JP4405324B2 - 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法 - Google Patents
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Description
従来、ザルコシンオキシダーゼは、例えば、コリネバクテリウム属(例えば、非特許文献1参照。)、バチルス属(例えば、特許文献1参照。)、シリンドロカーボン属(例えば、特許文献2参照。)、シュードモナス属(例えば、特許文献3参照。)、アースロバクター属(例えば、特許文献4参照。)等の菌株により生産されることが知られている。
また、本発明者等は、バチルス属よりザルコシンオキシダーゼ遺伝子(例えば、特許文献5参照。配列番号2記載)を単離し、遺伝子工学的手法により本酵素を大量に発現させることに成功した(例えば、特許文献5参照。)。
しかしながら、ザルコシンオキシダーゼは、麻酔剤の代謝産物であるN−エチルグリシンに対しても反応することが知られており、ザルコシンオキシダーゼを使用した試薬は、N−エチルグリシンの影響を受け、クレアチニン又はクレアチンの正確な測定が不可能であった。
(1)
下記の理化学的性質を有する改変型ザルコシンオキシダーゼ。
(a)作用:1モルのザルコシンを加水分解し、1モルのグリシン及び1モルのホルムアルデヒドを生成する。
(b)基質特異性:N−エチルグリシンに対する反応性が、改変前の蛋白質に比べて、70%以下である。
(c)至適pH:8.0付近
(d)安定pH範囲:6.5〜11.0
(e)至適温度:55℃
(f)熱安定性:55℃以下
(g)分子量:約43,000(SDS−PAGE)
(2)
以下の(a)、(b)又は(c)の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、N−エチルグリシンに対する反応性が改変前の蛋白質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、N−エチルグリシンに対する反応性が改変前の蛋白質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
(3)
以下の(a)、(b)又は(c)の改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、N−エチルグリシンに対する反応性が改変前の蛋白質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、N−エチルグリシンに対する反応性が改変前の蛋白質と比べて低下したザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
(4)
項目(3)記載のザルコシンオキシダーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え体DNA。
(5)
項目(4)記載の組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
(6)
項目(5)記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法。
(7)
項目(1)又は(2)記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定試薬。
(8)
項目(1)又は(2)記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチン測定試薬。
を提供するものである。
本改変型ザルコシンオキシダーゼを使用した試薬は、N−エチルグリシンの影響を受けにくいことから、これまで以上に正確な測定が可能となる。
本発明のザルコシンオキシダーゼは、ザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子を改変することにより得ることができる。改変に用いるザルコシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、特に限定されず、例えば、バチルス属由来ザルコシンオキシダーゼ遺伝子(特開平5-115281号公報記載)等を挙げることができる。
用いられるベクターDNAは、如何なるものでもよく、例えば、プラスミドDNA又はバクテリオファージDNA等でもよい。
転換又は形質導入し、種々の変異の導入されたザルコシンオキシダーゼ遺伝子を保有する組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体を得ることができる。
本酵素の活性の測定は、下記条件下で行なった。なお、1分間に1マイクロモルの尿素を生成する酵素活性を1単位とする。
反応用試薬として、以下の溶液を調製した。
1)0.2M ザルコシン,100mM Tris-HCl,2mM KCl,0.05% Triton-X100(pH7.7)又は10mM N−エチルグリシン,100mM Tris-HCl,2mM KCl,0.05% Triton-X100(pH7.7)
2)80U/ml POD溶液
3)0.2% phenol溶液
4)0.2% 4-aminoantipyrine溶液
5)0.3% SDS 溶液
6)20mM Tris-HCl,1mM KCl,0.2% BSA(pH7.7)(酵素希釈液)
1)5ml
2)1ml
3)2ml
4)1ml
1)活性測定液 0.95mlを37℃、5分間プレインキュベーションする。
2)酵素液(0.04U/ml〜0.16U/mlに酵素希釈液で調整)0.05mlを添加混合する。
3)37℃において10分間反応させる。
4)10分間の反応後、上記0.3% SDS溶液を混合する。
5)25℃にて10分間放置後、495nmの吸光度を測定する。(ODsample)
ブランク値は、酵素液の混合前に0.3% SDS溶液を混合することによって測定する。
(ODblank)
反応終了後、種々な変異の導入されたザルコシンオキシダーゼ遺伝子増幅断片をBamHI及びSpeIにて制限酵素処理した後、未変異の組み換え体プラスミドDNApSOM1のBamHI及びSpeI消化物にT4リガーゼ(ベーリンガー社製)を用いてライゲーションした。ライゲーション終了後、反応液をコンピテントHiE.coli JM109(東洋紡績社製)で形質転換し、形質転換体コロニーを得た。
得られた破砕上清の活性を、ザルコシン及びN−エチルグリシンを基質として測定した。
変異前の酵素と比較して、ザルコシンに対する活性が同等程度であり、N−エチルグリシンに対する活性が減少している酵素をスクリーニングした。
培養終了後、培養液1Lに対して遠心分離操作を行なって菌体を集菌し、50mlの20mM Tris-HCl、50mM EDTA(pH8.0)で菌体の懸濁を行なった。
このようにして得られた菌体懸濁液に対して超音波破砕を行ない、菌体を破砕して粗酵素液を得た。
このようにして得られた粗酵素50mlに対して20%の硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行なった。
硫安沈殿後、50mM KCl、20mM Tris-HCl及び2mM EDTAからなる緩衝液に沈殿を溶解させた。
DEAE−トヨパール(TOSO社製)300mlを充填したカラムに上記粗酵素液を吸着させ、600mlの100mM KCl、20mM Tris-HCl、2mM EDTA(pH8.0)で洗浄した後、150mM KCl、20mM Tris-HCl、2mM EDTA(pH8.0)で溶出を行なった。溶出終了後、精製度の高い画分を回収し、濃縮、150mM KCl、2mM EDTAを含む50mMリン酸緩衝液にて透析を行なった。
150mM KCl、2mM EDTAを含む50mM リン酸緩衝液でバッファライズしたセファデックスG-75(ファルマシア社製)200mlを充填したカラムに、ステップ3で処理した酵素液15mlをチャージしてゲルろ過を行なった。得られた精製酵素のOD280nmあたりの活性は、約27Uであった。
改変前ザルコシンオキシダーゼの活性を100%としたとき、改変型ザルコシンオキシダーゼ(Y269H)のN−エチルグリシンに対する活性は66.6%であった。
また、改変型ザルコシンオキシダーゼの理化学的性質は、次の通りであった。
至適pH:8.0付近
安定pH範囲:6.5〜11.0
至適温度:55℃
熱安定性:55℃以下(pH7.5,10分間)
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
Claims (7)
- 以下の(a)の改変型ザルコシンオキシダーゼ。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質 - 以下の(a)の改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質 - 請求項2記載のザルコシンオキシダーゼ遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え体DNA。
- 請求項3記載の組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
- 請求項4記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からザルコシンオキシダーゼを採取することを特徴とする改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法。
- 請求項1記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチニン測定試薬。
- 請求項1記載の改変型ザルコシンオキシダーゼを含むクレアチン測定試薬。
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