KR920009503B1

KR920009503B1 - 재조합 인 알파-인터페론의 정제방법

Info

Publication number: KR920009503B1
Application number: KR1019900013450A
Authority: KR
Inventors: 박순재; 배태옥; 장호진
Original assignee: 주식회사 럭키; 최근선
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1990-08-30
Publication date: 1992-10-17
Also published as: KR920004576A

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 인 알파-인터페론의 정제방법

제1도는 본 발명에 따라 재구성된 재조합 인 알파-인터페론을 음이온 교환 크로마토그래피하여 분리한 결과를 나타낸 그래프이고,

제2도는 본 발명에 따라 양이온 교환 크로마토그래피한 결과를 나타낸 그래프이며,

제3도는 본 발명에 따라 겔 여과 크로마토그래피한 결과를 나타낸 그래프이고,

제4도는 본 발명에 따라 헤파린-세파로즈를 이용하여 친화성 크로마토그래피한 결과를 나타낸 그래프며,

제5도는 본 발명에 따라 최종 정제된 재조합 인 알파-인터페론을 역상 고성능 크로마토그래피한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 효모로부터 재조합 인 알파-인터페론을 정제하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 재조합 인 알파-인터페론을 각종 크로마토그래피를 이용하여 고순도와 고역가를 갖는 의약품 제제에 적합한 단백질로 정제하는 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 알파-인터페론 정제시 단일항체를 이용한 면역 친화(Immuno affinity)컬럼을 이용하지 않고도 천연형과 같이 재구성(refolding)된 단백질을 얻을 수 있음을 특징으로 한다.

인터페론은 1957년 Isaacs과 Lindenmann이 닭을 인플루엔자 A바이러스로 감염시켰을 때 바이러스의 번식을 억제하는 인자가 있다는 것을 발견하여 최초로 알려지게 되었다(Isaacs, K. 및 Lindenmann, J., Proc. R. Soc. Lond., B 147,258-267,1957).

그후, 수많은 연구결과에서 인터페론이 항바이러스성질 뿐만 아니라 세포내 유전자의 발현, 구조 그리고 기능의 조절인자로 작용함이 알려졌으며, 인터페론은 또한 직접적인 항증식효과(antiproliferative effect)가 있는 것으로 밝혀졌는 바, 이를 이용하여 항암제로서의 가능성이 제시되었다.

알파-인터페론은 B-세포 분열인자(mitogen), 외래거대분자, 바이러스 또는 암세포 등에 의해 백혈구(B-세포, T-세포, 거식세포)가 자극받았을 때 생성되는 것으로 현재까지 20종 이상의 인터페론 유전자가 존재함이 알려져 있으며, 대부분 165 또는 166개의 아미노산으로 구성되어 있다.

최초의 임상실험에 사용된 알파-인터페론은 센다이 바이러스(Sendai Virus)로 자극된 연층 백혈구(buffy coat leukocyte)에서 얻어진 것으로 이 당시 단백질의 순도는 약 1%에 지나지 않았었다(Cantell, K. 및 Hirvonen, Tex. Rep. Biol. Med., 35,138-144,1977).

근래에는, 유전공학의 발달에 힘입어 생리활성을 갖는 유전자 재조합 인 알파-인터페론을 대량 생산할 수 있게 되었으며(Goedell, D. V. 등, Nature, 287,411-416,1980), 이러한 재조합 인 알파-인터페론을 이용한 임상실험 결과 여러 고형암의 치료에 효과가 있는 것으로 판명되었다. 특히, 방광암(Bladder cancer)(Torti, F. M. 등, J. Clin. Oncol., 6,476-483,1988), 후천성 면역 결핍증(Acquired Immuno Deficiency Syndrome)에 관련된 카포시육종(Rios, A. 등, J. Clin. Oncol., 3,506-512,1985), 신장암(Vugrin, D. 등, Cancer Treat. Rep., 69,817-820,1985)등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 C형 간염 바이러스의 치료에도 효과가 있음이 알려지는 등(Davis, G. G. 등, N. Engl. J. Med., 321,1501-1506,1989; Bisceglie, A. D. 등, N. Engl. J. Med., 321,1506-1510,1989)의약품 치료제로서의 적용범위가 날로 확대되고 있다.

천연형 알파-인터페론을 얻기 위한 방법으로서 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography)(Rubinstein, M. 등 Arch. Biochem. Biophys., 210,307-318,1981)를 이용하거나, Nu-Gel AC컬럼을 이용하거나(대한민국 특허공개 제88-1805호), 혹은 단일항체 친화 컬럼(Berg, K. 및 Heron, I., Methods Enzymol., 78,487-499,1981; 대한민국 특허공고 제88-1757호)등을 이용하여 비교적 순도가 높은 단백질들을 얻는 기술이 알려져 있다.

그러나, 이러한 방법들은 재조합 인 알파-인터페론을 대량 장제하기 위한 방법들로는 효과적이지 못하였다. 특히, 인 알파-인터페론이 효모나 대장균에서 발현될 때 2개의 다이설파이드(Disulfide) 결합이 제대로 형성된 않고 환원된 상태로 존재하며 단백질 자체도 변성된 형태로 존재하기 때문에, 재조합 인 알파-인터페론을 활성을 갖는 단백질로 대량 생산하는 것은 쉬운 일이 아니었다.

재조합 인 알파-인터페론을 활성을 갖는 형태로 얻기 위한 방법으로서 단일항체 친화컬럼을 이용하여 선택적으로 인 알파-인터페론을 다른 오염단백질로부터 분리한 후, 여러 컬럼을 이용하여 수차례 더 정제하는 방법이 고안된 바 있었다(Tarnowski, S. J. 등, Methods Enzymol., 119,153-165,1986; Pestka, S 및 Tarnowski, S. J., Pharmac. Ther., 29,299-319,1985). 그러나 이 방법은 그 효과는 우수하나 인 알파-인터페론에 대하여 선택적인 단일항체를 대량 생산해야만 한다는 결점을 갖고 있었다.

그 밖에, 재조합 인 알파-인터페론의 정제에 Cu-킬레이트 컬럼(Thatcher, D. R. 및 Panayotatos, N., Methods Enzymol., 119,166-177,1986)등을 이용한 예가 있지만, 이 방법 역시 재조합 인 알파-인터페론을 대량 생산하는데 응용하기에는 미흡하였다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 연구한 결과, 효모에서 발현된 재조합 인 알파-인터페론을 재구성시킨 후에 액체 크로마토그래피를 적절히 배합하여서 고순도와 고역가를 갖는 형태의 단백질로 대량 정제하는 방법을 개발하게 되었으며, 더욱이 이 방법은 인 알파-인터페론의 종류나 혹은 발현숙주에 관계없이 보편적으로 이용될 수 있는 것으로 기대된다.

즉, 본 발명의 목적은 재조합 인 알파-인터페론을 고순도와 고역가를 갖는 의약품 제제에 적합한 단백질로 정제하는 방법을 제공하는데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은, 재조합 인 알파-인터페론을 정제하는데 있어서, (가) 재조합 인 알파-인터페론을 단백질 변성제를 이용하여 용해시키고, 다시 단백질을 재구성시킨 다음, (나) 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고, (다) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 후, (라) 겔 여과 크로마토그래피를 수행하고, (마) 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 하는 재조합 인 알파-인터페론의 정제방법을 제공하는 것이다.

이와 같은 본 발명의 정제방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 통상적인 방법에 따라 재조합 인 알파-인터페론이 발현된 효모를 완충용액에서 유리구슬을 이용하여 현탁시킨 후 침전물을 얻는다. 이때 완충용액으로는 우레아를 1M 내지 4M의 구아니디움(구아니딘.HCl)이 함유된 완충용액을 사용한다.

회수된 재조합 인 알파-인터페론을 함유하는 침전물에 β-머캡토 에탄올이 함유된 8M 구아니딘용액(구아니딘. HCl, pH 8.0)을 첨가하여, 바람직하게는 이와 함께 β-머캡토에탄올 또는 디티오트레이톨과 같은 환원제를 50mM 내지 300mM 사용하여 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 얻는다. 이렇게 하여 얻어진 상등액에 용해된 인 알파-인터페론의 3차 구조는 해체된 상태가 된다. 그런 다음, pH 7.0 내지 pH 8.0의 완충용액을 첨가하여 인 알파-인터페론의 함유된 용액을 희석시킨 후 동일 완충용액에 투석시켜서, 재조합 인 알파-인터페론을 재구성시킨다. 이때 재구성을 위한 완충용액으로는 pH 8.0의 Tris. HCl 완충용액이 특히 바람직하다.

재구성이 완료되면, 원심분리하여 상등액을 모아 농축한 후 음이온 교환 크로마토그래피한다. 이때 재조합 인 알파-인터페론을 음이온 교환수지에 흡착시키지 않고 염(Noel)의 농도를 높여 용출되도록 한다. 얻어진 재조합 인 알파-인터페론 분획을 모아서 pH 4.5에 투석시킨다. 이때 수지로는 DEAE-셀룰로즈 또는 DEAE-세파로즈 등이 사용되어질 수 있다.

그런 다음, 상기 음이온 교환 수지 컬럼을 통과시켜 얻어진 재조합 인 알파-인터페론 분획의 용액을 양이온 교환 수지 컬럼을 통과시켜 더욱 정제시키는데, 이때 수지로는 CM-세파로즈 등이 사용될 수 있으며, 컬럼을 pH 4.5의 Na-아세테이트 완충용액으로 미리 평형시킨다.

이어서, 상기 양이온 교환 수지 컬럼을 통과시켜 얻어진 재조합 인 알파-인터페론 분획을 농축시킨 후 농축된 단백질을 염(NaCl)의 농도가 150mM을 넘지 않는 pH 4.0 내지 pH 5.0의 완충용액에서 겔 여과 크로마토그래피하여 중합체나 이합체 등으로부터 단일체인 재조합 인 알파-인터페론을 분리한다. 이때 겔로는 S-300이 사용되며 G-50을 이용할 수도 있다.

최종적으로, 상기 겔 여과 크로마토그래피를 통해 보다 정제된 재조합 인 알파-인터페론 분획을 모아 투석하고, 투석이 완료된 용액을 헤파린-세파로즈 수지를 이용하여 친화성 크로마토그래피한다. 이때 완충용액으로는 pH 5.0 내지 6.0의 NH₄아세테이트 완충용액을 사용한다.

이상과 같은 본 발명에 따르면 고역가의 인 알파-인터페론을 고순도로 정제할 수가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

알파-인터페론이 발현된 효모 1kg을 완충용액(20mM Tris-HCl, 1M 우레아, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 8.0)에 호모지나이저(Beckman사)로 현탁시킨 후 0.5 내지 0.75mm의 유리구슬을 넣은 다이노밀에서 750ml/분의 속도로 분쇄시켰다. 여기서 얻어진 분쇄된 효모 용액을 12000rpm(4℃, Beckman JA-14 로우터)으로 50분 동안 원심분리하여 상등액은 버리고 침전물을 회수하였다. 모아진 침전물에 다시 2ℓ의 완충용액(20mM Tris-HCl, 1M 우레아, 1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, pH 8.0)을 넣어 호모지나이저(Beckman사)로 현탁시킨 후, 12000rpm(Beckman J-14 로우터)에서 50분간 원심분리하여서 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 또 다시 2ℓ의 1M 구아니딘용액(구아니딘. HCl, Amresco사)에 호모나이저로 현탁시킨 후, 12000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이때, 회수된 침전물의 질량은 약 600g이었다.

[실시예 2]

회수된 침전물 600g에 1.8ℓ의 8M 구아니딘용액(8M 구아니딘 HCl, 20mM Tris-HCl, 100mM β-머캡토에탄올, pH 8.0)을 넣어 4℃에서 밤새 교반시키며 용해시켰다. 이튿날 침전물이 녹아있는 용액을 12000rpm(4℃, Beckman사 JA-14 로우터)으로 30분동안 원심분리하여 용해되지 않은 침전물을 가라앉혀 제거하고 상등액만을 모았다. 이때 모아진 상등액은 진한 갈색을 띄며 약 2.1ℓ가 되는데 여기에 6ℓ의 완충용액(20mM Tris-HCl, 0.1mM PMSF, pH 8.0)을 잘 저으면서 넣어주어 4배로 희석시킨 후 4℃에서 50ℓ의 완충용액(20mM Tris-HCl, 0,12M NaCl, 0.1mM PMSF, pH 8.0)에 3번 투석시켰다.

[실시예 3]

투석이 완료된 용액을 12000rpm(4℃, Beckman사 JA-14 로우터)으로 30분간 원심분리하여 투석시키는 동안 생성된 침전물을 가라앉혀 제거한 다음 상등액만을 모았다. 이때 모아진 상등액은 약 8ℓ가 되는데 이를 와선형 한외여과장치(Amicon사 SIY10타입)을 사용하여 1ℓ까지 농축시켰다. 농축된 단백질용액을 동일 완충용액(20mM Tris-HCl, 0.12M NaCl, pH 8.0)으로 평행시킨 DEAE-셀룰로즈(Whatman사)컬럼에서 10cm/시간의 용출속도로 통과시켜 겔에 붙지 않고 흘러나오는 단백질 용액을 모았다. 여기서 얻어진 분획을 SDS-PAGE하여 덴시토미터스캐닝한 결과를 제1도에 나타내었다. 알파-인터페론의 순도가 비교적 높은 부분인 검은 막대부분의 분획을 모아서 50ℓ의 완충용액(50mM Na-아세테이트, pH 4.5)에 3회 투석시켰다.

[실시예 4]

투석이 완료된 단백질용액을 12000rpm(4℃, Backman사 JA-14로우터)으로 30분간 원심분리하여 투석시키는 동안 생성된 침전물을 가라앉혀 제거한 후 상등액을 동일 완충액(50mM Na-아세테이트, pH 4.5)으로 평형시킨 CM-세파로즈(Pharmacia사) 컬럼에서 10cm/시간의 용출속도로 통과시켜 단백질을 겔에 흡착시켰다. 그리고, 컬럼에 다시 완충용액(50mM Na-아세테이트, pH 4.5)을 통과시켜 컬럼안에 유리된 상태로 남아 있는(혹은 겔에 흡착되지 않고 남아있는) 단백질을 모두 제거하였다. 다시, 0.15M NaCl이 함유되어 있는 완충용액(50mM Na-아세테이트, 0.15M NaCl, pH 4.5)을 컴럼부피의 3배 양으로 통과시켜 겔에 약하게 흡착된 단백질을 제거한 후, 0.2M NaCl이 함유 되어있는 완충용액(50mM Na-아세테이트, 0.2M NaCl, pH 4.0)을 상기와 같은 용출속도로 통과시켜 겔에 흡착된 단백질을 용출시켰다. 여기서 얻어진 분획을 15% SDS-PAGE하여 덴시토미터스캐닝한 결과를 제2도에 나타내었다. 알파-인터페론의 순도가 90% 이상되는 검은 막대 부분의 분획들만을 모아 한외여과막 YM-10(Amicon사)을 이용하여 농축하였다.

[실시예 5]

농축된 단백질 용액을 완충용액(20mM NH₄-아세테이트, 0.1M NaCl, pH 4.5)으로 미리 평형시킨 S-300(Pharmacia사 제품, 재질 : 교차결합된 아가로즈)에서 3cm/시간의 용출속도로 통과시켜서 겔여과 크로마토그래피하였다. 여기서 얻어진 분획을 비환원성 SDS-PAGE하여 덴시토미터스캐닝한 결과를 제3도에 나타내었다. 다중 체인 알파-인터페론이 거의 포함되지 않은 단일체인 알파-인터페론만을 함유하는 검은막대 부분의 분획을 모아 20ℓ 완충용액(20mM NH₄-아세테이트, pH 5.0)에 3번 투석시켰다.

[실시예 6]

투석이 완료된 단백질용액을 동일 완충용액(20mM NH₄-아세테이트, pH 5.0)으로 미리 평형시킨 헤파린-세파로즈(Pharmacia사 제품, 재질 : 교차결합된 아가로즈)컬럼에서 30cm/시간의 용출속도로 통과시켜 단백질을 겔에 흡착시킨 다음 동일 완충용액(20mM NH₄-아세테이트, pH 5.0)을 통과시켜서 컬럼에 유리된 상태로 남아있는 단백질을 모두 제거하였다. 그 다음, 처음 완충용액(20mM NH₄-아세테이트, pH 5.0)과 0.2M NaCl이 함유된 완충용액(20mM NH₄-아세테이트, 0.2M NaCl, pH 5.0)을 이용하여 NaCl의 농도구배가 OM부터 0.2M까지 되도록 하여 상기와 같은 용출속도로 선형구배시켜서 단백질을 용출시켰다. 여기서 얻어진 분획을 15% SDS-PAGE하여 쿠마시염색하고 알파-인터페론이 99% 이상되는 것만을 모아 다시 은(silver) 염색한 결과 순도가 97% 이상이 되었다.

[정제된 알파-인터페론의 생리활성 측정]

상기의 방법에 의해 최종 정제된 재조합 알파-인터페론의 생리활성도를 측정하기 위하여 세포병변 효과(cytopatic effect)를 이용한 항바이러스 역가를 결정하였다. T 75 플라스크에서 배양한 수송아지 신장 세포 부유액(MDBK, 3.5×10⁵세포/ml)을 96공 플레이트에 100㎕씩 넣어 37℃, 5% CO₂배양기에서 18-24시간 동안 배양하였다. 인산 완충용액(pH 7.0)으로 전체 공을 세척한 후 1×10⁵~4×10⁵pfu/ml의 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 100ml씩 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 18~24시간 배양하여 세포단층을 만든 후 검액인 알파-인터페론을 2배 연속 희석하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 48시간 방치하고, 크리스탈 바이오렛으로 염색하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 인 알파-인터페론의 단백질농도는 TCA 침전 후 로울리(Lowry)방법을 이용하여 측정하였다.

미국 국립 보건원(NIH)에서 분양받은 알파-인터페론 표준품(Gxa-01-901-535)을 이용하여 측정한 결과 2.0×10⁸IU/mg 이상의 비활성을 나타내었다. 알파-인터페론 표준품의 역가가 2.0×10⁸IU/mg인 점을 감안할 때, 상기 실시예에서 추출, 정제한 재조합 인 알파-인터페론이 단백질의 재구성 및 순도면에서 문제가 없음을 시사한다.

[역상 고성능 크로마토그래피]

정제된 재조합 인 알파-인터페론의 균질성 및 순도를 측정하기 위하여 상기 실시예에서 사용된 SDS-PAGE 이외에 역상 고성능 크로마토그래피(Reverse-phase HPLC)를 실시하였다.

15%(v/v) 아세토니트릴(아세토니트릴/0.05% 트리풀루오로아세트산)로 평형시킨 C18컬럼(μBondapak, Waters사)에 단백질을 주입한 후 5분에 걸쳐 25%(v/v) 아세토니트릴로 급격히 선형 구배하고 다시 35분에 걸쳐 56%(v/v)의 아세니트릴로 완만히 선형구배하였을 때, 제5도와 같은 결과를 얻었다. C18-HPLC상에서 재조합 인 알파-인터페론은 대칭인 단일 피크로 용출되었으며 순도는 98%를 나타내었다.

Claims

재조합 인 알파-인터페론을 정제하는데 있어서, (가) 재조합 인 알파-인터페론을 단백질 변성제를 이용하여 용해시키고, 다시 단백질을 재구성시킨 다음, (나) 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고, (다) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 후, (라) 겔 여과 크로마토그래피를 수행하고, (마) 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 하는 재조합 인 알파-인터페론의 정제방법.
제1항에 있어서, 세포파괴시에 우레아를 함유하는 완충용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 완충용액에서 우레아의 농도는 1M 내지 4M인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 세포파괴 후 얻어진 알파-인터페론이 함유된 침전물을 구아니디움(구아니딘-HCl)이 포함된 완충용액으로 세척하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 완충용액에서 구아니디움의 농도는 1M 내지 2M인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 세포내 침전물을 세척한 후에 얻어진 알파-인터페론을 용해시킬 때 구아니디움용액(구아니딘. HCl)과 β-머캅토 에탄올 및 디티오트레이톨 중에서 선택된 환원제를 이용하여 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 환원제의 농도는 50mM 내지 300mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단백질 용해 후 재구성을 위하여 pH 7.0 내지 9.0의 완충용액으로 희석하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 재구성을 위하여 pH 8.0의 Tris-HCl 완충용액으로 희석하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 수지로서 DEAE-셀룰로즈 또는 DEAE-세파크릴을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제10항에 있어서, 알파-인터페론이 함유된 단백질 용액을 음이온 교환 수지에 흡착시키지 않고 완충용액중의 염농도를 증가시켜 통과되어 나오도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 수지로서 CM-세파로즈를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 수지로서 CM-세파로즈를 사용하며, 이때 50mM Na-아세테이트를 함유하는 pH 4.5의 완충용액을 이용하여 평형시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 겔 여과 크로마토그래피는 수지로서 S-300을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제14항에 있어서, 겔 여과 크로마토그래피는 pH 4.0 내지 5.0의 완충용액을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 수지로서 헤파린-세파로즈를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제16항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 완충용액으로서 NH₄-아세테이트를 사용하며 pH 5.0 내지 6.0의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.