TWI534265B

TWI534265B - 用於操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之方法、基因建構體及基因轉殖植物細胞

Info

Publication number: TWI534265B
Application number: TW098130928A
Authority: TW
Inventors: 吉爾曼史賓根堡; 阿迪亞慕拉多夫; 梅根Ｅ葛利弗斯; 路西安諾Ｇ馬堤洛托
Original assignee: 農業維多利亞服務有限公司
Priority date: 2008-09-15
Filing date: 2009-09-14
Publication date: 2016-05-21
Also published as: UY32117A; JP2012501662A; NZ603035A; US9890387B2; JP6224030B2; WO2010028456A1; AR122447A2; TW201014909A; US20110277187A1; BRPI0913562A2; JP5805534B2; AU2009291522B2; NZ591777A; EP2337848A4; CA2737059A1; MX2011002786A; JP2015154789A; EP2337848A1; AR073593A1; AU2009291522A1

Description

用於操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之方法、基因建構體及基因轉殖植物細胞

發明領域

本發明有關植物中果聚糖生合成之修飾，更明確地係有關操作光合細胞中果聚糖生合成之方法，以及相關的核酸與建構體。

本發明亦有關增加植物的生物量，更明確地係有關提高包括植物中生長之枝和/或根之生物量產量和/或產量安定性之方法，以及相關的核酸與建構體。

本發明亦有關提高生化路徑的生產率之方法，更明確地係有關植物中之融合蛋白，以及相關的核酸與建構體。

發明背景

果聚糖係一種水溶性碳水化合物，其主要功能係為植物之生長提供易取得之能量儲備。果聚糖與禾本科植物中各種優點有關連，諸如耐寒與耐旱性、分蘗存活率增加、持久性提高、割下或放牧後良好的再生長、逆境後之恢復改善、早春生長以及營養價值增加。

禾本科植物與穀類植物中果聚糖的合成與代謝很複雜。果聚糖係由線性或分枝果糖鏈附著於蔗糖所構成。植物果聚糖之鏈長範圍從3至高達數百個果聚糖單元。不同類型之果聚糖可依據連接類型來做區別。在多年生黑麥草方面，已鑑定出三種果聚糖：菊糖、菊糖新生系列(inulin neoseries)以及左聚糖新生系列(levan neoseries)，在此等果聚糖之生合成中，牽涉四種果糖基轉移酶(FT)酵素(第6圖)。酵素1-SST(蔗糖：蔗糖1-果糖基轉移酶)催化果聚糖生合成之第一步驟，而剩下的酵素延長增長中的果糖鏈(1-FFT：果聚糖：果聚糖1-果糖基轉移酶、6G-FFT：6-葡萄糖果糖基轉移酶以及6-SFT：蔗糖：果糖6-果糖基轉移酶)。酵素1-FEH或6-FEH(果聚糖外水解酶)藉由釋出果糖分子而減少果聚糖之鏈長。

果聚糖為15%的植物物種中主要非結構碳水化合物之代表，且在草料品質方面扮演關鍵性的角色。在高果聚糖飼料上放牧之反芻家畜，展現出增進的動物成果。

在禾本科植物方面，已有透過設計表達果糖基轉移酶(FT)基因，來增加在莖與葉鞘中果聚糖之位準以及組成。

然而，藉由操縱生化路徑中酵素之活性來操縱該路徑可能會很困難，因為該方法中各種酵素以及其等之基質可能會交互反應。

因此，希望具有操縱生化路徑，尤其是針對植物，之改良方法。例如，希望具有操縱植物(包括諸如黑麥草屬(Lolium)與羊茅屬(Festuca)之草種以及諸如小麥與玉米之穀類植物)中果聚糖生合成之方法，從而促進如具有草料品質經改良的飼料牧草之生產，產生改良的牧草產物、改良的動物產物且降低環境污染、具有生物量產量提高之生質能源牧草(如用於生質酒精之生產)以及如具有穀粒與生物量產量增加之穀物植物。

以前已經有從某些植物物種中，分離出編碼牽涉某些聚糖生合成路徑之酵素之核酸序列。例如，本申請人之PCT/AU01/00705案，敘述來自黑麥草屬與羊茅屬之果糖基轉移酶同源物。然而，仍需要一種可用於修飾植物中果聚糖生合成以及亦能操縱果聚糖累積於植物之不同部位之物質。

本發明之目的係去克服或至少減少一或多個與先前技術有關聯之困難或缺點。

發明概要

申請人已發現，能夠藉由在空間上改編光合細胞之果聚糖生合成路徑，提高植物(如飼料牧草)之營養和/或增加植物生物量。使用此方法能夠迫使果聚糖累積在主要餵給家畜之植物器官，且正常情況下不會累積果聚糖之葉片。因此，果聚糖，特別是該等展現高聚合化位準者(‘高DP果聚糖)，提供放牧動物更易取得之營養。果聚糖會累積在莖以及葉鞘中，因為葉之果聚糖僅在CO₂之吸收勝過生長之時期形成。藉由在合成蔗糖之光合細胞中表達果聚糖基因，從而驅動果聚糖優先累積於葉片中，可提高飼料牧草之營養以及提供放牧家畜更多的能量。

飼料牧草內之果聚糖，能有效地幫助放牧的反芻動物易於取得飼料中之能量。在瘤胃中之發酵過程需要大量易於取得之能量。改善瘤胃中易於取得之能量，可增加瘤胃消化之效率。瘤胃消化之效率增加，可改善餵給反芻動物之飼料蛋白變成牛奶或肉之轉換，且降低氮廢棄物。

申請人亦發現，改編光合細胞以延長命，例如藉由延遲葉子老化，可幫助增加植物生物量。

申請人亦發現，利用一編碼由生化路徑而來之二或多種酵素之融合體(更特別地轉譯融合體)之基因建構體，使該路徑中之酵素活性協同作用，能夠提高該生化路徑之生產率。

雖然申請人不想要受理論之限制，但一般認為藉由將路徑中之二個酵素拉近，例如經由表達轉譯融合體，可使個別的酵素之表達產生協同作用，從而改良該路徑之效率。

例如，藉由表達二或多種FT基因(如，Lp1-SST與Lp6G-FFT)之轉譯融合體，可減少與此等基因獨自整合入植物基因體內所產生之表達形態的差異相關之問題，使得蔗糖分子直接轉換成果聚糖，該等展現低程度聚合化(‘低DP果聚糖’)以及高程度聚合化(‘高DP果聚糖’)之果聚糖。此外，該FT蛋白可按照自然規律彼此互相結合，形成供果聚糖之有效生合成之代謝管道。

此外，表達光合細胞之FT基因，使低與高DP果聚糖累積於光合細胞中，可免除光合作用之抑制機制，促進太陽能的捕捉以及增加CO₂之固定。

因此，申請人發現改編光合細胞以延長命以及提高果聚糖生合成，會促進太陽能之捕捉以及增加植物生物量，包括枝和/或根之生長。

此外，因為低與高DP果聚糖之累積與植物對諸如冷與乾旱之非生命逆境的耐受性有關；以及因為根生長之提高和/或葉老化之延遲亦與植物之耐旱性有牽連，所以改編光合細胞以延長命和/或提高果聚糖生合成，可促進產率安定性和/或植物對非生命逆境之耐受性。

據此，於一態樣方面，本發明提供一種操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之方法，該方法包括於該植物中引入一有效量之基因建構體，該基因建構體包括一啟動子或其功能活性片段或變異體，有效地連接至編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸或其等之功能活性片段或變異體。

關於‘操縱果聚糖生合成’，通常意指相對於未轉形對照組植物，增加轉形植物中果聚糖之生合成。然而，對於某些申請案而言，其可能希望相對於未轉形對照組植物，去減少或以其它方式修飾轉形植物之果聚糖的生合成。例如，其可能希望相對於未轉形對照組植物，去增加或減少轉形植物之果聚糖生合成路徑中，某些酵素之活性。

關於‘光合細胞’意指該等於其中發生光合作用之細胞。此等細胞一般含有葉綠素，又稱作綠色細胞。大部分的光合細胞在植物之葉子中。較佳地，本發明之基因建構體係在維管素鞘細胞中表達，更佳地在葉肉和/或薄壁組織維管素鞘細胞中表達。

關於‘有效量’意指足以在該植物或由該植物衍生而來之植物、植物種子或其它植物部份中，產生可識別的表現型特性之數量。熟悉此技藝之人士在考慮植物之種類、投與路徑以及其它相關的因素後，可很容易地決定此等數量。此一人士能夠很容易地決定適當的投與數量以及方法。參見，例如，Maniatis et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor，其全部揭示內容在此併入本案以為參考。

關於‘基因建構體’意指重組核酸分子。

關於‘啟動子’意指一核酸序列，其足以引導有效連接的核酸序列之轉錄。

關於‘有效地連接’意指該核酸與一諸如啟動子之規則序列，以使該核酸在適當條件下(例如，諸如轉錄活化蛋白之適當的分子連結至該規則序列時)能夠表達之方法連接。較佳地，有效地連接的啟動子在相關核酸之上游。

關於‘上游’意指沿著該核酸之3’至5’之方向。

關於‘核酸’意指能夠攜帶基因訊息之核苷酸鏈。該術語一般指的是基因或其功能活性片段或變異體和/或在有機體之基因組中會影響其表現型之其它序列。該術語‘核酸’包括DNA(諸如cDNA或基因組DNA)以及RNA(諸如mRNA或微RNA)，其為單鏈或雙鏈，任擇地含有合成、非天然或經改變的核苷酸鹼基；合成的核酸；以及其等之組合。

關於‘編碼果聚糖生合成酵素之核酸’意指編碼植物中果聚糖生合成路徑之酵素之核酸，例如果糖基轉移酶，諸如蔗糖：蔗糖1-果糖基轉移酶(1-SST)、果聚糖：果聚糖1-果糖基轉移酶(1-FFT)、蔗糖：果聚糖6-果糖基轉移酶(6-SFT)以及果聚糖：果聚糖6G-果糖基轉移酶(6G-FFT)；以及果聚糖外水解酶，諸如1-果聚糖外水解酶(1-FEH)以及6-果聚糖外水解酶(6-FEH)。

關於啟動子之‘功能活性片段或變異體’，意指能夠引導有效連接的核酸之轉錄之片段或變異體(諸如類似物、衍生物或突變體)。此等變異體包括天然發生的對偶變異體以及非天然發生的變異體。亦包括一或多個核苷酸之添加、刪除、取代以及衍化，只要該等修飾不會導致該片段或變異體之功能喪失即可。較佳地，該功能活性片段或變異體具有至少將近80%與以上所提及該片段或變異體相應之序列之相關部分一致，更佳地至少將近90%一致，甚至更佳地至少將近95%一致，最佳地至少將近98%一致。較佳地，該片段具有至少20個核苷酸之大小，更佳地至少50個核苷酸，更佳地至少100個核苷酸，更佳地至少200個核苷酸，更佳地至少300個核苷酸。

與編碼果聚糖生合成酵素之核酸有關之‘功能活性’，意指該片段或變異體(諸如類似物、衍生物或突變體)能夠以本發明之方法，例如被轉譯成能夠參與果聚糖生合成路徑之酵素，操縱植物中果聚糖之生合成。此等變異體包括天然發生之對偶變異體以及非天然發生之變異體。亦包括一或多個核苷酸之添加、刪除、取代以及衍化，只要該等修飾不會導致該片段或變異體之功能喪失即可。較佳地，該功能活性片段或變異體具有至少將近80%與以上所提及該片段或變異體相應之序列之相關部分一致，更佳地至少將近90%一致，甚至更佳地至少將近95%一致，最佳地至少將近98%一致。此等功能活性變異體以及片段包括，例如，該等具有保留性核酸改變者。

關於‘保留性核酸改變’意指核酸之取代，因該等基因碼之簡併，導致保留該編碼的蛋白質之胺基酸。此等功能活性變異體與片段亦包括，例如，該等具有在該對應的胺基酸序列中導致一或多個殘基之保留性胺基酸取代之核酸改變者。

關於‘保留性胺基酸取代’意指胺基酸被另一個相同類型之胺基酸取代，該等類型如下：

非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met Phe、Trp

不帶電極性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln

酸性：Asp、Glu

鹼性：Lys、Arg、His

其它保留性胺基酸取代亦可變成如下：

芳族的：Phe、Tyr、His

質子提供者：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp

質子接受者：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln

特佳的片段與變異體包括一或多個保留性蔗糖結合/水解結構區。此等結構區之例子示於本發明之第17、18以及36圖中，例如(N/S)DP(N)G、FRDP以及EC(I)D。

特佳的片段與變異體亦包括一或多個在黑麥草屬FT、轉化酶以及FEH序列中找到之保留性胺基酸結構區，例如，如本發明之第17、18以及36圖中所示。

較佳地，該片段具有至少20個核苷酸之大小，更佳地至少50個核苷酸，更佳地至少100個核苷酸，更佳地至少200個核苷酸，更佳地至少500個核苷酸。

較佳地，該編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸係擇自於由下列所構成之群組：編碼1-SST、1-FFT、6-SFT以及6G-FFT之基因；其等之組合；以及其等之功能活性片段與變異體。較佳地，該核酸編碼二或多個此等果聚糖生合成酵素之FT融合蛋白。

甚至更佳地，該編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸，編碼1-SST和/或6G-FFT，甚至更佳地1-SST與6G-FFT之FT融合蛋白，或其等之功能活性片段或變異體。

較佳地，該編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸係分離自或相應於由有興趣的物種而來之基因。更佳地，該(等)基因來自黑麥草、羊茅草或小麥物種，包括義大利或一年生黑麥草、多年生黑麥草、高羊茅、草原狐草、紫羊茅、小麥以及硬質小麥。甚至更佳地，該編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸係分離自或相應於由諸如多年生黑麥草(多年生黑麥草)或葦狀羊茅(Lolium arundinaceum)之黑麥草物種而來之基因。

適合的編碼果聚糖生合成酵素之核酸述於PCT/AU01/00705以及PCT/AU01/01275中，其等之全部揭示內容在此併入本案以為參考。

於特佳之具體例中，該編碼1-SST之核酸包括擇自於由下列所構成之群組之序列：PCT/AU01/00705之序列辨識編號：11中所示之序列；以及編碼PCT/AU01/00705之序列辨識編號：12中所示之多肽序列之核苷酸序列；以及其等之功能活性片段與變異體。

於一特佳的具體例中，該編碼6G-FFT之核酸包括擇自於由下列所構成之群組之序列：PCT/AU01/01275之序列辨識編號：110以及本發明之第7圖中所示之序列；以及編碼PCT/AU01/01275之序列辨識編號：111以及本發明之第8圖中所示之多肽序列之核酸序列；以及其等之功能活性片段與變異體。

於一特佳的具體例中，該編碼1-FFT之核酸包括擇自於由下列所構成之群組之序列：PCT/AU01/00705之序列辨識編號：3、PCT/AU01/01275之序列辨識編號：103與105-109以及本發明之第9圖中所示之序列；以及編碼PCT/AU01/00705之序列辨識編號：4、PCT/AU01/01275之序列辨識編號：104以及本發明之第10圖中所示之多肽序列之核苷酸序列；以及其等之功能活性片段與變異體。

申請人發現，藉由使二種FT基因之轉譯融合體成為單一開放讀取架構，例如，由多年生黑麥草(多年生黑麥草)而來之蔗糖-蔗糖1-果糖基轉移酶(Lp1-SST)以及果聚糖-果聚糖6G-果糖基轉移酶(Lp6G-FFT)，可產生單一mRNA轉錄本，其會轉譯成結合酵素活性之單一蛋白。藉由表達二種FT基因(如，Lp1-SST以及Lp6G-FFT)之轉譯融合體，可減少與此二種基因獨自整合入該植物基因體內所產生之表達形態的差異相關之問題，使得蔗糖轉換成低與高DP果聚糖。

於特佳的具體例中，該編碼1-SST與6G-FFT之FT融合蛋白之核酸包括擇自於由下列所構成之群組之序列：本發明之第12與14圖中所示之序列，以及編碼本發明之第13與15圖中所示之多肽序列之核酸序列；以及其等之功能活性片段與變異體。

於特佳的具體例中，該基因建構體包括擇自於由下列所構成之群組之序列：本發明之第24至27圖、第31圖、第32圖、第35圖、第36圖、第38圖以及第41至475圖中所示之序列；以及其等之功能活性片段與變異體。

在另外態樣方面，本發明提供一種提高植物中生化路徑之生產率之方法，該方法包括於該植物中引入一有效量之基因建構體，該基因建構體包括編碼從該路徑而來之二或多種酵素之核酸，或其等之功能活性片段或變異體。

較佳地，該等核酸連接形成一編碼該二或多種酵素之融合蛋白之融合基因。

關於‘生化路徑’意指在一個細胞內發生之數個化學反應，其等由超過一種酵素或酵素次單元催化，且導致基質轉換成產物。此包括，例如，其中二或多種酵素次單元(各為由不同的基因編碼之不連接的蛋白)結合形成一個將基質轉換成產物之處理單元之情況。‘生化路徑’不受時間或空間順序之限制。

關於‘提高生產率’一般意指相對於未轉形之對照組植物，於轉形的植物中生化路徑之產物數量或該產物之生產的速率增加。然而，對於某些申請案而言，其可能希望相對於未轉形對照組植物，去減少或以其它方式修飾該轉形植物中生物路徑之產物數量或該產物生產之速率。例如，其可能希望相對於未轉形對照組植物，去增加或減少該轉形植物中該路徑之中間體之數量或其生產之速率。

關於‘融合蛋白’意指藉由表達一融合基因(包括二或多種原先編碼不同蛋白，之後連接在一起之核酸，或其等之功能活性片段或變異體)，以重組方式產生的雜交或嵌合蛋白。

關於‘融合體’、‘轉譯融合體’或‘融合基因’意指二或多種核酸以使能表達該融合蛋白(較佳地轉譯融合體)之方式連接。此典型地涉及從編碼第一個蛋白之核酸序列中移除終止密碼子，接著將第二個蛋白之核酸序列附加在架構內。之後於一細胞中表達該FT融合基因成單一蛋白。該蛋白可被設計成包括原來蛋白二者之整段序列，或其等個別或二者之功能活性片段或變異體。

該基因建構體亦可包括編碼該二個連接的核酸間之連接子之核酸序列。‘連接子’係任一種位在融合蛋白之二個相鄰的活性片段之間且結合而形成二個相鄰的活性片段之化學物、合成物、碳水化合物、脂質、多肽分子(或其等之組合)。本發明之較佳的連接子係可彎曲的連接子，諸如由一或多種胺基酸殘基所構成，藉由胺基酸鍵結至該二個活性片段而連接在一起之多肽鏈。例如，(Gly₄Ser)₃連接子位於該融合蛋白中二個活性片段之間。

關於編碼從生化路徑而來之二或多種酵素之核酸之‘功能活性’意指，利用本發明之方法，該片段或變異體(諸如類似物、衍生物或突變體)能夠提高植物中生化路徑之生產率。此等變異體包括天然發生的對偶變異體以及非天然發生的變異體。亦包括一或多個核苷酸之添加、刪除、取代以及衍化，只要該等修飾不會導致該片段或變異體之功能喪失即可。較佳地，該功能活性片段或變異體具有至少將近80%與以上所提及該片段或變異體相應之序列之相關部分一致，更佳地至少將近90%一致，甚至更佳地至少將近95%一致，最佳地至少將近98%一致。此等功能活性變異體與片段包括，例如，該等具有保留性核酸改變者。‘保留性核酸改變’意指核酸之取代，因該等基因碼之簡併，導致保留該編碼的蛋白質之相同胺基酸。此等功能活性變異體與片段亦包括，例如，該等具有在該對應的胺基酸序列中導致一或多個殘基之保留性胺基酸取代之核酸改變者。關於‘保留性胺基酸取代’意指胺基酸被另一個相同類型之胺基酸取代，該等類型如下：

非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met Phe、Trp

不帶電極性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln

酸性：Asp、Glu

鹼性：Lys、Arg、His

其它保留性胺基酸取代亦可變成如下：

芳族的：Phe、Tyr、His

質子提供者：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp

質子接受者：Glu、ASp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln

特佳的片段與變異體亦包括一或多個例如本發明之第17、18以及36圖中所示之黑麥屬FT、轉化酶以及FEH序列中找到之保留性胺基酸結構區。

較佳地，該生化路徑係果聚糖生合成路徑。

較佳地，從該路徑而來之二或多種酵素係擇自於由下列所構成之群組：植物中果聚糖生合成路徑之酵素，例如，果糖基轉移酶，諸如蔗糖：蔗糖1-果糖基轉移酶(1-SST)、果聚糖：果聚糖1-果糖基轉移酶(1-FFT)、蔗糖：果聚糖6-果糖基轉移酶(6-SFT)以及果聚糖：果聚糖6G-果糖基轉移酶(6G-FFT)；以及果聚糖外水解酶，諸如1-果聚糖外水解酶(1-FEH)以及6-果聚糖外水解酶(6-FEH)。

甚至更較佳地，該編碼FT融合蛋白之核酸包括二或多種擇自於由下列所構成之群組之核酸：編碼1-SST、1-FFT、6-SFT以及6G-FFT之基因以及其等之功能活性片段與變異體(其等連接形成FT融合基因)。任擇地以諸如可彎曲的連接子連接該等核酸。

甚至更佳地，該編碼FT融合蛋白之核酸包括二或多種任擇地以諸如可彎曲的連接子連接，以形成1-SST與6G-FFT之FT融合蛋白之核酸，或其等之功能活性片段或變異體。

較佳地，該編碼果聚糖生合成路徑之酵素之基因，係分離自或對應於從黑麥草或羊茅草物種而來之基因，包括義大利或一年生黑麥草、多年生黑麥草、高羊茅、草原狐草以及紫羊茅。甚至更佳地，該編碼果聚糖生合成路徑之酵素之基因，係分離自或對應於從諸如多年生黑麥草(多年生黑麥草)或葦狀羊茅(Lolium arundinaceum)之黑麥草物種而來之基因。

適合的編碼果聚糖生合成酵素之核酸述於PCT/AU01/00705與PCT/AU01/01275中，其等之全部揭示內容在此併入本案以為參考。

於特佳的具體例中，該編碼1-SST之核酸包括擇自於由下列所構成之群組之序列：PCT/AU01/00705之序列辨識編號：11中所示之序列；以及編碼PCT/AU01/00705之序列辨識編號：12中所示之多肽序列之核苷酸序列；以及其等之功能活性片段與變異體。

於特佳的具體例中，該編碼6G-FFT之核酸包括擇自於由下列所構成之群組之序列：PCT/AU01/01275之序列辨識編號：110以及本發明之第7圖中所示之序列；以及編碼PCT/AU01/01275之序列辨識編號：111以及本發明之第8圖中所示之多肽序列之核酸序列；以及其等之功能活性片段與變異體。

於特佳的具體例中，該編碼1-FFT之核酸包括擇自於由下列所構成之群組之序列：PCT/AU01/00705之序列辨識編號：3、PCT/AU01/01275之序列辨識編號：103以及105-109以及本發明之第9圖中所示之序列；以及編碼PCT/AU01/01275之序列辨識編號：4、PCT/AU01/01275之序列辨識編號：104以及本發明之第10圖中所示之多肽序列之核苷酸序列；以及其等之功能活性片段以及變異體。

於特佳的具體例中，該編碼1-SST與6G-FFT之核酸包括擇自於由下列所構成之群組之序列：本發明之第12與14圖中所示之序列，以及編碼本發明之第13與15圖中所示之多肽序列之核酸序列；以及其等之功能活性片段以及變異體。

於特佳的具體例中，該基因建構體包括擇自於由下列所構成之群組之序列：本發明之第24至27圖、第31圖、第32圖、第35圖、第36圖、第38圖以及第41至47圖中所示之序列；以及其等之功能活性片段以及變異體。

在本發明之建構體以及方法中使用之啟動子可為組成、組織專一性或誘導性啟動子。於較佳具體例中，該啟動子係光調節啟動子，更佳地光合啟動子。‘光調節啟動子’意指一種能夠因應光刺激而介導基因表達之啟動子。‘光合啟動子’意指一種能夠介導編碼牽涉植物中光合作用路徑之蛋白質之基因的表達之啟動子。

於成熟葉片中，果聚糖之累積比葉鞘以及莖中少。為了明確地增加葉片中果聚糖之位準，已設計出一於光合細胞中協同表達果聚糖生合成基因之對策(第1圖)。光調節或光合啟動子之使用，可提供下列優點：

‧光合啟動子在一大群包括葉片、上位莖以及莖外側之細胞中很活躍(>55%細胞)；

‧其等在生產蔗糖之細胞(葉肉以及薄壁組織維管素鞘細胞)中很活躍；

‧其等之表達形態在時間與空間上與蔗糖之累積重疊；

‧果糖基轉移酶活性會從源頭中移除蔗糖，從而阻止了光合作用之回饋抑制，且可促進增加CO₂之固定；

特佳的光調節啟動子包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小次單元(RbcS)啟動子以及葉綠素a/b結合蛋白(CAB)啟動子，以及其等之功能活性片段與變異體。

該光調節啟動子可從任何適合的植物物種而來，包括單子葉植物[諸如玉米、米、小麥、大麥、高粱、甘蔗、飼料牧草、生質能源牧草]、雙子葉植物(諸如***芥屬、大豆、芥花(canola)、棉花、紫花苜蓿以及菸草)以及裸子植物。

較佳地，該光調節啟動子係分離自或相應於從黑麥草或羊茅草物種而來之啟動子，包括義大利或一年生黑麥草、多年生黑麥草、高羊茅、草原狐草以及紫羊茅。甚至更佳地，該光調節啟動子係分離自或相應於從諸如多年生黑麥草(多年生黑麥草)或葦狀羊茅(Lolium arundinaceum)之黑麥草物種而來之啟動子。

於另一具體例中，該光調節啟動子較佳地係分離自或相應於從***芥屬而來之啟動子，甚至更佳地從***芥(Arabidopsis thaliana)而來之啟動子。

於特佳的具體例中，該RbcS啟動子包括擇自於由下列所構成之群組之序列：本發明之第5圖中所示之序列，以及其功能活性片段與變異體。

於特佳的具體例中，該RbcS啟動子包括擇自於由下列所構成之群組之序列：本發明之第38圖中所示之序列，以及其功能活性片段與變異體。

於另一特佳的具體例中，該CAB啟動子包括擇自於由下列所構成之群組之序列：本發明之第4圖中所示之序列，以及其功能活性片段與變異體。

於另一特佳的具體例中，該啟動子可為組成啟動子，諸如泛素(Ubi)啟動子。

於一特佳的具體例中，該Ubi啟動子包括擇自於由下列所構成之群組之序列：本發明之第41圖中所示之序列，以及其功能活性片段與變異體。

本發明之基因建構體可經由任何適合的技術被引入植物中。用於將本發明之基因建構體併入植物細胞之技術(例如，轉導、轉染、轉形或基因標靶)係熟悉此技藝中眾所周知的。此等技術包括農桿菌介導的轉導；根瘤菌介導的轉導；組織、細胞以及原生質體電穿孔法；原生質體融合；注射進入生殖器官；注射進入幼胚；以及高速發射導入細胞、組織、癒合組織、幼胚以及成熟胚；基因槍轉形；絲轉形法(Whiskers transformation)；以及其等之組合。技術之選擇主要視欲轉形之植物的類型而定，且可由熟悉此技藝之適當人士輕易地決定。

併入本發明之基因建構體之細胞可依下列所述之方式選定，然後使用此技藝中眾所周知之技術培養於適當的培養基中，以便再生轉形植物。該培養條件，諸如溫度、pH等等，對熟悉此技藝之人士而言係顯而易見的。所產生的植物可使用此技藝中眾所周知之技術以有性或無性方式繁殖，以便產生轉形植物之連續世代。

本發明之方法可應用於各種植物，包括單子葉植物[諸如禾本科植物(如，草料、草皮以及生質能源牧草，包括多年生黑麥草、高羊茅、義大利黑麥草、紫羊茅、虉草、大藍莖草、網茅、紫狼尾草、野麥、甜根子草、芒草、柳枝稷(switchgrass))、玉米、米、小麥、大麥、高粱、甘蔗、黑麥、燕麥)]、雙子葉植物[諸如***芥屬、菸草、大豆、芥花(canola)、紫花苜蓿、馬鈴薯、樹薯、三葉草(如，白三葉草、紅三葉草、地下三葉草)、芸苔屬蔬菜、萵苣、菠菜]以及裸子植物。

於本發明之另一態樣方面，提供有一種能夠操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之基因建構體，該基因建構體包括光調節啟動子或其功能活性片段或變異體，有效地連接至編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸或其等之功能活性片段或變異體。

在本發明之又另一態樣方面，提供有一種能夠提高植物中生化路徑之生產率之基因建構體，該基因建構體包括編碼從該路徑而來之二或多種酵素之核酸，或其等之功能活性片段或變異體。

較佳地，該等核酸連接形成一編碼該二或多種酵素之融合蛋白。

於較佳具體例中，根據本發明之各個態樣之基因建構體可為載體。

關於‘載體’意指用於將基因材料轉移至標的細胞之基因建構體。

該載體可為任何適合的類型，可為病毒或非病毒的。該載體可為一表達載體。此等載體包括染色體、非染色體以及人工合成核酸序列，如植物病毒之衍生物；細菌質體；從根瘤農桿菌而來之Ti質體之衍生物；從根瘤農桿菌而來之Ri質體之衍生物；噬菌體DNA；酵母菌人造染色體；細菌人造染色體；二元細菌人造染色體；從質體與噬菌體DNA之組合衍生而來之載體。然而，可使用任何其它的載體，只要其在植物細胞中可複製或整合或可存活即可。

在本發明之此態樣之較佳具體例中，該基因建構體可進一步包含終結子；該啟動子、基因以及終結子係有效連接的。

該啟動子、基因以及終結子可為任何適合的類型，且可為該標的植物細胞之內源性的或外源性的，但有條件的是，其等在該標的植物細胞中能起作用。

各種可用於本發明之基因建構體之終結子亦為熟悉此技藝人士所熟知的。該終結子可來自與該啟動子序列相同之基因或為不同的基因。特別適合的終結子為多腺苷酸化訊號，諸如(CaMV)35S polyA，以及其它從胭脂鹼合成酶(nos)與章魚鹼合成酶(ocs)基因而來之終結子。

該基因建構體，除了啟動子、基因以及終結子之外，可包括其它表達該核酸時之必要元件(不同的組合)，例如，載體骨架、複製起點(ori)、多重選殖位點、間隔序列、增強子、內含子(諸如玉米泛素Ubi內含子)、抵抗抗生素基因以及其它篩選標記基因[諸如新黴素磷酸轉移酶(nptII)基因、潮黴素磷酸轉移酶(hph)基因、草丁膦乙醯轉移酶(bar 或pat)基因]以及報導基因(諸如β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因(gusA)]。該基因建構體亦可包含供轉譯起始用之核糖體結合位點。該基因建構體亦可包括供擴大表達用之適當序列。

特別是，該基因建構體可進一步包括如之前所述編碼介於二個連接的核酸間之連接子之核酸序列。

該等熟悉此技藝之人士當能領會到，需將該基因建構體之各種組份有效連接，以便使該核酸產生表達。用於將本發明之基因建構體之組份有效連接之技術係熟悉此技藝之人士所熟知的。此等技藝包括使用連接子，諸如合成連接子，例如包括一或多種限制酵素切點。

較佳地，該基因建構體係實質上純化的或分離出來的。‘實質上純化的’意指該基因建構體不含在衍生出本發明之核酸或啟動子之有機體之天然產生的基因體中，在該核酸或啟動子側邊之基因。因此該術語包括，例如一種被併入載體；併入自動複製質體或病毒；或併入原核生物或真核生物之基因體DNA之基因建構體；或以與其它序列分開之獨立的分子之形式存在(如，由PCR或限制內切核酸酶產生之cDNA或基因體或cDNA片段)之基因建構體。其亦包括一種基因建構體，其為編碼額外的多肽序列之融合基因之部分。較佳地，該實質上純化的基因建構體至少約90%為純的，較佳地至少約95%為純的，甚至更佳地至少約98%為純的。

術語“分離的”意指該材料係從其原本的環境(如，假如其為天然產生的，則為天然環境)中移開。例如，存在於活植物中之天然產生的核酸不是分離的，但從天然系統中某些或全部共存的材料中分開來之相同的核酸稱作分離的。此等核酸可為載體之部分和/或此等核酸可為組合之部分，且仍為分離的，因為此載體或組成不為其天然環境之部分。

除了使用篩選標記基因來提供用於篩選轉形宿主細胞之表現型特徵外，可使用其它此技藝中熟知之技術測定在轉形細胞中基因建構體之表現，諸如PCR(聚合酶鏈反應法)、南方墨點雜交分析法、組織化學分析(如，GUS分析)、薄層色層分析(TLC)、北方以及西方墨點雜交分析法。

申請人亦已發現，本發明之方法可導致相對於未轉形對照組植物，轉形植物中之生物量提高。此生物量提高轉而可作為鑑定轉形植物之篩選工具。此之優點在於，於某些在移除標記物(以及在製造無標記之植物方面)會產生困難之情況下，可能不需要包括抗生素抗性或其它標記來篩選轉形物。

‘提高生物量’或‘生物量提高’意指，相對於未轉形之對照組植物，轉形植物中包括枝和/或根生長之生物量產量提高、增加或安定性增加。例如，相對於未轉形之對照組植物，轉形植物中之一或多種擇自於由下列所構成之群組之生長特徵可能提高、增加或更安定：植物高度、草料乾重、總葉子區域、累積葉子區域、葉子生長動態(即隨時間增加之葉子數目)、枝之數目、分檗之數目、根之數目、根質量或重量、枝質量或重量、根長度、枝長度、匍匐枝長度、塊莖之數目、塊莖重量、花之數目、果實之數目、種子之數目、種子重量、果實重量、植物開花之百分比以及每朵花或每播種區域之種子產量。

此技術特別可應用於在轉形之前，實質上基因一致的或在生物量上展現輕微的表現型差異之植物。

據此，於本發明之另一態樣方面，提供有一種提高植物之生物量之方法，該方法包括於該植物中引入一有效量之基因建構體，該基因建構體包括一啟動子或其功能活性片段或變異體，有效地連接至編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸或其等之功能活性片段或變異體。較佳地，該啟動子係光調節啟動子。

於本發明之又另一態樣方面，提供有一種提高植物之生物量之方法，該方法包括於該植物中引入一有效量之基因建構體，該基因建構體包括編碼從該植物之生化路徑而來之二或多種酵素之核酸，或其等之功能活性片段或變異體。

於本發明之又另一態樣方面，提供有一種提高植物之生物量之方法，該方法包括於該植物中引入一有效量之能夠操縱該植物之光合細胞中果聚糖生合成之基因建構體以及能夠操縱植物之老化之基因建構體。

該基因建構體可經任何在此之前所述之適合的技術而被引入該植物中，且可同時、相繼或分開引入。

較佳地，該能夠操縱果聚糖生合成之基因建構體包括一啟動子或其功能活性片段或變異體，有效地連接至編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸或其等之功能活性片段或變異體。較佳地，該啟動子係光調節啟動子。

較佳地，該能夠操縱植物之老化之基因建構體，能夠操縱該植物之光合細胞之老化。

較佳地，該能夠操縱植物之老化之基因建構體，包括一MYB基因啟動子或經修飾的MYB基因啟動子或其功能活性片段或變異體，有效地連接至一編碼牽涉細胞***素之生合成之酵素之基因，或其功能活性片段或變異體。

適合的基因建構體或載體述於國際專利申請案PCT/AU01/01092以及美國專利申請案第11/789,526號，其等之全部內容在此併入本案以為參考。

“操縱老化”一般而言有關相對於未轉形之植物，延緩轉形植物，或轉形植物之細胞或器官(如光合細胞)之老化。然而，對某些申請案而言，其可能需要去促進或以其它方式修飾植物之老化。例如，老化可藉由使用反訊息基因促進或用別的方法修飾。

該MYB基因啟動子可為任何適當的類型。較佳地，該MYB基因啟動子為MYB32基因啟動子。較佳地，該MYB基因啟動子係來自***芥屬，更佳地係來自***芥。更佳地，該MYB基因啟動子包括擇自於由下列所構成之群組之核苷酸序列：PCT/AU01/01092之序列辨識編號：1中所示之序列，以及其功能活性片段與變異體。

適合的啟動子述於Li et al.,Cloning of three MYB-like genes from Arabidposis(PGR 99-138)Plant Physiology 121:313(1999)中，其全部內容在此併入本案以為參考。

“經修飾的MYB基因啟動子”意指一通常與MYB基因相關之啟動子，該啟動子經修飾而刪除掉該啟動子之一或多個根專一性模體和/或花粉專一性模體或去除其等之活性。

較佳地，該經修飾的MYB基因啟動子係經修飾的MYB32基因啟動子。較佳地，該經修飾的MYB基因啟動子係從來自***芥屬，或更佳地***芥，之MYB基因啟動子修飾而來。

可依照本發明修飾之適合的啟動子述於Li et al.,Cloning of three MYB-like genes from Arabidposis(PGR 99-138)Plant Physiology 121:313(1999)中，其全部內容在此併入本案以為參考

“根專一性模體”意指3-7個核苷酸，較佳地4-6個核苷酸，更佳地5個核苷酸之序列，其會引導植物之根中任何相關的基因之表達。

較佳地，該根專一性模體包括一致序列ATATT或AATAT。

“花粉專一性模體”意指3-7個核苷酸，較佳地4-6個核苷酸，更佳地4或5個核苷酸之序列，其會引導植物之花粉中任何相關的基因之表達。

較佳地，該花粉專一性模體包括擇自於由下列所構成之群組之一致序列：TTTCT、AGAAA、TTCT以及AGAA。

根或花粉專一性模體可藉由添加、刪除、取代或衍化該模體內一或多個核苷酸，使其不再具有該較佳的一致序列而去活化。

較佳地，該經修飾的MYB基因啟動子包括擇自於由下列所構成之群組之核苷酸序列：US 11/789,526之序列辨識編號：2、3以及4中所示之序列，以及其等之功能活性片段與變異體。

“編碼牽涉細胞***素之生合成之酵素之基因”意指一編碼牽涉諸如激動素、玉米素與苯甲腺苷之細胞***素之合成之酵素之基因，例如，一編碼異戊基轉移酶(IPT)之基因或諸如sho基因(如，來自矮牽牛)之似IPT基因。較佳地，該基因係異戊烯基轉移酶(IPT)基因或sho基因。於較佳具體例中，該基因係擇自於由下列所構成之群組之物種：農桿菌屬，更佳地根瘤農桿菌；蓮，更佳地百脉根(Lotus japonicus)；以及矮牽牛屬，更佳地矮牽牛(Petunia hybrida)。

最佳地，該基因包括擇自於由下列所構成之群組之核苷酸序列：US 11/789,526之序列辦識編號：5、7以及9中所示之序列、編碼US 11/789,526之序列辦識編號：6、8以及10中所示之多肽之序列，以及其等之功能活性片段與變異體。

本發明亦提供一種篩選轉形植物之方法，該方法包括於該植物中引入一有效量之基因建構體，該基因建構體包括一啟動子或其功能活性片段或變異體，有效地連接至編碼一或多種果聚糖生合成酵素之核酸或其等之功能活性片段或變異體；以及篩選生物量提高之植物。較佳地，該啟動子係光調節啟動子。

於本發明之另外的態樣方面，提供有一種基因轉殖植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分，其相對於未轉形對照組植物，具有經修飾的果聚糖生合成特徵或生物量提高。

“經修飾的果聚糖生合成特徵”意指相對於未轉形對照組植物，該轉形的植物會展現出果聚糖生合成增加和/或含有增加位準的可溶性碳水化合物。

於較佳具體例中，該具有生物量提高之基因轉殖植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分，相對於未轉形對照組植物，具有生物量增加至少約10%，更佳地至少約20%，更佳地至少約30%，更佳地至少約40%。

例如，相對於未轉形對照組植物，生物量可增加約10%至300%之間，更佳地約20%至200%之間，更佳地約30%至100%之間，更佳地約40%至80%之間。

例如，相對於未轉形對照組植物，植物高度可增加約10%至300%之間，更佳地約20%至200%之間，更佳地約30%至100%之間，更佳地約40%至80%之間。

例如，相對於未轉形對照組植物，草料乾重增加約10%至600%之間，更佳地約20%至400%之間，更佳地約30%至300%之間，更佳地約40%至200%之間。

於較佳具體例中，該具有經修飾的果聚糖生合成特徵之基因轉殖植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分，相對於未轉形對照組植物，具有可溶性碳水化合物增加至少約10%，更佳地至少約20%，更佳地至少約30%，更佳地至少約40%。

例如，相對於未轉形對照組植物，可溶性碳水化合物可增加約10%至300%之間，更佳地約20%至200%之間，更佳地約30%至100%之間，更佳地約40%至80%之間。

例如，相對於未轉形對照組植物，果聚糖濃度可增加約10%至600%之間，更佳地約20%至400%之間，更佳地約30%至200%之間，更佳地約40%至150%。

較佳地，該植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分包括如本發明之基因建構體或載體。較佳地，該基因轉殖植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分係利用本發明之方法所產生。

本發明亦提供一種由本發明之植物細胞衍生而來以及包括本發明之基因建構體或載體之基因轉殖植物、植物種子或其它植物部分。

本發明亦提供一種由本發明之植物衍生而來以及包括本發明之基因建構體或載體之基因轉殖植物、植物種子或其它植物部分。

較佳地，該基因轉殖植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分係黑麥草種，更佳地多年生黑麥草(多年生黑麥草)或葦狀羊茅(Lolium arundinaceum)。

較佳地，該基因轉殖植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分係穀粒，更佳地小麥屬物種，更佳地小麥(Triticum aestivum)。

例如，本發明使能夠產生在葉片中果聚糖增加、生長旺盛和/或對非生物逆境耐性增佳之基因轉殖多年生黑麥草植物，供用於改善提供給放牧動物之營養。

本發明亦使能夠產生果聚糖增加、生長旺盛和/或對非生物逆境耐性增佳之基因轉殖小麥植物，供用於增加可使用之碳水化合物之量，如生質燃料產物或動物飼料。

‘植物細胞’意指任何結合半滲透性膜之可自我增生且含有質體之細胞。若需進一步之增生，則此一細胞還需要細胞壁。在此使用之植物細胞包括(非限制性的)水藻、藍綠藻、種子懸浮培養物、胚、分生組織區域、癒合組織、葉、根、枝、配子體、孢子體、花粉以及小孢子。

‘基因轉殖’意指任何包括一DNA序列之細胞，該DNA序列技巧的被***細胞中，且變成從該細胞發展出之有機體之基因體的一部分。在此所使用之基因轉殖有機體一般為基因轉殖植物，且DNA(轉殖基因)技巧的被***核或質體基因體內。

於本發明之另一態樣方面，提供有一種融合蛋白，其包含二或多種植物中生化路徑之酵素，或其功能活性片段或變異體。

‘功能活性’在此情況下，意指該片段或變異體具有一或多個相應蛋白(該片段或變異體所從出之蛋白)之生物特性。亦包括一或多個胺基酸之添加、刪除、取代以及衍化，只要該等修飾不會導致該片段或變異體之功能活性喪失即可。較佳地，該片段或變異體具有至少約80%與以上所提及該片段或變異體相應之序列之相關部分一致，更佳地至少約90%一致，更佳地至少約95%一致，最佳地至少約98%一致。此功能活性片段與變異體包括，例如，該等具有於相應胺基酸序列中一或多個殘基之保留性胺基酸取代者。

較佳地，該片段具有至少10個胺基酸之大小，更佳地至少20個胺基酸，更佳地至少50個胺基酸，更佳地至少100個胺基酸，更佳地至少200個胺基酸。

較佳地，該生化路徑於果聚糖生合成路徑中。

較佳地，該從該路徑而來之二或多種酵素係擇自於由下列所構成之群組：植物中果聚糖生合成之酵素，例如，果糖基轉移酶，諸如蔗糖：蔗糖1-果糖基轉移酶(1-SST)、果聚糖：果聚糖1-果糖基轉移酶(1-FFT)、蔗糖：果聚糖6-果糖基轉移酶(6-SFT)以及果聚糖：果聚糖6G-果糖基轉移酶(6G-FFT)；以及果聚糖外水解酶，諸如1-果聚糖外水解酶(1-FEH)與6-果聚糖外水解酶(6-FEH)。

甚至更佳地，該融合蛋白係1-SST與6G-FFT之FT融合蛋白或其功能活性片段或變異體。

較佳地，該從該路徑而來之二或多種酵素相應於從黑麥草或羊茅草物種而來之酵素，包括義大利或一年生黑麥草、多年生黑麥草、高羊茅、草原狐草以及紫羊茅。甚至更佳地，該二或多種從該路徑而來之酵素相應於從黑麥草物種而來之酵素，諸如多年生黑麥草(多年生黑麥草)或葦狀羊茅(Lolium arundinaceum)。

適合的果聚糖生合成酵素述於PCT/AU01/00705以及PCT/AU01/01275中，其等之全部內容在此併入本案以為參考。

於特佳具體例中，該1-SST包括PCT/AU01/00705之序列辦識編號：12中所示之胺基酸序列，或其等之功能活性片段或變異體。

於特佳具體例中，該6G-FFT包括PCT/AU01/01275之序列辦識編號：111或本發明之第8圖中所示之胺基酸序列，或其等之功能活性片段或變異體。

於特佳的具體例中，該1-SST_6G-FFT FT融合蛋白包括本發明之第13或15圖中所示之胺基酸序列，或其等之功能活性片段或變異體。

圖式簡單說明

本發明在參照所附之範例與圖式下將能得到更充分的說明。然而，應了解下列說明僅是說明用的，不應被用來作為以上所述本發明之主要部分之限制。

第1圖，葉片之光合細胞中，果聚糖生合成基因之靶向表達模型。果糖基轉移酶(FT)基因之表達係由光合啟動子所驅動。之後，果聚糖生合成作用在生產蔗糖之光合細胞中發生。加上修飾細胞***素之生合成以延緩葉片老化，延長了經設計能合成果聚糖之光合細胞的命且使生物量產量增加。

第2圖，依照即時定量RT-PCR所示，多年生黑麥草中RuBisCO小次單元基因之表達係由光所調節的。組織採樣每四個小時進行一次。框框表示白天期間。

第3圖，多年生黑麥草中1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小次單元(LpRbcS)以及葉綠素a/b結合蛋白(LpCAB)之電腦模擬表達模式顯示出，其在營養組織中最豐富。LpRbcS(疊連基段LPCL9_C359)以47個EST為代表，而LpRbcS(疊連基段LPCL1112_C12)以19個EST為代表。

第4圖，LpCAB啟動子之核苷酸序列(序列辦識編號：1)。

第5圖，LpRbcS啟動子之核苷酸序列(序列辦識編號：2)。

第6圖，某些禾本科植物中果聚糖生合成路徑之概要圖。

第7圖，Lp6G-FFT開放讀取架構之核苷酸序列(序列辦識編號：3)。

第8圖，Lp6G-FFT之推論的胺基酸序列(序列辨識編號：4)。

第9圖，Lp1-FFT開放讀取架構之核苷酸序列(序列辨識編號：5)。

第10圖，Lp1-FFT之推論的胺基酸序列(序列辨識編號：6)。

第11圖，用於產生Lp1-SST與Lp6G-FFT果糖基轉移酶基因之轉譯FT融合體(Lp1-SST_Lp6G-FFT)之策略概要圖式。

第12圖，Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體1開放讀取架構之核苷酸序列(序列辨識編號：7)。

第13圖，Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體1之推論的胺基酸序列(序列辨識編號：8)。

第14圖，Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體3開放讀取架構之核苷酸序列(序列辨識編號：9)。

第15圖，Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體3之推論的胺基酸序列(序列辨識編號：10)。

第16圖，用於產生不同的Lp1-SST、Lp6G-FFT以及Lp1-FFT果糖基轉移酶基因之轉譯FT融合體之策略概要圖式。

第17圖，(A)與(B)，FT蛋白交互反應而形成穿膜蛋白之假設模型。(C)Lp1-SST-6G-FFT蛋白中主要的蛋白結構區之圖式。框框1：(N/S)DPNG；框框2：RDP；以及框框3：EC，代表牽涉基質(蔗糖)結合以及水解之高度保留性結構區。十字(X)代表從來自黑麥草(Lolium)物種之FT、轉化酶以及FEH序列之間所找到之高度保留性胺基酸序列(結構區)。LS-大次單元、SU-小次單元。Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體3蛋白之胺基酸序列內之活性結構區之代表圖，可在第36圖中找到。

第18圖，來自多年生黑麥草(多年生黑麥草)之FT、INV以及FEH的胺基酸(序列辨識編號：11-33)比對。在FT、轉化酶以及FEH序列中找到之主要蛋白結構區，諸如(N/S)DPNG、RDP以及EC(其代表牽涉基質(蔗糖)結合以及水解之高度保留性結構區)，以黑體底下劃線標記起來。在來自黑麥草(Lolium)物種之FT、轉化酶以及FEH序列中找到之高度保留性胺基酸結構區底下劃線。Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體3蛋白之胺基酸序列內之活性結構區之代表，可在第36圖中找到。

第19圖，果聚糖：果聚糖6G-果糖基轉移酶(Lp6G-FFT)之功能分析。A.酵母菌表達載體中Lp6G-FFT之質體輿圖。B.以聚丙烯醯胺凝膠電泳分開從含有pPICZαA::Lp6G-FFT或僅pPICZαA之酵母菌中分泌出來之蛋白。C.高壓陰離子交換色層分析(HPAEC)後之水溶性碳水化合物(WSC)之記錄圖。WSC係從洋葱分離出來的，或為1-蔗果三糖與Lp6G-FFT純化蛋白(pPICZαA::Lp6G-FFT)或僅載體對照組(pPICZαA)一起培育之溶液。

第20圖，用於Multisite Gateway重組選殖之基本目的載體pPZP200-ubi:bar-nos R4 R3。

第21圖，植物原位短暫表達系統之程序之概略圖。製備懷有表達建構體之農桿菌培養。將此等注射進入菸草葉中。3天後，檢測該蛋白之滲入後表達。右上格顯示GUS活性，右下格顯示以HPAEC分開水溶性碳水化合物之例子。

第22圖，使用高效陰離子交換色層分析(HPAEC)分開以及量化之碳水化合物，使用標準品(1-蔗果三糖)，以及量化從對照組植物以及短暫過量表達Lp1-SST(35S::1-SST)、Lp6G-FFT(35S::6G-FFT)與FT融合體(35S::Lp1-SST_Lp6G-FFT)之基因轉殖植物中萃取出之總果聚糖數量。

第23圖，驅動(A)Lp1-SST、(B)Lp6G-FFT、(C)Lp1SST_Lp6GFFT FT融合體1、(D)Lp1SST_Lp6GFFT FT融合體3以及(E)GUS標記基因之表達之小麥RuBisCO啟動子之目的載體。

第24圖，TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS表達盒之序列(序列辨識編號：34)。調節序列、TaRbcS啟動子以及終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第25圖，TaRbcS::Lp6GFFT::TaRbcS表達盒之序列(序列辨識編號：35)。調節序列、TaRbcS啟動子以及終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第26圖，TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1表達盒之序列(序列辨識編號：36)。調節序列、TaRbcS啟動子以及終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第27圖，TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3表達盒之序列(序列辨識編號：37)。調節序列、TaRbcS啟動子以及終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第28圖，懷有LpFT4 3’結終子序列之載體pBlueScript SK，pBS-LpFT4。

第29圖，(A)質體pBS-Lp1-SST::FT4以及(B)質體pBS-LpRbcS::Lp1-SST::LpFT4。

第30圖，(A)質體pBS-LpCAB::LpFT4以及(B)質體pBS-LpCAB::Lp6G-FFT::LpFT4。

第31圖，LpRbcS::Lp1-SST::LpFT4表達盒之序列(序列辨識編號：38)。調節序列、LpRbcS啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第32圖，LpCAB::Lp6G-FFT::LpFT4表達盒之序列(序列辨識編號：39)。調節序列、LpRbcS啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第33圖，質體PCR Blunt-Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體。

第34圖，含有驅動FT融合體1與3之黑麥草RuBisCO(LpRbcs)啟動子之目的載體。(A)pBS-LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4 FT融合體1以及(B)pBS-LpRbcS::Lp1-SST-Lp6G-FFT::LpFT4 FT融合體3。

第35圖，LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4 FT融合體1表達盒之序列(序列辨識編號：40)。調節序列、LpRbcS啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第36圖，LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4融合體3表達盒之序列(序列辨識編號：41)。調節序列、LpRbcS啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。胺基酸序列以黑體表示(序列辨識編號：42)。結構區以下列方式突顯：框框表示糖苷水解酶家族32中高度保留性模體，包括轉化酶、果糖基轉移酶以及果聚糖外水解酶，其等牽涉基質結合以及水解；底下劃雙線顯示穿膜結構區；以及陰影框框代表糖苷水解酶32間之保留性結構區。

第37圖，含有驅動FT融合體3之***芥屬RuBisCO(AtRbcS)啟動子之目的載體，pPZP200_AtRbcS::Lp1-SST_6G-FFT::nos FT融合體3。

第38圖，AtRbcS::Lp1-SST-6G-FFT::nos FT融合體3表達建構體之序列(序列辨識編號：43)。

第39圖，來自Promega之基本載體pBlueScript SK(-)之詳細內容，指出供選殖用之限制內切酶切點之位置。

第40圖，用於建構p-Ubi::Lp1-SST::35S以及p-Ubi::Lp6G-FFT::35S之載體骨架(Ye et al.,2001)。

第41圖，組成(Ubi)啟動子結合與FT融合蛋白以及終結子序列之代表性序列(序列辨識編號：44)。調節序列、Ubi啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第42圖，組成((CAMV)35S²)啟動子結合與FT融合蛋白以及終結子序列之代表性序列(序列辨識編號：45)。調節序列、(CAMV)35S²啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第43圖，組成(RUBQ2)啟動子結合與FT融合蛋白以及終結子序列之代表性序列(序列辨識編號：46)。調節序列、RUBQ2i啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第44圖，組成(OsAct1)啟動子結合與FT融合蛋白以及終結子序列之代表性序列(序列辨識編號：47)。調節序列、OsAct1啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第45圖，組織專一性(塊莖)啟動子(CathInh)結合與FT融合蛋白以及終結子序列之代表性序列(序列辨識編號：48)。調節序列、CathInh啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第46圖，逆境調節(Atrd29a)啟動子結合與FT融合蛋白以及終結子序列之代表性序列(序列辨識編號：49)。調節序列、Atrd29a啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第47圖，蔗糖調節(16R)啟動子結合與FT融合蛋白以及終結子序列之代表性序列(序列辨識編號：50)。調節序列、16R啟動子以及LpFT4終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第48圖，以TaRbcS啟動子光調節基因建構體(表1)與pAcH1載體共轉形後之基因轉殖多年生黑麥草，在潮黴素上篩選後之植物再生表現型。含有TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合建構體中任何一個之植物，在試管中培養條件下顯示出生長優勢，因此容許其等能早期鑑別以及篩選(最右欄)。

第49圖，以LpRbcS啟動子光調節基因建構體共轉形後之基因轉殖多年生黑麥草，在潮黴素上篩選後之植物再生表現型。該植物含有LpRbcS::Lp1-SST::LpFT4或LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LPFT4 FT融合體1/3建構體。含有該FT融合建構體之植物，在試管中培養條件下顯示出生長優勢。

第50圖，溫室條件下之成熟植物表現型。基因轉殖多年生黑麥草植物在生長階段之代表性例子。該TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4 FT融合體基因轉殖多年生黑麥草植物，與對照組、非基因轉殖多年生黑麥草植物相比，顯示出生長性能提高，葉子比較大、分檗提高、根生長增加。提前3週以同等方式剪裁該等植物。葉片之特寫顯微照片指出，FT融合體基因轉殖株中葉的直徑增加。

第51圖，在田野條件下之基因轉殖多年生黑麥草成熟植物表現型(4週)之代表性例子。該FT融合體基因轉殖多年生黑麥草植物，與對照組Lp1-SST基因轉殖多年生黑麥草植物相比，顯示出提高的生長性能，葉子比較大、分檗提高、根生長增加。

第52圖，表達FT融合體轉殖基因之基因轉殖多年生黑麥草植物，在田野條件下之表現型生物量得分(1-生物量最少至5-生物量最多)之代表性例子。

第53圖，基因轉殖多年生黑麥草之葉表現型。處於生長階段之葉片的徒手切片之代表性例子。左邊顯示整個葉切片之比較，右邊為葉切片之放大區域。Ad-近軸，Ab-遠軸。

第54圖，存在於安定的基因轉殖TaRbcS::Lp1-SST _Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3、TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS、TaRbcS::Lp6G-FFT::TaRbcS多年生黑麥草植物以及僅懷有篩選標記(hph基因)之對照組多年生黑麥草植物中之果聚糖位準以及組成之生化分析(HPAEC)。

第55圖，與僅懷有篩選標記(hph基因)之對照組多年生黑麥草植物相比(第6’道與第1’道)，存在於(A)TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1、(B)TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3、(C)TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS以及(D)TaRbcS::6G-FFT::TaRbcS基因轉殖多年生黑麥草植物中之整個分檗中總果聚糖之生化分析(HPAEC)。

第56圖，與僅懷有篩選標記(hph基因)之對照組多年生黑麥草植物相比(第6’道與第1’道)，存在於(A)TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1、(B)TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3、(C)TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS以及(D)TaRbcS::6G-FFT::TaRbcS基因轉殖多年生黑麥草植物中之整個分檗中1-蔗果三糖之生化分析(HPAEC)。

第57圖，與僅懷有篩選標記(hph基因)之對照組多年生黑麥草植物相比(第6’道與第1’道)，存在於(A)TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1、(B)TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3、(C)TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS以及(D)TaRbcS::6G-FFT::TaRbcS基因轉殖多年生黑麥草植物中之整個分檗中蔗糖之生化分析(HPAEC)。

第58圖，在田野條件下生長且於2009年12月所收集之野生型(對照組)以及FT融合體與LpRbcS::Lp1-SST基因轉殖多年生黑麥草植物之整個分檗以及葉片中之果聚糖位準。

第59圖，在田野條件下生長之野生型以及LpRbcS::Lp1-SST基因轉殖多年生黑麥草植物之葉片中之果聚糖組成。框框1表示低DP果聚糖(DP達10-15)。框框2表示高DP果聚糖(DP高於10-15)。

第60圖，在田野條件下生長之LpRbcS FT融合體以及LpRbcS::Lp1-SST基因轉殖多年生黑麥草植物之整個分檗中之轉殖基因之表達。樣本在2009年11月(白棒)以及12月(黑棒)收集。使樣本對內源性組織蛋白之表達正規化，以轉錄複製本之數目/35ng RNA表示。

第61圖，在盆栽混合土中從單一個分檗增生7週(A-C)以及12週(D-E)後，基因轉殖多年生黑麥草之表現型分析。與僅表達hph基因(C、E)之對照組植物相比，TarbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::Tarbcs FT融合體1(A、D)以及TarbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TarbcS FT融合體3(B)植物，顯示出葉子較長以及分檗數目較多。

第62圖，基因轉殖TarbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::Tarbcs FT融合體1以及TarbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::Tarbcs FT融合體3植物在生長7週(白棒)以及12週(黑棒)後之定量表現型分析。測量植物高度(A)、葉寬(B)以及分檗數目(C)，與8個僅表達hph基因之對照組植物之平均值相比較。

第63圖，在溫室條件下，表達單獨科技(AtMYB32::IPT)、單獨LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4 FT融合體3以及與LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4 FT融合體3一起之基因轉殖多年生黑麥草植物。

第64圖，在溫室條件下生長且於剪下後6週收集之GOI-ve對照組(5株之平均值)以及獨立的單獨FT融合體或FT融合體加上基因轉殖多年生黑麥草植物之草料乾重分析。

第65圖，在溫室條件下生長之GOI-ve對照組(5株之平均值)以及獨立的單獨FT融合體或FT融合體加上基因轉殖多年生黑麥草植物之葉片中之果聚糖位準。

第66圖，在溫室條件下，表達LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4 FT融合體3之基因轉殖高羊茅植物。

第67圖，溫室生長之GOI-ve對照組(5株之平均值)以及獨立的單獨FT融合體或FT融合體加上基因轉殖高羊茅植物之草料乾重。

第68圖，溫室生長之GOI-ve對照組(5株之平均值)以及獨立的單獨FT融合體或FT融合體加上基因轉殖高羊茅植物之分檗數目。

第69圖，累積於溫室生長之GOI-ve對照組(5株之平均值)以及獨立的表達FT融合體之基因轉殖高羊茅植物之葉片中之果聚糖。

第70圖，以光調節基因建構體轉形後之基因轉殖小麥植物之植物再生表現型。於試管中生長，含有Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體建構體之基因轉殖小麥植物，在試管培養條件中顯示出生長優勢，因此使其等能夠早期鑑定以及篩選。該基因轉殖小麥FT融合體株之最好的生長表現型，係在於組織培養皿上進行之試管中植物再生的早期階段觀察到。在光條件下培育6週後，在試管中生長之含有Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體建構體之基因轉殖小麥植物中之癒合組織，與對照組植物相比，在試管中生長的分檗/枝(A格)方面顯示進一步的進展，尤其是在試管中生長的根(B格)方面有進一步的進展。

第71圖，在(A)於試管條件下生長2個月以及(B)在溫室條件下生長之含有TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體建構體之基因轉殖小麥植物之分檗數，與對照組植物相比，在早期即顯示出明顯的增加。

第72圖，在溫室條件下生長之含有FT融合體建構體之基因轉殖小麥植物之分檗數目，與對照組植物相比，在早期即顯示出明顯的增加。

第73圖，在溫室條件(A)下，含有科技之基因轉殖小麥植物之分檗數，與對照組植物相比，在早期即顯示出明顯的增加。其等在溫室條件(B)下35天後，亦顯示出光合組織增加。

第74圖，表達單獨科技(AtMYB3::IPT::35S)、單獨TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3以及與TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3一起之基因轉殖小麥植物，在溫室條件下之表現型分析。

第75圖，含有單獨FT融合體建構體或加上FT融合體建構體之基因轉殖小麥植物中，與不含有興趣之基因(GOI-)對照組之轉形基因相比較之果聚糖的累積量以及分檗數目。

第76圖，播種後9週，T₁ GOI-ve對照組、單獨FT融合體以及加上FT融合體基因轉殖小麥植物中果聚糖的累積量。對照組中果聚糖位準相當於從6個GOI-ve植物所獲得之數據平均值。

第77圖，表達、AtRbcS::Lp1-SST-6G_FF::nos FT融合體或加上AtRbcS::Lp1-SST-6G_FF::nos FT融合體建構體之白三葉草植物，與沒有GOI之轉形對照組相比較之表現型。

第78圖，於白三葉草植物中，由AtRbcS驅動之FT融合體轉殖基因之轉殖基因表達位準。對照組為野生型植物。將樣本對內源性組織蛋白之表達正規化，然後以複製本之數目/35ng RNA表示。

第79圖，野生型對照組、AtRbcS FT融合體以及AtRbcSFT融合體加上基因轉殖白三葉草株中果聚糖之累積量。

第80圖，表達、AtRbcS::Lp1-SST-6G_FF::nos FT融合體或加上AtRbcS::Lp1-SST-6G_FF::nos FT融合體建構體之基因轉殖***芥屬植物，與沒有GOI之轉形對照組相比較之表現型。

第81圖，於***芥屬植物中，由AtRbcS啟動子驅動之FT融合體轉殖基因之轉殖基因表達位準。對照組為野生型植物。將樣本對內源性組織蛋白之表達正規化，然後以複製本數目/35ng RNA表示。

第82圖，土壤中生長之基因轉殖T₂FT融合體***芥屬植物。

第83圖，展現延遲葉的老化之A.白三葉草、B.芥花(canola)以及C.小麥植物之葉子(葉子來自基因轉殖植物，下面影像)，與陰性對照組植物之葉子(葉子來自對照組植物，上面影像)相比，從植物上脫離下來後7-20天之影像。

第84圖，藉由在無抗生素篩選之盤上篩選試管中生長之表現型，選出陽性多年生黑麥草基因轉殖植物。A-C，轉形後在黑暗中8週之癒合組織；D-F，移至光下後1週。

第85圖，移至光下之前以及之後4週，單獨以金粒子(對照組)以及覆蓋有TaRbcS FT融合體載體之金粒子衝擊之胚性多年生黑麥草癒合組織。

第86圖，移至光下後5週，單獨以金粒子(對照組)以及覆蓋有單獨TaRbcS FT融合體1、單獨TaRbcS FT融合體3、單獨LXR以及TaRbcS FT融合體加上LXR載體之金粒子衝擊之胚性多年生黑麥草癒合組織。分子分析陽性株：TaRbcS FT融合體1#1、2、3、4、7、6、12、13、14、16、17；TaRbcS FT融合體3#1、2、3、5、8、10、11、12、13；TaRbcS FT融合體1加上LXR#1、2、7、12(單獨TaRbcS FT融合體1)；#8、14(TaRbcS FT融合體1加上LXR)。

較佳實施例之詳細說明 範例1 光合啟動子之分離 從小麥中選殖出光合啟動子

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小次單元(RbcS)係高等植物中特徵已描述得很充份之光調節基因。小麥(Triticum aestivum)之TaRbcS調節序列(啟動子以及終結子)在之前就已經被選殖出來了(Zeng,et al.,1995;Sasanuma,2001)。利用PCR擴大之前已公開含有來自TaRbcS基因(NCBI寄存編號AB042069)之TATA訊號之序列之695bp大的啟動子片段。

從***芥屬中選殖出光合啟動子

1700bp大的***芥1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小次單元(AtRbcS)啟動子序列片段，在之前就已經被選殖出來了。將引子設計成用來擴大用於表達載體之AtRbcS啟動子中含TATA訊號之較小的片段。

從多年生黑麥草中發現以及選殖光合啟動子

RbcS以及葉綠素a/b結合蛋白(CAB)之表達，係高等植物中特徵已描述得很充份之光調節基因。多年生黑麥草中，利用即時定量PCR之LpRbcS mRNA轉錄產物之豐度示於第2圖中。

選擇LpRbcS以及LpCAB基因二者來發現以及分離多年生黑麥草中之啟動子。使用公開可得之cDNA序列(LpRbcS，EC778430以及LpCAB，EC778438)作為查詢序列，在吾人實驗室內部資料庫之多年生黑麥草EST資料庫中作BLAST搜尋。因為二個基因均係多基因家族之成員，所以在吾人之多年生黑麥草EST收集中鑑定出數個疊連基段(contig)(每一個疊連基段代表一個別的基因)。9個疊連基段被鑑定為與該公開的LpRbcS cDNA序列同源，而13個疊連基段被發現與該LpCAB cDNA序列同源。二個疊連基段，LPCL9_C359(LpRbcS)以及LpCL1112_C12(LpCAB)，代表欲被分離之啟動子之基因，分別含有(47)以及(19)EST序列。此等序列來自各種代表一系列不同組織之基因庫。將此數據用於電腦模擬(in silico)表達分析，指示出二個基因均僅在光合組織中表達(第3圖)。

完成該基因家族成員中每一個之DNA序列比對，設計針對疊連基段LpRbcS_C359以及LpCAB_C12之基因專一性引子，然後用於PCR篩選多年生黑麥草BAC DNA池。對該等BAC選殖株進行鑑定以及定序。設計引子，選殖出多年生黑麥草專一性啟動子調節序列並進行定序(第4圖以及第5圖)，然後經PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)鑑定出對光合啟動子具專一性之順式調節序列(表1)。該序列包括RbcS之I-Box模體(motif)以及GT1 box(Terzaghi,et al.,1995；Martinez-Hernandez,et al.,2002)。此外，該LpRbcS之16/19個核苷酸與單子葉植物RbcS一致序列同源共有(Schaffner,et al.,1991)。該I-Core box以及SORLIPs順式調節序列存在於該CAB啟動子中。SORLIPs被發現在***芥屬之光誘導型啟動子中過表達(Hudson,et al.,2003)。

表1，經PLACE資料庫鑑定出之順式調節序列之位置。列出常見順式作用調節序列(Schaffner,et al.,1991;Terzaghi,et al.,1995;Martinez-Hernandez,et al.,2002;Hudson,et al.,2003)。標記之位置係序列中相對於ATG之第一個核苷酸(n.p.-不存在)。

此等多年生黑麥草專一性啟動子調節序列隨後用於建構具果聚糖生合成基因之無骨架表達卡匣(cassettes)。

範例2 果聚糖生合成基因之分離 從多年生黑麥草中分離出果聚糖生合成基因

編碼Lp1-SST與Lp6G-FFT序列之多年生黑麥草cDNA選殖株，之前就已經從多年生黑麥草cDNA庫中選殖出來(Chalmers,et al.,2003;Chalmers,et al.,2005)。該分離出之多年生黑麥草果糖基轉移酶同源體之完整的基因序列係可買到的，且Lp1-SST之核苷酸與蛋白質序列揭示於國際專利申請案PCT AU01/00705中(序列辨識編號：11以及12)。

Lp6G-FFT之部分序列，核苷酸以及胺基酸序列，分別揭示於國際專利案PCT/AU/01/01275之序列辨識編號109以及110中。從cDNA中以PCR擴大整段選殖株，選殖然後定序(第7圖)。當Lp6G-FFT ORF與從多年生黑麥草而來之公開的Lp6G-FFT比較時，有23個核苷酸改變。預測的蛋白質序列之比較顯示出該二個胺基酸序列間僅有二個改變(第8圖)。

其它可使用以及單獨轉形或與Lp1-SST以及Lp6G-FFT共同轉形之FT基因包括Lp1-FFT、Lp6-SFT以及Lp6-SST。Lp1-FFT之cDNA序列已從多年生黑麥草分離出(第9圖)，胺基酸序列示於第10圖中。舉例來說，以此序列為基礎之引子，可用於以PCR擴大整段cDNA供選殖，以及用於以下所述之本發明。

篩選諸如EMBL(http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm)或National Center for Biotechnology Information(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi#)之資料庫，可找到其它同源蛋白質。在此資料庫搜尋方面，例如，將於第第7-10圖中所述之序列作為查詢序列，使用預設參數設定值設定該資料庫。例如，利用NCBI之蛋白質序列比對(Blastp)，設定值如下：限制entrez=沒有啟動；濾器=低複雜性啟動；期望值=10；字大小=3；矩陣=BLOSUM；空位罰分(gap costs)存在-11，延伸=1。此資料庫搜尋可用於找尋FTs內所含之結構區(使用預測參數)。

範例3 轉譯FT融合體蛋白之製造 FT轉譯FT融合體之選殖

依循第11圖中所述之程序，在Lp1-SST與Lp6G-FFT之開放讀取架構間製造基因FT融合體。Lp1-SST基因以併入正向引子中之GATEWAY重組位置PCR擴大。於逆向引子中併入編碼三個甘胺酸殘基接著Hind III切點之序列(已移除終止密碼子)。以Hind III切點後面接著編碼三個甘胺酸殘基以及無ATG之基因專一性序列，PCR擴大Lp6G-FFT基因。該Lp6G-FFT基因之逆向引子之側邊連著第二GATEWAY重組位置。該等引子序列提供於表2中。用Hind III消化純化後的片段，之後將接合之產物選殖入Invitrogen GATEWAY pDONR221中間載體(Entry vector)。對所產生之pENTRY1-Lp1-SST-Lp6G-FFT-2中間選殖株作定序時，一序列(FT融合體1)確認為預測的產物，在連接二個基因之連接子中具有8個胺基酸(第12圖以及第13圖)。而另一序列(FT融合體3)含有二個連續的Hind III切點，其會導致添加另外二個胺基酸，使得轉譯時，在二個FT基因之間具有全部10個胺基酸(第14圖以及第15圖)。

表2，用於擴大用於產生Lp1-SST與Lp6G-FFT果糖基轉移酶基因之轉譯FT融合體(FT Lp1-SST_Lp6G-FFT)之PCR片段之引子序列。以陰影標示之序列係基因專一性序列、粗體以及下面劃線的(Hind III RE切點)序列係***用以產生連接區域之核苷酸，斜體的核苷酸代表重組專一性序列。

使用表3中概述之引子序列，其可能使用與以上所述相同之方法，製造出一個順序顛倒成Lp6G-FFT-Lp1SST之新的FT融合體。

表3，用於擴大用於產生Lp1-SST與Lp6G-FFT果糖基轉移酶基因之轉譯FT融合體(Lp6G-FFT-Lp1-SST)之PCR片段之引子序列。以陰影標示之序列係基因專一性序列、粗體以及下面劃線的(Hind III RE切點)序列係***用以產生連接區域之核苷酸，斜體的核苷酸代表重組專一性序列。

在Lp1-SST_Lp6G-FFT中，該FT蛋白按照自然規律互相連結，形成含有三個SOSUI標出之穿膜結構區之FT融合蛋白(表4，第17圖以及第18圖)。

表4，SOSUI，膜蛋白之分類以及二級結構預測之資料庫(http://bp.nuap.nagova-u.ac.ip/sosui/sosui_submit.html)指示之FT融合體1/3穿膜結構區

植 物果糖基轉移酶之結構特徵

植物FT具有與液泡酸性轉化酶(β-果糖苷酶)高度相似的胺基酸，其等係糖苷水解酶家族32(GH32)之成員，且共同有三個高度保留區域，特徵為模體(N/S)DPNG(亦稱為β-果糖苷酶模體)、RDP以及EC(Altenbach et al.,2005)(第17圖、第18圖以及第36圖)。植物FT以及液泡轉化酶之另一共同特徵為，因後轉譯過程，其等通常係由大與小次單元構成。該大次單元(其懷有全部三個以上所述之保留模體)決定催化專一性(Altenbach et al.,2004)。

以第16A圖中所概述之圖示，其它的FT基因Lp1-FFT、Lp6-SFT以及Lp6-SST亦可用於與Lp1-SST或Lp6G-FFT結合，以產生一個轉譯FT融合體之選擇，如下所示：

‧Lp6G-FFT::Lp1-SST

‧Lp1-SST::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)

‧(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::Lp1-SST

使用相似的方法，亦可製造出三重FT融合體(第16B圖)。有人提出可將該三重融合體建構成併入基因Lp1-SST、Lp6G-FFT與Lp1-FFT、Lp6-SFT或Lp6-SST。改變用於將二個FT基因連接在一起之引子序列，其可能會改變連接子大小以及可能會添加至高達約30個胺基酸。FT蛋白可能會按照自然規律而彼此結合，形成代謝管道，因此分開轉譯融合體內FT基因之距離會影響蛋白質功能。FT融合蛋白較佳地含有從第17圖、第18圖以及第36圖所示之多年生黑麥草而來，代表FT、INV與FEH蛋白間高度保留的結構區之序列。

範例4 果聚糖生合成基因功能之暫時性分析 Lp1-SST、Lp6G-FFT以及FT融合蛋白之功能

編碼Lp1-SST成熟蛋白之cDNA序列之前已於嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)中表達出來，用於進行功能分析(Chalmers,et al.,2003)以及已用實例證實藉由表達此蛋白能將蔗糖轉換成1-蔗果三糖。相似地，將Lp6G-FFT cDNA選殖入表達載體pPICZαA(Invitrogen)，其含有甲醇誘導型啟動子以及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-因子序列，以便使該重組蛋白能夠分泌出，供分離以及功能分析。經添加甲醇誘導45個小時後，從接種入預培養培養基之單一轉形嗜甲醇酵母菌選殖株中，產生該重組Lp6G-FFT酵素。濃縮上清液，然後以100mM蔗糖培育一整夜。依照Chalmers et al.,2003，以HPAEC分析所產生之碳水化合物，使用從洋葱而來之果聚糖萃取物作為對照組(第19圖)。

產生供短暫基因表達分析之載體

若干載體均使用以重組選殖為基礎之Invitrogen Multisite Gateway^TM技術(見，www.Invitogen.com之產品操作手冊)建構。此方法依靠產生含有在兩側有重組位置之啟動子、有興趣之基因(GOI)或終結子序列之個別中間質體(Entry plasmid)。該等重組位置會幫助方向性地將每一個中間質體經由重組三重***Gateway-enabled目的載體。之後對最後的載體進行定序，且直接用於與質體或表達盒(用於表達植物篩選標記)之植物共轉形。

為了測驗FT融合蛋白之功能，在增強的花椰菜嵌紋病毒(CAMV)35S²啟動子之控制下(Kay,et al.,1987)，使用Multisite Gateway^TM科技重組系統(見，www.Invitrogen.com之產品操作手冊)，將該FT融合體1以及3 ORF選殖入農桿菌二元載體(第21圖)中(Hajdukiewicz,et al.,1994)。

建構(CAMV)35S²啟動子、TaRbcS終結子以及FT融合體1與3 ORF之Gateway中間載體。對選殖出之片段進行定序確認，然後用於以三方(three-way)重組，將選殖出之GOI cDNA序列選殖入pPZP200-ubi:bar-nos R4 R3目的載體中。此外，建構體亦包括由(CAMV)35S²啟動子驅動之Lp6G-FFT與Lp1-SST單一ORF作為對照組。舉例而言，亦以相同之方式選殖該Lp1-FFT(或Lp6-SFT、Lp6-SST)單一ORF。GUS ORF作為用於確認表達之對照組。製造出下列建構體。

‧pPZP200-35S²::Lp6G-FFT::TaRbcS

‧pPZP200-35S²::Lp1-SST::TaRbcS

‧pPZP200-35S²::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::TaRbcS

‧pPZP200-35S²::Lp1-SST::6G-FFT::TaRbcS(FT融合體1與3)

‧pPZP200-35S²::GUS::TaRbcS

使用Invitrogen Multisite Gateway^TM科技，製造出下列含有Atrbcs光合啟動子以及(CAMV)35S終結子之載體，供短暫分析用。

‧pPZP200-AtrbcS::Lp1-SST::35S

‧pPZP200-AtrbcS::Lp6G-FFT::35S

‧pPZP200-AtrbcS::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::35S

‧pPZP200-AtrbcS::Lp1-SST::6G-FFT::35S(融合體1與3)

Lp1-SST、Lp6G-FFT以及FT融合蛋白於短暫轉殖基因表達分析中之功能

為檢驗功能，於菸草植物(因為其等不會自然地產生果聚糖)中進行含有由(CaMV)35S啟動子驅動之嵌合Lp1-SST、Lp6G-FFT以及FT融合蛋白基因之建構體之短暫表達。該方法牽涉使該個別的建構體，以農桿菌滲入法進入本塞姆氏煙草(N. benthamiana)葉子中(Kapila,et al.,1997;Wydro,et al.,2006)，接著利用陰離子交換色層分析法進行生化分析。短暫表達程序之圖解示於第21圖中。注射後3天，收集該植物材料，然後用熱水萃取法萃取出水溶性碳水化合物。使用高效陰離子交換色層分析法(HPAEC)分開該萃取物。結果顯示產生之果聚糖，FT融合蛋白產生之1-蔗果三糖與6G-蔗果三糖二者之量均增加(第22圖)。使用相同的實驗去評估含有由AtRbcS啟動子驅動之嵌合Lp1-SST、Lp6G-FFT以及FT融合蛋白基因之建構體之功能。

使用供轉錄共轉形之載體組合進行農桿菌滲入

為評估當於一細胞中一起轉錄時果聚糖生合成之功能，使用以下概述之載體，進行三重農桿菌滲入實驗。使用述於第21圖中之短暫表達程序，將三個載體一起***相同的植物組織中。注射後3天，收集該植物材料，然後用熱水萃取法萃取出水溶性碳水化合物。使用高效陰離子交換色層分析法(HPAEC)分開該萃取物。結果指出於該植物基因體中，因三個果聚糖基因之獨立表達所產生之差異。

‧pPZP200-35S²::Lp6G-FFT::TaRbcS+

‧pPZP200-35S²::Lp1-SST::TaRbcS+

‧pPZP200-35S²::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::TaRbcS

‧pPZP200-AtRbcS::Lp1-SST::35S+

‧pPZP200-AtRbcS::Lp6G-FFT::35S+

‧pPZP200-AtRbcS::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::35S

使用供轉譯共轉形之FT融合體載體進行農桿菌滲入

為比較轉錄共轉形，藉由進行之前討論的以及以下所示之載體之短暫分析實驗，以便比較轉譯共轉形。

‧pPZP200-35S2::Lp1-SST_6G-FFT::TaRbcS(FT融合體1與3)

‧pPZP200-AtRbcS::Lp1-SST_6G-FFT::35S(FT融合體1與3)

範例5 產生用於安定的轉形以及生產基因工程植物之載體 產生用於基因槍以及農桿菌介導的轉形之 載體

科技以含有在AtMYB32基因啟動子之控制下之細胞***素生合成基因(編碼用於延緩葉老化之異丙烯基轉移酶(IPT))之載體為基礎。用於基因槍轉形之載體係使用Gateway^TM Multisite技術建構成的。二元載體pBS-ubi::bar::nos_AtMYB32_IPT_35S之詳細說明述於國際專利申請案PCT/AU01/01092中。

生產用於農桿菌介導的轉形之之方法，述於國際專利申請案PCT/AU01/01092中。對候選基因建構體做完整的定序，以及依循嚴格的品質驗證操作程序，產生用於農桿菌介導的轉形之載體。

含有小麥光合啟動子之建構體

用在側邊具有Gateway^TM(Invitrogen)重組位置之引子，從之前已公開含有從TaRbcS基因(NCBI登錄號：AB042069)而來之TATA訊號之序列中，PCR擴大出一個695kb大的啟動子片段。使用Gateway^TM重組技術，將該片段選殖進入Invitrogen pDONRP4-P1R中間載體中。亦使用具有重組位置之引子，PCR擴大一個696bp大之TaRbcS基因終結訊號序列(Sasanuma,2001)，然後選殖入Invitrogen pDONRP2-P3R中間載體中。對該等選殖出之片段進行定序確認，然後用於三方重組選殖，將選殖出之GOI cDNA序列選殖入pDEST-R4R3目的載體中：pDESTR1-R2R-Lp1-SST、pDESTR1-R2-Lp6G-FFT以及pDESTP1-P2R-Lp1-SST_Lp6G-FFT基因FT融合體表達載體。可使用之由TaRbcS啟動子光合調節果糖基轉移酶之表達之建構體概述於下，且圖示於第23圖中。pDEST-TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS、pDEST-TaRbcS::Lp6G-FFT::TaRbcS以及pDEST-TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcSFT融合體1與3之表達盒序列提供於第24-27圖中。

‧pDEST-TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS

‧pDEST-TaRbcS::Lp6G-FFT::TaRbcS

‧pDEST-TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1與3

‧pDEST-TaRbcS::GUS::TaRbcS

含有黑麥草光合啟動子之建構體

含有黑麥草光合啟動子之建構體係以習用選殖方法產生。使用在正向PCR引子之5’端含有限制內切酶(RE)切點EcoR I之基因專一性引子，PCR擴大693個鹼基對(bp)之果糖基轉移酶4基因(LpFT4)終結序列(Lidgett,et al.,2002)。在反向PCR引子之3’端併入EcoR V以及Xma I內切酶限制切點。將 PCR產物選殖進入pBlueScript SK(-)載體DNA之EcoR I與Xma I限制內切酶切點(Short,et al.,1988)，產生質體pBS-LpFT4(第28圖)。

使用在正向引子之5’端含有內切酶限制切點Xho I與EcoR V以及在反向引子之3’端含有EcoR I限制切點之基因專一性引子，擴大該LpRbcS啟動子。利用EcoR I與Xho I消化，將610bp大之PCR產物選殖入pBS-LpFT4質體中，產生質體pBS-LpRbcS::LpFT4(第29A圖)。使用在側邊均具有EcoR I切點之正向與反向PCR引子，從cDNA模板中擴大出編碼Lp1-SST之區域(Chalmers et al.,2003)，將其選殖入pBS-LpRbcS::LpFT4載體之EcoR I切點，產生最終建構體pBS-LpRbcS::Lp1-SST::LpFT4(第29B圖)。該表達盒之序列(指出啟動子、終結子以及ORF)提供於第31圖中。使用EcoR V限制內切酶，可將該含有多年生黑麥草序列之表達盒從該質體載體DNA中割下來。經瓊脂凝膠電泳後，在用於植物轉形之前，先從該瓊脂基質中純化出所產生之DNA片段，以產生不含載體骨架序列之DNA。

如以上概述之方法製備含有693個鹼基對LpFT4終結子序列之質體pBS-LpFT4(第28圖)。以含有Xho I與EcoR V切點之正向PCR引子以及含有EcoR I限制切點之反向PCR引子，擴大870個鹼基對之LpCAB啟動子片段。將此片段選殖入pBS-LpFT4之Xho I與EcoR I切點，產生pBS-LpCAB::LpFT4質體(第30A圖)。使用在側邊均具有EcoRI切點之正向與反向PCR引子，從cDNA模板中擴大出編碼Lp6G-FFT之區域(Chalmers et al.,2005)，將其選殖入pBS-LpCAB::LpFT4載體之EcoR I切點，產生最終建構體pBS-LpCAB::Lp6G-FFT::LpFT4(第30B圖)。該表達盒之序列(指出啟動子、終結子以及ORF)提供於第32圖中。使用EcoR V限制內切酶，可將DNA表達盒從該質體載體DNA中割下來。經瓊脂凝膠電泳後，在用於植物轉形之前，先從該瓊脂基質中純化出所產生之DNA片段，以產生不含載體骨架序列之DNA。

為產生表達建構體，使用對就在ORF外面之區域具專一性，在正向與反向引子二者之3’區域含有EcoR I限制切點之引子，從pDEST-TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1與3質體(第23C-D圖)中，擴大出基因Lp1-SST與Lp6G-FFT間之轉譯FT融合體。PCR擴大該3920bp ORF，然後選殖入pCR-Blunt載體(Invitrogen)中，以產生PCR Blunt-Lp1-SST-Lp6G-FFT FT融合體(第33圖)。其之後使用EcoR I限制酵素割下，以移除載體專一性序列，然後選殖入pBS-LpRbcS::LpFT4質體(第29A圖)之EcoR I限制切點處，產生pBS-LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4(第34圖)。指出相關結構區(FT融合體3)之FT融合體1與3之表達盒之序列，分別提供於第35圖與第36圖中。可使用EcoRV限制內切酶，將DNA表達盒從該質體載體DNA中割下來。經瓊脂凝膠電泳後，在用於植物轉形之前，先從該瓊脂基質中純化出所產生之DNA片段，以產生不含載體骨架序列之DNA。

由多年生黑麥草啟動子序列光合調節果糖基轉移酶之表達之建構體概述如下。

‧pBS-LpRbcS::Lp1-SST::LpFT4

‧pBS-LpCAB::Lp6G-FFT::LpFT4

‧pBS-LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4FT融合體1與3

含***芥屬光合啟動子之建構體

使用Multisite Gateway選殖方法，產生含有驅動FT融合體3表達之***芥屬光合啟動子之建構體-pPZP200_AtRbcS::Lp1-SST_6G-FFT::35S FT融合體3(第37圖)。該AtRbcS::Lp1-SST_6G-FFT::nos FT融合體3表達盒之序列提供於第38圖中。

含有組成泛素啟動子之建構體

使用習用選殖方法，產生含有啟動子以及玉米(Zea mays)泛素(Ubi)基因之第一內含子之建構體(Christensen et al.,1992)。該Ubi啟動子被視為係一種組成啟動子，但在幼小活躍生長之禾本科植物組織中之表達最多(Rooke et al.,2000)。

以如Chalmers et. al.(2003)所述之方去，PCR擴大候選基因Lp1-SST與Lp6G-FFT之cDNA複本，然後選殖入pBlueScript SK(-)載體中(第39圖)。使用限制內切酶Xho I與Xba I切下cDNA片段，然後將鈍端選殖進入p-Ubi-35S載體之BamH I切點(第40圖)。p-Ubi-35S二元植物表達載體在以前L. multiflorum(Ye et al.,2001)之其它轉形實驗中已經有敘述過。含有以5’至3’方向***該DNA之p-Ubi::Lp1-SST::35S與p-Ubi::Lp6G-FFT::35S選殖株，已經DNA定序確定。結合FT融合蛋白以及終結子序列之組成(Ubi)啟動子之代表性序列提供於第41圖中。使用相似的方法建構p-Ubi::Lp1-FFT::35S選殖株。

用於以Ubi啟動子序列光合調節果糖基轉移酶之表達之建構體概述於下。

‧p-Ubi::Lp1-SST::35S

‧p-Ubi::Lp6G-FFT::35S

‧p-Ubi::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::35S

含有花椰菜嵌紋病毒35S啟動子之建構體

在增強的花椰菜嵌紋病毒(CAMV)35S²啟動子(Kay,et al.,1987)之控制下，調節果糖基轉移酶之表達之建構體述於之前的節段中以及概述於下。

‧pPZP200-35S²::Lp6G-FFT::TaRbcS

‧pPZP200-35S²::Lp1-SST::TaRbcS

‧pPZP200-35S²::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::TaRbcS

‧pPZP200-35S²::Lp1-SST_6G-FFT::TaRbcS FT融合體1與3

含組織專一性或調節啟動子之建構體

於作物中驅動轉殖基因之表達、累積於特定目的組織/器官且避免其它多餘的表達，需要具組織專一性之啟動子。用於驅動為不同目的之轉殖基因之表達之不同的啟動子之例子，示於表5中。連接至FT融合體，屬於組成(Ubi、(CAMV)35S²、RUBQ2、OsAct1)、塊莖與匍匐枝專一性(CathInh)、逆境調節(Atrd29a)以及蔗糖反應性(14-3-3蛋白家族16R)之啟動子之代表性例子，分別示於第42-48圖中。

表5，用於驅動轉殖基因之表達之不同的啟動子之例子

許多光合啟動子在光反應性組織中，已顯示出為表達轉殖基因之強力調節物。用於表達果聚糖生合成基因之光合成啟動子之優點包括，其等在葉的大部分細胞以及莖之上部分(其占植物生物量之大部分)中很活躍。其等不是組成表達的，然而其等之表達形態在時間上以及空間上與蔗糖之累積重疊。

使用供轉錄共轉形之載體組合

單獨或成群地轉形(二個以及三個)下列載體，以便評估用於產生低與高DP果聚糖所需之共表達之協同反應。

‧pDEST-TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS

‧pBS-LpRbcS::Lp1-SST::LpFT4

‧p-Ubi::Lp1-SST::35S

‧pPZP200-35S²::Lp1-SST::TaRbcS

‧pDEST-TaRbcS::Lp6G-FFT::TaRbcS

‧pBS-LpCAB::Lp6G-FFT::LpFT4

‧p-Ubi::Lp6G-FFT::35S

‧pPZP200-35S²::Lp6G-FFT::TaRbcS

‧pDEST-TaRbcS::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::TaRbcS

‧p-Ubi::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::35S

‧pPZP200-35S²::(Lp1-FFT/Lp6-SFT/Lp-SST)::TaRbcS

使用供轉譯共轉形之FT融合體載體

為比較以上所指出之轉錄共轉形，亦以之前所討論的以及下面指出之FT融合體載體，進行轉譯共轉形實驗。

‧pDEST-TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1與3

‧pBS-LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4 FT融合體1與3

‧pPZP200-35S2::Lp1-SST_6G-FFT::TaRbcS FT融合體1與3

範例6 利用轉形產生安定的基因轉殖植物 植物之轉形

本發明之基因建構體可利用轉導、轉染、轉形或基因標靶之方法引入植物細胞中。此等技術包括農桿菌介導的引入法；組織、細胞以及原生質體電穿孔法；原生質體融合體；注射進入生殖器官；注射進入幼胚；以及高速發射導入細胞、組織、癒合組織、幼胚以及成熟胚；顯微注射進入細胞以及原生質體；聚乙二醇介導的直接基因轉移至原生質體；基因槍轉形；絲轉形法(Whiskers transformation)；以及其等之組合。技術之選擇主要取決於欲轉形之植物之類型，且使用因應所選擇之方法之適當的載體。

併入本發明之基因建構體之細胞，可依所使用之載體之指示選定，之後培養於適當的培養基中，以便使用已建立完整之技術，重新產生轉形的植物。所產生之植物可被有性或無性重製，而產生轉形植物之連續繼代。

本發明可應用於各種植物，包括單子葉植物[諸如小麥、玉米、米、大麥、高粱、甘蔗、燕麥、黑麥、禾本科植物(如，草料、草皮以及生質能源牧草，包括多年生黑麥草、高羊茅、義大利黑麥草、紫羊茅、虉草、大藍莖草、網茅、紫狼尾草、柳枝稷、野麥、甜根子草、芒草、雀稗)]、雙子葉植物[諸如***芥屬、菸草、大豆、芥花(canola)、紫花苜蓿、棉花、馬鈴薯、蕃茄、菸草、三葉草(如，白三葉草、紅三葉草、地下三葉草)、芸苔屬蔬菜、萵苣、菠菜]以及裸子植物。特別是，本發明可應用於穀類植物，諸如Triticum aestivum(小麥)、含有天然果聚糖之C3禾本科植物，諸如多年生黑麥草(黑麥草)或葦狀羊茅(Lolium arundinaceum)(高羊茅)以及毛花雀稗(Paspalum dilatatum)(雀稗屬)，一種C4多年生無融合體生殖牧草，不含天然的果聚糖。本發明亦可應用於雙子葉植物，諸如***芥、甘藍型油菜(Brassica napus)(canola)、Nicotiana benthamiana(煙草)以及Trifolium repens(白三葉草)。

單子葉植物，如小麥、多年生黑麥草、高羊茅以及雀稗之基因槍轉形

利用使用整個質體之粒子衝擊，將候選基因***植物基因體中，如此載體之骨架序列亦可併入該基因體中。藉由在含有篩選劑之組織培養基上存活下來，重獲基因轉殖植物組織。

雙子葉植物，如***芥屬、煙草、芥花(canola)以及白三葉草，之農桿菌介導的轉形

農桿菌介導的轉形利用土壤細菌根瘤農桿菌之天然病原活性之優點。根瘤農桿菌會感染雙子葉植物之根＆莖，導致腫瘤誘導(Ti)質體，藉由***專一性基因(T-DNA)於受感染的植物細胞之基因組中引導感染。使用以Ti質體為基礎之二元載體，經農桿菌介導的轉形，將候選基因***植物基因組中。

範例7 生產基因轉殖多年生禾本科植物 使用含有光合啟動子之建構體

在多年生黑麥草之胚性癒合組織上，進行含有TaRbcS與LpRbcS調節序列之載體(驅動個別果聚糖基因或為FT轉譯融合體之表達)以及pAcH1載體(具潮黴素抗性)之多年生黑麥草之基因槍共轉形。該pAcH1載體之前已經建構好了，且已成功地用於植物轉形實驗(Bilang,et al.,1991;Spangenberg,et al.,1995a;Spangenberg,et al.,1995b;Ye,et al.,1997;Bai,et al.,2001)。亦選殖GUS標記基因作為陽性對照組。表6總結產生此等株之轉形以及分子分析。

表6，產生基因轉殖多年生黑麥草植物(供用於在從小麥而來之光合啟動子的控制下，表達Lp1-SST與Lp6G-FFT以及FT融合體ORF)之摘要

使用EcoR V限制內切酶，從下列質體載體中切下含有多年生黑麥草序列之“盒DNA”：pBS-LpRbcS::Lp1-SST::LpFT4、pBS-LpCAB::Lp6G-FFT::LpFT4以及pBS-LpRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::LpFT4(分別於第29、30以及34圖)。瓊脂凝膠電泳後，在用於植物轉形之前，從瓊脂凝膠中純化出所產生之DNA片段，以便產生無載體骨架序列之DNA。亦使用限制酵素，消化之前建構好且成功地用於植物轉形實驗之pAcH1載體，產生僅表達篩選標記之DNA片段。

在多年生黑麥草之胚性癒合組織上，進行含有多年生黑麥草調節序列之載體(驅動個別果聚糖或為轉譯FT融合體之表達)以及pAcH1表達盒(具潮黴素抗性)之多年生黑麥草之基因槍共轉形。表7總結產生此等株之轉形以及分子分析。

表7，用於產生基因轉殖多年生黑麥草植物(供用於在黑麥草光合啟動子的控制下，表達Lp1-SST與Lp6G-FFT以及FT融合體ORF)之轉形過程之摘要

範例8 基因轉殖多年生牧草之特徵描述 基因轉殖FT與FT融合體多年生黑麥草植物之特徵描述

在基因轉殖多年生黑麥草植物之再生期間，注意到該等植株間在生長表型上有差異存在。與含有單一果聚糖生合成基因之基因轉殖植物或僅含有篩選標記hph之對照組植物相比，FT融合體1以FT融合體3基因轉殖植物二者之組織培養再生株以及相應的土壤生長植物，均顯示出較好之生長性能。於組織培養中，針對TaRbcS啟動子以及LpRbcS FT融合體轉殖基因之基因轉殖多年生黑麥草植物之表現型例子展現於第48-51圖中。

確認顯示較好的生長性能表現型之植物含有有興趣之FT基因。基因轉殖FT融合體1與FT融合體3植物之較好的生長性能表現型，於植物中進行植物再生之早期階段期間最早觀察到。明確而言，在光下接種後僅12天，該基因轉殖癒合組織即顯示出進一步生長的綠色幼枝。該FT融合體基因轉殖植物之最快的生長速率在移至生根培養基後22天，變得更明顯。含有FT融合體1或FT融合體3建構體之基因轉殖植物，清楚地顯示較多的分檗數目。此外，在試管中，該FT融合體基因轉殖植物一致地顯示出比對照組植物高的分檗密度/植物(第48-49圖)。

移至土壤後，於溫室條件下之增殖方面，在該FT融合體1與FT融合體3株之間觀察到更明確的差異。雖然二個FT融合體植物均展現出提高的生長性能，但FT融合體1植物具有更長、更厚以及稍微更深之綠色葉片。且該等植物按照自然規律長得更茁壯，具更厚的葉鞘以及葉片。FT融合體3株持續的長得比其它對照植物快，具有較長之葉片以及旺盛的分檗生長，但葉的形態比野生型小。在FT融合體1與FT融合體3土壤生長的基因轉殖多年生黑麥草植物中，亦觀察到根的生物量增加(第50圖)。懷有單獨Lp1-SST或Lp6G-FFT基因之對照組基因轉殖植物，沒有顯示出在FT融合體1與3基因轉殖植物中所觀察到之生長速率位準的增加。其等之外觀彼此相似，然而某些發展得比含GUS或hph之基因轉殖植物旺盛(第50圖)。

在田野中亦觀察到與溫室中所觀察到之表現型相似。該FT融合體基因轉殖植物顯示更旺盛的生長表現型，分檗數目增加以及葉片較長(第51圖)。分析田野試驗基因轉殖植物之生物量產量(表8)。如第52圖所示評估生物量，計分範圍從1最少生物量至5具最大生物量。

表8，指出在田野試驗生長條件下所觀察之每一基因型之生物量得分之範圍的百分比。

用手切下來自個別植物之葉片(第53圖)。所見到之明顯的差異在於各細胞中葉綠體之數量，以及具有葉綠體之細胞的數量；在基因轉殖FT融合體植物二者中均比對照組植物多。此外，僅管二種植物均在生長房內相同的光調件下生長，葉綠體存在於位在基因轉殖植物之遠軸側(葉子的較低部位)之細胞內。有時候觀察到，對照組植物在位於近軸側(面向光源之上側)之葉肉細胞內產生比遠軸側多的葉綠體，而該等基因轉殖植物在二側上通常產生幾乎相同數量的葉綠體。

從懷有TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1、TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3、TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS、TaRbcS::Lp6G-FFT::TaRbcS之單獨轉形株以及二個對照株(僅hph)萃取出之水溶性碳水化合物之HPAEC生化分析結果顯示出，FT融合體1以及FT融合體3基因轉殖植物含有相當高位準的總果聚糖(第54圖)，顯示比對照株增加至2.5倍(第54圖)。此外，與hph對照組相比，FT融合體1植株中之1-蔗果三糖位準高至4倍(乾重3.7μg/mg、總果聚糖：乾重20.5μg/mg以及蔗糖乾重51.2μg/mg)，FT融合體3植株中高3倍(乾重2.4μg/mg、總果聚糖：乾重26.0μg/mg以及蔗糖乾重49.8μg/mg)(第55A-B圖)。在TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS植物中，1-蔗果三糖乾重增加至2.9μg/mg(3倍增加)，而總果聚糖含量僅增加0.5倍至乾重14μg/mg。相反地，TaRbcS::Lp6G-FFT::TaRbcS基因轉殖植物株中1-蔗果三糖位準顯示出略增加至乾重1.6μg/mg(增加0.5倍)，而僅一株顯示總果聚糖小幅的增加至乾重10μg/mg(第55C-D圖以及第56C-D圖)。全部植株之蔗糖含量分析之結果顯示出，一些高果聚糖植株亦顯示總蔗糖含量增加(第57圖)。

亦評估該等基因轉殖多年生黑麥草在田野條件下之總果聚糖位準以及組成(第58 ＆ 59圖)以及轉殖基因之表達(第60C圖)。在田野試驗從頭到尾之生長季節，重覆採集對照組以及基因轉殖多年生黑麥草植物樣本。進行野生型對照組以及單獨的轉形株之生化分析，顯示每一植物之總果聚糖位準。第58圖說明基因轉殖與野生型在田野生長之整個分檗與葉片之果聚糖位準，乾重(DW)，單位毫克(mg)/克(g)。鑑定多樣的個別的FT融合體以及LpRbcS::Lp1-SST基因轉殖植物，在整個分蘗以及葉片樣本中之果聚糖濃度，高出對應的野生型(WT)對照組植物80至120百分比之間(第58圖)。

三個LpRbcS::Lp1-SST基因轉殖多年生黑麥草植物之葉片中果聚糖之組成，與野生型對照組相比之結果示於第59圖中。結果指出，在表達LpRbcS::Lp1-SST之基因轉殖植物中，低DP果聚糖之位準增加(框框1，第59圖)。

檢測以定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)分析的代表性LpRbcS FT融合體與LpRbcS::Lp1SST基因轉殖多年生黑麥草植物中，轉殖基因的表達(第60圖)。

為了量化增加的生物量，從各個T₀基因轉殖株以及對照植株上分離出單一個分檗，之後令其等在溫室條件下，於盆栽混合土中增生。7週以及12週後，分析每一個植物之高度、葉寬以及總分檗數目(第61圖以及第62圖)。7週後，對照組植物顯示出平均高度為24cm，平均葉寬為2.5mm以及每一個植物平均具有二個分檗。然而，基因轉殖FT融合體1與融合體3植顯示出植物高度增加80%(43cm)、葉寬增加60%(4mm)以及分檗數增至3倍(6個分檗)。12週後，對照組植物平均高度43cm、葉寬為3.5mm，每一植物產生5個分檗。在相同期間內，基因轉殖FT融合體1與融合體3植物長至62cm高(與對照組相比，增加43%)。葉寬長至6mm(增加70%)以及每一個植物所觀察到之最大分檗數目為16個(增加220%)(第62圖)。

基因轉殖 以及基因轉殖FT融合體加上 多年生黑麥草植物之特徵描述

共轉形FT融合體與科技產生生長提高的表現型。與對照組以及單獨基因轉殖植物相比，在溫室內生長之植物顯示出分檗之數目增加以及根之生物量增加(第65圖)。

進行植物組織之乾重實驗，以建立個別FT融合體與基因轉殖植物之生物量。將在溫室內生長，處於10個分檗階段之基因轉殖多年生黑麥草植物，在低於最低葉鞘5mm處切下。6週後，收集從土壤位準以上5cm高之整個植物生物量至紙袋中，用烤箱烤乾，然後在精確的天平上稱重。

對照組是計算5個獨立的沒有‘有興趣的基因’植物(GOI-ve)之平均值。FT融合體以及FT融合體加上基因轉殖植物，產生之植物具有乾重大於對照組之平均位準(增至2倍)(第64圖)。

亦進行GOI-ve對照組與單獨的轉形株之生化分析，顯示出每一個植物之總果聚糖。與對照組植物相比，單獨FT融合體以及FT融合體加上基因轉殖植物之葉片中，果聚糖之位準顯示出增至6倍(第65圖)。

描述基因轉殖FT融合體高羊茅植物之特徵描述

以含有多年生黑麥草調節序列(驅動該FT轉譯融合體)之載體以及pAcH1表達盒(具潮黴素抗性)之載體進行高羊茅草之轉形。在溫室內生長之基因轉殖高羊茅草植物，與對照組基因轉殖植物相比，顯示出分檗數目增加以及根生物量增加(第66圖)。

基因轉殖 以及基因轉殖FT融合體加上 高羊茅 植物之特徵描述

已產生出表達單獨LpRbcS FT融合體3、單獨TaRbcS FT融合體3以及TaRbcS FT融合體3加上科技(AtMYB32::IPT)一起之基因轉殖高羊茅(Lolium arundinaceum cv Jesup S3)之植物。表9總結產物此等植株之轉形以及分子分析。

表9，以光合調節的表達FT融合體3和/或轉形高羊茅之過程之摘要。

進行植物組織之乾重實驗，建立個別基因轉殖植物之生物量。將在溫室條件下生長，處於5個分檗階段之基因轉殖高羊茅植物，在低於最低葉鞘5mm處切下。6週後，收集從土壤位準以上5cm高之整個植物生物量至紙袋中，用烤箱烤乾，然後在精確的天平上稱重。

對照組是計算5個獨立的GOI-ve植物之平均值。單獨基因轉殖FT融合體以及FT融合體加上高羊茅植物二者，與對照組植物之平均值相比，均顯示出草料乾重2倍增加(第67圖)。

亦進行分檗數目實驗，建立個別基因轉殖植物之生長活力。高羊茅基因轉殖以及GOI-ve對照組植物二者，在5個分檗階段，以如上所提及之方法裁剪，然後在計數分檗之前，令其在溫室內生長6週。對照組之分檗數相當於從5個獨立的GOI-ve植物獲得之平均分檗數。單獨FT融合體以及FT融合體加上高羊茅植物之基因轉殖株，與對照組植物之平均值相比，顯示出分檗數增至2倍(第68圖)。

裁剪(如上所示)基因轉殖高羊茅植物(5個分檗)，在溫室下生長6週，然後收集葉片、冷凍乾燥供果聚糖分析。對照組之平均果聚糖位準相當於從5個獨立的GOI-ve植物獲得之數據。FT融合體高羊茅植物之基因轉殖株，在葉片中果聚糖之累積量，與GOI-ve對照組植物之平均果聚糖位準相比，顯示出戲劇性的增加(3至5倍之間)(第69圖)。

範例9 基因轉殖小麥植物之生產 表達單一果聚糖基因或FT轉譯融合體之光調節啟動子之轉形

在小麥胚性癒合組織中，進行含有光合啟動子調節序列(驅動個別果聚糖基因或為轉譯FT融合體之表達)之載體以及含有嵌合Ubi::bar::nos篩選標記(具草丁膦抗性)pAcH25之載體之小麥之基因槍共轉形。

AtMYB32啟動子與IPT基因(延緩老化)之轉形

已建構好用於基因槍轉形小麥之轉形載體，含有嵌合AtMYB32::IPT::35S與嵌合Ubi::bar::nos篩選標記基因(具草丁膦抗性)。用載體基因轉形小麥，係以基因槍轉形來自Triticum aestivum L Bobwhite 26小麥株之胚性癒合組織為基礎(如國際專利申請案PCT/AU01/01092所示)。使用整個質體利用粒子衝擊，將候選基因***該小麥基因體中，如此載體骨架序列亦可被併入基因體中。藉由在含有篩選劑之組織培養基上存活下來，重獲基因轉殖植物組織。

產生光合細胞中果聚糖生合成經改編以及光合細胞 命延長之基因轉殖植物

使用以上概述之方法，產生基因轉殖植物，其含有由光調節啟動子驅動之果聚糖生合成基因以及用於改編光合細胞中果聚糖生合成以及延長光合細胞之命之科技。表8簡述用於產生此等基因轉殖植物之轉形以及分子分析。

表10，用於在小麥之光合啟動子的控制下以及結合技術(用於改編光合細胞中果聚糖之生合成以及延長光合細胞命)，產生表達Lp1-SST以及Lp6G-FFT以及FT融合體ORF之基因轉殖小麥植物之轉形過程之摘要。

範 例10 基因轉殖小麥植物之特徵描述 基因轉殖FT融合體小麥植物之特徵描述

在該基因轉植小麥植物再生期間，在試管中生長之表現型上注意到差異。從該FT融合體1以及FT融合體3基因轉殖植物二者而來之組織培養再生物，比對照組顯示出更旺盛的表現型。

基因轉殖FT融合體1與FT融合體3植物之較好的生長性能表現型，於在組織培養皿上試管中植物再生之早期階段期間最早觀察到。基因槍轉形之後，使癒合組織保持在組織培養皿上，置於黑暗中2週，之後移至光下。在光下培育約6週後，該轉形的癒合組織顯示發展更完全的綠枝，且該FT融合體基因轉殖再生株之根生長的速度非常快(第70圖)。

該FT融合體基因轉殖植物之快速生長速率在移至生根培養基後變得更明顯。與無效的對照組相比，FT融合體基因轉殖植物在早期約2個月時即顯示出分檗增加(與對照組植物中1個分檗相比，高達5個分檗)。某些植物之葉寬為4-5mm，對照組植物為2-3mm。此外，該FT融合體基因轉殖株一致地顯示出比對照株高的分檗密度/植物(第71圖)。

移至土壤且於溫室條件下增生後，與對照組植物相比，該含有FT融合體建構體之基因轉殖小麥植物繼續顯示出分檗數目增加(第72圖)。

基因轉殖 以及FT融合體加上 小麥植物之特徵描述

在溫室條件下，含有科技建構體之基因轉殖小麥植物，與對照組植物相比，顯示出分檗數目增加(第73A圖)。在溫室條件下35天後，其等亦顯示出光合組織增加(第73B圖)。

共轉形該FT融合體建構體以及科技，產生生長提高之溫室生長植物之表現型。在溫室條件下，該等植物某些亦顯示出明顯的延遲老化(40天)(第74圖)。在溫室條件下，表達該FT融合體建構體以及該FT融合體建構體加上之基因轉殖小麥植物，與對照組植物相比，亦顯示出葉中之果聚糖位準增加以及分檗數目增加(第75圖)。

進行在溫室條件下生長之GOI-ve對照組、FT融合體以及FT融合體加上非依頼性T₁小麥轉形株的生化分析，以顯示每株植物之總果聚糖位準。二個基因轉殖株均檢測出果聚糖位準戲劇性的增加(高達5倍)(第76圖)。

範例11 產生基因轉殖毛花雀稗( paspalum dilatatum )植物 在AtMYB32啟動子控制下用於延緩葉老化之 IPT 基因之轉形

毛花雀稗(apomictic dallisgrass)之基因轉形，係以如國際專利申請案PCT/AU01/01092所述之基因槍轉形為基礎。

使用整個質體利用粒子衝擊，將候選基因表達建構體***該毛花雀稗基因體中，如此載體骨架序列亦可被併入基因體中。藉由在含有篩選劑之組織培養基上存活下來，重獲基因轉殖植物組織。

在光調節啟動子之控制下用於操縱光合細胞中果聚糖生合成之FT轉譯融合體之轉形

使用與用於產生基因轉殖毛花雀稗植物相同之方法，以光合調節的果聚糖生合成基因，基因轉形毛花雀稗。

範例12 基因轉殖毛花雀稗植物之特徵描述 基因轉殖植物展現較好的生長表現型。

表達該在AtMYB32啟動子控制下之IPT基因之基因轉殖毛花雀稗，展現出生物量累積增加。在推定的基因轉殖毛花雀稗植物之再生期間，注意到生長表現型之差異，顯示比對照組植物好的生長表現型。該有特色的生長表現型可用作為篩選工具，用於鑑別結合共轉形的載體之轉形植物。

範例13 產生基因轉殖雙子葉植物 以及FT融合體加上 雙子葉植物之轉形

已生產出用於農桿菌介導轉形雙子葉植物之含有FT融合體以及科技的二元載體。轉形載體亦含有嵌合35S::nptII::35S或35S::hph::35S作為篩選標記基因。

產生基因轉殖雙子葉植物

已生產出表達單獨科技(AtMYB3::IPT)、單獨AtRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::35S FT融合體以及科技與AtRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::35S FT融合體一起之基因轉殖白三葉草(Trifolium repens)以及***芥植物(第77圖以及第80圖)。表11以及表12簡述分別用於產生此等植株之轉形以及分子分析。

表11，以***芥光合調節表達FT融合體和/或轉形白三葉草之過程之摘要

表 12，以***芥光調節表達FT融合體和/或轉形***芥之過程之摘要

基 因轉殖白三葉草植物之特徵描述

使用定量RT-PCR去確認轉形株以及檢測所篩選出之植株中AtRbcS FT融合體之表達位準(第78圖)。此等植株(顯示該轉殖基因之表達)亦顯示出果聚糖之位準增加(第68B圖)。於對照植株中沒有檢測到表達(第78圖)。

以HPAEC進行從表達單獨AtRbcS FT融合體、AtRbcS FT融合體加上以及GOI-ve對照株之獨立的轉形株萃取而得之水溶性碳水化合物之生化分析，以便顯示每植株之總果聚糖位準。AtRbcS FT融合體以及AtRbcS FT融合體加上基因轉殖植株，在葉中累積之果聚糖比在對照組中觀察到之位準有2倍的增加(第79圖)。

基因轉殖***芥植物之特徵描述

使用定量RT-PCR去確認轉形株以及檢測所篩選出之植株中AtRbcS FT融合體之表達位準(第81圖)。於土壤中生長之基因轉殖T₂ FT融合體***芥植物示於第82圖中。亦出示無有興趣基因之植物(GOI-ve)，且與表達該轉殖基因之FT融合體基因轉殖植物間沒有顯示出表現差異。

亦使用二元載體進行農桿菌介導的轉形甘藍型油菜(canola)胚軸節段(專利PCT/AU01/01092)。

範例14 基因轉殖雙子葉植物之特徵描述 基因轉殖 雙子葉植物之特徵描述

如國際專利申請案PCT/AU01/01092中所述，使用AtMYB32啟動子之功能活性片段來驅動IPT於白三葉草以及芥花(canola)植物中之表達。從雙子葉植物之科技中觀察到之結果為延遲老化；葉生長動力增加；匍匐枝死亡減少；生物量產量增加；累積的綠葉區增加；種子產率增加；耐旱性增加；耐弱光性增加；反芻發酵動力學增加以及較高的乾物質消化率反映出草料品質增加。

基因轉殖植物展現延遲葉老化表現型。

老化發展之調節，可經由模擬以及開啟分離的葉子在體外濕濾紙上之人工老化進行評估。在黑暗中培育分離的葉子能非常有效的誘發老化相關的基因(SAGS)、葉變黃以及葉綠素流失(Weaver and Amasino,2001)。第83圖顯示在白三葉草以及芥花(canola)中，由AtMYB32啟動子之一或二個功能活性片段控制下之IPT基因的表達相關之分離老化之分析數據。與由對照組植物來的葉子相比，該基因轉殖植物之葉子展現出顯著的延遲老化，分離後7-20天。

範例15 產生用於改編光合細胞中果聚糖生合成以及延長此等光合細胞之壽命之基因轉殖植物

使用以上概述之方法，已產生含有在光調節的光合成啟動子控制用於改編光合細胞中果聚糖之生合成之果聚糖生合成基因(包括FT融合基因之FT)以及科技(透過共表達由AtMYB32啟動子驅動之IPT基因以延長光合細胞之壽命)二者之基因轉殖植物。

範例16 使用有特色的生長表現型作為於試管中鑑定基因轉殖植物 之篩選工具

於全部經轉形之植物類型(如，多年生黑麥草以及小麥)中，均觀察到基因轉殖FT融合體1或FT融合體3植物之較好的生長表現型。於黑麥草以及小麥二者中，其在於培養皿中進行之植物再生的早期階段首先被觀察到。在沒有抗生物篩選下進行之實驗中，在衝擊癒合組織後置於黑暗條件中8週之後，觀察到強力的枝誘導(第84A-C圖)。將培養皿移至光條件下後(轉移後7天)，於該基因轉殖植物中觀察到強力的枝誘導，而在對照組植物中檢測到非常低層度的枝再生(第84D-F)。

在TaRbcS或其它光合、蔗糖調節的或組成啟動子之控制下之FT融合體之表達，可用作為在組織培養階段鑑定轉形植物之篩選工具。FT融合體蛋白之表達亦可由一組啟動子所驅動，該啟動子會因組織培養基中存在高濃度的蔗糖而活化，然而因在土壤中生長之植物中存在低蔗糖位準而活性非常低。此轉殖基因之後可從該基因轉殖植物連續繼代中分離出來。可用作為篩選劑之生物量增加的轉形植物，不需要抗生素抗性標記來進行篩選，使得能夠生產上市產品。

進行分析，以評估使用有特色的生長表現型來檢測多年生黑麥草中陽性轉形之結果。以覆蓋有無任何篩選標記之單獨TaRbcS FT融合體1、單獨TaRbcS FT融合體3、單獨AtMYB32::IPT()以及TaRbcS FT融合體1加上載體之金粒子，衝擊胚性多年生黑麥草癒合組織FLP410-20。對照組癒合組織僅以金粒子衝擊。

在無抗生素篩選下再生植物，且置於黑暗條件下持續2週，之後移至光條件下(光/黑暗光週期，16/8小時)。檢驗該植物在移至光下之前以及在光條件下5週每週之生長。令癒合組織在相同培養皿上保持在日漸匱乏條件下5週(癒合組織誘導培養基：MS全量+250mg/L L-天門冬醯胺+2.5mg/L 2,4-D+6%蔗糖+0.7%瓊脂)。

對照組植物之生長在光條件下首2或3週期間開始，但在4與5週後顯著的慢下來(第85圖)。某些以TaRbcS FT融合體載體衝擊之癒合組織，在首2至3週期間顯示較旺盛的生長，且在4與5週後持續生長(速率降低)(第85圖)。在單獨衝擊的癒合組織中沒有觀察到差異存在。共轉形TaRbcS FT融合體1加上載體顯示一種介於對照組與該單獨TaRbcS FT融合體1載體間之中間表現型(第86圖)。

使用qRT-PCR，於推論的基因轉殖株中進行分子分析，以檢測TaRbcS FT融合體轉殖基因之存在。FT融合體基因轉殖株在無抗生素之情況下，顯示60%至70%之間的轉形以及選擇效力。單獨LXR基因轉殖植物沒有顯示出存在轉殖基因。共轉形TaRbcS FT融合體與LXR顯示11%的共轉形以及篩選效力(第86圖)。

共轉形FT融合體與，供用於陽性篩選以決定共轉形效力之方法已經成熟且概述於下。

首先，決定各種轉形項目(包括含有抗生素篩選標記)之共轉形效力。此等共轉形項目包括：

1.由光合啟動子調節之FT融合體+hph篩選標記

2.加上hph篩選標記

3.由光合啟動子調節之FT融合體加上加上hph篩選標記

在抗生素培養基上進行轉殖基因之篩選，然後測定每一個雙或三重共轉形項目之轉殖基因之存在，產生每一項目之共轉形效力數。

亦在無抗生素篩選標記之情況下，於無篩選培養基上進行共轉形項目第二輪之篩選。此等共轉形項目包括：

1.由光合啟動子調節之FT融合體+dsRED標記

2.加上dsRED標記

3.由光合啟動子調節之FT融合體加上加上dsRED標記

進行枝和/或根生長速率增加之篩選，然後測定每一個雙或三重共轉形項目之轉殖基因之存在。dsRED標記基因之存在，可輕易地經由螢光顯現測得，且可幫助測定每一項轉形項目之共轉形效力。比較在有或無篩選標記之情況下測定之共轉形效力，幫助建立使用較好的表現型作為篩選工具之效力。

參考文獻

Documents cited in this specification are for reference purposes only and their inclusion is not acknowledgment that they form part of the common general knowledge in the relevant art.

Altenbach,D.,et al. (2004) “The large subunit determines catalytic specificity of barley sucrose:fructan 6-fructosyltransferase and fescue sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase.” FEBS Lett. 567:214-218.

Altenbach,D.,et al. (2005) “Mutational analysis of the active center of plant fructosyltransferases:Festuca 1-SST and barley 6-SFT.”FEBS Lett. 579:4647-53.

Bai,Y.,et al.(2001)."Genetic transformation of elite turf-type cultivars of Tall Fescue."International Turf grass Society Research Journal 9:129-136.

Barry,G.,et al.(1984)."Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene."Proc Nat Acad Sci 81:4776-4780.

Biggs,D.,et al.(1998)."In vitro digestion of bacterial and plant fructans and effects on ammonia accumulation in cow and sheep rumen fluids."J Gen Appl Microbiol 44:167-171.

Bilang,R.,et al.(1991)."The 3'-terminal region of the hygromycin-B-resistance gene is important for its activity in Escherichia coli and Nicotiana tabacum."Gene 100:247-250.

Brenner W.G,et al.(2005)."Immediate-early and delayed cytokinin response genes of Arabidopsis thaliana identified by genome-wide expression profiling reveal novel cytokinin-sensitive processes and suggest cytokinin action through transcriptional cascades."Plant J 44:314-333.

Chalmers,J.,et al.(2003)."Isolation and characterisation of a sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase gene from perennial ryegrass(Lolium perenne)."J Plant Physiol 160(11):1385-1391.

Chalmers,J.,et al.(2005)."Functional genomics of fructan metabolism in temperate grasses."Plant Biotech J 3(5):459-474.

Chandlee,J.(2001)."Current molecular understanding of the genetically programmed process of leaf senescence."Physiologia Plantarum 93:113.

Chen,Z. et al.(1988)"A DNA sequence element that confers seed-specific enhancement to a constitutive promoter."EMBO J. 7:297-302.

Christensen,A.H.,et al.(1992)."Maize polyubiquitin genes:structure,thermal perturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation."Plant Mol Biol 18:675-689.

Doczi,R.,et al.(2005)"Conservation of the drought-inducible DS2 genes and divergences from their ARS paralogues in solanaceous species."Plant Phys.Biochem. 43:269-276.

Faiss，M. et al.(1997)"Conditional transgenic expression of the IPT gene indicates a function for cytokinins in paracrine signalling."The Plant Journal 12:401-415.

Gadegaard,G.,et al.(2007)."Improved fructan accumulation in perennial ryegrass transformed with the onion fructosyltransferase genes 1-SST and 6G-FFT."J Plant Physiol pubished on-line(doi:10.1016/j.jplph.2007.06.019).

Gan,S. S.,et al.(1999)."DevelOpmental targeting of gene expression by the use of a senescence-specific promoter."Inducible Gene Expression in Plants. R. P. New York,CAB International:169-186.

Guerrand,D.,et al.(1996). "Fructan metabolism in expanding leaves,mature leaf sheaths and mature leaf blades of Lolium perenne. Fructan synthesis,fructosyltransferase and invertase activities."New Phytol 134:205-214.

Hajdukiewicz,P.,et al.(1994). "The small,versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors RT for plant transformation."Plant Mol Biol 25:989-994.

Hauffe,K. et al.(1993)"Combinatorial interactions between positive and negative cis-acting elements control spatial patterns of 4CL-1 expression in transgenic tobacco."Plant J. 4:235-53.

Heazlewood,J.(2000)"AtMYB32:a MYB related gene from Arabidopsis thaliana expressed in developing anthers and roots" PhD thesis(Botany Department of La Trobe University).

Hendry,G.,et al.(1993). "The origin,distribution and evolutionary significance of fructans." Science and Technology of Fructans. Suzuki M and Chatterton NJ. Florida,CRC Press:119-139.

Herbers,K.,et al.(1994)"Cloning and characterization of a cathepsin D inhibitor gene from solanum tuberosum L."Plant Mol Biol. 26:73-83.

Hewelt,A.,et al.(1994)"Promoter tagging with a promoter-less IPT gene leads to cytokinin-induced phenotypic variability in transgenic tobacco plants:implications of gene dosage effects."The Plant Journal 6:879-891

Hisano,H.,et al.(2004)."Transgenic perennial ryegrass plants expressing wheat fructosyltransferase genes accumulate increased amounts of fructan and acquire increased tolerance on a cellular level to freezing."Plant Sci 167:861-868.

Hudson,M. E.,et al.(2003)."Identification of promoter motifs involved in the network of phytochrome A-regulated gene expression by combined analysis of genomic sequence and microarray data."Plant Physiol 133:1605-1616.

Huynh,L.N.,et al.(2005)"Regulation of flooding tolerance of SAG12:IPT Arabidopsis plants by cytokinin."Journal of experimental botany 56:1397-1407.

Jin,L. and Lui,J.(2008)"Molecular cloning,expression profile and promoter analysis of the novel ethylene responsive transcription factor gene GhERF4 from cotton."Plant Phys Biochem. 46:46-53.

Kapila,J.,et al.(1997)."An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves."Plant sci 124(2):227-227.

Kay,R.,et al.(1987). "Duplication of(CAMV)35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes."Science 236:1299-1302.

Khodakovskyaya,et al.(2004)"Distinct isoprenoid origins of cis-and trans-zeatin biosynthesis in Arabidopsis. Journal of biological"Chemistry 279:14049-14054.

Kwak,M.,et al.(2005)"Two sweet potato ADP-glucose phsophorylase isoforms are regulated antagonistically in response to sucrose content in storage roots."Gene 366:87-96.

Li,X.,et al.(2001)Sucrose regulation of ADP-glucose pyrophosphorylase subunit genes transcript levels in leaves and fruit.Plant Science 162:239-244.

Lidgett,A.,et al.(2002)."Isolation and characterisation of a fructosyltransferase gene from perennial ryegrass(Lolium perenne)."J Plant Physiol 159(9):1037-1043.

Lin,K.,et al.(2008)"Generation and analysis of the transgenic potatoes expressing heterologous Thermostable B-amylase"Plant science 174:649-657.

Liu,D.,et al.(2003)"High transgene expression levels in sugarcane(Saccharum officinarum L.)driven by the rice ubiquitin promoter RUBQ2."Plant Science 165:743-750.

Martinez-Hernandez,A.,et al.(2002)."Functional properties and regulatory complexity of a minimal RBCS light-responsive unit activated by phytochrome,cryptochrome,and plastid signals."Plant Physiol 128:1223-1233.

Mcabe,M.,et al.(2001)"Effects of PSAG12-IPT gene expression on development and senesence in transgenic lettuce."Plant Physiology 127:505-516.

McElroy,D.,et al.(1990)."Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation."Plant Cell 2:163-171.

Medford,J.I,et al.(1989)"Alterations of endogenous cytokinins in transgenic plants using chimeric isopentenyl transferase gene."The Plant Cell. 1:403-413.

Nocek,J.,et al.(1988)."Protein and energy as in integrated system. Relationship of ruminal protein and carbohydrate availability to microbial synthesis and milk production."J Dairy Sci 70:2070-2107.

Pollock,C.,et al.(1979)."Seasonal patterns of fructan metabolism in forage grasses."New Phytol 83:9-15.

Preston,J.,et al..(2004)"AtMYB32 is required for normal pollen development in Arabidopsis thaliana."The Plant Journal,40:979-995.

Ouellet,F.,et al.(1998)"The wheat wcs120 promoter is cold-inducible in both monocottyledeonous and dicotelydonous species."FEBS Letters 423:324-328.

RIRDC.(2007)."Biofuels in Australia-an overview of issues and prospects."from www.rirdc.gov.au.

Romero,H.,et al.(2006)Expression profile analysis and biochemical properties of the peptide methionine sulfoxide reductase A(PMSRA)gene family in Arabidopsis."Plant Science 170:705-714.

Rooke,L.,D. et al(2000)."Marker gene expression driven by the maize ubiquitin promoter in transgenic wheat."Ann Appl Bio 136:167-172.

Sasanuma,(2001)."Characterization of the rbcS multigene family in wheat:subfamily classification,determination of chromosomal location and evolutionary analysis."Mol Genetics Genomics 265(1):161-171.

Schaffner,A. R.,et al.(1991)."Maize RbcS Promoter Activity Depends on Sequence Elements Not Found in Dicot rbcS Promoters."Plant Cell 3:997-1012.

Siebertz,B.,et al.(1989)"cis-Analysis of the wound inducible promoter wun-1 in transgenic tobacco plants and histochemical localisation of its expression."The Plant Cell 1:960-968.

Short,J.,et al.(1988)."Lambda ZAP:a bacteriophage lambda expression vector with in vivo excision properties."Nucleic Acids Res 16(15):7583-7600.

Smart,C.(1994)."Gene expression during leaf senescence."New Phytol 126:419-448.

Spangenberg,G.,et al.(1995a)."Transgenic tall fescue and red fescue plants from microprojectile bombardment of embryogenic suspension cells."J Plant Physiol 145:693-701.

Spangenberg,G.,et al.(1995b)."Transgenic perennial ryegrass(Lolium perenne)plants from microprojectile bombardment of embryogenic suspension cells."Plant Sci 108(2):209-217.

Stark,D. et al. 1992"Regulation of the Amount of Starch in Plant Tissues by ADP Glucose Pyrophosphorylase"Science 258:287-292.

Szopa,J.,et al.(2003)"Structural organisation,expression,and promoter analysis of a 16R isoform of 14-3-3 protein gene from potato."Plant Phys Biochem. 41:417-423.

Taweel,H. Z.,et al.(2005)."Effects of feeding perennial ryegrass with an elevated concentration of water-soluble carbohydrates on intake,rumen function and performance of dairy cows."Ani Feed Sci Tech 121:243-256.

Terzaghi,W. B.,et al.(1995)."Light-regulated transcription."Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46:445-474.

Thomas,H.,et al.(1999)."Partitioning of sugars in Lolium perenne(perennial ryegrass)during drought and on rewatering."New Phytol 142:295-305.

Tran,L. et al.(2004)"Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter."Plant Cell 16:2481-98.

Wan,B.,et al.(2007)"Expression of rice Ca2+ -dependent protein kinases(CDPKs)genes under different environmental stresses."FEBS Letters 581:1179-1189.

Weaver L.M. and Amasino,R.M.(2001)"Senescence is induced in individually darkened Arabidopsis leaves but inhibited in whole darkened plants."Plant Physiology 127:876-886.

Weaver,L.M.,et al.(1998)."A comparison of the expression patterns of several senescence-associated genes in response to stress and hormone treatment."Plant Mol Biol 37:455-469.

Wydro,M.,et al.(2006)."Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana."Acta biochim Pol 53(2):289-298.

Yamaguchi-Shinozaki K. and Shinozaki K.(1993). Characterisation of the expression of a desiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol. Gen. Genet. 236:331-340.

Ye,X.,et al.(1997)."Transgenic Italian ryegrass(Lolium multiflorum)plants from microprojectile bombardment of embryogenic suspension cells."Plant Cell Rep 16(6):379-384.

Ye,X.,et al.(2001)."Altered fructan accumulation in transgenic Lolium multiflorum plants expressing a Bacillus subtilis sacB gene."Plant Cell Rep 20:205-212.

Zeng,W.K.,et al.(1995)."PCR Amplification and Sequencing of a Wheat rbcS Gene Promoter."Acta Bot Sinica 37(6):496-500.

Zhang,X.,et al.(2004)"The indigenous plasmid pQBR103 encodes plant-inducible genes,including three putative helicases."FEMS Micro. Ecol. 51:9-17.

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<120> 用於操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之方法、基因建構體及基因轉殖植物細胞

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<213> 多年生黑麥草

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第1圖，葉片之光合細胞中，果聚糖生合成基因之靶向表達模型。果糖基轉移酶(FT)基因之表達係由光合啟動子所驅動。之後，果聚糖生合成作用在生產蔗糖之光合細胞中發生。加上修飾細胞***素之生合成以延緩葉片老化，延長了經設計能合成果聚糖之光合細胞的Y命且使生物量產量增加。

第4圖，LpCAB啟動子之核苷酸序列(序列辦識編號：1)。

第5圖，LpRbcS啟動子之核苷酸序列(序列辦識編號：2)。

第6圖，某些禾本科植物中果聚糖生合成路徑之概要圖。

第8圖，Lp6G-FFT之推論的胺基酸序列(序列辨識編號：4)。

第10圖，Lp1-FFT之推論的胺基酸序列(序列辨識編號：6)。

第17圖，(A)與(B)，FT蛋白交互反應而形成穿膜蛋白之假設模型。(C)Lp1-SST-6G-FFT蛋白中主要的蛋白結構區之圖式。框框1：(N/S)DPNG；框框2：RDP；以及框框3：EC，代表牽涉基質(蔗糖)結合以及水解之高度保留性結構區。十字(X)代表從來自黑麥草(Lolium)物種之FT、轉化酶以及FEH序列之間所找到之高度保留性胺基酸序列(結構區)。LS-大次單元、SU小次單元。Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體3蛋白之胺基酸序列內之活性結構區之代表圖，可在第36圖中找到。

第25圖，TaRbcS::Lp6GFFT::TaRbcS表達盒之序列(序列辨識編號:35)。調節序列、TaRbcS啟動子以及終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第26圖，TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體1表達盒之序列(序列辨識編號:36)。調節序列、TaRbcS啟動子以及終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第27圖，TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS FT融合體3表達盒之序列(序列辨識編號:37)。調節序列、TaRbcS啟動子以及終結子分別以斜體以及底下劃線斜體表示。ORF序列係以常規字體表示，而起始(ATG)以及終止(TAG)密碼子以陰影表示。

第33圖，質體PCR Blunt-Lp1-SST_Lp6G-FFT FT融合體。

第54圖，存在於安定的基因轉殖TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcS　FT融合體3、TaRbcS::Lp1-SST::TaRbcS、TaRbcS::Lp6G-FFT::TaRbcS多年生黑麥草植物以及僅懷有篩選標記(hph基因)之對照組多年生黑麥草植物中之果聚糖位準以及組成之生化分析(HPAEC)。

第71圖，在(A)於試管條件下生長2個月以及(B)在溫室條件下生長之含有TaRbcS::Lp1-SST_Lp6G-FFT::TaRbcSFT融合體建構體之基因轉殖小麥植物之分檗數，與對照組植物相比，在早期即顯示出明顯的增加。

第79圖，野生型對照組、AtRbcS FT融合體以及AtRbcS FT融合體加上基因轉殖白三葉草株中果聚糖之累積量。

第82圖，土壤中生長之基因轉殖T₂ FT融合體***芥屬植物。

第86圖，移至光下後5週，單獨以金粒子(對照組)以及覆蓋有單獨TaRbcS FT融合體1、單獨TaRbcS FT融合體3、單獨LXR以及TaRbcS FT融合體加上LXR載體之金粒子衝擊之胚性多年生黑麥草癒合組織。分子分析陽性株：TaRbcS FT融合體1#1、2、3、4、7、6、12、13、14、16、17；TaRbcS FT融合體3#1、2、3、5、8、10、11、12、13；TaRbcS FT 融合體1加上LXR#1、2、7、12(單獨TaRbcS FT融合體1)；#8、14(TaRbcS FT融合體1加上LXR)。

Claims

一種操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之方法，該方法包括於該植物中引入一有效量之基因建構體，該基因建構體包括一光調節啟動子，操作性地連接至編碼二或多種果聚糖生合成酵素之核酸，其中該等核酸連接形成一編碼該二或多種酵素之融合蛋白之融合基因。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該二或多種果聚糖生合成酵素係擇自於由1-SST、1-FFT、6-SFT以及6G-FFT所組成之群組。
如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該方法包括提高該植物中果聚糖生合成生化路徑之生產率。
如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該方法包括提高該植物之生物量。
如申請專利範圍第4項之方法，其中該方法進一步包括於該植物中引入一有效量之能夠操縱植物之老化之基因建構體。
如申請專利範圍第5項之方法，其中該能夠操縱老化之基因建構體包括一MYB基因啟動子或經修飾的MYB基因啟動子，操作性地連接至一編碼牽涉細胞***素之生合成之酵素之基因，或其功能活性片段或變異體。
一種能夠操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之基因建構體，該基因建構體包括一光調節啟動子，操作性地連接至編碼二或多種果聚糖生合成酵素之核酸，其中該等核酸連接形成一編碼該二或多種酵素之融合蛋白之融合基因。
如申請專利範圍第7項之基因建構體，其中該二或多種果聚糖生合成酵素係擇自於由1-SST、1-FFT、6-SFT以及6G-FFT所組成之群組。
一種基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有經修飾的果聚糖生合成特徵或提高的生物量，其中該基因轉殖植物細胞包括一如申請專利範圍第7或8項之基因建構體。
如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有生物量增加至少10%。
如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有生物量增加至少20%。
如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有生物量增加至少30%。
如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有生物量增加至少40%。
如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有可溶性碳水化合物增加至少10%。
如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有可溶性碳水化合物增加至少20%。
如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有可溶性碳水化合物增加至少30%。
如申請專利範圍第9項之基因轉殖植物細胞，其相對於未轉形對照組植物細胞，具有可溶性碳水化合物增加至少40%。