DE3687246T2 - Antitumor-polypeptid und dessen methode zur herstellung. - Google Patents
Antitumor-polypeptid und dessen methode zur herstellung.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft allgemein ein neues Antitumor-Polypeptid und speziell ein neues von Human-Zellen deriviertes Antitumor-Polypeptid
- - allgemein auch als Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) klassifiziert - mit selektiver Toxizität gegenüber Tumor- (auch transformierten oder neoplastischen) Zellen.
- Als von Human-Zellen deriviertes Antitumor-Polypeptid mit zytotoxischer Wirkung gegen L-929-Fibroblast-Zellen von Mäusen ist ein Polypeptid der Klasse TNF bekannt. Dieses wird erhalten aus einer Human-Zell-Linie HL-60 (ATCC 240) und zeigt eine praktisch vollständig bestimmte Aminosäure-Sequenz auf (The Journal of Biological Chemistry 260, 2345-2354 (1985)).
- Ein derartiges, Polypeptid wird auch durch Escherichia coli, transformiert mit einem rekombinanten Plasmid, erhalten (Nature 312, 724- 729 (1984, Dec. 20/27); Nature 313, 803-806 (1985; Feb. 28); Science 228, 149-154 (1985, Apr. 12)). Die so erhaltenen Polypeptide sind identisch mit dem oben beschriebenen TNF gemäß The Journal of Biological Chemistry 260, wenn dieses von der Basis-Sequenz der geklonten DNA abgeleitet ist - allerdings mit der Ausnahme, daß der in Nature 313 beschriebene TNF die zwei N-terminalen Aminosäuren nicht aufweist (Val und Arg).
- Die vorliegend beschriebene Erfindung schafft ein neues Antitumor- Polypeptid von ausgezeichneter Aktivität und ein Verfahren zur Herstellung desselben.
- Die Erfinder haben das genannte neue Antitumor-Polypeptid aus einer ein Differenziation induzierendes Agens enthaltenden Kultur speziell einer Suspensions-Kultur - von Human-Leukämiezellen THP 1 (Monozyten) erhalten (Int. J. Cancer 26, 171-176 (1980)), welche Zell-Linie von der oben angegebenen HL-60-Human-Zell-Linie verschieden ist.
- Fig. 1 zeigt die NaCl-Konzentration, welche es ermöglicht, die Antitumor-Aktivität zu eluieren, wenn ein das erfindungsgemäße Antitumor-Polypeptid enthaltendes Gemisch gemäß dem unten folgenden Beispiel 1(1) erhalten und mittels zweifacher FPLC gereinigt worden ist. Das Eluat wird auf die Absorption bei 280 nm geprüft sowie auf seine zytotoxische Aktivität.
- Fig. 2 zeigt die Kurve der Umkehr-FPLC-Eluierung von TNF-1 über einen linearen Acetonitril-Gradienten.
- Das erfindungsgemäße Antitumor-Polypeptid zeigt die folgende N-terminale Aminosäure-Sequenz:
- Val-A-Ser-X-Thr-B-Thr-C-D-E-F-G-Val-Ala-His-Val-Ala-Asn; worin A für Arg oder Lys, B für Arg oder Pro, C für Arg oder Pro, D für Ser oder Lys, E für Arg oder Pro, F für Lys oder Val, G für Phe, Pro oder Ala stehen und X eine nicht-identifizierte Aminosäure ist,
- enthaltend tryptische Peptid-Fragmente der folgenden Aminosäure- Sequenzen:
- F1 : Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln,
- F2: Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala,
- F3: Asn-Gln-Leu-Val-Val-X-X-X-Gly-Leu,
- F4: Ile-Ala-Val-X-Tyr,
- F5: Val-Asn-Leu-Leu,
- F6: Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala,
- F7: Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe und
- F8: Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu- Ser-Gly-Gln-Val-Tyr.
- und aufweisend die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
- (a) Molekulargewicht: 17400 ± 500 (SDS Electrophoresis);
- (b) Isoelektrischer Punkt: pI 5,7 ± 0,2 (Gel-isoelektrischer Punkt-Electrophoresis);
- (c) pH-Stabilität: stabil bei pH 6-9;
- (d) Temperatur-Stabilität: Aktivitäts-Verlust von etwa 60-70% bei ≥ 65ºC, während 1 h bei pH 7,0;
- (e) Stabilität gegenüber Protease: nicht aktiviert; und
- (f) Physiologische Aktivität: praktisch keine Zytotoxizität gegen normale Human-Zellen, aber Zytotoxizität gegenüber Human-Tumorzellen.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumor- Polypeptides umfaßt die Kultivierung von myelozytischen Human- Leukämiezellen THP-1 in Anwesenheit eines eine Differenziation induzierenden Agens oder nach Inkontaktbringen mit dem genannten Agens; vorteilhafterweise ist dabei die Zellkultur eine Suspensions- Kultur.
- Das eine Differenziation induzierende Agens ist eine oder mehrere Substanz(en), welche fähig ist/sind, bösartige Monozyt-Zellen in Makrophagen und in massiven Monozyt-Zellen zu induzieren; Beispiele solcher Substanzen sind: Haemin, Actinomycin D, Hexamethylenaclacinomycin A, Teleocidin, Mitomycin C, Bleomycin, Propionsäure, Na-Acetat, Cadaverin, Tunicamycin, 12-o-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), ein Lymphokyn wie γ-Interferon, D-Faktor, Arginase, Histon HI, Lipopolysaccharid (LPS), Lipid A, Glucocorticoid, 1d-12-Dehydroxyvitamin D&sub3;, Poly(I), Poly(ADP-Ribose), BCG und Chloroquin.
- Das Inkontaktbringen der Human-Akut-Leukämiezellen THP-1 (Monozyten) mit dem die Differenziation induzierenden Agens kann während des Kultivierens, speziell während des Suspensions-Kultivierens der THP-1-Zellen geschehen. Das Antitumor-Polypeptid kann durch Kultivierung der THP-1-Zellen unter dauernder Anwesenheit des genannten Agens gewonnen werden. Nach dem Inkontaktbringen der THP-1-Zellen mit dem die Differenziation induzierenden Agens können die Zellen aber auch in ein anderes Kulturmedium ohne ein derartiges Agens transferiert werden. Im letztgenannten Fall kann ein extrazelluläres Stimulierungsagens dem zweiten Medium beigegeben werden.
- Das Stimulierungsagens ist eine Substanz, welche die Zellwände oder Lysozome so beeinträchtigt, daß endozelluläre Makromuleküle leichter aus der Zelle austreten. Illustrative Beispiele solcher Agentien sind Lipopolysaccharide, Lecithine und Vitamin A.
- Das Medium, in dem die THP-1-Zellen kultiviert werden, kann ein für die Kultivierung von Tier-Zellen übliches Medium sein. Das Rosewell Park Memorial Institute-1640-Medium, im folgenden RPMI-1640 genannt, ist ein geeignetes solches Medium. Andere bekannte Media, wie Dulbeccos Modified Eagle's Medium, Eagle's Minimum Essential Medium, im folgenden MEM-Medium genannt, und Chick-Medium können auch verwendet werden. Das Medium kann dabei wohl mit fötalem Rinderserum, im folgenden FBS genannt, neonatalem Rinderserum oder Pferde-Serum versetzt sein; ein serumfreies Medium ergibt jedoch üblicherweise sehr gute Resultate bei der Reindarstellung des erfindungsgemäßen Antitumor-Polypeptides.
- Die Suspensionr-Kultur wird dabei im allgemeinen mit 1 bis 5·10&sup6;/ml THP-1-Zellen angesetzt und zwar bei 35 bis 38ºC und unter einem 4- 6% CO&sub2;-haltigen Gasstrom.
- Das die Differenziation induzierende Agens wird üblicherweise zu Beginn der Kultivierung beigegeben, das extrazelluläre Stimulierungs- Agens entweder zu Beginn oder nach einem gewissen Wachstum der Zellen. Das erfindungsgemäße Antitumor-Polypeptid kann aber grundsätzlich ohne die Zugabe des Stimulierungs-Agens gewonnen werden; so wird v.a. die Reindarstellung des Polypeptides erleichtert.
- Die quantitative und qualitative Analyse des erfindungsgemäß hergestellten Antitumor-Polypeptides geschieht wie folgt:
- Als Ziel-Zellen werden L-929-Zellen (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3666-3670) in MEM mit 5% FBS gezüchtet bis zu einer Konzentration von 8·10&sup5; Zellen/ml Medium. Diese werden dann auf flachen Schalen mit 96 Probenvertiefungen unter konventionellen Bedingungen kultiviert (2 h, 37ºC, 5% 02, 100% HO). Nun wird dem Medium Actinomycin D zu einer Konzentration von 1 ug/ml zugegeben, die Menge an Kulturmedium gleichzeitig auf 150 ul gebracht. Dazu werden nun sofort 50 ul der mit MEM verdünnten Probe gegeben. Der Verdünnungsgrad wird kontrolliert, um die ED 50-Werte zu bestimmen. Die L-929- Zellen, die nun in einem Volumen vom 200 ul vorliegen, werden nun unter gleichen Bedingungen 18 h lang weiter kultiviert. Zur Bestimmung der Zell-Nekrose-Aktivität wird das gesamte Medium entfernt und die Zellen werden mit 2%-igem Methylalkohol plus 0,2% Crystal- Violett zwecks Fixierungsverfärbung versetzt. Die kariotischen Zellen werden dabei verfärbt, die abgetöteten und von der Unterlage abgelösten Zellen nicht; so läßt sich die Nekrose-Aktivität direkt anhand der Verfärbung bei OD 590 nm bestimmen. Die genannte Aktivität wird anhand von Einheits-Aktivität pro ml ausgedrückt; sie ist definiert als Verdünnungsgrad der Probe mit einer solchen, in der 50% der L-929-Zellen lebend vorliegen. Beispielsweise zeigt also eine Probe, die mit einem Volumen an Verdünnungsmittel verdünnt worden ist und zu ED 50 führt, eine Aktivität von 1 Einheit/ml.
- Das im Kulturmedium so angereicherte Antitumor-Polypeptid wird mittels bekannter Techniken rein dargestellt; Beispiele dafür sind: Ionenaustausch-Chromatographie unter Einsatz eines basischen Anionentauschers, Aussalzung, Dialyse, Gel-Filtration, Hydryphobe Chromatographie, Hochgeschwindigkeits-MS-Chromatographie und Elektrophorese.
- Zwei oder mehr der genannten Methoden können dabei kombiniert angewendet werden.
- An basischen Anionentauschern können spezifisch eingesetzt werden: DEAE-Sephadex A-25 oder A-50, DEAE-Sepharose GL-6B, DEAE Sephamil (alle von der Pharmacia Inc.) oder auch Anionentauscher mit Diäthylamino-, Aminoäthyl- oder quarternären Aminoäthyl-Gruppen. Der in der Chromatographie eingesetzte Puffer ist bevorzugterweise Tris-HCl oder Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,0 bis 9,0. Die das Antitumor- Polypeptid enthaltende Flüssigkeit wird nun mit einem solchen Puffer der Konzentration ≥ 0,05 M verdünnt, um eine Lösung mit einer Salzkonzentration von ≤ 0,1 M zu erhalten. Diese Flüssigkeit wird nun auf den Ionentauscher gegeben, das Polypeptid wird adsobiert. Die Eluierung des Antitumor-Polypeptides wird mit Salzlösungen wie 0,1 bis 0,2 M NaCl oder KCl durchgeführt, die vollständige Eluierung des Polypeptides geschieht bei einer nahezu 0,2 M-Salzkonzentration. Verfahren kann dabei an einer Kolonne oder in Einzelansätzen (batches) werden. Vor dem Ionenaustausch-Schritt kann die Probe vorteilhafterweise mittels geeigneter Membranen ultrafiltriert werden, um so niedermolekulare Substanzen zu entfernen und den Wirkungsgrad der Reindarstellungs-Methoden zu erhöhen.
- Die so erhaltene Lösung des Polypeptides wird dann der Dialyse und darauf der Gel-Filtration unterworfen. Als Filtermedium wird dabei eingesetzt: Sephadex D-75 oder G-100 (Pharmacia Inc.), Sephacryl S-200 (Pharmacia Inc.), Biogel P-100 (Biorad Inc.) oder Toyo Pearl HW-50 oder HW-55 (Toyo Soda Industry Co., Ltd.). Als Puffer wird bevorzugterweise Tris-HCl oder Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert zwischen 6,0 und 9,0 eingesetzt. Um Adsorption zu verhindern, wird ein Salz, bw. NaCl, in Mengen von 0,2 bis 0,5 M zugegeben. Dieser Verfahrensschritt ergibt normalerweise eine 2- bis 10-fache Erhöhung der Reinheit.
- Die so erhaltene Lösung des Antitumor-Polypeptides kann nun mittels hydrophobischer Chromatographie weiter gereinigt werden. Als feste Phase kann Butyl Toyo Pearl 650 (Toyo Soda Industry Co., Ltd.) eingesetzt werden. Die Eluationslösung enthält vorteilhafterweise Ammoniumsulfat oder NaCl. In diesem Verfahrensschritt wird eine Erhöhung des Reinheitsgrades um einen Faktor von 5 bis 30 erreicht; wiedergewonnen werden mindestens 80% des Polypeptides. Die spezifische Aktivität des Antitumor-Polypeptides nach diesem Reindarstellungs-Schritt ist 1·10&sup6; oder höher und der Dehalt an Polypeptid beträgt ≥ 1,0%.
- Die so erhaltene, das gesuchte Polypeptid enthaltende Lösung wird auch der highperformance-Anion-Austausch-Chromatographie unterworfen. Verwendet wird dazu das Polynucleotide-Liquid-Chromatographie- System FPLC mit Mono Q HR5/5-Kolonnen der Pharmacia Inc. Damit wird ein weiter gereinigtes Polypeptid erhalten. Dieser zusätzliche Reinigungsschritt führt zu einer 5- bis 10-fachen Erhöhung des Reinheitsgrades, wobei 70 bis 90% der Polypeptid-Aktivität wiedergewonnen werden. Die Bedingungen, unter denen dieser FPLC-Schritt ausgeführt wird, sind die gleichen, wie die oben beschriebenen, für die Anionen-Austausch-Chromatographie verwendeten.
- Die so erhaltene Lösung des Antitumor-Polypeptides kann schließlich noch weiter gereinigt werden und zwar mittels der SDS-Elektrophorese und einer Wiederholung der FPLC-Methode, immer mit Mono Q HR5/5- Kolonnen. Mittels dieser letzten Reinigung wird zugleich ein homogen aktives Protein erhalten. Dabei steigt der Grad der Reinheit um das 5- bis 10-fache und die spezifische Aktivität wird auf 5·10&sup8; Einheiten/mg Protein erhöht.
- Hierauf wird das derart gereinigte Polypeptid nochmals einer Ionen- Chromatographie in einem FPLC-System wiederum mit Mono Q HR5/5-Kolonnen unter verschiedenen Eluierungsbedingungen unterworfen; dabei stellt man drei verschiedene Aktivitätspeaks fest. Das Material jedes Peaks wird nun nochmals der FPLC unterworfen mit den gleichen Eluierungsbedingungen, um so drei verschiedene Arten von aktivem Protein zu erhalten, diese werden mit TNF-1, TNF-2 und TNF-3 bezeichnet. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser drei Proteine und ihre spezifische Aktivität gegenüber L-929-Zellen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: Molekular-Gewicht Isoelektrischer Punkt Spezifische Aktivität
- Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich, zeigen die drei Polypeptide keine Differenzen hinsichtlich des Molekulargewichtes und des Isotropischen Punktes. Die drei Polypeptide zeigen aber hinsichtlich der spezifischen Aktivität verschiedene Werte. TNF-1, TNF-2 und TNF-3 haben alle N-terminale Aminosäure-Sequenzen gemäß der unten folgenden Darstellung:
- In den oben angegebenen Aminosäure-Sequenzen ist die vierte Aminosäure-Sequenz mit X bezeichnet und mittels Dampf-Phasen-Aminosäure- Sequenz-Analyse nicht bestimmbar. Diese Aminosäure ist aber sicher nicht Serin. Es ist möglich, daß X für Cystein steht, diese Aminosäure kann jedoch mittels der genannten Methode nicht bestimmt werden. Hier kann nun auch die N-terminale Aminosäure-Sequenz der oben angegebenen TNF aus Human-HL-60-Zellen angegeben werden:
- Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val.
- Die Aminosäure-Sequenz von TNF-1, TNF-2 und TNF-3 differiert von der eben genannten TNF-Sequenz vor allem dadurch, daß bei den ersten Polypeptiden die vierte Aminosäure nicht Ser, die fünfte Aminosäure Thr anstelle von Ser und die zehnte Aminosäure Arg oder Pro anstelle von Asp sind. Zudem ist die zwölfte Aminosäure in TNF-1 Phe. Daher kann gesagt werden, daß die erfindungsgemäßen Antitumor-Polypeptide sich von den bekannten TNF unterscheiden.
- Die veröffentlichte, japanische Patentanmeldung Nr. 60-19719 (nicht geprüft) veröffentlicht die N-terminale Aminosäure-Sequenz der Kaninchen-TNF-Reihe:
- Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val;
- auch diese Sequenz unterscheidet sich von der HL-60-TNF dadurch, daß die erstere zwei N-terminale Aminosäuren nicht aufweist und andere Aminosäuren an den Plätzen vier, sieben, acht und dreizehn zeigt. Allerdings zeigen die größeren Abschnitte der Sequenz, daß zwischen den TNF-Linien von Kaninchen und der HL-60-TNF-Linie keine Differenzen bestehen.
- Das erfindungsgemäße Antitumor-Polypeptid (eine Mischung von TNF-1, TNF-2 und TNF-3) zeigt eine einfache Bande in der Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese mit Trypsin. Wenn so 100 ul einer wäßrigen Lösung mit 100 ug des erfindungsgemäßen Antitumor-Polypeptides 3,3 ug Trypsin zugegeben werden und die Mischung 22 h lang bei 37ºC und pH 8,0 stehen gelassen wird und die so erhaltene Mischung anschließend einer RP318-Phasenumkehr-HPLC unterworfen wird (Kolonnen von Biorad Inc.), werden acht Fragmente F-1 bis F-8 erhalten. Jedes Fragment wird nun der Edman-Degradation unter Einsatz des Aminosäure-Sequenz- Analysators Modell 470A (Applied Biosystems Inc.) unterworfen, und die erhaltenen Phenylthiohydantion-Aminosäuren werden mittels HPLC analysiert (Apparatur Shimadzu LC-4A). Es zeigen sich für die genannten Fragmente die folgenden Resultate:
- F-1: Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln
- F-2: Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala
- F-3: Asn-Gln-Leu-Val-Val-X-X-X-Gly-Leu
- F-4: Ile-Ala-Val-X-Tyr
- F-5: Val-Asn-Leu-Leu
- F-6: Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala
- F-7: Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe
- F-8: Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser- Gly-Gln-Val-Tyr.
- Da alle Strukturen aus den Resultaten der Analyse der Fragmente F-1 bis F-8 in der Struktur von HL-60-TNF gefunden werden, wird angenommen, daß die Aminosäure-Sequenz nach dem Platz dreizehn nach der N-terminalen Aminosäure aller drei Polypeptide, d. h. TNF-1, TNF-2 und TNF-3, identisch ist mit derjenigen der HL-60-TNF-Linie.
- Vom hochgradig gereinigten Antitumor-Polypeptid gemäß dieser Erfindung wird angenommen, daß es keine Nebeneffekte gegenüber dem menschlichen Körper zeigt, wenn es richtig dosiert ist. Hingegen zeigt es Nekrose-Aktivität ausschließlich gegenüber Tumorzellen. Das gereinigte Antitumor-Polypeptid zeigt keine akute oder subakute Toxizität, wenn es intravenös Mäusen verabreicht wird. Wenn daher dieses Polypeptid Tumorpatienten im terminalen Stadium mit metastatischem Lungenkarzinom ausgehend von Nierenkrebs intravenös verabreicht wird, wird sich der Focus entweder ganz zurückbilden, zusammenziehen oder zumindest nicht vergrößern. Das erfindungsgemäße Antitumor-Polypeptid zeigt keine Zytotoxizität gegenüber normalen Human-Zellen der Reihen WI-38 und Flow 1000, wie auch nicht gegenüber fötalen Mäusezellen. Das Mittel zeigt jedoch zytotoxische Aktivität gegenüber Human-Tumor-Zellen der Reihen Hela und KB wie auch gegenüber Tumorzellen der Maus der Linie Sarcoma 180 und L-1210. Ebenso zeigt das Polypeptid ausgezeichnete Zytotoxizitäts-Werte gegen T-24-Zellen, welche bekanntlich gegenüber konventionellen TNF-Aktivitäten unempfindlich sind (Science 230, 943-945 (1985)).
- Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung in Detail.
- In einen 300-l-Inkubator wurden 200 l des sterilen RPM-1640-Mediums gegeben; das Medium enthielt 5% fötales Rinderserum. In dieses Medium wurden nun THP-1-Zellen suspendiert (Int. J. of Cancer 26, 171 -176 (1980)), und zwar in einer derartigen Menge, daß die Zelldichte 2·10&sup5;/ml betrug. Die Zellen wurden in der Suspension 4 Tage lang bei 37ºC inkubiert, und die Kultur wurde anschließend zentrifugiert. Die THP-1-Zellen wurden so unter sterilen Bedingungen gewonnen. Die gewonnenen Zellen wurden nun den 200 l Serum-freiem RPMI- 1640-Medium in einem anderen Inkubator zugegeben. Die Mischung wurde zudem mit 100 ng/ml TPA versetzt. Inkubiert wurde hierauf unter sterilen Bedingungen 5 Tage lang bei 37ºC und langsamem Rühren (100 Umdrehungen pro Minute) zwecks Induktion. Anschließend wurde die Mischung zentrifugiert zur Abtrennung der Zellen. Die überstehende Flüssigkeit enthielt das erfindungsgemäße Antitumor-Polypeptid mit einer Aktivität von 1,5·10³ Einheiten/ml. Diese Flüssigkeit wurde nun mittels Ultrafiltration an der Membrane HVLP OHV20 der Millipore Inc. auf 1/10 des ursprünglichen Volumens konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde nun mit Ammoniumsulfat (65% der Sättigungsmenge) versetzt, um so die Proteine auszufällen. Die ausgefallene Substanz wurde mittels Zentrifugierens getrennt (1000 Umdrehungen pro Minute, 20 Minuten lang) und dann in einer kleinen Menge eines 0,05 M Tris-HCl-Puffers (pH 7,7) gelöst. Anschließend wurde gegen den gleichen Puffer bei 5ºC 24 Stunden lang dialysiert. Nach Zugabe eines gleichen Volumens des genannten Puffers wurde die Protein-Lösung auf eine Kolonne der DEAE-Toyo Pearl-M650 gegeben (5·40 cm), welche vorgängig mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Kolonne wurde mit 1,0 l des genannten Puffers gewaschen und dann mit dem gleichen Puffer, welcher zusätzlich mit 0,2 M NaCl versetzt worden war, eluiert.
- Fraktionen von 2,0 l mit dem Antitumor-Polypeptid wurden zusammengegeben und mittels Ammoniumsulfat-Fraktionierung (40-55% der Sättigungskonzentration) ausgefällt. Der so erhaltene Feststoff wurde in einer kleinen Menge von Wasser gelöst und wiederum gegenüber dem oben genannten Puffer bei 5ºC 24 Stunden lang dialysiert. Das Dialysat wurde wiederum mit Ammoniumsulfat versetzt (40% der Sättigungsmenge), und die Lösung wurde zwecks Entfernung von unlöslichen Stoffen zentrifugiert. Dann wurde sie der hydrophoben Chromatographie unterworfen unter Einsatz von Butyl Toyo Pearl 650X-Kolonnen (2,5· 30 cm), welche vorgängig mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer äquilibriert worden waren. Der Puffer enthielt zusätzlich Ammoniumsulfat und zwar zu 40% der Sättigungsmenge. Eluiert wurde nun mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 2,0 ml/min, wobei Fraktionen mit dem Antitumor- Polypeptid erhalten wurden. Diese wurden noch einmal gegenüber 0,05 M Tris-HCl-Puffer bei pH 7,8 dialysiert und das Dialysat dann auf eine Mono Q HR5/5-Kolonne gegeben. Diese Anionentauscher-Kolonne war vorgängig ebenfalls mit 50 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 8,5 äquilibriert worden. Nach Auswaschen mit dem gleichen Puffer wurde die Kolonne schrittweise mit zunehmendem NaCl-Gradienten eluiert; die Konzentrationen am genannten Salz betrugen dabei 0,1, 0,15, 0,2 und 0,3 M. Die eigentliche Antitumor-Polypeptid-Aktivität wurde bei 0,2 M NaCl eluiert. Dieses Eluat wurde dann gereinigt, bis eine spezifische Aktivität von 1·10&sup6; Einheiten/mg Protein erreicht worden war. Dieser Reinigungsschritt führte zu einer 5- bis 15-fachen Erhöhung des Reinheitsgrades, und es wurden dabei mindestens 80% des Materials wiedergewonnen.
- Die aktiven Fraktionen wurden nun zusammengegeben und noch einmal mittels Pharmacia FPLC behandelt. Eingesetzt wurden dabei Mono Q HR5/5-Kolonnen unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Die Eluierungskurve nach zwei FPLC-Behandlungen ist in der Figur l dargestellt. Die Ordinate zeigt die Absorption in Prozenten bei 280 nm und die Abszisse die Eluierungszeit in Minuten. Aus der genannten Fig. 1 ist ersichtlich, daß die Antitumor-Peptid-Aktivität, welche mit 0,1 M NaCl eluiert wird, in guter Übereinstimmung steht mit dem Absorptionspeak bei 280 nm. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben und gegen reines Wasser dialysiert. Dann wurde lyophilisiert und man erhielt 200 ug des gereinigten Musters mit einer spezifischen Aktivität von 5,0·10&sup8; Einheiten/mg Protein.
- Die Protein-Probe wurde nun einem Anionenaustausch über Mono Q-Chromatographiekolonnen unterzogen und zwar unter Bedingungen, wie sie in der folgenden Tabelle 1 dargestellt sind: Tabelle 1 Zeit Flüssigkeit
- Bei Retentionszeiten von 35, 36 und 37,8 Minuten wurden drei Peaks eluiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden getrennt aufbewahrt und mit TNF-1, TNF-2 und TNF-3 bezeichnet. Jede Fraktion alleine wurde nun wiederumchromatographiert, und zwar in der oben beschriebenen Art und Weise. Das erhaltene, gereinigte Protein war nun homogen gemäß den folgenden Kriterien.
- Jede Protein-Probe wurde hierauf einer Phasenumkehr-FPLC über Pro-FPC HR5/2-Kolonnen (Pharmacia Inc.) unterworfen. Dabei wurde als Entwickler 0,1% Trifluoressigsäure eingesetzt, und die Acetonitril- Konzentration wies einen linearen Gradienten von 0-70% auf. Die Eluierungskurve für TNF-1 ist in der beigelegten Fig. 2 dargestellt. Das TNF-1-Polypeptid wurde bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 36% eluiert. Keine andern Proteinpeaks sind festzustellen. Ähnliche Resultate wurden mit den Proben TNF-2 und TNF-3 erhalten. Daher wird angenommen, daß alle drei Substanzen, d. h. die Muster TNF-1, TNF-2 und TNF-3, einzelne Substanzen sind im Sinne der Resultate, die mittels der Phasenumkehr-FPLC erhalten werden.
- Als nächstes wurde jede Protein-Probe einer SDS-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese (SDS-PADE) unterzogen. Dazu wurde die Probe in ein 15%-iges Polyacrylamid-Gel gegeben, welches zusätzlich 0,1% SDS enthielt. Die Elektrophorese wurde ausgeführt in einem Stab- Elektrophorese-Apparat (Protean, 16 cm; Biorad Inc.). Es wurde eine konstante Stromstärke von 20 mA eingehalten. Das Protein wurde mittels Silberverfärbung nachgewiesen. In allen den Proben, d. h. in TNF-1, TNF-2 und TNF-3, wurde nur eine einzelne Bande festgestellt, und zwar immer an der Stelle 17,4 kd. Keine andern Banden waren zu sehen. Auch daraus kann gefolgert werden, daß jedes der Proteine TNF-1, TNF-2 und TNF-3 homogen im Sinne der SDS-PADE-Resultate ist.
- Ebenso wurde jede Protein-Probe einer isoelektrisch fucusierenden Gel-Elektrophorese unterzogen, wobei als Gel Ampholine-Polyacrylamid (LKB Inc.) eingesetzt wurde. Festgestellt wurden auf diesem Weg die isoelektrischen Punkte pI der Substanzen. Alle Proben zeigten einen isoelektrischen Punkt von 5,7.
- Schließlich wurde auch jede Polypeptid-Probe (ca. 10 pg) der Aminosäure-Sequenz-Analyse unterworfen, wobei als Apparat das Aminosäuresequenzier-Analysegerät Modell 470A (Applied Biosystems Inc.) verwendet wurde. Die N-terminalen Aminosäure-Sequenzen der drei Proben wurden bestimmt, und die Resultate sind in der folgenden Zusammenstellung dargestellt:
- In der oben angegebenen N-terminalen Aminosäuren-Sequenz wird die Aminosäure auf Platz 4 bei allen drei Proben mit X angegeben. Sie war mittels der Dampfphasen-Aminosäure-Sequenz-Analyse nicht bestimmbar; sicher ist, daß sie nicht Serin ist. Möglich ist, daß X Cystein ist, welches mittels der genannten Methode nicht bestimmt werden kann.
- Eine Mischung aller drei Fragmente (d. h. von TNF-1, TNF-2 und TNF-3) des erfindungsgemäßen Antitumor-Polypeptides, welche wie oben gezeigt bei der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ein einzelnes Band zeigt, wurde mit Trypsin versetzt. Dazu wurden in 100 ul einer wäßrigen Lösung, welche 100 ug des genannten Peptides enthielt, 3,3 ug Trysin gegeben. Die Mischung wurde dann 22 Stunden lang und bei einem pH von 8,0 bei 37ºC gehalten. Nach der Umsetzung wurde die Mischung auf eine RP318-Kolonne (Diorad Inc.) zwecks Phasenumkehr- HPLC gegeben. Erhalten wurden so 8 Fragmente F-1 bis F-8. Jedes Fragment wurde dann noch dem Edman-Abbau unterworfen und dann mittels der Aminosäuresequenz-Analyse-Apparatur Modell 470A (Applied Biosystems Inc.) analysiert. Die dabei freigesetzten Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurden mittels HPLC analysiert (Apparat Shimadzu LC-4A). Erhalten wurden so die Aminosäure-Sequenzen gemäß bekannter Methode. Die Resultate sind die folgenden:
- F-1: Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln
- F-2: Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala
- F-3: Asn-Gln-Leu-Val-Val-X-X-X-Gly-Leu
- F-4: Ile-Ala-Val-X-Tyr
- F-5: Val-Asn-Leu-Leu
- F-6: Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala
- F-7: Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe
- F-8: Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu- Ser-Gly-Gln-Val-Tyr
- T24-Zellen wurden in einem MEM-Medium mit 10 Gew.-% FCS suspendiert. Die Mischung wurde auf eine Kultivierplatte mit 96 Probeaufnahmevertiefungen gegeben. In jede Vertiefung wurde eine solche Menge Mischung gegeben, daß darin 1104 g/200 l gen. Nun wurde das Ganze 48 Stunden lang bei 37ºC und bei Anwesenheit von 0,5% CO&sub2; kultiviert. Anschließend wurde die überstehende Lösung, welche bei der Kultivierung von 1%-igem THP-1 erhalten wurde und eine Reinheit von 5·10&sup5; Einheiten/ml zeigte, in den folgenden Mengen zugegeben: 10 000 Einheiten/ml, 1000 Einheiten/ml, 100 Einheiten/ml und 0 Einheiten/ml. Das zugegebene Produkt enthielt auch 0,1 ug/ml Actinomycin D. Anschließend wurde die Kultivierung 16 Stunden lang weitergeführt, dies wiederum bei 37ºC und 0,5% CO&sub2;. Den Proben wurden nun je 10 uCi/ml Aktivität mittels ³H-Thymidin zugegeben. Nun wurde wieder 8 Stunden lang kultiviert. Dann wurde mittels der Flüssig-Scintillations-Meßmethode die Menge von in die Zellen aufgenommenem ³H-Thymidin bestimmt. Dies ist ein Maß für die Antitumor-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptides. Je weniger ³H-Thymidin aufgenommen wird, desto höher ist die Antitumor-Aktivität. Die Resultate sind in der unten folgenden Tabelle 9 zusammengestellt. Jeder Wert ist ein Mittelwert von 4 experimentellen Messungen. Die Werte in Klammern zeigen die Resultate für die Fälle, in denen nur Actinomycin D (und keine THP-1-Kultur) zugegeben wurde.
- Produkt der THP-1- Menge aufgenommenes Kultivierung ³H-Thymidin (Einheiten/ml) T24-Zellen
- 0 1222
- 100 920 (75 %)
- 1000 728 (59 %)
- 10 000 472 (39 %)
- Die in Ausführung dieser Erfindung verwendeten THP-1-Zellen sind diejenigen, welche im Int. J. Cancer 26, Seiten 171-176 (1980), beschrieben sind. Die Erfinder haben ihre Arbeiten mit Zellen ausgeführt, welche vom Autor der genannten Veröffentlichung direkt abgegeben worden sind. Die gleichen Zellen sind auch in Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 80, Seiten 5397-5401 (1983), und in Cancer Research 42, Seiten 484-489 (1982), beschrieben. Die letztere Veröffentlichung stellt fest, daß die Zellen von Dr. Rovera stammen.
- Die Zellen können von Experten leicht erhalten werden, und die Erfinder dieser Erfindung sind bereit, anderen Fachleuten die genannten Zellen abzugeben.
- Dem obigen kann also entnommen werden, daß das neuartige Antitumor- Polypeptid gemäß dieser Erfindung, welches wie gesagt mittels der Suspensions-Kultivierung von THP-1-Zellen erhalten wird, keine zytotoxische Aktivität gegenüber normalen Human-Zellen zeigt, daß das gleiche Polypeptid aber zytotoxisch gegenüber Human-Tumor-Zellen ist. Das gleiche Polypeptid kann wie gesagt in serumfreien, preisgünstigen Media hergestellt werden. Die neue DNA-Sequenz gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann neuartige Antitumor-Polypeptide exprimieren, welche keine Zytotoxizität gegenüber normalen Zellen zeigen, welche aber gegenüber Human-Tumor-Zellen zytotoxisch sind. Einige der neuartigen Antitumor-Polypeptide gemäß dieser Erfindung zeigen sogar Zytotoxizität-Aktivität gegenüber T24-Zellen; die letzteren sind bekanntlich völlig unempfindlich gegenüber konventionellen TNF-Zellreihen. Ebenso zeigen die neuen Polypeptide Zytotoxizitäts- Wirkung gebenüber primären Kulturzellen, welche von Metastasen in Patienten mit Rhabdomyo-Sarkom im Müllergang erhalten werden, welche Zellen bekanntlich bislang gegenüber allen Antitumor-Chemotherapeutika Unempfindlichkeit zeigten.
Claims (5)
1. Antitumor-Polypeptid der folgenden N-terminalen Aminosäure-
Sequenz:
Val-A-Ser-X-Thr-B-Thr-C-D-E-F-G-Val-Ala-His-Val-Ala-Asn; worin A
für Arg oder Lys, B für Arg oder Pro, C für Arg oder Pro, D für
Ser oder Lys, E für Arg oder Pro, F für Lys oder Val, G für Phe,
Pro oder Ala stehen und X eine nicht-identifizierte Aminosäure
ist, enthaltend tryptische Peptid-Fragmente der folgenden
Aminosäure-Sequenzen:
F1 : Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln,
F2: Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala,
F3: Asn-Gln-Leu-Val-Val-X-X-X-Gly-Leu,
F4: Ile-Ala-Val-X-Tyr,
F5: Val-Asn-Leu-Leu,
F6: Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala,
F7: Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe und
F8: Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-
Ser-Gly-Gln-Val-Tyr.
und die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften
aufweisend:
(a) Molekulargewicht: 17400 ± 500 (SDS Electrophoresis);
(b) Isoelektrischer Punkt: pI 5,7 ± 0,2 (Gel-isoelektrischer-
Punkt-Electrophoresis);
(c) pH-Stabilität: stabil bei pH 6-9;
(d) Temperatur-Stabilität: Aktivitäts-Verlust von etwa 60-70%
bei T ≥ 65ºC, während 1 h bei pH 7,0;
(e) Stabilität gegenüber Protease: nicht aktiviert; und
(f) Physiologische Aktivität: praktisch keine Zytotoxizität gegen
normale Human-Zellen, aber
Zytotoxizität gegenüber Human-Tumor-Zellen.
2. Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Polypeptides gemäß
Patentanspruch 1, umfassend die Kultivierung von myelozytischen
Human-Leukämiezellen THP-1 in Anwesenheit eines eine
Differenziation induzierenden Agens oder nach Inkontaktbringen mit dem
genannten Agens.
3. Verfahren gemäß Patentanspruch 2, worin die Zellkultur eine
Suspensions-Kultur ist.
4. Verfahren gemäß Patentanspruch 2, worin das eine Differenziation
induzierende Agens eine Substanz ist, welche fähig ist, bösartige
Monozyt-Zellen in Makrophagen und in massiven Monozyt-Zellen zu
induzieren.
5. Verfahren gemäß Patentanspruch 4, worin das eine Differenziation
induzierende Agens eine oder mehrere der folgenden Substanzen
ist: Haemin, Actinomycin D, Hexamethylenaclacinomycin A,
Teleocidin, Mitomycin C, Bleomycin, Propionsäure, Na-Acetat, Cadaverin,
Tunicamycin, 12-o-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), ein
Lymphokyn wie γ-Interferon, D-Faktor, Arginase, Histon HI,
Lipopolysaccharid (LPS), Lipid A, Glucocorticoid,
1d-12-Dehydroxyvitamin D&sub3;, Poly(I), Poly(ADP-Ribose), BCG und Chloroquin.
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