JPS61162174A - 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼn及びその製造法 - Google Patents

耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼn及びその製造法

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JPS61162174A
JPS61162174A JP60001989A JP198985A JPS61162174A JP S61162174 A JPS61162174 A JP S61162174A JP 60001989 A JP60001989 A JP 60001989A JP 198985 A JP198985 A JP 198985A JP S61162174 A JPS61162174 A JP S61162174A
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sarcosine oxidase
oxidase
heat
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勝 鈴木
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0032Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な耐熱性ザルコシン・オキシダーゼN及び
その製造法に関する。
〔従来の技術〕
ザルコシン・オキシダーゼは。
ザルコシン+H20+02−−÷ グリシン+ホルムアルデヒ)’+H20゜の反応を触媒
する酵素で1例えば特開昭jg−j、47g9号公報、
ジャーナル・オブ魯バイオケミストリー纂g9巻、第!
99頁、79gノ年ジャパン(J、Biochem、&
9.  j9?(tqg t )JAPAN )に記載
され、知られている。
一方、現在、臨床医学分野において血清、尿中のクレア
チニンあるいはクレアチンを定量して腎臓機能の疾患、
筋肉疾患等の診断をおこなっているが、その定量法とし
ては、アルカリ性ピクリン酸とクレアチニンとの反応に
より生ずる橙色を測定する、いわゆるヤツフエ法が知ら
れている。しかしその発色反応は血清、尿中にある各種
物質により影響を受ける非特異的反応である。そのため
ヤツフエ広で測定した値は信頼性が乏しく、またこの方
法では除蛋白操作を必要することが多く。
操作が煩雑になる欠点がある。
そこで、最近になって、クレアチニンあるいはクレアチ
ンを酵素的に定量する方法が報告され〔臨床化学シンポ
ジウム第1り集、第19乙頁(/979))、その定量
法は下記の通りであって。
これにザルコシン・オキシダーゼが使用されている。な
お、下記の式中、括弧内は使用酵素である0クレアチニ
ン+H20;マクレアチニン(クレアチニン・アミジノ
ヒドロラーゼ)クレアチン十H,O−→ザルコシン+尿
素(クレアチンのアミジノヒドロラーゼ)ザルコシン+
H,O+ O,−→ グリシン+ホルムアルデヒド゛+ H2O。
(ザルコシン・オキシダーゼ) 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記したように、最近クレアチニンあるいはクレアチン
を酵素的に定量する方法が開発されたが。
血清、尿中に含まれるクレアチニン量あるいはクレアチ
ン量は非常に少ないので、その定量に際しては、高感度
の酵素的測定法が期待されていた〇最近になって、過酸
化水素(H2O2)をパーオキシダーゼ(西洋ワサビ由
来のperoxidaae )と中性〜微酸性で高感度
に発色する発色剤が開発され。
その際の発色剤による発色は背合あるいは緑色で。
血清成分由来の黄色、赤色とは全(異なるので。
血清ブランク値を個別に測定する必要がない点で有利で
ある。しかしながら、これ等の発色剤は、pH7゜5以
上では発色した色素が不安定で脱色するので、酵素反応
−発色反応を中性ないし微酸性で行ない、安定な発色反
応を行なわせる必要があり、しかも、パーオキシダーゼ
の至適pHが微酸性(1)H≦、j付近)にあるので、
共役酵素も微酸性で充分酵素作用を有する酵素の開発が
要求されるO また、定量に用いられる酵素としては、夾雑酵素を含ま
ない純度の高い酵素が要求され、それを得るために酵素
の大量精製工程において夾雑酵素(例えばカタラーゼ、
ウリカーゼ等〕を加熱処理で完全に失活させた。比活性
の高い高純度の酵素の出現が期待されている。
さらに、血清、尿中に含まれるクレアチニンあるいはク
レアチンの量が小さいので、クレアチニンあるいはクレ
アチンが酵素的に分解されて生成サレるザルコシンの量
も当然微量となり、このような微量のザルコシンにも作
用するKm値(ミカエリス定数]の小さい酵素の開発が
業界では強(要望されている。
このような問題点を解決したのが本発明である。
〔問題点を解決するための手段〕
上記した事情に鑑み1本発明者は、クレアチニンあるい
はクレアチンの高感度な酵素的測定法に好適な、微酸性
でも充分に酵素作用し、熱に安定で、ザルコシンに対す
るKm値の低い酵素的性質を同時に所有する新規なザル
コシンeオキシダーゼを提供すべ(鋭意検討を重ねた結
果、新たに土壌より分離したバチルス属に属する菌株を
培養したものより、微酸性でも充分酵素活性を示し、耐
熱性で、ザルコシンに対するKm値の低い新規なザルコ
シン・オキシダーゼが得られることを知り、本発明を完
成した。
すなわち1本発明は、以下の理化学的性質を有する耐熱
性ザルコシン・オキシダーゼNである。
(a)作用: ザルコシンを酸化分解して、グリシン、ホルムアルデヒ
ド及び過酸化水素を生成する下記の酵素反応を触媒する
酵素である。
ザルコシン+H,0+ 02  → グリシン+ホルムアルデヒド”+H2O2(b)基質特
異性: ザルコシンに対するKm値(ミヵエIJス定数)は3り
C,pH7,7(リン酸緩衝液)でグ、7ミリモルであ
る。
(c)至適p)(及び安定pH範囲: 至適pHは、ザルコシンを基質とした場合、pH6,2
〜)θ、θである。
安定pH範囲はpHg、j〜11.J−である。
cd)作用適温の範囲: 4tj〜乙0Cの範囲にある。
(e)熱安定性: 660.10分間の処理で9g%の酵素活性を保持し、
300110分間の処理でも75%の残存活性を示す。
(f)分子量: セファデックスQ −/ 、5−θを用いたカラムゲル
濾過法で測定した結果、約4tqoooである。
(g)フラビン酵素蛋白: フラビン・アデニンΦジヌクレオチド(FAD )が酵
素蛋白に共有結合し、結合比Vil:lである。
又、本発明は耐熱性ザルコシン・オキシダーゼNを生産
するバチルス属に属する微生物を培地に培養し、培養物
より該耐熱性ザルコシン・オキシダーゼNを採取するこ
とを特徴とする耐熱性ザルコシンΦオキシダーゼNの製
造法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
先ず、未発明の精製酵素(耐熱性ザルコシン・オキシダ
ーゼN)の理化学的性について詳細に説明すると、以下
のとおりである。
(1)作用 本酵素は、ザルコシンを酸化分解して、グリシン、ホル
ムアルデヒドと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵
素である。
ザルコシン+H,0+ 02 −→ グリシン+ホルムアルデヒド’+H20□(2)基質特
異性 本酵素の基質特異性を調べるために以下の反応条件で調
べた。
各基質(θ、2M]を0−J−1,0,3Mリン酸緩衝
/[pH7,7を0−1rnl、θ−2%s、<を−ジ
クロロフェノール・サルフオネートヲ0.1rn13.
70 ml 7 dlの@−7ミ/77fビリ7ft0
.1m7!、70単位/ rugのパーオキシダーゼを
0.7酎に、17単位/ ml (希釈を必要とする場
合、適当に0.3M+)ン酸緩衝液pi(7、7で希釈
する)の本酵素液(耐熱性ザルコシン・オキシダーゼN
)を0.1mg加え、3・りCで1C分間反応させ、θ
、!Nの酢酸を2酎添加し反応を停止させ、次に反応時
間ゼロ時間の反応液を対照として波長!lonmでの吸
光度値を測定した。なお、相対活性C%)は、N−メチ
ル−グリシン(ザルコシン)を基質として酵素反応させ
て得られる波長j / 0 [71の吸光度値を100
C%〕とし、他の物質を基質とした場合の比較値C%)
で示した。
基    質        相対活性(易)N−メチ
ル−グリシン〔ザルコシン1    100N−メチル
−L−アラニア         3)、3N−メチル
−L−バリア           7.3N−メチル
−L−イソロイシン        j、3N−メチル
−L−セリン           θN−メチルーL
−グルタミン酸         ON−メチル−L−
リジン            θザルコシルーグリシ
ン       θグリシン            
 θ、09L−アラニン           0L−
バリン          0 L−イソロイシン         0L−スレオニン
          θL−セリン         
  θ D−グルタミン散          0D−アスパラ
ギン酸        θチラミン         
     θヒスタミン            ON
、N−ジメチルグリシン        θベタイン 
             0コリン        
    Q l、3−ジメチル尿素        θl−メチルグ
アニジン       0本酵素のザルコシンに対する
Km値(ミカエリス(Michaelis )定数〕は
37C,pH7,7(リン酸緩衝液)ではg 、 7 
ミIJモルである〇(3)至適pH” 本酵素の至適pHは、ザルコシンを基質とした場合、第
7図に示す如(pH6,y〜10.0である。なお、第
1図中、o−=oはPIPESグツト・バッファー(p
H6,0−6,7) ;←−(I/iu、J−ジメチル
グルタレート−バッフ7−(pH50−2,0);赳植
は燐酸バッファー(p)(7,θg、j):門−1はト
リス−HClバッファー〔pH7,!−9,θ );ト
(はグリシン−NaOHバッファー(pH9、θ−IQ
、θ];ト→はグリシン−NaC1−NaOHバッファ
ー(pH/ 0 、0−ノコ、θ)である。
(4]力価の測定法 第1法:ザルコシンを酸化分解して生成されて(るホル
ムアルデヒドを発色定量する方法0.2%ルのザ/I/
ニア 7ン浴g O、j rn13に0.3モルのリン
酸緩衝液(pH2,?)0.1−および適当な濃度の本
酵素液o、1mlを加えて37C1IQ分間反応させた
後、θ、J−N酢酸液0.5m6ヲ添加して反応を停止
させ、次にこれに了セチル・アセトン呈色液(アセチル
やアセトン0−2%。
V / V ; ’) y酸277%ニウム/ 0%、
W/V。
pH4,j)を3 tug添加し、32Cで4to分間
発色させて、光電比色計により波長4t’ o nmに
おける吸光度値を測定した。
そして、予じめ作成したホルムアルデヒドの検量曲線よ
り、その生成量を調べておき、37C17分間当たQ/
マイクロモルのホルムアルデヒドを生産する酵素量を1
単位とした。
第2法:酵素反応で生成する過酸化水素CH2O□)を
定量する方法 0.2モルのザルコシン溶液0.1m1%0.3モルの
リン酸緩衝液(1)H7,7)θ、l酎、耐、コ%コ、
4t−ジクロロフェノールサルフォネート液0、Irt
rl、70■/ノoorntのグーアミノアンチピリン
#LO、/mJ、 7 <7単位/αのパーオキシダー
ゼo、impの混液に適当な濃度の本酵素液0.1ml
を加えて、32C*  ’θ分間反応させ1次にこれに
717.sN酢酸液2Mを添加して反応を停止させ、光
電比色計により波長j / Ofimにおける吸光度を
測定した。
そして、予じめ測定したH2O2の検量曲線より。
その生成量を調べておき、37’f:、1分間当たりノ
マイクロモルのH2O,を生成する酵素量を7単位とし
た。
(5)作用適温の範囲 第2図に示す如く本酵素の作用適温の範囲は4ts−6
oCにある。
(6)熱安定性 精製した本酵素をQ、l単位含有する酵素液o、imt
cリン酸緩衝液、0.3モル、p)l 7,71を各温
度に19分間放置して、残存する酵素活性量を調べた結
果、第3図に示す如<tOCにおいてもtzOj)の残
存活性を示した0また。jOC。
30分間処理しても全(活性は低下せず、jjC。
70分間処理で9g%の活性を保持した。
(7)pH安定性 θ、ノ9単位の本酵素を含有する各緩衝液θ、rrIL
lをjCで4tg時間放置後、残存する酵素活性を調べ
た。その結果は第7図に示す如(であって、pHt、r
−ii、zまで安定であった0なお、第7図中、α−り
はPIPESグツト・バッファー(pH1,,0−4,
7) ;)→は燐酸バッファー(pH6,OK 、j 
 1 ; b−Aはトリス−HClバッファー(pH7
,0−9,0)ニジ−1はグリシy −NaOHバッフ
ァー(pH9,0−10,0);0−0はグリシン−N
aC1−NaOHバッファーCpH10,0−ノコ、0
)である。
(8)阻害、活性化及び安定化 本酵素はCu 2” s Zn2+、Ai”、 Hg”
s モノヨード”i[、シアン化カリ、N−エチルマレ
イミド(各λミリモル濃度)により強(阻害される。
活性化剤、安定化剤は特にない。
(9)精製方法 本酵素は後記する精製方法により精製することができる
C10】分子量 本酵素の分子量は、アントリウスの方法〔P、Andr
ews+ Biochem、J、、 ? 4.  j 
q s riqts)〕に基づき、セファデックスG−
t6θ(5ephadexG−7tθ)(スウェーデン
国、ファーマシア社製)を用いたカラムゲル濾過法で測
定した結果。
0.7モル食塩含有0.01モル燐酸緩衝液中で4t9
θθθであった。
(11]等電点 ディスク焦点電気泳動法により測定した結果、pI=j
、3oであった。
(12)ディスク電気泳動 デーヴイス(B、 J、 Davis* Ann、Ne
w YorkAcad、Sci、、 /、2 /、  
4to4tc tqta ) )ノpH9、グのゲルを
用いてjmA/ゲルでjC,ty分(分離用ゲルの泳動
時間)泳動を行ない、酵素蛋白質をクマジープリリアン
トプルーG−2!θ(CoomassjeBrilli
antBlue G−コjO)で染色した。その結果、
ゲルのアクリルアミドゲル!度7−j%の時には原点よ
り陽極側にJ、?Qn(ブロム拳フェノール・ブルー、
色素の泳動ttz4t、θc′rn)、lj%の時には
陽極側に7.3CW1のところに単一なバンドヲ認めた
(13]フラピン酵素 本酵素は黄色の酵素で、酵素蛋白7分子量たり1分子の
フラピン・アデニン・ジヌクレオチド°(FAD)を共
有結合している酵素である。
以上の本発明酵素を従来のザルコシン・オキシダーゼと
比較すると、第1表の如(である。
第1表 で で と” る ン ハ (注)(1)第4表中、公知例1の酵素は特開昭!ター
!22g9号公報に記載のザルコシン・オキシダーゼで
あり、公知例2の酵素はジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー第g9巻、第799頁(ツタg/)ジャパン(
J、Biochem、trq、  sqtprtqgt
)JAPAN )に記載のザルコシン・オキシダーゼで
ある。
上述の如(1本酵素は、その酵素化学的、物理化学的諸
性質より公知の何れのザルコシン・オキシダーゼとも異
なっており、殊に従来のザルコシン・・オキシダーゼよ
り格段に熱安定性が高い。したがって本酵素は、高い温
度での使用に際して失活せず大変有利であるとともに、
大量の酵素精製に際しても夾雑酵素C)例、H70□を
分解するカタラーゼ)を完全に失活させることができ、
純度の高い酵素を得ることが容易になる。
また、従来のザルコシン・オキシダーゼに比較して本酵
素が微酸性でも充分酵素活性を有していることは、少量
のクレアチニンあるいはクレアチンを定量する高感度の
発色剤を使用する際に殊に有利である0なぜならば、長
波長側(6θO〜ys。
nm)に最大吸光度をもつ発色剤は1発色感度が非常に
高いが、pi(7、2以上になると急激に不安定になる
傾向があり、また共役反応に必ず使用されるパーオキシ
ダーゼの至適pHはpH6,s付近にあるので、pH6
,j〜7.2で酵素反応をさせるのが重要であり、この
点で本酵素は従来の何れの酵素よりも格段に適している
からである。
次に1本発明による耐熱性ザルコシン・オキシダーゼN
の製造去について説明する0 有する菌株であって、その具体例としては、バチルス・
エスピー(Bacillua sp、 ) NS−/ 
29が挙げられ、該菌の変種もしくは変異株も用いられ
る。バチルス・エスピー(Bacillus sp、 
) NS−/U?は1本発明者が土壌中より新たに分離
した菌株であり、その菌学的性質は下記のとおりである
0 (a)形態 顕微鏡的観察(肉汁寒天培地30C,l〜3日培養] (1)細胞の大きさ:1.3〜/、9×3.g−4.グ
ミクロンの桿菌。
(2)細胞の多形性、:認められない。
(3)運動性二周鞭毛で運動する。
(4)胞子の有無:コル3日間で内生胞子を細胞の中央
又は少し端よりにつ(す、胞子の形は楕円形で、1.j
x2,3ミクロンの大きさである。胞子によって歯体は
膨張している0 〔5)ダラム染色性:陽性0 (6)抗酸性:陰性0 (b)各培地における生育状態 (1]肉汁寒天平板培養:30C,24を時間で淡灰褐
色コロニー、表面平滑で鈍い光沢を有し、不透明である
O色素の生成にないO (2〕肉汁寒天斜面培養:生育は良好で(1)に同じ0 (3)肉汁液体培養:静止培養は生育悪(、生育菌体の
沈澱を形成するO (4]肉汁ゼラチン穿刺培養:2jC,3θCで培養し
ても全(液化しない。振盪培養しても菌は生育するが、
液化は全(認められない。
(5)リドマスミルク:全(変化しない0(c)生理的
性質 (11硝酸塩の還元:陽性0 (2)脱窒反応:陰性0 (33M Pテスト:陰性0 (4) V Pテスト:陰性0 (5)インド−ルの生成:陰性O (6]硫化水素の生成:陽性O 【7)スターチの加水分解:陰性0 (8)カゼインの加水分解:陰性0 (9)尿酸の分解(ウリカーゼの生産):陰性0(10
)チロシンの分解:陰性0 C11)セルロースの加水分解:陰性。
(12)クエン酸の利用:シモン(Simons )培
地で陰性、クリステンセン(Christensenl
の培地で陽性0 (13]無機窒素の利用:アンモニアは利用するが弱い
。硝酸塩はほとんど利用しない。
(14]ウレアーゼ:陰性。
(15)オキシダーゼ:陽性0 (16)カタラーゼ:陽性0 (17]色素の生成:陰性0 (18)耐塩性: NaC1s%まで生育する。
(19]酸素に対する態度:好気性0 (20]生育の範囲:生育pH域は6.0〜9.0゜生
育温度域はJjC−4tjC’。
〔21)死滅温度:gOC,30分間処理で死滅せず、
gjC,30分間処理で完全に死滅する。
(22) 0− Fテスト:反応せず、グリセロール。
グルコースを用いて寒天培地で行なったが、変化しない
。好気的に振盪培養すると、菌は良(生育(ペプトン−
イーストエキス培地)するが、酸を生成しなかった0 (23)糖類から酸及びガスの生成: 静置培養及び振盪培養の両方により酸の生ぼを調べ、ガ
スの生成は静置培養で調べた。その結果、下記の糖類よ
り酸及びガスの生成が全(認められなかった。使用した
糖類:イノシトール、D−ガラクドース、D−マンノー
ス、D−リボース。
トレハロース、L−アラビノース、D−キシロース、エ
リスリトール、L−ラムノース、マンニトール、シュク
ロース、マルトース、フルクトース、ラクトース。
D−アラビノース、L−ソルボース、L−ラムノース、
デキストリン、ソルビトール、D−(+)ラフィノース
、サリシン、イヌリン、D(+)−フリビオース。
グリセリン、グルコース、セロビオース。
メレジトース、ギシリトール。
(d)その他の性質 ビタミン・フリーのカザアミノ酸とリン酸塩、Mg5o
、・りH,O培地で良(生育する。
上述の耐熱性ザルコシン・オギシダーゼN生産能を有す
る本菌株の分類学的諸性質を、「バージエイス・マニュ
アル番オプ・デターミネイテイフ。
・バクテリオロジー」第8版(1974を年)の分類と
対比すると1本菌株ハ1.ダラム染色性が陽性。
好気性の内生胞子をつ(る桿菌であることにより、バチ
ルス属に属する菌であり、しかも胞子が楕円められす、
極めて好気性であり、3Cでは生育しないことより、バ
チルス・ファーマス(Bacillusfirmus)
、バチルス・プレビス(Bacillus brevi
s)、バチルス・ファスチディオサス(Bacillu
sfastidiosus )、バチルス・フロイデン
ライチイ(Bacillus freudenreic
hii )、バチルス・バデイウス(Bacillus
 badius )等のいづれかに入るものと考えられ
るが、バチ゛ルス・ファーマスではグルコースより酸化
的に酸をつ(ること、ビオチンを要求すること、バチル
ス・ファスチデイオサスでは尿酸を強力に分解してアル
カリ性になり。
硝酸を還元しないこと、バチルス・フロイデンライチイ
では尿素を利用してアルカリ性になること。
バチルスΦバディウスではコロニーが根状又ハ毛状に生
育することより、本菌株と異なり、最も良く性質の似て
いるバチルス・プレピストハチロジンの加水分解、s 
係NaC1で生育する点で本菌株スピー(Bacill
us sp、 ) NS−/ユタは1通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄纂d71号(
FERM BP−t 7 / )として寄託されている
次に、本発明で使用する培地としては、炭素源。
窒素源、無機塩、その他の栄養素を適宜混ぜていれば1
合成培地、天然培地のいずれ本使用可能である0炭素源
としては1例えばクレアチニン、クレアチン、ザルコシ
ン、クエン駿、脂肪酸等を用いることができる。窒素源
としては、例えばペプトン、カゼイン消化物、大豆粉等
の蛋白質物または蛋白性消化物、あるいは酵母エキス等
の窒素性有機物等が好適に使用できる。無機物としては
例えばナトリウム、カリウム、マンガン、マグネシウム
、カルシュラム、鉄、コバルト等の塩類が使用できる。
本発明においては、クレアチニン又はクレアチン又はザ
ルコシンを含有する培地で培養したときに耐熱性ザルコ
シン・オキシダーゼNが最も収量良(得られる。該培養
培地の好適な例としては、例えばザルコシンo、tr係
、酵母エキス。1g%。
ポリペプトン2%、燐酸水素1カリウム□、or%、燐
酸水素2カリウムo、ojq)、硫酸マグネシラlhQ
、0/%、硫醗鉄o 、oos%、pH6,z    
1の培地例が挙げられる。
培養は通常26 C−KθCの範囲で、好適には30C
付近で行われる。培養開始のpHは通常6−gの範囲で
、好適には6.!付近である。このような条件下で、/
4〜2Z時間振盪又は深部攪拌すれば、培養物中に耐熱
性ザルコシン・オキシダーゼNが効率良(生成蓄積する
本酵素は、培養時間を長(すると菌が溶菌して菌体外に
生産されるようにもなるが、通常は菌体中に存在するの
で、培養物を遠心分離又は濾過等によって集菌し、適量
の緩衝液中で菌体を破砕〔超音波破砕、溶菌酵素を用い
る方法、機械的破砕。
化学的自己消化等〕して酵素を可溶化することによって
溶液中に遊離させる。このようにして得られた酵素含有
液より、核酸と菌体細胞壁を常法により除去し、濾過又
は遠心分離によって不溶物を除き、耐熱性ザルコシン・
オキシダーゼNを得る。
そして本酵素は、必要により酵素の単離精製の常f:V
C従って1例えば(1)DEAE−セルロースのカラム
クロマトグラフィー、(2)硫安分画、C3)QAE−
セファデックスのカラムクロマトグラフィー、(4)T
SK−GELブチルート−ヨーパール630C〔東洋ソ
ーダ(株)製〕の疎水クロマトグラフィー、(5)セフ
ァデックスによるゲル濾過等の方法、又はその他の方法
を必要に応じて組み合わせて用いることにより精製酵素
を得ることができる。本酵素の精製の具体例を示すと次
のとおりである。
割合で加え、32Cで3θ分間溶菌後、これに硫酸マン
ガン、ポリエチルイミン、硫酸プロタミン。
ストレプトマイシン等の除核酸剤を加え、沈澱物をセル
ロース濾過する。得られた酵素液をIOCで、ノー2時
間処理後、再びセルロース濾過し。
次にこのF液を、θ。Q1モル、pHg、θの燐酸緩衝
液で予じめ緩衝化したQAE−セファデックスA−tθ
カラムに吸着させた後、Q、1モルの食塩含有0.0ノ
モル、pHg、0の燐酸緩衝液で洗い、ついで0.7〜
0.6モルの食塩濃度勾配溶出を行なう0溶出してきた
活性区分を集め、硫安をコ01−//θθ祷の割合にな
るように溶解させ、これを前以ってコθ%硫安含W0.
01モル、pHg、θ燐酸緩衝液で緩衝化しておいたT
SK−GELブチル゛−トーヨーパールtroc〔東洋
ソーダ(株)製〕カラムに通して該カラムに酵素を吸着
させ、同緩衝液でカラムを洗浄後、ノθ係硫安含有θ、
θノモル、pHg、θ燐酸緩衝液で溶出すると、黄色の
酵素が溶出して(る。次いで、活性区分をセファデック
スG−/r00カラムクロマトグラフィー(前以ってカ
ラムをQ、1モル食塩含有の0.01モル、pHg、θ
燐酸緩衝液で緩衝化してお()を行ない1本酵素の活性
区分を分取し、これを濃縮した後、凍結乾燥して本酵素
の精製酵素粉末を得たO 〔発明の効果〕 本発明は、例えば腎臓機能の疾患、筋肉疾患等の診断の
際に用いられる定量用酵素として極めて有用な耐熱性ザ
ルコシン・オキシダーゼNを提供するとともに、この酵
素を効率良(得ることのできる方法を提供するものであ
るので1本発明は産業上極めて宵意義である。
〔実施例〕
以下に本発明の実施例を示す。
バチルス・エスピー(Bacillus sp、 ) 
NN5−129(FERBP−g 7 t )をroo
ms坂ロフラメロフラスコ中ン培地lθθaに植菌し、
3θCで16時間培養した。この種培養物を30!のジ
ャーファーメンタ−中のザルコシン00g%、ポリベブ
トンコ%、酵母エキスo、troj)、燐酸水素1カリ
ウム0,0j4)、燐酸水素2カリウムo、oj%、硫
酸マグネシウムo、ot4、硫酸鉄o 、 oos曝の
釦虜シ百−Fる懸登串音協袖(nT−Tに ぐ1りn!
に接種し1通気量20J!I1分、攪拌速度3jθrp
mの条件下で30CでIg時間培養し、培養物を遠心分
離機にて遠心分離して集菌した。
その培養菌体の一部(1109−1に0.0ノモル燐酸
緩衝液(pi(g 、θ)J、jBを加え、菌を良く分
散させ、次にこれに卵白リゾチームIQθ■を加え、3
7Cで1時間溶菌させ、引き続きIOCで2時間加熱し
て夾雑蛋白を変性させ1次にこれにプロタミン硫酸の飽
和溶液(pH7,jlを沈澱が生成しな(なるまで添加
し、ついでセルロースパウダーをjl加え良(攪拌し、
P紙濾過を行なった。このF液を、0.05モルNaC
1含有0.01モル燐酸緩衝液p)(g 、θで緩衝化
したQAE−セファデックスA−jOカラム(ファーマ
シ了社製。
ixyocm)に通し、酵素を吸着させ、θ、7モルN
aC1含有θ、θノモル燐酸緩衝M pHg 、θで良
(洗浄し、続いてNaC10、/−o 、 4 モA/
の濃度勾配で溶出して活性区分を集めた。次に、この酵
素溶出液に、硫安を20)/ / 00 rnlの割合
で溶解させた後、予じめコQ%硫安含有0.01モル燐
酸緩衝液CpHg、0)で緩衝化したTSK−GELブ
チルート−ヨーバールtsoCカラム(3×)θCrn
)に吸着させ、同硫安緩衝液で洗浄後、IQ%硫安含有
0,01モル燐酸緩衝液で溶出させた0活性区分をアミ
コン社製限外濾過装置C分画膜100θQ)にて濃縮後
、セファデックスG−izθを充填したカラムC1,2
×100cm、Q、1モルNaCl含有、001モル燐
酸緩衝液pHg 、0で緩衝化してお()にかけゲル濾
過した。
得られた活性区分を限外f過装置で約3rIL7!まで
濃縮後、凍結乾燥した。その結果、黄色の精製酵素粉末
り0.タダが得られ、比活性は30./単位/m9で1
回収率は/7.1%であった。
【図面の簡単な説明】
第2図は本酵素の至適pHを示す図であり、第2図は本
酵素の作用適温の範囲を示す図であり、第3図は本酵素
の熱安定性を示す図であり、ga図は本酵素の1)H安
定性を示す図である。 出願人 財団法人 野田産業科学研究所H 第2図 35  4.5  55  65  75pH 手  続  補  正  書 昭和60年70月30日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 1、事件の表示 昭和60年特許願第19♂9号 2、発明の名称 耐熱性ザルコシン・オキシダーゼN及びその製造法4、
代理人 住所 郵便番号 /7/ 東京都豊島区雨池袋二丁目12番!号〔英ビル)゛〈−
2 5、補正命令の日付 自  発  補  正 6、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 7、補正の内容 (1)明細書筒グ頁第io行の「クレアチニン+H20
#クレアチニン」を「クレアチニン+ H20#クレア
チン」と訂正します。 (2)明細書第1コ頁第10行のjo、rN酢酸液」を
「1.θN酢酸液」と訂正します〇−□□□□□

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)以下の理化学的性質を有する耐熱性ザルコシン・
    オキシダーゼNo (a)作用: ザルコシンを酸化分解して、グリシン、 ホルムアルデヒド、及び過酸化水素を生成する下記の酵
    素反応を触媒する酵素である。 ザルコシン+H_2O+O_2→ グリシン+ホルムアルデヒド+H_2O_2(b)基質
    特異性: ザルコシンに対するKm値(ミカエリス 定数)は37℃、pH7.7(リン酸緩衝液)で4.7
    ミリモルである。 (c)至適pH及び安定pH範囲: 至適pHは、ザルコシンを基質とした場 合、pH6.7〜10.0である。 安定pH範囲はpH6.5〜11.5である。 (d)作用適温の範囲: 45〜60℃の範囲にある。 (e)熱安定性: 55℃、10分間の処理で98%の酵素 活性を保持し、60℃、10分間の処理でも75%の残
    存活性を示す。 (f)分子量: セフアデツクスG−150を用いたカラ ムゲルろ過法で測定した結果、約49000である。 (g)フラビン酵素蛋白: フラビン・アデニン・ジヌクレオチド( FAD)が酵素蛋白に共有結合し、結合比は1:1であ
    る。
  2. (2)耐熱性ザルコシン・オキシダーゼNを生産するバ
    チルス属に属する微生物を培地に培養し、培養物より該
    耐熱性ザルコシン・オキシダーゼNを採取することを特
    徴とする耐熱性ザルコシン・オキシダーゼNの製造法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6359885A (ja) * 1986-08-29 1988-03-15 Kikkoman Corp 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼnの製造法
JPS6359893A (ja) * 1986-08-29 1988-03-15 Kikkoman Corp 新規な組み換え体dna
US4740465A (en) * 1985-01-11 1988-04-26 Noda Institute For Scientific Research Heat-resistant sarcosine oxidase N and process for producing the same
WO2004044193A1 (ja) 2002-11-13 2004-05-27 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha 改変型ザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物
CN109957553A (zh) * 2019-04-04 2019-07-02 大连大学 一种产肌氨酸氧化酶的芽孢杆菌的发酵产酶方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3519218A1 (de) * 1985-05-29 1986-12-04 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung
JP2593481B2 (ja) * 1987-08-10 1997-03-26 旭化成工業株式会社 サルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するdnaおよびその用途
US4826762A (en) * 1987-10-23 1989-05-02 Massachusetts Industry Of Technology Enzymatic temperature change indicator
AU4677793A (en) * 1992-07-14 1994-01-31 Genzyme Corporation A highly specific sarcosine oxidase
DE19514004A1 (de) * 1995-04-13 1996-10-17 Heike Dr Juergens Verfahren zur quantitativen Bestimmung von reversibel wirkenden Inhibitoren der Oxidoreduktasen

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6029473B2 (ja) * 1977-10-04 1985-07-10 東洋醸造株式会社 ザルコシン・オキシダ−ゼの製法
JPS5692790A (en) * 1979-12-26 1981-07-27 Hideaki Yamada Preparation of sarcosine oxidase
JPS61162174A (ja) * 1985-01-11 1986-07-22 Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼn及びその製造法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4740465A (en) * 1985-01-11 1988-04-26 Noda Institute For Scientific Research Heat-resistant sarcosine oxidase N and process for producing the same
JPS6359885A (ja) * 1986-08-29 1988-03-15 Kikkoman Corp 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼnの製造法
JPS6359893A (ja) * 1986-08-29 1988-03-15 Kikkoman Corp 新規な組み換え体dna
JPH0632608B2 (ja) * 1986-08-29 1994-05-02 キッコーマン株式会社 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼnの製造法
WO2004044193A1 (ja) 2002-11-13 2004-05-27 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha 改変型ザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物
CN109957553A (zh) * 2019-04-04 2019-07-02 大连大学 一种产肌氨酸氧化酶的芽孢杆菌的发酵产酶方法

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