JPWO2004037859A1 - Ｇｌｐ−１誘導体及びその経粘膜吸収型製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＧＬＰ−１（７−３５）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加された配列からなり、かつＧＬＰ−１活性を有するペプチドのＣ末端にＷａａ−（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ（ＷａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ＸａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ｎは０〜１４の整数、ＹａａはＡｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＮＨ２またはＨｓｅ）が付加されたＧＬＰ−１誘導体である。本誘導体は、粘膜からの吸収性が高い誘導体である。本発明では更に、ＧＬＰ−１アミノ酸配列の８位をＳｅｒに置換することでジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する耐性を付加、また２６位をＧｌｎに３４位をＡｓｎに置換することでトリプシン耐性を付加することができる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、表面電荷をマイナスに調整した電荷調整脂肪乳剤を用いて製剤化することにより、更にその粘膜吸収率を高めることができる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、表面電荷をマイナスに調整した電荷調整脂肪乳剤を用いて製剤化することにより、更にその粘膜吸収率を高めることができる。
Description
本発明は、口腔、肺、鼻、あるいは腸などの粘膜から吸収される割合の高い、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の新規誘導体、およびその製造と利用方法に関する。
ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１）は、食物摂取により消化管より分泌され、膵臓に働きインスリン分泌を刺激するインクレチンホルモンとして知られている。同様の作用を示すものには、ＧＩＰ（Ｇａｓｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅまたはＧｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）がある。２型糖尿病患者では、健常人に比べ、このインクレチン効果が欠如しているかもしくは障害されていることが示唆されていて、これが高血糖の成因の一つと考えられている。例えば、２型糖尿病患者では血中ＧＬＰ−１濃度が低下し、ＧＩＰは健常人と変わらないことが報告されている。また、２型糖尿病患者へのインクレチンホルモン投与試験の結果、インスリン分泌促進反応が健常人に比べて、ＧＬＰ−１投与では差違は認めないが、ＧＩＰ投与で顕著に低下していることが報告されている。このため、糖尿病患者ではＧＬＰ−１に対する応答性は維持されているので、不足を補うＧＬＰ−１製剤は、インスリン分泌促進剤としての糖尿病治療薬としての応用に期待が持たれている。
ＧＬＰ−１のインスリン分泌作用の特徴は、血糖値が１１０ｍｇ／ｄｌ以下ではインスリン分泌を刺激せず、それ以上の血糖値になってはじめてインスリン分泌させるという血糖値依存性を表すことである。すなわち、ＧＬＰ−１の投与により、血糖値に応じてインスリン分泌が促進され、血糖値が正常以下になるとインスリン分泌は起こらない。したがってＧＬＰ−１を使用した場合、低血糖の心配がないこと、またインスリンの過剰な分泌がなく膵臓を疲弊させないことが大きな臨床上のメリットである。一方、２型糖尿病の治療において中心的に使用されているスルフォニル尿素剤は、持続的にＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルを閉鎖しインスリン分泌を促進させる。しかし、血糖値とは無関係に膵臓のインスリン分泌細胞に働くため、低血糖、β細胞への過剰な刺激による膵臓の疲弊、長期投与による２次無効が報告されている。したがって、ＧＬＰ−１の薬理学的特性は、従来の糖尿病薬とは異なる有用なものである。
またＧＬＰ−１には、グルカゴン分泌を抑制する特性、食物の胃からの***を遅らせる特性、胃酸分泌を抑制する特性、脳に作用して摂食を抑制する特性、さらには膵臓β細胞でのインスリン合成や膵臓β細胞の増殖を促進する特性がある。したがって、ＧＬＰ−１は、２型糖尿病における高グルカゴン血症等の高血糖の成因に拮抗し、糖尿病の治療に有用であるだけでなく、肥満治療にも有効と考えられている。
しかしながら、ＧＬＰ−１の活性本体はＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅあるいはＧＬＰ−１（７−３７）のポリペプチドであり、ＧＬＰ−１の経口摂取では消化管内で消化酵素により消化・分解され、吸収されない。このため臨床では、点滴による静脈内注射や皮下注射が試みられているのが現状である。しかも、血中や組織に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によってＧＬＰ−１は分解を受け、生体内半減期は１〜２分と非常に短いことが知られており、これらが臨床応用へのネックになっている。
この問題点を解決するために、いくつかの研究開発が行われている。例えば、分解されにくく半減期の長い、８位アミノ酸置換誘導体（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４１：２７１−２７８（１９９８），Ｂｉｏｃｈｅｍ ４０：２８６０−２８６９（２００１））や、皮下からの吸収が遅い徐放型注射剤の開発が試みられている。また、ＧＬＰ−１様アゴニスト活性をもち、血中半減期の長いトカゲ由来の合成Ｅｘｅｎｄｉｎ−４での注射剤の開発（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ２８１：Ｅ１５５−Ｅ１６１（２００１））が行われている。しかし、ＧＬＰ−１が糖尿病治療薬として広く用いられるためには、患者の負担や利便性を考慮すると、注射以外の投与経路が望ましい。
注射剤や経口投与剤に代えて、侵襲性を伴わない投与方法として、肺、口腔、鼻腔、膣、眼、直腸などの粘膜吸収剤が考えられる。しかし、一般にＧＬＰ−１のようなペプチドは高分子であるため、単独での粘膜からの吸収率は低い。このため、一般的には、ペプチドのような高分子は、吸収促進剤とともに処方される。また、薬剤の持続吸収性を確保するには、水溶性あるいは水膨潤性の接着剤が使用され、皮膚層に付着するフィルム、バッカル錠、軟膏、トローチの形態で処方される。これまでに多くの吸収促進剤あるいは接着剤が試験され、粘膜薬物投与を容易にする上で有効であることが見出されている。しかしながら、Ｇｕｔｎｉａｋら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２０：１８７４−１８７９（１９９７））により報告された、４００μｇのＧＬＰ−１を含むバッカル錠でのヒト口腔粘膜からのＧＬＰ−１の吸収は、前記のような従来技術を駆使しても、静脈内注射の７％、皮下注射の４７％のバイオアベイラビリティ（生物学的利用率）であり、その吸収率は十分とはいえない。
尚、ＧＬＰ−１を分解する酵素として知られるジペプチジルペプチダーゼＩＶは、腎臓、肝臓、小腸、唾液腺、各種結合組織など広く組織に分布する他、血液、尿、唾液などの体液や鼻腔粘膜にも存在することが明らかになっており、おそらく他の粘膜組織にも存在することが推測される。
ＧＬＰ−１のインスリン分泌作用の特徴は、血糖値が１１０ｍｇ／ｄｌ以下ではインスリン分泌を刺激せず、それ以上の血糖値になってはじめてインスリン分泌させるという血糖値依存性を表すことである。すなわち、ＧＬＰ−１の投与により、血糖値に応じてインスリン分泌が促進され、血糖値が正常以下になるとインスリン分泌は起こらない。したがってＧＬＰ−１を使用した場合、低血糖の心配がないこと、またインスリンの過剰な分泌がなく膵臓を疲弊させないことが大きな臨床上のメリットである。一方、２型糖尿病の治療において中心的に使用されているスルフォニル尿素剤は、持続的にＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルを閉鎖しインスリン分泌を促進させる。しかし、血糖値とは無関係に膵臓のインスリン分泌細胞に働くため、低血糖、β細胞への過剰な刺激による膵臓の疲弊、長期投与による２次無効が報告されている。したがって、ＧＬＰ−１の薬理学的特性は、従来の糖尿病薬とは異なる有用なものである。
またＧＬＰ−１には、グルカゴン分泌を抑制する特性、食物の胃からの***を遅らせる特性、胃酸分泌を抑制する特性、脳に作用して摂食を抑制する特性、さらには膵臓β細胞でのインスリン合成や膵臓β細胞の増殖を促進する特性がある。したがって、ＧＬＰ−１は、２型糖尿病における高グルカゴン血症等の高血糖の成因に拮抗し、糖尿病の治療に有用であるだけでなく、肥満治療にも有効と考えられている。
しかしながら、ＧＬＰ−１の活性本体はＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅあるいはＧＬＰ−１（７−３７）のポリペプチドであり、ＧＬＰ−１の経口摂取では消化管内で消化酵素により消化・分解され、吸収されない。このため臨床では、点滴による静脈内注射や皮下注射が試みられているのが現状である。しかも、血中や組織に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によってＧＬＰ−１は分解を受け、生体内半減期は１〜２分と非常に短いことが知られており、これらが臨床応用へのネックになっている。
この問題点を解決するために、いくつかの研究開発が行われている。例えば、分解されにくく半減期の長い、８位アミノ酸置換誘導体（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４１：２７１−２７８（１９９８），Ｂｉｏｃｈｅｍ ４０：２８６０−２８６９（２００１））や、皮下からの吸収が遅い徐放型注射剤の開発が試みられている。また、ＧＬＰ−１様アゴニスト活性をもち、血中半減期の長いトカゲ由来の合成Ｅｘｅｎｄｉｎ−４での注射剤の開発（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ２８１：Ｅ１５５−Ｅ１６１（２００１））が行われている。しかし、ＧＬＰ−１が糖尿病治療薬として広く用いられるためには、患者の負担や利便性を考慮すると、注射以外の投与経路が望ましい。
注射剤や経口投与剤に代えて、侵襲性を伴わない投与方法として、肺、口腔、鼻腔、膣、眼、直腸などの粘膜吸収剤が考えられる。しかし、一般にＧＬＰ−１のようなペプチドは高分子であるため、単独での粘膜からの吸収率は低い。このため、一般的には、ペプチドのような高分子は、吸収促進剤とともに処方される。また、薬剤の持続吸収性を確保するには、水溶性あるいは水膨潤性の接着剤が使用され、皮膚層に付着するフィルム、バッカル錠、軟膏、トローチの形態で処方される。これまでに多くの吸収促進剤あるいは接着剤が試験され、粘膜薬物投与を容易にする上で有効であることが見出されている。しかしながら、Ｇｕｔｎｉａｋら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２０：１８７４−１８７９（１９９７））により報告された、４００μｇのＧＬＰ−１を含むバッカル錠でのヒト口腔粘膜からのＧＬＰ−１の吸収は、前記のような従来技術を駆使しても、静脈内注射の７％、皮下注射の４７％のバイオアベイラビリティ（生物学的利用率）であり、その吸収率は十分とはいえない。
尚、ＧＬＰ−１を分解する酵素として知られるジペプチジルペプチダーゼＩＶは、腎臓、肝臓、小腸、唾液腺、各種結合組織など広く組織に分布する他、血液、尿、唾液などの体液や鼻腔粘膜にも存在することが明らかになっており、おそらく他の粘膜組織にも存在することが推測される。
ＧＬＰ−１の粘膜からの吸収は、膜透過性の低さや吸収部位での分解により、注射に比べ非常に非効率的である。例えば、ＧＬＰ−１を経鼻投与することは可能であるが、その吸収率が低いために、十分な薬理効果を得るためには、非常に高用量が必要である。したがって、ペプチドの原体生産コストの面から、天然型ＧＬＰ−１を経鼻剤として医薬品開発することは非現実的である。ＧＬＰ−１を臨床応用するためには、粘膜からの吸収率が注射剤に匹敵するＧＬＰ−１誘導体の開発が必要である。そこで、本発明者らは、粘膜からの吸収性が改善されたＧＬＰ−１新規誘導体を考案し、注射剤に代わる粘膜投与剤を提供すべく、鋭意研究を行った。
その結果、ＧＬＰ−１にプラスの電荷をもつアルギニンまたはリジンを付加すれば粘膜吸収が増大するとの新規な思想に至った。加えて、活性発現に重要なＮ末端側を避け、Ｃ末端側に数個のアルギニンまたは／及びリジンを付加することを考案し、下記ＧＬＰ−１誘導体を得た。また、更に粘膜吸収率を増大させるために、表面電荷をマイナスに調整した電荷調整脂肪乳剤を利用して、粘膜吸収が著しく増大したＧＬＰ−１製剤を創出した。
即ち、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、ＧＬＰ−１（７−３５）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または／及び付加された配列からなり、かつＧＬＰ−１活性を有するペプチドのＣ末端にＷａａ−（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ（ＷａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ＸａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ｎは０〜１４の整数、ＹａａはＡｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＮＨ２またはＨｓｅ）が付加されたペプチドである。このように、Ｃ末端側に数個のアルギニンまたは／及びリジンを付加することにより、粘膜からの吸収性の高い、すなわち粘膜からの生物学的利用率の高い新規ＧＬＰ−１誘導体が提供される。
本発明のＧＬＰ−１誘導体においては、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する耐性を付加するために、８位のアラニンをセリンに置換するのが好ましい。そのようなペプチドは、一般式、［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｗａａ−（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ（式中、ＷａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ＸａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ｎは０〜１４の整数、ＹａａはＡｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＮＨ２またはＨｓｅ）で示される。
また、本発明のＧＬＰ−１誘導体においては、２６位のリジンをグルタミンに、３４位のリジンをアスパラギンに置換することにより、トリプシン耐性を持たせることができる。そのようなペプチドは、一般式、［Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｗａａ−（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ 式中、ＷａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ＸａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ｎは０〜１４の整数、ＹａａはＡｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＮＨ２またはＨｓｅで示される。
これらジペプチジルペプチダーゼＩＶ耐性又はトリプシン耐性のＧＬＰ−１誘導体においても、勿論、ＧＬＰ−１（７−３５）のアミノ酸配列中の、１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換または／及び付加が可能である。
前述の本発明のＧＬＰ−１誘導体においては、好ましくは、ｎは１〜９の整数であり、更に好ましくは、ｎは３〜５の整数である。
本発明のＧＬＰ−１誘導体において、最も好ましいペプチドは、一般式、［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−（Ａｒｇ）ｎ−Ｙａａ 式中、ｎは４〜６の整数、ＹａａはＡｒｇまたはＡｒｇ−ＮＨ２で示される
本発明のＧＬＰ−１誘導体をマウスに経鼻投与後、耐糖能試験を行い、血糖低下作用およびインスリン分泌促進作用によりＧＬＰ−１誘導体の吸収効率を調べた。その結果、高い血糖低下作用およびインスリン分泌促進作用を示し、天然型ＧＬＰ−１の１０分の１用量で同等の効果を示したことから、鼻粘膜からの吸収が天然型ＧＬＰ−１に比べて１０倍増大したと推測される。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、さらにその吸収率を高めるために、特開平８−２７０１８に記載の電荷調整脂肪乳剤を用いて製剤化を行った。即ち、本発明は、表面電荷をマイナスに調整した脂肪乳剤と本発明のＧＬＰ−１誘導体とを含有するＧＬＰ−１製剤をも提供する。
電荷調整脂肪乳剤は表面電荷をマイナスに調整した脂肪乳剤で、ペプチドおよび蛋白質を吸着し、ペプチドおよび蛋白質の対酵素安定性を向上させ、さらには薬理効果の増強と持続時間の延長がもたらされると考えられている。一方、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、プラスの荷電をもつアルギニンまたはリジンが数個付加されているので、前記電荷調整脂肪乳剤に吸着されやすくなっている。したがって、この電荷調整脂肪乳剤を用いて製剤化すれば、本発明のＧＬＰ−１誘導体の粘膜吸収はより増大することが推測される。実際に、グルコース負荷マウスに対し、前記電荷調整脂肪乳剤を併用して本発明のＧＬＰ−１誘導体を経鼻投与し、血糖低下作用により吸収効率を調べたところ、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、天然型ＧＬＰ−１の３０分の１用量で同等の効果を示した。即ち、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、電荷調整脂肪乳剤を併用することにより、天然型ＧＬＰ−１に比べて鼻粘膜からの吸収が３０倍増大しているものと考えられる。
このように、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、粘膜吸収性が高く、特に鼻粘膜から吸収させる製剤とするのに最適なペプチドである。本発明のＧＬＰ−１誘導体は、８位をセリンに置換することにより、血中や組織に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶによる分解を受けにくくなり、生体内半減期の長いＧＬＰ−１誘導体とすることができる。更に、前述のように、トリプシン耐性を付加することで、組織中に存在するトリプシンによる分解からも保護され、生物学的利用率を更に高めることができる。
また、本発明のＧＬＰ−１誘導体と電荷調製脂肪乳剤とを組み合わせることにより、更に粘膜吸収性が向上し、皮下注射剤並みの低用量で効果を発現させることができる。すなわち、本発明は、従来の注射剤に代わる、投与が容易で苦痛を伴わない粘膜吸収型ＧＬＰ−１製剤の臨床応用の可能性を格段に高めるものであり、糖尿病患者および肥満患者のＱＯＬの改善に役立つものと考えられる。
その結果、ＧＬＰ−１にプラスの電荷をもつアルギニンまたはリジンを付加すれば粘膜吸収が増大するとの新規な思想に至った。加えて、活性発現に重要なＮ末端側を避け、Ｃ末端側に数個のアルギニンまたは／及びリジンを付加することを考案し、下記ＧＬＰ−１誘導体を得た。また、更に粘膜吸収率を増大させるために、表面電荷をマイナスに調整した電荷調整脂肪乳剤を利用して、粘膜吸収が著しく増大したＧＬＰ−１製剤を創出した。
即ち、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、ＧＬＰ−１（７−３５）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または／及び付加された配列からなり、かつＧＬＰ−１活性を有するペプチドのＣ末端にＷａａ−（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ（ＷａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ＸａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ｎは０〜１４の整数、ＹａａはＡｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＮＨ２またはＨｓｅ）が付加されたペプチドである。このように、Ｃ末端側に数個のアルギニンまたは／及びリジンを付加することにより、粘膜からの吸収性の高い、すなわち粘膜からの生物学的利用率の高い新規ＧＬＰ−１誘導体が提供される。
本発明のＧＬＰ−１誘導体においては、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する耐性を付加するために、８位のアラニンをセリンに置換するのが好ましい。そのようなペプチドは、一般式、［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｗａａ−（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ（式中、ＷａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ＸａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ｎは０〜１４の整数、ＹａａはＡｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＮＨ２またはＨｓｅ）で示される。
また、本発明のＧＬＰ−１誘導体においては、２６位のリジンをグルタミンに、３４位のリジンをアスパラギンに置換することにより、トリプシン耐性を持たせることができる。そのようなペプチドは、一般式、［Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｗａａ−（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ 式中、ＷａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ＸａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ｎは０〜１４の整数、ＹａａはＡｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＮＨ２またはＨｓｅで示される。
これらジペプチジルペプチダーゼＩＶ耐性又はトリプシン耐性のＧＬＰ−１誘導体においても、勿論、ＧＬＰ−１（７−３５）のアミノ酸配列中の、１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換または／及び付加が可能である。
前述の本発明のＧＬＰ−１誘導体においては、好ましくは、ｎは１〜９の整数であり、更に好ましくは、ｎは３〜５の整数である。
本発明のＧＬＰ−１誘導体において、最も好ましいペプチドは、一般式、［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−（Ａｒｇ）ｎ−Ｙａａ 式中、ｎは４〜６の整数、ＹａａはＡｒｇまたはＡｒｇ−ＮＨ２で示される
本発明のＧＬＰ−１誘導体をマウスに経鼻投与後、耐糖能試験を行い、血糖低下作用およびインスリン分泌促進作用によりＧＬＰ−１誘導体の吸収効率を調べた。その結果、高い血糖低下作用およびインスリン分泌促進作用を示し、天然型ＧＬＰ−１の１０分の１用量で同等の効果を示したことから、鼻粘膜からの吸収が天然型ＧＬＰ−１に比べて１０倍増大したと推測される。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、さらにその吸収率を高めるために、特開平８−２７０１８に記載の電荷調整脂肪乳剤を用いて製剤化を行った。即ち、本発明は、表面電荷をマイナスに調整した脂肪乳剤と本発明のＧＬＰ−１誘導体とを含有するＧＬＰ−１製剤をも提供する。
電荷調整脂肪乳剤は表面電荷をマイナスに調整した脂肪乳剤で、ペプチドおよび蛋白質を吸着し、ペプチドおよび蛋白質の対酵素安定性を向上させ、さらには薬理効果の増強と持続時間の延長がもたらされると考えられている。一方、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、プラスの荷電をもつアルギニンまたはリジンが数個付加されているので、前記電荷調整脂肪乳剤に吸着されやすくなっている。したがって、この電荷調整脂肪乳剤を用いて製剤化すれば、本発明のＧＬＰ−１誘導体の粘膜吸収はより増大することが推測される。実際に、グルコース負荷マウスに対し、前記電荷調整脂肪乳剤を併用して本発明のＧＬＰ−１誘導体を経鼻投与し、血糖低下作用により吸収効率を調べたところ、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、天然型ＧＬＰ−１の３０分の１用量で同等の効果を示した。即ち、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、電荷調整脂肪乳剤を併用することにより、天然型ＧＬＰ−１に比べて鼻粘膜からの吸収が３０倍増大しているものと考えられる。
このように、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、粘膜吸収性が高く、特に鼻粘膜から吸収させる製剤とするのに最適なペプチドである。本発明のＧＬＰ−１誘導体は、８位をセリンに置換することにより、血中や組織に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶによる分解を受けにくくなり、生体内半減期の長いＧＬＰ−１誘導体とすることができる。更に、前述のように、トリプシン耐性を付加することで、組織中に存在するトリプシンによる分解からも保護され、生物学的利用率を更に高めることができる。
また、本発明のＧＬＰ−１誘導体と電荷調製脂肪乳剤とを組み合わせることにより、更に粘膜吸収性が向上し、皮下注射剤並みの低用量で効果を発現させることができる。すなわち、本発明は、従来の注射剤に代わる、投与が容易で苦痛を伴わない粘膜吸収型ＧＬＰ−１製剤の臨床応用の可能性を格段に高めるものであり、糖尿病患者および肥満患者のＱＯＬの改善に役立つものと考えられる。
以下に、本発明を更に詳細に説明する。ＧＬＰ−１（７−３５）は、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１）で示される配列を持つペプチドである。［Ｓｅｒ８］は前記配列の２番目、即ち８位のＡｌａがＳｅｒに変換されていることを示し、８Ｓと同義である。さらに、−ＮＨ２はアミド化されていることを示し、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、Ｃ末端がアミド化されている場合とアミド化されていない場合のいずれか一方の形態をとることが可能である。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、化学合成あるいは遺伝子組換え技術により製造することができる。
ポリペプチドの化学合成の原理は、本発明の技術分野において周知である。その原理は、例えば、以下の様な一般のテキストを参考にできる；Ｄｕｇａｓ Ｈ．及びＰｅｎｎｅｙ Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５４−９２頁、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄｓ ＪＭ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９（１９６２）及びＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２４−６６項，Ｆｒｅｅｍａｎ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）。例えば、４３０Ａペプチド合成機（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ ９４４０４）及びＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給された合成サイクルを用いて、固相方法により本発明のペプチドを合成できる。Ｂｏｃアミノ酸及びその他の試薬は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及び他の薬品供給業者から購入可能である。
本発明のペプチドを遺伝子組換え技術により生産する方法について、以下に詳細に説明する。
ＧＬＰ−１のＤＮＡは、全合成、又はより大きな天然のグルカゴンがコードしているＤＮＡの修飾により得られる。プレプログルカゴンをコードしているＤＮＡ配列はＬｕｎｄら［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：３４５−３４９（１９８２）］において示されており、この天然の配列を変えることにより、本発明化合物の生産に使用することができる。合成遺伝子の構築方法は本発明の技術分野では周知であり、例えばＢｒｏｗｎらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ第６８巻、１０９−１５１頁を参照できる。本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列をそのアミノ酸配列に基づいてデザインし、Ｍｏｄｅｌ ３８０Ａ又は３８０ＢＤＮＡ合成機（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ ９４４０４）などの通常のＤＮＡ合成機を用いてその配列自身をもつＤＮＡを製造できる。
また、本発明のＧＬＰ−１誘導体の産生に用いるＤＮＡには、発現量を高め産物を宿主内に安定的に蓄積させる工夫、生産後の精製を容易にする工夫、あるいは融合タンパクとして生産させ容易にＧＬＰ−１誘導体を切り出す工夫等を施すことができる。例えば、本発明のＧＬＰ−１誘導体遺伝子の複数個をタンデムに繋ぎ、発現量を高めるといった手法、または、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、プロテインＡ、ＴｒｐＥなどのタンパクの遺伝子に繋ぎ、融合タンパクとして産生させるといった手法が例示される。これらの場合、例えば、産生後ＧＬＰ−１誘導体を単体として得るには、各遺伝子との間にアミノ酸のメチオニンに対応する遺伝子を入れておき、臭化シアン処理することができる。この場合に、Ｃ末端はＨｓｅ（ホモセリン）になる。また、本発明のＧＬＰ−１誘導体の中には、Ｃ末端のみにアルギニンをもつものがあり、アルギニルエンドペプチダーゼによる酵素処理により、ＧＬＰ−１誘導体の単体を得ることができる。
ＧＬＰ−１誘導体ペプチドの発現を効果的に行うためには、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な組換えＤＮＡ発現ベクターに所定の配列をもつ合成ＤＮＡを挿入する。一般にはＭａｎｉａｔｉｓら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ第１−３巻を参照できる。その際、合成遺伝子の効率的な転写を達成するために、それをプローモーター−オペレーター領域と機能的に結合させる。合成遺伝子プローモーター−オペレーター領域を合成遺伝子のＡＴＧ開始コドンに関して同じ配列の配向性にて配置する。原核細胞及び真核細胞の形質転換に使用できる種々の発現ベクターは周知であり、Ｔｈｅ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ及びＴｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅが参照できる。
ＧＬＰ−１誘導体ペプチドのための発現ベクターを構築した後、そのベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換させる。宿主細胞には真核性細胞又は原核性細胞のいずれかを使用できる。細胞を形質転換するための技術は本分野において周知であり、上記のＭａｎｉａｔｉｓらの様な一般の引用文献に見出すことができる。原核性宿主細胞は、一般にはより高い割合でタンパク質を生産し、より培養し易い。高レベルの細菌発現系において発現されるタンパク質は特徴的に凝集して、高レベルの過剰に発現されたタンパク質を含有する粒子又は封入体となる。この様な典型的に凝集しているタンパク質を本分野にて周知の技術を用いて可溶化し、変性し、さらに再度折り畳む。これについては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｋｒｅｕｇｅｒら（１９９０）１３６−１４２頁、Ｇｉｅｒａｓｃｈ及びＫｉｎｇ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎが参照できる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、製剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または吸収促進剤と組み合わせて製剤化し、医薬組成物とすることもできる。吸収促進剤には、例えば、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチル酸塩）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、非界面活性剤（例えば、不飽和環状尿素）、および胆汁酸塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム）が上げられる。この様な医薬組成物は、製薬分野における周知の方法で製造することができる。また、これらの医薬組成物は、鼻腔等の粘膜投与に適しており、個々に又は他の治療薬と組み合わせて投与することができる。尚、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、注射剤、経口剤等、粘膜投与製剤以外の製剤にすることもできる。
本発明組成物は、本技術分野における周知の方法を用いて、患者に投与後迅速かつ持続的又は遅延した活性成分の放出を提供する様に製剤化できる。例えば、適切なマクロ分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロロリドン、酢酸エチレンビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及び硫酸プロタミン）、あるいはポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ（乳酸）又は酢酸エチルビニルコポリマーなどのポリマー物質などを用いて、本発明ペプチドを複合体とするか又は本発明ペプチドを吸着させることにより、放出がコントロールされた製剤を製造することができる。また、これらのポリマー粒子にペプチドを混合する代わりに、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって製造されたマイクロカプセル、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンからなるマイクロカプセル、コロイド状薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン マイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）、もしくは、マイクロエマルジョン中に、本発明ペプチドを封入することが可能である。
本発明においては、特開平８−２７０１８に従って調製される電荷調整脂肪乳剤に本発明ペプチドを吸着させることにより、本発明ペプチドの粘膜からの吸収が更に促進された製剤を製造することができる。電荷調整剤としては、各種の酸性リン脂質およびその塩、各種の脂肪酸類およびその塩、胆汁酸類およびその塩等から選択された少なくとも１種類の物質が使用される。酸性リン脂質およびその塩は特に限定されないが、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびその塩を例示することができる。脂肪酸類およびその塩も特に限定されないが、炭素数６以上の脂肪酸およびその塩が望ましい。胆汁酸類およびその塩も特に限定されないが、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸およびその塩を例示することができる。電荷調整剤の選択、電荷調整脂肪乳剤濃度の設定により、投与部位に適した本発明品医薬組成物を調製することができる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、ＧＬＰ−１製剤が有効である各種疾患に有効である。即ち、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、例えば、インスリン非依存性慢性糖尿病の処置、インスリン依存性慢性糖尿病の処置、肥満の処置、または／及び、食欲抑制等のために、使用することができる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体の投与量は、各種疾患の個々の患者に対して当業者によって決定されることが望ましい。しかし、一般的にはその投与量は、１回体重ｋｇあたり１μｇから１ｍｇまでの範囲内、好ましくは１回体重ｋｇあたり１０μｇから１００μｇの範囲内と考えられる。食時直前に使用し、１日１回から３回以上投与することも可能である。
以下に実施例、試験例でもって、更に本発明の説明を行う。尚、これらの実施例は本発明の技術的範囲を限定するものではない。
製造例 ＧＬＰ−１誘導体の合成
ＧＬＰ−１誘導体の合成は、Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａペプチド合成機（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）による固相合成によって行い、ＨＰＬＣにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。純度は大部分のものについて９５％以上のものを使用し、インビトロおよびインビボでの試験を行った。
以下に合成した化合物を示す。ＧＬＰ−１（７−３６）の配列は、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号２）である（すなわち、ＧＬＰ−１（７−３６）は、ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇと同じである）。例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）＋Ａｒｇ−ＮＨ２とは、天然型ＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端にアミド化Ａｒｇを１残基付加したものである。また、［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）は、２番目（８位に相当）のＡｌａをＳｅｒに変換し、最後（３６位に相当）のＡｒｇを削除したものである。
比較製造例１． ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２・・・天然型ＧＬＰ−１
比較製造例２． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号３）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１と略す
製造例１． ＧＬＰ−１（７−３６）＋Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号４）・・・ＧＬＰ−１＋１Ｒと略す
製造例２． ＧＬＰ−１（７−３６）＋Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号５）・・・ＧＬＰ−１＋２Ｒと略す
製造例３． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号６）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋２Ｒと略す
製造例４． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号７）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋３Ｒと略す
製造例５． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号８）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋４Ｒと略す
製造例６． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号９）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒと略す
製造例７． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２
（配列番号１０）・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋６Ｒと略す
製造例８． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２
（配列番号１１）・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋８Ｒと略す
製造例９． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１２）
・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋１ＫＲと略す
製造例１０． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１３）
・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋２ＫＲと略す
製造例１１． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１４）
・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋３ＫＲと略す
製造例１２． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１５）
・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋５ＫＲと略す
製造例１３． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２
（配列番号１６）・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋７ＫＲと略す
製造例１４． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１７）・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋１０ＫＲと略す
製造例１５． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１８）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋２Ｋと略す
参考製造例１． ［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ（配列番号１９）
・・・８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１と略す
参考製造例２． ［Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２０）
・・・２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１と略す
また、これら製造例以外にも、例１６．［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２１）（８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１＋４Ｒと略す）、例１７．［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２２）（８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１＋６Ｒと略す）、例１８．［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２３）（８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋５ＫＲと略す）等のＧＬＰ−１誘導体が好ましいものと考えられる。
さらに、以上の製造例１〜１５、例１６〜１８については、Ｃ末端はアミド化（−ＮＨ２）されているが、非アミド化（−ＯＨ）体とすることもできる。例えば、製造例５の非アミド化（−ＯＨ）体は、例１９．［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号２４）（８Ｓ−ＧＬＰ−１＋４Ｒと略す）となる。また、Ｃ末端はＨｓｅとすることもできる。そのようなペプチドとしては、例２０．［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｓｅ（配列番号２５）（８Ｓ−ＧＬＰ−１＋３ＲＨｓｅと略す）を例示することができる。
試験例１ ＧＬＰ−１誘導体のサイクリックＡＭＰ産生活性
ヒトＧＬＰ−１受容体の公表されたＤＮＡ配列［Ｇｒａｚｉａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ１９６：１４１−１４６（１９９３）］に基づき発現ベクターを構築した。チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ−Ｋ１細胞を該ベクターで形質転換し、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する組換えＣＨＯ細胞を得た。
ヒトＧＬＰ−１受容体発現細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌで２４ウエルプレートに植え込んだ。３日後アッセイに使用し、緩衝液（ＰＢＳ、５．６ｍＭグルコース、１ｍＭイソブチルメチルキサンチン、２０μＭ Ｒｏ２０−１７２４、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中でＧＬＰ−１誘導体と３７℃で３０分間インキュベーションした。５Ｎ塩酸を１０μｌ加えてインキュベーションを停止した。
各種ＧＬＰ−１誘導体とＧＬＰ−１受容体との反応により、細胞内に形成されるサイクリックＡＭＰ生成物は、ｃＡＭＰ−ＳｃｒｅｅｎＴＭ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるエンザイムイムノアッセイにより測定した。表１に各種ＧＬＰ−１誘導体のサイクリックＡＭＰ産生活性を、天然型ＧＬＰ−１の活性を１００％としたときの相対的数値で示した。
この結果、どのＧＬＰ−１誘導体もｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイクリックＡＭＰ産生活性を持っていた。しかしながら、アルギニンまたはリジンが多く付加されるにつれて活性の低下傾向が見られた。特にリジンにおいてその傾向が認められる。しかし、粘膜吸収時には、付加されたアルギニンまたはリジンがペプチダーゼにより切除される可能性が高いことから、必ずしも、このｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性がｉｎ ｖｉｖｏでの活性を反映するとは考えられず、このことが後記ｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果となっていると考えられる。
試験例２ ＧＬＰ−１誘導体の粘膜からの吸収に伴う、血糖低下作用およびインスリ ン分泌促進作用
ＧＬＰ−１誘導体の粘膜からの吸収増大を、ｉｎ ｖｉｖｏでの血糖低下作用およびインスリン分泌促進作用により評価した。すなわち、マウスにＧＬＰ−１誘導体を経鼻投与し、グルコース負荷後の血糖値の変動を調べる経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）で評価した。
ＧＬＰ−１誘導体は蒸留水で１ｍＭに調製し、−８０℃にストックした。試験時に生理食塩水で所定の濃度に希釈して使用した。
マウスはエーテルを用いて軽麻酔した。マイクロピペットを用いて２０μｌのＧＬＰ−１誘導体溶液を、チップの先から直接マウスの鼻にゆっくりと放出した。このときＧＬＰ−１誘導体溶液は、マウスの呼吸により鼻から吸引された。ＧＬＰ−１誘導体を経鼻投与して５分後、５％グルコース溶液を１０ｍｌ／ｋｇの割合でゾンデにより経口投与した。
血糖値は、試験直前とグルコース投与５，１０，２０分後に、尾先端部を切除した傷口から血液数μｌを揉み出し、小型血糖値測定機（グルテストエース、（株）三和化学研究所）を用いて測定した。ＧＬＰ−１誘導体投与前の血糖値からの上昇分の曲線下面積（ＡＵＣ ０−２０分）を個々のマウスについて算出した。
また、血中インスリン値は、グルコース投与５分後にヘパリン処理したガラスキャピラリーを用いて眼窩静脈叢より７５μｌ採血し、遠心分離により得た血漿を用いてＥＩＡ法（レビスマウスインスリンキット、（株）シバヤギ）により測定した。
各ＧＬＰ−１誘導体投与群の血糖値と血中インスリン値を、平均値と標準誤差で表２に示した。
この結果、８Ｓ−ＧＬＰ−１＋４Ｒおよび８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋５ＫＲのＧＬＰ−１誘導体において、最も強い血糖低下作用がみられた。また、８Ｓ−ＧＬＰ−１＋４Ｒ以上にアルギニンを付加した誘導体、あるいは８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋５ＫＲ以上にリジンを付加した誘導体において、最も高いインスリン分泌促進作用がみられた。このとき、天然型ＧＬＰ−１に比べて１０分の１量で同等の効果を示していることから、これらのＧＬＰ−１誘導体は、天然型ＧＬＰ−１に比べて１０倍吸収が増大したと考えられた。
試験例３ 電荷調整脂肪乳剤のＧＬＰ−１誘導体の粘膜吸収に対する作用
試験例２と同様の方法で経口耐糖能試験を行い、電荷調整脂肪乳剤の併用によるＧＬＰ−１誘導体の血糖値低下作用およびインスリン分泌促進作用を調べた。使用した電荷調整脂肪乳剤は特開平８−２７０１８にしたがって調製し、ホスファチジルグリセロール（ナトリウム塩）２％（ｗ／ｗ）、中性油８％（ｗ／ｗ）、水９０％（ｗ／ｗ）を用いて、最終濃度８％電荷調整脂肪乳剤を得た。
８％電荷調整脂肪乳剤溶液５０μｌ、１ｍＭ ８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒ溶液３．５６μｌ、蒸留水１４６．４μｌを混和して、最終濃度０．０１７８ｍＭ ８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒを含む２％電荷調整脂肪乳剤溶液を調製した。比較対照には、２％電荷調整脂肪乳剤溶液を含まない０．５３４ｍＭ天然型ＧＬＰ−１溶液（８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒに比べて３０倍量）、２％電荷調整脂肪乳剤溶液を含まない０．０１７８ｍＭ ８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒ溶液、および生理食塩水を用いた。
マウスはエーテルを用いて軽麻酔した。マイクロピペットを用いて２０μｌのＧＬＰ−１誘導体溶液を、チップの先から直接マウスの鼻にゆっくりと放出した。ＧＬＰ−１誘導体を経鼻投与して５分後、５％グルコース溶液を１０ｍｌ／ｋｇの割合でゾンデにより経口投与した。
血糖値は、試験直前とグルコース投与１０，２０，３０分後に、尾先端部を切除した傷口から血液数μｌを揉み出し、小型血糖値測定機（グルテストエース、（株）三和化学研究所）を用いて測定した。ＧＬＰ−１誘導体投与前の血糖値からの上昇分の曲線下面積（ＡＵＣ ０−３０分）を個々のマウスについて算出した。
また、血中インスリン値は、グルコース投与１０分後にヘパリン処理したガラスキャピラリーを用いて眼窩静脈叢より７５μｌ採血し、遠心分離により得た血漿を用いてＥＩＡ法（レビスマウスインスリンキット、（株）シバヤギ）により測定した。
各ＧＬＰ−１誘導体投与群の血糖値と血中インスリン値を、平均値と標準誤差で表３に示した。
この結果、電荷調整脂肪乳剤を併用した８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒは、電荷調整脂肪乳剤を併用しない天然型ＧＬＰ−１の３０分の１量で、天然型ＧＬＰ−１と同等の血糖低下作用を示した。即ち、電荷調整脂肪乳剤により８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒの吸収が増大し、より低濃度で効果が発揮された。
試験例４ ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１の活性評価
試験例１の方法に従がって、ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１のインビトロにおけるサイクリックＡＭＰ産生活性を測定した。アミノ酸置換後も活性を維持していた（表４）。
また、マウスランゲルハンス島を用いて、１６．７ｍＭグルコース存在下（高血糖条件）における３０分間のインスリン分泌活性を調べたところ、ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１は天然型ＧＬＰ−１に比べて活性が強い傾向を示した（表５）。
更に、マウスにおける血糖低下作用を、マウスにＧＬＰ−１誘導体を皮下投与した５分後、尾静脈からのグルコース０．５ｇ／ｋｇ負荷を行うことにより調べた。ＧＬＰ−Ｌ誘導体８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１は濃度依存的な血糖低下がみられ、その作用は天然型ＧＬＰ−１より強かった（表６）。
本試験の結果は、参考製造例１のＧＬＰ−１誘導体が、ＧＬＰ−１活性を保持していることを示すものである。表１の試験結果を合わせて考えると、このＧＬＰ−１誘導体のＣ末端側に数個のアルギニンまたは／及びリジンを付加しても、やはりＧＬＰ−１活性を保持していると結論付けることができる。
試験例５ ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ−ＧＬＰ−１のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）に対 する耐性の評価
５００ｐＭ ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ−ＧＬＰ−１を４０μＵ／μｌジペプチジルペプチダーゼＩＶと混和し、３７℃にて６０分間反応させた。その後、２倍量のエタノールで抽出し、遠心エバポレーターにて乾固した。得られた乾固物を１％ＢＳＡ含有蒸留水に溶解し、試験例１に従ってサイクリックＡＭＰ産生活性を測定し、残存活性（％）を算出した。
この結果、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる処理なしと処理ありで活性に違いがなく、本ＧＬＰ−１誘導体がジペプチジルペプチダーゼＩＶに対して耐性であることがわかった。したがって８位をセリンに置換することにより、ＧＬＰ−１誘導体はジペプチジルペプチダーゼＩＶ耐性を獲得できる（表７）。
試験例６ ＧＬＰ−１誘導体２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１のトリプシンに対する耐性の評価
参考製造例２のＧＬＰ−１誘導体２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１を、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムｐＨ７．８に５００μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。この溶液１００μｌに、５００μｇ／ｍｌトリプシン溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ５１１３）を５μｌ加えて、３７℃、１時間反応させた。反応停止は７１．５％エタノールを１２００μｌ（ｆｉｎａｌ ６５％）を加えて行い、４℃で５分間の１５，０００ｒｐｍ遠心により上清を回収し、エバポレーションした。乾固物を蒸留水に溶解し、試験例１の方法でｃＡＭＰ活性を測定し、残存活性（％）を求めた。
この結果、トリプシン処理なしと処理ありで活性に違いがなく、本ＧＬＰ−１誘導体がトリプシンに耐性であることがわかった（表８）。
この結果は、ＧＬＰ−１誘導体の２６位をグルタミンに、３４位をアスパラギンに置換することにより、ＧＬＰ−１誘導体がトリプシン耐性を獲得することを示す。これにより、このＧＬＰ−１誘導体のＣ末端側に数個のアルギニンまたは／及びリジンを付加したＧＬＰ−１誘導体も、やはりトリプシン耐性を有すると結論付けることができる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、化学合成あるいは遺伝子組換え技術により製造することができる。
ポリペプチドの化学合成の原理は、本発明の技術分野において周知である。その原理は、例えば、以下の様な一般のテキストを参考にできる；Ｄｕｇａｓ Ｈ．及びＰｅｎｎｅｙ Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５４−９２頁、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄｓ ＪＭ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９（１９６２）及びＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２４−６６項，Ｆｒｅｅｍａｎ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）。例えば、４３０Ａペプチド合成機（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ ９４４０４）及びＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給された合成サイクルを用いて、固相方法により本発明のペプチドを合成できる。Ｂｏｃアミノ酸及びその他の試薬は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及び他の薬品供給業者から購入可能である。
本発明のペプチドを遺伝子組換え技術により生産する方法について、以下に詳細に説明する。
ＧＬＰ−１のＤＮＡは、全合成、又はより大きな天然のグルカゴンがコードしているＤＮＡの修飾により得られる。プレプログルカゴンをコードしているＤＮＡ配列はＬｕｎｄら［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：３４５−３４９（１９８２）］において示されており、この天然の配列を変えることにより、本発明化合物の生産に使用することができる。合成遺伝子の構築方法は本発明の技術分野では周知であり、例えばＢｒｏｗｎらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ第６８巻、１０９−１５１頁を参照できる。本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列をそのアミノ酸配列に基づいてデザインし、Ｍｏｄｅｌ ３８０Ａ又は３８０ＢＤＮＡ合成機（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ ９４４０４）などの通常のＤＮＡ合成機を用いてその配列自身をもつＤＮＡを製造できる。
また、本発明のＧＬＰ−１誘導体の産生に用いるＤＮＡには、発現量を高め産物を宿主内に安定的に蓄積させる工夫、生産後の精製を容易にする工夫、あるいは融合タンパクとして生産させ容易にＧＬＰ−１誘導体を切り出す工夫等を施すことができる。例えば、本発明のＧＬＰ−１誘導体遺伝子の複数個をタンデムに繋ぎ、発現量を高めるといった手法、または、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、プロテインＡ、ＴｒｐＥなどのタンパクの遺伝子に繋ぎ、融合タンパクとして産生させるといった手法が例示される。これらの場合、例えば、産生後ＧＬＰ−１誘導体を単体として得るには、各遺伝子との間にアミノ酸のメチオニンに対応する遺伝子を入れておき、臭化シアン処理することができる。この場合に、Ｃ末端はＨｓｅ（ホモセリン）になる。また、本発明のＧＬＰ−１誘導体の中には、Ｃ末端のみにアルギニンをもつものがあり、アルギニルエンドペプチダーゼによる酵素処理により、ＧＬＰ−１誘導体の単体を得ることができる。
ＧＬＰ−１誘導体ペプチドの発現を効果的に行うためには、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な組換えＤＮＡ発現ベクターに所定の配列をもつ合成ＤＮＡを挿入する。一般にはＭａｎｉａｔｉｓら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ第１−３巻を参照できる。その際、合成遺伝子の効率的な転写を達成するために、それをプローモーター−オペレーター領域と機能的に結合させる。合成遺伝子プローモーター−オペレーター領域を合成遺伝子のＡＴＧ開始コドンに関して同じ配列の配向性にて配置する。原核細胞及び真核細胞の形質転換に使用できる種々の発現ベクターは周知であり、Ｔｈｅ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ及びＴｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅが参照できる。
ＧＬＰ−１誘導体ペプチドのための発現ベクターを構築した後、そのベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換させる。宿主細胞には真核性細胞又は原核性細胞のいずれかを使用できる。細胞を形質転換するための技術は本分野において周知であり、上記のＭａｎｉａｔｉｓらの様な一般の引用文献に見出すことができる。原核性宿主細胞は、一般にはより高い割合でタンパク質を生産し、より培養し易い。高レベルの細菌発現系において発現されるタンパク質は特徴的に凝集して、高レベルの過剰に発現されたタンパク質を含有する粒子又は封入体となる。この様な典型的に凝集しているタンパク質を本分野にて周知の技術を用いて可溶化し、変性し、さらに再度折り畳む。これについては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｋｒｅｕｇｅｒら（１９９０）１３６−１４２頁、Ｇｉｅｒａｓｃｈ及びＫｉｎｇ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎが参照できる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、製剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または吸収促進剤と組み合わせて製剤化し、医薬組成物とすることもできる。吸収促進剤には、例えば、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチル酸塩）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、非界面活性剤（例えば、不飽和環状尿素）、および胆汁酸塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム）が上げられる。この様な医薬組成物は、製薬分野における周知の方法で製造することができる。また、これらの医薬組成物は、鼻腔等の粘膜投与に適しており、個々に又は他の治療薬と組み合わせて投与することができる。尚、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、注射剤、経口剤等、粘膜投与製剤以外の製剤にすることもできる。
本発明組成物は、本技術分野における周知の方法を用いて、患者に投与後迅速かつ持続的又は遅延した活性成分の放出を提供する様に製剤化できる。例えば、適切なマクロ分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロロリドン、酢酸エチレンビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及び硫酸プロタミン）、あるいはポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ（乳酸）又は酢酸エチルビニルコポリマーなどのポリマー物質などを用いて、本発明ペプチドを複合体とするか又は本発明ペプチドを吸着させることにより、放出がコントロールされた製剤を製造することができる。また、これらのポリマー粒子にペプチドを混合する代わりに、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって製造されたマイクロカプセル、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンからなるマイクロカプセル、コロイド状薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン マイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）、もしくは、マイクロエマルジョン中に、本発明ペプチドを封入することが可能である。
本発明においては、特開平８−２７０１８に従って調製される電荷調整脂肪乳剤に本発明ペプチドを吸着させることにより、本発明ペプチドの粘膜からの吸収が更に促進された製剤を製造することができる。電荷調整剤としては、各種の酸性リン脂質およびその塩、各種の脂肪酸類およびその塩、胆汁酸類およびその塩等から選択された少なくとも１種類の物質が使用される。酸性リン脂質およびその塩は特に限定されないが、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびその塩を例示することができる。脂肪酸類およびその塩も特に限定されないが、炭素数６以上の脂肪酸およびその塩が望ましい。胆汁酸類およびその塩も特に限定されないが、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸およびその塩を例示することができる。電荷調整剤の選択、電荷調整脂肪乳剤濃度の設定により、投与部位に適した本発明品医薬組成物を調製することができる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体は、ＧＬＰ−１製剤が有効である各種疾患に有効である。即ち、本発明のＧＬＰ−１誘導体は、例えば、インスリン非依存性慢性糖尿病の処置、インスリン依存性慢性糖尿病の処置、肥満の処置、または／及び、食欲抑制等のために、使用することができる。
本発明のＧＬＰ−１誘導体の投与量は、各種疾患の個々の患者に対して当業者によって決定されることが望ましい。しかし、一般的にはその投与量は、１回体重ｋｇあたり１μｇから１ｍｇまでの範囲内、好ましくは１回体重ｋｇあたり１０μｇから１００μｇの範囲内と考えられる。食時直前に使用し、１日１回から３回以上投与することも可能である。
以下に実施例、試験例でもって、更に本発明の説明を行う。尚、これらの実施例は本発明の技術的範囲を限定するものではない。
製造例 ＧＬＰ−１誘導体の合成
ＧＬＰ−１誘導体の合成は、Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａペプチド合成機（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）による固相合成によって行い、ＨＰＬＣにより精製後、マススペクトルにより合成品を確認した。純度は大部分のものについて９５％以上のものを使用し、インビトロおよびインビボでの試験を行った。
以下に合成した化合物を示す。ＧＬＰ−１（７−３６）の配列は、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号２）である（すなわち、ＧＬＰ−１（７−３６）は、ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇと同じである）。例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）＋Ａｒｇ−ＮＨ２とは、天然型ＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端にアミド化Ａｒｇを１残基付加したものである。また、［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）は、２番目（８位に相当）のＡｌａをＳｅｒに変換し、最後（３６位に相当）のＡｒｇを削除したものである。
比較製造例１． ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２・・・天然型ＧＬＰ−１
比較製造例２． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号３）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１と略す
製造例１． ＧＬＰ−１（７−３６）＋Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号４）・・・ＧＬＰ−１＋１Ｒと略す
製造例２． ＧＬＰ−１（７−３６）＋Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号５）・・・ＧＬＰ−１＋２Ｒと略す
製造例３． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号６）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋２Ｒと略す
製造例４． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号７）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋３Ｒと略す
製造例５． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号８）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋４Ｒと略す
製造例６． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号９）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒと略す
製造例７． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２
（配列番号１０）・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋６Ｒと略す
製造例８． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２
（配列番号１１）・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋８Ｒと略す
製造例９． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１２）
・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋１ＫＲと略す
製造例１０． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１３）
・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋２ＫＲと略す
製造例１１． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１４）
・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋３ＫＲと略す
製造例１２． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１５）
・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋５ＫＲと略す
製造例１３． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２
（配列番号１６）・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋７ＫＲと略す
製造例１４． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号１７）・・・８Ｓ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋１０ＫＲと略す
製造例１５． ［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１８）
・・・８Ｓ−ＧＬＰ−１＋２Ｋと略す
参考製造例１． ［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ（配列番号１９）
・・・８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１と略す
参考製造例２． ［Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２０）
・・・２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１と略す
また、これら製造例以外にも、例１６．［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２１）（８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１＋４Ｒと略す）、例１７．［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２２）（８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１＋６Ｒと略す）、例１８．［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号２３）（８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ，ｄｅｓ３６Ｒ−ＧＬＰ−１＋５ＫＲと略す）等のＧＬＰ−１誘導体が好ましいものと考えられる。
さらに、以上の製造例１〜１５、例１６〜１８については、Ｃ末端はアミド化（−ＮＨ２）されているが、非アミド化（−ＯＨ）体とすることもできる。例えば、製造例５の非アミド化（−ＯＨ）体は、例１９．［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号２４）（８Ｓ−ＧＬＰ−１＋４Ｒと略す）となる。また、Ｃ末端はＨｓｅとすることもできる。そのようなペプチドとしては、例２０．［Ｓｅｒ８］−ＧＬＰ−１（７−３５）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｓｅ（配列番号２５）（８Ｓ−ＧＬＰ−１＋３ＲＨｓｅと略す）を例示することができる。
試験例１ ＧＬＰ−１誘導体のサイクリックＡＭＰ産生活性
ヒトＧＬＰ−１受容体の公表されたＤＮＡ配列［Ｇｒａｚｉａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ１９６：１４１−１４６（１９９３）］に基づき発現ベクターを構築した。チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ−Ｋ１細胞を該ベクターで形質転換し、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する組換えＣＨＯ細胞を得た。
ヒトＧＬＰ−１受容体発現細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌで２４ウエルプレートに植え込んだ。３日後アッセイに使用し、緩衝液（ＰＢＳ、５．６ｍＭグルコース、１ｍＭイソブチルメチルキサンチン、２０μＭ Ｒｏ２０−１７２４、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中でＧＬＰ−１誘導体と３７℃で３０分間インキュベーションした。５Ｎ塩酸を１０μｌ加えてインキュベーションを停止した。
各種ＧＬＰ−１誘導体とＧＬＰ−１受容体との反応により、細胞内に形成されるサイクリックＡＭＰ生成物は、ｃＡＭＰ−ＳｃｒｅｅｎＴＭ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるエンザイムイムノアッセイにより測定した。表１に各種ＧＬＰ−１誘導体のサイクリックＡＭＰ産生活性を、天然型ＧＬＰ−１の活性を１００％としたときの相対的数値で示した。
試験例２ ＧＬＰ−１誘導体の粘膜からの吸収に伴う、血糖低下作用およびインスリ ン分泌促進作用
ＧＬＰ−１誘導体の粘膜からの吸収増大を、ｉｎ ｖｉｖｏでの血糖低下作用およびインスリン分泌促進作用により評価した。すなわち、マウスにＧＬＰ−１誘導体を経鼻投与し、グルコース負荷後の血糖値の変動を調べる経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）で評価した。
ＧＬＰ−１誘導体は蒸留水で１ｍＭに調製し、−８０℃にストックした。試験時に生理食塩水で所定の濃度に希釈して使用した。
マウスはエーテルを用いて軽麻酔した。マイクロピペットを用いて２０μｌのＧＬＰ−１誘導体溶液を、チップの先から直接マウスの鼻にゆっくりと放出した。このときＧＬＰ−１誘導体溶液は、マウスの呼吸により鼻から吸引された。ＧＬＰ−１誘導体を経鼻投与して５分後、５％グルコース溶液を１０ｍｌ／ｋｇの割合でゾンデにより経口投与した。
血糖値は、試験直前とグルコース投与５，１０，２０分後に、尾先端部を切除した傷口から血液数μｌを揉み出し、小型血糖値測定機（グルテストエース、（株）三和化学研究所）を用いて測定した。ＧＬＰ−１誘導体投与前の血糖値からの上昇分の曲線下面積（ＡＵＣ ０−２０分）を個々のマウスについて算出した。
また、血中インスリン値は、グルコース投与５分後にヘパリン処理したガラスキャピラリーを用いて眼窩静脈叢より７５μｌ採血し、遠心分離により得た血漿を用いてＥＩＡ法（レビスマウスインスリンキット、（株）シバヤギ）により測定した。
各ＧＬＰ−１誘導体投与群の血糖値と血中インスリン値を、平均値と標準誤差で表２に示した。
試験例３ 電荷調整脂肪乳剤のＧＬＰ−１誘導体の粘膜吸収に対する作用
試験例２と同様の方法で経口耐糖能試験を行い、電荷調整脂肪乳剤の併用によるＧＬＰ−１誘導体の血糖値低下作用およびインスリン分泌促進作用を調べた。使用した電荷調整脂肪乳剤は特開平８−２７０１８にしたがって調製し、ホスファチジルグリセロール（ナトリウム塩）２％（ｗ／ｗ）、中性油８％（ｗ／ｗ）、水９０％（ｗ／ｗ）を用いて、最終濃度８％電荷調整脂肪乳剤を得た。
８％電荷調整脂肪乳剤溶液５０μｌ、１ｍＭ ８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒ溶液３．５６μｌ、蒸留水１４６．４μｌを混和して、最終濃度０．０１７８ｍＭ ８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒを含む２％電荷調整脂肪乳剤溶液を調製した。比較対照には、２％電荷調整脂肪乳剤溶液を含まない０．５３４ｍＭ天然型ＧＬＰ−１溶液（８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒに比べて３０倍量）、２％電荷調整脂肪乳剤溶液を含まない０．０１７８ｍＭ ８Ｓ−ＧＬＰ−１＋５Ｒ溶液、および生理食塩水を用いた。
マウスはエーテルを用いて軽麻酔した。マイクロピペットを用いて２０μｌのＧＬＰ−１誘導体溶液を、チップの先から直接マウスの鼻にゆっくりと放出した。ＧＬＰ−１誘導体を経鼻投与して５分後、５％グルコース溶液を１０ｍｌ／ｋｇの割合でゾンデにより経口投与した。
血糖値は、試験直前とグルコース投与１０，２０，３０分後に、尾先端部を切除した傷口から血液数μｌを揉み出し、小型血糖値測定機（グルテストエース、（株）三和化学研究所）を用いて測定した。ＧＬＰ−１誘導体投与前の血糖値からの上昇分の曲線下面積（ＡＵＣ ０−３０分）を個々のマウスについて算出した。
また、血中インスリン値は、グルコース投与１０分後にヘパリン処理したガラスキャピラリーを用いて眼窩静脈叢より７５μｌ採血し、遠心分離により得た血漿を用いてＥＩＡ法（レビスマウスインスリンキット、（株）シバヤギ）により測定した。
各ＧＬＰ−１誘導体投与群の血糖値と血中インスリン値を、平均値と標準誤差で表３に示した。
試験例４ ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１の活性評価
試験例１の方法に従がって、ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１のインビトロにおけるサイクリックＡＭＰ産生活性を測定した。アミノ酸置換後も活性を維持していた（表４）。
試験例５ ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ−ＧＬＰ−１のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）に対 する耐性の評価
５００ｐＭ ＧＬＰ−１誘導体８Ｓ−ＧＬＰ−１を４０μＵ／μｌジペプチジルペプチダーゼＩＶと混和し、３７℃にて６０分間反応させた。その後、２倍量のエタノールで抽出し、遠心エバポレーターにて乾固した。得られた乾固物を１％ＢＳＡ含有蒸留水に溶解し、試験例１に従ってサイクリックＡＭＰ産生活性を測定し、残存活性（％）を算出した。
この結果、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる処理なしと処理ありで活性に違いがなく、本ＧＬＰ−１誘導体がジペプチジルペプチダーゼＩＶに対して耐性であることがわかった。したがって８位をセリンに置換することにより、ＧＬＰ−１誘導体はジペプチジルペプチダーゼＩＶ耐性を獲得できる（表７）。
参考製造例２のＧＬＰ−１誘導体２６Ｑ３４Ｎ−ＧＬＰ−１を、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムｐＨ７．８に５００μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。この溶液１００μｌに、５００μｇ／ｍｌトリプシン溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ５１１３）を５μｌ加えて、３７℃、１時間反応させた。反応停止は７１．５％エタノールを１２００μｌ（ｆｉｎａｌ ６５％）を加えて行い、４℃で５分間の１５，０００ｒｐｍ遠心により上清を回収し、エバポレーションした。乾固物を蒸留水に溶解し、試験例１の方法でｃＡＭＰ活性を測定し、残存活性（％）を求めた。
この結果、トリプシン処理なしと処理ありで活性に違いがなく、本ＧＬＰ−１誘導体がトリプシンに耐性であることがわかった（表８）。
ＧＬＰ−１は現在皮下注射で臨床開発が進められている。この原因には、ＧＬＰ−１がペプチドであり、経口投与では吸収されないことが上げられる。本発明品はこの点を改善し、注射以外での投与を可能にする。ＧＬＰ−１を用いた糖尿病治療は長期間にわたることが予想され、患者にとって繰り返しの注射から開放されるメリットは大きい。
【配列表】
Claims (11)
- ＧＬＰ−１（７−３５）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加された配列からなり、かつＧＬＰ−１活性を有するペプチドのＣ末端にＷａａ−（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ（ＷａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ＸａａはＡｒｇまたはＬｙｓ、ｎは０〜１４の整数、ＹａａはＡｒｇ、Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−ＮＨ２またはＨｓｅ）が付加されたペプチド。
- ＧＬＰ−１アミノ酸配列の８位がＳｅｒに置換されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
- ＧＬＰ−１アミノ酸配列の２６位がＧｌｎに、３４位がＡｓｎに置換されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
- ｎが１〜９の整数である、請求項１に記載のペプチド。
- ｎが３〜５の整数である、請求項１に記載のペプチド。
- 一般式、［Ｓｅｒ８，Ｇｌｎ２６，Ａｓｎ３４］−ＧＬＰ−１（７−３５）−（Ａｒｇ）ｎ−Ｙａａ
式中、ｎは４〜６の整数、ＹａａはＡｒｇまたはＡｒｇ−ＮＨ２、で示される、請求項１に記載のペプチド。 - 天然型ＧＬＰ−１よりも高い粘膜吸収率を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
- 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
- 表面電荷をマイナスに調整した脂肪乳剤を含有していることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
- 経粘膜投与，特に経鼻投与で用いることを特徴とする、請求項８または９に記載の医薬組成物。
- インスリン非依存性慢性糖尿病の処置、インスリン依存性慢性糖尿病の処置、肥満の処置、又は／及び食欲抑制のための、請求項８または９に記載の医薬組成物。
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