KR101170145B1 - 토마토 유래 뿌리 특이적 알파-디옥시게나아제1 프로모터 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토마토 유래의 알파-디옥시게나아제1(α-Dioxygenase1) 유전자의 식물 뿌리 특이적 발현 프로모터, 이를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 식물 발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 뿌리 특이적으로 발현시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 상기 프로모터 증폭용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 기존에 널리 사용되고 있는 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 CaMV 35S 프로모터가 전 조직에서 외래 유전자의 발현을 유도하는 것에 비해 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 뿌리 특이적으로 발현시킬 수 있다. 또한 본 발명에 의한 뿌리 특이적 프로모터는 뿌리 작물의 농업적 형질을 개량하거나 당근, 고구마 및 인삼 뿌리 등을 이용한 유용 물질 생산시 식물 생육에 영향을 주지 않고 뿌리에 국한시키고자 하는 형질전환 식물체 개발에 유용하다.

토마토, 알파-디옥시게나아제1, 프로모터, 뿌리 특이적 발현, 형질전환

Description

토마토 유래 뿌리 특이적 알파-디옥시게나아제1 프로모터 및 그 용도{Root-specific α-Dioxygenase1 promoter in Tomato and uses thereof}

본 발명은 토마토 유래 뿌리 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 토마토 유래의 알파-디옥시게나아제1(α-Dioxygenase1) 유전자의 식물 뿌리 특이적 발현 프로모터, 이를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 식물 발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 뿌리 특이적으로 발현시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 상기 프로모터 증폭용 프라이머 세트에 관한 것이다.

토마토는 최근에 보통의 영양적 가치 이상으로 건강 증진에 이로우며 질병 예방성을 가진 슈퍼 푸드로 알려져 있다. 토마토의 중요성을 반영하듯이 토마토 게놈 시퀀싱 프로젝트가 진행 중이다. 토마토의 발현 서열 태그(Expressed sequence tags: EST)를 이 프로젝트로부터 받았다. 무작위로 선정된 cDNA의 single pass 서열 tag, EST는 유전자 발현에 관한 정보를 얻는 신속하며 비용 효율이 높은 수단이 되어 왔다. Audic 검정법을 이용하여, EST가 조직 특이적으로 발현되는 것으로 예 측되었다 (Kim et al. (2008) BMC Plant Biol 8:101).

α- DOX 유전자는 최근에 식물에서 발견된 지방산 대사 효소 패밀리에 포함된다. α- DOX는 지방산의 산화를 촉매하여 산화적 손상 및 세포 사멸로부터 조직을 보호하는 역할을 하는 옥시리핀(oxylipin)의 새로이 동정된 그룹을 생성한다. 토마토에는 적어도 3 개의 α-DOX 구성원(Leα-DOX1, 2, 및 3)이 있다. α-DOX1은 뿌리에서 고도로 발현된다 (Tirajoh et al. (2004) J Experi Bot 56:713-723).

DNA의 전사 조절 구간인 프로모터에는 시스 액팅 인자가 있다. 시스 액팅 인자는 유전자의 조직 특이적 발현, 환경 및 호르몬 반응성에 영향을 미친다. 에틸렌, ABA 적용 및 170 mM 염 처리가 토마토 뿌리에서 Le α- DOX1의 발현을 현저하게 상향조절함은 잘 알려져 있다 (Tirajoh et al. (2004) J Experi Bot 56:713-723).

작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다.

이러한 작물분자육종 기술의 효과를 극대화시키려면 1) 여러 가지 식물의 유전자를 대표할 수 있는 많은 유전자 데이터의 축적이 선행되어야 하고, 2) 다양한 작물의 형질전환 시스템이 구축되어야 하며, 3) 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다양한 프로모터의 개발이 선행되어져야 한다.

외래 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 공지된 프로모터들은 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.

첫째로, 뿌리 특이 발현 프로모터이다. 아직 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 ADP-글루코오스 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이 발현을 유도하며 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인한 바 있다(특허공보 2004-0067290, 특허공보 2004-0070820). 이들 프로모터는 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용이 기대될 수 있다.

둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로서 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시킨 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 등을 들 수 있으며 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도를 확인한 사례가 있다. 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용되고 있다.

셋째로, 전신발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물 전신발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C 유전자(OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다(한국등록특허공보 제10-429335호). 이들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체 내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있다. 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 rbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴(patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 PDS(phytoene synthase) 프로모터 및 그 기능이 배추꽃의 화분 특이적임이 확인된 배추 유래 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 포함된다.

그 외에도 다양한 목적에 따른 다양한 식물 유래의 식물체 각 조직에 대하여 많은 수의 프로모터들이 보고되었고 현재에도 계속 개발이 진행 중이지만, 상용화 되었거나 식물 연구자들 사이에 범용되는 프로모터의 종류는 이상에서 언급된 경우에 대부분이 속하며, 개발자의 의도에 따라 보다 정밀하게 유전자 발현의 부위를 조절할 수 있는 새로운 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요성이 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 외래 유용 단백질 및 물질을 식물 뿌리에서 생성하거나 축적시킴으로써 식물 뿌리 성분을 변경하거나 농업적 특성을 개량하고자 할 때 사용 가능한 프로모터에 대하여 연구한 결과, EST 데이터 베이스를 이용하여 Audic 검정법으로 토마토에서 분리한 α-DOX1 프로모터의 활성이 뿌리에서 특이적으로 발현됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 토마토 유래의 뿌리 특이적 발현 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뿌리 특이적 발현 프로모터를 포함하는 뿌리 특이적 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 식물체 뿌리에서 유용 물질을 대량 생산하고자 하는 경우, 상기 뿌리 특이적 발현 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 식물체 뿌리에서 발현시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 뿌리 특이적 프로모터는 유전공학적 방법으로 변경된 단백질 또는 외래 유용 유전자 도입에 의한 단백질 등과 같은 목적 단백질 유전자를 뿌리 특이적으로 유도함으로써 식물 생육에 영향을 주지 않고, 그 발현을 뿌리에 국한시키는 효과가 있기 때문에 형질전환 저장뿌리 조직에서 유용 단백질을 대량으로 생산하고자 할 때, 혹은 형질전환체를 이용한 저장뿌리의 대사 조절 및 기능성 물질 생산 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 뿌리 특이적 발현 프로모터를 제공한다.

기존에 널리 사용되고 있는 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터가 전 조직에서 도입된 유전자를 발현시키는데 비해, 상기 본 발명의 뿌리 특이적 발현 프로모터는 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 뿌리 특이적으로 발현시킬 수 있다.

또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열 의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물체의 뿌리 특이적 발현 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 일 구현예에 따른 바이너리 벡터는 pCAMBIA1391z (CAMBIA, Australia)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 프로모터를 GUS 유전자가 있는 프로모터 분석용 바이너리 벡터(pCAMBIA1391z)에 삽입하여 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용한 화서침지법으로 식물 형질전환에 이용하였다. 상기 GUS 리포터 유전자를 다른 목적 외래 유전자로 치환할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(바이너리) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이 신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 쌍자엽 혹은 단자엽 식물에 상관없이 어떤 식물체도 형질전환시킬 수 있으나, 본 발명에서는 아라비돕시스 탈리아나(Col-0)에서 형질전환을 실시하였다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식물체는 애기장대, 토마토, 가지, 담배, 고추, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 샐러리, 미나리, 파슬리, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 무, 순무, 배추, 양배추, 당근, 우엉, 고구마, 마, 연근, 감자 및 생강 등의 근채류 작물; 인삼, 칡 및 더덕 등의 약용식물; 옥수수 및 콩 등의 사료작물; 벼 등의 주곡작물; 유채 등의 유지작물을 포함하는 뿌리로 이용 될 수 있는 식물체들을 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및

상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 뿌리 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

상기 외래 유전자는 식물체 뿌리에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 식물 발현 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 토마토, 가지, 담배, 고추, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 샐러리, 미나리, 파슬리, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 무, 순무, 배추, 양배추, 당근, 우엉, 고구마, 마, 연근, 감자 및 생강 등의 근채류 작물; 인삼, 칡 및 더덕 등의 약용식물; 옥수수 및 콩 등의 사료작물; 벼 등의 주곡작물; 유채 등의 유지작물을 포함하는 뿌리로 이용될 수 있는 식물체일 수 있으나, 바람직하게는 애기장대이다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 형질전환 식물체는 뿌리 특이적 발현 프로모터에 의해 외래 유전자를 뿌리 특이적으로 발현시킬 수 있다.

본 발명의 뿌리 특이 프로모터의 전사 활성에 의하여 발현되는 목적 유전자의 예로는, 형질전환 대상 작물의 농업적 형질 개량을 위해서는 뿌리 병 방제를 위한 내병성 또는 병 방어 신호전달 관련 유전자들이 될 수 있다. 특히, 인삼 등 약용 뿌리작물의 경우, 내병성 유전자를 도입하게 되면 수년간 재배시 가장 문제가 되고 있는 병 방제 농약의 사용량 감소도 기대할 수 있다. 또한 뿌리작물의 배양근 세포를 이용하여 경제적으로 부가가치가 높은 약용성분이나 특정 유효성분을 생산하거나 강화하려는 목적으로 토코페롤, 베타카로틴 등과 같이 특정 영양 성분을 작물의 뿌리에서 강화하려는 경우에는 관련 물질대사경로의 생합성 유전자 또는 사포닌, 감마리놀렌산 등 약용성분 관련 생합성 유전자 등을 들 수 있으나, 여기에 한정되지 않고, 본 발명의 뿌리 특이 프로모터를 사용하여 조절될 수 있는 각종 목적 유전자들이 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 및 3의 염기서열로 이루어진, 본 발명에 따른 프로모터 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

토마토(Solanum lycopersicum)의 재배품종 마이크로톰(Micro-Tom)은 작은 크기 (10-20 cm) 및 빠른 생활사 (70-90일)의 이점을 가진다 (Emmanuel & Levy (2002) Curr Opinion Pl Biol 5:112-117). 마이크로톰을 25℃에서 16/8 시간의 광 주기로 배양실에서 키웠다.

2. EST 데이터베이스에서 조직 특이적 유전자 선택

in silico Audic 검정법에 의해 조직 특이적 발현으로 예측된 토마토 EST는 KRIBB (http://sol.kribb.re.kr)의 가지과 유전자 Indices(Solanaceae Gene Indices)로부터 선택되었다.

3. RNA 분리 및 RT - PCR

RT-PCR 분석을 위한 마이크로톰의 총 RNA는 Prescott 및 Martin (1987, Pl Mol Biol Rep 4:219-224)에 의한 LiCl-페놀 방법으로 추출되었다. 프로토콜에 따라 역전사 Master PreMix (5X) (ELPIS, 한국)를 사용하여 총 RNA (1μg)가 역전사를 위한 주형으로 사용되었다. RT-PCR은 정방향 프라이머 (TGGGCCAAACAAATCTCTTC: 서열번호 2) 및 역방향 프라이머 (CACTAGCTTGATGCCCCATT:서열번호 3)를 사용하여 수행되었다. 94 ℃에서 30 초, 57.4 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초간의 반응이 30 회 수행되었다.

4. 토마토의 α- DOX1 프로모터의 Deletion 분석

α DOX1 유전자를 포함하는 contig가 동정되었다 (http://www.sgn.cornell.edu). α DOX1 프로모터 구간(SlDOX1P)이 프라이머 SlDOX1p2002 (5'-TTAAGCTTAAAACGAGAAAGAGAGAAAGGC-3' 정방향:서열번호 4) 및 SlDOX1p2 (5'- ATGAATTCAGATAATATTATCACGATTGGG-3' 역방향:서열번호 5)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. α DOX1 프로모터의 세부적인 동정을 위하여, 프라이머 SlDOX1p1036 (5'-TTAAGCTTAGATCATAAATGTTATATGGTG-3':서열번호 6) 및 SlDOX1P0566 (5'-CAAAGCTTGTGTGTTAATAGGGAGGATAGC-3':서열번호 7), 및 역방향 프라이머 SlDOX1p2를 사용하여 PCR에 의해 약 500 bp 간격으로 일련의 deletions을 만들어 각각 SlDOX1P10 및 SlDOX1P05라 하였다. 정방향 프라이머에는 HindIII 제한부위가, 역방향 프라이머에는 EcoRI 제한부위가 있다. 프로모터 단편들은 GUS 유전자의 발현을 추진하기 위해 HindIII 및 EcoRI으로 제한효소 처리된 바이너리 벡터인 pCAMBIA1391z (CAMBIA, Australia)로 클로닝되었다 (도 2).

5. 아그로박테리움- 매개된 형질전환

SlDOX1P10 및 SlDOX1P05 구축물이 동결용해법(freeze-thaw procedure) (Chen et al. (1994) Biotechniques 16:664-670)에 의해 아그로박테리움 투머파시엔스로 전달되어, 화서침치법 (Clough & Bent (1998) Plant J 16:735-743)에 의해 아라비돕시스 탈리아나(Col-0)로 도입되었다. 형질전환된 아라비돕시스 식물체를 23 ℃에서 16/8 시간 광주기로 배양기에서 키웠다. T₀ 종자는 20 mg/L 하이그로마이신이 함유된 1/2 MS 배지 상에서 스크리닝되었다. T₁ 형질전환 식물체가 선발되었으며, T₁ 종자가 GUS 분석에 사용되었다.

6. GUS 활성의 조직화학적 분석

GUS 염색은 변형된 1/2 MS 배지에서 자라는 형질전환된 아라비돕시스 식물로 수행되었다. 뿌리 특이성 및 NaCl 및 에틸렌, ABA 및 옥신 같은 식물호르몬의 효과를 조사하기 위해, 5일 된 형질전환 아라비돕시스 식물체에 100 μM 에테폰, 100 μM ABA, 1 μM NAA, 및 170 mM NaCl이 각각 2 시간 동안 처리되었다. GUS 발현은 형질전환 식물체를 37℃에서 2 시간 동안 pH 7.0의 100 mM 나트륨 인산염 버퍼, 10 mM Na-EDTA, 0.5 mM 페리시안화칼륨, 0.5 mM 페로시안화칼륨, 1 mM X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid), 0.06% (v/v) Triton X-100에 배양(Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907)한 후 관찰하였다. 염색된 시료는 100% 에탄올로 엽록소를 제거한 후 촬영되었다.

실시예 1: RT - PCR 및 프로모터 분석

α- DOX1 유전자의 공간적 발현을 보기 위해, 총 RNA를 마이크로톰의 잎, 녹색 열매, 적색 열매, 꽃, 및 뿌리로부터 추출하였다. α- DOX1의 발현은 뿌리 특이적으로 보였다 (도 1). α- DOX1 유전자의 이런 발현 양상은 이전 연구 (Tirajoh et al. (2004) J Experi Bot 56:713-723)와 동일하였으므로, 세부적인 연구를 위하여 EST 중에서 선택되었다. α- DOX1 유전자의 프로모터 추정 구간은 토마토(Solanum lycopersicum) BAC library (http://www.sgn.cornell.edu)의 전장의 서열이 결정된 BAC 클론으로부터 얻었다. α- DOX1 프로모터는 식물시스 액팅조절 DNA 인자(Plant cis-acting regulatory DNA elements: PLACE) 프로그램 (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE)에 의한 분석으로 해독 개시점으로부터 2 kbp 업스트림 구간까지로 한정되었다. ROOTMOTIFTAPOX1 (ATATT) 및 OSE2ROOTNODULE (CTCTT)같은 뿌리 특이적 인자가 프로모터에 걸쳐 20 회 반복되어 있었다. rolD 프로모터의 일부인 ROOTMOTIFTAPOX1은 주로 뿌리의 신장대 및 유관속 조직에서 발현된다 (Elmayan & Tepfer (1995) Transgenic Res 4:388-396). 기관 특이적 인자 OSE2ROOTNODULE은 콩 근립헤모글로빈에 있어 뿌리혹 조직의 감염된 세포에서 발현된다 (Vieweg et al. (2004) MPMI 17: 62-69). ABA, 에틸렌, 상처 및 병원균과 관련된 몇 가지 인자가 있다 (도 2, 표 1).

표 1. 토마토 α- DOX1 프로모터의 2kb 업스트림 상의 추정적인 시스 액팅 인자

시스 액팅 인자	기능	위치	서열	빈도
ROOTMOTIFTAPOX1	뿌리 특이성 관련	-1923	ATATT	16
		-1758
		-1342
		-1207
		-1114
		-885
		-741
		-714
		-680
		-534
		-477
		-458
		-423
		-366
		-188
		-11
OSEROOTNODULE	뿌리혹의 감염세포에서 활성화	-1993	CTCTT	3
		-1779
		-824
MYCCONSENSUSAT	ABA에 관련	-1909	CANNTG	10
		-1702
		-1607
		-1445
		-576
		-204
ABRELATERD1		-576	ACGTG
ABRERATCAL		-577	MACGYGB
ACGTABREMOTIFA2OSEM		-578	ACGTGKC
LTRECOREATCOR15		-1349	CCGAC
GT1GMSCAM4	염에 관련	-1414	GAAAAA	4
		-1295
		-524
		-121
ASF1MOTIFCAMV	옥신에 관련	-1448	TGACG	2
		-210
GCCCORE	에틸렌에 관련	-81	GCCGCC	1

실시예 2: α- DOX1 프로모터의 통제 하에서 GUS 발현

본 발명에서, 토마토의 α- DOX1 뿌리 특이적 프로모터는 형질전환된 아라비돕시스에서 활성이 있었다. 토마토 프로모터의 화분 특이성은 유전자 융합물의 형질전환에 토마토 또는 아라비돕시스의 사용 시 독자적이었다 (Twell et al. (1990) Development 109:705-713). 다른 연구에서, 아라비돕시스의 산성 키티네이즈 프로 모터의 발현을 테스트하기 위해 이종형질전환 토마토를 만들었다. 토마토 및 아라비돕시스에 있어 기관 특이성의 GUS 염색은 비슷하였다 (Samac & Shah (1991) Plant cell 3:1063-1072). 토마토 및 아라비돕시스 양자에 있어 프로모터의 이종형질전환은 잘 수행되는 것으로 보인다.

SlDOX1P10 및 SlDOX1P05를 지닌 형질전환 식물체의 GUS 염색은 하배축 및 뿌리 간 전이부 및 뿌리 분화 구간에서 고도의 GUS 발현을 보였으나, 근단에서는 보이지 않았다 (도 3, 도 4의 A 및 F). SlDOX1P05 프로모터 하에서 GUS 발현은 유관속 조직에서보다는 주로 뿌리의 표피세포 및 피층세포 였다 (도 3의 C 및 D). 이들 결과는 Le α- DOX1 전사물이 뿌리에서만 검출된 RT-PCR 결과 (도 1; Tirajoh et al. (2004) J Experi Bot 56:713-723) 및 At α- DOX1의 GUS 발현이 뿌리의 표피세포에서 보였던 것 (Vellosillo et al. (2007) Plant Cell 19:831-846)과 일치한다. 뿌리의 분열조직 구간에는 GUS 발현이 거의 없었다(도 3의 A 및 C). 생성 중인 측근은 희미하게 염색되었다 (도 3의 A 및 D). 그러나, GUS 발현은 성숙한 잎이 아니라 잎의 발생이 시작되는 부위인 엽원기로 여겨지는 구간에서 보였다 (도 3의 E 및 F). 꽃, 장각과, 줄기, 및 줄기에 달린 잎은 염색되지 않았다. GUS 발현은 상처 스트레스에 의해서도 증가되었으며 (자료 미제시), 이는 상처 스트레스가 토마토에 있어서 α- DOX1의 강력한 상향조절을 유도한다는 이전 연구 (Tirajoh et al. (2004) J Experi Bot 56:713-723)와 일치하는 것이다. 추가적으로 SlDOX1P15을 지닌 형질전환 식물체도 뿌리에서만 GUS 발현을 보였다 (자료 미제시).

실시예 3: α- DOX1 프로모터 활성에 미치는 식물호르몬 및 염의 효과

GUS의 발현 수준이 다양한 처리 하에서 평가되었다. SlDOX1P10 및 SlDOX1P05의 통제 하에서, GUS 발현은 근단에서는 보이지 않았으며, 주로 하배축에 가까운 뿌리 분화 구간에서 보였다 (도 4의 A 및 F). 어린 뿌리에서 SlDOX1P10의 GUS 발현 조직은 에틸렌 처리에 의해 저해되었다 (도 4의 B). 대조구에 비해 (도 4의 F), 에테폰, ABA 및 염으로 처리된 SIDOX1P05의 GUS 발현은 뿌리에서 뿐 아니라 자엽에서도 나타났으나 (도 4의 G, H, 및 J), 옥신은 SlDOXP05 프로모터의 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 4의 I). 에테폰으로 처리된 형질전환 식물체에 있어 GUS 발현의 결과는 현저하였다. SlDOX1P05의 경우, GUS 발현은 뿌리에 제한적이지 않았고, 대조구에 비하여 잎 및 특히 근관에서 상당히 증가되었다 (도 4의 G). 그러나, SlDOX1P10의 조절 하에서 GUS 발현은 억제제 같은 강력한 전사 인자에 의한 영향을 받을 것이다. 프로모터 분석에 따르면, 아라비돕시스 및 토마토(Solanum lycopersicum)에서 질병발생-관련된 유전자에 에틸렌 반응성을 주기에 충분한 GCCCORE 인자(GCCGCC)가 있다 (Tournier et al. (2003) FEBS Letters 550:149-154). GCCCORE 서열은 SlDOX1P10 및 SlDOX1P05에 있어 -81 bp에서 -76 bp 사이에서 발견되었다. 이 에틸렌 반응성 인자는 SlDOX1P05의 GUS 발현에 영향을 미칠 수 있다.

아라비돕시스에 있어 병원균 유도된 α- DOX의 발현은 ABA에 의해 조절된다 (Seki et al. (2002) Funt Integr Genomics 2:282-291). Le α- DOX1 발현은 또한 ABA에 반응한다 (Tirajoh et al. (2004) J Experi Bot 56:713-723). 프로모터 분석 에 따르면, ABA에 관련된 시스 액팅 인자(CANNTG)가 있다 (도 2). ABA 관련 모티프 중 하나인, ABRE (ACGTG)는 ABA 유도성 유전자의 대부분의 프로모터에서 전사 개시점의 300bp 업스트림 내에서 발견되나, ABA 반응성 인자 (ABRE)의 단일 copy는 ABA 유도에 충분하지 않다 (Hobo et al. (1999) Plant J 19:679-689). SlDOX1P10에 의해 추진된 GUS 발현은 대조구와 비슷하게 뿌리에서 되었다 (도 4의 A 및 C). 반면, SlDOX1P05은 GUS 발현을 뿌리뿐 아니라 자엽에서도 보였다 (도 4의 H). 이 인자는 다른 전사 인자와의 상호작용에 의한 다른 신호에 반응하는 것이 가능하다.

bZIP 전사 인자(Izawa et al. (1993) J Mol Biol 230:1131-1144)에 대한 결합부위인 옥신 관련 인자, ASF1MOTIFCAMV (TGACG)가 -210 bp에서 -206 bp 사이에 있다. TGACG 모티프는 옥신 또는 살리실산에 의한 몇 유전자의 전사 활성화에 관여된다. 다른 시약 처리 결과와 비교하여, 옥신 처리된 SlDOX1P10 및 SlDOX1P05의 GUS 발현은 대조구 중의 하나와 비슷하였다 (도 4의 D 및 I). 옥신은 α- DOX1의 발현에 영향을 미치지 않는다.

염에의 노출은 Le α- DOX의 모든 isoforms의 전사물의 수준에 가장 빠른 시간 간격으로 음의 효과를 가진다. Le α- DOX1은 염 처리 후 30 분에 하향 조절된다 (Tirajoh et al. (2004) J Experi Bot 56:713-723). 본 발명에서, 형질전환 식물은 170 mM NaCl로 2 시간 동안 처리되었다. 염 관련 인자, GT1GMSCAM4 (GAAAAA)가 -121 bp에서 -116 bp 사이, 및 -524 bp에서 -519 bp 사이에서 발견되었다. 아라비돕시스에 있어서 GT1GMSCAM4의 전사 인자, AtGT-3b의 전사는 NaCl에 의해 유도된다 (Park et al. (2004) Pl Physiol 135:2150-2161). SlDOX1P10에 있어 GUS 발현은 대 조구와 비슷하였다 (도 4의 E). 대조적으로, NaCl-처리된 SlDOX1P05의 GUS 발현은 삼투 스트레스로 인해 자엽에서 나타났다 (도 4의 J). 보다 명확한 결과는 α- DOX1이 보다 낮은 염 농도에서 8 또는 24 시간 동안 처리되면 가능하다.

조직화학적 GUS 분석은 정성 분석이며, 동일한 시스 인자임에도 불구하고 아라비돕시스 및 토마토에서 다르게 작용할 또 다른 가능성이 있음을 고려해야 한다.

결론적으로, SlDOX1P10의 발현은 다양한 처리 하에서 뿌리에 제한되었다. 반면, SlDOX1P05의 발현은 뿌리에 제한되지 않았으며, 자엽에서도 보였다. 따라서, 566 bp (-566 bp에서 -1 사이) 내의 구간은 뿌리 특이적 발현에 충분하여, 식물 뿌리에서 외래 유전자를 발현시키기에 유용하다. 더욱이, 469 bp 구간 (-1036 bp에서 -567 bp 사이)은 뿌리 특이성의 증가를 위해 뿌리를 제외한 다른 조직에서 SIDOX1 유전자의 발현을 제한하는 강력한 억제 구간을 포함한다.

도 1은 토마토에서 알파-디옥시게나아제1(α- DOX1 )의 뿌리 특이적 발현을 보여준다. RT-PCR 분석을 위해 총 RNA 시료를 잎 (L), 녹색 열매 (GF), 적색 열매 (RF), 꽃 (FL), 및 뿌리 (R)에서 분리하였다. 액틴 유전자의 전사물 수준이 RNA 동량 로딩의 대조구로 사용되었다.

도 2는 SlDOX1P10 및 SlDOX1P05의 Deletion 단편이다. α- DOX1 프로모터(SlDOX1P)에 있어 뿌리 특이성 및 식물 호르몬 반응성에 대한 많은 시스 액팅 인자가 PLACE 분석에 의해 발견되었다. 시스 액팅 인자의 위치는 SlDOX1P 상에 몇 개의 bars로 표시되었다. 뿌리 특이적 모티프는 프로모터 상에 산재한다. deletion 분석은 약 500bp 간격이었다. 제한부위 뒤에 두 개의 염기를 첨가한 것은 프로모터 단편을 안정적으로 클로닝하기 위한 것이다.

도 3은 SlDOX1P10 (A-B) 및 SlDOX1P05 (C-F) 하에서 형질전환된 아라비돕시스 뿌리의 GUS 조직화학적 염색을 보여준다. A 및 B는 하배축 및 뿌리 간의 전이부에서의 GUS 발현, C 및 D는 뿌리 표피세포에서의 GUS 발현, E 및 F는 엽원기에서의 GUS 발현을 보여준다.

도 4는 다양한 처리 하에서 SlDOX1P10 (A-E) 및 SlDOX1P05 (F-J)을 발현하는 형질전환된 아라비돕시스 실생의 GUS 조직화학적 염색을 보여준다. 5일 된 형질전환 아라비돕시스 실생은 100 μM 에테폰, 100 μM ABA, 170 mM NaCl, 또는 1μM NAA로 2 시간 동안 처리되고, 1 mM X-GluC 용액으로 2 시간 동안 염색되었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Root-specific alpha-Dioxygenase1 promoter in Tomato and uses thereof <130> PN09016 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2002 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <400> 1 taaaacgaga aagagagaaa ggcaaaagaa actggacagg ggagtatttt tactgtagaa 60 ttattagtgt atcggacgaa aatatatgta cttgcatgtg tatatacaat tttctcacga 120 ttcatacgaa cagaaacgca atttatatgt ttcgcttttg tttgtataag tgagaaaggc 180 gagggtggcg agcgagattt gggagagtgg cgagcaagat ttggaagagg ggagagggga 240 acaaaaatat acgtatttat acaattttct ctgctttata caattagaaa caatttttat 300 acacttgtat ttgtataaaa agtgaggaag cgagcgagag attggaggag agtggcgagc 360 gacatatttg ggagagagga gcctgacaat tttttgcaaa tgttttctat ggaactcaat 420 taaattaaac cctagctatt ccatttattt taagttatta gtttgctatt atatacaatt 480 ttcccaaatt ataaagtacg aattgaaaat acagggttta cttttactaa ttgtttagtt 540 cgtaatttcc tgactcgtca tatgcttggt caaaacttta taattttttt ttttcaatta 600 tatccttaaa attattctgt aattgaatta aggtaaataa ttatcggaat aattgtcgga 660 caatattacc aacatgagaa gaacaaattt gtcgtcgtgt ttgcctcttt tttccactta 720 aattatttga agaaaaataa ttgtccttat tgatacttgc aaaatgtaaa ttttcatttt 780 tttaaagaaa aagtagaata tttactttta aaattgaaaa gacggcataa aacagtaaat 840 ttgaataaat catatacact tacacataaa aattacactt cgtaatttta atatatatgc 900 aatttaataa attgttagaa atacaattaa ttagaaaacc acaaaagtat ttatatatat 960 tcaattaaga tcataaatgt tatatggtga tatttttgtc ttttttatta gttaatgtta 1020 aacaacatat ttcaaatttt gtattaattt atttagtaac aaatcatttt ctctaaataa 1080 tttgtaagtc aatctattta aataaatcta ctaataaaaa tataaatcat aaaatcaaga 1140 aaatttataa aataataaaa ataatttaaa attactttta tcttttacct aaacttatat 1200 catgatatta tatcttatat tttactaatc tctctaaatg aaagtattag taataatcct 1260 ataatatcat gtaagtgaga taactaatta atatattaat tatatatatt taaattctta 1320 tcaaatataa tactaaatta tacgatacac aaaatatgga ctctttattt tatcgccacc 1380 taccaagtag caacaaccgc tcaaagtcac cgaccattag gagcggacac gtgtaggtgt 1440 gttaataggg aggatagcat ttttgagaaa atattcttat ttttccgact ttttagaaaa 1500 taaaaggaaa ttgacgttgg gctgaaaata tagttaaaca ataaaaatat attattttta 1560 atagattaaa ttttttaaat aatatattca tacactgtaa caataataat gctgagcgca 1620 caaaaaaatt gaaattgaat atcatcgtaa aaaaaatctc taatcaaaat tagagaatcg 1680 cgttcatcat acaataattt tacccaaaac cgtctattca atgaccaatc atttaaaaat 1740 tattacattg cagatctgga gctaaagaca aagtgaattt caattagtat attcgtcatc 1800 aaatgatata aaaataatat ctcagctctt tctttttgac tgatatatcg tcttgtatat 1860 gtgcacacca tatatacaat tttttttcct ttcaaatttc tacaagatct tatcatttag 1920 ctggcggcta aaattggaaa ataattgtca aagccatcca acatgctagt attatttatt 1980 cccaatcgtg ataatattat ct 2002 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCRf <400> 2 tgggccaaac aaatctcttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCRr <400> 3 cactagcttg atgccccatt 20 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SlDOX1p2002 <400> 4 ttaagcttaa aacgagaaag agagaaaggc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SlDOX1p2 <400> 5 atgaattcag ataatattat cacgattggg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SlDOX1p1036 <400> 6 ttaagcttag atcataaatg ttatatggtg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SlDOX1P0566 <400> 7 caaagcttgt gtgttaatag ggaggatagc 30

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열 중 968번에서 1436번째 염기서열로 이루어진 식물 뿌리 특이적 발현 프로모터.
2. 제1항의 뿌리 특이적 발현 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
3. 제2항의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체.
4. 삭제
5. 제2항의 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및

   상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 뿌리 특이적으로 발현시키는 방법.
6. 삭제
7. 제5항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 뿌리 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체.
8. 삭제

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