von DNAs, welche die Synchronizität des Pollenabwurfs und des Empfängnisvermögens der weiblichen Blütenteile, d. h. der Seidefäden bzw. Griffelfäden, verbessern, von Vorteil. Darüber hinaus würde die Expression von Genen, welche Korn-Abtreibung während Stresszeiten minimieren, die Menge an Korn, die geerntet werden kann, erhöhen und damit von Nutzen sein. Die Regulation von Cytokininspiegeln in Monokotylen, wie Mais, durch Einbringen und Expression eines Isopentenyltransferase-Gens mit angemessenen regulatorischen Sequenzen kann Stressresistenz und Ertrag von Monokotylen verbessern (Gan 1995).
  • Angesichts der globalen Rolle von Wasser bei der Bestimmung des Ertrags, wird es in Betracht gezogen, dass das Befähigen von Pflanzen zu effizienterer Wasserverwertung durch die Einbringung und Expression neuer Gene die Gesamtleistung verbessern wird, sogar wenn die Bodenwasserverfügbarkeit nicht einschränkend ist. Durch Einbringen von Genen, welche das Vermögen von Pflanzen verbessern, die Wasserverwertung über ein volles Spektrum von Stressformen hinsichtlich der Wasserverfügbarkeit zu maximieren, können Ertragsstabilität oder Konsistenz der Ertragsleistung realisiert werden.
  • Verbesserter Schutz der Pflanze vor abiotischen Stressfaktoren, wie Dürre, Hitze oder Kälte, kann ebenfalls erzielt werden – zum Beispiel – durch Überexprimieren von Gefrierschutz-polypeptiden aus Myoxocephalus scorpius ( WO 00/00512 ), Myoxocephalus octodecemspinosus, des Arabidopsis thaliana-Transkriptionsaktivators CBF1, von Glutamatdehydrogenasen ( WO 97/12983 , WO 98/11240 ), von Calcium-abhängige-Proteinkinase-Genen ( WO 98/26045 ), Calcineurinen ( WO 99/05902 ), Caseinkinase aus Hefe ( WO 02/052012 ), Farnesyltransferasen ( WO 99/06580 ; Pei ZM et al. (1998) Science 282:287–290), Ferritin (Deck M et al. (1999) Nature Biotechnology 17:192–196), Oxalatoxidase ( WO 99/04013 ; Dunwell JM (1998) Biotechn Gent Eng Rev 15:1–32), DREB1A-Faktor ("Dehydration response element B 1A"; Kasuga M et al. (1999) Nature Biotech 17:276–286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese, wie Trehalosephosphatsynthase oder Trehalosephosphatphosphatase ( WO 97/42326 ), oder durch Hemmen von Genen, wie etwa Trehalase ( WO 97/50561 ).
  • 1.4 Krankheitsresistenz
  • Es wird vorgeschlagen, dass erhöhte Resistenz gegenüber Krankheiten durch Einbringung von Genen in der Anpflanzperiode realisiert werden kann. Es ist möglich, Resistenz gegen durch Viren, Bakterien, Pilze, Wurzelpathogene, Insekten und Nematoden verursachte Krankheiten hervorzurufen. Es wird auch in Betracht gezogen, dass die Bekämpfung von Mycotoxin-produzierenden Organismen durch Expression von eingebrachten Genen realisiert werden kann.
  • Eine Resistenz gegen Viren kann durch Expression von neuen Genen 'geschaffen werden. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die Expression eines viralen Hüllproteins in einer transgenen Pflanze Resistenz gegen Infektion der Pflanze durch dieses Virus und eventuell andere nahverwandte Viren verleihen kann (Cuozzo 1988, Hemenway 1988, Abel 1986). Es wird in Betracht gezogen, dass die Expression von Antisense-Genen, die auf essentielle virale Funktionen zielgerichtet sind, eine Resistenz gegen das Virus verleihen können. Zum Beispiel kann ein Antisense-Gen, das auf das Gen zielt, das für die Replikation von viraler Nukleinsäure verantwortlich ist, die Replikation inhibieren und zu Resistenz gegen das Virus führen. Es wird angenommen, dass das Stören anderer viraler Funktionen durch die Verwendung von Antisense-Genen ebenfalls die Resistenz gegen Viren erhöhen kann. Außerdem wird vorgeschlagen, dass es möglich sein kann, Resistenz gegen Viren durch andere Verfahrensweisen zu erzielen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung von Satelliten-Viren.
  • Es wird vorgeschlagen, dass eine erhöhte Resistenz gegen durch Bakterien und Pilze ausgelöste Krankheiten durch Einbringen von neuen Genen bewirkt werden kann. Es wird in Betracht gezogen, dass Gene, codierend sogenannte ”Peptidantibiotika”, Pathogeneseverwandte(PR)-Proteine, Toxinresistenz, und Proteine, welche Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen, wie morphologische Charakteristika, beeinflußen, nützlich sind. Peptidantibiotika sind Polypeptidsequenzen, welche inhibitorisch für das Wachstum von Bakterien und anderer Mikroorganismen sind. Zum Beispiel hemmen die Klassen von Peptiden, die man als Cecropine und Magainine bezeichnet, das Wachstum von vielen Spezies von Bakterien und Pilzen. Es wird vorgeschlagen, dass eine Expression von PR-Proteinen in Pflanzen nützlich zur Verleihung von Resistenz gegen bakterielle Erkrankung sein kann. Diese Gene werden im Anschluss an eine Pathogenattacke auf eine Wirtspflanze induziert und sind in mindestens fünf Klassen von Proteinen eingeteilt worden (Bol 1990). Ingebriffen unter der PR-Proteinen sind beta-1,3-Glucanasen, Chitinasen und Osmotin und andere Proteine, die vermutlich bei der Pflanzen-Resistenz gegen Krankheitsorganismen wirken. Man hat weitere Gene identifiziert, welche antifungale Eigenschaften besitzen, z. B. UDA (Brennessel-Lektin) und Hevein (Broakgert 1989; Barkai-Golan 1978). Es ist bekannt, dass gewisse Pflanzenkrankheiten durch die Produktion von Phytotoxinen verursacht werden. Die Resistenz gegen diese Krankheiten könnte durch Expression eines neuen Gens erreicht werden,. das ein Enzym codiert, welches in der Lage zum Abbauen oder anderweitigen Inaktivieren des Phytotoxins ist. Die Expression neuer Gene, welche die Wechselwirkungen zwischen der Wirtspflanze und dem Pathogen verändern, kann nützlich bei der Verringerung des Vermögens des Krankheitsorganismus zum Eindringen in Gewebe der Wirtspflanze, z. B. ein Anstieg der Wachshaltigkeit der Blattkutikula oder eines anderen morphologischen Merkmals, sein.
  • Pflanzenparasitische Nematoden sind eine Krankheitsursache bei vielen Pflanzen. Es wird vorgeschlagen, dass es möglich ist, die Pflanze durch die Expression von neuen Genen resistent gegen diese Organismen zu machen. Es wird vorhergesagt, dass eine Bekämpfung von Nematodenbefällen durch Verändern des Vermögens der Nematode, eine Wirtspflanze zu erkennen oder sich daran anzulagern, und/oder durch Befähigen der Pflanze, nematizide Verbindungen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Proteine, zu produzieren, bewerkstelligt werden könnte.
  • Ferner kann eine Resistenz gegen Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten durch zielgerichtete Akkumulation von gewissen Metaboliten oder Proteinen erreicht werden. Zu solchen Proteinen zählen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Glucosinolate (Abwehr gegen Herbivoren bzw. Pflanzenfresser), Chitinasen oder Glucanasen und andere Enzyme, welche die Zellwand von Parasiten zerstören, Ribosomen-inaktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der Pflanzenresistenz und Stressantwort, wie sie induziert werden, wenn Pflanzen durch Mikroben, oder chemisch, zum Beispiel durch Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen verwundet oder attackiert werden, oder Lysozyme aus nicht-pflanzlichen Quellen, wie zum Beispiel T4-Lysozym oder Lysozym aus einer Vielzahl von Säugern, insektizide Proteine, wie Bacillus thuringiensis-Endotoxin, a-Amylaseinhibitor oder Proteaseinhibitoren (Kuhbohnen-Trypsininhibitor), Lektine, wie Weizenkeim-Agglutinin, RNAsen oder Ribozyme. Weitere Beispiele sind Nukleinsäuren, welche die Trichoderma harzianum chit42-Endochitinase (GenBank Eintr. Nr.: S78423) oder das N-hydroxylierende, multifunktionale Cytochrom P-450 (CYP79)-Protein aus Sorghum bicolor (GenBank Eintr. Nr.: U32624) oder funktionelle Äquivalente von diesen codieren. Die Akkumulation von Glucosinolaten als Schutz vor Schädlingen (Rask L et al. (2000) Plant Mol Biol 42:93–113; Menard R et al. (1999) Phytochemistry 52:29–35), die Expression von Bacillus thuringiensis-Endotoxinen (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33–37) oder der Schutz gegen Angriff durch Pilze durch Expression von Chitinasen, zum Beispiel aus Bohnen (Broglie et al. (1991) Science 254:1194–1197), ist vorteilhaft. Eine Resistenz gegen Schädlinge, wie zum Beispiel den Reis-Schädling Nilaparvata lugen in Reispflanzen, kann durch Exprimieren des Schneeglöckchen(Galanthus nivalis)-Lektins Agglutinin erzielt werden (Rao et al. (1998) Plant J 15(4):469–77). Die Expression von synthetischen cryIA(b)- und cryIA(c)-Genen, welche Lepidoptera-spezifische Bacillus thuringiensis-D-Endotoxine codieren,. kann eine Resistenz gegen Insektenschädlinge in diversen Pflanzen bewirken (Goyal RK et al. (2000) Crop Protection 19(5):307–312). Weitere Zielgene, welche zur Pathogenabwehr geeignet sind, umfassen ”Polygalacturonase-inhibierendes Protein” (PGIP), Thaumatin, Invertase und antimikrobielle Peptide, wie Lactoferrin (Lee TJ et al. (2002) J Amer Soc Horticult Sci 127(2):158–164). Andere Nukleinsäuresequenzen, welche in vorteilhafter Weise hierin verwendet werden können, schließen Eigenschaften zur Insektenbekämpfung ( U.S.-Pat. Nrn. 6 063 597 ; 6 063 756 ; 6 093 695 ; 5 942 664 ; und 6 110 464 ), Resistenz gegen Pilzerkrankung ( U.S.-Pat. Nrn.. 5 516 671 ; 5 773 696 ; 6 121 436 ; 6 316 407 ; und 6506962 ), Virusresistenz ( U.S.-Pat. Nrn.. 5 304 730 und 6 013 864 ), Nematodenresistenz ( U.S.-Pat. Nr. 6 228 992 ) und Bakterienerkrankungsresistenz ( U.S.-Pat. Nr. 5 516 671 ) ein.
  • 1.5 Mykotoxin-Verringerung/Eliminierung
  • Die Produktion von Mycotoxinen, einschließlich Aflatoxin und Fumonisin, durch Pilze, die mit Pflanzen vergesellschaftet sind, ist ein beträchtlicher Faktor, der Getreide nicht verwertbar macht. Diese Pilzorganismen verursachen keine Krankheitssymptome und/oder Störung des Wachstums der Pflanze, aber sie erzeugen Chemikalien (Mycotoxine), welche toxisch für Tiere sind. Die Inhibition des Wachstum dieser Pilze würde die Synthese dieser toxischen Substanzen verringern und, daher Kornverluste wegen Mycotoxin-Kontamination vermindern. Neue Gene können in Pflanzen eingebracht werden, welche die Synthese des Mycotoxins hemmen werden, ohne das Pilzwachstum zu stören. Die Expression eines neuen Gens, das ein Enzym codiert, das in der Lage ist, das Mykotoxin nicht-toxisch zu machen, wäre nützlich zur Erzielung einer reduzierten Mycotoxin-Kontamination von Körnern. Das Ergebnis von jedwedem der oben genannten Mechanismen wäre ein verringertes Vorhandensein von Mycotoxinen auf dem Korn.
  • 1.6 Kornzusammensetzung oder -Qualität
  • Gene können in Pflanzen, insbesondere kommerziell wichtige Getreidesorten, wie Mais, Weizen oder Reis, eingebracht werden, um das Korn zu verbessern, dessentwegen das Getreide hauptsächlich angebaut wird. Ein breites Spektrum von neuen transgenen Pflanzen, die auf diese Weise hergestellt werden, kann abhängig von der jeweiligen Endanwendung des Getreides in Erwägung gezogen werden.
  • Zum Beispiel ist die größte Anwendung von Mais-Getreide die Verwendung für Futter oder Lebensmittel. Die Einbringung von Genen, welche die Zusammensetzung des Korns. ändern, kann den Wert als Futter oder Lebensmittel erheblich steigern. Die Hauptkomponenten von Maisgetreide sind Stärke, Protein und Öl. Jede dieser Hauptkomponenten von Maisgetreide kann durch Ändern ihres Spiegels oder ihrer Zusammensetzung verbessert werden. Es können einige Beispiele zu Zwecken der Veranschaulichung erwähnt werden, aber sie stellen keineswegs eine erschöpfende Liste von Möglichkeiten dar.
  • Das Protein von vielen Getreidekörnern ist für Futter- und Speisezwecke, insbesondere bei Verfütterung an Schweine, Geflügel und Menschen suboptimal. Das Protein ist defizient hinsichtlich mehrerer Aminosäuren, welche in der Nahrung dieser Spezies essentiell sind, was den Zusatz von Ergänzungsmitteln zum Getreide notwendig macht. Limitierende essentielle Aminosäuren können Lysin, Methionin, Tryptophan, Threonin, Valin, Arginin und Histidin einschließen. Manche Aminosäuren werden erst limitierend, nachdem das Getreide mit anderen Eintragstoffen für Futterformulierungen ergänzt wird. Wenn zum Beispiel das Getreide mit Sojabohnen-Mehl zur Erfüllung der Lysin-Erfordernisse ergänzt wird, wird Methionin limitierend. Die Spiegel an diesen essentiellen Aminosäuren in Samen und Getreide können durch Mechanismen erhöht werden, welche, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Einbringung von Genen zum Erhöhen der Biosynthese der Aminosäuren, zum Verringern des Abbaus der Aminosäuren, zum Erhöhen der Speicherung der Aminosäuren in Proteinen oder zum Erhöhen des Transports der Aminosäuren zu den Samen oder zum Korn einschließen.
  • Ein Mechanismus zum Erhöhen der Biosynthese der Aminosäuren besteht darin, Gene einzubringen, welche die Aminosäure-Biosynthesewege deregulieren, so dass die Pflanze die Spiegel, die produziert werden, nicht länger adäquat steuern kann. Dies kann durch Deregulieren oder Umgehen von Schritten im Aminosäure-Biosyntheseweg erfolgen, welche normalerweise durch die Spiegel des Aminosäure-Endprodukts des Weges reguliert sind. Zu Beispielen zählen die Einbringung von, deregulierte Versionen der Enzyme Aspartokinase oder Dihydrodipicolinsäure(DHDP)-Synthase, zum Erhöhen der Lysin- und Threoninproduktion, und Anthranilatsynthase, zum Erhöhen der Tryptophanproduktion, codierenen Genen. Die Verminderung des Katabolismus der Aminosäuren kann durch Einbringung von DNA-Sequenzen bewirkt werden, welche die Expression von Genen reduzieren oder eliminieren, die Enzyme codieren, welche Schritte in den katabolischen Wegen katalysieren, wie etwa das Enzym Lysin-Ketoglutarat-Reduktase.
  • Die Proteinzusammensetzung des Korns kann verändert werden, um das Gleichgewicht von Aminosäuren auf zahlreichen Wegen zu verbessern, einschließlich Erhöhen der Expression von nativen Proteinen, Verringern der Expression von jenen mit schlechter Zusammensetzung, Ändern der Zusammensetzung von nativen Proteinen oder Einbringen von Genen, die vollständig neue Proteine codieren, welche eine höherwertige Zusammensetzung besitzen. Es kann DNA eingebracht werden, welche die Expression von Mitgliedern der Zein-Familie von Speicherproteinen verringert. Diese DNA kann Ribozyme oder Antisense-Sequenzen codieren, welche zielgelenkt sind, um die Expression von Zein-Proteinen oder die Expression von Regulatoren der Zein-Expression, wie dem opaque-2-Genprodukt, zu stören. Die Proteinzusammensetzung des Korns kann durch das Phänomenon der Cosuppression modifiziert werden, d. h. Inhibition der Expression eines endogenen Gens vermittels der Expression eines identischen Strukturgens oder Genfragments, das durch Transformation eingebracht wurde (Goring 1991). Darüber hinaus kann die eingebrachte DNA Enzyme codieren, welche Zeine abbauen. Die Verminderungen der Zein-Expression, welche erzielt werden, können von Erhöhungen bei Proteinen mit erwünschterer Aminosäurezusammensetzung oder von Erhöhungen bei anderen wichtigen Samenbestandteilen, wie Stärke, begleitet werden. Alternativ dazu kann ein chimäres Gen eingebracht werden, das eine codierende Sequenz für ein natives Protein von adäquater Aminosäurezusammensetzung, wie für eines der Globulin-Proteine oder 10-kD-Zein von Mais, und einen Promotor oder eine sonstige regulatorische Sequenz, die zum Anheben der Expression des Proteins entworfen ist, umfasst. Die codierende Sequenz des Gens kann Zusatz- oder Austauschcodons für essentielle Aminosäuren einschließen. Ferner kann eine aus einer anderen Spezies erhaltene Codiersequenz oder eine teilweise oder vollständig synthetische Sequenz, die eine vollständig einzigartige Peptidsequenz codiert, die zur Verbesserung der Aminosäurezusammensetzung des Samens entworfen ist, verwendet werden.
  • Die Einbringung von Genen, welche den Ölgehalt des Korns verändern, kann von Nutzen sein. Zuwächse des Ölgehalts können zu Erhöhungen im metabolisierbaren Energiegehalt und in der Dichte der Samen für Anwendungen in Futter und Lebensmitteln führen. Die eingebrachten Gene können Enzyme codieren, welche Geschwindigkeitsbeschränkungen oder regulierte Schritte in der Fettsäure- oder Lipidbiosynthese beseitigen oder verringern. Zu solchen Genen können, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, diejenigen zählen, welche Acetyl-CoA-Carboxylase, ACP-Acyltransferase, beta-Ketoacyl-ACP-Synthase sowie andere allgemein bekannte Fettsäure-biosynthetische Aktivitäten codieren. Andere Möglichkeiten sind Gene, welche Proteine codieren, die keine enzymatische Aktivität besitzen, wie etwa Acyl-Carrierprotein. Weitere Beispiele schließen 2-Acetyltransferase, Oleosinpyruvatdehydrogenase-Komplex, Acetyl-CoA-Synthetase, ATP-Citratlyase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase und Gene der Carnitin-CoA-acetyl-CoA-Shuttles ein. Es wird vorhergesagt, dass die Expression von mit der Ölbiosynthese verbundenen Genen unter Verwendung einer Plastidentransitpeptid-Sequenz auf die Plastide zielgelenkt wird, und vorzugsweise im Samenembryo exprimiert wird. Gene können eingebracht werden, welche das Gleichgewicht der in dem Öl vorhandenen Fettsäuren ändern, um ein gesünderes oder nahrhafteres Futtermittel bereitzustellen. Die eingebrachte DNA kann auch Sequenzen codieren, welche die Expression von Enzymen blockieren, die in der Fettsäurebiosynthese involviert sind, wodurch die Anteile von im Korn vorhandenen Fettsäuren verändert werden, wie unten beschrieben. Es können Gene eingebracht werden, die den Nährwert der Stärkekomponente des Korns steigern, zum Beispiel durch Erhöhen des Verzweigungsgrads, was zu verbesserter Verwertung der Stärke in Kühen durch Verzögern ihres Stoffwechsels führt.
  • Neben dem Beeinflußen der Hauptbestandteile des Korns, können Gene eingebracht werden, welche eine Vielzahl von anderen Nährstoff-, Verarbeitungs- oder sonstigen Qualitätsaspekten des Korns, wie es für Futter und Lebensmittel verwendet wird, beeinflußen. Zum Beispiel kann die Pigmentierung des Korns erhöht oder verringert werden. Die Verstärkung und Stabilität von gelber Pigmentierung ist in manchen Tierfuttern wünschenswert, und kann durch Einbringung von Genen erzielt werden, welche eine gesteigerte Produktion von Xanthophyllen und Karolinen durch Eliminieren von Geschwindigkeits-limitierenden Schritten in deren Produktion zur Folge haben. Solche Gene können veränderte Formen der Enzyme Phytoen-Synthase, Phytoen-Desaturase oder Lycopin-Synthase codieren. Alternativ dazu ist unpigmentierter weißer Mais für die Produktion vieler Lebensmittelprodukte erwünscht und kann durch die Einbringung von DNA hergestellt werden, welche Schritte in den Pigmentproduktionswegen blockiert oder eliminiert.
  • Futter- oder Lebensmittel, die gewisse Getreidekörner umfassen, besitzen ungenügende Mengen an Vitaminen und müssen ergänzt werden, um einen adäquaten Nährwert bereitzustellen. Die Einbringung von Genen, welche die Vitaminbiosynthese in Samen steigern, kann in Betracht gezogen werden, einschließlich zum Beispiel Vitamine A, E, B12, Cholin und dergleichen. Zum Beispiel besitzt auch Maisgetreide keinen ausreichenden Mineraliengehalt für einen optimalen Nährwert. Gene, welche die Akkumulation oder Verfügbarkeit von Verbindungen beeinflußen, welche unter anderem Phosphor, Schwefel, Calcium, Mangan, Zink und Eisen enthalten, wären von Nutzen. Ein Beispiel kann die Einbringung eines Gens sein, das die Phytinsäure-Produktion verringern oder das Enzym Phytase, das den Phytinsäure-Abbau steigert, codieren würde. Diese Gene erhöhen die Spiegel an verfügbarem Phosphat in der Nahrung, was die Notwendigkeit für eine Ergänzung mit mineralischem Phosphat verringert.
  • Zahlreiche andere Beispiele zur Verbesserung von Getreiden für Futter- und Lebensmittel-Zwecke könnten beschrieben werden. Die Verbesserungen müssen nicht einmal notwendigerweise das Korn betreffen, sondern können zum Beispiel den Nutzen des Korns für Silage bzw. Silo-Lagerung verbessern. Die Einbringung von DNA, um dies zu bewirken, könnte Sequenzen einschließen, welche die Ligninproduktion verändern, wie etwa diejenigen, welche zum ”brown midrib”-Phänotyp führen, der mit einem höherwertigen Futterwert für Rinder assoziiert ist.
  • Zusätzlich zu direkten Verbesserungen im Futter- oder Lebensmittel-Wert, können auch Gene eingebracht werden, welche die Verarbeitung des Korns verbessern und den Nutzwert der aus der Verarbeitung gewonnenen Produkte verbessern. Das primäre Verfahren der Verarbeitung von gewissen Getreiden, wie Mais, erfolgt durch Nassmahlen. Mais kann dank der Expression neuer Gene, welche die Effizienz der Verarbeitung erhöhen und ihre Kosten senken, wie etwa durch Verringern der Einweichdauer, verbessert werden.
  • Das Verbessern des Werts von Nassmahl-Produkten kann das Verändern der Quantität oder Qualitität von Stärke, Öl, Mais-Glutenmehl oder der Komponenten von Mais-Glutenfutter einschließen. Den Anstieg an Stärke kann man durch die Identifizierung und Eliminierung von Geschwindigkeits-limitierenden Schritten in der Stärkebiosynthese oder durch Senken der Spiegel der anderen Komponenten des Korns erzielen, was zu proportionalen Zuwächsen bei Stärke führt. Ein Beispiel für Ersteres kann die Einbringung von ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Enzyme codierenden Genen mit veränderter regulatorischer Aktivität sein, oder die bei einem höhern Spiegel exprimiert werden. Beispiele für Letzteres können selektive Inhibitoren von zum Beispiel Protein- oder Ölbiosynthese einschließen, welche während späterer Stadien der Kornentwicklung exprimiert werden.
  • Die Eigenschaften von Stärke können vorteilhaft verändert werden durch Ändern des Verhältnisses von Amylose zu Amylopectin, der Größe der Stärkemoleküle, oder ihres Verzweigungsmusters. Durch diese Änderungen kann ein breites Spektrum an Eigenschaften modifiziert werden, welche, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Änderungen in der Gelbildungs-Temperatur, der Wärme der Gelatinisierung, der Klarheit von Filmen und Pasten, der rheologischen Eigenschaften und dergleichen einschließen. Zur Bewirkung dieser Veränderungen der Eigenschaften können Gene, welche Granalien-gebundene oder lösliche Stärkesynthase-Aktivität oder Verzweigungsenzym-Aktivität codieren, allein oder in Kombination eingebracht werden. DNA, wie etwa Antisense-Konstrukte, können auch verwendet werden, um die Spiegel der endogenen Aktivität dieser Enzyme zu verringern. Die eingebrachten Gene oder Konstrukte können regulatorische Sequenzen besitzen, welche deren Expression zeitlich auf spezifische Intervalle in der Stärkebiosynthese und Stärkegranalien-Entwicklung regeln. Darüber hinaus kann es ratsam sein, Gene einzubringen und zu exprimieren, welche zur In-vivo-Derivatisierung, oder sonstigen Modifikation, der Glucose-Einheiten des Stärkemoleküls führen. Die kovalente Anheftung von jedwedem Molekül kann in Betracht gezogen werden, was nur von der Existenz von Enzymen, welche die Derivatisierungen katalysieren, und der Zugänglichkeit von passenden Substraten in der Stärkegranalie eingeschränkt wird. Beispiele für wichtige Derivatisierungen können die Addition von funktionellen Gruppen, wie Aminen, Carboxylen oder Phosphatgruppen, welche Stellen für anschließende In-vitro-Derivatisierungen vorsehen oder Stärke-Eigenschaften durch die Einbringung von ionischen Ladungen beeinflußen, einschließen. Beispiele für andere Modifikationen können direkte Veränderungen der Glucose-Einheiten, wie Verlust von Hydroxylgruppen oder deren Oxidation zu Aldehyd- oder Carboxylgruppen, einschließen.
  • Öl ist ein weiteres Produkt aus dem Nassmahlen von Mais und anderen Getreiden, dessen Wert durch Einbringung und Expression von Genen verbessert werden kann. Die Menge an Öl, welche durch Nassmahlen extrahiert werden kann, kann durch Vorgehensweisen erhöht werden, wie für Futter- und Lebensmittel oben beschrieben. Öl-Eigenschaften können auch zum Verbessern von dessen Verhalten in der Herstellung und Anwendung von Speiseöl, Bratöl, Gleitmitteln oder sonstigen Öl-abgeleiteten Produkten, oder zum Verbessern von dessen Gesundheitsmerkmalen bei der Verwendung in den Speise-bezogenen Anwendungen, verändert werden. Auch können neue Fettsäuren synthetisiert werden, welche nach Extraktion als Ausgangsmaterialien für chemische Synthesen dienen können. Die Veränderungen der Öl-Eigenschaften können durch Verändern des Typs, Spiegels oder der Lipid-Anordnung der im Öl vorhandenen Fettsäuren erzielt werden. Dies kann seinerseits durch die Zugabe von Genen, welche Enzyme codieren, welche die Synthese neuer Fettsäuren und der Lipide, welche diese besitzen, ”katalysieren, oder durch Erhöhen der Spiegel an nativen Fettsäuren unter möglicher Verringerung der Spiegel an Vorläufern, bewirkt werden. Alternativ dazu können DNA-Sequenzen eingebracht werden, welche Schritte in der Fettsäurebiosynthese verlangsamen oder blockieren, was zum Anstieg von Vorläufer-Fettsäureintermediaten führt. Gene, welche zugegeben werden könnten, schließen Desaturasen, Epoxidasen, Hydratasen, Dehydratasen und andere Enzyme ein, welche Reaktionen katalysieren, die Fettsäureintermediate betreffen. Zu repräsentativen Beispielen für katalytische Schritte, die blockiert werden könnten, zählen die Desaturationen von Stearin- zu Ölsäure und von Öl- zu Linolensäure, welche zu den jeweiligen Akkumulationen von Stearin- und Ölsäuren führen.
  • Verbesserungen in den sonstigen wichtigen Getreide-Nassmahlprodukten, Glutenmehl und Glutenfutter können ebenfalls durch die Einbringung von Genen erzielt werden, um neue Pflanzen zu erhalten. Repräsentative Möglichkeiten schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, jene ein, die oben für die Verbesserung des Lebensmittel- und Futterwertes beschrieben sind.
  • Darüber hinaus kann es ferner in Betracht gezogen werden, dass die Pflanze für die Herstellung oder Produktion von nützlichen biologischen Verbindungen verwendet wird, welche zuvor in der Pflanze entweder überhaupt nicht produziert wurden oder nicht auf gleichem Spiegel produziert wurden. Die neuen Pflanzen, die diese Verbindungen produzieren, werden durch die Einbringung und Expression von Genen durch Transformationsmethoden möglich gemacht. Die Möglichkeiten schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, eine beliebige biologische Verbindung, welche derzeit durch einen beliebigen Organismus produziert wird, wie Proteine, Nukleinsäuren, primäre und intermediäre Metabolite, Kohlenhydratpolymere, etc. ein. Die Verbindungen können durch die Pflanze produziert, nach der Ernte extrahiert und/oder verarbeitet werden, und für jedweden derzeit anerkannten nützlichen Zweck verwendet werden, wie etwa Pharmazeutika, Duftstoffe, industrielle Enzyme, um einige wenige zu nennen.
  • Zu weiteren Möglichkeiten zum Veranschaulichen des Spektrums an Korn-Merkmalen oder -Eigenschaften, die potentiell von den eingebrachten Genen in transgenen Pflanzen codiert werden, zählen Korn mit geringerer Anfälligkeit für Zerbrechen zu Exportzwecken oder mit größerer Schrotgröße bei Verarbeitung durch Nassmahlen dank der Einbringung von Genen, welche die gamma-Zein-Synthese steigern, Popcorn mit verbessertem/r Aufplatzen, Qualität und Ausdehnvolumen dank Genen, welche die Pericarp-Dicke erhöhen, Mais mit weißerem Korn für Lebensmittelanwendungen dank der Einbringung von Genen, welche effektiv die Expression von Enzymen blockieren, die an Pigmenterzeugungswegen involviert sind, und verbesserte Qualität von alkoholischen Getränken oder Süßmais dank der Einbringung von Genen, welche den Geschmack beeinflußen, wie etwa das ”shrunken”-Gen (codierend für Saccharose-Synthase) für Süßmais.
  • 1.7 Zusammensetzung oder Qualität von Knolle oder Samen
  • Diverse Merkmale können, insbesondere in Samen oder Knollen, vorteilhafterweise exprimiert werden, damit die Zusammensetzung oder die Qualität verbessert werden. Nützliche Nukleinsäuresequenzen, welche mit der Promotor-Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung kombiniert werden können, und verbesserte Eigenschaften des Endprodukts vorsehen, schließen, ohne Einschränkung, jene ein, die Samenspeicherproteine, Fettsäureweg-Enzyme, Tocopherol-Biosynthese-Enzyme, Aminosäurebiosynthese-Enzyme, und Stärke-Verweigungsenzyme codieren. Eine Diskussion von beispielhaften heterologen DNAs, die für die Modifizierung von Pflanzenphänotypen brauchbar sind, kann zum Beipsiel in den U.S.-Pat. Nrn. 6 194 636 ; 6 207 879 ; 6 232 526 ; 6 426 446 ; 6 429 357 ; 6 433 252 ; 6 437 217 ; 6 515 201 ; und 6 583 338 und der PCT-Veröffentlichung WO 02/057471 gefunden werden, wobei jede davon spezifisch hierin durch den Bezug darauf in ihrer Gesamtheit einbezogen ist. Solche Merkmale schließen folgende ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt:
    • – Expression von Stoffwechsel-Enzymen zur Verwendung im Nahrungsmittel- und-Futter-Sektor, zum Beispiel von Phytasen und Cellulasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, wie die künstliche cDNA, welche eine mikrobielle Phytase (GenBank Eintr.-Nr.: A19451) oder funktionelle Äquivalente davon codiert.
    • – Expression von Genen, welche eine Akkumulation von Feinchemikalien, wie Tocopherolen, Tocotrienolen oder Karotinoiden, hervorrufen. Ein Beispiel, welches erwähnt werden kann, ist Phytoen-Desaturase. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, welche die Narcissus pseudonarcissus Photoen-Desaturase (GenBank Zugangs-Nr.: X78815) codieren, oder funktionelle Äquivalente davon. Bevorzugte Tocopherol-biosynthetische Enzyme schließen tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGPPS, HPPD, GMT, MT1, tMT2, AANT1, slr 1737, und ein Antisense-Konstrukt für Homogentisinsäure-Dioxygenase ein (Kridl et al., Seed Sci. Res., 1:209:219 (1991); Keegstra, Cell, 56(2):247–53 (1989); Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12760–12764 (1994); Xia et al., J. Gen. Microbiol., 138:1309–1316 (1992); Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (5):2105–2110 (1998); Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):9879–9884 (1998); Norris et al., Plant Physiol., 117:1317–1323 (1998); Bartley und Scolnik, Plant Physiol., 104:1469–1470 (1994); Smith et al., Plant J., 11:83–92 (1997); WO 00/32757 ; WO 00/10380 ; Saint Guily et al., Plant Physiol., 100(2):1069–1071 (1992); Sato et al., J. DNA Res., 7(1):31–63 (2000)) wobei alle davon hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
    • – Stärkeproduktion ( U.S.-Pat. Nrn. 5 750 876 und 6 476 295 ), hohe Proteinproduktion ( U.S.-Pat. Nr. 6 380 466 ), Fruchtreifung ( U.S.-Pat. Nr. 5 512 466 ), gesteigerter Nährwert für Tiere und Mensch ( U.S.-Pat. Nrn. 5 985 605 und 6 171 640 ), Biopolymere ( U.S.-Pat. Nr. 5 958 745 und U.S.-Patentveröffentlichungs-Nr. 2003/0028917 ), Resistenz gegen Umweltstress ( U.S.-Pat. Nr. 6 072 103 ), pharmazeutische Peptide ( U.S.-Pat. Nr. 6 080 560 ), verbesserte Prozessiermerkmale ( U.S.-Pat. Nr. 6476295 ), verbesserte Verdaubarkeit ( U.S.-Pat. Nr. 6 531 648 ), geringe Raffinose ( U.S.-Pat. Nr. 6 166 292 ), Produktion von industriellem Enzym ( U.S.-Pat. Nr. 5 543 576 ), verbesserter Geschmack ( U.S.-Pat. Nr. 6 011 199 ), Stickstofffixierung ( U.S.-Pat. Nr. 5 229 114 ), Hybridsamen-Produktion ( U.S.-Pat. Nr. 5 689 041 ) und Biotreibstoff-Produktion ( U.S.-Pat. Nr.. 5 998 700 ), wobei die genetischen Elemente und Transgene, die in den oben aufgelisteten Patenten beschrieben sind, hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind. Bevorzugte Stärkeverzweigungsenzyme (zur Modifizierung von Stärkeeigenschaften) schließen jede ein, die in den U.S.-Pat. Nrn.. 6 232 122 und 6 147 279 ; und der PCT-Veröffentlichung WO 97/22703 beschrieben sind, wobei alle davon hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
    • – Produktion von modifizierten Ölen ( U.S.-Pat. Nr. 6 444 876 ), hohe Ölproduktion ( U.S.-Pat. Nrn. 5 608 149 und 6 476 295 ) oder modifizierter Fettsäuregehalt ( U.S.-Pat. Nr. 6 537 750 ). Bevorzugte Fettsäure-Stoffwechselweg-Enzyme schließen Thioesterasen ( U.S.-Pat. Nrn. 5 512,482 ; 5 530,186 ; 5 945 585 ; 5 639,790 ; 5 807,893 ; 5 955 650 ; 5 955 329 ; 5 759,829 ; 5 147,792 ; 5 304,481 ; 5 298,421 ; 5 344,771 ; und 5 760,206 ), Diacylglycerol-Acyltransferasen ( U.S.-Patentveröffentlichungen 20030115632A1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 90030028923A1 ) und Desaturasen ( U.S.-Pat. Nrn. 5 689 050 ; 5 663 068 ; 5 614 393 ; 5 856 157 ; 6 117 677 ; 6 043 411 ; 6 194 167 ; 5 705 391 ; 5 663 068 ; 5 552 306 ; 6 075 183 ; 6 051 754 ; 5 689 050 ; 5 789 220 ; 5 057 419 ; 5 654 402 ; 5 659 645 ; 6 100 091 ; 5 760 206 ; 6 172 106 ; 5 952 544 ; 5 866 789 ; 5 443 974 ; und 5 093 249 ) ein, wobei alle davon hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
    • – Bevorzugte Aminosäurebiosynthese-Enzyme schließen Anthranilat-Synthase (Nr. 5 965 727 und PCT-Veröffentlichung WO 97/26366 , WO 99/11800 , WO 99/49058 ), Tryptophan-Decarboxylase (PCT-Veröffentlichung WO 99/06581 ), Threonin-Decarboxylase ( U.S.-Pat. Nrn.. 5 534 421 und 5 942 660 ; PCT-Veröffentlichung WO 95/19442 ), Threonin-Deaminase (PCT-Veröffentlichung WO 99/02656 und WO 98/55601 ), Dihydrodipicolinsäure-Synthase ( U.S.-Pat. Nr. 5 258 300 ) und Aspartatkinase ( U.S.-Pat. Nrn. 5 367 110 ; 5 858 749 ; und 6 040 160 ) ein, wobei alle davon hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
    • – Produktion von Nutraceuticals, wie zum Beispiel mehrfach ungesättigten Fettsäuren (zum Beispiel Arachidonsäure, Eicosapentaensäure oder Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder -desaturasen, oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nährwert, wie zum Beispiel mit einem hohen Gehalt an essentiellen Aminosäuren (zum Beispiel das Hochmethionin-2S-Albumin-Gen der Paranuss). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, welche das Bertholletia excelsa Hochmethionin-2S-Albumin (GenBank Eintr.-Nr.: AB044391), die Physcomitrella patens-Delta-6-Acyl-Lipiddesaturase (GenBank Eintr.-Nr.: AJ222980; Girke et al. (1998) Plant J 15:39–48), die Mortierella alpina-Delta-6-Desaturase (Sakuradani et al. 1999 Gen 238:445–453), die Caenorhabditis elegans-Delta-5-Desaturase (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439:215–218), die Caenorhabditis elegans Delta-5-Fettsäuredesaturase (des-5) (GenBank Eintr.-Nr.: AF078796), die Mortierella alpina-Delta-5-Desaturase (Michaelson et al. JBC 273:19055–19059), die Caenorhabditis elegans Delta-6-Elongase (Beaudoin et al. 2000, PNAS 97:6421–6426), die Physcomitrella patens Delta-6-Elongase (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions 28:654–657) oder funktionelle Äquivalente von diesen codieren.
    • – Produktion von Hochqualitäts-Proteinen und -Enzymen für industrielle Zwecke (zum Beispiel Enzyme, wie Lipasen) oder als Pharmazeutika (wie zum Beispiel Antikörper, Blutgerinnungsfaktoren, Interferon, Lymphokine, Koloniestimulationsfaktor, Plasminogenaktivatoren, Hormone oder Impfstoffe, wie durch Hood EE, Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10(4): 382–6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236:275–92, beschrieben). Zum Beispiel ist es möglich gewesen, in großem Maßstab rekombinantes Avidin aus Hühnereiweiß sowie bakterielle beta-Glucuronidase (GUS) in transgenen Maispflanzen herzustellen (Hood et al. (1999) Adv Exp Med Biol 464:127–47, Übersichtsartikel).
    • – Erzielen eines erhöhten Speichervermögens in Zellen, welche normalerweise weniger Speicherproteine oder Speicherlipide umfassen, mit der Absicht, den Ertrag an diesen Substanzen zu steigern, zum Beispiel durch Expression von Acetyl-CoA-Carboxylase. Bevorzugte Nukleinsäuren sind jene, welche die Medicago sativa-Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase) (GenBank Eintr.-Nr.: 125042) oder funktionelle Äquivalente davon codieren. Alterenativ dazu könnte in gewissen Szenarios ein erhöhter Speicherproteingehalt für die Produktion von Erzeugnissen mit hohem Proteingehalt vorteilhaft sein. Bevorzugte Samen-Speicherproteine schließen Zeine ( U.S.-Pat. Nrn. 4 886 878 ; 4 885 357 ; 5 215 912 ; 5 589 616 ; 5 508 468 ; 5 939 599 ; 5 633 436 ; und 5 990 384 ; PCT-Veröffentlichung WO 90/01869 , WO 91/13993 , WO 92/14822 , WO 93/08682 , WO 94/20628 , WO 97/28247 , WO 98/26064 und WO 99/40209 ), 7S-Proteine ( U.S.-Pat. Nrn. 5 003 045 und 5 576 203 ), Paranuss-Protein ( U.S.-Pat. Nr. 5 850 024 ), Phenylalanin-freie Protein (PCT-Veröffentlichung WO 96/17064 ), Albumin (PCT-Veröffentlichung WO 97/35023 ), b-Conglycinin (PCT-Veröffentlichung WO 00/19839 ), 11S ( U.S.-Pat. Nr. 6 107 051 ), alpha-Hordothionin ( U.S.-Pat. Nrn. 5 885 802 und 5 88 5801 ), Arcelin-Samenspeicherproteine ( U.S.-Pat. Nr. 5 270 200 ), Lektine ( U.S.-Pat. Nr. 6 110 891 ) und Glutenin ( U.S.-Pat. Nrn. 5 990 389 und 5 914 450 ) ein, wobei alle davon hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
    • – Verringerung der Spiegel von alpha-Glucan-L-Typ-Knollen-Phosphorylase(GLTP)- oder alpha-Glucan-H-Typ-Knollen-Phosphorylase(GHTP)-Enzymaktivität vorzugsweise innerhalb der Kartoffelknolle (siehe US 5 998 701 ). Die Umwandlung von Stärken in Zucker in Kartoffelknollen, insbesondere während einer Lagerung bei Temperaturen unter 7°C, ist in Knollen vermindert, welche verringerte GLTP- oder GHTP-Enzymaktivität aufzeigen. Die Verringerung der Kälteversüßung bei Kartoffeln gestattet eine Kartoffellagerung bei kühleren Temperaturen, was zu längerer Ruhephase, verringertem Krankheitsauftreten und erhöhter Haltbarkeit führt. Eine Verringerung der GLTP- oder GHTP-Aktivität innerhalb der Kartoffelknolle kann durch solche Techniken, wie Unterdrückung von Genexpression unter Verwendung von homologer Antisense- oder doppelsträngiger RNA, Anwendung von Cosuppression, regulatorische Silencing-Sequenzen, bewirkt werden. Eine Kartoffelpflanze mit verbesserten Kälte-Speichercharakteristika umfasst eine Kartoffelpflanze, die mit einer Expressionskassette transformiert ist, bei der eine TPT-Promotorsequenz funktionsfähig an eine DNA-Sequenz verknüpft ist, die mindestens 20 Nukleotide von einem Gen umfasst, das eine alpha-Glucanphosphorylase, gewählt aus der aus alpha-Glucan-L-Typ-Knollen-Phosphorylase (GLTP) und alpha-Glucan-H-Typ-Phosphorylase (GHTP) bestehenden Gruppe, codiert.
  • Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel in Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seiten 487–96, erwähnt.
  • 1.8 Landwirtschaftliche Pflanzen-Charakteristika
  • Zwei von den Faktoren, die bestimmen, wo Pflanzen angebaut werden können, sind die mittlere Tagestemperatur während der Wachstumssaison und die Zeitlänge zwischen Frostvorkommnissen. Innerhalb der Areale, in denen der Anbau einer bestimmten Pflanze möglich ist, bestehten variierende Einschränkungen hinsichtlich der maximalen Zeitdauer, die man ihr zugesteht, um zur Reife heranzuwachsen und geerntet zu werden. Die in einem bestimmten Areal anzubauende Pflanze wird hinsichtlich ihres Vermögens, innerhalb des erforderlichen Zeitraums bei maximal möglichem Ertrag heranzureifen und zu einem erntefähigen Feuchtigkeitsgehalt einzutrocknen, ausgewählt bzw. selektiert. Deshalb werden Pflanzen von variierenden Reifegraden für verschiedene Anbau-Örtlichkeiten entwickelt. Neben der Notwendigkeit einer ausreichenden Eintrocknung zur Ermöglichung der Ernte steht die Erwünschtheit, dass eine maximale Trocknung auf dem Felde stattfindet, um die für zusätzliches Trocknen nach der Ernte nötige Energiemenge zu minimieren. Außerdem steht, je leichter das Getreide eintrocknen kann, umso mehr Zeit für das Wachstum und die Kornfüllung zur Verfügung. Gene, welche Reife und/oder Eintrocknung beeinflußen, können identifiziert und mit Hilfe von Transformationstechniken in Pflanzenlinien eingebracht werden, um neue Varietäten zu erzeugen, die an abweichende Anbau-Örtlichkeiten oder dieselbe Anbau-Örtlichkeit angepasst sind, jedoch dabei ein verbessertes Ertrag-zu-Feuchtigkeit-Verhältnis bei der Ernte aufweisen. Die Expression von Genen, welche an der Regulierung der Pflanzenentwicklung beteiligt sind, kann besonders nützlich sein, z. B. die ”liguleless”- und ”rough sheath”-Gene, welche in Pflanzen identifiziert worden sind.
  • Es können Gene in Pflanzen eingebracht werden, welche die Standfähigkeit und andere Pflanzenwachstumscharakteristika verbessern werden. Zum Beispiel wäre die Expression von neuen Genen, welche stärkere Stengel, verbesserte Wurzelsysteme vermitteln oder Kolben/Ähren-Abwurf verhindern oder verringern, von großem Nutzen für Maisanbau-Unternehmer. Die Einbringung und Expression von Genen, welche die Gesamtmenge an Photoassimilat erhöhen, erhältlich zum Beispiel durch Steigern des Lichtverteilens und/oder -einfangens, wäre vorteilhaft. Darüber hinaus würde die Expression von Genen, welche die Effizienz der Photosynthese und/oder der Laubkrone erhöhen, Produktivitätssteigerungen weiter erhöhen. Derartige Vorgehensweisen würden erhöhte Pflanzenpopulationen auf dem Feld gestatten.
  • Eine Verzögerung der vegetativen Seneszenz der Spätsaison würde den Fluss von Assimilaten in das Korn vermehren und somit den Ertrag erhöhen. Die Überexpression von Genen innerhalb von Pflanzen, welche mit ”Grünbleiben” assoziiert sind, oder die Expression von jedwedem Gen, das die Seneszenz verzögert, wäre vorteilhaft. Zum Beispiel ist eine nicht-vergilbende Mutante in Festuca pratensis identifiziert worden (Davies 1990). Die Expression dieses Gens, wie auch von Anderen, kann den verfrühten Abbau von Chlorophyll verhindern und somit die Laubkronen-Funktion aufrecht erhalten.
  • 1.9 Nährstoffverwertung
  • Die Befähigung, verfügbare Nährstoffe und Mineralien zu verwerten, kann ein limitierender Faktor beim Wachstum vieler Pflanzen sein. Es wird vorgeschlagen, dass es möglich wäre, die Nährstoffaufnahme, die zu tolerierenden pH-Extreme, die Mobilisation seitens der Pflanze, die Speichervorräte und die Verfügbarkeit für Stoffwechselaktivitäten, durch die Einbringung von neuen Genen zu verändern. Diese Modifikationen würden es einer Pflanze erlauben, die zur Verfügung stehenden Nährstoffe effizienter zu verwerten. Es wird in Betracht gezogen, dass eine Erhöhung der Aktivität von zum Beispiel einem Enzym, das normalerweise in der Pflanze vorhanden und an der Nährstoffverwertung beteiligt ist, die Verfügbarkeit eines Nährstoffs erhöhen wird. Ein Beispiel eines solchen Enzyms wäre Phytase. Es wird auch in Betracht gezogen, dass die Expression eines neuen Gens eine Nährstoffquelle verfügbar machen kann, welche zuvor nicht zugänglich war, z. B. ein Enzym, das eine Komponente mit Nährwert aus einem komplexeren Molekül, eventuell einem Makromolekül, freisetzt.
  • 1.10 Männliche Sterilität
  • Männliche Sterilität ist nützlich bei der Herstellung von Hybridsaatgut. Es wird vorgeschlagen, dass männliche Sterilität durch Expression von neuen Genen herbeigeführt werden kann. Zum Beispiel, ist es gezeigt worden, dass die Expression von Genen, welche Proteine codieren, die die Entwicklung des männlichen Blütenteils und/oder Gametophyts stören, zu männlicher Sterilität führen. Chimäre Ribonuklease-Gene, welche eine Expression in den Antheren von transgenem Tabak und Ölsamenraps aufweisen, führen bewiesenermaßen zu männlicher Sterilität (Mariani 1990). Zum Beispiel wurde in Mais eine Anzahl von Mutationen gefunden, welche eine zytoplasmatische männliche Sterilität herbeiführen. Eine Mutation im Besonderen, bezeichnet als T-Cytoplasma, korreliert auch mit Anfälligkeit gegen die Blattfleckenkrankheit ”Southern corn leaf blight”. Eine DNA-Sequenz, genannt TURF-13 (Levings 1990), wurde identifiziert, welche mit T-Cytoplasma korreliert. Es wäre durch die Einbringung von TURF-13 mittels Transformation möglich, männliche Sterilität von Krankheitsanfälligkeit zu trennen. Da es erforderlich ist, in der Lage zu sein, männliche Fertilität für Züchtungszwecke und für die Kornproduktion wiederherzustellen, wird vorgeschlagen, dass für die Wiederherstellung von männlicher Fertilität codierende Gene ebenfalls eingebracht werden können.
  • 1.11, Nicht-Protein-Exprimierende Sequenzen
  • 1.11.1 RNA-Exprimierend
  • Man kann DNA in Pflanzen zum Zwecke des Exprimierens von RNA-Transkripten einbringen, welche zur Einflußnahme auf den pflanzlichen Phänotyp fungieren, jedoch nicht in ein Protein translatiert werden. Zwei Beispiele sind Antisense-RNA und RNA mit Ribozymaktivität. Beide können mögliche Funktionen zur Verringerung oder Aufhebung der Expression von nativen oder eingebrachten Pflanzengenen erfüllen.
  • Es können Gene konstruiert oder isoliert werden, die, wenn sie transkribiert werden, Antisense-RNA oder doppelsträngige RNA produzieren, welche komplementär zur Gesamtheit oder Teilen) einer angezielten Botschafter-RNA(s) sind. Die Antisense-RNA verringert die Herstellung des Polypeptidprodukts der Botschafter-RNA. Das Polypeptidprodukt kann ein beliebiges vom Pflanzengenom codiertes Protein sein. Die zuvor genannten Gene werden als Antisense-Gene bezeichnet. Ein Antisense-Gen kann somit in eine Pflanze durch Transformationsmethoden eingebracht werden, um eine neue transgene Pflanze mit verringerter Expression eines gewählten Proteins von Interesse zu erzeugen. Zum Beispiel kann das Protein ein Enzym sein, das eine Reaktion in der Pflanze katalysiert. Die Reduktion der Enzymaktivität kann Produkte der Reaktion vermindern oder eliminieren, zu denen jedwede enzymatisch synthetisierten Verbindung in der Pflanze, wie Fettsäuren, Aminosäuren, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und dergleichen, zählen. Alternativ kann das Protein ein Speicherprotein, wie ein Zein, oder ein Strukturprotein sein, dessen verringerte Expression zu Änderungen bei der Samen-Aminosäurezusammensetzung bzw. zu morphologischen Änderungen der. Pflanze führen kann. Die oben genannten Möglichkeiten sind lediglich als Beispiele aufgeführt und repräsentieren nicht den vollen Umfang von Anwendungen.
  • Die Expression von Antisense-RNA oder doppelsträngiger RNA durch eine der Expressionskassetten der Erfindung ist besonders bevorzugt. Auch die Expression von Sense-RNA kann für Gensilencing angewandt werden (Cosuppression). Diese RNA ist vorzugsweise eine nicht-translatierbare RNA. Genregulation durch doppelsträngige RNA (”doppelsträngige RNA-Interferenz”; dsRNAi) ist im Stand der Technik allgemein bekannt und für diverse Organismen, einschließlich Pflanzen, beschrieben (z. B. Matzke 2000; Fire A et al. 1998; WO 99/32619 ; WO 99/53050 ; WO 00/68374 ; WO 00/44914 ; WO 00/44895 ; WO 00/49035 ; WO 00/63364 ).
  • Es können auch Gene konstruiert oder isoliert werden, welche, wenn sie transkribiert werden, RNA-Enzyme, oder Ribozyme, produzieren, welche als Endoribonukleasen wirken können, und die Spaltung von RNA-Molekülen mit ausgewählten Sequenzen katalysieren. Die Spaltung von ausgewählten Botschafter-RNAs kann die verringerte Herstellung von deren codierten Polypeptidprodukten zur Folge haben. Diese Gene können zum Herstellen neuer transgener Pflanzen, welche diese beinhalten, verwendet werden. Die transgenen Pflanzen können verringerte Spiegel an Polypeptiden besitzen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, der oben genannten Polypeptide, welche durch Antisense-RNA beeinflußt werden können.
  • Es ist auch möglich, dass Gene eingebracht werden können, um neue transgene Pflanzen zu erzeugen, welche eine verringerte Expression eines nativen Genprodukts vermittels einem Mechanismus der Cosuppression aufweisen. Es ist in Tabak, Tomate und Petunie gezeigt worden (Goring 1991; Smith 1990; Napoli 1990; van der Krol 1990), dass die Expression des Sense-Transkripts eines nativen Gens die Expression des nativen Gens in einer ähnlichen Weise zu derjenigen verringern oder eliminieren wird, die man für Antisense-Gene beobachtet. Das eingebrachte Gen kann die Gesamtheit oder einen Teil des angezielten nativen Proteins codieren, aber seine Translation muss für die Senkung der Spiegel an diesem nativen Protein nicht erforderlich sein.
  • 1.11.2 Nicht-RNA-Exprimierend
  • Zum Beispiel können DNA-Elemente, einschließlich jenen von transponierbaren Elementen, wie Ds, Ac oder Mu, in ein Gen inseriert werden und lösen Mutationen aus. Diese DNA-Elemente können inseriert werden, um ein Gen zu inaktivieren (oder zu aktivieren) und dadurch ein bestimmtes Merkmal zu ”taggen” bzw. ”etikettieren”. In diesem Fall verursacht das transponierbare Element keine Instabilität der getaggten Mutation, weil die Brauchbarkeit des Elements nicht von dessen Fähigkeit abhängt, sich im Genom zu bewegen. Sobald ein gewünschtes Merkmal getaggt ist, kann die eingebrachte DNA-Sequenz verwendet werden, um das entsprechende Gen, z. B. unter Verwendung der eingebrachten DNA-Sequenz als einem PCR-Primer zusammen mit PCR-Genklonierungstechniken, zu klonieren (Shapiro, 1983; Dellaporta 1988). Sobald identifiziert, kann/können die gesamten Gen(e) für das jeweilige Merkmal, einschließlich Kontroll- oder regulatorischen Regionen, falls gewünscht, isoliert, kloniert und nach Wunsch manipuliert werden. Die Brauchbarkeit von DNA-Elementen, die in einen Organismus zum Zwecke des Gen-Taggings eingebracht werden, ist unabhängig von der DNA-Sequenz und ist nicht von irgendeiner biologischen Aktivität der DNA-Sequenz, d. h., Transkription zu RNA oder Translation zu Protein, abhängig. Die einzige Funktion des DNA-Elements besteht darin, die DNA-Sequenz eines Gens zu disruptieren.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass man nicht-exprimierte DNA-Sequenzen, einschließlich. neuer synthetischer Sequenzen, in Zellen als eigentumsanzeigende bzw. proprietäre ”Labels” für diese Zellen und Pflanzen und Samen davon einbringen könnte. Es wäre für ein Label-DNA-Element nicht notwendig, die Funktion eines bezüglich des Wirtsorganismus endogenen Gens zu disruptieren, da es die einizge Funktion dieser DNA wäre, die Herkunft des Organismus anzuzeigen. Zum Beispiel könnte man eine einzigartige DNA-Sequenz in eine Pflanze einbringen, und dieses DNA-Element würde alle Zellen, Pflanzen und Nachkommen dieser Zellen als aus dieser gelabelten Quelle entstanden kennzeichnen. Es wird vorgeschlagen, dass die Einbindung von Label-DNAs es gestatten würde, firmeneigenes Keimplasma, oder aus diesem abgeleitetes Keimplasma, von ungelabeltem Keimplasma zu unterscheiden.
  • Ein weiteres mögliches Element, das eingebracht werden kann, ist ein Matrixanheftungsregion-Element (MAR), wie das Hühnerlysozym-A-Element (Stief 1989), das in der Nähe um ein exprimierbares Gen von Interesse herum positioniert werden kann, um eine Erhöhung der Gesamtexpression des Gens zu bewirken und positionsabhängige Effekte beim/nach Einbau in das Pflanzengenom zu verringern (Stief 1989; Phi-Van 1990).
  • Weitere Nukleotidsequenzen von Interesse, welche innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in funktionsfähiger Verknüpfung mit den erfindungsgemäßen Promotorsequenzen in Betracht gezogen werden können, sind isolierte Nukleinsäuremoleküle, z. B. DNA oder RNA, die eine erfindungsgemäße Pflanzennukleotidsequenz umfassen, die ein offenes Leseraster umfasst, welches präferentiell in einem spezifische Gewebe, d. h. Samen, Wurzel, Grüngewebe (Blatt und Stengel), Rispe oder Pollen, exprimiert wird oder konstitutiv exprimiert wird.
  • 2. Marker-Gene
  • Um das Vermögen zum Identifizieren von Transformanten zu verbessern, kann man wünschen, ein selektierbares oder screenbares Markergen als, oder zusätzlich zu, dem exprimerbaren Gen von Interesse zu verwenden. ”Markergene” sind Gene, welche einen distinkten Phänotyp an Zellen verleihen, die das Markergen exprimieren, und es daher erlauben, solche transformierte Zellen von Zellen zu unterscheiden, die den Marker nicht aufweisen. Solche Gene können entweder einen selektierbaren oder screenbaren Marker codieren, was davon abhängig ist, ob der Marker ein Merkmal verleiht, auf das man durch chemische Methoden, d. h. durch die Verwendung eines selektiven Agens (z. B. ein Herbizid, Antibiotikum oder dergleichen), ”selektieren” kann, oder ob es sich bei diesem einfach um ein Merkmal handelt, das man durch Beobachten oder Testen, d. h. durch 'Screening', identifizieren kann (z. B. das R-Locus-Merkmal, das Grün-Fluoreszierendes-Protein (GFP)). Selbstverständlich sind im Fachgebiet viele Beispiele für geeignete Markergene bekannt und können in der Praxis der Erfindung angewandt werden.
  • Innerhalb der Ausdrücke selektierbare oder screenbare Markergene sind auch Gene eingeschlossen, welche einen ”sezernierbaren Marker” codieren, dessen Sekretion als Mittel zum Identifizieren von, oder Selektieren auf, transformierte Zellen erfasst werden kann. Zu Beispielen zählen Marker, welche ein sezernierbares Antigen, das durch Antikörper-Wechselwirkung identifiziert werden kann, oder sogar sezernierbare Enzyme, die durch ihre katalytische Aktivität nachgewiesen werden können, codieren. Sezernierbare Proteine lassen sich in eine Anzahl von Klassen einteilen, einschließlich kleine, diffundierbare Proteine, die z. B. durch ELISA nachweisbar sind; kleine aktive Enzyme, die in extrazellulärer Lösung nachweisbar sind (z. B. alpha-Amylase, beta-Lactamase, Phosphinothricin-Acetyltransferase); und Proteine, die in der Zellwand inseriert oder eingefangen sind (z. B. Proteine, welche eine Leader-Sequenz(en) enthalten, wie jene, die man in der Expressionseinheit von Extensin oder Tabak-PR-S findet).
  • In Bezug auf selektierbare sezernierbare Marker erachtet man die Verwendung eines Gens als besonders vorteilhaft, welches ein Protein codiert, das in der Zellwand sequestriert wird, und wobei das Protein ein einzigartiges Epitop einschließt. Ein derartiger sezernierter Antigenmarker wird idealerweise eine Epitopsequenz, die einen geringen Hintergrund in Pflanzengewebe vorsieht, und eine Promotor-Leader-Sequenz, die eine effiziente Expression und Ziellenkung quer durch die Plasmamembran verleiht, verwenden und ein Protein ergeben, das in der Zellwand gebunden und dennoch für Antikörper zugänglich ist. Ein normal sezerniertes Wandprotein, das modifiziert wurde, um ein einzigartiges Epitop zu enthalten, würde allen diesen Anforderungen genügen.
  • Ein Beispiel eines für Modifikation in dieser Weise geeigneten Proteins ist Extensin oder Hydroxyprolin-reiches Glycoprotein (HPRG). Zum Beispiel ist das Mais-HPRG(Steifel 1990)-Molekül hinsichtlich Molekularbiologie, Expression und Proteinstruktur gut charakterisiert. Allerdings könnte ein beliebiges aus einer Vielzahl von Ultilane- und/oder Glycin-reichen-Wandproteinen (Keller 1989) durch die Addition einer antigenen Stelle modifiziert werden, um einen screenbaren Marker zu erzeugen.
  • Eine exemplarische Ausführungsform eines sezernierbaren screenbaren Markers betrifft die Verwendung einer Mais-Sequenz, die das Wandprotein HPRG codiert, das modifiziert ist, um ein 15-Reste-Epitop aus der Pro-Region von murinem Interleukin einzuschließen, wobei jedoch praktisch jedwedes nachweisbare Epitop in solchen Ausführungsformen verwendet werden kann, wie es aus der extrem großen Vielzahl an dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Antigen-Antikörper-Kombinationen ausgewählt wird. Das einzigartige extrazelluläre Epitop kann dann unter Verwendung von Antikörpermarkierung in Verbindung mit chromogenen oder fluoreszierenden Hilfsstoffen direkt nachgewiesen werden. Elemente der vorliegenden Offenbarung können im Einzelnen durch die Verwendung der bar- und/oder GUS-Gene, und auch durch die Verwendung von diversen anderen Markern, exemplifiziert werden. Selbstverständlich werden dem Fachmann auf dem Gebiet, in Hinblick auf diese Offenbarung, sehr viele andere mögliche selektierbare und/oder screenbare Markergene offensichtlich sein, zusätzlich zu dem einen, das hierin nachstehend dargestellt ist. Deshalb versteht es sich, dass die nachfolgende Erörterung eher exemplarisch denn erschöpfend ist. Angesichts der hierin offenbarten Techniken und der allgemeinen rekombinanten Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, macht die vorliegende Erfindung die Einbringung von jedwedem Gen, einschließlich Markergenen, in eine Empfängerzelle möglich, um eine transformierte Pflanze zu erzeugen.
  • 2.1 Selektierbare Marker
  • Verschiedene selektierbare Marker sind im Fachgebiet als für Pflanzentransformation geeignet bekannt. Solche Marker können, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, folgende einschließen:
  • 2.1.1 Negativ-Selektionsmarker
  • Negativ-Selektionsmarker verleihen eine Resistenz gegen eine biozide Verbindung, wie einen Stoffwechselinhibitor (z. B. 2-Desoxyglucose-6-phosphat, WO 98/45456 ), Antibiotika (z. B. Kanamycin, G 418, Bleomycin oder. Hygromycin) oder Herbizide (z. B. Phosphinothricin oder Glyphosat). Transformierte Pflanzenmaterialien (z. B. Zellen, Gewebe oder Pflänzchen), welche Markergene exprimieren, sind zur Entwicklung bei Gegenwart von Konzentrationen einer entsprechenden Selektionsverbindung (z. B. Antibiotikum oder Herbizid), die das Wachstum eines untransformierten Wildtyp-Gewebes unterdrückt, in der Lage. Besonders bevorzugte Negativ-Selektionsmarker sind diejenigen, welche eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispiele, die genannt werden können, sind Folgende:
    • – Phosphinothricin-Acetyltransferasen (PAT; auch genannt Bialophos ®Resistenz; bar; de Block 1987; Vasil 1992, 1993; Weeks 1993; Becker 1994; Nehra 1994; Wan & Lemaux 1994; EP 0 333 033 ; US 4,975,374 ). Bevorzugt sind das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus oder das pat-Gen aus Streptomyces viridochromogenes. PAT inaktiviert den aktiven Bestandteil im Herbizid Bialaphos, Phosphinothricin (PPT). PPT inhibiert Glutaminsynthetase (Murakami 1986; Twell 1989), was eine rasche Akkumulation von Ammoniak und den Zelltod verursacht.
    • – veränderte 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), die Resistenz gegen Glyphosate® (N-(Phosphonomethyl)glycin) verleiht (Hinchee 1988; Shah 1986; Della-Cioppa 1987). Falls ein mutantes EPSP-Synthase-Gen verwendet wird, kann ein zusätzlicher Vorteil durch den Einbau eines geeigneten Chloroplastentransitpeptids, CTP realisiert werden ( EP-A1 0 218 571 ).
    • – Glyphosate® abbauende Enzyme (Glyphosate® Oxidoreductase; gox),
    • – Dalapon® inaktivierende Dehalogenasen (deh)
    • – Sulfonylharnstoff- und/oder Imidazolinon-inaktivierende Acetolactatsynthasen (ahas oder ALS; zum Beispiel mutierte ahas/ALS-Varianten mit beispielsweise der S4-, XI12-, XA17-und/oder Hra-Mutation ( EP-A 1 154 204 )
    • – Bromoxynil® abbauende Nitrilasen (bxn; Stalker 1988)
    • – Kanamycin- oder Genticin (G418)-Resistenzgene (NPTII; NPT oder neo; Potrykus 1985), welche z. B. für Neomycin-Phosphotransferasen codieren (Fraley 1983; Nehra 1994)
    • – 2-Desoxyglucose-6-phosphat-Phosphatase (DOGR1-Genprodukt; WO 98/45456 ; EP 0 807 836 ), die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose verleiht (Randez-Gil 1995).
    • – Hygromycin-Phosphotransferase (HPT), die Resistenz gegen Hygromycin vermittelt (Vanden Elzen 1985).
    • – veränderte Dihydrofolat-Reduktase (Eichholtz 1987), die Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Thillet 1988);
    • – mutierte Gene für Anthranilatsynthase, die Resistenz gegen 5-Methyltryptophan verleiht.
  • Zu weiteren negativ-selektierbaren Markergenen von bakterieller Herkunft, welche Resistenz gegen Antibiotika verleihen, zählen das aadA-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Spectinomycin verleiht, Gentamycinacetyltransferase, Streptomycinphosphotransferase (SPT), Aminoglycosid-3-Adenyl-Transferase und die Bleomycin-Resistenz-Determinante (Hayford 1988; Jones 1987; Svab 1990; Hille 1986).
  • Besonders bevorzugt sind negative Selektionsmarker, welche Resistenz gegen die toxischen Effekte verleihen, die durch D-Aminosäuren, wie z. B. D-Alanin und D-Serin ausgeübt werden ( WO 03/060133 ; Erikson 2004). Besonders bevorzugt als Negativ-Selektionsmarker in diesem Kontext sind das daoI-Gen (EC: 1.4.3.3: GenBank Eintr.-Nr.: U60066) aus der Hefe Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) und das E. coli-Gen dsdA (D-Serin-Dehydratase (D-Serin-Desaminase) [EC: 4.3.1.18; GenBank Eintr.-Nr.: J01603).
  • Transformierte Pflanzenmaterialien (z. B. Zellen, Embryos, Gewebe oder Pflänzchen), welche derartige Markergene exprimieren, sind fähig zur Entwicklung in Gegenwart von Konzentrationen einer entsprechenden Selektionsverbindung (z. B. Antibiotikum oder Herbizid), die das Wachstum eines untransformierten Wildtyp-Gewebes unterdrückt. Die resultierenden Pflanzen können in der üblichen Weise gezüchtet und hybridisiert werden. Man sollte zwei oder mehr Generationen wachsen lassen, um zu gewährleisten, dass die genomische Integration stabil und vererbbar ist. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (Jenes 1993; Potrykus 1991).
  • Darüber hinaus können Reportergene verwendet werden, um ein visuelles Screening zu erlauben, das (abhängig vom Typ des Reportergens) einen Zusatz mit einem Substrat als einer Selektionsverbindung erfordern kann oder nicht.
  • Verschiedene Zeitschemen können für die diversen Negativselektions-Markergene zur Anwendung kommen. Im Fall von Resistenzgenen (z. B. gegen Herbizide oder D-Aminosäuren) wird die Selektion vorzugsweise während der gesamten Kallusinduktionsphase für etwa 4 Wochen und über mindestens 4 Wochen hinaus bis in die Regeneration hinein angewandt. Ein solches Selektionsschema kann für alle Selektionsvorgehen angewandt werden. Es ist außerdem möglich. (obwohl nicht explizit bevorzugt), die Selektion auch während des gesamten Regenerations-Schemas, einschließlich der Wurzelbildung, aufrecht zu halten.
  • Zum Beispiel kann, mit dem Phosphinotricin-Resistenz-Gen (bar) als dem Selektivmarker, Phosphinotricin bei einer Konzentration von etwa 1 bis 50 mg/l im Medium eingebunden werden. Zum Beispiel kann, mit dem dao1-Gen als dem Selektivmarker, D-Serin oder D-Alanin bei einer Konzentration von etwa 3 bis 100 mg/l im Medium eingebunden werden. Typische Konzentrationen für die Selektion sind 20 bis 40 mg/l. Zum Beispiel kann, mit den mutierten ahas-Genen als dem Selektivmarker, PURSUITTM bei einer Konzentration von etwa 3 bis 100 mg/l im Medium eingebunden werden. Typische Konzentrationen für die Selektion sind 20 bis 40 mg/l.
  • 2.1.2 Positiv-Selektionsmarker
  • Ferner können Positiv-Selektionsmarker verwendet werden. Gene, wie Isopentenyltransferase aus Agrobacterium tumefaciens (Stamm:PO22; Genbank Eintr.-Nr.: AB025109) können – als ein Schlüsselenzym der Cytokininbiosynthese – die Regeneration von transformierten Pflanzen erleichtern (z. B. durch Selektion auf Cytokinin-freiem Medium). Entsprechende Selektionsmethoden sind beschrieben (Ebinuma 2000a,b). Weitere Positiv-Selektionsmarker, welche einer transformierten Pflanze im Vergleich zu einer nicht-transformierten Pflanze einen Wachstumsvorteil verleihen können, sind z. B. in der EP-A 0 601 092 beschrieben. Wachstums-Stimulations-Selektionsmarker können (ohne jedoch darauf eingeschränkt sein zu sollen) beta-Glucuronidase (in Kombination mit z. B. einem Cytokinin-Glucuronid), Mannose-6-phosphat-Isomerase (in Kombination mit Mannose), UDP-Galactose-4-Epimerase (in Kombination mit z. B. Galactose) einschließen, wobei Mannose-6-phosphat-Isomerase in Kombination mit Mannose besonders bevorzugt ist.
  • 2.1.3 Gegen-Selektionsmarker
  • Gegen-Selektionsmarker sind besonders geeignet zum Sektieren von Organismen mit definierten deletierten Sequenzen, die den Marker umfassen (Koprek 1999). Beispiele für Gegen-Selektionsmarker umfassen Thymidinkinasen (TK), Cytosindeaminasen (Gleave 1999; Perera 1993; Stougaard 1993), Cytochrom P450-Proteine (Koprek 1999), Haloalkan-Dehalogenasen (Naested 1999), iaaH-Genprodukte (Sundaresan 1995), Cytosindeaminase codA (Schlaman & Hooykaas 1997), tms2-Genprodukte (Fedoroff & Smith 1993). oder alpha-Naphthalinacetamid (NAM; Depicker 1988). Gegen-Selektionsmarker können bei der Konstruktion von Transposon-Tagging-Linien nützlich sein. Zum Beispiel könnte man, durch Markieren eines autonomen transponierbaren Elements, wie Ac, Master Mu oder En/Spn, mit einem Gegen-Selektionsmarker nach Transformanten selektieren, in denen das autonome Element nicht stabil in das Genom integriert ist. Dies wäre zum Beispiel wünschenswert, wenn eine transiente Expression des autonomen Elements gewünscht ist, um in trans die Transposition eines defekten transponierbaren Elements, wie Ds, zu aktivieren, aber die stabile Integration des autonomen Elements nicht erwünscht ist. Die Gegenwart des autonomen Elements kann nicht erwünscht sein, um das defekte Element zu stabilisieren, d. h. dieses am weiteren Transponieren zu hindern. Allerdings wird vorgeschlagen, dass wenn eine stabile Integration eines autonomen transponierbaren Elements in einer Pflanze gewünscht wird, die Gegenwart eines negativen selektierbaren Markers es möglich machen kann, das autonome Element während des Züchtungsverfahrens zu eliminieren.
  • 2.2. Screenbare Marker
  • Screenbare Marker, die verwendet werden können, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, ein beta-Glucuronidase (GUS)- oder uidA-Gen, das ein Enzym codiert, für das diverse chromogene Substrate bekannt sind; ein R-Locus-Gen, das ein Produkt codiert, welches die Herstellung von Anthocyanin-Pigmenten (rote Farbe) in Pflanzengeweben reguliert (Dellaporta 1988); ein beta-Lactamase-Gen (Sutcliffe 1978), das ein Enzym codiert, für das diverse chromogene Substrate bekannt sind (z. B. PADAC, ein chromogenes Cephalosporin); ein xyIE-Gen (Zukowsky 1983), das eine Catecholdioxygenase codiert, welche chromogene Catechole umsetzen kann; ein alpha-Amylase-Gen (Ikuta 1990); ein Tyrosinase-Gen (Katz 1983), das ein Enzym codiert, das zum Oxidieren von Tyrosin zu DOPA und Dopachinon in der Lage ist, das seinerseits unter Bildung der leicht nachweisbaren Verbindung Melanin kondensiert; ein beta-Galactosidase-Gen, das ein Enzym codiert, für das es chromogene Substrate gibt; ein Luciferase(lux)-Gen (Ow 1986), das Biolumineszenz-Detektion gestattet; oder sogar ein Aequorin-Gen (Prasher 1985), das in der Calcium-empfindlichen Biolumineszenz-Detektion verwendet werden kann, oder ein Grün-Fluoreszenz-Protein-Gen (Niedz 1995) ein.
  • Gene aus dem Mais-R-Genkomplex werden als besonders nützliche screenbare Marker in Betracht gezogen. Der R-Genkomplex in Mais codiert ein Protein, welches zum Regulieren der Produktion von Anthocyanin-Pigmenten in den meisten Samen- und Pflanzengeweben wirkt. Ein Gen aus dem R-Genkomplex wurde bei Maistransformation angewandt, weil die Expression dieses Gens in transformierten Zellen den Zellen nicht schadet. Daher wird ein in solche Zellen eingebrachtes R-Gen die Expression eines roten Pigments verursachen und kann, sofern es stabil eingebunden wurde, visuell als ein roter Sektor erfasst werden. Wenn eine Maislinie dominant bezüglich Genen ist, welche die enzymatischen Intermediate im Anthocyanin-Biosyntheseweg (C2, A1, A2, Bz1 und Bz2) codieren, aber ein rezessives Allel am R-Locus trägt, wird die Transformation einer beliebigen Zelle aus dieser Linie mit R zur Bildung von rotem Pigment führen. Zu exemplarischen Linien zählen Wisconsin 22, die das rg-Stadler Allel enthält, und TR112, ein K55-Derivat, das r-g, b, P1 ist. Alternativ kann jedweder Genotyp von Mais verwendet werden, wenn die C1- und R-Allele gemeinsam eingebracht werden.
  • Es wird ferner vorgeschlagen, dass R-Gen-regulatorische Regionen in chimären Konstrukten angewandt werden können, um Mechanismen für die Steuerung der Expression von chimären Genen bereitzustellen. Am R-Locus ist eine größere Diversität der phänotypischen Expression bekannt als an einem beliebigen anderen Locus (Coe 1988). Es wird in Betracht gezogen, dass regulatorische Regionen, die aus Regionen 5' zum R-Strukturgen erhalten werden, nützlich bei der Steuerung der Expression von Genen, z. B. Insektenresistenz, Dürreresistenz, Herbizidtoleranz oder anderer Protein codierender Regionen, sein werden. Für die Absichten der vorliegenden Erfindung, wird davon ausgegangen, dass jedwedes von den diversen R-Gen-Familienmitgliedern erfolgreich angewandt werden kann (so z. B. P, S, Lc, etc.). Allerdings wird allgemein Sn (insbesondere Sn:bol3) am meisten bevorzugt. Sn ist ein dominantes Mitglied des R-Genkomplexes und ist funktional ähnlich zu den R- und B-Loci dahingehend, dass Sn die gewebespezifische Ablagerung von Anthocyanin-Pigmenten in gewissen Sämlings- und Pflanzenzellen steuert, wesegen sein Phänotyp ähnlich zu R ist.
  • Ein weiterer screenbarer Marker, der für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, ist Leuchtkäfer-Luciferase, die durch das lux-Gen codiert wird. Das Vorhandensein des lux-Gens in transformierten Zellen kann unter Verwendung von zum Beispiel Röntgenfilm, Szintillations-Zählung, Fluoreszenz-Spektrophotometrie, Weniglicht-Videokameras, Photonenzählungs-Kameras oder Mehrfach-Vertiefungs-Luminometrie nachgewiesen werden. Es wird auch in Betracht gezogen, dass dieses System für das Screening von Populationen hinsichtlich Biolumineszenz, wie etwa auf Gewebekulturplatten, oder sogar für Gesamtpflanzen-Screening weiterentwickelt werden kann. Falls die Verwendung eines screenbaren Marker-Gens, wie lux oder GFP gewünscht ist, kann ein Nutzen durch Erzeugen einer Genfusion zwischen dem screenbaren Markergen und einem selektierbaren Markergen, zum Beispiel einer GFP-NPTII-Genfusion, realisiert werden. Diese könnte zum Beispiel die Selektion von transformierten Zellen, gefolgt von Screening von transgenen Pflanzen oder Samen, erlauben.
  • 3. Anwendungen von transgenen Pflanzen
  • Sobald eine Expressionskassette der Erfindung in eine jeweilige Pflanzenspezies transformiert worden ist, kann sie in dieser Spezies vermehrt werden oder unter Anwendung von herkömmlichen Züchtungstechniken in andere Varietäten derselben Spezies, insbesondere einschließlich kommerzieller Varietäten, hinein bewegt werden. Besonders bevorzugte Pflanzen der Erfindung schließen die oben aufgelisteten landwirtschaftlich wichtigen Nutzpflanzen ein. Die in die oben beschriebenen transgenen Samen und Pflanzen einkonstruierten genetischen Eigenschaften werden durch sexuelle Reproduktion weitergegeben und können daher in Nachkommenpflanzen beibehalten und fortgepflanzt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein(e) transgene(s) pflanzliche Zelle, Gewebe, Organ, Samen oder Pflanzenteile, die aus der transgenen Pflanze erhalten werden. Ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen sind transgene Abkömmlinge der Pflanze sowie transgene Pflanzenzellen, Gewebe, Organe, Samen und Pflanzenteile, die aus den Abkömmlingen erhalten werden.
  • Vorzugsweise wird die Expressionskassette in der transgenen Pflanze sexuell übertragen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die codierende Sequenz sexuell durch einen kompletten normalen sexuellen Zyklus von der R0-Pflanze zu der R1-Generation übertragen. Weiterhin bevorzugt, wird die Expressionskassette in den Zellen, Geweben, Samen oder einer Pflanze von einer transgenen Pflanze in einem Ausmaß exprimiert, das unterschiedlich zu dem Ausmaß in den Zellen, Geweben, Samen oder einer Pflanze von einer Pflanze ist, die sich nur dadurch unterscheidet, dass die Expressionskassette nicht vorhanden ist.
  • Die hierin hergestellten transgenen Pflanzen sind daher, der Erwartung nach, für eine Vielzahl von kommerziellen und wissenschaftlichen Zwecken nützlich. Transgene Pflanzen können für die Verwendung in der traditionellen Agrikultur geschaffen werden, um für den Bauern vorteilhafte Eigenschaften (z. B. landwirtschaftliche Eigenschaften, wie Resistenz gegen Wassermangel, Schädlingsresistenz, Herbizidresistenz oder erhöhter Ertrag), für den Verbraucher vorteilhafte Eigenschaften des von der Pflanze geernteten Getreides (z. B. verbesserter Nährstoff gehalt in menschlicher Nahrung oder Tierfutter; erhöhter Vitamin-, Aminosäure-, und Antioxidationsmittelgehalt; die Erzeugung von Antikörpern (passive Immunisation) und Nutrazeuticals) oder für den Lebensmittelverarbeiter vorteilhafte Eigenschaften (z. B. verbessere Verarbeitungseigenschaften) zu besitzen. In solchen Anwendungen werden die Pflanzen im Allgemeinen für die Verwendung ihrer Körner in Nahrungsmitteln für Menschen oder Tiere angebaut. Darüber hinaus kann die Verwendung von wurzelspezifischen Promotoren in transgenen Pflanzen vorteilhafte Eigenschaften bereitstellen, welche in den (von Tieren und Menschen) verzehrbaren Wurzeln von Pflanzen, wie Karotten, Pastinaken und Rüben, verortet sind. Allerdings können auch andere Teile der Pflanzen, einschließlich Stengeln, Hüllblättern, vegetativen Teilen und dergleichen, eine Verwendbarkeit besitzen, einschließlich Verwendung als Teil von Silo-Tierfutter oder zu Zwecken der Verzierung. Oft werden chemische Bestandteile (z. B. Öle oder Stärken) von Mais und anderen Nutzpflanzen für Lebensmittel oder eine industrielle Verwendung extrahiert, und es können transgene Pflanzen erzeugt werden, welche gesteigerte oder modifizierte Spiegel solcher Komponenten aufweisen.
  • Transgene Pflanzen können auch in der kommerziellen Herstellung von Proteinen oder anderen Molekülen Verwendung finden, worin das Molekül von Interesse aus Pflanzenteilen, Samen und dergleichen extrahiert oder gereinigt wird. Zellen oder Gewebe aus den Pflanzen können auch kultiviert, in vitro herangezogen oder fermentiert werden, um derartige Moleküle herzustellen.
  • Die transgenen Pflanzen können auch in kommerziellen Zuchtprogrammen verwendet werden oder können mit Pflanzen von verwandten Nutzpflanzenspezies gekreuzt oder verpaart werden. Verbesserungen, die von der Expressionskassette codiertwerden, können z. B. aus Maiszellen auf Zellen von anderen Spezies, z. B. mittels Protoplastenfusion, übertragen werden.
  • Die transgenen Pflanzen können viele Anwendungen in Forschung oder Züchtung haben, einschließlich Erzeugung von neuen Mutantenpflanzen durch insertionale Mutagenese, um nützliche Mutanten zu identifizieren, welche später durch traditionelle Mutation und Selektion erzeugt werden könnten. Ein Beispiel wäre die Einbringung einer rekombinanten DNA-Sequenz, die ein transponierbares Element codiert, das für die Erzeugung von genetischer Variation verwendet werden kann. Die Verfahren der Erfindung können auch angewandt werden, um Pflanzen zu erzeugen, die einmalige ”Signatur-Sequenzen” oder andere Markersequenzen aufweisen, die man verwenden kann, um firmeneigene bzw. proprietäre Linien oder Varietäten zu identifizieren.
  • Somit können die transgenen Pflanzen und Samen gemäß der Erfindung in der Pflanzenzucht verwendet werden, welche auf die Entwicklung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften, die von der Expressionskassette vermittelt werden, wie etwa Toleranz gegen Dürre, Krankheit oder andere Stressarten, abzielt. Die diversen Züchtungsschritte sind durch gut definierte menschliche Eingriffe, wie Selektieren der zu kreuzenden Linien, Lenken der Bestäubung der parentalen Linien oder Selektieren von angemessenen Nachkommenpflanzen, charakterisiert. Abhängig von den gewünschten Eigenschaften werden unterschiedliche Zuchtmaßnahmen ergriffen. Die relevanten Techniken sind im Stand der Technik gut bekannt und beinhalten, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Hybriderzeugung, Inzucht, Rückkreuzungs-Zucht, Mehrspurige Züchtung, Mischen von Sorten, interspezifische Hybriderzeugung, Aneuploidie-Techniken, etc. Hybridisiertechniken schließen auch die Sterilisation von Pflanzen ein, um männliche oder weibliche sterile Pflanzen durch mechanische, chemische oder biochemische Methoden zu erhalten. Kreuz-Bestäubung einer männlichen sterilen Pflanze mit Pollen einer anderen Linie gewährleistet, dass das Genom der männlich-sterilen aber weiblich-fertilen Pflanze einheitlich Eigenschaften von beiden parentalen Linien erhalten wird. Somit können die transgenen Samen und Pflanzen gemäß der Erfindung zur Züchtung von verbesserten Pflanzen-Linien verwendet werden, die zum Beispiel die Wirksamkeit herkömmlicher Methoden, wie Herbizid- oder Pestizidbehandlung erhöhen, oder den Verzicht auf besagte Methoden wegen ihrer modifizierten genetischen Eigenschaften ermöglichen. Alternativ dazu können neue Nutzpflanzen mit verbesserter Stresstoleranz erhalten werden, welche aufgrund ihrer optimierten genetischen ”Ausstattung” Ernteprodukte von besserer Qualität ergeben als Produkte, die nicht in der Lage waren, vergleichbare nachteilige Entwicklungsbedingungen zu tolerieren. Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1:
  • IDENTIFIZIEREN VON KG(KEYGEN)-TRANSKRIPT-KANDIDATEN
  • Eine Mais-Genexpressions-Profilerstellungs-Analyse wurde mit Hilfe eines kommerzielen Anbieters von vergleichender AFLP-Expressionstechnologie (Keygene N.V., P.O.Box 216, 6700 AE Wageningen, Niederlande) durchgeführt, wobei eine von den Erfindern der vorliegenden Erfindung erzeugte Batterie von RNA-Proben aus 23 Maisgeweben verwendet wurde (Tabelle 1). Bei neun Fragmenten wurde ermittelt, dass sie eine Embryo- oder Gesamtsamenspezifische Expression aufweisen. Diese Fragmente wurden jeweils als KG_Fragment 56, 129, 49, 24, 37, 45, 46, 103, 119 bezeichnet. Sequenzen von jedem Fragment sind in den SEQ ID NRn: 145 bis 153 gezeigt. Tabelle 1. Maisgewebe, die für das mRNA-Expressionsprofilerstellungs-Experiment verwendet wurden
    Probe Nr. Gewebe Timing und Anzahl von Pflanzen Tage nach der Bestäubung
    1 Wurzel 9 am (4 Pflanzen) 5
    2 9 am (4 Pflanzen) 15
    3 9 am (4 Pflanzen) 30
    4 Blatt über kolben 9 am (6 Pflanzen) 5
    5 9 am (6 Pflanzen) 15
    6 9 am (6 Pflanzen) 30
    7 Kolben komplett 9 am (6 Pflanzen) 5
    8 9 am (6 Pflanzen) 10
    9 Gesamtsamen 9 am (6 Pflanzen) 15
    10 9 am (6 Pflanzen) 20
    11 9 am (6 Pflanzen) 30
    12 Endosperm 9 am (6 Pflanzen) 15
    13 9 am (6 Pflanzen) 20
    14 9 am (6 Pflanzen) 30
    15 Embryo 9 am (6 Pflanzen) 15
    16 9 am (6 Pflanzen) 20
    17 9 am (6 Pflanzen) 30
    18 Weibl. Stempelblüte 6 Pflanzen vor der Bestäubung
    19 Keimender Samen 20 Samen Tränken während 3 Tagen
    20 Wurzel, veg. Zusand V2
    21 Wurzel, veg. Zusand V4
    22 Blatt, veg. Zusand V2
    23 Blatt, veg. Zusand V4
  • BEISPIEL 2:
  • IDENTIFIZIEREN DES EST, ENTSPRECHEND DEN KG_FRAGMENT-KANDIDATEN
  • Sequenzen der KG_Fragment-Kandidaten wurden als Suchsequenz bzw. Abfragesatz für eine BLASTN-Suche gegen die hauseigene Datenbank der Erfinder, HySeq All EST, verwendet. EST-Einträge, die die höchsten Identitäten zu den obigen KG_Fragmenten zeigen, sind in der Tabelle 2 aufgelistet, und Sequenzen von diesen ESTs sind in den SEQ ID NRn: 93, 94 und 98–104 gezeigt. Tabelle 2. Mais EST–Eintragsnummer, die die höchten Identitäten zu den KG-Fragment-Kandiaten zeigt
    KG-Fragment ID Hyseq Mais EST ID % Identitäten SEQ ID NR.:
    24 62001211.f01 100 99
    37 62029487.f01 100 100
    45 57894155.f01 100 101
    46 62096689.f01 100 102
    49 62158447.f01 91 98
    56 no N/A 93
    103 ZM07MC01323_57619299 100 103
    119 ZM07MC15086_59463108 100 104
    129 62092959.f01 100 94
  • BEISPIEL 3:
  • BESTÄTIGEN DES EXPRESSIONSMUSTERS DER KG-KANDIDATEN UNTER VERWENDUNG VON QUANTITATIVER REVE RSER-TRANSKRI PTASE-POLYMERASEKETTENREAKTION (Q-RT-PCR)
  • Zur Bestätigung des nativen Expressionsmusters der KG-Kandidaten, wurde quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (q-RT-PCR) unter Verwendung von Gesamt-RNA durchgeführt, die aus denselben Materialien isoliert wurde, wie sie für die AFLP-Expressionsprofil-Erstellung verwendet wurden (Tabelle 1). Primer für qRT-PCR wurden basierend auf den Sequenzen entweder der KG_Fragmente oder der identifizierten Mais-Hyseq-EST mit Hilfe des Vektor NTI-Softwarepakets (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) entworfen. Zwei Sätze von Primern wurden für die PCR-Amplifikation für jeden Kandidaten verwendet. Das Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-Gen diente als eine Kontrolle für Normierungszwecke. Sequenzen von Primern für q-RT-PCR sind in der Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3. Primerequenzen für q-RT-PCR
    Figure 00860001
    Figure 00870001
  • q-RT-PCR wurde unter Verwendung von SuperScript III-Reverser-Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und von SYBR-Green QPCR Master Mix (Eurogentec, San Diego, CA, USA) in einem ABI-Prism 7000-Sequenzdetektions-System durchgeführt. Kurz gesagt, wurde cDNA unter Verwendung von 2–3 Mikrogramm Gesamt-RNA und 1 μl Reverser Transcriptase in einem Volumen von 20 μl synthetisiert. Die cDNA wurde auf einen Bereich von Konzentrationen (15–20 ng/μl) verdünnt. Dreißig bis vierzig ng cDNA wurden für quantitative PCR (qPCR) in einem Volumen von 30 μl mit SYBR Green QPCR Master-Mix unter Befolgen der Anleitung des Herstellers verwendet. Die Thermozyklierbedingungen waren wie folgt: Inkubieren bei 50°C während 2 Minuten, Denaturieren bei 95°C während 10 Minuten, und Ausführen von 40 Zyklen bei 95°C während 15 Sekunden und 60°C während 1 Minute für die Amplifikation. Nach dem letzten Zyklus der Amplifikation, wurde die Dissoziationskurvenanalyse durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Amplifikation spezifisch stattgefunden hatte und dass kein Primerdimerprodukt während des Amplifikationsverfahrens gebildet worden war. Das Haushaltsgen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, Primer-Sequenzen in Tabelle 3) wurde als ein endogenes Referenzgen verwendet, um die Berechnung mit Hilfe des Vergleichs-Ct(”Cycle of threshold” bzw. Schwellenzyklus)-Wert-Verfahrens zu normieren. Der ΔCT-Wert wurde durch Subtrahieren des Ct-Werts des GAPDH-Gens von dem Ct-Wert des Kandidatengens erhalten, und die relative Transkriptionsmenge (Expressionsspiegel) des Kandidatengens wurde als 2–ΔCT ausgedrückt. Die q-RT-PCR-Ergebnisse sind in der 1 zusammengefasst. Alle KG-Kandidaten zeigten ähnliche Expressionsmuster, welche äquivalent zu den Expressionsmustern sind, die aus den AFLP-Daten erhalten wurden: spezifisch oder vorzugsweise in Embryo oder Gesamtsamen exprimiert (1).
  • BEISPIEL 4:
  • KOMMENTIERUNG UND PROMOTORIDENTIFIKATION DER KG-KANDIDATEN
  • Die den KG-Kandidaten entsprechenden codierenden Sequenzen wurden basierend auf den In-silico-Ergebnissen auskommentiert, die sowohl aus dem BLASTX von jeder EST-Sequenz gegen GenBank-Protein-Datenbank (nr) als auch dem Resultat der In-silico-Translation der Sequenz mit Hilfe des Vektor NTI-Softwarepakets erhalten worden waren.
  • 1). KG_Fragment 24
  • Mais EST 62001211.f01 codiert ein Protein, das Homologie zu einem hypothetischen Protein von Weizen aufweist (GenBank-Eintrag: BAC80265). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Suche identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4. BLASTX-Suchergebnisse von KG_Fragment 24/Hyseq EST 62001211.f01
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    BAC80265 hypothetisches Protein [Triticum aestivum]. 191 9,00E-56 81
    Q07764 HVA22_HORVU Protein HVA22 191 2,00E-54 81
    EAY81013.1 hypothetisches Protein OsJ_OsI_034972 [Oryza sativa (Indica-Kultivar-gruppe bzw. Sortengruppe)] 162 2,00E-39 67
    NP_001062004.1 Os08g0467500 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 133 5,00E-39 76
    EAZ18437.1 hypothetisches Protein OsJ_032646 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 161 6,00E-39 66
    NP_001067939.1 Os11g0498600 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 161 6,00E-39 66
    NP_568744.1 ATHVA22E (Arabidopsis thaliana HVA22 Homolog E) 148 1,00E-35 62
    BAD09552.1 putatives Abscisinsäureinduziertes Protein [Oryza sativa Japonica-Gruppe] 119 5,00E-35 75
    NP_567713.1 ATHVA22D (Arabidopsis thaliana HVA22 Homolog D) 139 1,00E-31 57
    EAZ07285.1 hypothetisches Protein OsI_028517 [Oryza sativa (Indica Kultivargruppe)] 119 1,00E-31 75
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 24 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 27 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 45 gezeigt.
  • Identifizierung der Promotorregion von KG24
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 24-Gens als der Promotor p-KG24 definiert.
  • Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die EST-Sequenz von 62001211.f_o1 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_23949 (3602 bp) wurde identifiziert (SEQ ID NR.: 81). Diese 3602 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS des zu KG_Fragment 24 entsprechenden Gens und mehr als 1,6 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens.
  • Isolierung der Promotorregion von KG24 mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 00890001
    Das erwartete 1507 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG24 (p-KG24) bezeichnet. Die Sequenz von p-KG24 ist in SEQ ID NR.: 9 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG24
  • Die besten 13 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert wurden, sind in der Tabelle 5 dargelegt. Tabelle 5. BlastN-Ergebnisse von p_KG24
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeck-ung E-Wert Max. Ident.
    AF205807.1 Zea mays subsp. huehuetenangensis-Isolat Beadle s.n. b1 Gen, B-M033-Allel, partielle Sequenz 522 660 22% 2,00E-144 94%
    EU961185.1 Zea mays, Klon 233237, unbekannte mRNA 491 491 21% 3,00E-135 93%
    EU945925.1 Zea mays, Klon 290258, mRNA-Sequenz 491 491 21% 3,00E-135 93%
    AF448416.1 Zea mays, B73 Chromosom 9S bz genomische Region 491 660 33% 3,00E-135 94%
    AC157319.2 Zea mays, Klon ZMMBBb-136E2, komplette Sequenz 489 489 21% 1,00E-134 93%
    AY883458.1 Zea mays subsp. parviglumis-Kultivar, CIMMYT-11355 ”Teosinte glume”-Architektur 1 (tga1)-Gen, Promotorregion 484 484 21% 5,00E-133 92%
    AY508163.1 Zea mays -Kultivar F324, disruptiertes Peroxidase (pox3)-Gen, Exons 1 bis 3; und Transposon MITE, komplette Sequenz 479 479 21% 2,00E-131 92%
    AY508162.1 Zea mays-Kultivar F227, disruptiertes Peroxidase (pox3) Gen, Exons 1 bis 3; und Transposon MITE, komplette Sequenz 479 479 21% 2,00E-131 92%
    AY508161.1 Zea mays-Kultivar F226, disruptiertes Peroxidase (pox3) Gen, Exons 1 bis 3; und Transposon MITE, komplette Sequenz 479 479 21% 2,00E-131 92%
    AY508160.1 Zea mays-Kultivar F7012, disruptiertes Peroxidase (pox3) Gen, Exons 1 bis 3; und Transposon MITE, komplette Sequenz 479 479 21% 2,00E-131 92%
    AY508159.1 Zea mays-Kultivar Quebec28, disruptiertes Peroxidase (pox3) Gen, pox3-2-Allel, Exons 1 bis 3; und Transposon MITE, komplette Sequenz 479 479 21% 2,00E-131 92%
    AY883461.1 Zea mays subsp. parviglumis-Kultivar HGW-Wilkes Stelle 6 ”Teosinte glume”-Architektur 1 (tga1)-Gen, Promotorregion 479 479 21% 2,00E-131 93%
    AY508516.1 Zea mays, disruptiertes Peroxidase (pox3) Gen, partielle Sequenz; und Transposon MITE, komplette Sequenz 475 475 21% 3,00E-130 92%
  • 2). KG_Fragment 37
  • Das KG_Fragment 37/Mais EST 62029487.f01 codiert ein Protein, das homolog zu einem hypothetischen Protein von Reis ist (GenBank-Eintrag: NP_001051496). Die besten 15 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 6 dargelegt. Tabelle 6. BLASTX-Suchergebnisse von KG_Fragment 37/Hyseq EST 62029487.f01
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    NP_001051496 Os03g0787200 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)]. 518 e-145 65
    EAY92106 hypothetisches Protein OsI_013339 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe) 518 e-145 65
    ABF99245 IQ Calmodulin-bindendes Motiv-Familie-Protein, exprimiert [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 479 e-133 67
    CAO70668 unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera] 367 2,00E-99 51
    CAN68445 hypothetisches Protein [Vitis vinifera]. 318 8,00E-85 46
    NP_001067295 Os12g0619000 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 301 1,00E-79 45
    NP_188858 IQD5 (IQ-Domäne 5); Calmodulin-bindend [Arabidopsis thaliana] 301 2,00E-79 49
    BA603067 unbenanntes Proteinprodukt [Arabidopsis thaliana] 298 1,00E-78 44
    ACF85687 unbekannt [Zea mays] 294 2,00E-77 45
    EAY94673 hypothetisches Protein OsI_015906 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 280 4,00E-73 43
    EAY83925 hypothetisches Protein OsI_037884 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 279 5,00E-73 43
    NP_001050778 Os03g0648300 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 276 6,00E-72 43
    AAU89191 exprimiertes Protein [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 276 6,00E-72 43
    EAZ27950 hypothetisches Protein OsJ_011433 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 269 3,00E-27 44
    EAY92104 hypothetisches Protein OsI_013337 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 266 4,00E-69 73
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 37 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 28 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR.: 46 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von KG37
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 37-Gens als der Promotor p-KG37 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die EST-Sequenz von 62029487.f_o1 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Die Reverses-Komplement-Sequenz von AZM5_22959 (2441 bp) wurde identifiziert (SEQ ID NR.: 82). Diese 2441 bp große Sequenz enthielt teilweise vorausgesagte CDS von dem zu KG_Fragment 37 entsprechenden Gen und etwa 1,4 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens.
  • Isolierung der Promotorregion von KG37 mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 00930001
    Das erwartete 910 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG37 (p-KG37) bezeichnet. Die Sequenz von p-KG37 ist in der SEQ ID NR.: 10 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG37
  • Die besten 11 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 7 dargelegt. Tabelle 7. BlastN-Ergebnisse von p_KG37
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamtergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    EU966853.1 Zea mays Klon 297738 unbekannte mRNA 619 619 38% 6,00E-174 99%
    AC084296.12 Oryza sativa Chromosom 3 BAC OSJNBb0024J04 genomische Sequenz, komplette Sequenz 51,8 51,8 7% 0,006 78%
    AP008209.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) genomische DNA, Chromosom 3 51,8 51,8 7% 0,006 78%
    6X284754.1 Neurospora crassa-DNA-Kopplungsgruppe II BAC-Contig B23G1 50 50 3% 0.02 93%
    AC143357.1 Pan troglodytes BAC-Klon RP43-171 124 aus Chromosom 7, komplette Sequenz 48,2 48,2 3% 0.069 96%
    AC003013.1 Humaner PAC-Klon RP1-205E24 aus Xq23, komplette Sequenz 48,2 48,2 3% 0.069 96%
    AL136101.7 Humane DNA-Sequenz vom Klon RP5-954O23 auf Chromosom Xq22.2-23, komplette Sequenz 48,2 48,2 3% 0.069 96%
    AM910995.1 Plasmodium knowlesi-Stamm H Chromosom 13, komplettes Genom 46,4 46,4 4% 0.24 82%
    AY573057.1 Plasmodium knowlesi Merozoit-Oberflächenprotein 4 (MSP4) – Gen, komplettes cds 46,4 46,4 3% 0.24 90%
    Ad 20393.16 Mus musculus Chromosom 7, Klon RP24-312B12, komplette Sequenz 46,4 46,4 3% 0.24 89%
    AL357510.17 Humane DNA-Sequenz vom Klon RP11-195F21 auf Chromosom 10, enthält das 5'-Ende eines neuen Gens, komplette Sequenz 46,4 46,4 4% 0.24 85%
  • 3). KG_Fragment 45
  • Das KG_Fragment 45/Mais EST 57894155.f01 codiert ein Protein, das homolog zu einem hypothetischen Protein Os06g0473800 von Reis ist (GenBank-Eintrag: NP_001057629). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 8 dargelegt. Tabelle 8. BLASTX-Suchergebnisse von KG_Fragment 45/Hyseq EST 57894155.f01
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    NP_001057629 Os06g0473800 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 176 1e-42 60
    EAZ00929 hypothetisches Protein OsI_022161 [Oryza sativa (Indica-Kuti vargruppe)] 172 2e-41 66
    AAG01171 Samen-Oleosin-Isoform 1 [Fagopyrum esculentum] 97 1e-18 40
    AAG09751 Oleosin [Perilla frutescens] 91 6e-17 36
    AAG24455 19 kDa-Oleosin [Perilla frutescens] 91 8e-17 36
    AAB58402 15,5 kDa-Oleosin [Sesamum indicum] 90 1e-16 45
    AAB24078 Lipidkörper-Membranprotein [Daucus carota] 89 2e-16 42
    CAA57994 Oleosin mit hohem Molekulargewicht [Hordeum vulgare subsp. Vulgare] 89 2e-16 48
    AAG23840 Oleosin [Sesamum indicum] 89 3e-16 37
    ABW90149 Oleosin 2 [Jatropha curcas] 88 5e-16 35
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 45 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 29 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 47 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von KG45
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 45-Gens als der Promotor p-KG45 definiert.
  • Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von 57894155.f_o1 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Die Reverses-Komplement-Sequenz von einer genomischen Mais-DNA-Sequenz AZM5_29112 (2548 bp) wurde identifiziert (SEQ ID NR.: 83).
  • Diese 2548 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu KG_Fragment 45 entsprechenden Gen und etwa 1,2 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens.
  • Isolierung der Promotorregion von KG45 mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 00950001
    Das erwartete 1131 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG45 (p-KG45) bezeichnet. Die Sequenz von p-KG45 ist in SEQ ID NR.: 11 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG45
  • Die besten 15 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9. BlastN-Ergebnisse von p_KG45
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    EU976834.1 Zea mays, Klon 991429, unbekannte mRNA 59 59 2% 5,00E-05 100%
    CU634021.8 Zebrafish DNA-Sequenz vom Klon CH73-96B22 in Kopplungsgruppe 20, komplette Sequenz 53,6 53,6 4% 0,002 85%
    AC158582.2 Mus musculus Chromosom 7, Klon RP24-173K12, komplette Sequenz 51,8 51,8 4% 0,007 83%
    AC102506.9 Mus musculus Chromosom 1, Klon RP24-139E15, komplette Sequenz 51,8 51,8 4% 0,007 80%
    AC114988.21 Mus musculus Chromosom 7, Klon RP23-207N5, komplette Sequenz 51,8 51,8 4% 0,007 83%
    AY105760.2 Zea mays PCO070107 mRNA-Sequenz 50 50 2% 0.025 100%
    DQ485452.1 Homo sapiens Proteinkinase D1 (PRKD1)-Gen, komplettes cds 50 50 3% 0.025 89%
    AC102004.7 Mus musculus Chromosom 15, Klon RP24-489M6, komplette Sequenz 50 50 4% 0.025 82%
    AC158556.9 Mus musculus Chromosom 15, Klon RP23140F20, komplette Sequenz 50 50 4% 0.025 82%
    AC111275.4 Rattus norvegicus 4 BAC CH23049L22 (Children's Hospital Oakland Research Institute) komplette Sequenz 50 50 5% 0.025 78%
    AC097745.8 Rattus norvegicus 3 BAC CH230-11N5 (Children's Hospital Oakland Research Institute) komplette Sequenz 50 50 4% 0.025 80%
    AL356756.4 Humane Chromosom 14 DNA-Sequenz BAC C-250316 aus Bibliothek CalTech-D vom Chromosom 14 von Homo sapiens (Mensch), komplette Sequenz 50 50 3% 0.025 89%
    AL445884.4 Humane Chromosom 14 DNA-Sequenz BAC R-419C10 aus Bibliothek RPCI-11 vom Chromosom 14 von Homo sapiens (Mensch), komplette Sequenz 50 50 3% 0.025. 89%
    AC199142.9 Canis familiaris, Klon XX-240A15, komplette Sequenz 48,2 48,2 4% 0.087 82%
    AC182436.1 Mus musculus Chromosom 5, Klon wi1-1982K15, komplette Sequenz 48,2 48,2 4% 0.087 81%
  • 4). KG_Fragment 46
  • Das KG_Fragment 46/Mais EST 62096689.f01 codiert ein Protein, das zu einem Reisprotein der Cupin-Familie homolog ist (GenBank-Eintrag: ABF95817.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, welche in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 10. dargelegt. Tabelle 10. BLASTX-Suchergebnisse von KG_Fragment 26/Hyseq EST 62096689.f01
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    ABF95817.1 Protein der Cupin-Familie, exprimiert [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 313 1,00E-98 76
    ABK80758.1 7S Globulin-Vorläufer [Ficus pumila var. awkeotsang] 294 4,00E-90 67
    NP_001050038.1 0s03g0336100 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 313 1,00E-98 76
    CAO43605.1 unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera] 280 5,00E-87 63
    BAA06186.1 präproMP27-MP32 [Cucurbita cv. Kurokawa Amakuri] 278 6,00E-87 61
    AAT40548.1 Putatives Vicilin, identisch [Solanum demissum] 291 5,00E-84 61
    CAN60323.1 hypothetisches Protein [Vitis vinifera] 263 7,00E-82 63
    AAC15238.1 Globulin-artiges Protein [Daucus carota] 250 4,00E-76 57
    NP_180416.1 Protein der Cupin-Familie [Arabidopsis thaliana] 253 5,00E-76 61
    ABD33075.1 Cupin-Region [Medicago truncatula] 249 2,00E-72 55
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 46 entspricht, ist in der SEQ ID NR. 30 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR. 48 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von KG46
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 46-Gens als der Promotor p-KG46 definiert.
  • Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von 62096689.f_o1 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_23539 (2908 bp) wurde identifiziert (SEQ ID NR.: 84). Diese 2908 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu KG_Fragment 24 entsprechenden Gen und etwa 600 bp Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens (SEQ ID NR.: 84).
  • Isolierung der Promotorregion von KG46 mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 00990001
    Das erwartete 563 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG46 (p-KG46) bezeichnet. Die Sequenz von p-KG46 ist in der SEQ ID NR.: 12 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG46
  • Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11. BlastN-Ergebnisse von p_KG46
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    EU953111.1 Zea mays, Klon 1383292, unbekannte mRNA 156 156 15% 1,00E-34 100%
    AY105246.1 Zea mays PCO130570, mRNA-Sequenz 138 138 13% 3,00E-29 100%
    EU971630.1 Zea mays Klon 368362, unbekannte mRNA 122 122 37% 2,00E-24 75%
    AY455286.1 Zea mays Chloroplasten-Phytoen-Synthase (Y1) Gen, komplettes cds; nukleares Gen für Chloroplasten-Produkt 107 107 22% 5,00E-20 81%
    EU968175.1 Zea mays Klon 316213, unbekannte mRNA 64,4 64,4 11% 5,00E-07 85%
    AY664417.1 Zea mays-Kultivar, Mo17 Locus 9002, komplette Sequenz 46,4 46,4 24% 0.15 71%
    AP008213.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) genomische DNA, Chromosom 7 44,6 44,6 8% 0.51 81%
    EU970588.1 Zea mays Klon 347636, unbekannte mRNA 42,8 42,8 6% 1.8 89%
    EU958640.1 Zea mays Klon 1706905, unbekannte mRNA 42,8 42,8 5% 1.8 90%
    CP000964.1 Klebsiella pneumoniae, 342, komplett, Genom 42,8 42,8 6% 1.8 88%
  • 5). KG_Fragment 49
  • Das KG_Fragment 49/Mais EST 62158447.f01 codiert ein Protein, das homolog zu einem hypothetischen Protein OsI_010295 von Reis ist (GenBank-Eintrag: EAY89062). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 12 dargelegt. Tabelle 12. BLASTX-Suchergebnisse von KG_Fragment 49/Hyseq EST 62158447.f01
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    EAY89062 hypothetisches Protein OsI_010295 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 1021 0,0 87
    ABF94669 dnaK-Protein, exprimiert [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 1020 0,0 87
    CAN68225 hypothetisches Protein [Vitis vinifera] 776 0,0 65
    CAO71160 unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera] 776 0,0 66
    NP_180771 HSP70T-2; ATP-Bindung [Arabidopsis thaliana] 754 0,0 64
    AAM67201 70kD-Hitzeschockprotein [Arabidopsis thaliana] 749 0,0 64
    ACC93947 Hitzeschockprotein 70 [Hevea brasiliensis] 297 3,00E-78 35
    XP_001785822 Vorausgesagtes Protein [Physcomitrella patens subsp. patens] 289 7,00E-76 35
    XP_001783048 Vorausgesagtes Protein [Physcomitrella patens subsp. patens] 288 1,00E-75 35
    XP_001781229 Vorausgesagtes Protein [Physcomitrella patens subsp. patens] 288 2,00E-75 35
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 49 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 26 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 44 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von KG49
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 49-Gens als der Promotor p-KG49 definiert. Zum Identifzieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von 62001211.f_o1 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Die Reverses-Komplement-Sequenz von einer genomischen Mais-DNA-Sequenz, AZM5_34102 (1719 bp) wurde identifiziert (SEQ ID NR.: 80). Diese 1719 bp große Sequenz enthielt teilweise vorausgesagte CDS von dem zu KG_Fragment 49 entsprechenden Gen und etwa 1,2 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens (SEQ ID NR.: 80).
  • Isolierung der Promotorregion von KG49 mittels PCR-Amplifikation Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01020001
    Das erwartete 1188 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG49 (p-KG49) bezeichnet. Die Sequenz von p-KG49 ist in der SEQ ID NR.: 8 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG49
  • Die 2 pflanzlichen homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 13 dargelegt. Tabelle 13. BlastN-Ergebnisse von p_KG49
    Figure 01020002
  • 6). KG_Fragment 56
  • Das KG_Fragment 56 weist keine Übereinstimmungstreffer bezüglich der BPS-hauseigenen Hyseq EST-Datenbank auf, weist aber eine 100%ige Identität zu einer Sequenz auf, die in der Patentanmeldung, pat_US20040034888A1_3514, offenbart ist.
  • Das KG_Fragment56/pat_US20040034888A1_3514 codiert ein Protein, das homolog zu einem hypothetischen Protein Os02g0158900 von Reis ist (GenBank-Eintrag: NP_001045960.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, welche in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 14 dargelegt. Tabelle 14. BLASTX–Suchergebnisse von KG_Fragment 56
    Figure 01030001
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 56 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 21 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 39 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von KG56
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 56-Gens als der Promotor p-KG56 definiert.
  • Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von 62001211.f_o1 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische DNA-Sequenz-Datenbank PUB_zmdb_Genomsurveyseqs.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz, ZmGSStuc11-12-04.2541.1 (8495 bp), wurde identifiziert (SEQ ID NR.: 75). Die ersten 4,2 kb der ZmGSStuc11-12-04.2541.1-Sequenz enthielten die vorausgesagte CDS von dem zu KG_Fragment 56 entsprechenden Gen und mehr als 2 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens (SEQ ID NR.: 75).
  • Isolierung der Promotorregion von KG56 mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01040001
    Das erwartete 1945 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG56 (p-KG56) bezeichnet. Die Sequenz von p-KG56 ist in der SEQ ID NR.: 3 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG56
  • Die besten 15 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 15 dargestellt. Tabelle 15. BlastN-Ergebnisse von p_KG56
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    EU971086.1 Zea mays Klon 357153, unbekannte mRNA 1088 1895 54% 0 99%
    AP008208.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) genomische DNA, Chromosom 2 437 956 51% 8,00E-119 87%
    AP004843.2 Oryza sativa Japonica-Gruppe genomische DNA, Chromosom 2, BAC-Klon: B1103G11 437 956 51% 8,00E-119 87%
    NM_001052494.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) Os02g0158800 (Os02g0158800) mRNA, komplettes cds 430 975 41% 1,00E-116 87%
    AK119177.1 Oryza sativa Japonica-Gruppe cDNA-Klon: 001037-G06, Voll-Insert-Sequenz 430 975 41% 1,00E-116 87%
    AK065389.1 Oryza sativa Japonica-Gruppe cDNA Klon: J013021B10, Voll-Insert-Sequenz 430 975 41% 1,00E-116 87%
    BT041386.1 Zea mays Volllängen-cDNA Klon ZM_BFc0117N09 mRNA, komplette cds 242 670 41% 4,00E-60 83%
    EU976055.1 Zea mays Klon 509800, unbekannte mRNA 239 659 41% 4,00E-59 82%
    AP008212.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) genomische DNA, Chromosom 6 239 731 43% 4,00E-59 84%
    AP005395.3 Oryza sativa Japonica-Gruppe genomische DNA, Chromosom 6, PAC Klon: P0623A10 239 683 43% 4,00E-59 84%
    NM_001064941.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) Os06g0687400 (Os06g0687400) mRNA, partielles cds 237 663 41% 2,00E-58 83%
    AK072400.1 Oryza sativa Japonica-Gruppe cDNA Klon: J023078C17, Voll-Insert-Sequenz 237 663 41% 2,00E-58 83%
    AK060934.1 Oryza sativa Japonica-Gruppe cDNA Klon: 006201-B09, Voll-Insert-Sequenz 237 656 41% 2,00E-58 83%
    AP001298.1 Arabidopsis thaliana genomische DNA, Chromosom 3, BAC Klon: F20C19 221 406 46% 1,00E-53 77%
    BT009221.1 Triticum aestivum Klon wle1n.pk0074.b4:fis, Voll-Insert mRNA-Sequenz 210 614 41% 2,00E-50 82%
  • 7). KG_Fragment 103
  • Das KG_Fragment 103/Mais EST ZM07MC01323_57619299 codiert ein Mais-Cytochrom P450 78A1-Protein (GenBank-Eintrag: NP_001106069.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, welche in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 16 dargelegt. Tabelle 16. BLASTX–Suchergebnisse von KG_Fragment_103/EST ZM07MC01323_57619299
    Figure 01060001
    Figure 01070001
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 103 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 31 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR.: 49 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von KG103
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 103-Gens als der Promotor p-KG103 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von EST ZM07MC01323_57619299 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische DNA-Sequenz-Datenbank PUB_zmdb_Genomsurveyseqs.nt kartiert. Die Reverses-Komplement-Sequenz von einer genomischen Mais-DNA-Sequenz, ZmGSStuc11-12-04.9475.1 (5105 bp), wurde identifiziert (SEQ ID NR.: 85). Diese 5105 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu KG_Fragment 103 entsprechenden Gen und etwa 1,2 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodort dieses Gens.
  • Isolierung der Promotorregion von KG103 mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01070002
    Das erwartete 991 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG103 (p-KG103) bezeichnet. Die Sequenz von p-KG103 ist in der SEQ ID NR.: 13 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG 103
  • Die besten 25 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 17 dargelegt. Tabelle 17. BlastN-Ergebnisse von p_KG103
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    AC157319.2 Zea mays Klon ZMMBBb-136E2, komplette Sequenz 1079 3747 66% 0 96%
    AY530952.1 Zea mays unbekannt (Z576C20.2), putative Hämoxygenase 1 (Z576C20.3), Anthocyanin-Biosyntheseregulatorisches Protein PI1_B73 (Z576C20.4), putative Wachstumregulierende Faktor 1 (Z576C20.6), und putative Aminoalkoholphosphotransferase (Z576C20.14)-Gene, komplette cds; und putatives Rezeptorproteinkinase (Z576C20.21)-Gen, partielle cds 1068 2126 66% 0 96%
    EU952200.1 Zea mays-Klon 1221105, unbekannte mRNA 1058 1058 66% 0 95%
    EU338354.1 Zea mays-Kultivar W22 bz-Gen Locus, komplette Sequenz 1050 5123 68% 0 95%
    AF391808.3 Zea mays-Kultivar McC bz Locus-Region 1050 5117 68% 0 95%
    AC165176.2 Zea mays Klon ZMMBBb-177G21, komplette Sequenz 1031 1.20E+04 66% 0 94%
    AY883559.2 Zea mays-Kultivar Inzuchtlinie 673, Teosinte-glume-Architektur 1 (tga1)-Gen, komplette cds 1018 3526 66% 0 94%
    AF466646.1 Zea mays putatives Transposase (Z195D10.1)-Gen, partielle cds; Glycyl-tRNA-Synthetase (Z195D10.2), Ornithin-Carbamoyltransferase (Z195D10.3), putatives gag-Protein (Z195D10.5), putativer SET-Domäne-Transkriptionsregulator (Z195D10.7), putatives Oxysterol-bindendes Protein (Z195D10.8), putatives Polyprotein (Z195D10.9), putatives Oxysterol-bindendes Protein (Z195D10.10), putatives gag-pol-Polyprotein (Z195D10.11), putative Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-kinase (Z195D10.12), hypothetisches Protein (Z195D10.15), putatives gag-pol-Polyprotein (Z195D10.16), putatives Polyprotein (Z195D10.17), putatives Retrotransposonprotein (Z195D10.18), und prpol (Z195D10.19)-Gene, komplette cds; und putatives ”Teosinte branched2” (Z195D10.20)-Gen, partielle cds 1007 1007 66% 0 94%
    AC152495.1 Zea mays BAC Klon Z486N13, komplette Sequenz 1003 1984 66% 0 94%
    AF123535.1 Zea mays Alkohol-Dehydrogenase 1 (adh1)-Gen, adh1-F-Allel, komplette cds 991 1964 67% 0 93%
    AY691949.1 Zea mays Alkohol-Dehydrogenase 1 (adh1A)-Gen, komplette cds; Fourf copia_LTR- und Huck gypsy_LTR-Retrotransposons, komplette Sequenz; Opie2 copia_LTR-Retrotransposon Zeon gypsy_LTR und Opie1 copia_LTR-Retrotransposons, komplette Sequenz; Ji copia_LTR-Retrotransposon, komplette Sequenz; und unbekanntes Protein (adh1B), cyclin H-1 (adh1C), unbekanntes Protein (adh1D), hypothetisches Protein (adh1E), und unbekanntes Protein (adh1F)-Gene, komplette cds 991 1970 67% 0 93%
    DQ417752.1 Zea mays B73 Pathogenese-bezogenes Protein 2 und GASA-like Protein-Gene, komplette cds 984 5530 66% 0 93%
    AF050440.1 Zea mays-Retrotrans-poson Huck-2 3' LTR, partielle Sequenz 982 982 66% 0 93%
    DQ002408.1 Zea mays gypsy-Retrotransposon Huck, und Copia-Retrotransposon ji, komplette Sequenz; und Helitron Mo17_14594, komplette Sequenz 976 3501 66% 0 93%
    U68404.1 Zea mays, Retrotransposon Huck-2 5'-LTR- und Primerbindungstelle-DNA-Sequenz 973 973 66% 0 93%
    AY530950.1 Zea mays-Gene für putatives Zinkfingerprotein (Z438D03.1), unbekannt (Z438D03.5), epsilon-COP (Z438D03.6), putative Kinase (Z438D03.7), unbekannt (Z438D03.25), und C1B73 (Z438D03.27), komplette cds 971 4162 67% 0 93%
    AC160211.1 Genomische Sequenz für Zea mays-BAC-Klon ZMMBBb0448F23, komplette Sequenz 969 4518 66% 0 93%
    AC157487.1 Genomische Sequenz für Zea mays-Klon ZMMBBb0614J24, aus Chromosom 8, komplette Sequenz 966 6419 66% 0 93%
    AY530951.1 Zea mays, putative Wachstumregulierender-Faktor 1 (Z214A02.12)-, putatives 40S-ribosomales-Protein-S8 (Z214A02.25)- und putative Caseinkinase I (Z214A02.27)-Gene, komplette cds 964 4254 66% 0 93%
    AY664416.1 Zea mays-Kultivar Mo17, Locus bz, komplette Sequenz 958 3019 66% 0 92%
    AY555142.1 Zea mays BAC-Klon c573F08, komplette Sequenz 951 2719 66% 0 92%
    AY664419.1 Zea mays-Kultivar Mo17-Locus 9009, komplette Sequenz 951 4061 66% 0 92%
    AC165174.2 Zea mays-Klon ZMMBBb-127F19, komplette Sequenz 921 1836 66% 0 91%
    AC165173.2 Zea mays-Klon ZMMBBb-125019, komplette Sequenz 921 2326 66% 0 91%
    DQ493649.1 Zea mays-Kultivar Coroico, bz-Locus-Region 915 3472 66% 0 91%
  • 8). KG_Fragment 119
  • Das KG_Fragment 119/Mais EST ZM07MC15086_59463108 codiert ein Protein, das homolog zu einem hypothetischen Protein Os09g0433900 von Reis ist (GenBank-Eintrag: NP_001063248). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert wurden, sind in Tabelle 18 dargestellt. Tabelle 18. BLASTX-Suchergebnisse von KG_Fragment 119/Hyseq EST ZM07MC15086 59463108
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    NP_001063248 Os09g0433900 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 696 0,0 67
    EAZ09214 hypothetisches Protein OsI_030446 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 657 0,0 67
    EAZ44840 hypothetisches Protein OsJ_028323 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 611 e-173 61
    AAV64199 putative Alanin-Aminotransferase [Zea mays] 571 e-161 56
    AAV64237 putative Alanin-Aminotransferase [Zea mays]. 570 e-160 56
    BAC79995 putative Alanin-Aminotransferase [Oryza sativa Japonica-Gruppe] 559 e-157 60
    EAZ40671 hypothetisches Protein OsJ_024154 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 556 e-156 58
    EAZ04721 hypothetisches Protein OsI_025953 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 555 e-156 58
    CA045546 unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera] 555 e-156 58
    CAA49199 Alanin-Aminotransferase [Panicum miliaceum] 553 e-155 57
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 119 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 32 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 50 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von KG119
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 119-Gens als der Promotor p-KG119 definiert.
  • Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM07MC15086_59463108 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz, AZM5_10092 (8208 bp, SEQ ID NR.: 86) wurde identifiziert. Die Reverses-Komplement-Sequenz dieser Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu KG_Fragment 119 entsprechenden Gen und mehr als 2 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens (SEQ ID NR.: 86).
  • Isolierung der Promotorregion von KG119 mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01140001
    Das erwartete 2519 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG119 (p-KG119) kommentiert. Die Sequenz von p-KG119 ist in der SEQ ID NR.: 14 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG119
  • Die besten 15 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 19 dargelegt. Tabelle 19. BlastN-Ergebnisse von p_KG119
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    EU966511.1 Zea mays Klon 294961, unbekannte mRNA 821 1032 23% 0 99%
    AF215823.2 Zea mays T-Cytoplasma, männlicher Sterilitäts-Restaurier-Faktor 2 (rf2a)-Gen, rf2a-B73 Allel, komplettes cds 545 545 15% 3,00E-151 92%
    AC157977.1 Genomische Sequenz für Zea mays-Chromosom 8 BAC Klon ZMMBBb0284N04, komplette Sequenz 535 535 15% 5,00E-148 91%
    EU957455.1 Zea mays, Klon 1592915 unbekannte mRNA 531 531 14% 6,00E-147 92%
    AY662985.1 Zea luxurians YZ1 (yz1) Gen, komplettes cds; Transposons mPIF-artiges Element und „Frequent flyer”, komplette Sequenz; und NADPH-abhängige Reduktase (a1)-Gen, partielle cds 504 716 21% 9,00E-139 89%
    AC165178.2 Zea mays, Klon ZMMBBb-272P17, komplette Sequenz 497 497 14% 1,00E-136 90%
    EF659468.1 Zea mays, Klon BAC b0288K09 AP2-Domäne, Transkriptionsfaktor (Rap2.7)-Gen, partielle cds 484 621 14% 8,0dE-133 90%
    AJ005343.1 Zea mays Ama-Gen, codierend Einzel-Untereinheit-RNA-Polymerase 464 464 14% 8,00E-127 89%
    AC165171.2 Zea mays, Klon CH201145P10, komplette Sequenz 462 462 15% 3,00E-126 87%
    AF466646.1 Zea mays putatives Transposase (Z195D10.1)-Gen, partielle cds; Glycyl-tRNA-Synthetase (Z195D10.2), Ornithin-Carbamoyltransferase (Z195D10.3), putatives gag-Protein (Z195D10.5), putative SET-Domäne transkriptionaler Regulator (Z195D10.7), putatives Oxysterolbindendes Protein (Z195D10.8), putatives Polyprotein (Z195D10.9), putatives Oxysterolbindendes Protein (Z195D10.10), putatives gag-pol-Polyprotein (Z195D10.11), putative Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-kinase (Z195D10.12), hypothetisches Protein (Z195D10.15), putatives gag-pol-Polyprotein (Z195D10.16), putatives Polyprotein (Z195D10.17), putatives Retrotransposon-Protein (Z195D10.18), und prpol (Z195D10.19)-Gene, komplette cds; und putatives ”Teosintbranched2”(Z195D10.20)-Gen, partielle cds 461 606 14% 9,00E-126 87%
    AY789036.1 Zea mays subsp. parviglumis, floricaula/leafy-like 2 (zfl2)-Gen, komplette cds 461 461 14% 9,00E-126 88%
    AC165174.2 Zea mays, Klon ZMMBBb-127F19, komplette Sequenz 459 959 19% 3,00E-125 88%
    AF448416.1 Zea mays 673 Chromosom 9S bz genomische Region 459 459 14% 3,00E-125 87%
    AF416310.1 Zea mays, Klon mPIF268 mPIF miniatur-invertiertes-Repeat-transponierbares Element 459 459 14% 3,00E-125 88%
    DQ493647.1 Zea mays-Kultivar NalTel bz–Locus-Region 453 453 14% 1,00E-123 86%
  • 9). KG_Fragment 129
  • Das KG_Fragment 129/Mais EST 62092959.f01 codiert ein Protein, das homolog zu einem unbekannten Mais-Protein ist (GenBank-Eintrag: ACF78165.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in Tabelle 20 dargelegt. Tabelle 20. BLASTX-Suchergebnisse vom KG_Fragment 129/Hyseq EST 62092959.f01
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    ACF78165.1 unbekannt [Zea Mays]. 513 e-143 91
    ACF83516.1 unbekannt [Zea mays] 401 e-110 69
    ACF86030.1 unbekannt [Zea mays] 243 7e-96 69.
    ACF78865.1 unbekannt [Zea mays] 243 1e-84 69
    EAY82651.1 hypothetisches Protein OsI_036610 129 3e-42 45
    NP_001066495.1 Os12g0247700 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 121 1e-39 44
    NP_001066367.1 Os12g0198700 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 88 2e-35 47
    ABE11623.1 unbekannt [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 102 6e-34 41
    ABS82785.1 Jasmonat-induziertes Protein [Triticum aestivum] 92 1e-32 51
    AAR20919.1 Jasmonat-induziertes Protein [Triticum aestivum] 91 3e-32 50
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das dem KG_Fragment 129 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 22 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 40 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von KG129
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorausgesagten KG_Fragment 129-Gens als der Promotor p-KG129 definiert.
  • Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von 62092959.f_o1 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_91706 (2131 bp) wurde identifiziert (SEQ ID NR.: 76). Diese 2131 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu KG_Fragment 129 entsprechenden Gen und etwa 600 bp Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens.
  • Isolierung der Promotorregion von KG129 mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01170001
    Das erwartete 512 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert, und als Promotor KG129 (p-KG129) kommentiert. Die Sequenz von p-KG129 ist in der SEQ ID NR.: 4 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_KG129
  • Die besten 20 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 21 aufgeführt. Tabelle 21. BlastN-Ergebnisse von p_KG129
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    EU241905.1 Zea mays ZCN14 (ZCN14)-Gen, komplettes cds 230 353 38% 6,00E-57 86%
    AY682272.1 Zea mays subsp. mexicana, ”Fruchtloser Stiel”- bzw. barrenstalk-1-Gen, Promotorregion I 228 465 37% 2,00E-56 86%
    AY682271.1 Zea mays subsp. mexicana, ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 228 465 37% 2,00E-56 86%
    AY682262.1 Zea mays, ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 228 459 37% 2,00E-56 86%
    AY682258.1 Zea mays ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 228 459 37% 2,00E-56 86%
    AY682256.1 Zea mays, ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 228 459 37% 2,00E-56 86%
    AY743721.1 Zea mays subsp. parviglumis Kultivar INIFAP-JSG 374, ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotor I-Region 228 459 37% 2,00E-56 86%
    AY682254.1 Zea mays ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 224 455 37% 2,00E-55 86%
    AY743723.1 Zea mays subsp. parviglumis Kultivar CIMMYT-11355, ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotor I-Region 215 283 37% 1,00E-52 85%
    AY753906.1 Zea mays subsp. parviglumis ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotor I-Region 206 206 37% 6,00E-50 84%
    AY683001.1 Zea mays Kultivar B73 ”Fruchtloser Stiel” 1 (BA1)-Gen, komplette cds 201 527 38% 3,00E-48 85%
    AY682281.1 Zea mays subsp. parviglumis ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion 199 541 37% 9,00E-48 85%
    AY682274.1 Zea mays subsp. parviglumis ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion 199 525 37% 9,00E-48 85%
    AY682273.1 Zea mays subsp. parviglumis ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion 199 525 37% 9,00E-48 85%
    AY682270.1 Zea mays subsp. mexicana ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion 199 525 37% 9,00E-48 85%
    AY682269.1 Zea mays subsp. mexicana ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 199 525 37% 9,00E-48 85%
    AY682268.1 Zea mays ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 199 525 37% 9,00E-48 85%
    AY682267.1 Zea mays ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 199 525 37% 9,00E-48 85%
    AY682266.1 Zea mays ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 199 525 37% 9,00E-48 85%
    AY682265.1 Zea mays ”Fruchtloser Stiel”-1 Gen, Promotorregion I 199 525 37% 9,00E-48 85%
  • BEISPIEL 5:
  • PLACE-ANALYSE VON DEN PROMOTOREN
  • Cis-wirkende Motive in den Promotorregionen wurden unter Anwendung von PLACE (einer Datenbank von pflanzlichen Cis-wirkenden regulatorischen DNA-Elementen) identifiziert, wobei die Genomatix-Datenbank-Suite verwendet wurde.
  • 1.) p-KG24
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG24 sind in der Tabelle 22 aufgelistet. Kein TATA-Box-Motiv wurde in diesem Promotor gefunden, jedoch gibt es 2 CAAT-Box-Motive an der Nukleotidposition 191–195 bzw. 247–251 des Vorwärts-Strangs. Diese CAAT-Box-Motive liegen distal von dem 3'-Ende des Promotors und können deshalb keine funktionellen Motive sein. Tabelle 22. PLACE–Analyseergebnisse des 1507 bp-Promotors von p-KG24
    Figure 01200001
    Figure 01210001
    Figure 01220001
  • 2.) p-KG37
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG37 sind in der Tabelle 23 aufgelistet, weder TATA-Box- noch CAAT-Motive werden in diesem Promotor gefunden. Tabelle 23. PLACE-Analyseergebnisse von dem 910 bp-Promotor von p-KG37
    Figure 01220002
    Figure 01230001
    Figure 01240001
  • 3.) p-KG45
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG45 sind in der Tabelle 24 aufgelistet. Drei TATA-Box-Motive werden an der Nukleotidposition 310–316, 312–318 bzw. 1065–1071 des Vorwärts-Strangs gefunden. Ein CAAT-Box-Motiv wird an der Nukleotidposition 976–980 des Vorwärts-Strangs gefunden, welches das funktionelle Motiv sein kann, das mit der. TATA-Box an der Position 1065–1071 arbeitet, um die transkriptionelle Initiation zu erleichtern. Tabelle 24. PLACE-Analyseergebnisse des 1131 bp-Promotors von p-KG45
    Figure 01240002
    Figure 01250001
    Figure 01260001
  • 4.) p-KG46
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG46 sind in der Tabelle 25 aufgelistet, weder TATA-Box- noch CAAT-Motive werden in diesem Promotor gefunden. Tabelle 25. PLACE-Analyseergebnisse des 563 bp-Promotors von p-KG46
    Figure 01260002
    Figure 01270001
  • 5.) p-KG49
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG49 sind in Tabelle 26 aufgelistet. Ein TATA-Box-Motiv wird an der Nukleotidposition 803–809 des Vorwärts-Strangs gefunden, und ein CAAT-Box-Motiv wird an der Nukleotidposition 472–476 auf dem Rückwärts-Strang gefunden. Tabelle 26. PLACE-Analyseergebnisse des 11 88 bp-Promotors von p-KG49
    Figure 01280001
    Figure 01290001
  • 6.) p-KG56
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG56 sind in Tabelle 27 aufgelistet. Zwei TATA-Box-Motive werden an der Nukleotidposition 729–735 bzw. 1900–1906 des Vorwärts-Strangs gefunden. Ein CAAT-Box-Motiv wird an der Nukleotidposition 599–603 des Rückwärts-Strangs gefunden. Tabelle 27. PLACE-Analyseergebnisse des 1188 bp-Promotors von p-KG56
    Figure 01290002
    Figure 01300001
    Figure 01310001
    Figure 01320001
    Figure 01330001
  • 7.) p-KG103
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG103 sind in der Tabelle 28 aufgelistet. Zwei TATA-Box-Motive werden an der Nukleotidposition 879–888 bzw. 880–886 des Vorwärts-Strangs gefunden. Es wird kein CAAT-Box-Motiv gefunden. Tabelle 28. PLACE-Analyseergebnisse von dem 992 bp-Promotor von p-KG103
    Figure 01330002
    Figure 01340001
    Figure 01350001
  • 8.) p-KG119
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG119 sind in der Tabelle 29 aufgelistet. Zwei TATA-Box-Motive werden an der Nukleotidposition 1925–1931 bzw. 1998–2004 des Vorwärts-Strangs gefunden. Ein CAAT-Box-Motiv wird an der Nukleotidposition 214-218 des Vorwärts-Strangs gefunden. Tabelle 29. PLACE-Analyseergebnisse von dem 2519 bp-Promotor von p-KG119
    Figure 01350002
    Figure 01360001
    Figure 01370001
    Figure 01380001
    Figure 01390001
  • 9.) p-KG129
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-KG129 sind in der Tabelle 30 aufgelistet. Keine TATA-Box-Motive werden in diesem Promotor gefunden. Ein CAAT-Box-Motiv wird an der Nukleotidposition 244–248 des Vorwärtsstrangs gefunden. Tabelle 30. PLACE-Analyseergebnisse von dem 512 bp-Promotor von p-KG129
    Figure 01390002
    Figure 01400001
  • BEISPIEL 6:
  • BINÄRVEKTORKONSTRUKTION ZUR MAISTRANSFORMATION, UM DIE FUNKTION DER PROMOTOREN ZU EVALUIEREN
  • Zur Erleichterung der Subklonierung wurden die Promotorfragmente von KG24, 37, 45, 46, 49, 103, 119, 129 durch die Addition einer PacI-Restriktionsenzymsstelle (für p_KG24, p_KG37, p_KG45, p_KG46, p_KG49, p_KG103, p_KG119, p_KG129) oder einer NotI (für p_KG56) an ihrem 5'-Ende und einer NotI-Stelle (für p_KG24, p_KG103, p_KG129) oder einer BslWI-Stelle (für p_KG37, p_KG45, p_KG46, p_KG49, p_KG56) an ihrem 3'-Ende modifiziert. Das PacI-pKG37 (oder 45, 46, 49)-BslWI-, oder PacI-pK24 (oder 103, 119)-Note oder NotI-pKG56-BslWI-Promotorfragment wurde verdaut und in einen mit entsprechendem Enzym verdauten basalen BPS-Binärvektor HF84 ligiert. HF84 umfasst eine Pflanzen-selektierbare Marker-Expressionskassette (p-Ubi::c-EcEsdA::t-OCS3) sowie eine Promotor-Evaluierungskassette, die aus einer Mehrfachklonierungsstelle (MCS) zur Promotor-Insertion und dem Reis-MET1-1-Intron zur Bereitstellung von Intron-vermittelter Verstärkung in monokotylen Zellen, dem GUS-Reportergen und dem NOS-Terminator besteht. Das Diagram von HF84 ist in der 2A gezeigt. Das p-KG129-Fragment wurde in ein Binärvektor-Gerüst RCB1O06 (2B) durch Gateway-Reaktion kloniert.
  • Die Tabelle 31 listet den resultierenden Binärvektor der KG-Promotoren auf. Die Sequenzen der Promotor-Kassetten in den Binärvektoren sind in den SEQ ID NR.: 57, 58 und 62–68 gezeigt Tabelle 31. Binärvektoren von den KG-Promotoren zur Maistransformation
    Promotor ID Vektor ID Beschreibung SEQ ID des VEKTORS
    p-KG24 RHF155 p-KG24::iMET1::GUS::t-NOS 63
    p-KG37 RKF109 p-KG37::iMET1::GUS::t-NOS 64
    p-KG45 RKF106 p-KG45::iMET1::GUS::t-NOS 65
    p-KG46 RKF107 p-KG46::iMET1::GUS::t-NOS 66
    p-KG49 RKF108 p-KG49::iMET1::GUS::t-NOS 62
    p-KG56 RKF125 p-KG56::iMET1::GUS::t-NOS 57
    p-KG103 RHF128 p-KG103::iMET1::GUS::t-NOS 67
    p-KG119 RHF138 p-KG119::iMET1::GUS::t-NOS 68
    p-KG129 RTP1047 p-KG129::iMET1::GUS::t-NOS 58
  • BEISPIEL 7:
  • PROMOTOR-EVALUIERUNG IN TRANSGENEM MAIS MIT DEN KG-PROMOTOREN
  • Expressionsmuster und -spiegel, angetrieben durch die KG-Promotoren, wurden unter Anwendung der histochemischen GUS-Analyse gemessen, und zwar unter Nachvollziehen des Protokolls im Fachbereich (Jefferson 1987). Die Maistransformation wurde unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems durchgeführt. Zehn und fünf Einzelkopie-Ereignisse für T0- und T1-Pflanzen wurden für die Promotoranalyse ausgewählt.
  • Die GUS-Expression wurde bei verschiedenen Entwicklungsstadien gemessen:
    • 1) Wurzeln und Blattwerk im 5-Blatt-Stadium
    • 2) Stengel im V-7-Stadium
    • 2) Blattwerk, Hüllblatt und Griffelfäden im Blühstadium (erstes Auftreten von Maisgriffelfäden)
    • 3) Ährchen/Quaste (bei Bestäubung)
    • 5) Kolben oder Körner bei 5, 10, 15, 20 und 25 Tagen nach der Bestäubung (DAP).
  • Die Ergebnisse zeigten an, dass alle diese 9 Promotoren spezifisch in Pollen und in Embryo exprimierten (4 bis 11).
  • BEISPIEL 8:
  • IDENTIFIZIEREN VON MA-TRANSKRIPTKANDIDATEN
  • Eine Mikroarray-Untersuchung wurde durchgeführt, um Transkripte mit Gesamtsamen-spezifischer und/oder Embryo-spezifischer Expression in Mais zu identifizieren, wobei eine Batterie von RNA-Proben aus 23 Maisgeweben, erzeugt von BASF, verwendet wurde (Tabelle 32). Die dreiundzwanzig markierten RNAs aus diesen Maisgeweben wurden separat an 23 von unseren maßgefertigt entworfenen BPS Mais-Affymetrix-Chips hybridisiert, mit fluoreszentem Streptavidin-Antikörper markiert, gewaschen, gefärbt und gescannt, wie gemäß der Anleitung im Technischen Handbuch der ”Affymetrix Expression Analysis”.
    Tabelle 32. Maisgewebe, die für das mRNA-Expressionsprofilingexperiment verwendet werden
    Probe Nr. Gewebe Timing und Anzahl und Pflanzen Tage nach der Bestäubung
    1 Wurzel 9 am (4 Pflanzen) 5
    2 9 am (4 Pflanzen) 15
    3 9 am (4 Pflanzen) 30
    4 Blatt oberhalb des Kolbens 9 am (6 Pflanzen) 5
    5 9 am (6 Pflanzen) 15
    6 9 am (6 Pflanzen) 30
    7 Kolben komplett 9 am (6 Pflanzen) 5
    8 9 am (6 Pflanzen) 10
    9 Gesamtsamen 9 am (6 Pflanzen) 15
    10 9 am (6 Pflanzen) 20
    11 9 am (6 Pflanzen) 30
    12 Endosperm 9 am (6 Pflanzen) 15
    13 9 am (6 Pflanzen) 20
    14 9 am (6 Pflanzen) 30
    15 Embryo 9 am (6 Pflanzen) 15
    16 9 am (6 Pflanzen) 20
    17 9 am (6 Pflanzen) 30
    18 Weibl. Stempelblüte 6 Pflanzen Vor der Bestäubung
    19 Keimende Samen 20 Samen Tränken während 3 Tagen
    20 Wurzel, vev. Zustand V2
    21 Wurzel, veg. Zustand V4
    22 Blatt, veg. Zustand V2
    23 Blatt, veg. Zustand V4
    am = vormittags
  • Die Chip-Hybridisierungs-Daten wurden unter Verwendung von Gendata Specialist-Software analysiert, und relative Expressions-Spiegel wurden basierend auf der Hybridisierungssignal-Intensität von jedem Gewebe bestimmt. Acht der BPS Mais-Chip-Sondensätze wurden als Kandidatentranskripte ausgewählt, welche 3–8-fach höhere Expression in Gesamtsamen und/oder in Embryo im Vergleich zu anderen Geweben zeigten. Entsprechende Transkripte von diesen Sondensätzen wurden als MAWS23, MAWS27, MAWS30, MAWS57, MAWS60, MAWS63, MAEM1 und MAEM20 (Tabelle 32-1) bezeichnet. Consensus-Sequenzen der ausgewählten Chip-Sondensätze sind in den SEQ ID NRn. 91, 92, 95–97, 10–107 gezeigt. Tabelle 32-1 Mikroarray-Kandidaten und Sondensätze
    MA-Kandidaten Sondensatz SEQ ID
    MAWS23 ZM1s57912912 105
    MAWS27 ZM3s00207 96
    MAWS30 ZM1a61269071 106
    MAWS57 ZM1s57500283 107
    MAWS60 ZM4s20063 91
    MAWS63 ZM1s62013293 97
    MAEM1 ZM4s09689 92
    MAEM20 ZM1s59153555 95
  • BEISPIEL 9:
  • EXPRESSIONSMUSTER-BESTÄTIGUNG DER MA-KANDIDATEN UNTER VERWENDUNG VON QUANTITATIVER REVERSER-TRANSCRIPTASE-POLYMERASEKETTENREAKTION (Q-RT-PCR)
  • Zum Bestätigen des nativen Expressionsmusters der MA-Kandidaten wurde eine quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (q-RT-PCR) unter Verwendung von Gesamt-RNA, isoliert aus den gleichen Materialien, wie sie für die Chip-Hybridisierung verwendet wurden (Tabelle 32), durchgeführt.
  • Primer für qRT-PCR wurden basierend auf den Consensus-Sequenzen von in Tabelle 2 gezeigten Sondensätzen mit Hilfe des Vektor NTI-Software-Pakets (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) entworfen. Zwei Sätze von Primern wurden für die PCR-Amplifikation für jeden Kandidaten verwendet. Das Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-Gen diente als eine Kontrolle zu Normierungszwecken. Sequenzen von Primern für die q-RT-PCR sind in der Tabelle 32-2 aufgelistet. Tabelle 32-2. Primer-Sequenzen für q-RT-PCR
    Figure 01430001
    Figure 01440001
  • q-RT-PCR wurde unter Verwendung von SuperScript III-Reverser-Transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und von SYBR-Green QPCR Master Mix (Eurogentec, San Diego, CA, USA) in einem ABI Prism 7000-Sequenzdetektions-System durchgeführt. Kurz gesagt, wurde cDNA unter Verwendung von 2–3 μg Gesamt-RNA und 1 μl Reverse Transkriptase in einem Volumen von 20 μl synthetisiert. Die cDNA wurde auf einen Bereich von Konzentrationen (15–20 ng/μl) verdünnt. Dreißig bis vierzig ng cDNA wurden für quantitative PCR (qPCR) in einem Volumen von 30 μl mit SYBR Green QPCR Master-Mix unter Befolgen der Anleitung des Herstellers verwendet. Die Thermozyklierbedingungen waren wie folgt: Inkubieren bei 50°C für 2 Minuten, Denaturieren bei 95°C für 10 Minuten, und Ausführen von 40 Zyklen bei 95°C für 15 Sekunden und 60°C für 1 Minute für die Amplifikation. Nach dem letzten Zyklus der Amplifikation wurde die Dissoziationskurvenanalyse durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Amplifikation spezifisch stattgefunden hatte und dass kein Primerdimerprodukt während des Amplifikationsverfahrens gebildet wurde. Das Haushaltsgen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, Primer-Sequenzen in Tabelle 3) wurde als ein endogenes Referenzgen verwendet, um die Berechnung unter Anwendung des Vergleichs-Ct(”Cycle of threshold”)-Wert-Verfahrens zu normieren. Der ΔCT-Wert wurde durch Subtrahieren des Ct-Werts des GAPDH-Gens von dem Ct-Wert des Kandidatengens erhalten, und die relative Transkriptions-Menge (Expressionsspiegel) der Kandidatengenexpression wurde als 2-ΔCT dargestellt. Die q-RT-PCR-Ergebnisse sind in der 12 zusammengefasst. Alle Kandidaten zeigten ähnliche Expressionsmuster, welche äquivalent zu den Expressionsmustern sind, die aus der Chip-Hybridisierungs-Studie erhalten wurden.
  • BEISPIEL 10:
  • KOMMENTIERUNG UND PROMOTOR-IDENTIFIKATION DER MA-KANDIDATEN
  • Die codierenden Sequenzen der MA-Kandidaten wurden basierend auf In-silico-Ergebnissen kommentiert, die sowohl aus dem BLASTX jeder EST-Sequenz gegen die GenBank-Protein-Datenbank (nr) als auch den Ergebnissen der In-silico-Translation der Sequenz mit Hilfe des Vektor NTI-Softwarepakets erhalten wurden.
  • 1. Kommentierung von MAWS23
  • MAWS23 codiert Lipidkörperchen-assoziiertes Protein 12 (Mais Oleosin 18 kDa) (GenBank-Eintrag: P21641). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Suche identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 33 aufgeführt. Tabelle 33. BLASTX-Suchergebnisse von Mais ZM1s57912912 (MAWS23)
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    P21641 OLEO3 MAIS Oleosin Zr-II (Oleosin 18 kDa) (Lipidkörperassoziiertes Protein 12) 69 4,00E-34 100
    AAA68066.1 17 kDa oleosin 65 5,00E-29 93
    NP_001050984.1 Os03g0699000 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 63 8,00E-20 93
    CAA57994.1 Oleosin mit hohem Molekulargewicht [Hordeum vulgare subsp. vulgare] 60 4,00E-19 86
    AAC02240.1 18 kDa Oleosin [Oryza sativa] 60 5,00E-19 90
    CAN80217.1 hypothetisches Protein [Vitis vinifera] 70 1,00E-09 54
    AAB24078.1 Lipidkörper-Membran-Protein [Daucus carota] 59 9,00E-07 83
    AAG43516.1 AF210696_1 15kD Oleosinartiges Protein 1 [Perilla frutescens] 52 2,00E-06 66
    AAG43517.1 AF210697_1 15kD Oleosinartiges Protein 2 [Perilla frutescens] 52 2,00E-06 66
    CAN80218.1 hypothetisches Protein [Vitis vinifera] 59 2,00E-06 80
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das MAWS23 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 33 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 51 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von MAWS23
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des MAWS23-Gens als der Promotor p-MAWS23 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM1s57912912 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_84556 (2036 bp, SEQ ID NR. 87) wurde identifiziert. Diese 2036 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu MAWS23 entsprechenden Gen und weniger als 0,5 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens. Darüber hinaus wurde eine öffentlich verfügbare Sequenz CL990349 mit AZM5_84556 überlappt. Das Contig aus diesen 2 genomischen Sequenzen, das 1,3 kb Stromaufwärts-Region enthielt; ist in SEQ ID NR.: 87 gezeigt.
  • Isolation der Promotorregion mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01460001
    Das erwartete 1264 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor MAWS23 (p-MAWS23) bezeichnet. Die Sequenz von p-MAWS23 ist in SEQ ID NR.: 15 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_MAWS23
  • Die besten 20 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage von p_MAWS23 identifiziert worden sind, sind in Tabelle 34 angeführt. Tabelle 34. BlastN-Ergebnisse von p_MAWS23
    Figure 01460002
    Figure 01470001
  • 2. Kommentierung von MAWS27
  • MAWS27 codiert ein unbekanntes Mais-Protein (GenBank-Eintrag: ACF80385.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 35 dargelegt. Tabelle 35. BLASTX-Suchergebnisse von Mais ZM3s00207 (MAWS27)
    Figure 01480001
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das MAWS27 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 24 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 42 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von MAWS27
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des MAWS27-Gens als der Promotor p-MAWS27 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM3s00207 auf die firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank von BASF Plant Science, PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt, kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_32720 (2113 bp, SEQ ID NR.: 78) wurde identifiziert. Diese 2113 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu MAWS27 entsprechenden Gen und 1,2 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens. Darüber hinaus wurde eine öffentlich verfügbare Sequenz DX863447 mit AZM5_32720 überlappt. Das Contig aus diesen 2 genomischen Sequenzen, das 1,35 kb Stromaufwärts-Region enthielt, ist in SEQ ID NR.: 78 gezeigt.
  • Isolierung der Promotorregion mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01490001
    Das erwartete 1355 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor MAWS27 (p-MAWS27) bezeichnet. Die Sequenz von p-MAWS27 ist in SEQ ID NR.: 6 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_MAWS27
  • Die besten 20 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage von p-MAWS27 identifiziert worden sind, sind in Tabelle 36 aufgeführt. Tabelle 36. BLASTN–Ergebnisse von p_MAWS27
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    AY072300.1 Zea mays, Cytochrom P450 Monooxygenase-CYP72A5-Gen, komplettes cds 228 443 13% 5,00E-56 90%
    BT042628.1 Zea mays, Volllängen-cDNA, Klon ZM BFb0383P13 mRNA, komplette s cds 215 283 11% 3,00E-52 93%
    BT041400.1 Zea mays, Volllängen cDNA-Klon ZM BFc0115C19 mRNA, komplettes cds 210 273 13% 1,00E-50 89%
    AJ251453.1 Zea mays see2a-Gen für putatives Legumain, Exons 1-9 208 269 11% 5,00E-50 90%
    EU241894.1 Zea mays, ZCN3 (ZCN3)-Gen, komplette cds 199 271 13% 3,00E-47 90%
    EU943068.1 Zea mays Klon 1558247, mRNA-Sequenz 197 265 13% 9,00E-47 93%
    EU953408.1 Zea mays Klon 1408713 unbekannte mRNA 190 255 11% 1,00E-44 93%
    AY662985.1 Zea luxurians YZ1 (yz1) Gen, komplette cds; Transposons mPIF-artiges Element und „frequent flyer”, komplette Sequenz; und NADPH-abhängige Reduktase (a1)-Gen, partielle cds 187 238 13% 2,00E-43 88%
    AJ437282.1 Zea mays ZmEBE-2-Gen für ZmEBE-2-Protein, Exons 1-4 176 176 11% 3,00E-40 85%
    AJ437281.1 Zea mays ZmEBE-1-Gen für ZmEBE-1-Protein, Exons 1-5 169 215 11% 4,00E-38 85%
    AY530950.1 Zea mays, putatives Zinkfingerprotein (Z438D03.1), unbekannt (Z438D03.5), epsilon-COP (Z438D03.6), putative Kinase (Z438D03.7), unbekannt (Z438D03.25) und C1B73 (Z438D03.27)-Gene, komplettes cds 167 .231 13% 2,00E-37 93%
    DQ020097.1 Zea mays Kultivar B73 Inzucht-abberantes Pollentransmissions 1 (apt1)-Gen, komplette cds 165 226 13% 5,00E-37 89%
    AY555143.1 Zea may, BAC Klon c573L14, komplette Sequenz 163 309 13% 2,00E-36 85%
    AY111966.1 Zea mays CL4954_1 mRNA-Sequenz 158 206 10% 8,00E-35 96%
    EU975033.1 Zea mays, Klon 465494, unbekannte mRNA 156 156 11% 3,00E-34 83%
    AF391808.3 Zea mays Kultivar McC bz Lokus-Region 156 272 17% 3,00E-34 82%
    009989.1 Zea mays D3L H(+)-transportierende ATPase(Mha1)-Gen, komplette cds 156 218 11% 3,00E-34 89%
    EU241912.1 Zea mays ZCN21-(ZCN21) Gen, komplette cds 154 204 11% 1,00E-33 84%
    BT039577.1 Zea mays, Volllängen cDNA-Klon ZM BFc0031C07 mRNA, komplette cds 149 197 12% 4,00E-32 83%
    DQ219417.1 Zea mays YZ1 (Yz1A)-Gen, Yz1A-1012M-Allel, partielle cds; und a1-Gen, A1-b alpha-Allel, Transposon Ins2 und cin4-Retrotransposon, komplette Sequenz 149 362 13% 4,00E-32 89%
  • 3. Kommentierung von MAWS30
  • MAWS30 codiert Mais-17KDa-Oleosin (GenBank-Eintrag: AAA68066.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 37 dargelegt. Tabelle 37. BLASTX-Suchergebnisse von dem Mais ZM1a61269071 (MAWS30)
    Figure 01510001
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das MAWS30 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 34 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 52 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von MAWS30
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des MAWS30-Gens als der Promotor p-MAWS30 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM1a61269071 auf die firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank von BASF Plant Science, PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt, kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_84557 (3426 bp) wurde identifiziert. Diese 3426 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu MAWS30 entsprechenden Gen und etwa 0,6 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens. Die Sequenz von AZM5_84557 ist in der SEQ ID NR.: 88 gezeigt.
  • Isolierung der Promotorregion mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:.
    Figure 01520001
    Das erwartete 623 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor MAWS30 (p-MAWS30) bezeichnet. Die Sequenz von p-MAWS30 wurde in der SEQ ID NR.: 16 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_MAWS30
  • Die besten 20 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage von p_MAWS30 identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 38 dargestellt. Tabelle 38. BLASTN–Ergebnisse von p_MAWS30
    Eintrag. Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    U13702.1 Zea mays-Ölkörperchen-Protein-17-kDa-Oleosin (ole17)-Gen, komplette cds 686 686 60% 0 100%
    J05212.1 Mais-Oleosin KD18 (KD18; 12) Gen, komplette cds 187 187 42% 7,00E-44 75%
    AY427563.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) 18-kDa-Oleosin-Gen, Promotorregion 98,7 98,7 18% 3,00E-17 78%
    AF019212.1 Oryza sativa subsp. Indica 18 kDa-Oleosin (ole18)-Gen, komplette cds 98,7 98,7 18% 3,00E-17 78%
    AP008209.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) genomische DNA, Chromosom 3 95,1 95,1 18% 4,00E-16 77%
    AC097368.3 Oryza sativa Chromosom 3 BAC OSJNBb0017F17 genomische Sequenz, komplette Sequenz 95,1 95,1 18% 4,00E-16 77%
    AF369906.1 Sorghum bicolor Klon BAC10J22 Sbb3766 Sequenz 53,6 53,6 8% 0,001 82%
    FJ119498.1 Pinus taeda-Isolat 8102 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119497.1 Pinus taeda-Isolat 8112 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119496.1 Pinus taeda-Isolat 8099 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119495.1 Pinus taeda-Isolat 8105 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119494.1 Pinus taeda-Isolat 8108 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119493.1 Pinus taeda-Isolat 8103 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119492.1 Pinus taeda-Isolat 8100 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119491.1 Pinus taeda-Isolat 8107 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119490.1 Pinus taeda-Isolat 8113 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119489.1 Pinus taeda-Isolat 8101 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119488.1 Pinus taeda-Isolat 8111 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119487.1 Pinus taeda-Isolat 8114 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
    FJ119486.1 Pinus taeda-Isolat 8110 anonymer Locus UMN_CL22Contig1_02 genomische Sequenz 46,4 46,4 6% 0,16 85%
  • 4. Kommentierung von MAWS57
  • MAWS57 codiert ein Protein, das ein Homolog zu einem unbekannten Reis-Protein Os05g0576700 ist (GenBank-Eintrag: NP_001056403.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 39 dargelegt. Tabelle 39. BLASTX-Suchergebnisse von dem Mais ZM1s57500283 (MAWS57)
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    NP_001056403.1 Os05g0576700 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 112 8,00E-33 95
    ABK40507.1 Pollen-Oleosin [Lilium longiflorum] 102 2,00E-26 82
    EAZ35378.1 hypothetisches Protein OsJ_018861 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 112 5,00E-25 95
    AAX49393.1 OLE-5 [Coffea canephora] 92 4,00E-19 81
    CAO68008.1 unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera] 89 2,00E-18 73
    NP_188487.1 Glycin-reiches Protein/Oleosin [Arabidopsis thaliana] 90 6,00E-16 78
    AC187763.1 putatives Oleosin [Cupressus sempervirens] 84 5,00E-14 69
    ACA30297.1 putatives Oleosin [Cupressus sempervirens] 84 5,00E-14 69
    NP_175329.1 Glycin-reiches Protein/Oleosin [Arabidopsis thaliana] 74 5,00E-11 69
    CAN74835.1 hypothetisches Protein [Vitis vinifera] 66 1,00E-08 53
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das MAWS57 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 35 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 55 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von MAWS57
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des MAWS57-Gens als der Promotor p-MAWS57 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM1s57500283 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_16632 (5254 bp) wurde identifiziert. Diese 5254 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu MAWS57 entsprechenden Gen und mehr als 2,5 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens. Sequenzen von AZM5_16632 ist (sind) in SEQ ID NR.: 89 gezeigt.
  • Isolierung der Promotorregion mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01550001
    Das erwartete 1950 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor MAWS57 (p-MAWS57) bezeichnet. Die Sequenz von p-MAWS57 wurde in der SEQ ID NR.: 17 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_MAWS57
  • Die besten 20 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage von p_MAWS57 identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 40 dargelegt. Tabelle 40. BlastN-Ergebnisse von p_MAWS57
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamtergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    AP008217.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) genomische DNA, Chromosom 11 259 415 26% 5,00E-65 81%
    BX000501.4 Oryza sativa-Chromosom 11, BAC OSJNBa0032J07 aus Bibliothek OSJNBa vom Chromosom 11 vom Kultivar Nipponbare von ssp. Japonica von Oryza sativa (Reis), komplette Sequenz 259 415 26% 5,00E-65 81%
    AP008218.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe), genomische DNA, Chromosom 12 179 447 23% 4,00E-41 83%
    BX000494.2 Oryza sativa Chromosom 12, BAC OSJNBa0052H10 aus Bibliothek OSJNBa vom Chromosom 12 vom Kultivar Nipponbare von ssp. Japonica von Oryza sativa (Reis), komplette Sequenz 179 447 23% 4,00E-41 83%
    BX000491.1 Oryza sativa Chromosom 12, BAC OSJNBb0068K19 aus Bibliothek OSJNBb vom Chromosom 12 vom Kultivar Nipponbare von ssp. Japonica von Oryza sativa (Reis), komplette Sequenz 179 447 23% 4,00E-41 83%
    AK242870.1 Oryza sativa Japonica-Gruppe cDNA, Klon: J090076L04, Voll-Insert-Sequenz 176 389 18% 4,00E-40 84%
    NM_001072463.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) Os12g0105300 (Os12g0105300) mRNA, komplettes cds 167 389 18% 2,00E-37 84%
    AK099132.1 Oryza sativa Japonica-Gruppe, cDNA-Klon: J023051M04, Voll-Insert-Sequenz 167 389 18% 2,00E-37 84%
    AK072914.1 Oryza sativa Japonica-Gruppe, cDNA Klon: J023150I16, Voll-Insert-Sequenz 167 389 18% 2,00E-37 84%
    AK062121.1 Oryza sativa Japonica-Gruppe cDNA Klon: 001045-D01, Voll-Insert-Sequenz 167 389 18% 2,00E-37 84%
    AK250796.1 Hordeum vulgare subsp. vulgare cDNA Klon: FLbaf94j01, mRNA-Sequenz 123 323 25% 2,00E-24 84%
    AP008213.1 Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe) genomische DNA, Chromosom 7 111 111 5% 2,00E-20 81%
    AP005768.3 Oryza sativa Japonica-Gruppe genomische DNA, Chromosom 7, BAC-Klon: OSJNBa0039C01 111 111 5% 2,00E-20 81%
    AP005255.4 Oryza sativa Japonica-Gruppe, genomische DNA, Chromosom 7, BAC-Klon: OSJNBb0087F05 111 111 5% 2,00E-20 81%
    AC232448.1 Brassica rapa subsp. pekinensis-Klon KBrB008D15, komplette Sequenz 100 191 9% 3,00E-17 93%
    CT828672.1 Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe) cDNA Klon: OSIGCSA057D18, Voll-Insert-Sequenz 98,7 141 6% 1,00E-16 87%
    AM448932.2 Vitis vinifera zusammenhäng. VV78X114050.3, Gesamt-Genom-Schrotschuss-Sequenz 96,9 177 15% 3,00E-16 79%
    AP010508.1 Lotus japonicus genomische DNA, Chromosom 2, Klon: LjT28N02, TM1615, komplette Sequenz 95,1 241 16% 1,00E-15 90%
    EF145201.1 Populus trichocarpa, Klon WS01121_K10, unbekannte mRNA 87,8 155 9% 2,00E-13 85%
    AC098571.2 Oryza sativa Japonica-Gruppe, Chromosom 5, Klon OJ1126_B10, komplette Sequenz 80,6 80,6 3% 3,00E-11 84%
  • 5. Kommentierung von MAWS60
  • MAWS60 codiert ein unbekanntes Maisprotein (GenBank-Eintrag: ACF78165.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 41 dargelegt. Tabelle 41. BLASTX-Suchergebnisse von Mais-ZM4s20063 (MAWS60)
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    ACF78165.1 unbekannt [Zea mays] 138 3,00E-52 64
    ACF83516.1 unbekannt [Zea mays] 204 2,00E-50 82
    ACF86030.1 unbekannt [Zea mays] 124 2,00E-48 73
    ACF87441.1 unbekannt [Zea mays] 79 1,00E-46 73
    ACF78865.1 unbekannt [Zea mays] 102 1,00E-22 72
    ACF88449.1 unbekannt [Zea mays] 42 5,00E-11 48
    NP_001066367.1 Os12g0198700 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 42 1,00E-10 46
    NP_001066495.1 Os12g0247700 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 39 4,00E-10 61
    ABR25456.1 beta-Glucosidase-Aggregationsfaktor-Vorläufer [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 46 7,00E-10 53
    NP_001066435.1 Os12g0227500 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 46 7,00E-10 53
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das MAWS60 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 19 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 37 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von MAWS60
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des MAWS60-Gens als der Promotor p-MAWS60 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM4s20063 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenzen AZM5_25938 (3185 bp) wurde identifiziert. Diese 3185 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu MAWS60 entsprechenden Gen und 1,2 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens. Die Sequenz von AZM5_25938 ist in der SEQ ID NR.: 73 gezeigt.
  • Isolierung von der Promotorregion mittels PCR-Amplifikation Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01580001
    Das erwartete 1106 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor MAWS60 (p-MAWS60) bezeichnet. Die Sequenz von p-MAWS60 wurde in SEQ ID NR.: 1 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_MAWS60
  • Die besten 20 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage von p_MAWS60 identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 42 dargelegt. Tabelle 42. BlastN-Ergebnisse von p_MAWS60
    Figure 01590001
    Figure 01600001
    Figure 01610001
  • 6. Kommentierung von MAWS63
  • MAWS63 codiert ein Protein, das zu einem hypothetischen Reisprotein OsI_026531 (GenBank-Eintrag: EAZ05299.1) homolog ist. Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 43 dargelegt. Tabelle 43. BLASTX-Suchergebnisse von dem Mais ZM1s62013293 (MAWS63)
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    EAZ05299.1 hypothetisches Protein OsI_026531 98 2,00E-20 59
    NP_001060778.1 Os08g0104400 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 94 2,00E-19 72
    EAZ05298.1 hypothetisches Protein OsI_026530 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 99 9,00E-19 53
    CAO22190.1 unbenanntes Proteinprodukt. [Vitis vinifera] 58 2,00E-06 61
    CAO46216.1 unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera] 58 2,00E-06 61
    CAN64204.1 hypothetisches Protein [Vitis vinifera] 58 2,00E-06 61
    ABB72396.1 Samenreifungsprotein [Glycine tomentella] 58 2,00E-06 62
    ABB72388.1 Samenreifungsprotein [Glycine latifolia] 58 2,00E-06 62
    ABB72387.1 Samenreifungsprotein [Glycine latifolia] 58 2,00E-06 62
    ABB72392.1 Samenreifungsprotein [Glycine tomentella] 58 2,00E-06 62
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das MAWS63 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 25 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 43 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von MAWS63
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des MAWS63-Gens als der Promotor p-MAWS63 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM1s62013293 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_12462 (5275 bp) wurde identifiziert. Diese 5275 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu MAWS63 entsprechenden Gen und 2,3 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens. Die ersten 3 kb an Sequenz von AZM5_12462 sind in der SEQ ID NR.: 79 gezeigt.
  • Isolierung von der Promotorregion mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01620001
    Das erwartete 1941 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor MAWS63 (p-MAWS63) bezeichnet. Die Sequenz von p-MAWS63 ist in der SEQ ID NR.: 7 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_MAWS63
  • Die besten 20 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage von p_MAWS63 identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 44 dargelegt. Tabelle 44. BLASTN–Ergebnisse von p_MAWS63
    Figure 01620002
    Figure 01630001
    Figure 01640001
  • 7. Kommentierung von MAEM1
  • MAEM1 codiert Mais ZCN9-Protein (GenBank-Eintrag: ABX11011.1). Die besten 10 homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 45 aufgeführt. Tabelle 45: BLASTX-Suchergebnisse von dem Mais ZM4s09689 (MAEM1)
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    ABX11011.1 ZCN9 [Zea mays] 326 3,00E-97 100
    NP_001106248.1 ZCN9-Protein [Zea mays] 326 3,00E-97 100
    NP_001106249.1 ZCN10-Protein [Zea mays] 309 5,00E-92 94
    EAY84662.1 hypothetisches Protein OsI_005895 [Oryza sativa (Indica-Kutivargruppe)] 210 6,00E-76 84
    NP_001041806.1 Os01g0111600 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 208 7,00E-75 83
    NP_001057701.1 Os06g0498800 [Oryza sativa (Japonica-Kultivargruppe)] 193 1,00E-65 68
    ABB90591.1 „Terminal flower 1” [Aquilegia formosa] 212 8,00E-60 63
    CAO68168.1 unbenanntes Protein Produkt [Vitis vinifera] 170 2,00E-59 65
    BAD22677.1 Blüh-Locus-T-artiges Protein [Populus nigra] 173 5,00E-59 67
    CAN80336.1 hypothetisches Protein [Vitis vinifera] 170 9,00E-59 65
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das MAEM1 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 20 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 38 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von MAEM1
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des MAEM1-Gens als der Promotor p-MAEM1 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM4s09689 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_13765 (3272 bp) wurde identifiziert. Diese 3272 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu MAWS23 entsprechenden Gen und weniger als 0,5 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens. Darüber hinaus wurde eine öffentlich verfügbare Sequenz CL383739 mit AZM5_13765 überlappt. Das Contig aus diesen 2 genomischen Sequenzen, das 0,9 kb Stromaufwärts-Region enthielt, ist in SEQ ID NR.: 74 gezeigt.
  • Isolierung von der Promotorregion mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01650001
    Das erwartete 922 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor MAEM1 (p-MAEM1) bezeichnet. Die Sequenz von p-MAEM1 wurde in der SEQ ID NR.: 2 gezeigt.
  • BLASTN-Ergebnisse von p_MAEM1
  • Die 18 besten homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage von p_MAEM1 identifiziert worden sind, sind in der Tabelle 46 dargelegt. Tabelle 46 BLASTN–Ergebnisse von p_MAEM1
    Figure 01650002
    Figure 01660001
    Figure 01670001
  • 8. Kommentierung zu MAEM20
  • MAEM20 codiert ein Protein, das homolog zum hypothetischen Reisprotein OsJ_029225 (GenBank-Eintrag: EAZ45742.1) ist. Die 10 besten homologen Sequenzen, die in der BlastX-Abfrage identifiziert wurden, sind in der Tabelle 47 aufgeführt. Tabelle 47. BLASTX-Suchergebnisse von dem Mais ZM1s59153555 (MAEM20)
    Eintrag Beschreibung Ergebnis E-Wert % Identitäten
    EAZ45742.1 hypothetisches Protein OsJ_029225 154 4,00E-35 80
    EAZ10155.1 hypothetisches Protein OsI_031387 [Oryza sativa (Indica-Kultivargruppe)] 154 4,00E-35 80
    BAD46602.1 putatives Histon H2B [Oryza sativa Japonica-Gruppe] 154 4,00E-35 80
    CAN78957.1 hypothetisches Protein [Vitis vinifera] 139 1,00E-30 69
    NP_172295.1 Protein der Histon H2B-Familie [Arabidopsis thaliana] 133 7,00E-30 62
    XP_001104238.1 VORAUSGESAGT: ähnlich zum Histon H2B [Macaca mulatta] 132 2,00E-28 64
    XP_001914780.1 VORAUSGESAGT: ähnlich zum Histon H2B.3 [Equus caballus] 131 4,00E-28 63
    XP_532763.2 VORAUSGESAGT: ähnlich zum Testis-spezifischen Histon 2b [Canis familiaris] 129 1,00E-27 62
    XP_8.72016.1 VORAUSGESAGT: ähnlich zum Histon H2B.3 [Bos taurus] 128 2,00E-27 62
    XP_002060453.1 GJ19809 [Drosophila virilis] 126 1,00E-26 59
  • Die CDS-Sequenz von dem Gen, das MAEM20 entspricht, ist in der SEQ ID NR.: 23 gezeigt, und die translatierte Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NR.: 41 gezeigt.
  • Identifizieren der Promotorregion von MAEM20
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des MAEM20-Gens als der Promotor p-MAEM20 definiert. Zum Identifizieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von ZM1s59153555 auf die BASF Plant Science-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank PUB_tigr_Mais_genomic_partial_5.0.nt kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz AZM5_23292 (1996 bp) wurde identifiziert. Diese 1996 bp große Sequenz enthielt die vorausgesagte CDS von dem zu MAEM20 entsprechenden Gen und 0,7 kb Stromaufwärts-Sequenz ab dem ATG-Startcodon dieses Gens. Die Sequenz von AZM5_23292 ist in SEQ ID NR.: 77 gezeigt.
  • Isolieren der Promotorregion mittels PCR-Amplifikation
  • Die putative Promotorregion wurde mittels genomischer PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
    Figure 01690001
  • Das erwartete 698 bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor MAEM20 (p-MAEM20) bezeichnet. Die Sequenz von p-MAEM20 wurde in SEQ ID NR.: 5 gezeigt.
  • BLASTN–Ergebnisse von p_MAEM20
  • Die besten 16 homologen Sequenzen, die in der BlastN-Abfrage von p_MAEM20 identifiziert wurden, sind in der Tabelle 48 dargelegt. Tabelle 48. BLASTN–Ergebnisse von p_MAEM20
    Eintrag Beschreibung Max. Ergebnis Gesamt-Ergebnis Abfrage-Abdeckung E-Wert Max. Ident.
    EU951788.1 Zea mays-Klon 1000340 unbekannte mRNA 196 196 15% 2,00E-46 100%
    CP000820.1 Frankia sp. EAN1pec, komplettes Genom 44,6 44,6 5% 0,64 86%
    AC174361.12 Medicago truncatula-Chromosom 8 – Klon mth2-39o9, komplette Sequenz 42,8 42,8 4% 2,2 93%
    AC146791.12 Medicago truncatula-Chromosom 8 – Klon mth2-123m17, komplette Sequenz 42,8 42,8 4% 2,2 93%
    XM_001502388.2 VORAUSGESAGT: Equus caballus ähnlich zu Neurotrypsin (LOC100072455), mRNA 41 41 3% 7,8 92%
    CP000548.1 Burkholderia mallei NCTC 10247 Chromosom I, komplette Sequenz 41 41 3% 7,8 92%
    CP000572.1 Burkholderia pseudomallei 1106a Chromosom I, komplette Sequenz 41 41 3% 7,8 92%
    CP000546.1 Burkholderia mallei NCTC 10229 Chromosom I, komplette Sequenz 41 41 3% 7,8 92%
    CP000526.1 Burkholderia mallei SAVP1 Chromosom I, komplette Sequenz 41 41 3% 7,8 92%
    CP000539.1 Acidovorax sp. JS42, komplettes Genom 41 41 5% 7,8 85%
    CP000489.1 Paracoccus denitrificans PD1222 Chromosom 1, komplette Sequenz 41 41 4% 7,8 90%
    EF130439.1 Sus scrofa, Klon KVL4379, Microsatelliten-Sequenz 41 41 5% 7,8 86%
    CP000383.1 Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406, komplettes Genom 41 41 3% 7,8 96%
    XM_001106371.1 VORAUSGESAGT: Macaca mulatta ähnlich zu Chromosom 9 offenes Leseraster 58 Isoform 1, Transkript-Variante 4 (LOC715655), mRNA 41 41 4% 7,8 90%
    CP000010.1 Burkholderia mallei ATCC 23344 Chromosom 1, komplette Sequenz 41 41 3% 7,8 92%
  • BEISPIEL 11
  • PLACE-ANALYSE DER PROMOTOREN
  • Cis-wirksame Motive in den Promotorregionen wurden unter Anwendung von PLACE (eine 5 Datenbank von pflanzlichen cis-wirksamen regulatorischen DNA-Elementen) identifiziert, wobei die Genomatix-Datenbank-Suite eingesetzt wurde.
  • 1) p-MAWS23
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-MAWS23 sind in der Tabelle 49 aufgelistet. Zwei TATA-Box-Motive werden in diesem Promotor gefunden, wobei eines an der Nukleotidposition 419–425 des Vorwärts-Strangs lokalisiert ist, das andere an der Nukleotidposition 736–742 des Rückwärts-Strangs lokalisiert ist. Es liegt 1 CAAT-Box-Motiv an der Nukleotidposition 621–625 des Vorwärts-Strangs vor. Tabelle 49. PLACE-Analyseergebnisse des 1264 bp-Promotors p-MAWS23
    Figure 01710001
    Figure 01720001
    Figure 01730001
    Figure 01740001
  • 2) p-MAWS27
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-MAWS27 sind in der Tabelle 50 aufgelistet. Mehrere TATA-Box-Motive werden in diesem Promotor gefunden, lokalisiert an der Nukleotidposition 1–7, 278–284, 597–603, 1246–1252 des Vorwärts-Strangs bzw. 273–279, 533–539 des Rückwärts-Strangs. Drei CAAT-Box-Motive sind an der Nukleotidposition –947–951, 968–972 und 985–989 des Vorwärts-Strangs lokalisiert. Tabelle 50. PLACE-Analyseergebnisse des 1355 bp-Promotors p-MAWS27
    Figure 01740002
    Figure 01750001
    Figure 01760001
    Figure 01770001
  • 3) p-MAWS30
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-MAWS30 sind in der Tabelle 51 aufgelistet. Ein TATA-Box-Motiv wird in diesem Promotor gefunden, lokalisiert an der Nukleotidposition 290–296 des Vorwärts-Strangs. Keine CAAT-Box-Motive werden in diesem Promotor gefunden. Tabelle 51. PLACE-Analyseergebnisse von dem 623 bp-Promotor p-MAWS30
    Figure 01770002
    Figure 01780001
  • 4) p-MAWS57
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-MAWS57 sind in der Tabelle 52 aufgelistet. Keine TATA-Box-Motive werden in diesem Promotor gefunden. Vier CAAT-Box-Motive sind an der Nukleotidposition 217–221, 423–427, 501–505 des Vorwärts-Strangs bzw. 340–344 des Rückwärts-Strangs lokalisiert. Tabelle 52. PLACE-Analyseergebnisse von dem 1950 bp-Promotor p-MAWS57
    Figure 01780002
    Figure 01790001
    Figure 01800001
    Figure 01810001
  • 5) p-MAWS60
  • PLACE-Analyseergebnisse von p-MAWS60 sind in der Tabelle 53 aufgelistet. Ein TATA-Box Motiv wird an der Nukleotidposition 156–162 des Vorwärts-Strangs gefunden. Ein CAAT-Box-Motiv ist an der Nukleotidposition 547–551 des Rückwärts-Strangs lokalisiert. Tabelle 53. PLACE-Analyseergebnisse von dem 1106 bp-Promotor p-MAWS60
    Figure 01810002
    Figure 01820001
    Figure 01830001
  • 6) p-MAWS63
  • Die PLACE-Analyseergebnisse von p-MAWS63 sind in der Tabelle 54 aufgelistet. Drei TATA-Box-Motive werden an der Nukleotidposition 1555–1561, 1577–1583 bzw. 1628–1634 des Vorwärts-Strangs gefunden. Ein CAAT-Box-Motiv ist an der Nukleotidposition 987–991 des Vorwärts-Strangs lokalisiert, und drei CAAT-Box-Motive sind an der Nukleotidposition 156–160, 199–203, 249–253 des Rückwärts-Strangs lokalisiert. Tabelle 54. PLACE-Analyseergebnisse des 1941 bp-Promotors p-MAWS63
    Figure 01830002
    Figure 01840001
    Figure 01850001
    Figure 01860001
    Figure 01870001
    Figure 01880001
  • 7) p-MAEM1
  • Die PLACE-Analyseergebnisse von p-MAEM1 sind in Tabelle 55 aufgelistet. Keine TATA-Box-Motive werden in diesem Promotor gefunden. Ein CAAT-Box-Motiv ist an der Nukleotidposition 655–659 des Vorwärts-Strangs lokalisiert. Tabelle 55. PLACE-Analyseergebnisse des 922 bp-Promotors p-MAEM1
    Figure 01880002
    Figure 01890001
  • 8) p-MAEM20
  • Die PLACE-Analyseergebnisse von p-MAEM20 sind in der Tabelle 56 aufgelistet. Keine TATA-Box-Motive werden in diesem Promotor gefunden. Ein CAAT-Box-Motiv ist an der Nukleotid-position 668–672 des Rückwärts-Strangs lokalisiert. Tabelle 56. PLACE-Analyseergebnisse des 698 bp-Promotors p-MAEM20
    Figure 01900001
    Figure 01910001
  • BEISPIEL 11
  • BINÄRVEKTORKONSTRUKTION ZUR MAIS-TRANSFORMATION, UM DIE FUNKTION DER PROMOTOREN ZU EVALUIEREN
  • Zur Erleichterung der Subklonierung wurden die Promotorfragmente von MAWS23, 27, 30, 57, 60, 63, MAEM1 und MAEM20 durch die Addition einer SwaI-Restriktionsenzymsstelle an ihrem 5'-Ende und einer BslWI-Stelle an ihrem 3'-Ende modifiziert. Das SwaI-p-MA-Promotor-BsiWI-Fragment wurde verdaut und in einen mit SwaI und BsiWI verdauten basalen Binärvektor RCB1006 von BPS ligiert, der eine Pflanzen-selektierbare Marker-Expressionskassette (p-Ubi::AHAS::t-XI12) sowie eine Promotor-Evaluierungskassette umfasste, die aus einer Mehrfachklonierungsstelle (MCS) zur Promotor-Insertion und dem Reis-MET1-1-Intron zur Bereitstellung von Intron-vermittelter Verstärkung in monokotylen Zellen, dem GUS-Reportergen und dem NOS-Terminator besteht. Das Diagram von RCB1006 ist in der 13 gezeigt.
  • Die Tabelle 57 listet die resultierenden Binärvektoren der MA-Promotoren auf. Sequenzen der Promotorkassetten in den Binärvektoren sind in den SEQ ID NRn: 55, 56, 59–61, 69–71 gezeigt. Tabelle 57. Binäre Vektoren der MA–Promotoren zur Maistransformation
    Promotor ID Vektor ID Beschreibung SEQ ID NR.
    p-MAWS23 RTP1060 p_MAWS23::iMET1::GUS::t-NOS 69
    p-MAWS27 RTP1059 p_MAWS27::iMET1::GUS::t-NOS 60
    p-MAWS30 RTP1053 p_MAWS30::iMET1::GUS::t-NOS 70
    p-MAWS57 RTP1049 p_MAWS57::iMET1::GUS::t-NOS 71
    p-MAWS60 RTP1056 p_MAWS60::iMET1::GUS::t-NOS 55
    p-MAWS63 RTP1048 p_MAWS63::iMET1::GUS::t-NOS 61
    p-MAEM1 RTP1061 p_MAEM1::iMET1::GUS::t-NOS 56
    p-MAEM20 RTP1064 p_MAEM20::iMET1::GUS::t-NOS 59
  • BEISPIEL 12
  • PROMOTOR-EVALUIERUNG IN TRANSGENEM MAIS MIT DEN MA-PROMOTOREN
  • Expressionsmuster und -spiegel, angetrieben durch die MA-Promotoren, wurden unter Anwendung der histochemischen GUS-Analyse gemessen, und zwar unter Nachvollziehen des Protokolls im Fachbereich (Jefferson 1987). Die Maistransformation wurde unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems durchgeführt. Zehn und fünf Einzelkopie-Ereignisse für T0- und T1-Pflanzen wurden für die Promotor-Analyse gewählt. Die GUS-Expression wurde bei verschiedenen Entwicklungsstadien gemessen:
    • 1) Wurzeln und Blattwerk im 5-Blatt-Stadium
    • 2) Stengel im V-7-Stadium
    • 2) Blattwerk, Hüllblatt und Griffelfäden im Blühstadium (erstes Auftreten von Maisgriffelfäden)
    • 3) Ährchen/Quaste (bei Bestäubung)
    • 5) Kolben oder Körner bei 5, 10, 15, 20 und 25 Tagen nach der Bestäubung (DAP).
  • Die Ergebnisse zeigten an, dass alle diese 9 Promotoren spezifisch in Pollen und in Embryo exprimierten (14 bis 21).
  • Beispiel 13
  • Identifizierung des Mais-Promotors pZmNP28
  • Basierend auf einem Affymetrix-”GenChip® Wheat Genom Arrays”-Experiment, das unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren durchgeführt worden ist, wurde ein Transkript, Ta.4874.1.S1_at als Dürre-induzierbare Expression aufweisend selektiert. Kurz gesagt, wurden Affymetrix GenChip® ”Wheat Genom Arrays” mit Sonden abgefragt, die aus verschiedenen RNA-Proben (Stengel, Blattwerk, Wurzeln, Dürre-gestresste Wurzeln und Dürre-gestresste Blätter) abgeleitet waren, und Kandidatengene, die ein Dürre-induzierbares Expressionsprofil zeigten, wurden identifiziert. Stengel, Blätter und Wurzeln bei normalen Wachstumsbedingungen und Dürre-gestressten Bedingungen wurden geerntet, RNA wurde extrahiert und weiter gereinigt, und die Qualität und der Ertrag von RNA wurden durch im Fachgebiet bekannte Techniken bestätigt. Die RNA wurde markiert und an GenChip® Wheat Genom Arrays hybridisiert, und die Daten wurden analysiert, um Listen von Genen in Rangfolge abzuleiten. Die Mikroarray-Expression wurde unter Verwendung von AVADISTM-Software (Strand Genomics Pvt. Ltd. Bangalore) analysiert. Die Rohdaten für sämtliche Mikroarrayanalyse wurden in AVADIS importiert, und der RMA-Algorithmus (Irazarry et al., Biostatistics 4(2): 249–264, 2003) wurde für Hintergrundkorrektur, Normalisieren und Sondenaggregation angewandt. ”Absolute calls” und p-Werte wurden für jedes Gen erstellt, und alle Sondensätze, welche nicht an Nukleinsäure in einer Probe hybridisierten, d. h. abwesend waren (absolute call), quer über alle Arrays, wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Zur Bestimmung von Transkripten, die präferentiell oder selektiv in Dürre-gestressten Wurzeln und Blättern exprimiert werden, wurden differentielle Expressionsanalysen durchgeführt, worin normal herangezogene Stengel, Blätter und Wurzeln mit Dürre-gestressten Wurzeln und Blättern verglichen wurden. Ta.4874.1.S1_at, das eine 10-fach gößere Expression in Dürre-gestressten Blättern als in anderen Geweben zeigte, wurde als ein Dürre-induzierbares Transkript ausgewählt.
  • Die Sequenz von Ta.14617.1.S1_at wurde zu den Sequenzen des Affymetrix-Mais-Chip aligniert. Das Mais-Zm.8705.1.S1_at wurde, basierend auf der Nukleotid-Sequenzidentität bei 76% zu einem Teil von Ta.4874.1.S1_at, als ein Ortholog identifiziert. Die Sequenz von Zm.8705.1.S1_at ist in der SEQ ID NR.: 108 gezeigt.
  • Beispiel 14
  • Die Expressionsmuster von Zm.8705.1.S1_at in Mais Die Analyse von 36 Affymetrix Mais-Chips, einschließlich unreifem Embryo (6), Blatt (8), Kolben (11) und Korn (11), ergab, dass Zm.8705.1.S1_at spezifisch im unreifen Embryo und im Korn (22) exprimiert war.
  • Beispiel 15
  • Validierung des Expressionsmusters von Zm.8705.1.S1_at bei den mRNA-Spiegeln Eine quantitative RT-PCR (qRT-PCR) wurde durchgeführt, um die Expression vom Zm.8705.1.S1_at-Gen in verschiedenen Gewebetypen zu validieren. Um eine mRNA-Sequenz mit besserer Qualität für das Entwerfen von qRT-PCR-Primern zu finden, wurde die Sequenz von Zm.8705.1.S1_at gegen die hauseigene Hyseq-Datenbank von BPS geblastet. Ein Hyseq-Mais-EST ZM06MC34918_62096753 (846 bp) wurde dahingehend identifiziert, das gleiche Gen wie Zm.8705.1.S1_at zu sein. Die Sequenz von ZM06MC34918_62096753 ist in der SEQ ID NR.: 108 gezeigt.
  • Primer für die qRT-PCR wurden mit Hilfe des Vektor NTI-Software-Packets (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) entworfen. Zwei Sätze von Primern wurden für die PCR-Amplifikation verwendet. Die Sequenzen von Primern stehen in der Tabelle 58. Tabelle 58. Primer-Sequenzen für RT-QPCR
    Figure 01930001
  • qRT-PCR wurde unter Verwendung von SuperScript III-Reverser-Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und SYBR-Green QPCR Master Mix (Eurogentec, San Diego, CA, USA) in einem ABI Prism 7000-Sequenzdetektions-System durchgeführt. cDNA wurde unter Verwendung von 2–3 μg Gesamt-RNA und 1 μl Reverser Transkriptase in einem Volumen von 20 μl synthetisiert. Die cDNA wurde auf einen Bereich von Konzentrationen (15–20 ng/μl) verdünnt. Dreißig bis vierzig ng cDNA wurden für QPCR in einem Volumen von 30 μl mit SYBR Green QPCR Master-Mix unter Befolgen der Anleitung des Herstellers verwendet. Die Thermozyklierbedingungen waren wie folgt: Halten bei 50°C während 2 Minuten und bei 95°C während 10 Minuten, 40 Zyklen von 95°C während 15 Sekunden und 60°C während 1 Minute für die Amplifikation. Nach dem letzten Zyklus der Amplifikation wurde die Dissoziationskurvenanalyse durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Amplifikation spezifisch stattgefunden hatte und dass kein Primerdimer während des Amplifikationsverfahrens gebildet worden war. Das Haushaltsgen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, Tabelle 58 für Primersequenzen) wurde als ein endogenes Referenzgen verwendet, um die Berechnung unter Anwendung des Vergleichs-Ct(Schwellenzyklus)Wert-Verfahrens zu normieren. Der ΔCT-Wert wurde durch Subtrahieren des GAPDH-Ct-Werts von dem Kandidatengen(ZM06MC34918_62096753)-Ct-Wert der gleichen Proben erhalten. Der relative mRNA-Expressionsspiegel des Gen-Kandidaten wurde durch 2–ΔCT angegeben. Die qRT-PCR-Ergebnisse sind in der 22 zusammengefasst. Beide Primersätze ergaben Embryospezifische Expressionsmuster, welche gegenüber den Expressionsmustern, die man aus der Mais-Affymetrix-Chip-Analyse erhalten hatte, bestätigt wurden.
  • Beispiel 16
  • Kommentierung bzw. Annotierung von Zm.8705.1.S1_at
  • Die Sequenz von dem Mais EST ZM06MC34918_62096753 wurde mittels BlastX abgefragt. Das EST hatte keine Übereinstimmung zu irgendeinem bekannten Mais-Gen. Die 20 Homologen von EST ZM06MC34918_62096753 mit dem höchsten Ergebniswert sind in Tabelle 59 aufgelistet. Tabelle 59. Zm.8705.1.S1_at Gen – Kommentierung
    Eintrag Beschreibung Spezies Ergebnis E-Wert
    AAL23749.1 Stress-induzierbares Membranporen-Protein Bromus inermis 259 2,00E-67
    NP_001042833.1 Os01g0303300 Oryza sativa 265 7,00E-65
    ABE83193.1 mitochondriale Import-Innere-Membran-Translokase-Untereinheit Tim17/22 Medicago truncatula 200 9,00E-50
    AAV84280.1 Dehydrierung hochreguliertes putatives Membranporen-Protein 199 1,00E-49
    NP_001049884.1 Os03g0305600 Oryza sativa 190 7,00E-47
    ABD32318.1 mitochondriales Import-Innere-Membran-Translokase-Untereinheit-Protein der Tim17/Tim22/Tim23 Familie Oryza sativa 190 9,00E-47
    EAY89687.1 hypothetisches Protein OsI_010920 Oryza sativa 188 3,00E-46
    NP_849394.1 Protein-Translokase/Proteintransporter Arabidopsis thaliana 178 3,00E-43
    AAM65873.1 Protein-Translokase/Proteintransporter Arabidopsis thaliana 178 3,00E-43
    NP_567488.1 hypothetisches Protein OsI_010920 Oryza sativa 178 3,00E-43
    EAZ26649.1 hypothetisches Protein OsI_010920 Oryza sativa 164 4,00E-39
    CAB10395.1 Porenprotein-Homolog Arabidopsis thaliena 148 3,00E-34
    AAT45008.1 Stress-induzierbares Membranporen-artiges Protein Xerophyta humilis 136 2,00E-30
    CAK26794.1 hypothetisches Protein Sporobolus stapfianus 134 5,00E-30
    NP_001054446.1 Os05g0111200 Oryza sativa 91 7,00E-17
    CAA09867.1 Aminosäure-selektives Kanalprotein Hordeum vulgare subsp.vulgure 89 4,00E-16
    EAY96269.1 hypothetisches Protein OsI_017502 Oryza sativa 87 8,00E-16
    CAA97910.1 Kernprotein Pisum sativum 84 7,00E-15
    CAA63967.1 pom14 Solanum tuberosum 84 7,00E-15
    NP_180456.1 Protein-Translokase/Proteintransporter Arabidopsis thaliana 80 1,00E-13
  • Beispiel 17
  • Identifizierung und Isolierung der Promotorregion
  • Für unsere Promotoridentifizierungs-Absichten wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des Zm.8705.1.S1_at-Gens als der Promotor pZmNP28_655 definiert. Zum Isolieren dieser vorausgesagten Promotorregion wurde die Sequenz von EST ZM06MC34918_62096753 auf die BPS-firmeneigene genomische Mais-DNA-Sequenz-Datenbank kartiert. Von einer genomischen Mais-DNA-Sequenz von 1697 bp, ZmGSStuc11-12-04.119561.1, wurde identifiziert, dass sie den EST ZM06MC34918_62096753 in einer Antisense-Richtung enthält. Die 1697 bp große Sequenz von ZmGSStuc11-12-04.119561.1, die in SEQ ID NR.: 196 gezeigt ist, enthält eine komplette Codiersequenz (CDS) des Gens und eine 655 bp Stromaufwärts-Sequenz von dem Startcodon ATG aus, einschließlich einer 140 bp großen putativen 5'-UTR, basierend auf dem Sequenzalignment-Ergebnis gegen die Sequenz des Zea mays-mRNA-Klons EL01N0448C02.c (GenBank-Eintrag: BTO17732.1). Diese 656 bp wurden als pZmNP28_655 bezeichnet und durch PCR unter Verwendung der folgenden spezifischen Primer kloniert:
    Figure 01950001
  • Die in SEQ ID NR.: 36 gezeigte CDS-Sequenz wurde mittels des Vektor NTI-Software-Pakets als ein Gen identifiziert, das ein Protein codiert, das homolog zum Stress-induzierbaren Membranporen-Protein von Bromus inermis (GenBank-Eintrag: AAL23749,1, Tabelle 59) ist. Die translatierte Aminosäuresequenz der CDS ist in SEQ ID NR.: 54 gezeigt, und die Sequenz von pZmNP28_655 ist als Teil von SEQ ID NR.: 18 gezeigt (Nukleotid 1459 bis Nukleotid 2112).
  • Um mehr Sequenzinformation von weiter stromaufwärts von pZmNP28_655 zu erhalten, wurde ein Genom Walk durchgeführt. Genomische Mais-DNA wurde aus Zea mays B73 extrahiert und mit den Glattenden-Restriktionsenzymen SspI, ScaI, EcoRV, StuI, DraI, verdaut, um Genom WalkerTM-Mais-DNA-Bibliotheken zu erzeugen. Verdaute DNA wurde mit Phenol/Chloroform gereinigt und in TE-Puffer (10 mM Tris HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) erneut gelöst, vor Ligation an die Genom WalkerTM-Adapter unter Befolgen der Anleitung des Herstellers (Clontech Laborstories, Inc, Mountain View, CA, USA). Eine verschachtelte PCR wurde mit Hilfe von Genom WalkerTM-Bibliothek-Matrize mit Adaptor- und sequenzspezifischen Primern durchgeführt. Die GenomWalk-Reaktionen erzeugten ein 2771 bp-Fragment mit einer 270 bp-Überlappung mit dem 5'-Ende von pZmNP28_655. Das Agarosegel, das dieses Fragment zeigt, wurde abgebildet, wie in 23. Das Fragment von Spur 6 von 23 wurde gereinigt, in einen TOPO TA-Vektor, pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008, USA) kloniert und sequenziert. Eine Contig-Sequenz, die dieses 2771 bp-Fragment, kombiniert mit pZmNP28_655, enthält, wurde zusammengefügt, und die resultierende 3177 bp große Contig-Sequenz ist in SEQ ID NR.: 90 gezeigt.
  • Beispiel 18
  • Identifikation der längeren Promotorregionen
  • Um die Promotorregion zu bestimmen, isolierten wir noch 3 Fragmente mit unterschiedlichen Längen, und zwar basierend auf der obigen Contig-Sequenzinformation zur Evaluierung ihrer Funktion als ein Promotor:
    • 1). Ein 2070 bp-Fragment, das als pZmNP28_2070 bezeichnet wurde und mittels PCR unter Verwendung der folgenden spezifischen Primer isoliert wurde:
      Figure 01960001
      Die Sequenz von pZmNP28_2070 ist in SEQ ID NR.: 18 gezeigt.
    • 2). Ein 1706 bp-Fragment, das als pZmNP28_1706 bezeichnet wurde und mittels PCR unter Verwendung der folgenden spezifischen Primer isoliert wurde:
      Figure 01960002
      Im Vergleich zu pZmNP28_2070 hat pZmNP28_1706 eine Deletion von 326 bp an seinem 3'-Ende von dem pZmNP28_2070. Die Sequenz von pZmNP28_1706 ist als Teil von SEQ ID NR.: 18 gezeigt.
    • 3). Ein 507 bp-Fragment, das als pZmNP28_507 bezeichnet wurde und mittels PCR unter Verwendung der folgenden spezifischen Primer isoliert wurde:
      Figure 01960003
  • Beispiel 19
  • BlastN-Ergebnisse von der längsten Promotorregion pZmNP28_2070
  • Die 2113 bp-Region von dem 5'-Ende von pZmNP28_2070 bis direkt stromaufwärts des ATG wurde mittels BlastN gesucht. Einige wenige Homologe zum 3'-Ende dieser Region wurden gefunden und in Tabelle 60 aufgelistet. Tabelle 60. BlastN-Ergebnisse der 2113 bp-Region, die ZmNP28_2070 einschließt
    Einträge Beschreibung Ergebnis E-Wert
    BT017732.1 Zea mays, Klon EL01N0448CO2.c, mRNA-Sequenz 254 2,00E-63
    EU977126.1 Zea mays, Klon 999692, mRNA-Sequenz 202 7,00E-48
    NM_001159134.1 Zea mays LOC100286246 (gpm462), mRNA > gb|EU976384.1| Zea 202 7,00E-48
    EU968359.1 Zea mays, Klon 319482, Stress-induzierbares Membranporen-Protein, mRNA, komplette cds 202 7,00E-48
    EU953175.1 Zea mays, Klon 1389131 mRNA-Sequenz 202 7,00E-48
    AY111174.1 Zea mays CL27726_1 mRNA-Sequenz 196 3,00E-46
    DQ245984.1 Zea mays, Klon 93911, mRNA-Sequenz 195 1,00E-45
  • Beispiel 20
  • PLACE-Analyse von der längsten Promotorregion pZmNP28_2070
  • Cis-wirkende Motive in der 2113-bp-Region vom 5'-Ende von pZmNP28_2070 bis direkt stromaufwärts des ATG wurden unter Anwendung von PLACE (eine Datenbank von pflanzlichen Cis-wirkenden regulatorischen DNA-Elementen) mittels Genomatix identifiziert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 61 aufgelistet. Tabelle 61. PLACE-Analyseergebnisse des 656 bp-ZmNP19-Promotor
    Figure 01970001
    Figure 01980001
    Figure 01990001
    Figure 02000001
    Figure 02010001
  • Beispiel 21
  • Binärvektor-Konstruktion zur Maistransformation
  • Für pZmNP28_655 und pZmNP28_507, wurden die aus PCR erhaltenen Promotorfragmente in pENTRTM 5'-TOPO TA Klonierungs-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kloniert. Ein Intron-vermitteltes ”Enhancement”(IME)-Intron (BPSI.1) wurde in die Restriktionsenzym BsrGI-Stelle inseriert, welche 24 bp stromabwärts des 3'-Endes von pZmNP28_655 und pZmNP28_507 liegt. Der resultierende Vektor wurde als ein Gateway-Entry-Vektor verwendet, um den finalen Binärvektor RLN 90 und RLN 93 für Maistransformation zu erzeugen, der eine pflanzliche selektierbare Marker-Expressionskassette (p-Ubi::AHAS::t-NOS) sowie eine Promotorevaluations-Kassette umfasst, die aus dem Testpromotor, dem MET1-1-Intron zur Bereitstellung von Intron-vermittelter Verstärkung in Monokotylen-Zellen, dem GUS-Reportergen und dem NOS-Terminator besteht (24A und B). Für pZmNP28_2070 und pZmNP28_1706 wurden die 2070 bp und die 1706 bp großen Fragmente durch die Addition einer PacI-Restriktionsenzym-Stelle an ihrem 5'-Ende und einer BslWI Stelle an ihrem 3'-Ende modifiziert. Die Fragmente PacI-pZmNP28_2070-BslWI und PacI-pZmNP28_1706-BslWI wurden verdaut und in einen mit PacI und BslWI verdauten basalen Binärvektor HF84 von BPS ligiert. HF84 umfasst eine Pflanzen-selektierbare Marker-Expressionskassette (p-Ubi::c-EcEsdA::t-NOS) wie auch eine Promotor-Evaluierungskassette, welche aus einer Mehrfachklonierungsstelle für Insertion von putativen Promotoren via PacI und BslWI, dem Reis-MET1-1-Intron zur Bereitstellung von Intron-vermittelter Verstärkung in Monokotylen-Zellen, dem GUS-Reportergen und dem NOS-Terminator besteht. Die resultierenden Binärvektoren, welche die Expressionskassette pZmNP28_2070::i-MET1::GUS::t-NOS oder pZmNP28_1706::i-METI::GUS::t-NOS umfassen, wurden als RHF160 oder RHF158 bezeichnet und wurden bei der Maistransformation zum Evaluieren des Expressionsmusters verwendet, das durch pZmNP28_2070 oder pZmNP1706 angetrieben wurde. Die 24C ist ein Diagramm von RHF160, und die 24D ist ein Diagramm von RHF158.
  • Beispiel 22
  • Promotor-Evaluierung in transgenem Mais mit den Binärvektoren RLN90, RLN93, RHF158 und RHF160
  • Expressionsmuster und -spiegel, die durch die Promotoren angetrieben wurden, wurden unter Anwendung der histochemischen GUS-Analyse gemessen, und zwar unter Nachvollziehen des Protokolls des Stands der Technik (Jefferson 1987). Die Maistransformation wurde unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems durchgeführt. Zehn und fünf Einzelkopie-Ereignisse für T0- und T1-Pflanzen wurden für die Promotoranalyse verwendet. Die GUS-Expression wurde bei verschiedenen Entwicklungsstadien gemessen:
    • 1) Wurzeln und Blattwerk im 5-Blatt-Stadium
    • 2) Stengel im V-7-Stadium
    • 2) Blattwerk, Hüllblatt und Griffelfäden im Blühstadium (erstes Auftreten von Maisgriffelfäden)
    • 3) Ährchen/Quaste (bei Bestäubung)
    • 5) Kolben oder Körner bei 5, 10, 15, 20 und 25 Tagen nach der Bestäubung (DAP).
  • Die Ergebnisse zeigten an, dass pZmNP28_655, pZmNP28_507 und pZmNP28_2070 spezifisch in Pollen und in Embryo exprimiert wurden, und pZmNP28_1706 wurde in keinem der getesteten Geweben exprimiert (25A bis D).
  • Beispiel 23
  • Kernsequenzen, die die Embryo-spezifische Expression vom Promotor pZmNP28 antreiben Die Versuchsergebnisse der Evaluierung der Expression, die durch mehrere Fragmente dieser Promotorregion in unterschiedlicher Länge, wie oben beschrieben; angetrieben wurde, zeigte, dass die 326 bp–Kernsequenz kritisch für die Embryo-spezifische Expression dieses Promotors ist. Die Promotorfragmente pZmNP28_655, pZmNP28-507 und pZmNP28_2070, welche diese Kernsequenz enthalten, zeigten eine Embryo-spezifische Expression (25A, C und D). Das Promotorfragment pZmNP28_1706, welches diese Kernsequenz nicht enthält, zeigte überhaupt keine Expression. Die Kernsequenz ist in SEQ ID NR.: 18 gezeigt (insbesondere die Nukleotide 1745 bis 2070 der SEQ ID NR.: 18).
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (11)

  1. Expressionskassette zum Regulieren der samenspezifischen Expression eines Polynukleotids von Interesse, wobei die Expressionskassette eine transkriptionsregulierende Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Folgendem besteht: (a) einer Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR.: SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18, oder einer Variante davon; (b) einer Nukleinsäuresequenz, die zu mindestens 80% identisch ist mit einer Nukleinsäuresequenz, die in einer beliebigen SEQ ID NR. gezeigt ist aus: SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18; (c) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR.: SEQ ID NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder 18 hybridisiert; (d) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz der SEQ ID NR.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 befindet; (e) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz befindet, welche eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR.: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 codiert; (f) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts einer Offenen-Leseraster-Sequenz befindet, welche zu mindestens 80% identisch ist mit einer Offenen-Leseraster-Sequenz der SEQ ID NR.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert; (g) einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die sich stromaufwärts eines offenen Leserasters befindet, codierend eine Aminosäuresequenz, welche zu mindestens 80% identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NR.: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert; (h) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder durch thermische asymmetrische verschachtelte Polymerasekettenreaktion (TAIL-PCR) auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz erhältlich ist, wie in der SEQ ID NR.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt; und (i) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz erhältlich ist, welche zu mindestens 80% mit einem offenen Leseraster identisch ist, wie in SEQ ID NR.: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 oder 36 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert; und (j) einer Nukleinsäuresequenz, die durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA vom ersten Exon einer Offenen-Leseraster-Sequenz erhältlich ist, die eine Aminosäuresequenz codiert, welche zu mindestens 80% mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, welche durch ein offenes Leseraster codiert wird, wie in SEQ ID NR.: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 oder 54 gezeigt, wobei das offene Leseraster ein Samenprotein codiert.
  2. Expressionskassette gemäß Anspruch 1, wobei die Expressionskassette weiter mindestens ein Polynukleotid von Interesse umfasst, das funktionell mit der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz verbunden ist.
  3. Expressionskassette gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid von Interesse bezüglich der transkriptionsregulierenden Nukleotidsequenz heterolog ist.
  4. Vektor, umfassend die Expressionskassette von einem der Ansprüche 1 bis 3.
  5. Vektor gemäß Anspruch 4, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.
  6. Wirtszelle, umfassend die Expressionskassette von einem der Ansprüche 1 bis 3 oder den Vektor von Anspruch 4 oder 5.
  7. Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
  8. Transgenes Pflanzengewebe, Pflanzenorgan, Pflanze oder Samen, umfassend die Expressionskassette von einem der Ansprüche 1 bis 3 oder den Vektor von Anspruch 4 oder 5.
  9. Transgene(s) Pflanzengewebe, Pflanzenorgan, Pflanze oder Samen gemäß Anspruch 8, wobei das (die/der) transgene Pflanzengewebe, Pflanzenorgan, Pflanze oder Samen von Monokotylen abgeleitet ist.
  10. Verfahren für die Herstellung eines/einer transgenen Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens, umfassend: (a) Einführen der Expressionskassette von einem der Ansprüche 1 bis 3 oder des Vektors von Anspruch 4 oder 5 in eine Pflanzenzelle; und (b) Regenerieren der Pflanzenzelle zur Bildung eines/einer Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens.
  11. Verfahren für die Herstellung eines/einer transgenen Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens, umfassend: (a) Integrieren der Expressionskassette von einem der Ansprüche 1 bis 3 oder des Vektors von Anspruch 4 oder 5 in das Genom einer Pflanzenzelle; (b) Regenerieren der Pflanzenzelle zur Bildung eines/einer Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens, und (c) Selektieren der Pflanzenzelle zur Bildung eines/einer Pflanzengewebes, Pflanzenorgans, Pflanze oder Samens für das Vorliegen der Expressionskassette von einem der Ansprüche 1 bis 3 oder des Vektors von Anspruch 4 oder 5.
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