JPH064675B2 - 抗腫瘍性ポリペプチド - Google Patents
抗腫瘍性ポリペプチドInfo
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- JPH064675B2 JPH064675B2 JP60167037A JP16703785A JPH064675B2 JP H064675 B2 JPH064675 B2 JP H064675B2 JP 60167037 A JP60167037 A JP 60167037A JP 16703785 A JP16703785 A JP 16703785A JP H064675 B2 JPH064675 B2 JP H064675B2
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は抗腫瘍性ポリペプチドに関し、特にこの内、
一般的にＴＮＦと称されるＬ−９２９マウス線維芽細胞
に対し毒作用を有するヒト起源の抗腫瘍性ポリペプチド
に関する。
一般的にＴＮＦと称されるＬ−９２９マウス線維芽細胞
に対し毒作用を有するヒト起源の抗腫瘍性ポリペプチド
に関する。
Ｌ−９２９マウス線維芽細胞に対し毒作用を有するヒト
起源の抗腫瘍性ポリペプチドとしては、The Journal of
Biol.Chem.，２６０，２３４５−２３５４，（１９８
５）に記載されているヒト細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ
２４０）より得られたＴＮＦと名付けられたポリペプチ
ドが知られている。このポリペプチドは、そのアミノ酸
配列も殆ど全部が知られている。
起源の抗腫瘍性ポリペプチドとしては、The Journal of
Biol.Chem.，２６０，２３４５−２３５４，（１９８
５）に記載されているヒト細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ
２４０）より得られたＴＮＦと名付けられたポリペプチ
ドが知られている。このポリペプチドは、そのアミノ酸
配列も殆ど全部が知られている。
更に、ＴＮＦと名付けられたポリペプチドは、組換えプ
ラスミドにより形質転換された大腸菌により生産される
ことも知られている（Nature,３１２，７２４−７２
９，（１９８４，１２，２０／２７），Nature，３１
３，８０３−８０６，（１９８５，２，２８），Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２２８，１４９−１５４，（１９８５，４，
１２））。
ラスミドにより形質転換された大腸菌により生産される
ことも知られている（Nature,３１２，７２４−７２
９，（１９８４，１２，２０／２７），Nature，３１
３，８０３−８０６，（１９８５，２，２８），Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２２８，１４９−１５４，（１９８５，４，
１２））。
これらの形質転換された大腸菌により産生されるポリペ
プチドも又、クローン化されたＤＮＡより推測される塩
基配列はThe Journal of Biol.Chem.，２６０に記載さ
れたものと同じであり、Nature，３１３に記載されたも
のがＮ−末端アミノ酸の２個バリンとアルギニンが欠落
している点が相違するのみである。
プチドも又、クローン化されたＤＮＡより推測される塩
基配列はThe Journal of Biol.Chem.，２６０に記載さ
れたものと同じであり、Nature，３１３に記載されたも
のがＮ−末端アミノ酸の２個バリンとアルギニンが欠落
している点が相違するのみである。
この発明の目的は、叙上のような情況下において、新規
な抗腫瘍性ポリペプチドを見い出すことにある。
な抗腫瘍性ポリペプチドを見い出すことにある。
本発明者等は叙上の目的を達成するものとして以下の性
質を有する抗腫瘍性ポリペプチドを、製造することに成
功した。
質を有する抗腫瘍性ポリペプチドを、製造することに成
功した。
すなわち本発明は、Ｎ末端からのアミノ酸配列がVal-A-
Ser-X-Thr-B-Thr-C-D-E-F-G-Val-Ala-His-Val-Ala-Asn
で表わされ、かつＡがArg又はLys、ＢがArg又はPro、Ｃ
がArg又はPro、ＤがSer又はLys、ＥがArg又はPro、Ｆが
Lys又はVal、ＧがPhe又はPro、Ｘが未同定アミノ酸であ
るペプチドフラグメントを有し、他にトリプシン分解フ
ラグメントとしてVal-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gl
y-Gln-Leu-Gln,Ala-Asn-Ala-Leu-leu-Ala,Asn-Gln-Leu-
Val-Val-X-X-X-Gly-Leu,Ile-Ala-Val-X-Tyr,Val-Asn-Le
u-Leu,Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala,Tyr-Glu-Pro-
Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe及びLeu-Ser-Ala-Glu-Ile-A
sn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gln
-Val-Tyrを有し、かつ下記の理化学的性質を有する抗腫
瘍性ポリペプチドである。
Ser-X-Thr-B-Thr-C-D-E-F-G-Val-Ala-His-Val-Ala-Asn
で表わされ、かつＡがArg又はLys、ＢがArg又はPro、Ｃ
がArg又はPro、ＤがSer又はLys、ＥがArg又はPro、Ｆが
Lys又はVal、ＧがPhe又はPro、Ｘが未同定アミノ酸であ
るペプチドフラグメントを有し、他にトリプシン分解フ
ラグメントとしてVal-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gl
y-Gln-Leu-Gln,Ala-Asn-Ala-Leu-leu-Ala,Asn-Gln-Leu-
Val-Val-X-X-X-Gly-Leu,Ile-Ala-Val-X-Tyr,Val-Asn-Le
u-Leu,Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala,Tyr-Glu-Pro-
Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe及びLeu-Ser-Ala-Glu-Ile-A
sn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gln
-Val-Tyrを有し、かつ下記の理化学的性質を有する抗腫
瘍性ポリペプチドである。
（ａ）分子量：１７４００±５００（ＳＤＳ電気泳動
法） （ｂ）等電点：ｐＩ5.7±0.2（ゲル等電点電気泳動法） （ｃ）pH安定性：pH６から９の範囲で安定 （ｄ）温度安定性：pH7.0，６５℃，１時間の加熱によ
り６０〜７０％失活する （ｅ）蛋白質分解酵素に対する安定性：失活する （ｆ）生理活性：ヒト正常細胞に対し細胞毒性を示さ
ず、ヒト腫瘍細胞に対し細胞毒性を示す このものは、例えばヒト急性骨髄性白血病細胞ＴＨＰ−
１（Int.J.Cancer，２６，１７１−１７６（１９８
０））を分化誘導物質と接触せしめつつ又は接触せしめ
た後、培養又は培地中に懸濁することにより製造するこ
とができる。
法） （ｂ）等電点：ｐＩ5.7±0.2（ゲル等電点電気泳動法） （ｃ）pH安定性：pH６から９の範囲で安定 （ｄ）温度安定性：pH7.0，６５℃，１時間の加熱によ
り６０〜７０％失活する （ｅ）蛋白質分解酵素に対する安定性：失活する （ｆ）生理活性：ヒト正常細胞に対し細胞毒性を示さ
ず、ヒト腫瘍細胞に対し細胞毒性を示す このものは、例えばヒト急性骨髄性白血病細胞ＴＨＰ−
１（Int.J.Cancer，２６，１７１−１７６（１９８
０））を分化誘導物質と接触せしめつつ又は接触せしめ
た後、培養又は培地中に懸濁することにより製造するこ
とができる。
分化誘導物質は、悪性化単球性細胞と接触した時、この
悪性化単球性細胞をマクロファージ、顆粒球の単球細胞
に分化誘導せしめる作用を有する物質であり、具体的に
はヘミン、アクチノマイシンＤ，ヘキサメチレンアクラ
ミノマイシンＡ，テレオシジン，マイトマイシンＣ，プ
レオマイシン，プロピオン酸，酢酸ナトリウム，カダベ
リン，ツニカマイシン，１２−ｏ−テトラデカノイルフ
ォルボール１３アセテート（ＴＰＡ），γ−インターフ
ェロン等のリンフォカイン、Ｄ−因子，アルギナーゼ，
ヒストンＨＩ，リポポリサッカライド（ＬＰＳ），脂質
Ａ，グルココルチコイド，１ｄ−２５−デハイドロオキ
シビタミンＤ3，ポリ（Ｉ），ポリ（ＡＤＰ−リボー
ス），ＢＣＧ，クロロキン等があげられる。
悪性化単球性細胞をマクロファージ、顆粒球の単球細胞
に分化誘導せしめる作用を有する物質であり、具体的に
はヘミン、アクチノマイシンＤ，ヘキサメチレンアクラ
ミノマイシンＡ，テレオシジン，マイトマイシンＣ，プ
レオマイシン，プロピオン酸，酢酸ナトリウム，カダベ
リン，ツニカマイシン，１２−ｏ−テトラデカノイルフ
ォルボール１３アセテート（ＴＰＡ），γ−インターフ
ェロン等のリンフォカイン、Ｄ−因子，アルギナーゼ，
ヒストンＨＩ，リポポリサッカライド（ＬＰＳ），脂質
Ａ，グルココルチコイド，１ｄ−２５−デハイドロオキ
シビタミンＤ3，ポリ（Ｉ），ポリ（ＡＤＰ−リボー
ス），ＢＣＧ，クロロキン等があげられる。
ヒト骨髄性白血病細胞ＴＨＰ−１を分化誘導物質に接触
せしめる方法は、ＴＨＰ−１を分化誘導物質を含有する
培地に懸濁または培養すればよい。ＴＨＰ−１を培養し
て抗腫瘍性ポリペプチドを生成せしめるには、分化誘導
物質が存在する条件下で培養を続けてもよいが、ヒト骨
髄性白血病細胞を分化誘導物質と接触せしめた後、同細
胞を分化誘導物質を含まない培地に移し変えて培養して
もよい。後者の方法の場合、ＴＨＰ−１を移し変えた後
の培地に生体外刺激物質を添加してもよい。
せしめる方法は、ＴＨＰ−１を分化誘導物質を含有する
培地に懸濁または培養すればよい。ＴＨＰ−１を培養し
て抗腫瘍性ポリペプチドを生成せしめるには、分化誘導
物質が存在する条件下で培養を続けてもよいが、ヒト骨
髄性白血病細胞を分化誘導物質と接触せしめた後、同細
胞を分化誘導物質を含まない培地に移し変えて培養して
もよい。後者の方法の場合、ＴＨＰ−１を移し変えた後
の培地に生体外刺激物質を添加してもよい。
生体外刺激物質とは、ヒト細胞の細胞膜またはライソゾ
ームに変化を与え生体内高分子を細胞外に放出または漏
出し易くさせる作用を有するものである。具体的にはリ
ポポリサッカライド（ＬＰＳ），各種レクチン，ビタミ
ンＡ等がある。
ームに変化を与え生体内高分子を細胞外に放出または漏
出し易くさせる作用を有するものである。具体的にはリ
ポポリサッカライド（ＬＰＳ），各種レクチン，ビタミ
ンＡ等がある。
ＴＨＰ−１を培養する培地は、動物細胞を培養する通常
の培地のいずれもが用いられる。具体的にはローズウエ
ル・パーク・メモリアル・インスティテュート１６４０
培地（Rosewell Park Memorial Instiute−１６４０、
以下、ＲＰＭＩ−１６４０と略す。）が好適であるが、
他にダルベッコ変法イーグル培地（Dulbeccos Modified
Eagle Medium），イーグル基礎培地（Eagles Minimum
Essential Medium，以下、ＭＥＭ培地と略す。），クリ
ック培地（Click Medium）なども用いられる。これらの
培地には胎児ウシ血清（以下ＦＢＳと略す。）や新生児
ウシ血清，ウマ血清などを添加して用いることもある
が、血清を全く含まない培地を用いたとき抗腫瘍性ポリ
ペプチドの分離、精製工程において極めて良い結果が得
られる。
の培地のいずれもが用いられる。具体的にはローズウエ
ル・パーク・メモリアル・インスティテュート１６４０
培地（Rosewell Park Memorial Instiute−１６４０、
以下、ＲＰＭＩ−１６４０と略す。）が好適であるが、
他にダルベッコ変法イーグル培地（Dulbeccos Modified
Eagle Medium），イーグル基礎培地（Eagles Minimum
Essential Medium，以下、ＭＥＭ培地と略す。），クリ
ック培地（Click Medium）なども用いられる。これらの
培地には胎児ウシ血清（以下ＦＢＳと略す。）や新生児
ウシ血清，ウマ血清などを添加して用いることもある
が、血清を全く含まない培地を用いたとき抗腫瘍性ポリ
ペプチドの分離、精製工程において極めて良い結果が得
られる。
ＴＨＰ−１の培養は通常１〜５×１０6個/ｍの細胞密
度で３５〜３８℃にて４〜６％炭酸ガス気流中で行な
い、培養は浮遊培養で行なう。
度で３５〜３８℃にて４〜６％炭酸ガス気流中で行な
い、培養は浮遊培養で行なう。
分化誘導物質は、通常培養当初より培地に含有せしめ
る。また、生体外刺激物質は分化されたヒト骨髄性白血
病細胞の培養当初より培地に含有せしめてもよいが、同
細胞の増殖がある程度進んでから培地に含有せしめても
よい。しかし、生体刺激物質を添加しなくとも抗腫瘍性
ポリペプチドは充分生産されるので、生体外刺激物質を
添加しない方が、抗腫瘍性ポリペプチドの精製の際に好
都合である。
る。また、生体外刺激物質は分化されたヒト骨髄性白血
病細胞の培養当初より培地に含有せしめてもよいが、同
細胞の増殖がある程度進んでから培地に含有せしめても
よい。しかし、生体刺激物質を添加しなくとも抗腫瘍性
ポリペプチドは充分生産されるので、生体外刺激物質を
添加しない方が、抗腫瘍性ポリペプチドの精製の際に好
都合である。
抗腫瘍性ポリペプチドは以下のように定性及び定量分析
できる。即ち、標的細胞であるＬ−９２９細胞（Proc.
Natl. Acad. Sci. Ｕ．Ｓ．Ａ．７２，３６６６−３６
７０）をＭＥＭ培地に５％仔牛胎児血清を加え育成し、
８×１０4細胞が１００μの同上培地に含まれる様に
し、９６穴の平底プレートに育種する。育種条件は３７
℃、２時間、５％ＣＯ2、１００％Ｈ2Ｏで通常細胞培養
に用いられる方法でよい。その後、アクチノマイシンＤ
培地中に終濃度１μｇ／ｍとなる様に加え、培養液の
液量を１５０μとする。即座に抗腫瘍性ポリペプチド
を含むと考えられる検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈した
ものを５０μ加える。この際、稀釈率を適宜調整して
ＥＤ５０を求めることができる。更に、最終液量が２０
０μとなったＬ−９２９細胞を上記条件で１８時間培
養を継続する。細胞壊死活性は、まず全培地を除去し、
ここに0.2％クリスタルバイオレットの２％メチルアル
コール溶液を加え固定染色する。クリスタルバイオレッ
トは全有核細胞を染色し、抗腫瘍性ポリペプチドにより
壊死し、フラスコ底面より遊離した細胞は染色しないの
で、抗腫瘍性ポリペプチド活性を直接測定できる。この
染色度をＯＤ ５９０ｎｍの吸収で測定し、対照群に対
する染色度と比較することにより抗腫瘍性ポリペプチド
活性を測定する。活性の定義は次の様に行う。Ｌ−９２
９細胞が５０％生存できる検体原液の稀釈率を原液の１
mlあたりの活性とする。即ち、原液の１倍稀釈でＥＤ５
０を与える検体の活性は１単位／mlである。
できる。即ち、標的細胞であるＬ−９２９細胞（Proc.
Natl. Acad. Sci. Ｕ．Ｓ．Ａ．７２，３６６６−３６
７０）をＭＥＭ培地に５％仔牛胎児血清を加え育成し、
８×１０4細胞が１００μの同上培地に含まれる様に
し、９６穴の平底プレートに育種する。育種条件は３７
℃、２時間、５％ＣＯ2、１００％Ｈ2Ｏで通常細胞培養
に用いられる方法でよい。その後、アクチノマイシンＤ
培地中に終濃度１μｇ／ｍとなる様に加え、培養液の
液量を１５０μとする。即座に抗腫瘍性ポリペプチド
を含むと考えられる検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈した
ものを５０μ加える。この際、稀釈率を適宜調整して
ＥＤ５０を求めることができる。更に、最終液量が２０
０μとなったＬ−９２９細胞を上記条件で１８時間培
養を継続する。細胞壊死活性は、まず全培地を除去し、
ここに0.2％クリスタルバイオレットの２％メチルアル
コール溶液を加え固定染色する。クリスタルバイオレッ
トは全有核細胞を染色し、抗腫瘍性ポリペプチドにより
壊死し、フラスコ底面より遊離した細胞は染色しないの
で、抗腫瘍性ポリペプチド活性を直接測定できる。この
染色度をＯＤ ５９０ｎｍの吸収で測定し、対照群に対
する染色度と比較することにより抗腫瘍性ポリペプチド
活性を測定する。活性の定義は次の様に行う。Ｌ−９２
９細胞が５０％生存できる検体原液の稀釈率を原液の１
mlあたりの活性とする。即ち、原液の１倍稀釈でＥＤ５
０を与える検体の活性は１単位／mlである。
このようにして得られる抗腫瘍性ポリペプチドが生成蓄
積された培養液は通常の蛋白質の精製法に準じて精製さ
れ、本発明の抗腫瘍性ポリペプチドが精製される。即
ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグ
ラフィー，塩析法，透析法．ゲル濾過法，疎水クロマト
グラフィー，高速分子篩クロマトグラフィー，電気泳動
法等を順次又は適宜組み合せることによって精製され
る。以下、更に具体的に説明する。塩基性陰イオン交換
体としてはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５，Ａ−５
０，ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ，ＤＥＡＥ−セ
ファミル（以上、ファルマシア社製）が好ましく、その
他ジエチルアミノ基，アミノエチル基または四級化アミ
ノエチル基含有陰イオン交換体等も使用される。使用さ
れる緩衝液としてはpH6.0〜9.0のトリス−塩酸塩または
リン酸緩衝液が望ましく、これら0.05Ｍ程度の希薄な緩
衝液で抗腫瘍性ポリペプチドの培養液を稀釈し、塩濃度
0.1Ｍ以下の溶液としてて陰イオン交換体と接触せしめ
て抗腫瘍性ポリペプチドを吸着させる。抗腫瘍性ポリペ
プチドの溶出は0.1〜0.2Ｍの食塩又は塩化カリウム等の
塩類溶液で行なわれ、抗腫瘍性ポリペプチドは0.2Ｍ付
近の塩濃度で溶出される。当該陰イオン交換体との接触
はカラム法が望ましいが、大量の場合にはバッチ法も採
用される。
積された培養液は通常の蛋白質の精製法に準じて精製さ
れ、本発明の抗腫瘍性ポリペプチドが精製される。即
ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグ
ラフィー，塩析法，透析法．ゲル濾過法，疎水クロマト
グラフィー，高速分子篩クロマトグラフィー，電気泳動
法等を順次又は適宜組み合せることによって精製され
る。以下、更に具体的に説明する。塩基性陰イオン交換
体としてはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５，Ａ−５
０，ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ，ＤＥＡＥ−セ
ファミル（以上、ファルマシア社製）が好ましく、その
他ジエチルアミノ基，アミノエチル基または四級化アミ
ノエチル基含有陰イオン交換体等も使用される。使用さ
れる緩衝液としてはpH6.0〜9.0のトリス−塩酸塩または
リン酸緩衝液が望ましく、これら0.05Ｍ程度の希薄な緩
衝液で抗腫瘍性ポリペプチドの培養液を稀釈し、塩濃度
0.1Ｍ以下の溶液としてて陰イオン交換体と接触せしめ
て抗腫瘍性ポリペプチドを吸着させる。抗腫瘍性ポリペ
プチドの溶出は0.1〜0.2Ｍの食塩又は塩化カリウム等の
塩類溶液で行なわれ、抗腫瘍性ポリペプチドは0.2Ｍ付
近の塩濃度で溶出される。当該陰イオン交換体との接触
はカラム法が望ましいが、大量の場合にはバッチ法も採
用される。
陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう前に、前処理
として限外濾過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。
として限外濾過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。
陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶液は透析
後、濃縮してゲル濾過に付される。ゲル濾過用の担体と
してはセファデックスＧ−７５，Ｇ−１００（ファルマ
シア社製），セファクリルＳ−２００（ファルマシア社
製），バイオゲルＰ−１００（バイオラット社製）及び
トーヨーパールＨＷ−５０，ＨＷ−５５（東洋曹達工業
社製）等が使用される。ゲル濾過に使用する緩衝液はpH
6.0〜9.0のトリス−塩酸塩またはリン酸緩衝液が使用さ
れ、吸着を防ぐ目的で0.2〜0.5Ｍの食塩等の塩類を添加
して使用すことが望ましい。この工程による精製度は２
〜１０倍である。
後、濃縮してゲル濾過に付される。ゲル濾過用の担体と
してはセファデックスＧ−７５，Ｇ−１００（ファルマ
シア社製），セファクリルＳ−２００（ファルマシア社
製），バイオゲルＰ−１００（バイオラット社製）及び
トーヨーパールＨＷ−５０，ＨＷ−５５（東洋曹達工業
社製）等が使用される。ゲル濾過に使用する緩衝液はpH
6.0〜9.0のトリス−塩酸塩またはリン酸緩衝液が使用さ
れ、吸着を防ぐ目的で0.2〜0.5Ｍの食塩等の塩類を添加
して使用すことが望ましい。この工程による精製度は２
〜１０倍である。
また、陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた抗腫
瘍性ポリペプチド活性溶液は疎水クロマトグラフィーで
精製することもでき、この場合はブチル−トーヨーパー
ル６５０（東洋曹達工業社製）等を担体とし、硫安，食
塩等の塩類を用いて抗腫瘍性ポリペプチドを溶出せしめ
る。この工程による精製度は５〜３０倍であり、回収率
は８０％以上である。また、この段階で抗腫瘍性ポリペ
プチドの比活性は１×１０6以上、抗腫瘍性ポリペプチ
ド含有率は1.0％以上になる。
瘍性ポリペプチド活性溶液は疎水クロマトグラフィーで
精製することもでき、この場合はブチル−トーヨーパー
ル６５０（東洋曹達工業社製）等を担体とし、硫安，食
塩等の塩類を用いて抗腫瘍性ポリペプチドを溶出せしめ
る。この工程による精製度は５〜３０倍であり、回収率
は８０％以上である。また、この段階で抗腫瘍性ポリペ
プチドの比活性は１×１０6以上、抗腫瘍性ポリペプチ
ド含有率は1.0％以上になる。
ゲル濾過で精製した抗腫瘍性ポリペプチド含有液は、次
いでMono Ｑ ＨＲ５／５カラム（ファルマシア社製、
高性能陰イオン交換体カラム）を使用するファルマシア
ＦＰＬＣ（Fast Protein,Peptide,Polynucleotide,Liqu
id Chromatography）システムによる高性能陰イオン交
換クロマトグラフィーによって更に精製される。精製度
は５〜１０倍で活性の回収率は７０〜９０％である。
いでMono Ｑ ＨＲ５／５カラム（ファルマシア社製、
高性能陰イオン交換体カラム）を使用するファルマシア
ＦＰＬＣ（Fast Protein,Peptide,Polynucleotide,Liqu
id Chromatography）システムによる高性能陰イオン交
換クロマトグラフィーによって更に精製される。精製度
は５〜１０倍で活性の回収率は７０〜９０％である。
この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィーの条件は
最初のＤＥＡＥ−セファローズ等の担体を使用する陰イ
オン交換クロマトグラフィーの場合と同じ条件下であ
る。
最初のＤＥＡＥ−セファローズ等の担体を使用する陰イ
オン交換クロマトグラフィーの場合と同じ条件下であ
る。
ＦＰＬＣにより精製された抗腫瘍性ポリペプチド溶液を
Mono Ｑ ＨＲ５／５カラムを使用する再ＦＰＬＣでＳ
ＤＳ−電気泳動的に単一な活性蛋白として精製すること
ができ、この方法による精製度は５〜１０倍であり、蛋
白に対する比活性５×１０8単位／mg蛋白質を有する精
製標品が得られる。
Mono Ｑ ＨＲ５／５カラムを使用する再ＦＰＬＣでＳ
ＤＳ−電気泳動的に単一な活性蛋白として精製すること
ができ、この方法による精製度は５〜１０倍であり、蛋
白に対する比活性５×１０8単位／mg蛋白質を有する精
製標品が得られる。
ところが、このＳＤＳ−電気泳動的に単一な活性標品に
ついて溶出条件を変えてMono Ｑ ＨＲ５／５カラムを
使用するＦＰＬＣによるイオン交換クロマトグラフィー
を行うことにより３種類の活性蛋白質成分が分離される
ことが判明した。それぞれの活性蛋白を分取し、同条件
下で再ＦＰＬＣを行うことにより３種類の活性蛋白標品
が得られる。
ついて溶出条件を変えてMono Ｑ ＨＲ５／５カラムを
使用するＦＰＬＣによるイオン交換クロマトグラフィー
を行うことにより３種類の活性蛋白質成分が分離される
ことが判明した。それぞれの活性蛋白を分取し、同条件
下で再ＦＰＬＣを行うことにより３種類の活性蛋白標品
が得られる。
ＦＰＬＣで溶出される順にＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２，及
びＴＮＦ−３と名づけた。
びＴＮＦ−３と名づけた。
これら単離された抗腫瘍性ポリペプチドの理化学的性質
及びＬ−９２９に対する比活性は次のとおりである。
及びＬ−９２９に対する比活性は次のとおりである。
この表に示すように分子量及び等電点について差は見ら
れないが、比活性において差が見出される。次にＴＮＦ
−１，ＴＮＦ−２，ＴＮＦ−３のＮ末端アミノ酸配列を
示す。
れないが、比活性において差が見出される。次にＴＮＦ
−１，ＴＮＦ−２，ＴＮＦ−３のＮ末端アミノ酸配列を
示す。
上記Ｎ末端アミノ酸配列においてＸで示される第４番目
のアミノ酸は気相アミノ酸配列分析機で同定されないア
ミノ酸であり、Serは検出されず、この方法では検出さ
れないアミノ酸であるCysの可能性が考えられる。前述
のヒト細胞株ＨＬ−６０より得られるＴＮＦのＮ末端ア
ミノ酸配列はVal-Arg-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Ly
s-Pro-Val-Ala-His-Valであることが記載されており、
これと比較するとＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２，ＴＮＦ−３
は第４番目のアミノ酸がSerではなく、第５番目のアミ
ノ酸もSerではなくThrとなっており、第１０番目のアミ
ノ酸もAspではなくArg又はProとなっている。更にＴＮ
Ｆ−１は第１２番目のアミノ酸がPheとなっている。従
って、ＨＬ−６０より得られるＴＮＦと本発明の抗腫瘍
性ポリペプチドはＮ末端アミノ酸配列において明らかに
異なっている。因みにウサギのＴＮＦのＮ末端アミノ酸
配列は特開昭６０−１９７１９号公報にSer-Ala-Ser-Ar
g-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Valであるこ
とが記載されているが、これとＨＬ−６０のＴＮＦを比
較すると、Ｎ末端の２個のアミノ酸が欠如しているほ
か、第４，第７，第８及び第１３番目のアミノ酸が異な
っている。他の大部分のアミノ酸配列はウサギのものも
ＨＬ−６０のものも差がないといわれている。本発明の
抗腫瘍性ポリペプチドについてＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で単一なバンドを示す抗腫瘍性ポリペプ
チド（ＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２およびＴＮＦ−３の混合
物）１００μｇを含む水溶液１００μにトリプシン3.
3μｇを加え３７℃、pH8.0で２２時間放置してトリプシ
ン分解を行った。分解物をＲＰ３１８カラム（バイオラ
ッド社製、逆相ＨＰＬＣ用カラム）を使用するＨＰＬＣ
によりＦ−１からＦ−８のフラグメントとして分離し
た。それぞれのフラグメントについてアプライド・バイ
オシステムズ社製、アミノ酸シークエンシングアナライ
ザー（モデル ４７０Ａ）を用いてエドマン分解を行っ
た。遊離してくるフェニルチオヒダントイン−アミノ酸
をＨＰＬＣ（島津ＬＣ−４Ａ型）にて分析を行い常法に
従ってアミノ酸を決定した。その結果は次のとおりであ
った。
のアミノ酸は気相アミノ酸配列分析機で同定されないア
ミノ酸であり、Serは検出されず、この方法では検出さ
れないアミノ酸であるCysの可能性が考えられる。前述
のヒト細胞株ＨＬ−６０より得られるＴＮＦのＮ末端ア
ミノ酸配列はVal-Arg-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Ly
s-Pro-Val-Ala-His-Valであることが記載されており、
これと比較するとＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２，ＴＮＦ−３
は第４番目のアミノ酸がSerではなく、第５番目のアミ
ノ酸もSerではなくThrとなっており、第１０番目のアミ
ノ酸もAspではなくArg又はProとなっている。更にＴＮ
Ｆ−１は第１２番目のアミノ酸がPheとなっている。従
って、ＨＬ−６０より得られるＴＮＦと本発明の抗腫瘍
性ポリペプチドはＮ末端アミノ酸配列において明らかに
異なっている。因みにウサギのＴＮＦのＮ末端アミノ酸
配列は特開昭６０−１９７１９号公報にSer-Ala-Ser-Ar
g-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Valであるこ
とが記載されているが、これとＨＬ−６０のＴＮＦを比
較すると、Ｎ末端の２個のアミノ酸が欠如しているほ
か、第４，第７，第８及び第１３番目のアミノ酸が異な
っている。他の大部分のアミノ酸配列はウサギのものも
ＨＬ−６０のものも差がないといわれている。本発明の
抗腫瘍性ポリペプチドについてＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で単一なバンドを示す抗腫瘍性ポリペプ
チド（ＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２およびＴＮＦ−３の混合
物）１００μｇを含む水溶液１００μにトリプシン3.
3μｇを加え３７℃、pH8.0で２２時間放置してトリプシ
ン分解を行った。分解物をＲＰ３１８カラム（バイオラ
ッド社製、逆相ＨＰＬＣ用カラム）を使用するＨＰＬＣ
によりＦ−１からＦ−８のフラグメントとして分離し
た。それぞれのフラグメントについてアプライド・バイ
オシステムズ社製、アミノ酸シークエンシングアナライ
ザー（モデル ４７０Ａ）を用いてエドマン分解を行っ
た。遊離してくるフェニルチオヒダントイン−アミノ酸
をＨＰＬＣ（島津ＬＣ−４Ａ型）にて分析を行い常法に
従ってアミノ酸を決定した。その結果は次のとおりであ
った。
Ｆ−１：Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-G ly-Gl
n-Leu-Gln Ｆ−２：Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala Ｆ−３：Asn-Gln-Leu-Val-Val-X-X-X-Gly-Leu Ｆ−４：Ile-Ala-Val-X-Tyr Ｆ−５：Val-Asn-Leu-Leu Ｆ−６：Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala Ｆ−７：Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe Ｆ−８：Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Le
u-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gly-Gln-Val-Tyr これらのＦ−１〜Ｆ−８のトリプシン分解フラグメント
の分析結果から推定される構造はいずれもＨＬ−６０の
ＴＮＦ構造中に見い出されるので、ＴＮＦ−１，ＴＮＦ
−２，およびＴＮＦ−３のいずれもＮ末端から１３番目
以降のアミノ酸配列はＨＬ−６０のＴＮＦと同じである
と推定される。
n-Leu-Gln Ｆ−２：Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala Ｆ−３：Asn-Gln-Leu-Val-Val-X-X-X-Gly-Leu Ｆ−４：Ile-Ala-Val-X-Tyr Ｆ−５：Val-Asn-Leu-Leu Ｆ−６：Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala Ｆ−７：Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe Ｆ−８：Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Le
u-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gly-Gln-Val-Tyr これらのＦ−１〜Ｆ−８のトリプシン分解フラグメント
の分析結果から推定される構造はいずれもＨＬ−６０の
ＴＮＦ構造中に見い出されるので、ＴＮＦ−１，ＴＮＦ
−２，およびＴＮＦ−３のいずれもＮ末端から１３番目
以降のアミノ酸配列はＨＬ−６０のＴＮＦと同じである
と推定される。
高純度に精製された本発明の抗腫瘍性ポリペプチドはヒ
トに投与したときに副作用がなく、腫瘍細胞のみを壊死
せしめる作用を有するものと期待される。精製した抗腫
瘍性ポリペプチドはマウスに静注投与したとき急性およ
び亜急性毒性を示さず、たとえば腎原発肺転移を有する
末期癌患者に静注投与すれば病巣は消失、縮退または拡
大を停止し、治癒するものと思われる。本発明の抗腫瘍
性ポリペプチドはヒト正常細胞ＷＩ−３８及びFlow１０
００並びにマウス胎児細胞に対して細胞毒性を示さない
が、ヒト腫瘍細胞ヘラ(Hele)及びＫＢ並びにマウス腫瘍
細胞サルコーマ１８０及びＬ−１２１０に対して細胞毒
性を示すと思われる。
トに投与したときに副作用がなく、腫瘍細胞のみを壊死
せしめる作用を有するものと期待される。精製した抗腫
瘍性ポリペプチドはマウスに静注投与したとき急性およ
び亜急性毒性を示さず、たとえば腎原発肺転移を有する
末期癌患者に静注投与すれば病巣は消失、縮退または拡
大を停止し、治癒するものと思われる。本発明の抗腫瘍
性ポリペプチドはヒト正常細胞ＷＩ−３８及びFlow１０
００並びにマウス胎児細胞に対して細胞毒性を示さない
が、ヒト腫瘍細胞ヘラ(Hele)及びＫＢ並びにマウス腫瘍
細胞サルコーマ１８０及びＬ−１２１０に対して細胞毒
性を示すと思われる。
以下、実施例にて本発明を詳細に説明する。
実施例１ ５％牛胎児性血清を有するＲＰＭＩ−１６４０無菌培地
２００を３００容培養槽に張り込み、この培地ＴＨ
Ｐ−１細胞を２×１０5個／ｍになるように懸濁し
た。これを３７℃で４日間培養し、得られた培養液を遠
心分離してＴＨＰ−１細胞を無菌的に採取した。この細
胞を別の培養槽に入れた血清を含まない上記ＲＰＭＩ−
１６４０培地２００に移し、これにＴＰＡを１００ｎ
ｇ／ｍ添加し、ゆるやかに液を攪拌（１００ｒ．ｐ．
ｍ．）しつつ無菌的条件下37.0℃で５時間培養（誘導）
を行った。このようにして得られた培養液を遠心分離し
て細胞を分離、除去して1.5×１０３単位／mlの抗腫瘍
性ポリペプチド活性を有する培養液を得た。このように
して得られた培養上清液を限外濾過膜（ミリポア社製、
ＨＶＬＰ ＯＨＶ ２０）で1/10量になるまで濃縮し
た。この濃縮液に固形硫酸アンモニウムを加え（６５％
飽和量）て溶解し、蛋白を沈澱させた。該沈殿物を遠心
分離（１０００r.p.m.，２０分間）により採取し、少量
の0.05Ｍトリス−塩酸塩緩衝液（pH7.7）に溶解せしめ
た。次いで、これを同緩衝液に対し透析し（５℃、２４
時間）、内液に等量の緩衝液を加え、これを予め同緩衝
液で平衡化させたＤＥＡＥ−トーヨーパールＭ６５０カ
ラム（５×４０cm）に負荷した。このカラムを同緩衝液
1.0で洗浄後、0.2Ｍの食塩を含有する同緩衝液で溶出
した。
２００を３００容培養槽に張り込み、この培地ＴＨ
Ｐ−１細胞を２×１０5個／ｍになるように懸濁し
た。これを３７℃で４日間培養し、得られた培養液を遠
心分離してＴＨＰ−１細胞を無菌的に採取した。この細
胞を別の培養槽に入れた血清を含まない上記ＲＰＭＩ−
１６４０培地２００に移し、これにＴＰＡを１００ｎ
ｇ／ｍ添加し、ゆるやかに液を攪拌（１００ｒ．ｐ．
ｍ．）しつつ無菌的条件下37.0℃で５時間培養（誘導）
を行った。このようにして得られた培養液を遠心分離し
て細胞を分離、除去して1.5×１０３単位／mlの抗腫瘍
性ポリペプチド活性を有する培養液を得た。このように
して得られた培養上清液を限外濾過膜（ミリポア社製、
ＨＶＬＰ ＯＨＶ ２０）で1/10量になるまで濃縮し
た。この濃縮液に固形硫酸アンモニウムを加え（６５％
飽和量）て溶解し、蛋白を沈澱させた。該沈殿物を遠心
分離（１０００r.p.m.，２０分間）により採取し、少量
の0.05Ｍトリス−塩酸塩緩衝液（pH7.7）に溶解せしめ
た。次いで、これを同緩衝液に対し透析し（５℃、２４
時間）、内液に等量の緩衝液を加え、これを予め同緩衝
液で平衡化させたＤＥＡＥ−トーヨーパールＭ６５０カ
ラム（５×４０cm）に負荷した。このカラムを同緩衝液
1.0で洗浄後、0.2Ｍの食塩を含有する同緩衝液で溶出
した。
抗腫瘍性ポリペプチド活性区分2.0を集め、硫安分画
（４０％〜５５％飽和画分）を行い、得られた硫安沈澱
を少量の水に溶かし、この水溶液を同緩衝液で十分透析
した（５℃、２４時間）。
（４０％〜５５％飽和画分）を行い、得られた硫安沈澱
を少量の水に溶かし、この水溶液を同緩衝液で十分透析
した（５℃、２４時間）。
透析内液に４０％飽和量の硫安を加えて溶解し、遠心分
離して不溶物を除去し、予め４０％飽和硫安を含む0.05
Ｍトリス−塩酸塩緩衝液で平衡化したブチル−トーヨー
パール６５０Ｓカラム接触2.5×３０cm）を用い流速2.0
ｍ／min．の条件で疎水クロマトグラフィーを行っ
た。次いで、抗腫瘍性ポリペプチド活性画分を集め、0.
05Ｍトリス−塩酸塩緩衝液（pH7.8）で透析した。透析
内液を予め５０ｍＭトリス−塩酸塩緩衝液（pH8.5）で
平衡化したMono Ｑ ＨＲ５／５カラムに負荷し、同緩
衝液で洗浄した後、0.1,0.15,0.2,0.3Ｍと順次食塩濃度
を上げる段階的溶出法により抗腫瘍性ポリペプチド活性
物質を溶出した。抗腫瘍性ポリペプチド活性は0.2Ｍの
食塩で溶出され、比活性１×１０8単位／mg蛋白質まで
精製された。この工程における精製度は５〜１５倍、回
収率は８０％以上であった。
離して不溶物を除去し、予め４０％飽和硫安を含む0.05
Ｍトリス−塩酸塩緩衝液で平衡化したブチル−トーヨー
パール６５０Ｓカラム接触2.5×３０cm）を用い流速2.0
ｍ／min．の条件で疎水クロマトグラフィーを行っ
た。次いで、抗腫瘍性ポリペプチド活性画分を集め、0.
05Ｍトリス−塩酸塩緩衝液（pH7.8）で透析した。透析
内液を予め５０ｍＭトリス−塩酸塩緩衝液（pH8.5）で
平衡化したMono Ｑ ＨＲ５／５カラムに負荷し、同緩
衝液で洗浄した後、0.1,0.15,0.2,0.3Ｍと順次食塩濃度
を上げる段階的溶出法により抗腫瘍性ポリペプチド活性
物質を溶出した。抗腫瘍性ポリペプチド活性は0.2Ｍの
食塩で溶出され、比活性１×１０8単位／mg蛋白質まで
精製された。この工程における精製度は５〜１５倍、回
収率は８０％以上であった。
このようにして得られた活性区分を集め、Mono Ｑ Ｈ
Ｒ５／５カラムを用いて同条件で再びＦＰＬＣを行っ
た。再ＦＰＬＣの溶出パターンを第１図に示す。この図
において縦軸は２８０nmにおける吸光度（％）を示し、
横軸は溶出時間（分）を示す。図面から明らかなよう
に、抗腫瘍性ポリペプチド活性は0.1Ｍの食塩で溶出さ
れ、２８０ｎｍのピークと良く一致した。この活性区分
を集めて純水で透析した後、凍結乾燥して２００μｇの
精製標品を得た。この標品の比活性は5.0×１０8単位／
mg蛋白質である。
Ｒ５／５カラムを用いて同条件で再びＦＰＬＣを行っ
た。再ＦＰＬＣの溶出パターンを第１図に示す。この図
において縦軸は２８０nmにおける吸光度（％）を示し、
横軸は溶出時間（分）を示す。図面から明らかなよう
に、抗腫瘍性ポリペプチド活性は0.1Ｍの食塩で溶出さ
れ、２８０ｎｍのピークと良く一致した。この活性区分
を集めて純水で透析した後、凍結乾燥して２００μｇの
精製標品を得た。この標品の比活性は5.0×１０8単位／
mg蛋白質である。
次に本蛋白質についてファルマシア製、ＦＰＬＣシステ
ムのアニオン交換カラムMono Ｑ カラム クロマトを
行い、下記の条件で溶出を行った。
ムのアニオン交換カラムMono Ｑ カラム クロマトを
行い、下記の条件で溶出を行った。
この溶出条件においてリテンションタイム３５分，３６
分，37.8分に溶出される３つのピークを分取した。（こ
れら３つのピークはそれぞれＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２，
ＴＮＦ−３である。）さらに、各々について上記の条件
で再クロマトを行い、純化した。それぞれの抗腫瘍性ポ
リペプチドは以下に示す方法でいずれも単一な蛋白であ
ることが証明される。
分，37.8分に溶出される３つのピークを分取した。（こ
れら３つのピークはそれぞれＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２，
ＴＮＦ−３である。）さらに、各々について上記の条件
で再クロマトを行い、純化した。それぞれの抗腫瘍性ポ
リペプチドは以下に示す方法でいずれも単一な蛋白であ
ることが証明される。
まず、それぞれのサンプルについてPro−ＲＰＣ ＨＲ
５／２（ファルマシア社製、Ｃ−４逆相担体）カラムを
用いて逆相ＦＰＬＣを行った。0.1％トリフルオロ酢酸
を展開液とし、アセトニトリルの濃度を０％から７０％
直線時に変えて溶出した。この内ＴＮＦ−１の溶出パタ
ーンを第２図に示す。ＴＮＦ−１ポリペプチドはアセト
ニトリル３６％付近で溶出され、他に蛋白のピークは認
められない。ＴＮＦ−２およびＴＮＦ−３についても同
じような結果が得られた。従って、逆相ＦＰＬＣ的に単
一物質といえる。
５／２（ファルマシア社製、Ｃ−４逆相担体）カラムを
用いて逆相ＦＰＬＣを行った。0.1％トリフルオロ酢酸
を展開液とし、アセトニトリルの濃度を０％から７０％
直線時に変えて溶出した。この内ＴＮＦ−１の溶出パタ
ーンを第２図に示す。ＴＮＦ−１ポリペプチドはアセト
ニトリル３６％付近で溶出され、他に蛋白のピークは認
められない。ＴＮＦ−２およびＴＮＦ−３についても同
じような結果が得られた。従って、逆相ＦＰＬＣ的に単
一物質といえる。
次に、同じサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。すなわち、バ
イオラッド社製のスラブ電気泳動装置（「ＰＲＯＴＥＡ
Ｎ」、１６cm）を用い、0.1％ＳＤＳを含有する15.0％
のポリアクリルアミドゲルにサンプルを負荷し、２０ｍ
Ａの定電流で電気泳動を行った。次いで銀染色を行って
蛋白を検出した。この結果、いずれも17.4Ｋｄの位置に
単一バンドとして検出され、他に蛋白のバンドは認めら
れなかった。従って、本蛋白標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥ的
に均一な蛋白であることが証明された。またこれらの蛋
白標品についてＬＫＢ社製のアンホライン（Ampholin
e）ポリアクリルアミドゲルを使用するポリアクリルア
ミドゲル等電点電気泳動法により等電点を測定した結
果、いずれも等電点（ｐＩ）は5.7であった。
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。すなわち、バ
イオラッド社製のスラブ電気泳動装置（「ＰＲＯＴＥＡ
Ｎ」、１６cm）を用い、0.1％ＳＤＳを含有する15.0％
のポリアクリルアミドゲルにサンプルを負荷し、２０ｍ
Ａの定電流で電気泳動を行った。次いで銀染色を行って
蛋白を検出した。この結果、いずれも17.4Ｋｄの位置に
単一バンドとして検出され、他に蛋白のバンドは認めら
れなかった。従って、本蛋白標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥ的
に均一な蛋白であることが証明された。またこれらの蛋
白標品についてＬＫＢ社製のアンホライン（Ampholin
e）ポリアクリルアミドゲルを使用するポリアクリルア
ミドゲル等電点電気泳動法により等電点を測定した結
果、いずれも等電点（ｐＩ）は5.7であった。
次に、これら３つの抗腫瘍性ポリペプチドについて、Ｎ
末端よりアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列の決定
はガスフェイズアミノ酸シークエンサー（モデル４７０
Ａ）を用い、各々のサンプルについて約１０μｇを分析
した。その結果をＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２及びＴＮＦ−
３のＮ末端アミノ酸配列は前記した通りであった。
末端よりアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列の決定
はガスフェイズアミノ酸シークエンサー（モデル４７０
Ａ）を用い、各々のサンプルについて約１０μｇを分析
した。その結果をＴＮＦ−１，ＴＮＦ−２及びＴＮＦ−
３のＮ末端アミノ酸配列は前記した通りであった。
本発明に使用するＴＨＰ−１はInt.J.Cancer２６，１７
１−１７６（１９８０）に記載されているものであり、
この報文の著者より分与されたものである。ＴＨＰ−１
はProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. ８０，５３９７−５４
０１（１９８３），Cancer Research，４２，４８４−
４８９（１９８２）（ここには、ＴＨＰ−１はDr.G.Rov
eraより分与されたものであると記載されている。）に
も記載されていて、これらの研究機関にも分与されてい
る。また、本発明者らは権利を有するいずれのものに対
してもＴＨＰ−１を分与する用意がある。
１−１７６（１９８０）に記載されているものであり、
この報文の著者より分与されたものである。ＴＨＰ−１
はProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. ８０，５３９７−５４
０１（１９８３），Cancer Research，４２，４８４−
４８９（１９８２）（ここには、ＴＨＰ−１はDr.G.Rov
eraより分与されたものであると記載されている。）に
も記載されていて、これらの研究機関にも分与されてい
る。また、本発明者らは権利を有するいずれのものに対
してもＴＨＰ−１を分与する用意がある。
以上のように、本発明の抗腫瘍性ポリペプチドはヒト正
常細胞には細胞毒性を示さないが、ヒト腫瘍細胞に対し
て細胞毒性を示す。しかも、本発明によればこの抗腫瘍
性ポリペプチドは、ヒト骨髄性白血病細胞を浮遊培養す
ることによっても、また血清を含まない培地を用いても
製造することができる。
常細胞には細胞毒性を示さないが、ヒト腫瘍細胞に対し
て細胞毒性を示す。しかも、本発明によればこの抗腫瘍
性ポリペプチドは、ヒト骨髄性白血病細胞を浮遊培養す
ることによっても、また血清を含まない培地を用いても
製造することができる。
第１図は抗腫瘍性ポリペプチド混合物の陰イオン交換ク
ロマトグラフと抗腫瘍性ポリペプチド活性を示すグラ
フ、第２図はＴＮＦ−１の逆相クロマトグラフを示すも
のである。
ロマトグラフと抗腫瘍性ポリペプチド活性を示すグラ
フ、第２図はＴＮＦ−１の逆相クロマトグラフを示すも
のである。
Claims (1)
- 【請求項１】Ｎ末端からのアミノ酸配列がVal-A-Ser-X-
Thr-B-Thr-C-D-E-F-G-Val-Ala-His-Val-Ala-Asnで表わ
され、かつＡがArg又はLys、ＢがArg又はPro、ＣがArg
又はPro、ＤがSer又はLys、ＥがArg又はPro、ＦがLys又
はVal、ＧがPhe又はPro、Ｘが未固定アミノ酸であるペ
プチドフラグメントを有し、他にトリプシン分解フラグ
メントとしてVal-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gl
n-Leu-Gln,Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala,Asn-Gln-Leu-Val-
Val-X-X-X-Gly-Leu,Ile-Ala-Val-X-Tyr,Val-Asn-Leu-Le
u,Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala,Tyr-Glu-Pro-Ile-
Tyr-Leu-Gly-Gly-X-Phe及びLeu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-A
rg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gln-Val
-Tyrを有し、かつ下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性
ポリペプチド。 （ａ）分子量：１７４００±５００（ＳＤＳ電気泳動
法） （ｂ）等電点：ｐＩ5.7±0.2（ゲル等電点電気泳動法） （ｃ）pH安定性：pH６から９の範囲で安定 （ｄ）温度安定性：pH7.0，６５℃，１時間の加熱によ
り６０〜７０％失活する （ｅ）蛋白質分解酵素に対する安定性：失活する （ｆ）生理活性：ヒト正常細胞に対し細胞毒性を示さ
ず、ヒト腫瘍細胞に対し細胞毒性を示す
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60167037A JPH064675B2 (ja) | 1985-07-29 | 1985-07-29 | 抗腫瘍性ポリペプチド |
| DE8686110139T DE3687246T2 (de) | 1985-07-29 | 1986-07-23 | Antitumor-polypeptid und dessen methode zur herstellung. |
| EP86110139A EP0210588B1 (en) | 1985-07-29 | 1986-07-23 | Antitumor polypeptide and a method of preparing the same |
| AT86110139T ATE83246T1 (de) | 1985-07-29 | 1986-07-23 | Antitumor-polypeptid und dessen methode zur herstellung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60167037A JPH064675B2 (ja) | 1985-07-29 | 1985-07-29 | 抗腫瘍性ポリペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6226226A JPS6226226A (ja) | 1987-02-04 |
| JPH064675B2 true JPH064675B2 (ja) | 1994-01-19 |
Family
ID=15842213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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