JPS6243670B2 - - Google Patents
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、ザルコシンオキシダーゼ
(EC.1.5.3.1)の製造法に関するものである。ザ
ルコシンオキシダーゼは、クレアチニン、及びコ
リンの代謝に関与する重要な酵素で、又クレアチ
ニン、クレアチンの定量に用いられる診断用酵素
としても重要であり、次の反応を触媒する。 CH3NHCH2COOH+H2O+O2 →NH2CH2COOH+HCHO+H2O2 従来この酵素の製造法としては、種々の哺乳動
物から抽出する方法が知られているが、この方法
は、酵素の精製が不充分でかつ大量生産に適さな
い等の欠点がある。 本発明者等は、微生物利用による本酵素の製造
法につき研究を重ねた結果、自然界より分離した
シリンドロカルポン属に属するシリンドロカルポ
ン・デイデイマムM−1や本酵素を大量に生産す
ることを見い出し、本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の要旨は、シリンドロカルポン
属に属するザルコシンオキシダーゼ生産性微生物
を培養し培養物からザルコシンオキシダーゼを採
取することを特徴とする、ザルコシンオキシダー
ゼの製造法に存する。 以下に本発明を詳細に説明するに、ザルコシン
オキシダーゼを生産する微生物としては、シリン
ドロカルポン属に属する微生物、例えばシリンド
ロカルポン・デイデイマム(ハルテイグ)ウオレ
ンウイバーM−1(Cylindrocarpon didymum
(Hartig)Wollenweber)が挙げられる。シリン
ドロカルポン・デイデイマムM−1は公知の菌
で、また工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されており(微生物受託番号第4168号)その同定
に関してはアグリカルチユラル バイオロジカル
ケミストリー(Agricultural Biological
Chemistry)、43、815〜820頁、1973年、(日本)
に詳しく書かれている。又その菌学的性質はシ
ー・ブース著“ザ ジーナスシリンドロカルポ
ン”マイコロジカル ペーパーズ、104巻、32〜
34頁、1966年 コモンウエルス マイコロジカル
インステイチユート、キユー、サリー、イング
ランド発行 (C.Booth The genus Cylindrocarpon.
Mycological Papers 104:32−34、1966、
Commonwealth Mycological Institute、Kew、
Surrey、England.) に詳しく述べられている。 これらのザルコシンオキシダーゼ生産性微生物
の培養に必要な栄養物としては、特に限られるも
のではなく、通常微生物の培養について用いられ
る諸物質が利用できる。例えば炭素源としてはグ
ルコース、シユクロース、フラクトース、グリセ
ロール、ソルビトール、糖蜜、澱粉加水分解物等
の糖質、酢酸、フマル酸などの有機酸が使用され
る。窒素源としては、硝酸塩類及びアンモニウム
塩類、コーンステイ−プリカー、酵母エキス、肉
エキス、酵母粉末、綿実粉、大豆粉、ポリペプト
ン、ペプトンなどが挙げられる。無機塩として
は、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウムなどが利用できる。 本発明においては、これらの培地にコリン又は
ジメチルグリシン又はザルコシンを添加すること
により、ザルコシンオキシダーゼの生産性を高め
ることができる。これらの添加量は0.1〜2重量
%が好適である。 培養温度は20〜40℃、特に20〜30℃が好適であ
る。培養は通常48〜72時間好気的に行なう。又培
養中のPHは5〜8に保つことが望ましい。 かくして得られるザルコシンオキシダーゼは主
として微生物の菌体内に存在しており、その分離
精製については超音波処理、硫安分別、イオン交
換クロマトグラフイー、ゲル過などの公知の方
法が適用できる。 即ち培養後得られた菌体を遠心分離、過等に
よつて集めた後、超音波処理、ホモゲナイザー、
ガラスビーズによる磨砕等の機械的手段又は細胞
壁溶解酵素等による化学的手段により、細胞を破
砕した後遠心分離により上清を得る。 次にこの上清を硫安分別、DEAE−セフアデツ
クス(フマルマシアフアインケミカルズ社商
標)、DEAE−セルロース等のイオン交換クロマ
トグラフイー、ハイドロキシルアポタイト等によ
る吸着クロマトグラフイー、セフアデツクス(フ
アルマシアフアインケミカルズ社商標)等による
ゲルクロマトグラフイー等の組合わせで精製され
る。得られたザルコシンオキシダーゼの諸性質は
次の通りである。 1 分子量 45000(ゲル過法) 48000(SDS−デイスク電気泳動) 2 沈降定数 S20、w;3.8 3 吸光度 E1%1cn280nm;26.4 4 補酵素 1分子FAD/1分子酵素 5 等電点 5.2 6 Km(ザルコシンに対し) 1.8mM 7 至適 PH 8.0付近 8 至適温度 35℃ 9 熱安定性 0.05Mリン酸バツフアー(PH8.0)中、各 温度で10分間処理したときの残存活性 温度(℃) 残存活性(%) 30 98 35 90 40 90 45 75 50 3 55 0 10 PH安定性 トリス塩酸バツフアー中、PH8−8.5で最も
安定 11 吸収スペクトル 450nmに極大吸収 12 阻害剤;1mMのAg+、Hg2+、Cu2+、ヨー
ド酢酸及び0.1mMのP−CMBの添加によつて
完全に阻害を受ける。 13 基質特異性 ザルコシンのみが基質となり、その他のN−
メチルアミノ酸には作用しない。 (酸素と水の存在下ザルコシンを化学量論的
に分解してグリシン、ホルムアルデヒド、過酸
化水素を生ずる。) 次に実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されるものではない。 活性の測定方法 ザルコシンオキシダーゼの活性測定は、生成物
であるホルムアルデヒド及び過酸化水素をナツシ
ユ(Nash)の方法及びパーオキシダーゼを共役
させた方法で定量した。 (1) ホルムアルデヒドの定量 リン酸カリウムバツフアー(PH8.0)125μ
mol、ザルコシン30μmol及び被験液を含む反
応液3.0mlを30℃で10分間反応させた後、4N−
HCl0.1mlを加えて反応を停止する。その1ml
に1中酢酸アンモニウム150g、酢酸3ml、
アセチルアセトン2mlを含む試薬1mlを加え、
37℃で60分間反応させた後、412nmの吸光度
を測定する。 (2) 過酸化水素の定量 リン酸カリウムバツフアー(PH8.0)125μ
mol、ザルコシン30μmol、フエノール6μ
mol、4−アミノアンチピリン4.5μmol、パー
オキシダーゼ及び被験液(ザルコシンオキシダ
ーゼ)を含む反応液3.0mlを30℃で反応させ
505nmの吸光度を測定する。 実施例 1 シリンドロカルポン・デイデイマムM−1をコ
リンクロリド1.0%、NaCl0.1%、K2HPO40.1%、
MgSO4・7H2O0.05%、肉エキス0.1%の組成より
なる500mlの培地を含む2フラスコ40本に接種
し28℃、48時間振盪培養する。培養液20より得
られた菌体を0.01%の2−メルカプトエタノール
を含む0.1M−トリス−塩酸バツフアー300mlにけ
んだくした後超音波処理し、遠心分離によつて菌
体抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安分画し、
ザルコシンオキシダーゼ活性区分(30〜50%飽
和)を0.1mMジチオスライトールを含む10mM
トリス−塩酸バツフアー(PH8.0)で透析した後
DEAE−セルロースのカラムに流し、酵素を吸着
させる。これに0.1mMジチオスライトールを含
む50mMのトリス−塩酸バツフアー中食塩を
0.2Mまで直線的に加えた溶液で溶出を行なう。
かくして得られるザルコシンオキシダーゼ含有溶
出液について硫安分画を行ない、硫安40〜50%飽
和区分を集め、0.1mMジチオスライトールを含
む10mMリン酸カリウムバツフアー(PH8.0)で
透析を行なう。透析酵素液をハイドロキシルアパ
タイトカラムにかけ0.1mMジチオスライトール
を含む10mMリン酸カリウムバツフアー(PH
8.0)で溶出する。ザルコシンオキシダーゼ含有
区分をフアルマシアフアインケミカルズ社商標セ
フアデツクスG−75のカラムに流し0.1mMジチ
オスライトール及び0.1Mの食塩を含む50mMの
リン酸カリウムバツフアーでゲル過を行なう。
得られたザルコシンオキシダーゼ含有区分を再度
同じゲル過を行なつて精製ザルコシンオキシダ
ーゼを得る。得られたザルコシンオキシダーゼは
デイスク電気泳動及び超遠心分析で単一な蛋白で
ある。 精製ザルコシンオキシダーゼの比活性は、
27.6Unit/mg蛋白である。 以上の結果をまとめたものを表−1に示す。
(EC.1.5.3.1)の製造法に関するものである。ザ
ルコシンオキシダーゼは、クレアチニン、及びコ
リンの代謝に関与する重要な酵素で、又クレアチ
ニン、クレアチンの定量に用いられる診断用酵素
としても重要であり、次の反応を触媒する。 CH3NHCH2COOH+H2O+O2 →NH2CH2COOH+HCHO+H2O2 従来この酵素の製造法としては、種々の哺乳動
物から抽出する方法が知られているが、この方法
は、酵素の精製が不充分でかつ大量生産に適さな
い等の欠点がある。 本発明者等は、微生物利用による本酵素の製造
法につき研究を重ねた結果、自然界より分離した
シリンドロカルポン属に属するシリンドロカルポ
ン・デイデイマムM−1や本酵素を大量に生産す
ることを見い出し、本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明の要旨は、シリンドロカルポン
属に属するザルコシンオキシダーゼ生産性微生物
を培養し培養物からザルコシンオキシダーゼを採
取することを特徴とする、ザルコシンオキシダー
ゼの製造法に存する。 以下に本発明を詳細に説明するに、ザルコシン
オキシダーゼを生産する微生物としては、シリン
ドロカルポン属に属する微生物、例えばシリンド
ロカルポン・デイデイマム(ハルテイグ)ウオレ
ンウイバーM−1(Cylindrocarpon didymum
(Hartig)Wollenweber)が挙げられる。シリン
ドロカルポン・デイデイマムM−1は公知の菌
で、また工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されており(微生物受託番号第4168号)その同定
に関してはアグリカルチユラル バイオロジカル
ケミストリー(Agricultural Biological
Chemistry)、43、815〜820頁、1973年、(日本)
に詳しく書かれている。又その菌学的性質はシ
ー・ブース著“ザ ジーナスシリンドロカルポ
ン”マイコロジカル ペーパーズ、104巻、32〜
34頁、1966年 コモンウエルス マイコロジカル
インステイチユート、キユー、サリー、イング
ランド発行 (C.Booth The genus Cylindrocarpon.
Mycological Papers 104:32−34、1966、
Commonwealth Mycological Institute、Kew、
Surrey、England.) に詳しく述べられている。 これらのザルコシンオキシダーゼ生産性微生物
の培養に必要な栄養物としては、特に限られるも
のではなく、通常微生物の培養について用いられ
る諸物質が利用できる。例えば炭素源としてはグ
ルコース、シユクロース、フラクトース、グリセ
ロール、ソルビトール、糖蜜、澱粉加水分解物等
の糖質、酢酸、フマル酸などの有機酸が使用され
る。窒素源としては、硝酸塩類及びアンモニウム
塩類、コーンステイ−プリカー、酵母エキス、肉
エキス、酵母粉末、綿実粉、大豆粉、ポリペプト
ン、ペプトンなどが挙げられる。無機塩として
は、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウムなどが利用できる。 本発明においては、これらの培地にコリン又は
ジメチルグリシン又はザルコシンを添加すること
により、ザルコシンオキシダーゼの生産性を高め
ることができる。これらの添加量は0.1〜2重量
%が好適である。 培養温度は20〜40℃、特に20〜30℃が好適であ
る。培養は通常48〜72時間好気的に行なう。又培
養中のPHは5〜8に保つことが望ましい。 かくして得られるザルコシンオキシダーゼは主
として微生物の菌体内に存在しており、その分離
精製については超音波処理、硫安分別、イオン交
換クロマトグラフイー、ゲル過などの公知の方
法が適用できる。 即ち培養後得られた菌体を遠心分離、過等に
よつて集めた後、超音波処理、ホモゲナイザー、
ガラスビーズによる磨砕等の機械的手段又は細胞
壁溶解酵素等による化学的手段により、細胞を破
砕した後遠心分離により上清を得る。 次にこの上清を硫安分別、DEAE−セフアデツ
クス(フマルマシアフアインケミカルズ社商
標)、DEAE−セルロース等のイオン交換クロマ
トグラフイー、ハイドロキシルアポタイト等によ
る吸着クロマトグラフイー、セフアデツクス(フ
アルマシアフアインケミカルズ社商標)等による
ゲルクロマトグラフイー等の組合わせで精製され
る。得られたザルコシンオキシダーゼの諸性質は
次の通りである。 1 分子量 45000(ゲル過法) 48000(SDS−デイスク電気泳動) 2 沈降定数 S20、w;3.8 3 吸光度 E1%1cn280nm;26.4 4 補酵素 1分子FAD/1分子酵素 5 等電点 5.2 6 Km(ザルコシンに対し) 1.8mM 7 至適 PH 8.0付近 8 至適温度 35℃ 9 熱安定性 0.05Mリン酸バツフアー(PH8.0)中、各 温度で10分間処理したときの残存活性 温度(℃) 残存活性(%) 30 98 35 90 40 90 45 75 50 3 55 0 10 PH安定性 トリス塩酸バツフアー中、PH8−8.5で最も
安定 11 吸収スペクトル 450nmに極大吸収 12 阻害剤;1mMのAg+、Hg2+、Cu2+、ヨー
ド酢酸及び0.1mMのP−CMBの添加によつて
完全に阻害を受ける。 13 基質特異性 ザルコシンのみが基質となり、その他のN−
メチルアミノ酸には作用しない。 (酸素と水の存在下ザルコシンを化学量論的
に分解してグリシン、ホルムアルデヒド、過酸
化水素を生ずる。) 次に実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されるものではない。 活性の測定方法 ザルコシンオキシダーゼの活性測定は、生成物
であるホルムアルデヒド及び過酸化水素をナツシ
ユ(Nash)の方法及びパーオキシダーゼを共役
させた方法で定量した。 (1) ホルムアルデヒドの定量 リン酸カリウムバツフアー(PH8.0)125μ
mol、ザルコシン30μmol及び被験液を含む反
応液3.0mlを30℃で10分間反応させた後、4N−
HCl0.1mlを加えて反応を停止する。その1ml
に1中酢酸アンモニウム150g、酢酸3ml、
アセチルアセトン2mlを含む試薬1mlを加え、
37℃で60分間反応させた後、412nmの吸光度
を測定する。 (2) 過酸化水素の定量 リン酸カリウムバツフアー(PH8.0)125μ
mol、ザルコシン30μmol、フエノール6μ
mol、4−アミノアンチピリン4.5μmol、パー
オキシダーゼ及び被験液(ザルコシンオキシダ
ーゼ)を含む反応液3.0mlを30℃で反応させ
505nmの吸光度を測定する。 実施例 1 シリンドロカルポン・デイデイマムM−1をコ
リンクロリド1.0%、NaCl0.1%、K2HPO40.1%、
MgSO4・7H2O0.05%、肉エキス0.1%の組成より
なる500mlの培地を含む2フラスコ40本に接種
し28℃、48時間振盪培養する。培養液20より得
られた菌体を0.01%の2−メルカプトエタノール
を含む0.1M−トリス−塩酸バツフアー300mlにけ
んだくした後超音波処理し、遠心分離によつて菌
体抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安分画し、
ザルコシンオキシダーゼ活性区分(30〜50%飽
和)を0.1mMジチオスライトールを含む10mM
トリス−塩酸バツフアー(PH8.0)で透析した後
DEAE−セルロースのカラムに流し、酵素を吸着
させる。これに0.1mMジチオスライトールを含
む50mMのトリス−塩酸バツフアー中食塩を
0.2Mまで直線的に加えた溶液で溶出を行なう。
かくして得られるザルコシンオキシダーゼ含有溶
出液について硫安分画を行ない、硫安40〜50%飽
和区分を集め、0.1mMジチオスライトールを含
む10mMリン酸カリウムバツフアー(PH8.0)で
透析を行なう。透析酵素液をハイドロキシルアパ
タイトカラムにかけ0.1mMジチオスライトール
を含む10mMリン酸カリウムバツフアー(PH
8.0)で溶出する。ザルコシンオキシダーゼ含有
区分をフアルマシアフアインケミカルズ社商標セ
フアデツクスG−75のカラムに流し0.1mMジチ
オスライトール及び0.1Mの食塩を含む50mMの
リン酸カリウムバツフアーでゲル過を行なう。
得られたザルコシンオキシダーゼ含有区分を再度
同じゲル過を行なつて精製ザルコシンオキシダ
ーゼを得る。得られたザルコシンオキシダーゼは
デイスク電気泳動及び超遠心分析で単一な蛋白で
ある。 精製ザルコシンオキシダーゼの比活性は、
27.6Unit/mg蛋白である。 以上の結果をまとめたものを表−1に示す。
【表】
* フアルマシアフアインケミカルズ社商標
Claims (1)
- 1 シリンドカルポン属に属するザルコシンオキ
シダーゼ生産性微生物を培養し、培養物からザル
コシンオキシダーゼを採取することを特徴とする
ザルコシンオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16986079A JPS5692790A (en) | 1979-12-26 | 1979-12-26 | Preparation of sarcosine oxidase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16986079A JPS5692790A (en) | 1979-12-26 | 1979-12-26 | Preparation of sarcosine oxidase |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5692790A JPS5692790A (en) | 1981-07-27 |
JPS6243670B2 true JPS6243670B2 (ja) | 1987-09-16 |
Family
ID=15894275
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16986079A Granted JPS5692790A (en) | 1979-12-26 | 1979-12-26 | Preparation of sarcosine oxidase |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5692790A (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61162174A (ja) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼn及びその製造法 |
DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
US7229812B2 (en) | 2002-11-13 | 2007-06-12 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
JP4405324B2 (ja) | 2003-11-18 | 2010-01-27 | キッコーマン株式会社 | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法 |
CN109715799B (zh) | 2016-09-15 | 2023-04-04 | 龟甲万株式会社 | 经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法 |
-
1979
- 1979-12-26 JP JP16986079A patent/JPS5692790A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5692790A (en) | 1981-07-27 |
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