JPS62153300A - ヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＋１１　　産業上の利用分野 本発明はヒト免疫グーグ’）　７　ＧＦｃ領域蛋白質、
該蛋白質をコードするＤＮＡ断片を組込んだ組換えプラ
スミド、および該プラスミドを含む微生物を用いたヒト
免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質の製造法に関する。

（２）　　発明の背景 すべてのを椎動物の体液中に存在し、抗原と特異的に結
合する能力を有する蛋白が抗体であり、抗体蛋白と＠遺
的０機能的関連をもつ蛋白質を総称して免疫グロブリン
という。免疫グロブリン（以下Ｉｇと略す）は、物理化
学的あるいは免疫学的な性状から、ＬｇＧ　＋　ＩｇＡ
　、　ＩｇＭ　、　ＩｇＥ　＊ＩｇＤの５つのクラスに
分類される。

なかでもＩｇＧは細菌やウィルスに対する生体防御に１
！！！な役割を持っており、従来より、ヒトＩｇＧを多
量に含むｒ−グロブリン両分はヒトの血液より分離され
、それを一部食性することにより重症患者のための免疫
製剤として用いられてきた。しかしながら、これは原料
を人血に依存しており、その大量の安定した入手が困難
であること、またそのために均質で安全なものを常時得
に（いという＃１点があった。そこでこト抗体蛋白を遺
伝子操作技術によって安定して多量に産出することがで
きれば、医薬品製造のために極めて有利であることは論
を待たない。

ヒトＩｇＧは２本のＨ鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　）
　　と２本のＬ　１１　（Ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　）
がジスルフィド結合で結ばれた形態をしている。ヒトＩ
ｇＧ分子にパパインなどの蛋白分解酵素を作用させると
分子その分子のはｇ中央で切断され、抗原結合活性のあ
る断片（Ｆａｂ領域蛋白’Ｊｔ）と、抗原結合活性はな
（条件により結晶化しやすい断片（Ｆｃ領域蛋白質）と
に分かれる。ｔａｂ領域蛋白質はＬ鎖全体とＨｆ１ｔ４
のアミノ基末端側の半分を含み、１分子のＩｇＧから２
分子のＦａｂ領域蛋白質が生じる。一方、Ｈ鎖のカルボ
キシル基末端側の半分であるＦａｉｌ域蛋白質は、切断
部位からヒンジｌｈ１．　　ＣＨ２，Ｃｆ（３の順序で
のこれら３つの部位より構成され、ヒンジｔｈ）部位に
おいて２本のＨ鎖がジスルフィド結合によって結ばれた
形態をしている。そして、Ｆｃ領域蛋白質はエフェクタ
ー　（ｏｆｆｅｃｔｅｒ　）機能を有している。

従来、ｒ−グロブリン製剤は、無（低）ｒ−グロブリン
血症への補光、ウィルス感染症の予防と治療投与４に適
用されてさた。近年、ｒ−グロブリン製剤が特発性血小
板減少性紫斑病（ＩＴＰ）治療に有効であり（）’、　
Ｉｍｂａｃｈら。

Ｌａｎｃｅｔ、１．１２２８（１９８１）　参照Ｊ、％
にそのＦｃ領域が■要であることが示唆されている〔朴
ら、臨床免疫、１５．７６（１９８３）参照〕。

また、全身性エリテスト−デス（ＳＬＥ）＊に＃ける腎
糸球体沈層免疫複合体が、ヒ）　ＩｇＧ　Ｆｃ領域蛋白
質の添加により融解したという報告もある〔河住ら、臨
床免疫、１６，２４０（１９８’４）参照〕。以上のよ
うに、ヒトＩｇＧにおけるＦｃ領域蛋白質は、１Ｉｌｌ
記Ｉ’ｒＰ−？ＳＬｇのよ５、な自己免疫疾患の治療系
として用いることができる可能性があるが、作用機序な
どを含めて不明な点が多（、また均質なＦｃ領域蛋白質
を多量に供給できないことが、実用化への障害の理由と
なっている。

一方、ヒトＩｇＧのｉｆ鎖は、史にγ１鎖、γ、鎖。

ｒａＭｉ　　ｒａｉｌＡの４撞のサブクラスに細分され
る。

それらのうち、γ、ｉＡ及びｒａＭｉについてはクララ
イフケルら（Ｕ、　Ｋｒａｗｉｎｋｅｌら、ＥＭＢＯＪ
、ｌＩ。

４０３（１”Ｊ８２）参照〕が、ｒ、鎖についてはエリ
ンンら（Ｊ、Ｗ、Ｅｌｌｉａｏｎら＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ１１０，４０７１（１９８２〕参照
〕が、それぞれ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の一部について
報告している。しかし、上記報告にはヒトＩｇＧ蛋白を
発現させるためのＤＮＡｌｌｉ片としての記載はない。

（３）発明の目的 そこで本発明の目的は、ヒ）　ＩｇＧのＦｃｉ域におけ
る単量体蛋白質および二蓋体蛋白質を提供することにあ
る。

本発明の他の目的は、ζ）　ＩｇＧのＦｃ領域蛋白貞を
コードするＤＮＡ断片および七の断片が組み込まれた組
換えプラスミドを提供することにある。

不発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換され、目的とするヒトＩｇＧのＦｃ領域の蛋
白質を産生じ得ろ組換え微生物細胞およびその微生物細
胞を用いてヒ）　ＩｇＧのＦｃ領域蛋白質を製造する方
法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から−ｊ−明らか
となるであろう。

（４）　　発明の構成 本発明者の研究によれば、前記本発明の目的は、添付ｗ
Ｊ１図に示されたアミノ酸配列の２番目（Ｔｈｒ　）か
ら２２４番目（Ｌｙｓ　）までのポリペプチドを含み、
ヒト由来の他の蛋白買ｔｔ央負的に含まないヒト免疫グ
ロブ＋４７ＧのＦ”ｃ領域単瀘体蛋白質およびその二斌
体蛋白質を提供することによって達成され、また上記Ｆ
ｃ領域蛋白質をコードした遺伝子断片およびその断片が
組み込まれた組換えプラスミドを提供することによって
達成され、更にかくして得られた組換えプラスミドによ
って形質転換された組換え微生物細胞およびその微生物
細胞を用いて目的とするヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領
域蛋白質を産生する方法を提供することによって達成さ
れることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

なお本明細書および図面において、７ミ／酸。

ペプチド、その他に関し略号で表示する場合、それらは
ＩＵＰＡＣＩＵＢ　（Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏ、ｎ　ｏｎＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　）に
よる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づ（も
のである。

先ず本発明によれば、第１図に示されたアミ／［配列の
２番目（Ｔｈｒ）から２２４番目（Ｌｙｓ　）までによ
って表わされるポリペプチドを含み、ヒト由来の他の蛋
白質を実質的に含まないヒト免疫グロブ’Ｊ／ＧＦｃ領
域単被体蛋白買が提供される。こりポリペプチドとして
は、第１図に示されたアミノ酸配列の１番目（ＭＥＴ）
から２２４番目（ＬｙＳ）までによって衣わされるもの
であることができる。さらに上記蛋白質は天然のグリコ
ンル化を伴わないものであることがでざる。

本発明のヒト免疫クロプリンＧ　　ｆｉ’ｃ領域二量レ
ド蛋し買は、前記した単量体蛋白質を自然に或いは人為
的に会合させたものであればよく、例えば〜５−８−結
合によって会８されていてもよ（１゜ ・ｒ−発明によれは、さらに第１図に示されたアミノ酸
配列の２番目（Ｔｈｒ）から２２４番目（Ｌｙｓ　）ま
でによって表わされるポリペプチドｔコードしたＤＮＡ
を含む遺伝子断片が提供される。またこの遺伝子断片は
第１図の１）ＮＡ配列の８６″４ｉ目（４）から７５４
番目（２）までによって表わされる一本ｍＤＮＡとそれ
に相補的な一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを含む断
片であることもできるし、さらに第１図のＤＮＡ配列の
１番目（Ｃ１から７６５番目（Ｑまでによって表わされ
る一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮＡからなる
二本鎖ＤＮＡを含む断片であることもできる。

本発明の組換えプラスミドにおいては、前ａｄした蛋白
をコードするＤＮＡ’１１む遺伝子断片はその上流翻訳
開始ゴドノな有することもでさるし、また下流方向に翻
訳終止ゴドンを有することもできる。またその遺伝子断
片と適当なプロモーターとを連結させて微生物細胞中で
ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ　　領域蛋白質の発現な容
易に可能ならしめるようにプラスミド中に組込むことも
できる。

さらに組換えプラスミドにおいては、前記遺伝子断片が
トリプトフ７／・オペ口／・プロモーターまたはｔａｃ
プロモーターの下流に組み込まれていてもよい。

（＆ｌ　　ヒト染色体ＤＮＡおよび遺伝子ライブラリー
の作成； ヒトＩｇＧｔ’産生する細胞、たとえばビト骨髄複細胞
ＡＲＨ７７株（Ｋ、　Ｈ，Ｂｕｒｋら＋　Ｊ−Ｃａｎ−
ｅｅｒ　Ｒｅｓ、、３８．２５０８（１９７ｇ）＄照〕
を、適当な条件下、たとえば３７℃、炭酸ガス濃度５％
で培養増殖させ、得られた細胞を遠心分離によって集め
る。この細胞ｔまたとえばラウリル硫酸ナトリウム（Ｓ
Ｏ２ンのような界面活性剤存在下で、たとえばプロテア
ーゼにのような蛋白質分解酵素を用いて溶解させる。

さらに、たとえばフエ／−ルによる抽出によって除蛋白
を行ない、ヒト染色体ＤＮＡを得る。

こうして得られたＤＮＡを、たとえば≧ｅ。

Ｒ１のような制限酵素で切映し、得られた断片を適当な
ファージ・ベクター、たとえばシャａ　）（Ｃｈａｒｏ
ｎ　）　４　ＡベクターＣＦ、　Ｒ，Ｂｌａ−ｊｔｎｅ
ｒら＊　５ｃｉｅｎｃｅ　、　１９６　、１６１　（１
９７７）参照〕と連結した後、イン・ビトロ・パンケー
ジング（Ａ、　Ｂｅａｋｅｒら＋　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ。

８ｃ４．ＵＳＡ＋７２，５８１（１９７５ン　参照〕を
行ない、ヒトの遺伝子ラインラリ−な得る。

ｇｃｏＲＩ以外の制限酵素を用いる場合や、クロー二／
グ・ＴイトとしてＥｃｏＲＩ　をもたないような他の７
７−ジ・ベクターを使用する場合には、適当なり／カー
ＤＮＡを用いれば遺伝子ライブラリーの作製が可能にな
る。

（ｂ）　　サブクローンの１１ｉＩｌ限酵素切貼地図の
ｆｆ製；この遺伝子ライブラリーのファージを、たとえ
ば大＆ｔｌＬｇ３９２株（ＡＴＣＣ３：う５７２）に感
染、プラークを形成させ、たとえばプラーク・ハイブリ
ダイゼーション法（Ｗ、　Ｄ。

Ｂｅｎｔｏｎらｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　、１９６，１８０
（１９７７）参照〕によって目的クローンの選択を行な
う。

プローグとしては、たとえばニックトランスレージ”１
７法ＣＰ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｒｉｇｂｙら、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、１１３，２３７（１９７？）　参照〕によ
り３２Ｐ標識を行なったヒト免疫クロッｌＩ／［鎮Ｊ領
域（ＦａｂｖＡ域の中の一部であり、抗原結合活性を有
するＩ５Ｔ変部とエフェクター機能を有する定常部との
境界に存在）遺伝子や、あるいはヒ）　ＩｇＧ　Ｆｃ　
　狽域蛋白負の７ミノは配列に対応すると考えられる塩
基配列なもつオリゴヌクレオチドを化学合成した後、こ
れを３２Ｐ　ｍ　ａｆｔ　したものを用いることができ
る。

このプラーク・ハイプリダイゼーシＥ／によって陽性を
示したりロー７の制限酵素切断点地図を作製し、ヒト染
色体由来のＤＮＡ断片を、たとえばＰＢＲ３２２（Ｆ、
　Ｂｏｌｉｖａｒら。

Ｇｅｎｅ、２．９５（１９７７）参照〕のようなプラス
ミド・ベクターにサブ・クロー二／グする。

得られたサグクロー／の押入部分の１）ＮＡ塩基配列を
、たとえばツヤサム−ギルバート法（Ａ、　Ｍ、　Ｍａ
ｘａｍら＋　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、＋　６
５　＊４９９（１９８０）参照〕あるいはＭ１３ファー
ジを用いたジデオキシ・チェーン・ターミネーション法
（Ｊ９Ｍｅｓｓｉｎｇら＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓＲｅａ、＋　９−３０９　（１９８１）　＃照〕の方
法により決定し、ヒトＩｇＧ　Ｆｃ　　領域遺伝子の存
在を確認する。

（ｃ）　ＤＮＡＷｒ片の作成； こうして得られたヒ）　ｉｇＧ　Ｆ’ｃ　領域遺伝子は
、ヒト染色体由来のものであるかり、実際にアミノ酸を
フードしないイントロ／（ｉｎｔｒｏｎ）を含んでおり
、このままでは倣生物中で発現させることはできない。

そこでこのＦｃ　領域遺伝子を適当な制限酵素で切貼し
、１ノドロンの部分を完全に除去する。この制限醇訛切
晴の際に、実際にアミノ酸をコードするエタン／（＠ｘ
ｏｎ　）の部分も削られてしまうことがありうるが、そ
の場合には化学合成したオリゴヌクレオチドのンヨイ／
トを用いて削られた部分を修復させると共に、隣り合っ
たエタン／同志を連結させる。同時ＶＣ１盆成オリゴヌ
クレオチドを用いた同様な手法により、Ｆｃ領域遺伝子
の３末端に読みとりフンーム乞一致させるようンこ翻訳
終止コドン（ＴＧＡ　、　ＴＡＧ　。

ＴＡＡ　）を２つ以上夕／デムに壜紹し、発現効率の向
上をはかることもできる。ここで得られたイノトロンを
言まないＦｃ領域遺伝子は、−？はり合成Ｔ　Ｕゴヌク
レオチドを用いた手法を用い、その上流に読みとりフレ
ームを一致させろように翻訳開始コド／を付与すること
ができる。さらにこのＦｃ題域遺伝子は、適当なプロモ
ーター、ＳＤ（シャー（／・グルガーノ）配列の下流に
つなぐことにより、発現型遺伝子とすることができる。

使用可能なプロモーターとして、トリプト７７ノ・オペ
−／・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）、ラクトー
ス・オペロバプロモーター（ｌａｃ　７’口七−ター）
、ｔａｃブロモ−クー、ＰＬブｐモーター、Ｉｐｐプロ
モーター号があげられるが、とりわケｔｒｐブジモータ
ー９ｔａｃプロモーターが好適である。Ｆｃ領域遺伝子
を効率良く発現させろためには、プロモーター、ＳＬ）
配列。

翻訳開始コド／、翻訳終止コド／のすべてン連結したも
のが好ましく、プロモーター。

ＳＤ配列、翻訳開始コド／＋　Ｆｃ領域遺伝子。

翻訳終止フド／が、この順で連結したものがとりわけ好
ましい。

ｔｄｌ　　組換えプラスミドおよび組換え微生？！Ｉ細
胞の作成； 本発明の発現型ヒトＩｇＧ　Ｆｃ　　領域遺伝子を、適
当なプラスミド・ベクター、たとえばｐＢＲ３２２に挿
入することにより、発現型プラスミドが作製できる。発
現型プラスミドの例として、好ましくは、ｐＦｃ２０３
　、　　ｐＦｃ２１Ｊ４　。

ｐＦｃ２０３Ｓ　、　　ｐＦ’ｃ２０３Ｐ　、　　ｐＦ
ｃ２１１　、　　ｐＦ’ｃ３６１　、　ｐＦＣ３６２が
用いられる。

ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域遺伝子を発現させろための微生物
宿主としては、大腸菌、枯草直、酵母などがあげられる
が、とりわけ大腸菌が好ましい。上記のＦｃ領域発現型
プラスミドは、たとえば公知の方法ＣＭ、　Ｖ、Ｎｏｒ
ｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ、３．２７！ｊ（１９７８）＃照〕を用いて、
微生物宿主、たとえば大腸−に導入することができる。

このようにして得られた組換え微生物を、それ自体は公
知の方法でｊ＠養する。培地としては、たとえばグルコ
ースとカザミノ酸を含むＭＱＪＭ地（’１’０Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら−＋　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　
＋　Ｐ　４４　Ｌ）　（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
　１９８２　）参照〕があげられ、発現型プラスミドの
宿主内安定化のために、必安に応じて、たとえばア／ピ
シリ／等を添加するのが望ましい。

ｆ＠髪は目的の組換え微生物に通した条件、たとえば振
とうによる通気、４１拌を加えながり、３７”Ｃで２〜
３６＃間何なり。また、培養開始時または培養中に、プ
ロモーターを効４　ａ　＜　＋ｆｉ能させろ目的で、ｊ
、β−イノドールアクリルｐ　（ｔｒｐプロモーターの
場合）、イソプロピル−β−υ−チ才ガラクトンド（Ｌ
ａｃブｑモーターの場合）などの薬剤を加えることもで
きる。

培養後、たとえば遠心分ｍｙこエリ組換え微生物細胞を
果め、たとえばリン醒バッファーに懸濁させ、たとえば
超音匝処理により細胞を破砕し、遠心分離により組換え
微生物細胞のライゼートを得る。ライゼート中のヒトＩ
ｇＧ　Ｆｃ領域蛋白貞の菫は、たとえ□ば市販のウサギ
抗ヒトＩｇＧ　　Ｆｃ成分、抗血清及び岬累標識抗つサ
ギＩｇ抗体を用いた工／ザイム・イムノアツセイ（ｈ：
ＩＡ）によりへ１ｊ定することができる。

このライゼートからのヒ）　ＩｇＧ　Ｆｃ　’％域蛋白
質の精製は、公知の辿渚知られ−Ｃ（・ろ蛋白實の分離
・精製法に従えばよいが、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃフラグメ
ント抗体を用いた７フイニデイーカラム・クロマトグラ
フィーがとりわけ有利である。かくして得しれた４＃装
Ｆｃ　’磯城蛋白質のうち準鼠体のものについては、た
とえばチャメスらの方１４　（Ｒ，ＦＪ、　Ｃｈａｎｃ
ｅら。

ＲｅｐＬｊｄｅｓ　：第７回米国ペブチドン／ホジウム
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　（Ｄ、　）ｉ、　Ｒｉｃｈ及
びＥ、Ｇｒｏｓｓ　Ｉ！１ＩｉＬ７２１−７２８　、Ｐ
ｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、＋Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ　、　ＩＬ、（１９８１）　　参照〕を用いる
ことにより、天然の免疫クロプリ／と同様に２本のポリ
ペプチドがジスルフィド結合Ｙｔ弁して４結された形の
２麓体とすることかでざる。

以下実施例を掲げて、本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されろものではない。

実施例１　（ヒト染色体１）ＮＡの単離）ヒト骨髄ｌ１
１１１１１１胞ＡＲ１（’／７株３Ｘ１０”個をガラス
俸でつぶし、２％ＳＤＳ　存在下、プロテアーゼＫ（シ
グマ）で処理した後、ｌ　ｕ　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−）Ｉ
ＣＡ　（ｐｄ’８．０ン−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ水＃漱で
飽和したフェノールを加えた。遠心分離により水相とフ
ェノール相ヲ分離しくフェノール抽出）、水相を２０　
ｒｒｎｖｌ　　Ｔｒｉｓ−ＭＣｄ　（ｐＨ７，５）　−
１００ｍＭＮａＣｌ−５ｍＭ　　ＩＥＤＴＡ　ＩＫ　浴
液に対して透４］ｒした。

リポヌクレアーセＡ（シグマ）処ａをし、再度フェノー
ル抽出７行なった後、１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　（ｐＨ８，０）　−１ｍｍ　　ｇＤＴＡ水溶液に対し
て透析し、ヒト染色体１）ＮＡＡｌ１２■を取得した（
　Ｎ、　Ｂ１１ｎら＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、＋　３　、２３Ｌ１３（１９７６）参照〕。

実施例２　（ヒト遺伝子ライブラリーラリ成）実施例１
で得られたヒト染色体ＤＮＡ　１５０μｓ　を後述する
実施例４に示した方法に革じて制限ｔ！＃素ＥｅｏａＩ
（宝酒造）で部分分解した仮、蔗糖密度勾配遠心〔蔗糖
１０〜４０％（ｗｔ／　ｖｏｌ　）。

ｚｓｏｏｏｒ＋ｍｘｉｓ時間、ｚｏＣ）ｋ行ない、１５
Ｋｂｐ〜２３　Ｋ　ｂｐに相当するＤＮＡ断面４．３４
を得た。次にこのＤＮＡ１！ｆｒ片　０．８ａＪｌとシ
ャー７４Ａベクターとの連結を何い、シマロア４八ベク
ターの右のアームと圧のアームの間にヒト由来のＤＮＡ
が押入されたハイグリッドＤＮＡな得た。４ＭにはＴ４
−ＤＮＡリガーゼ（ベセスタ・リサーチ・ラボラ）　Ｉ
Ｊ−ズ）を用い、連結反応は６６　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
Ｈｃｌ（ｐ）ｉ　７．６　）−６，６ｍＭ　　ＭｇＣＡ
＋、　　１０　ｍＭジチオスレイトール−ｌ　ｍｙＬ　
　ＡＴ　Ｐ　＊浴１ｅＬ中で、１ｌｔｌ’ｃ、１２Ｑ闇
行なった。得られたハイプリントＤＮＡについて、イ／
・ビ）Ｒ・パンケージフグを何ない、ヒト遺伝子ライブ
ラリー（１，８Ｘ　１０’　ＰＦＵ／μｙ、ヒト染色体
ＤＮＡの９９％以上ン含む）とした。

実施ｔｉ’１１３（ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子のスク
リーニング） 削記芙施例２で得られたヒト由来のＤＮＡ　Ｙ含むシャ
ー７４Ａフアージの渠せ（遺伝子ライブラリー）を大ａ
困ＬＥ３９２株に感染させ、プラークを形成させた。ヒ
ト抗体遺伝子を含むクロー／は、プラーク・ハイプリタ
イゼーショ／法により、（３２ｐ　）−憚識ヒト抗体１
（ｊｊｉ　Ｊ遺伝子で選択した。ヒト抗庫遺伝子？言む
ツヤロン４Ａ）７−ジからのＤＮＡの調製は、Ｔｈｏｍ
ａｓらの方法ＣＭ、　Ｔｂｏｍａｓら＋　Ｊ、　Ｒ４ｏ
１．　Ｂ＋ｏ１．＋　９１　＋３１５（１９７４）ｉ７
１槓Ｊにより行なった。

実施例４　（制限陣素切断点地図の作成）実施例３で得
られたヒト免疫グロブリン遺伝子を含むシャａＺ４ＡＤ
ＮＡ１μｙを制限酵素切断用パンファー（ｇｃｏ　ＲＩ
　、　Ｔｑｑ　Ｌ　Ｘｂａｌ、　Ｘｈｏｌ切断では５０
　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　−１
００ｍＭ　　Ｎａｅ６−１０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４水Ｓａ
を、ＢａｍｔｌＩ＋ＣＪａ１．　Ｈｉｎｄｌｌ［、Ｐｓ
ｔｌ、　ＲｓａＩ、　Ｓａｗ　３．ＡＩ　　切断では　
１　０　　ｍＭ　　　Ｔｒｉｍ　　−ＨＣｌ　　（ｐＨ
７，５２−６０ｍＭＮａＣｌ−７ｍＭ　　Ｍｇ（Ｊｔ水
１ｔ１ｕを、Ｂａｌ　Ｉ、　ＢａｔＮｌ。

Ｎａｅ　Ｉ、　５ａｔＩＩ切断ではｌ　ＯｍＭ　　’ｒ
ｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　−１０ｒｎｈ’ｌ
　Ｍｇ５ｏ４１　ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４１　ｒｎＲＡジチオ
スレイトール水＃！液を、セしてＳｍａＩ切断ではｌ　
ＯｍＭ　　’ｒｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐＨｒ３．０ノ一
２０ｍＭＫＣ６−７ｍＭ　　ＭｇＣ１，−７ｍＭ　２−
メルヵフトエタノール水溶液を、それぞれ用いた。〕２
０μｇに溶解させ、制限酵素（ｊ３ｓｔＮ１．　Ｃ１１
ａｉ、　Ｎａｅ　Ｉはニュー・イノグランド・バイオラ
プズｆｉ、５ｓｔｌｌはベセスタ・リサーチ・ラボラト
リーズ！！！。

Ｒｓａ　Ｉ、　Ｓａｕ　３Ａ１＋　Ｔｑｑ　Ｉは二７ボ
／・ジー／、喪、それ以外は宝酒造製を用いた。）２〜
．１ユニントを添加して、３７℃、１時間以上切断を行
なった。制限ｒＪ、素ＢｓｔＮＩ及び’ｌ’ａｑ　Ｉに
よる切断は、６０′Ｃで１時間以上切断を行なった。な
お、二種類の１ｔｉｌＪ限酵素による切貼を行な５楊合
には、まず低塩ａ度で作用する制限酵素で処理し、次に
所定ｄ度まで塩濃度ン上けてから、より篩塩ａ度で作用
する制限酵素で処理した。

制限酵素による切断後、４μｅのｏ、２５％ブロモフェ
ノールブルー・５０％グリセロール水浴水浴側え、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル＃に反０．８％〜２．５％）
を行なった。アガロースはシグマ社のタイプＵｔｔ気泳
動用を使用した。電気泳動パンファーとして、４０　ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｍ　　ＣＨ，Ｃ００Ｈ（ｐＨ８，０ン−１
ｍ１ｖＩＥＤ″ｒＡ水溶液を用いた。厚さ２闘の垂直ゲ
ルにて、６〜９Ｖ／αの電圧で、１．５〜３時間電気泳
ｍｆｔ行なった。この電気泳動の際、ｏＮｈ町片の分子
量マーカーとして、λ）７−ジの１）ＮＡを制限酵素１
（ｉｎｄｌｌｌで切断したもの（ベーリ／ガー・マンハ
イム）を用いた。

電気泳動終了後、７ガロースゲル中のＤＮＡを２μＪ／
／ｒｔｔｌエチジ、ウムプロマイド水溶液で染色し、こ
のゲルに対して長波長紫外線を照射して、切断バター／
の観察を行なった。各塊制限専素単独による切断、及び
二種の制限簿素の組合せによる切断、これらの切断バタ
ー／を解析することにより、第２図囚に示すような各制
限酵素切断点の相対位置関係を決定した。第２図囚は免
疫グログ＋）７Ｇ遺伝子を含むヒト染色体ＤＮＡの制限
酵素切断点地図を示す。

実施例５　（ヒト免疫グロブ＋Ｊ７Ｇ遺伝子断片のサメ
クロー二／グ） ヒト免疫グロズリ／Ｇ遺伝子を宮むンヤロ／４ＡＤＮＡ
３μｙｔｔ実施例４の方法に準じて制限酵素Ｈｉｎｄ　
ＩＩＩ　で切断し、７ガロースゲルを気泳動（ゲル濃度
０．８％）を行なった。ヒｌ−ＩｇＧＦｃ領域遺伝子を
含む約８．２　ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍ｉｔ　（ｖｏ
ｌ／ｗｔ　）の８Ｍ　　Ｎａ（ＪＯ，水溶液に溶解させ
た。チェ／らのグラスフィルター法（Ｃ，Ｗ、　Ｃｈｅ
ｎら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、Ｉ　Ｏ１。

３３９（１９８０））により、約８，２　ＫｂｐのＤＮ
Ａ萌片を７ガロースゲルにより回収した。一方、大腸開
用プラスミドｐＢＲ３２２ｌｐｉ’を実施例４に卓じて
制限酵素ＨｉｎｄｌｌＬ　　で切断したものに対して、
アルカリ性ホスファターゼ（Ｅ、　ｅｏｌｉｃ７５）（
全酒造）を０．５−”　ニット加えて、４５℃で１時間
反応させた。反応終了後、又応敢中のアルカリ性ホスフ
ァターゼを失活・除去するために、フェノール抽出を３
回繰返した。このようにして得られたｐＢＲ３２２のＨ
ｉｎｄｌｌｌ−アルカリ性ホスファターゼ処理辰な、ゲ
ルより回収した約８．２　Ｋｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ　ｌ
！Ｉ？片水浴腹水浴液、エタノール沈殿の後、連結反応
用バッファー（実施例２を参照）５０μ１Ｖｃｆ＆解さ
せる。２ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加え、１１
℃、１２時間反応させて、４結を行なった。

大腸菌Ｃ６００株（ＡＴＣＣ３３５２ｓ）の形質転換は
、通゛８のＣａＣ４法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法）の改良法で行なった。すなわち、５−〇Ｌ培地
（１％トリブ）／、０．５％酵母エキス。

０．５％ＮａＣ１、ｐＨ７，２ノに大Ｗｋ−０６００抹
の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養液の６００
　ｎｍにおける濁度（００６００）０．．３　！で生育
させる。一体を冷たいマグネシウム・パンファー（０，
ＩＭ　　ＮａＣ１−５ｍＭ　　ＭｇＣ１，−５ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐｉ（７，６，０１Ｃ）　）中で２
回′洗い、２ｄの冷やしたカルシウム・バッファー（ｌ
ｕｏｍＭＣｈＣ＆　−２５０ｍ　Ｍ　　Ｋ　Ｃ１５ｍＭ
　ＭｇＣ１ｔ　　５　ｍＭＴｒｉｍ　−ＨＣＩ　（ｐＨ
７，６、０℃）〕中に再懸ｍさせ、０℃で２５分間放置
する。矢に菌体なこの容量の１７１０にカルシウム・パ
ンファーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水醪液と２：１
（ｖｏｌ、：　ｖａｔ、）混合する。この混合物１ｔ　
６０分間、０℃で保った後、１ゴのＬＢＣ培地（１％ト
リプト７．０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１。

０．０８％グルコース、　ｐｉ（７，２）な添加し、３
７℃で１時間振と５培餐する。培養ＭＹ、選択培地（ア
／ピシリ／３０μ＆７ｍｌを含むし培地プレート）に１
００μｌ／プレートの割合で接種する。

プレートを３７℃で１晩培貢して、形質転換株を生付さ
せる。得られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知
の方法を用いてＤＮＡ　ｆｔ１Ｊｉ製し、７カロースゲ
ル電気泳励により、目的のサブクロー；／ｐＴＪＩＢ（
約１２．６　Ｋｂｐ　）を確認した。

前記実施例４０方法により作製した、このサククローン
の制限−累切町点地図を第２図（Ｂ）に示した。この＄
２凶ｆＢ＋においてＰｓｔＩ　　Ｌ３）からＨｉｎｄｕ
ｌ　　（３１の間に、Ｐａｔ　Ｉサイトが３〜４個存在
することは確認したが、その位置についての確認は行な
っていない。

さらに、前記プラスミドｐＴＪＩＢのＰａｔＩ　　Ｌ２
１←→Ｐｓｔ　Ｉ　−ｔ３１のＤＮＡ断片（約１．７　
Ｋｂｐ　）　’＆。

ｐ’ｒＪＩＢ　　の場合とほぼ同様の手法により、プラ
スミドｐＢＲ３２２のｐｓｔＩサイトに押入し、プラス
ミドｐＴＪ５（約６．Ｉ　Ｋｂｐ　）　’に：作製した
。目的のクロー７は、テトラサイクリ／耐性の形ｊＩｔ
転侠株の中から選択した。得られたサブクロー／の割限
岬索切町点地図を、第２図（ａに示した。

実施例６　　（ＤＮＡ塩基配列の決定）ヒト免疫グａフ
’）：／ＧＦｃ領域遺伝子の塩基配列は、マ千サム・ギ
ルバート法により決定した。

たとえば、前記実施例５において作成されたサブクロー
ｙｐＴＪ５ＤＮＡ約５０μ＆ｔｔ−Ａ凡例４の方法に準
じてＳｍａ　ｌで切断する。得られたＤＮＡ断片をアル
カリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化し、ポリヌクレ
オチドキナー−ｔ？（）’−Ｌバイオケミカルズ）５ユ
ニツトを用いてｌｒ−３２Ｐ　）　Ａ　Ｔ　Ｐで標識し
た。ポリヌクレオチドキナーゼ反応は５０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉａ　−ＨＣｌｔ　（ｐＨ９，５）−ｌ　ＯｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１，−５ｍＭジ＋ｒスレイトール水浴液中で行ないＣ
ｒ−３”Ｐ）ＡＴＰは７マーシヤム製を１００μＣｉ分
用いた。３２ｐ標６６　Ｄ　Ｎ　ＡｌＲ１片’ｔ　Ｐｓ
ｔ　ｌで切断した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲルａ度５％）Ｖｒ−より目的のＤＮＡ断片を分離し
、ゲルからの抽出を行なった。得られた　Ｐ標識−Ｓｍ
ａ　［／　Ｐｓｔ　ｌ断片について、各塩基臀真的な部
分分解反応を行ない、７Ｍ尿索を當むポリアクリルアミ
ドゲル′亀気泳！１ｌｌ（ゲルＩＡ度８％〜２３％〕で
分離した。２〜７日間、−ｓ　Ｌ）　’Ｃで万一トラジ
オタラフィーを行なった後、分解パター７の解析を行な
い、Ｆｅ憤域遺伝子の塩基配列決定のための貸料とした
。

一方、ｐＴＪ５をＰｓｔｌで切断した場合には、３′禾
端標識キツト（７マーシヤム）を用いて、〔α−５２Ｐ
　）　ｄｄＡＴＰ　Ｉｃよる標識を行なった。

この３２Ｐ　　ｍ　ａ　ｌ）　Ｎ　Ａ　１９７片を５ｍ
ｍ１で切断した後、目的のＤＮ　Ａ　ｌｒ片のポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲルｄ度５％ンによる分離・
回収を行なった。得られた　Ｐ−標識−ｐｓｔ　１　／
Ｓｍａ［断片についても、上ｄｄ手順に従って解析を行
ない、Ｆｅ領域遺伝子の塩基配列決定のための室料とし
た。

実施例７　〔元机型プラスミドの作製（ＣＨ，部位遺伝
子のクロー二／グン〕 実施例５で得られたプラスミドｐＴＪ５を、実施例４０
方法に準じて１σ１ｊ限酵素Ｐｓｔ　ｌで切断した後、
７ガロースゲル電気泳動（ゲル嬢度０．８％）を行ない
、Ｆｅ領域遺伝子を含む約１，７ＫｂｐのＤＮＡ断片な
実施例５の方法でゲルより回収した。得られたＤＮＡ断
片を、実施例４０方法で制Ｐ＆酵素Ｎａｅ　Ｉで切断し
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル嬢度５％）を
行なった。

ＣＭ８部位遺伝子を含む約Ｌ１．６　ＫｂｐのＤＮＡの
部分に相歯するバンドを切断し、そのポリアクリルアミ
ドゲル断片を細か（破砕した後、２〜５−の溶出用バッ
ファー（５００ｍＭ　　ＮＨ４ＯＡｃ−１ｍＭ　　ＩＥ
ＤＴＡ　−０，１％８１）Ｓ　（ｐ）１７．５　）　　
）を加え、３７℃で一晩振とうした。遠心分離により、
目的のＤＮＡを含む水相の回収を行なった。さらに得ら
れたＤＮＡ１片を、実施例４の方法で制限＃索Ｒｓａ　
Ｉで切断し、ポリアクリル７ミド寛気泳動（ゲル濃度５
％）の後、ＣＨ８部位を含む約３１０　ｂｐのＤＮＡ　
ｗＴ片を、上記と同様な方法により、ポリアクリルアミ
ドゲルから回収した。

こうして得られたＣＩ（、部位遺伝子を含む約３１０　
ｂｐのＲａａ　Ｉ　＊−＋　Ｎａｅ　ＩのＤＮＡ断片を
、実施例５０方法にほぼ準じてプラスミドｐＢＲ３２２
のＢａｌ　Ｌサイトに挿入し、Ｃ）（、１ｉｉ（Ｓ位遺
伝子の読みとり方向がプラスミドｐＢＲ３２２中のテト
ラサイクリ／耐性遺伝子の読みとり方向と一致する方向
（第３図において時計まわりの方向ンに押入されたプラ
スミドｐＦｃ７０（約４．７に’ｏｐ　）　ｌ：作製し
た。ｐＦｃ７０作製の方法を第３図に示した。

実施例８　〔発現型プラスミドの作製（Ｃ）ｌ、部位遺
伝子とＣＨ，部位遺伝子の連結ン〕 実施例７で得られた、Ｆｃ領域遺伝子を含む約１．７　
ＫｂｐのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制限酵
素３ａｕ３ＡＩ及びＴａｑｌで切断し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、ＣＨ１部位遺
伝子を含む約２４０ｂｐのＤＮＡｗｒ片約０．５μＪを
、実施例７０方法に準じて、ポリアクリルアミドゲルか
ら回収した。

ＣＭ、部位とａｎ、　ｓ位の連結部分に相当する、第４
図記載の塩基配列を有する２不備オリゴヌクレオチドを
、上の頚と下の頚とに分けて化学合成した・オリゴヌク
レオチドの合成は全目動ＤＮｋ合成機（７プライド・パ
イ２−システムズ。

モｆル３８０Ａ）を用いて、ホスフォアミダイト法によ
り行なった。合成オリゴヌクレオチドの梢裏は、アプラ
イド・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なっ
た。すなわち、甘酸オリゴヌクレオチドを含むアノモニ
ア水溶液ヲ５５℃で一晩保つことにより、ＤＮｋ＠基の
保護基ｔはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲ
ル（ファルマシア）ｆｔ用いたゲルｆ’通によって、高
分子量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。つい
で、７Ｍ尿素を言むポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル濃度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により
原動パターンの観察を行ない、目的とする大きさのバ／
ド部分を切出して、実施例７０方法に準じて合成オリゴ
ヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルより回収した。

最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル１過カ
ラム（セファデックスＧ−５１Ｊ）＜かけることにより
、合成オリゴヌクレオチドの祠製品を得た。なお、必要
に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰り返し
、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはρ）つだ。

このようにして得られた合成オリゴヌクレ１−チド梢裏
物０．１−１．０μｌ　を、実施例６０力法に早じて、
　　１　ｍ１ｖｉ　　Ａ’ｆ’　Ｐ存在下でポリヌクレ
オチド干ナーセ反応を行ない、５′末端側をリン酸化す
る。５′末端なり／酸化した、上の頼と下の頭にａ当す
る２本の合成オリゴヌクレオチドを混合し、その７に溶
液温度を７０℃から冨温よで徐々に冷却することにより
、アニーリ／グ乞竹なった。以上のようにして、ＣＨ１
部位とＣｌ、部位との遅Ｍ部分に相当するＴａｑｌＨ８
ｍａＬのＤＮＡａｆＴ片（約６８ｂｐ）を取得した。

−万、＠記災施例７で作製したプラスミドｐｆ”Ｃ７υ
　Ｉ）ＮＡ約５μ：ｙ　を、実施例４記載の制限酵巣Ｓ
ｍａｊ＋ｊＪ断用ハンフ７−に溶解し、２〜５ユニント
のＳｍａｉ′？：加えて２０゛Ｃで１５〜４５分反応さ
せて部分分解ヲ行なつ１．フェノール抽出によりＳｍａ
■を失活させた後、実施例４の方法に準じて、制限Ｉ＃
素ＢａｍＨＩ　による切断を行なう。アガー−スゲルミ
気泳Ｍ（ゲル濃度Ｌ１．８％）の後、ＣＨ，部位遺伝子
とベクターの大部分を含む第４図記載のＢ　ａｍ　ＨＩ
　＋−＋Ｓｍａ　１−（１）のＤＮＡ断片（約３．６　
Ｋｂｐ　）を、実施例５０方法に準じてアガー−スゲル
より回収した。

以上のようにして得られた、ＣＨ，部位遺伝子を含むＳ
ａｕ　３　Ａ　Ｉ　−Ｔａｑ　ＩのＤＮＡ＃片、ＯＨ。

部位とＯＨ，部位の連結部分に相当するＴａｑＩ−８ｍ
＆ＩのＤＮＡ断片、セしてＣＨ１部位とベクタ一部分を
含むＢａｍＨＩ　（Ｓａｕ　３　Ａ　Ｉ　）　−８ｍａ
　１−（１）のＤＮＡ４片を混合し、実施例５０方法に
ほぼ準じて、ＣＨ，部位遺伝子とＣＨ５部位遺伝子がイ
ントロンを介さずに連結された遺伝子を含むプラスミド
ｐＦＣ７７（約３，９　Ｋｂｐ　）を作製した。第４図
にｐＦＣ７７０作製方法を示した。

実施例９　〔発現型プラスミドの作製（Ｆｃ領域遺伝子
とプロモーターとの４績）〕 実施例８で得られたプラスミドｐＦｃ７７　’ｉｔ。

実施例４の方法１ｃ準じて制限酵素５ｓｔｌＩ及びＰｓ
ｔ　ｌで切断し、７ガロースゲル電気泳４１Ｌｌｌ（ゲ
ル濃度０．８％）の後、ＣＨ１部位遺伝子の後半部分、
ＣＨ，部位遺伝子全域及びベクターの一部を含む、第５
図記載のＳｓｔ　ＩＩ←→Ｐｓｔ　ｌのＤＮＡ断片（約
２．７　Ｋｂｐ　）を、実施例５の方法に準じてアガロ
ースゲルより回収した。

次に、実施例７で得られたＦｃ領域遺伝子を含む約１．
７　ＫｂｐのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制
限酵素ＢｓｔＮＩ及び５ｓｔｌＩで切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、ＣＨ，部
位遺伝子の前半部分を含む約１７１　ｂｐのＢ　ｓ　ｔ
　Ｎ　Ｉ　　ｆ５１　Ｈ３ｓ　ｔ　ＩＩの１）ＮＡ断片
を、実施例７０方法に準じて、ポリアクリルアミドゲル
から回収した。

さらに、プロモーターと　Ｆｃ領域遺伝子との連結部分
に相当する、８ｇ５図記載の塩基配列な有する２本鎖オ
リゴヌクレオチド（約３９ｂｐ）を、実施例８の方法に
準じてｔ’ｌ＝製した。このＣＡａ　Ｉ　ＨＢ　ｓｔ　
Ｎ　Ｉ　−ｔ５）の１）ＮＡ断片中には、ｔｒｐプロモ
ーターとの連結のための制限酵素Ｃ１ａＩサイ）、ＡＴ
Ｇという塩基配列で衣わされる翻訳開始ラド／、ｈ部位
遺伝子及びＣＨ７部位遺伝子の一部が巡続して含まれて
おり、このＤｉ”ＪＡｙｆｒ片を用いることにより、イ
ントロ／のないＦｃ領域（ｈ−ＣＨｔ−ＣＨｔ部に）遺
伝子乞トリプトファ／・オペ口／・ＳＤ配列下流ＶＣ適
轟な距離をへだてて連結することが０丁能になった。

一方、ｔｒｐプロモーターを含むプラスミドｐＹ８３１
Ｎ（約４．７　Ｋｂｐ　）を、実施例４０方法に準じて
制限−＃ＰｓｔＩ及びＣ４ａ　Ｉで９ノ町し、７ガロー
スゲル電気泳動（ゲルｄ度０．８％ンのｉ、ｔｒｐプロ
モーター及びベクターの一部を含む、第５図記載のＰｓ
ｔ　１４−＋Ｃｌａ　ｌの１）ＮＡ　ｌｆＴ片（約１．
Ｉ　Ｋｂｐ　）を、実施例５の方法によりアガロースゲ
ルより回収した。

以上のようにして得られた、Ｃ１（、部位後半とＣＨ８
部位遺伝子とベクターの一部を含む５ａｔｌＩ＋＋ｐ　
ｓ　ｔ　１の１）ＮＡ＃＋片、Ｃ山部位遺伝子前半部分
を含むＢｓｔＮｌ　　（５）Ｈ８ｓｔｆＩのＤＮＡ断片
、プロモーターと　Ｆｃ禎域遺伝子との連結部分に相当
するＣ１１ａ　Ｉ　＋−＋Ｂ　ａ　ｔ　Ｎ　Ｉ　−（５
１のＤ　Ｎ　Ａ　ｔｌｒ片、セしてｔｒｐプロモーター
とベクターの一部を含むＰｓｔ　１−Ｃ１＆　Ｉ　ｄ）
　ＤＮＡ　断片を混合し、実施−１５の方法にはぼ準じ
て、Ｆｃ領域（ｈ−ＣＨ，−ＣＨ３部立）遺伝子発現型
プラスミドｐＦＣ２０３（約４．ＯＫｂｐ　）を作ｍｌ
、た。第５図ＫｐＦＣ２０３の炸裂方法を示した。

また、プロモーターとＣＨ，部位遺伝子との連結部分に
相当する、第６図記載の塩基配列を有する２不知オリゴ
ヌクレオチドを用いることにより、上記とほぼ同じ方法
で、Ｆｃ％Ｂｉ域（ｃＨ，−ＣＵ、　部位）ａ伝子発現
型プ５　スミトｐＦｃ　２０４（約３，９　Ｋｂｐ　）
　？：作製した。第６図にｐＦｃ２Ｕ４の作製方法ケ示
した。

実施例１０　　（発現製プラスミドの改造（ＳＤ配列と
翻訳開始コドンとの距離の改変）〕前記実施例９で得ら
れた　Ｆｃ領域遺伝子発現屋プラスミドｐＦＣ２０３Ｄ
ＮＡ約３ｔｔｌＹ、実施例４の方法に準じて制＠酵素Ｃ
１ａｌで切断した後、ポリメラーゼ用バッファー（５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，２）　−１０ｍＭ
　Ｍｇ５Ｏ，二〇、１　ｍＭＤＴＴ　　５０　ｒ／Ｉｌ
ｌ　ＢＳＡ　〕４０　μＡ’に溶解し、０．２５ｍＭの
ｄＣＴＰ及び０．２５　ｍＭのｄＧＴＰ存在下で、２ユ
ニツトのＤＮＡポリメラーセ■・ラージ・７ラグメ／ト
（ベセスタ・リサーチ・ラボラド１１−ズ）を加えた。

３７゛ｃで３０分間反応させて、末端の平滑化をはかる
。フェノール抽出によりＤＮＡポリメラーゼ■・ラージ
・フラグメントを失活させた後、実施例２に記載の方法
に準じて自己連結反応を行ない、実施例５の方法に準じ
て　ｈ”ｃ＠域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ２０３Ｐ
を作製した。このｐＦＣ２０３Ｐにおいては、ＳＤ配列
と翻訳開始ラド／との距離が、ｐＦｃ２０３よりも２　
ｂｐ長（なっている。

第７図にｐＦ’ｃ２０３）’　の作製方法と、翻訳開始
コドン上流域のＤＮＡ塩基配列を示した。

人に、実施例９で作製した　ｆ＋”ｃ領域遺伝子発現型
プラスミドｐＦｃ２０３　　ＤＮＡ約３μ９を、実施例
４の方法に準じて制限酵素Ｃ１ａＩ　で切断した後、Ｓ
−１ヌクレアーゼ用パンファー１：３０ｍＭ　　Ｎａ０
Ａｃ　−５ｔ）　ｍＭ　ＮａＣＡ！　−１ｍＭ　　Ｚｎ
ＳＯ４−５％グリセロール（ｐＨ４，６）　）　４０μ
ｌに溶解し、Ｓ−１ヌｙレアーゼ（ペセスタ・リサーチ
・う゛　　ホラトリーズ）２５ユニツトを１え、３７℃
。

３０分間の成心により木端の平滑化を計った。

フェノール抽出によりＳ−１ヌクレアーゼを失活させた
後、上記と同線な方法により、ＦＣＣ領域遺伝子発現型
プラスミドルＦｃ２０３を作製した。このｐＦＣ２（１
３８においては、８１）配列と翻訳開始ラド／との距離
が、ｐＦｃ２０３よりも２ｂｐ短くなッテイる。第７図
ｖｃｐＦＣ２０３Ｓの作製方法と、翻訳開始コドン上流
域のＤＮＡ塩基配列を示した。

実施例１１　Ｃ発現型プラスミドの改造（ａ訳終止コド
ンのタ／テム化）〕 実施例９で倚られた　Ｆｃ領域遺伝子発机型プラスミド
ｐＦｅ２０３ｆｔ、実施例８に記載の方法にほぼ準じて
、制現酵素Ｓｍａｌで部分分解した後、制限酵素Ｐｓｔ
　１よる児全分解を行なう。アガロースゲル電気泳ＭＪ
（ゲル濃度０．８％）の仮、Ｆｃ領域遺伝子の大部分と
ベクターの一部を含む第８図記載のＳｍａ　ｌ　−＋２
１−Ｐ　ａ　ｔ　１の１）ＮＡ断片（約１，８　Ｋｂｐ
　）’ｔ　、実施例５の方法ＩＣ準じてアガロースゲル
より回収した。

また、Ｃｉ（、部位遺伝子後部と翻訳終止フド／に相当
する、第８図記載の１４基配列を有する２本鎖オリゴヌ
クレオチド（約１７ｂｐ）ｆｔ、″Ｘ施例８の方法に準
じて作製した。このＳｍａ　Ｉ　　１２１−Ｂ　ａｍ　
ＨＩのＤＮＡ　１ｌＦｒ片中には、ＣＩ（、部位遺伝子
の一部、Ｔ　Ａ　Ａ　’ｒ　Ａ　Ｇという塩基配列で表
わされるタンデム化翻訳終うドド／及びベクターとの連
結のための制限＃素ＢａｍＨＩサイトが含まれており、
このＤＮＡ１ｌ？片を用いることによりＦ”ｃ領域遺伝
子の翻訳終止ラド／のタンデム化がｏＪ能になった。

一部、プラスミドｐＢＲ３２２ｆｔ、実施例４の方法に
準じて制眠ｒ＃索ｐａｔ　ｌ及びｇａｍＨＩで切回、ア
ガｐ−スゲル電気泳励（ゲル濃度０．８％ンの後、ベク
ターの大部分を含む、第８図記載のＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ
　ｌの１）ＮＡ　断片（約３，２　Ｋｂｐ　）ｔ、実施
例５の方法によりアガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、Ｆｃ領域遺伝子の大部分と
ベクターの一部を含むＳｍａＩ　　（２１ＨＰｓｔ　Ｉ
の１）ＮＡ断片、ＣＩ（、部位遺伝子後部とり／デム化
翻訳終止フド／を含むＳｍａｌ　−＋２し−ＢａｍＨＩ
のＤＮＡ断片、そしてベクターの大部分を含むＢａｍ　
ＨＩ　Ｈｐｓｔ　ｌの１）ＮＡ断片を混合し、実施例５
の方法にほぼ準じて、タンデム化５訳終うドド／を有す
る　Ｆｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ２１１（約
５．ＯＫｂｐ　）を作製した。第８図にｐＦｃ２１１の
作製方法を示した。

実施例１２　〔発現型プラスミドの改造（ｔａｅプロモ
ーターとの連結ン〕 実施例９で得られた　Ｆｃ領域遺伝子発現型プラスミド
ｐＦｃ２０３を、実施例４の方法に準じて制限＃素ＣＡ
！ａ　Ｌで切断し、ついで実施例１０の方法に準じて、
ｄｃＴＰ及びｄＧＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼエ・
ラージ・フ・ラグメ／ト処理により、末端の平滑化を行
なう。次にこのＤＮＡ断片を、実施例４０方法に準じて
制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで切断し、アガロ−スゲルミ４気泳
動（ゲル濃度０．８％）の後、Ｆｃ領域遺伝子全域とベ
クターの大部分を含む、第９図記載の約２．８　Ｋｂｐ
の１）ＮＡ断片を、７ガロースゲルより回収した。

久に、ｔＪＬｃプロモーターを含むプラスミドｐＤＲ５
４０（約４．ＯＫｂｐ　、ファルマシア）　ＤＮＡを、
実施例４０方法に準じて制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、
ついで実施例１０の方法に準じて、ｄＧＴＰ　、　ｄＡ
ＴＰ　、　ｄＴＴＰ　、　ｄｃ’ｒＰ存在Ｆ、ＤＮＡポ
リメラーゼトラージ・フラグメント処理により、末端の
平滑化を行なう。次にこのＤＮＡ断片を、実施例４の方
法に準じて制限酵素Ｐｓｔ■で切断し、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ｔａｃプロモータ
ーとベクターの一部を含む、第９図記載の約１．Ｉ　Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、ＦＣ領域遺伝子全域とベク
ターの大部分を含む約２．８　ＫｂｐのＤＮＡ断片と、
ｔａｃプロモーターとベクターの一部を宮ｔＪ約１．Ｉ
　Ｋｂｐ　（１）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｖｊｉ片とを混合し、
実施例５の方法にほぼ準じて、ｔａｃプロモーターの下
流ｉＣ’Ｆｃ領域遺伝子が２！！結した形の発現型プラ
スミドｐＦｃ３６１（約３．９　Ｋｂｐ　）を作製した
。

第９図にｐＦｃ３６１の作製方法を示した。

上記により得られた　Ｆｃ領域遺伝子発現型プラスミド
ｐＦｃ３６１　　ＤＮＡを、実施例４の方法に準じて制
限酵素ＳｇｔｌＩ及びＰａｔ　Ｉで切断し、アガａ−ス
ゲルミ気泳ｍ（ゲル瓢度０．８％）の後、ベクターの一
部、ｔａｃプロモー２−及びＦｃ領域遺伝子前半部分を
含む、第９図記載の５ｓｔ１１　←−＋　ｐ　ｓ　ｔ　
ＩのＤＮＡ断片（約１．：（Ｋｂｐ　）を、実施例５の
方法によりアガロースゲルより回収した。

また、実施例１１により得られたタンデム化翻訳終止う
ド／を有する　Ｆｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ
２１１　ＤＮＡを、実施例４０方法に準じて制限＃累Ｓ
ｓｔ　ＩＩ及びＰｓｔ　（で切断した後、上記と同じ手
法により、Ｆｃｖｔ域遺伝子後半部分、タンデム化翻訳
終うドド／及びベクターの大部分を含む、第９図記載の
Ｐｓｔ　ｌ　−３ｓｔＩＩのＤＮＡｌＩＴ片（約３，６
　Ｋｂｐ　）を得た。

かくして得られた、ベクターの一部、ｔａｃプロモータ
ー及び　Ｆｃ領域遺伝子前半部分を含む５ＩＩｔ　ＩＩ
　４−＋Ｐｓｔ　Ｉ　／）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片と、Ｆｅ領
域遺伝子後半部分、タンデム化翻訳終うドド／及びベク
ターの大部分を含むＰｓｔ　ｌ　（へ）Ｓａｔ　ＩＩの
ＤＮＡ断片とを混合し、実施例５の方法にほば準じで、
ｔａｃプロモーターの下流に　Ｆｃ領域遺伝子が連結さ
れ、なおかつタンデム化翻訳終うドド／を有する形の発
現型プラスミドｐＦＣ３６２（約４．９　Ｋｂｐ　）を
作製した。第９図にｐＦＣ３６２の作製方法を示した。

上記実施例により得られた　Ｆｃ領域遺伝子発睨型プラ
スミドｐＦＣ３６２のＤＮＡ塩基配列の一部を、第１図
に示した。８６査目から７５４食目０ｉ）ＮＡ塩基配列
で示されるポリヌクレオチドは、アミノ酸配列２番目か
ら２２４２４査目わされるポリペプチド、すなわちヒ）
ＩｇＧＦ’ｃ領域蛋白頁をコードしていた。

実施例１３　　（Ｆｃ領域遺伝子の発現Ｍ認少前記実施
例９，１０．１１及び１２で得られた　Ｆｃ領域遺伝子
発現型プラスミドを有する大ａｅＭｃ　６ｏｏ株な、３
０〜５０　μ＆　／　７　（１）　７７ビノリ１０．２
％のグリコース及び２〜／　ｒｎｌのカザミノ酸を２０
Ｍ９培地〔０，６％Ｎａ２ＨＰ０４−　Ｌ）、３％Ｋ１
１２ＰＯ，ｏ、ｕ　５％ＮａＣｊ＋　−０，１％Ｎ）Ｉ
、ＣＪ水溶版（ｐＨ７，−１）をオートクレーブ滅菌し
た後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭｇ　Ｓ　０４
水溶液及びＣａＣ４水浴欣をそれぞれ最終榎度２　ｍＭ
及び０．１ｍＭ　　になるように加える。〕又は３０〜
５゜μｉ／ｄのア／ピシリ／を含むＬ培地に炭種し、０
Ｄ６ｏｏがｔｌ、ｌに達するまで、３７℃で振とり培Ｉ
Ｉを行なう。久いで、ｔｒｐプロモーター使用の場合に
は最終良に５０μｙ／耐の３−β−イ／ドールアクリル
酸（シグマ）を、ｔａｃプロモーター便用の場合には最
終濃度５ｍＭ　のイソプロピル−β、Ｄ−チオガラクト
シド（シダ・マ）を、それぞれ培′＃液中に添加し、さ
らに０Ｄ６００が０．５に到達するまで、３７℃で振と
５培誉をαけた。

遠心分＃Ｉｌにより大腸菌画体を果めた後、ＰＢＳパン
ファー（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ！を含む２０　ｍＭす／
酸バッフ７　　、ｐＨ７，４）ｔｌ用いて菌体の抗争を
行なった。洗浄後の１体をＰＢＳパンファーに懸Ｓさせ
、超音波発生装置（久保田、２０１３Ｍ型）を用いて菌
体な破壊した後、遠心分離により菌体残渣の除去を行な
った。

得られた大Ｒ１ｋ菌ライゼートに対して、Ｔｒｉｓ　−
ＨＣ１バフ７７　　（ｐＨ６，８）、ＳＤＳ、２−）ル
カ７’ｌ−エタノール、グリセロールを、それぞれ最終
一度６１）　ｍＭ、　２％、４％、１０％になるように
加え、５Ｌ）Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔鈴
木、遺伝、３１．４３（１９７７））を行なった。分離
用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳ　Ｄ　Ｓ
　”−’ｉ’ｒｉａ−グリシ／系（Ｕ、Ｋ。

Ｌａｅｍｍｌｉ　、　Ｎａｔｕｒｅ　ｒ　　２２７　＋
　　６８０（１９７０）　３を用いた。電気泳動終了後
、ゲル中の蛋白質を、２５　ｍＭ’ｒｒｊｓ　−１９２
ｍＭ　グリシ７　（ｐＨ８，３）−２０％メタノールの
バッファー中で、電気泳動的ニニトロセルロース・フィ
ルターに吸着させ、ウエスタ／・プロツテイ／グを行な
った。

蛋白質を吸着させたニドｐセルロース・フィルターを５
％ウシ血清７ルグミンを言むＰＢＳパンファー中に６０
分間浸した後、−矢抗体としてウサギ抗ヒ）　ＩｇＧ−
Ｆｃ成分仇血ｍ（カンペル）を用いた間接法で、ベルオ
キシターゼ標識抗体を用いたイミュン・プロット・アッ
セイ・キット（バイオ・ランド）により、ヒト免疫グロ
ブＩに／ＧＦｃ領域蛋白質を％異的に染色した。

結果の一部を複写して第１０図に示した。この際に、後
記参考側記載の方法によりｇ４製した既知量の天然型ヒ
ト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質も同一の５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動号を行ない、既知量の
　Ｆｃ領域蛋白質のバンドの濃さとの比較により、大腸
菌における　Ｆｃ領域蛋白質産生賃？決定した。各櫨Ｆ
ｃ領域遺伝子発現をプラスミドを有する大１＆笛０６０
０株のＦｃ領域蛋白質の産生量を、第１表に示した。

第　　１　　表 （Ｆｃ領域蛋白質産生ｔの比較） 第１表記載の　Ｆｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐＦｃ
３６２を有する大腸１ｉ１ｉｃ　６００株について、そ
の培地・培養条件等の検討を行なったところ、Ｆｃ領域
蛋白質の産生量は１１１＠養あたり１５ｍ９にまでｕＪ
上した。この産生量は大腸菌全１体蛋白の１０％にも及
び、入腸−細胞１個あたり約３０万分子のヒト免疫グロ
ブｌＪ：／Ｇｆ＋”ｃ領域蛋白質が生産されていること
になる。

また、天然型　Ｆｃ領域蛋白質にくらべ大腸菌産生　Ｆ
ｃ領域蛋白質の分子型が約５０００クルトン小さいとい
う第１０図の結果から考えて、大腸酊産生　Ｆｃ領域蛋
白質には糖鎖の付加がＨこつ工いないものと思われる。

実施例１４　（大腸菌産生Ｆｃ領域蛋白質の精製）３　
ｍｌの活性型７フイニテイー支持坏アフイ・ゲル１０（
バイオ・ランド）と６，２　Ｉｎ９の７フイニテイ−ｍ
ｍしツジ抗ヒ）　ＩｇＧ−Ｆｃ成分抗体（カッペル）と
を、（１，１ＭＭＵＰＳパンファー（ｐＨ７，５、半片
化学薬品）中でカンプリングさせて、大腸菌産生　Ｆｃ
領領域蛋白質槽周用７フイニテイーカラムを作製した。

４℃で２時間カンプリングを行なったところ、用いたヒ
ツジ抗辷）　ＩｇＧ−Ｆｃ成分抗体の約４０％が支持体
上に固定化された。

前記実施例１３で調製した大腸菌ライセードを上記の７
フイニテイー・カラムピ通し、Ｆｃ１Ｊ域蛋白質のみを
特異的にカラムに吸着させた。

カラムをＰＢＳバッファー及び５００　ｍＭ　ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭす／鍍パンファー（ｐｆ（７，４）で光
分洗沖した後、０．１Ｍグリシ７−　ＨＣＩバッファ　
　（ｐＨ２，３）ヲ用イテ、Ｆｃ　＊　ｋＡ　蛋白買ヲ
浴出させた。溶出した　Ｆｃ領域蛋白質を水に対して透
性し、凍結乾燥した後に、実施例１３０方法に準じて５
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ゲル濃度１２．５
％）を行なった。′ｆ姪気水動終了後、ゲル中の蛋白頁
のバンドを銀染色試薬（第−化学薬品）を用いて染色し
たところ、高純度の大腸菌産生　Ｆｃ領域蛋白質が得ら
れたことが確認できた。

参考例　（天然型ヒト免疫グロブ１ＪｙＧＦｃ領域蛋白
質の調製） ０．３ｙのヒト免疫グロブリンＱ（シグマ）。

１７．５ｍ９のシスティＺ、７．５＃のＥＤＴＡ・２Ｎ
ａをＰＢＳバッファー（実施例１３を参照）に浴解し、
１５０μどのパパイン（シグマ、タイプ１■）をＡｍし
て、３７′Ｃで７時間放置する。パバイ／処ｑ後のＩｇ
Ｇを、ＰＢＳバッファーで平衡化したセファデックスＧ
−２θＯスーパー・ファイン・ゲル（ファルマシア）を
用いたゲル１過カラムにかげ、パバイ／処理によって生
成したＦｃ領域蛋白質及びＦａｂ領域蛋白質を、未反応
のＩｇＧと分離した。得られた　Ｆｃ領域蛋白質とＦａ
ｂ領域蛋白質とを含む溶液を水に対して透析し、凍結乾
燥によって濃縮した後、ＤＩＣ５２・ＤｇＡＥ・セルロ
ース（ワットマ／）を用いたイオノ父換カラムにかげた
。カラムを１０ｍＭす／酸バッファー（ｐＨ７，４）で
洗浄し、Ｆａｂ領域蛋白質を完全に溶出−させた後、Ｎ
ａＣ１磯度をＯｍＭから３５０　ｍＭまで直線的に変化
させた１　０　ｍＭ　’）／酸バッファ　−（ｐｉ（７
，４）を用いて、Ｆｃ領域蛋白質を浴出させた。上記と
同様にして透析、凍結乾燥を行ない、天然型ヒト免疫ク
ロ７’　ＩＪ　７　ＧＦｃＦｃ領域蛋白質得した。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト免疫グロプリ／ＧＦＣ領域遺伝子発現型プ
ラスミドｐＦＣ３６２のＤＮＡ塩基配列の一部と、それ
に対応する　Ｆｃ領域蛋白質のアミノ酸配列を示したも
のである。第２図は、ヒト免疫グロブ＋）７Ｇ遺伝子を
含むクロー／の制限酵素切断点地図と、Ｆｃ領域遺伝子
を含むサブ・クローンの制限酵素切断点地図とを示した
ものである。第３図はＣＩ（、部位遺伝子を営むプラス
ミドｐＦＣ７０の作製方法を示したものであり、８ｇ４
図はＣＨ，−ＣＨ，部位遺伝子を含むプラスミドｐＦｃ
７７の作製方法を示したものである。 第５図及び第６図はそれぞれ　Ｆｃ領域遺伝子発現型プ
ラスミドｐＦｃ２０３及びｐＦｃ２０４の作製方法を示
したものであり、第７図は　Ｆｃ　％域発現減プラスミ
ドｐＦｃ２０３ｓ及びｐＦ’ｃ２０３Ｐのｆ′Ｆ−裏方
法を示したものである。第８図はＦｃ領域発現型プラス
ミドｐＦｃ２１１の作製方法を示したものであり、第９
図は　Ｆｃ領域発現梨プラスミドｐＦｃ３６１及びｐＦ
ｅ３６２の作製方法を示したものである。第１０図はＦ
ｃ領域遺伝子の発現確認結果を示したものである。 ％許出願人　帝人株式会社 笛３図 ↓ＰｓｔＸ 手続補正書 昭和６１年６り／／日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図に示されたアミノ酸配列の２番目（Ｔｈｒ）
   から２２４番目（Ｌｙｓ）までによって表わされるポリ
   ペプチドを含み、ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含ま
   ないヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域単量体蛋白質。 ２、該蛋白が第１図に示されたアミノ酸配列の１番目（
   ＭＥＴ）から２２４番目（Ｌｙｓ）までによって表わさ
   れるポリペプチドを含む第１項記載の単量体蛋白質。 ３、天然のグリコシル化を伴わない第１項または第２項
   記載の単量体蛋白質。 ４、第１項、第２項または第３項記載のいずれかの単量
   体蛋白質を会合させることにより得られたヒト免疫グロ
   ブリンＧＦｃ領域二量体蛋白質。 ５、微生物細胞によって生産された第１項、第２項、第
   ３項または第４項記載のいずれかの蛋白質。 ６、第１図に示されたアミノ酸配列の２番目（Ｔｈｒ）
   から２２４番目（Ｌｙｓ）までによって表わされポリペ
   プチドをコードしたＤＮＡを含む遺伝子断片。 ７、第１図のＤＮＡ配列の８６番目（Ａ）から７５４番
   目（Ａ）までによって表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに
   相補的な一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを含む第６
   項記載の遺伝子断片。 ８、第１図のＤＮＡ配列の１番目（Ｃ）から７６５番目
   （Ｃ）までによって表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相
   補的な一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを含む第６項
   記載の遺伝子断片。 ９、第１項、第２項または第３項記載のいずれかのヒト
   免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質をコードしたＤＮＡを
   含む遺伝子断片を組み込んだ組換えプラスミド。 １０、第９項記載の組換えプラスミドによって形質転換
   された組換え微生物細胞。 １１、該微生物細胞が大腸菌である第１０項記載の組換
   え微生物細胞。 １２、第１０項記載の組換え微生物細胞を培養し、培養
   物中にヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域蛋白質を生成蓄積
   せしめ、得られた培養物からヒト免疫グロブリンＧＦｃ
   領域蛋白質を分離することを特徴とする、ヒト免疫グロ
   ブリンＧＦｃ領域蛋白質の製造方法。