JP4405324B2

JP4405324B2 - 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法

Info

Publication number: JP4405324B2
Application number: JP2004184690A
Authority: JP
Inventors: 圭介古川; 直樹梶山
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2003-11-18
Filing date: 2004-06-23
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2024-06-23
Also published as: US20050287624A1; DE102004055686A1; US7132253B2; JP2005168487A; DE102004055686B4

Description

本発明は、Ｎ−エチルグリシンに対する反応性が改変前の酵素と比べて低下した改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法に関する。

ザルコシンオキシダーゼは、ザルコシンを加水分解してグリシン及びホルムアルデヒドを生成する触媒作用を有する酵素であり、ヒトの血清中又は尿中のクレアチニン量の測定に用いることができ、腎臓病をはじめとする各種の疾患の診断薬として利用することができる。
従来、ザルコシンオキシダーゼは、例えば、コリネバクテリウム属（例えば、非特許文献１参照。）、バチルス属（例えば、特許文献１参照。）、シリンドロカーボン属（例えば、特許文献２参照。）、シュードモナス属（例えば、特許文献３参照。）、アースロバクター属（例えば、特許文献４参照。）等の菌株により生産されることが知られている。
また、本発明者等は、バチルス属よりザルコシンオキシダーゼ遺伝子（例えば、特許文献５参照。配列番号２記載）を単離し、遺伝子工学的手法により本酵素を大量に発現させることに成功した（例えば、特許文献５参照。）。
しかしながら、ザルコシンオキシダーゼは、麻酔剤の代謝産物であるＮ−エチルグリシンに対しても反応することが知られており、ザルコシンオキシダーゼを使用した試薬は、Ｎ−エチルグリシンの影響を受け、クレアチニン又はクレアチンの正確な測定が不可能であった。

J.Biochem.，89，1981，p.599 特開昭54-52789号公報特開昭56-92790号公報特開昭60-43379号公報特開平2-265478号公報特開平5-115281号公報

このような状況下において、Ｎ−エチルグリシンに対する反応性の低下したザルコシンオキシダーゼの開発が望まれていた。

そこで、本発明者等は、上記課題に鑑み、バチルス由来のザルコシンオキシダーゼ遺伝子（特開平5-115281号公報、配列番号２記載）の遺伝子改変を行なった結果、Ｎ−エチルグリシンに対する反応性の低下したザルコシンオキシダーゼを取得することに成功し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、
（１）
下記の理化学的性質を有する改変型ザルコシンオキシダーゼ。
（ａ）作用：１モルのザルコシンを加水分解し、１モルのグリシン及び１モルのホルムアルデヒドを生成する。
（ｂ）基質特異性：Ｎ−エチルグリシンに対する反応性が、改変前の蛋白質に比べて、７０％以下である。
（ｃ）至適ｐＨ：8.0付近
（ｄ）安定ｐＨ範囲：6.5〜11.0
（ｅ）至適温度：55℃
（ｆ）熱安定性：55℃以下
（ｇ）分子量：約43,000（SDS−PAGE）
（２）
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎ−エチルグリシンに対する反応性が改変前の蛋白質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、Ｎ−エチルグリシンに対する反応性が改変前の蛋白質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
（３）
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎ−エチルグリシンに対する反応性が改変前の蛋白質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、Ｎ−エチルグリシンに対する反応性が改変前の蛋白質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
（４）
項目（３）記載のザルコシンオキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
（５）
項目（４）記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
（６）
項目（５）記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法。
（７）
項目（１）又は（２）記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定試薬。
（８）
項目（１）又は（２）記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチン測定試薬。
を提供するものである。

本発明の改変型ザルコシンオキシダーゼは、クレアチニン又はクレアチンの測定試薬として使用できる。
本改変型ザルコシンオキシダーゼを使用した試薬は、Ｎ−エチルグリシンの影響を受けにくいことから、これまで以上に正確な測定が可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のザルコシンオキシダーゼは、ザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子を改変することにより得ることができる。改変に用いるザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、特に限定されず、例えば、バチルス属由来ザルコシンオキシダーゼ遺伝子（特開平5-115281号公報記載）等を挙げることができる。

上記遺伝子を改変する手法としては、既知の如何なる方法でもよく、例えば、前記バチルス属由来ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含むザルコシンオキシダーゼ発現プラスミド（pSOM1）(特開平5-115281号公報記載)に、ハイドロキシルアミン、亜硝酸等の化学変異剤を接触させる方法又はＰＣＲ法を用いてランダムに変換する方法等の点変異、市販のキットを利用する部位特異的な置換又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法；この組み換え体プラスミドＤＮＡを選択的に開裂し、次いで、選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
用いられるベクターＤＮＡは、如何なるものでもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ又はバクテリオファージＤＮＡ等でもよい。

次いで、上記処理後の組み換え体ＤＮＡを、例えば、脱塩カラム、QIAGEN(フナコシ社)等を用いて精製し、種々の組み換え体ＤＮＡを得る。

このようにして得られた種々の組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K12、好ましくは大腸菌DH5α、大腸菌JM109(東洋紡績社製)、XL1-Blue〔STRATAGENE社製〕等を形質
転換又は形質導入し、種々の変異の導入されたザルコシンオキシダーゼ遺伝子を保有する組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を得ることができる。

次いで、ザルコシンオキシダーゼのＮ−エチルグリシンに対する反応性を確認し、改変前のザルコシンオキシダーゼと比べてＮ−エチルグリシンに対する反応性が低下した形質転換体又は形質導入体を得る。

このようにして得られた形質転換体又は形質導入体を、栄養培地で培養することにより大量の改変型ザルコシンオキシダーゼを生産させることができる。培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。

なお、培地の初発pHは、7〜9に調整するのが適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃前後で6〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物よりザルコシンオキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。

培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からザルコシンオキシダーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体からザルコシンオキシダーゼを採取するのが好ましい。

このようにして得られた粗酵素液からザルコシンオキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。

（酵素活性）
本酵素の活性の測定は、下記条件下で行なった。なお、1分間に1マイクロモルの尿素を生成する酵素活性を1単位とする。

（試薬調製）
反応用試薬として、以下の溶液を調製した。
1)0.2M ザルコシン，100mM Tris-HCl，2mM KCl，0.05% Triton-X100(pH7.7)又は10mM Ｎ−エチルグリシン，100mM Tris-HCl，2mM KCl，0.05% Triton-X100(pH7.7)
2)80U/ml POD溶液
3)0.2% phenol溶液
4)0.2% 4-aminoantipyrine溶液
5)0.3% SDS 溶液
6)20mM Tris-HCl，1mM KCl，0.2% BSA(pH7.7)（酵素希釈液）

次いで、上記各溶液を以下の数量混合し、活性測定液を調製した。
1)5ml
2)1ml
3)2ml
4)1ml

測定は、以下のようにして行なった。
1)活性測定液 0.95mlを37℃、5分間プレインキュベーションする。
2)酵素液（0.04U/ml〜0.16U/mlに酵素希釈液で調整）0.05mlを添加混合する。
3)37℃において10分間反応させる。
4)10分間の反応後、上記0.3% SDS溶液を混合する。
5)25℃にて10分間放置後、495nmの吸光度を測定する。（ＯＤsample）
ブランク値は、酵素液の混合前に0.3% SDS溶液を混合することによって測定する。
（ＯＤblank）

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。

組み換え体プラスミドＤＮＡ（ｐSOM1）の含まれる大腸菌E.coli JM109(pSOM1)（ＦＥＲＭＢＰ−３６０４）を、LB培地（DIFCO社製）にて培養し、菌体を集菌した後、そこからQIAGEN(QIAGEN社)を使用して組み換え体プラスミドＤＮＡ pSOM1 を抽出、精製した。得られた組み換え体プラスミドは、約100μｇであった。

得られたプラスミドをもとにN末端、C末端用プライマー（配列番号３及び４）を用いてエラープローンPCRを行なった。具体的には、これらのプライマーにてマンガン濃度0.075mM下でEx-taq（宝酒造社製）を使用し、pSOM1に対してPCR増幅反応を行なった。
反応終了後、種々な変異の導入されたザルコシンオキシダーゼ遺伝子増幅断片をBamHI及びSpeIにて制限酵素処理した後、未変異の組み換え体プラスミドＤＮＡpSOM1のBamHI及びSpeI消化物にT4リガーゼ(ベーリンガー社製)を用いてライゲーションした。ライゲーション終了後、反応液をコンピテントHiE.coli JM109(東洋紡績社製)で形質転換し、形質転換体コロニーを得た。

次いで、得られたコロニーを、2ml TY培地（25μg/ml カナマイシン、1mM IPTGを含む）にて培養した。37℃で18〜24時間の培養の後、遠心分離にて菌体を集菌して20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM KCl(pH7.7)に置換して超音波破砕を行ない、遠心分離（12000r.p.m.、3分間）を行なった。
得られた破砕上清の活性を、ザルコシン及びＮ−エチルグリシンを基質として測定した。
変異前の酵素と比較して、ザルコシンに対する活性が同等程度であり、Ｎ−エチルグリシンに対する活性が減少している酵素をスクリーニングした。

上記の酵素を生産する株よりプラスミドを分離し、ｐＳＯＭ5と命名した。［このｐＳＯＭ5は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭＢＰ−１００２５（ＦＥＲＭＰ−１９５８７号より移管）として寄託されている。］本プラスミドがコードしているザルコシンオキシダーゼの塩基配列をCEQ2000 DNA SequencingSystem(ベックマンコールター社製)を用いて決定したところ、本発明のザルコシンオキシダーゼは、２６９番目のチロシンがヒスチジンに置換されていることが判った。（配列番号１）

上記のようにして得られた改変ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌(E.coli)JM109（ｐＳＯＭ５）を、25μg/ml カナマイシンを含むＴＹ培地（1% バクト−トリプトン、0.5% バクト−イーストエクストラクト、0.5%％ＮａＣｌ、ｐＨ7.5）100mlにて37℃で16時間振とう培養した後、同様に調製した１LのＴＹ培地（但し、1mM IPTGを含む）に10ml接種した。接種後、回転数120r.p.m.、37℃にて約20時間培養した。

ステップ１（粗酵素液の調整）
培養終了後、培養液1Ｌに対して遠心分離操作を行なって菌体を集菌し、50mlの20mM Tris-HCl、50mM EDTA(ｐH8.0)で菌体の懸濁を行なった。
このようにして得られた菌体懸濁液に対して超音波破砕を行ない、菌体を破砕して粗酵素液を得た。

ステップ２（硫安沈澱処理）
このようにして得られた粗酵素50mlに対して20%の硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行なった。
硫安沈殿後、50mM KCl、20mM Tris-HCl及び2mM EDTAからなる緩衝液に沈殿を溶解させた。

ステップ３（DEAE−トヨパールイオン交換クロマト）
DEAE−トヨパール（TOSO社製）300mlを充填したカラムに上記粗酵素液を吸着させ、600mlの100mM KCl、20mM Tris-HCl、2mM EDTA(pH8.0)で洗浄した後、150mM KCl、20mM Tris-HCl、2mM EDTA(pH8.0)で溶出を行なった。溶出終了後、精製度の高い画分を回収し、濃縮、150mM KCl、2mM EDTAを含む50mMリン酸緩衝液にて透析を行なった。

ステップ４（セファデックスG-75 ゲルろ過処理）
150mM KCl、2mM EDTAを含む50mM リン酸緩衝液でバッファライズしたセファデックスG-75（ファルマシア社製）200mlを充填したカラムに、ステップ3で処理した酵素液15mlをチャージしてゲルろ過を行なった。得られた精製酵素のOD280nmあたりの活性は、約27Uであった。

上記の方法で精製した改変型ザルコシンオキシダーゼ及び改変前のザルコシンオキシダーゼのＮ−エチルグリシンに対する反応性をザルコシン活性を1.0U/mlに統一して比較した。
改変前ザルコシンオキシダーゼの活性を100％としたとき、改変型ザルコシンオキシダーゼ（Ｙ２６９Ｈ）のＮ−エチルグリシンに対する活性は66.6％であった。

上記の通り、得られた改変型ザルコシンオキシダーゼのＮ−エチルグリシンに対する反応性は、低下していることが明らかとなった。
また、改変型ザルコシンオキシダーゼの理化学的性質は、次の通りであった。
至適ｐＨ：8.0付近
安定ｐＨ範囲：6.5〜11.0
至適温度：55℃
熱安定性：55℃以下（pH7.5,10分間）
分子量：約43,000（SDS−PAGE）

Claims

以下の（ａ）の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
以下の（ａ）の改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
請求項２記載のザルコシンオキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
請求項４記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法。
請求項１記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定試薬。
請求項１記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチン測定試薬。