JPS60226816A - 抗腫瘍活性をもつヒト由来蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗腫瘍活性を有する新規なヒト由来生理活性
物質に関するものである。

本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記法
により表示され、例えば下記の略号が使用される。なお
、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特
に明示しなければ５体を示すものとする。

Ａｌａ　：　アラニン ＡＳｎ　：　アスパラギン Ｇｌｎ　：　グルタミン Ｇｌｕ　：　グルタミン酸 Ｇｔｙ　：　グリシン Ｌｅｕ　：　ロイシン Ｐｒｏ　：　プロリン Ｖａｌ　：　バリン 網内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば、各種ダ
ラム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗腫瘍細
胞能力などの生理活性を有する物質の存在は多数報告さ
れている。例えばＣａｒｓｗｅｌｌらは、ＣＤ　−Ｉ　
５ｗ１ｓｓ−ｒウスにＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔ
ｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　（Ｂ　ＣＧ　）を投与し、その２
週間後にエンドトキシンを静脈内注射して得られる該マ
ウスの血清が、培養した細胞に対して殺細胞作用を有す
ること、およびＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａで担癌さ
せた（　ＢＡＬＢ／ｃＸＣ５７ＢＬ／６）Ｆ、　マウス
の腫瘍を出血性壊具に至らしめる現象を見出し、ＴＮＦ
Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　）と名
づけたＣ　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２巻（Ａ９
）５６６６頁（１９７５年）〕。その後、Ｒｕｆｆら（
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　。

１２５巻（Ａ４）１６７１頁（’１９８０年）〕および
ＭａｔｔｈｅｗｓらＣＢｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　ａ皓４
１ｂ頁（１９８０年）〕は、前記ＣＣａｎｃｅｒｌらの
方法に準じて調製したウサギ血清からＴＮＦの精製を試
みて、それぞれ原血清に比べて約２０００倍および約１
０００倍ｍｇされたものを得ている。しかし、いずれの
場合にも精製されたものに関しては動物実験において抗
腫瘍効果を確認していない。

また、Ｒｕｆｆら（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１１
５巻５９５頁（１９７５年）〕は、ヒト末梢血中の付着
性細胞よシ、Ｍａｔｔｈｅｗら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
　４４巻１３５頁（１９８１年）〕は、ヒト末末梢血球
および骨髄性単球性白血病患者由来の白血病細胞より、
ＴＮＦ様の活性を有する因子を見出したとの報告をして
いるが、動物実験における抗腫瘍効果すら確認されてい
ないなど、その本体については明確ではない。

本発明者らは、ヒト由来の活性化マクロファージを含む
組織培養系に誘発される、制癌作用含有する蛋白性の生
理活性物質について鋭意研究を続けていたが、分子量約
４．５万、等電点的６．０の優れた抗腫瘍活性を有する
新しい蛋白性生理活性物質を見出し、更に研究を続けた
結果、本発明を完成するに至った。

本発明は、 Ｖａ　１７Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　ｓ　ｎ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　
Ｉ　ｎ−Ａ　Ｉ　ａ　−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ で表わされるアミノ酸配列構造を含有するポリペプチド
のサブユニットからなる構造を有し、かつ実験例３に記
載のＬ−Ｍ細胞を用いる評価における比活性が４　Ｘ　
１０６〜２×１０丁単位／ｍ９蛋白質である蛋白質に関
す為ものである。

更に、本発明の物質は、実験例４に記載のＭｅ　ｔ　ｈ
Ａ　ｓａｒｃｏｍａ　押癌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マ
ウスを用いる生物評価において、１匹当り１００〜２０
０単位を腫瘍内に投与した場合の活性が（＋）以上であ
る。また、セルロースアセテート膜を用いる電気泳動で
けγ−グロブリン領域に泳動され、各種レクチンカラム
ｒ　Ｃｏｎ　Ａ−セファロース（ファルマシア社製）、
ＲＣＡ　−Ｉ−ゲル（Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社Ｍ）、Ｗ
　Ｇ　Ａ−セファロース６ＭＢ（ファルマシア社製）Ｕ
ＥＡ−Ｉ−ゲル（Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社製）、ＬＰＡ
−ゲル（Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社製）〕Ｋ吸着しない性
状を有している。

本発明にかかる新規生理活性物質はヒト由来活性化マク
ロファージよシ誘導される。ヒト由来活性化マクロファ
ージとはヒ臓または肺組織マクロファージなどの組織マ
クロファージ、分化誘導能を有する物質共存下で培養し
た末梢血単球もしくはある棟の骨髄性単球性白血病患者
の白血病細胞から樹立された株細胞などを用いることが
できる。

株細胞としてはＨＬ−６０ｆｊｊＵ胞（Ｎａｔｕｒｅ　
２７０巻６４７頁（１９７７年）〕、ＴＩ（Ｐ−１細胞
（Ｉｎｔ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　２６巻１７１頁（１９８０年）〕
などがあげられる。分化誘導能を有する物質としては１
２−０−テトラデカノイルホルボール−１５−アセテー
ト、ホルボール１２．１３−ジデカノエート、ホルボー
ル１２．１３−ジベンゾエートなどのホルボールエステ
ル類、メゼレインなどのジテルペン類、テレオシジン、
ビタミンＡ酸、ビタミンＡアルコールなどのビタミンＡ
誘導体、ジメチルスルホキシド、ペプトンまたはカゼイ
ン加水分解物などが好適に用いられる。

本発明における活性化マクロファージはグラム陰性菌由
来のエンドトキシンもしくはダラム陽性菌または酵母の
菌体壁を共存下に培養することによりＴＮＦ様物質をよ
り多量に産生ずる。

本発明の新規生理活性物質の物性は、以下に記載する実
験方法１〜８の各方法によって測定したものである。

実験方法 １）分子量測定法 Ａ）セファクリル３−２００（ファルマシア社製、スウ
ェーデン）のカラム（１，５ｘ　１００ＱＩ）を用い、
０．１Ｍ塩化ナトリウム７５０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）Ｉｃてゲル濾過を行った。分子量測定用標準
蛋白質（ファルマシア社製、リボヌクレアーゼＡ１キモ
トリプシノーゲンＡ１オブアルプミン、アルドラーゼ）
を用いて分子量検量線を作成し、Ｌ−Ｍ細胞を用いた活
性評価により分子量の測定をした。本発明になる生理活
性物質は、オプアルプミンとほぼ同じ位置に溶出し、分
子量は４５．０００±ｓ、ｏ　ｏ　ｏであった。

Ｂ）　Ｓｅｒｇｒｅｓｔらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２８−８巻５４頁（１９７２年
）〕に従い、トリス／グリシン／ＳＤＳ　（ｐＨ８，３
）でＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルに１０μ７の試料
を付与し、電気泳動を行った。、標準分子量キット（フ
ァルマシア社製）を用いて分子量検量線を作成し、Ｌ−
Ｍ細胞での活性評価と、染色（クーマシー・ブリリアン
ト・ブルーＲ−２５０）により分子量を決定した。本発
明になる生理活性物質は、２２，０００±５，０００の
位（ｈｋ染色バンドと活性を示した。

２）等電点測定法 アト−株式会社製の等電点電気泳動装置（ＳＪ−１０７
１，Ｅ（１３ｊ）を用い、ファルマライト（ファルマシ
ア社製、　ｐＨ４〜ｂ、５　）とグリセロールを含む５
％ポリアクリルアミド平板ゲル（厚み１ｍ艮長さ１０儀
、巾１０儂）を作成した。陽極側に０．０４　Ｍ、ＤＬ
−グルタミン酸、陰極側に０．２　Ｍ。

Ｌ−ヒスチジンを使用して、７００ｖで５０分間の前泳
動を行った。続いて試料５０μ２を付与し、７００ｖで
１時間、５００ｖで１６時間泳動を行った。泳動終了後
ゲルを２．５ＩＩＩＩｌｌ巾で切出し、次いで各ゲル片
を０．１５Ｍｔｉ化ナトリウムを含む０．０２Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）　０．２　ｍｅで抽出し、
各抽出液についてＬ−Ｍ細胞を用いた活性評価を行った
。本発明になる生理活性物質の等電点け６．０±０，５
であった、 ３）Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価 Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価は、　Ｒｕｆｆ（Ｌｙｍｐ
ｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２巻Ｅ、Ｐｉｃｋ　１
ｆ！集、Ａｃａｄｅｍｉ　ｃＰｒｅｓｓ　２３５頁（１
９８０年）〕あるいは（Ｊ。

Ｉｒｒｍｕｎｏｌ、　１２６巻２３５頁（１９８１年）
〕ノ方法に準じ、本発明者らが改良したものであり、本
発明になる生理活性物質がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タ
イプ・カルチャーΦコレクション、ＣＣＬｌ、２）を殺
す効果を測定するもので　ある。

すなわち、順次培地で希釈した試料ａ、ｉｍｐと１０５
コ／　ｍｅの霞度のＬ−Ｍ細胞の培地！１で濁液０．１
ｍｌを９６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・
ラボラトリ−社）に加えた。培地は１ｖ／ｖ％のウシ胎
児＋ｍ　ｎ＋を含むイーグルのミニマム・エツセンシャ
ル培地（その組成は、たとえば、「組織培養」中井準之
助他編集、朝食書店、１９６７年に記載されている）を
用いた。マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空気
中、３７Ｃで４８時間培養した。培養終了後、グルタル
アルデヒド７．０’／１ｔを加え４１Ｂ胞を固定した。

固定後、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、０，０５
％メチレンブルー溶液をＯＡｍｌ加え、生き残った細胞
を染色した。余分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した
後、残ったメチレンブルーを０．３６　Ｎ塩酸溶液で抽
出し、その６６５　ｎｍにおける吸光度をタイターチッ
ク・マルチスキャン（フロー・ラボラトリ−社）で測定
した。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ
−Ｍ細胞の５０係を殺すために会費な生理活性量を１単
位／−と定義し、試料を加えない対照の吸光度の５０％
の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算に
よってめ、その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単位
／ｆｎ１．で表記する）とした。

一方、蛋白質量は、Ｂｒａｎｆｏｒｄらの方法（Ａｎａ
ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２巻２４Ｂ頁（１９７６年）〕に
よシ、クーマシー・ブリリアント・ブルーＧ２５０を用
いる色素結合法から算出した。

本発明になる生理活性物質の比活性は、４Ｘ１０６〜２
　Ｘ　１０７単位／　ｍｙ蛋白質であった。

４）　Ｍｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ担癌マウスを用い
る活性評価ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部皮肉に２　Ｘ　１
０’コのＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植し、
７日後移植した腫瘍の大きさが直径７〜８■となり、出
血性壊死がなく良好な血行状態にある腫瘍を有するマウ
スを選び、腫瘍内に生理食塩水で希釈した０、０５ｄの
試料を注射し、２４時間後に次の判定基準に則り壊死反
応の判定を行った。

（−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （＋）：中程度の出血性壊死 （移ｒ（＜癌表面の真中から５０％以上にわたって壊死
） （＋）：顕著な出「■性壊死 （移植癌の中央部が重度に壊死し、周囲の癌組織がわず
かに残った状態） １だ、試料投与後２０日８に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率をめた。

以上の方法により測定した本生理活性物質の活性を下表
に示す。

１００　６　２　１　３　０　２／６ ２００　６　０　０　２　５　３／６ １．０００　６　０　０　１　５　６／６５）アミノ酸
配列構造決定 本発明になる生理活性物質を用いて次の検討を行なった
。

試料調製用の厚み１市、長さ１１ｃＩＩＳ、巾１５鋸の
ポリアクリルアミド１５％を含む５ＤＳ−ポリアクリル
アミド平板ゲルを作成した。作成法の詳細は、アト−株
式会社「スラブ型５ＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動
」のパンフレットによった。

装置はアト−株式会社製５Ｊ−１０６０・ＳＤＨ型を用
いた。

該平板ゲル１板当り、本発明になる生理活性物質を４０
０μｍ付与した。付与に際して前処理として、１０ｍ９
／艷のトリプシン溶液にて１時間処理を施したのち１％
ＳＤＳ水溶液１００μｔと４０％ショ糖水溶液５０μｔ
に４００μグの本生理活性物質を含む５００μｔの水溶
液を混合し、５０Ｃ５０分の熱処理を行なった。電気泳
動は１５０■定電圧で、４時間３０分を要した。この操
作を５回くりかえして行なった。泳動後、外側の一部を
クーマシー・ブリリアント・ブルー０２５０で５分間染
色を行ない、脱色後明瞭に見える染色バンドを中心に２
．５１間隔で５本に切出しを行なった。次いで１％の重
炭酸アンモニウム１．５−の中に該ゲル片を（ｓＬ　７
８して、４Ｃ２４時間抽出を行なった。抽出後、パスツ
ールピペットにて抽出液を取り出し、同液で洗浄を行な
って、各２．５−ずつの抽出液を５スライス分、取得し
た。得られた抽出液は、確認のためＬ−Ｍ細胞を用いる
活性評価を行なった。

中心のバンドの部分に活性が総て回収された。

合計５回の電気泳動を行ない、１．２ｍｇのチャージ試
料より０．９　ｍ９の抽出試料を得た、該抽出試料溶液
をセファデックスＧ２５のカラム（０，９ｘ　１００ｖ
Ｌ）に付し、脱塩を行なった、次いでトミー精工社製、
遠心真空乾燥機コンセントレータ−（ＥＣ−１ｏ）を用
いて、２５７：、２時間１．５０　Ｏｒｐｍで乾燥を行
ない、アミノ酸配列用分析試料とした。

アブライドバイオシステムズ社製アミノ酸シークエンシ
ングアナライザー（モデル４７０Ａ）を用い、Ｒ，Ｍ、
Ｈｅｗｉｃｋらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５
６巻７９９０−７９９７頁（１９８１年）〕に準じて、
Ｎ末端側より順次エドマン分解を行った。遊離してくる
フェニルチオヒダントイン−アミノ酸ヲ、スペクトａフ
イジクス社製高速液体クロマトグラフィー（ｓｐａｔｏ
ｏ）、使用カラムデュポン社製ゾルパックスＯＤＳに付
し、分析を行ない、常法に従ってアミノ酸決定をした。

その結果、得られた生理活性物質は、Ｎ末端側に共通し
て下記に示すアミノ酸配列を含有していた。

Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−ＧｌｎＬｅ　ｕ ６）レクチンカラムへの吸着性 市販の各種レクチン固定化樹脂を市販セパコールミ二カ
ラム（バイオランド社製）に充填し、１５０　ｍＭの塩
化ナトリウムをざむ５０　ｍＭリン酸緩衝＊　（ｐＨ７
，５）で充分に洗浄後、同緩衝液に溶解した１０μｍの
本発明になる生理活性物質試料を付与し、仄いて下記に
示す溶出液で溶出を行なった後、素通り画分と溶出画分
とをＬ−Ｍ細胞を用いる活性評価法にかけ測定した。総
てのカラムにおいて、総ての活性が素通り画分に回収さ
れた。

７）電気泳動の易動度 セルロースアセテート膜としてセパラックスＳ（富士写
真フィルム社製）を用い、ｐＨ８゜６イオン強度０゜０
６〜０．０７で泳動を行なった。泳動終了後１■巾で切
片を作成した。得られた切片を生理食塩水で抽出し、Ｌ
−Ｍ細胞での活性評価を行ない易動度をめた。同時に染
色用サンプルを泳動し、ポンソー５Ｒ（半井化学薬品株
式会社製）で染色を行なった。

本発明の生理活性物質は、γ−グロブリン領域に泳動さ
れる染色バンドの位置に活性を示した。

８）ジスルフィド結合の還元による影響ジスルフィド結
合還元剤としてジチオスレイトール（ｏ、１ｍＭ、　１
　ｍＭ）または２−メルカプトエタノール（０，１ｍＭ
、　１ｍＭ　）を用い、本発明に７ｆｆｉる生理活性物
質２μ２／−を０．１５Ｍ塩化ナトリウム７５０　ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中、２５℃で２時間反応さ
せた。反応後、Ｌ−Ｍ細胞を用いて残存活性を測定し、
ジスルフィド結合還元剤を用いなかった対照の残存活性
に対する比をめ、その結果を下表に示す。

なお、これまでの説明で明らかなように、本発明になる
新規生理活性物質は、溶液中での分子量、すなわちゲル
濾過時の分子量が４５，０００±ｓ、ｏ　ｏ　。

であｆｉ、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の
サブユニット解離状態での分子量が２２，０００±５．
０００である。しかも５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動後の抽出サンプルをゲル濾過に付すと、活性画
分が分子量４０，０００±ｓ、ｏ　ｏ　ｏ付近にあるこ
とから、本発明の生理活性物質は、サブユニット構造を
有する蛋白質と考えられる。

本発明の生理活性物質を得るだめの好ましい精製法の骨
子は、活性化マクロファージの培養液を次の工程に付す
ことである。

（１１電気泳動的等電点分画法 ；２１塩基性陰イオン交換体クロマトグラフィー（３）
加熱処理 （４１ゲル沖過 （５）アフイニテイクロマトグラフイー（６１ゲル濾過 以下に、これらの工程の詳細を説明する。

なお、培養液および精製溶出液中の蛋白質濃度および本
生理活性物質の濃度は、それぞれ前述の蛋白質測定法お
よびＬ−Ｍ細胞を用いた活性評価で測定される。

精製工程１ 培養液をｐＨ５，５〜１０のキャリヤー・アンフォライ
ア　（Ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ　）とシ
ョ糖密度勾配液のカラムに添加した後、培養液中の各成
分をそれぞれの等電点位置まで泳動させるために通電す
る。

泳動終了後、カラム下端より、細いチューブからゾーン
を乱さないように静かに分画し、ｐＨ５，５〜６．５の
分画部分を集める。

採取した分画液は透析処理を行う。

精製工程２ 前記工程で得られた分画液と塩基性陰イオン交換体との
接触は、カラム法、パッチ法のいずれを用いてもよい。

塩基性陰イオン交換体との接触に先立ち、濾過液を陰イ
オン交換体との接触時に用いる緩衝液に対して透析して
もよいし、捷たは低塩濃度の緩衝液で希釈してもよい。

本工程は、精製溶液をｐＨ６，０〜８．０、塩濃度０．
１Ｍ以下の緩衝液を用い、堪基性陰イオン交換体に接触
させて本発明の生理活性物質を吸着させ、次いで同緩衝
液で該イオン交換体を洗浄して非吸着蛋白質を除去した
後、゛高塩濃度の緩衝液を用いて、本生理活性物質を溶
出させること罠よ如行なわれる。

塩基性陰イオン交換体の具体例としては、ＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡ−５０、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６８，ＤＥＡＥ−セファセル（以上ファルマシア社製）
のようなジエチルアミノエチル基含有陰イオン交換体が
好ましい。緩衝液としては、例えば希薄なトリス−塩酸
緩衝液およびリン酸緩衝液が挙げられる。塩濃度を調節
するために加える塩としては、塩化ナトリウム、塩化カ
リウムが好ましい。

なお、精製工程２の終了後、精製度が原培養液に比し２
００倍以上に達していない場合は、精製工程２をくりか
えして行なう。

精製工程３ 前記工程で得られた溶出液は、限外濾過、凍結乾燥また
は適当な大きさの塩基性陰イオン交換体カラムを用いて
濃縮した後、加熱処理を行なう。

加熱処理は通常６０〜７０Ｃで３０分〜２時間行なわれ
るが、６０Ｃで６０分間処理するのが好ましい。加熱処
理の際の緩衝液としては、例えばトリス−塩酸緩衝液あ
るいはリン酸緩衝液などが挙げられ、そのｐＨは６．０
〜９．０である。精製工程１〜３を通しての精製度は３
００倍以上、活性の回収率は約６０〜１００％である。

精製工程４ 本生理活性物質を含む溶出液は、限外濾過、凍結乾燥ま
たは適当な大きさの塩基性陰イオン交換体カラムを用い
て濃縮した後、分子量ｓ　ｏ、ｏ　ｏ。

〜７０，０００の物質の分離に適した担体を用いるゲル
濾過に付す。溶出液としては緩衝液が用いられ、そのｐ
Ｈは通常６．０〜９．０である。緩衝液中の塩濃度は１
．０Ｍ以下である。ゲル濾過用担体の具体例としては、
セファデックスＧ−１５０、Ｇ−２００（ファルマシア
社製）、七フアクリルＳ−２００（７アルマシア社製）
、バイオゲルＰ−１５０、Ｐ−２００（バイオランド社
製）、トヨパールＨＷ−５５、ＨＷ−，６５（東洋ソー
ダ株式会社製）等が挙げられる。

緩衝液および加えられる塩としては、精製工程２で挙げ
たものが同様に用いられる。ゲルテ過で得た本生理活性
物質含有画分を集め、限外濾過、凍結乾燥、塩基性陰イ
オン交換体、小型カラム等で濃縮を行なうと、原培養液
に比べて約Ｉ　Ｘ　１０８〜Ｉ　Ｘ　１０’倍に精製さ
れた本生理活性物質の溶液が得られる。精製工程１〜４
を通しての活性の回収率は約５０〜９５％である。

精製工程５ 精製工程４で得られた溶液をアフィニティー・クロマト
グラフィー・カラムに付す。アフィニティー・カラムと
１．ては　ｚ２＋などの金属キレート・カラム、色素結
合カラムもしくは抗ヒトアルブミン抗体などの抗体結合
カラム等が好適に用いられる。なかでも、ｚ２＋キ、レ
ートカラムが好ましく、Ｊ、Ｐｏｒａｔｈらの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ　２５８巻５９８頁（１９７５年）〕に準す
るか、イミノジ酢酸をカップリングしたセファロースＣ
Ｌ−６Ｂ（ファルマシア社製、スウェーデン）を使用し
て行なう。

たとえば、イミノジ酢酸をカップリングしたセファロー
スＣＬ−６Ｂカラムに’　Ｉｎ’；ｌ　／　ｔｒｉの濃
度の塩化亜鉛を流し　ｚ２＋をキレート吸着させる。続
いて溶出に用いる緩衝液を用いてカラムを洗浄した後、
精製工程４で得られた溶液をそのまま、もしくは濃縮し
た後付す。この工程で使用する緩衝液およびその中で使
用する塩濃度と種類は、精製工程２で用いたものと同様
のものが用いられる。

この操作でほとんどの夾雑蛋白質が吸着され、本生理活
性物質は非吸着画分に溶出される。この溶出液の精製度
は原培養液に比べて約Ｉ　Ｘ　１０’〜５ｘ１０４倍で
あり、精製工程１〜５を通しての活性回収率は約４５〜
７５チである。

精製工程６ 精製工程５で得られた溶出液は、精製工程４と同様の担
体、緩衝液、塩を用いてゲル濾過に付す。

但し、使用するカラムは、精製工程４で用いたものより
も小径かつ長尺のものを用いる。活性画分を集め、濃縮
、透析、濾過滅菌および必要に応じて凍結乾燥等を行な
い、本発明の新規生理活性物質を得る。精製工程１〜６
を通しての精製度は約４　Ｘ　１０４〜１．５　ｘ　１
０６倍で、活性回収率は約４０〜６０％である。

このようにして得られた本発明の生理活性物質は、各種
同系移植マウス癌およびヌードマウス移植ヒト癌に対し
て腫瘍内および静脈内投与において優れた制癌効果を示
した。すなわち、マウス由来の結腸癌Ｃｏ１ｏｎ　２６
を移植したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マウスあるいは悪
性黒色腫Ｂ１６を移植したＣ５７ＢＬ／６糸マウスおよ
び神経芽腫Ｎｅｕｒｏ　２　Ｂを移植したＡ系マウスに
、本発明の生理活性物質ｓ、ｏｏ。

〜１０，０００単位を１回ないし３回静脈内投与した試
験において、対照群（生理食塩水投与群）罠比して有意
な癌の増殖抑制と退縮が認められた。

捷た、ヒト由来の肺癌ＰＣ−１０、悪性黒色腫Ｗ−２あ
るいは神経芽腫ＧＯＴＯを移植したＢＡＬＢ／Ｃ系ヌー
ドマウスに１本発明の生理活性物質１０，０００〜３０
，０００単位を１回ないし７回静脈内投与した試験にお
いて、対照群（生理食塩水投与群）に比して有意な癌の
増殖抑制と退縮が認められた。

以上説明したように５本発明の生理活性物質は、粗製溶
液から約４０〜６０％という好収率で得られる。本物質
は極めて優れた抗腫瘍効果を有し、その作用は種特異性
が少なく、シかも広範囲な効果を持ち、加えて毒性がほ
とんど認められないことから、極めて有用な抗腫瘍剤と
して期待できるものである。

以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述べるが、
本発明は、この実施例に限定されるものではなく、酵素
等の分解により、末端部にゎずかに切断をうけた物質も
本発明に含まれることは当然である。

実施例 ＴＩ（Ｐ−１細胞を１．５　Ｘ　１０’個／ｌＲｔの濃
度にてＴｈ　５％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培
地に分散させたのち、径１０算のプラスチック・シャー
レＫ　２０　ｄずつ分注した。３７Ｃに加温した該細胞
溶液［，１２−Ｑ−テトラデカノイルホルボール−１３
−ジアセテートおよびビタミンＡ酸をそれぞれ最終一度
１μｍ／−および０．５μｆ／ｍｌとなるように添加し
、５％炭酸ガス培養器中にて、３７［，１時間培養した
。

１時間後、シャーレ中の培養液を除去し、０．５μｍ／
−ビタミンＡ酸、１００　ｍｇ／−ポリペプトンを含有
する５チ牛脂児血清−ＲＰＭＩ−１６４０培地２０ｔｎ
ｔで置換え、さらに２４時間３７Ｃにて培養を行った後
、培地を除去し、２０−のＲＰＭＩ−１６４０培地２０
−に置換し、７２時間さらに培養を継続した。

その後、培養液を集め、３０口ＯｒｐｍＫて３０分間遠
心処理を行って、細胞沈渣を除去したのち、Ｌ−Ｍ細胞
に対する細胞障害性を検討し、１８０Ｕ／−の活性を有
する培養液２ｔを得た。

精製工程１ 該培養液２ｔを、限外濾過法にて２０倍に濃縮したのち
、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ■〔キャリヤー・アンフオライソ
（Ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ　）　）　（
Ｌ　Ｋ　Ｂ社製、スウェーデン）−ショ糖密度勾配カラ
ム（４４０ＷＥｔ）に添加したのち、約４２時間通電し
、泳動を行ったのち、カラムの下端より細いチューブで
ゾーンを乱さないように約２−７分の流速で分画した。

ｐＨ５，５〜６．５の分画を採取したのち、ｐＨを約７
．４に調整したのち、透析にて、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ■
およびショ糖を除去した。

精製工程２ 該分画液０．２１Ｋ　Ｃ０８ｔｏ　ｏ、０２　Ｍ　）リ
ス−塩酸緩衝液（１）　Ｈ７，８）　を加えた後、０．
０２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２　Ｍ　）リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，８）で充分圧平衡止したＤＥＡＥ−
セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社與）のカラム
（１０Ｘ４５ｃｒ１１）Ｉｃ徐々に付した。次いで０．
７５　ｔのカラム平衡化緩衝液（０，０２Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液、ｐＨ７
，８）で洗浄した後、ｏ、ｏｓＭ塩化ナトリウムを含む
０．０２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐａ７．ａ）０．
５ｔで洗浄後、０．ＩＭ塩化ナト°リウムを含む０．０
２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，２）を用いて
溶出を行なった。流速は０．５ｔ／ｌｌｒとし、溶出液
は５０−ずつ分画して活性画分を集めた。該活性画分に
同容量のｏ、ｏ　２　Ｍ　）　ＩＪスス−酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，８）’を加えて希釈した後、０，２　ｔ／　ｈｒ
の流速でＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂのカラム（
１０Ｘ１３ｃＩｎ）ＶＣ付した。

次いで０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２　Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，８）　１　ｔを用いて、
流速２０−／ｈｒで洗浄を行なった後、０，１Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）０．５ｔ？用いて、流速２ＯＮｔ／ｈｒで溶
出を行なった。溶出液は２５−ずつ分画して活性画分を
集めた。

精與工程３ 次に該溶出液を容器に移し７０Ｃの湯浴中に浸した後、
攪拌しながら該溶出液の温度を６０Ｃになるまで加熱し
た。その後６０ｃの別の湯浴に移し、３０分間加熱処理
した後、速やかに４ｃに冷却した。加熱処理した溶液は
、限外濾過により濃縮した。

精製工程４ ０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むｏ、ｏ　ｏ　５　Ｍリン
酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）で充分に平衡化したセファク
リルＳ−２００（ファルマシア社１ｉりのカラム（５Ｘ
８０ｃｒｎ）に該濃縮液を付し、同緩衝液にてゲル濾過
溶出を行なった。流速は４　ｍｌ　／　ｈｒで４−ずつ
分画して活性画分を採取し、活性画分を限外濾過によシ
濃縮した。

精製工程５ ゲル瀘過によって得られた活性画分の濃縮液をＺ％＋キ
レートセファロ−ヌカラムに付した。キレートセファロ
ース（イミノジ酢酸固定化樹脂）を充填したカラム（１
，６Ｘ　１０（７））に、１１ダ／ゴの塩化亜鉛水溶液
６０ゴを流速１ｏｍｔ７ｈｒで流した。次いで０．１Ｍ
塩化ナトリウムを含むｏ、ｏ　５　Ｍリン酸緩衝液（ｐ
　Ｈ７，４）で充分に平衡ｆヒした後、前工程で得られ
た濃縮液を流速１ｏｅ／ｈｒで付し、更に６０　ｍｌの
同緩衝液で溶出した非吸着画分を採取した。活性はこの
両分にほとんどが回収された。

精製工程６ 前精製工程で得られた活性画分を濃縮し、０．１５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．００５　Ｍリン酸緩衝液（Ｊ）
　Ｈ７，４）で充分に平衡化したトヨパールＨＷ−５５
（東洋ソーダ株式会社）のカラム（１，５Ｘ９０　ｃｍ
　）に付した。同緩衝液にて流速４ｍ／ｈｒでゲル濾過
溶出を行ない、活性画分全採取した。

全梢製工程會通しての活性の回収率５１％、精製度４，
２　Ｘ　１０番倍で、比活性５，５　Ｘ　１０６単位／
ダ蛋白質の生理活性物質が得られた。

手　続　補　正　！（方式） ％式％ １　事件の表示 特願昭５９−２４０８３７号 ２　発明の名称 抗腫瘍活性金もつヒト由来蛋白質 ３　補正をする者 事件との関係・特許出願人 （００５）旭化成工業株式会社 ４代理人 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ピル５階
昭和６０年４月３０日 ６　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７　補正の内容 明細書の記載を次のとおり補正する。

１１１　第２頁１２行の ［Ｃａｒｓｗｅｊｌ　Ｊ　ｆ　「カルスウェル（Ｃａｒ
ｓｗｅｌｌ）Ｊと補正する。

（２）　第２頁１３〜１４行の ［ｃＤ−１・・・・・・・・・・・・（ＢＣＧ）ｊを下
記のと参り補正する。

１’−ＣＤ−１スイス（Ｓｗｉｓｓ）マウスにバチルス
・カルメット・ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅ
ｔｔｅ−Ｇｕ５ｒｉｎ（ＢＣＧ）ＩＪ１３１　第２頁１
７行の 「Ｍｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ　Ｊを［メス・ニー・
ザルコーマ（ＭｅｔｈＡ　ｓａｒｃｏｍａ）Ｊと補正す
る。

（４１第２頁２０行〜第６頁１行の ［Ｐｒｏｃ、・・・・・・・・Ｓｃｉ、Ｊを下記のとお
り補正する。

「プロシーディンゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイアンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、）Ｊ（５１第５頁２行の 「Ｒｕｆｆら［Ｊ、Ｉｍｎｕｎｏｌ、ｊ’ｉ＝下記のと
おり補正する。

［ラフ（Ｒｕｆｆ）ら〔ジャーナル・オプ・イムノロシ
イ（Ｊ、Ｉｒｒｍｕｎｏｌ、）　Ｊ （６）第３頁４行の ［Ｍａｔｔｈｅｗｓら［Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　
Ｊを下記のとおり補正する。

「マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら〔ブリティッシュ
・ジャーナル・オプ・キャ／サー（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｊ（７）第５頁１１行の 「Ｒｕｆｆら（Ｊ、　Ｉｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙ」を下記
のとおり補正する。

［う７（Ｒｕｆｆ）ら〔ジャーナル・オプ・イムノロシ
イ（Ｊ、Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌｏｇｙ　）　Ｊ（８）第３
頁１３行の ［Ｍａｔｔｈｅｗら〔Ｉｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊを下
記のとおり補正する。

「マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら〔イムノロシイ（
Ｉｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙ　）Ｊ （９）第５頁１３行の 「、ＮａｔｕｒｅＪ　を「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
Ｊと補正する。

（ＩＩ　第５頁１４〜１５行の 「Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊを［インターナシ
ョナル・ジャーナ／Ｌ／＋オプ・キャンサー（Ｉｎｔ、
　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ）Ｊと補正する。

（１１）第７頁５行の ［Ｓｅｒｇｒｅｓｔらの−・＝−Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｊを下記のとおり補正する。

［サーブレスト（Ｓｅｒｇｒｅｓ　ｔ　）らの方法〔メ
ンード・イン・エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　Ｊ 圓　第８頁１２〜１４行の ［Ｒｕｆｆ・・・・・−・・・Ｐｒｅｓｓ　Ｊを下記の
とおり補正する。

「ラフ（Ｒｕｆｆ）　（す／ホカイ７−リポー）　（Ｌ
ｙｍｐｈｏｋｉｎｅＲｅｐｏｒｔｓ　）２巻イー・ビッ
ク（Ｅ、　Ｐｉｃｋ　）編集。

アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
　）　Ｊ（１３）第８頁１４〜１５行の 「Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、Ｊを「ジャーナル・オブ・
イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　Ｊと補正す
る。

（１４）第１０頁４〜５行の ［Ｂｒａｎｆｏｒｄらの方法（Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊを下記のとおり補正する。

［プランフォード（Ｂｒａｎｆｏｒｄ　）らの方法〔ア
ナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｊ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｖａ　１−Ａｔ　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ａｌ
   　ａ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌｙ　−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ で表わされるアミノ酸配列構造を含有するポリペプチド
   のサブユニットからなる構造を有し、かつ４　Ｘ　１０
   ’〜２　Ｘ　１０７単位／Ｉｎｇ蛋白質（本文定義のＬ
   −’Ｍ細細胞用用る評価による）の比活性含有する蛋白
   質。