JPH025866A - ヒトアルファフェトプロテインドメインｉ遺伝子、対応プラスミド組換体、対応形質転換体、該ドメインｉの製造法及び製造された該ドメインｉ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、合成アルファフェトプロティン（以下ｒＡＦ
ＰＪという）ドメインエ遺伝子、より詳・しくは、ヒト
アルファフェトプロティン（以下ｒｈＡＦＰＪという）
ドメインＩをコードする遺伝子、該遺伝子を挿入した対
応プラスミド組換体、該組換体で形質転換された形質転
換体、遺伝子工学的手法によるｈＡＦＰドメインＩの製
造法、及びこれにより製造されたｈＡＦＰドメインエに
関している。

従来の技術及びその課題 ｈＡＦＰは、胎児性蛋白質であり胎児肝で合成され、成
人ではほとんど合成されないが、肝癌の発生に伴い血清
中に再び現われ、その濃度は著しく増加する。ｈＡＦＰ
は、胎児期の血清アルブミンの役割を果たしていると考
えられているが、詳細な役割は明確ではない。而して、
ｈＡＦＰの生化学的性質としてはビリルビン、脂肪酸、
ステロイドホルモン等との結合能を有していること、免
疫抑制作用を有することが知られており、胎児の保護と
ホルモン調節を行い、母体からの拒絶反応抑制をつかさ
どっていることなどが考えられている（　ｒＢｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ａｌｐｈａ
−Ｐｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｖｏｌ、Ｉ　Ｊ　ｅｄ、ｂ
ｙ　Ｇ、Ｊ、　Ｍｉｚｅｊｅｖｓｋｌ、ｌＩ。

１１ａｃｏｂｓｏｎ、ｃＲｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８７　
）。

ｈＡＦＰは、分子量約７万の蛋白質であり、そのジスル
フィド結合様式から相互に類似した３つのドメインから
なることが報告されている［Ｐｒｉｍａｒｙ　５ｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ａ　−Ｐｅｔｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍＲＮＡ、Ｔ、Ｍｏｒｌ
ｎａｇａ、Ｍ、５ａｋａｉ。

Ｔ、Ｇ、Ｗｅｇｌｌａｎｎ　ａｎｄ　Ｔ、Ｔａｍａｏｋ
ｉ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０．４６０４−４６０８（１９８３
）　］　、これらのドメインについてヒト以外の動物種
間でのＡＦＰの比較においてはそれぞれ高い相同性が認
められているが、ヒトと他の動物との比較においてはｈ
ＡＦＰのドメイン■について他の動物のものとの相同性
が低い。このことは、ＡＦＰが進化を経て、３つのドメ
イン構造を採るようになったが、特にｈＡＦＰのドメイ
ンＩについては最も進化が進みｈＡＦＰとしての特徴は
そのドメインＩに存しているものと思われる。

従って、上述のようなｈＡＦＰの性質、機能にはそのド
メインＩが大きく関与していると考えられ、またｈＡＦ
ＰドメインＩ自体にｈＡＦＰと同様の性質、機能、例え
ば免疫抑制剤活性が期待でき、その研究、医薬品への応
用等のためｈＡＦＰドメインＩの大量生産が要望されて
いる。

課題を解決するための手段 本発明者は、上記要望に応えるべく、ｈＡＦＰドメイン
Ｉを遺伝子工学的手法により製造する方法について鋭意
研究を重ねた。その結果、ｈＡＦＰドメインＩをコード
する遺伝子を新たに設計し、化学合成することに成功す
ると共に、かくして得られる遺伝子を適当なプラスミド
ベクターに組込んで遺伝子組換体（発現ベクター）を構
築し、これを利用して微生物等を形質転換し、該形質転
換体を培養して目的とするｈＡＦＰドメインＩを発現さ
せるのに成功し、ここに本発明を完成するに至った。

本発明によれば、下記アミノ酸配列［Ａ］Ｔｈｒ　Ｌｙ
ｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　　　　　　　［
Ａ］で表わされるｈＡＦＰドメインＩをコードする遺伝
子を含有する遺伝子であって、Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ
に対応する塩基配列が５′端からＡＴＴＣＴＡＧＡＣで
あす、Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒに対応する塩基配列が５
′端からＧＡＧＡＴＡＴＣＴであり、Ａｓｐ　Ａｌａ　
Ｌｅｕに対応する塩基配列が５′端からＧＡＣＧＣＧＴ
ＴＧであり、Ｇｌｕ　ｌ１ｅＬｅｕに対応する塩基配列
が５′端からＧＡＧＡＴＣＴＴＧであり、Ｇｉｎ　Ｖａ
ｌ　Ｐｒｏに対応する塩基配列が５′端からＣＡＧＧＴ
ＡＣＣＡであり、Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒに対応する塩
基配列が５′端からＧＡＡＧＣＴＴＡＣであり、４ｇ Ａｌａ　Ａｒｇに対応する塩基配列が５′端からＧＣＧ
ＣＧＣであり、且つＧｌｕ　Ｌｅｕに対応する塩基配列
が５′端からＧＡＧＣＴＣであることを特徴とするｈＡ
ＦＰドメインＩ遺伝子が提供される。

また本発明によれば、上記遺伝子の具体例として下記式
［１］で表わされる、アミノ酸配列［Ａ］に対応する塩
基配列を含有することを特徴とするｈＡＦＰドメインＩ
遺伝子が提供される。

５°ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＡＧＡ　ＡＡＣＧＡＧ　
ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＡＴＣＧＣＴ３°ＴＧＴ　ＧＡＣＧＴ
Ａ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＣＴＣＡＴＡ　ＣＣＴ　ＴＡＧ　
ＣＧＡＴＣＣＡＴＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＴＣＴ　ＴＡＴ　
ＣＡＡ　ＴＧＴ　ＡＣＣＧＣＧＡＧＧ　ＴＡＡ　ＧＡＴ
　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＡＴＡ　ＧＴＴ　ＡＣＡ　ＴＧＧ　
ＣＧＣＧＡＧ　ＡＴＡ　ＴＣＴ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＧＡ
Ｔ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＡＣＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴ　ＡＧ
Ａ　ＡＡＴ　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＧＡＣＣＧＡ　ＴＧＧ　
ＴＡＴＴＴＴ　ＴＴＣＧＣＧ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＧＴＴ
　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＧ　ＡＣＣＡＡＡ　ＡＡＧ　Ｃ
ＧＣＧＴＣＡＡＡ　ＣＡＡ　ＧＴＣＣＴＴ　ＣＧＣＴＧ
ＧＴＡＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＡＧＣＡＡＡ　ＡＴ
Ｇ　ＧＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＣＡＴＧ　ＴＴＣＣＴＣＣＡ
Ｔ　ＴＣＧ　ＴＴＴ　ＴＡＣＣＡＡ　ＴＴＴ　ＣＴＧＧ
ＣＴ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＣＧＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＣＴＴ
　ＣＴＣＧＡＣＡＣＧＴＧＡ　ＴＴＴ　ＣＴＣＧＡＧ　
ＴＣＴ　ＣＴＣ５゜［１］ 更に本発明は、上記式［１］で表わされるｈＡＦＰドメ
インＩ遺伝子を、プラスミドベクターに挿入したプラス
ミド組換体、該組換体で形質転換させた形質転換体、及
びｈＡＦＰドメインＩの遺伝子工学的製造技術をも提供
するものである。

本明細書において、塩基配列、アミノ酸配列、之等を構
成する各核酸塩基、アミノ酸乃至その残基等の表示は、
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定乃至当該分野において慣用さ
れる略号によるものとする。

以下、本発明遺伝子の設計、合成、該遺伝子を含む発現
ベクターの構築、該ベクターの導入による形質転換体の
製造、該形質転換体の培養等につき順次説明する。

本発明遺伝子の塩基配列の設計は、以下の基準に従い、
種々の検討を重ねて行なわれたものである。

（１）宿主細胞として用いる、例えば大腸菌での使用頻
度の高いトリヌクレオチドコドンを選択する。これは、
大腸菌には大腸菌特有の転移リボ核酸の存在分布があり
、それに合致したコドン使用頻度に従うほうが高発現を
期待できるからである。また、用いるプラスミドベクタ
ー中の遺伝子発現調節領域に適合した配列を選択する。

例えば、本発明では、プラスミドベクターとして、トリ
プトファンプロモーターを用いた後記ｐＲＧ−１２が該
プロモーターのインデューサーである３−インドールア
クリル酸により極めて高い発現が誘導し得るので、好適
に使用できる。この場合、使用したベクターの遺伝子発
現領域のコドン使用頻度に従って使用頻度の高いコドン
を選択するほうが高発現を期待できる。

そこで、宿主細胞やプラスミドベクターの使用頻度の高
いコドンをアミノ酸配列にあてはめて第一次的な遺伝子
のヌクレオチド配列を決定する。

（２）遺伝子内及びその両端に特定の制限酵素認識部位
を持たせ、任意にその部位を操作して、他の遺伝子との
結合、プラスミドベクターへの挿入を行ない得るように
する。

特に、本発明遺伝子は、前記の通り、特定部位のアミノ
酸に対応して、遺伝子内に８カ所の特定の制限酵素認識
配列を設けた点に一つの特徴を有する。これにより、将
来の遺伝子変換によるｈＡＦＰドメインＩの活性の増強
や選択、安定性の増大等のためのｈＡＦＰドメインＩの
修飾等が容易になる。

従来の遺伝子合成では合成すべき遺伝子の配列を決定し
たときに偶然に検出される制限酵素認識部位を後に利用
するということであったが、本発明では制限酵素の種類
を厳選し、制限酵素の認識配列から可能なアミノ酸配列
を推定し、そのアミノ酸配列の存在をｈＡＦＰドメイン
Ｉのアミノ酸配列について検索し、その存在が認められ
たとき、その部位に制限酵素認識部位を設けることがで
きるという方法を案出した。制限酵素の種類は、合成遺
伝子領域及びプラスミドベクター領域内で重複しないも
のを選択した。

選択した制限酵素の認識配列より可能なアミノ酸配列を
推定し、それらのアミノ酸配列がｈＡＦＰドメイン■の
アミノ酸配列内に存在するかどうか検索する。例えば、
Ｘｂａ　Ｉの認識配列は５′端よりＴＣＴＡＧＡであり
、この配列から可能なアミノ酸配列としてＩ　Ｉｅ−Ｌ
ｅｕ−ＡＳＩ）が推定され、この配列がｈＡＦＰドメイ
ンエのＮ末端から１２番目に存在し、そのヌクレオチド
配列は、前記（１）の基準より５′端よりＡＴＡＴＴＧ
ＧＡＴであるのでコドンの置換によりこれをＡＴＴＣＴ
ＡＧＡＣとすればＸｂａ　Ｉの認識部位が導入されたこ
とになる。同様の操作を十数種類の制限酵素について行
ない、ｈＡＦＰドメインＩ遺伝子内の特定位置に８カ所
の特有な制限酵素認識部位を設けることができた。

（３）化学合成したオリゴヌクレオチドを集合、結合さ
せる場合、目的とする結合状態とは異なる遺伝子の結合
が起こらないか、又は最小限に留め得るようにする。

即ち、ｈＡＦＰドメインＩ遺伝子は、全鎖長が約６００
ｂｐと大きいので、例えば５ブロツクに分は遺伝子合成
を二段階の工程で行なうのが好ましい。各ブロックの遺
伝子の合成は、数十ヌクレオチド鎖長のオリゴヌクレオ
チドを合成し、それらの結合により行なわれる。合成オ
リゴヌクレオチドをアニールして二本鎖を形成させ、Ｄ
ＮＡリガーゼで結合して各ブロックを得、更に各ブロッ
クを同様に結合することにより遺伝子が得られるが、合
成すべき遺伝子のヌクレオチド配列内にｄｉｒｅｃｔ　
ｒｅｐｅａｔ及び１ｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ　、
長鎖のパリンドローム構造が存在すると合成オリゴヌク
レオチドをアニールするときに期待しないオリゴヌクレ
オチド同士の会合や、ヘアピン構造を形成して目的の二
本鎖ＤＮＡが効率良く形成されない。従って、コンピュ
ーターを使用して反復配列を検索し、それらが存在する
場合はコドンの置換によりアミノ酸配列及び先に導入し
た制限酵素認識配列を変えることなく反復配列を除去す
る。−回目の除去操作により新たに反復配列が生ずるの
で検索−除去操作を繰り返してほぼ完全に除去する。

上記基準より設計された本発明遺伝子構成部分の好まし
い塩基配列の一具体例は、前記式［１］に示す通りであ
り、これはｈＡＦＰドメイン■のアミノ酸配列に対応す
るもの、即ち該アミノ酸配列をコードするものである。

しかして本発明遺伝子は、ｈＡＦＰドメインＩのアミノ
酸配列をコードし、遺伝子組換え技術によりｈＡＦＰド
メインＩを発現、製造できる限り、また特に前記特定部
位のアミノ酸に対応して、遺伝子内に８カ所の特定の制
限酵素認識配列を有する限り、前記式［１コの塩基配列
に限定されるものではなく、これを基礎としてその塩基
配列の若干の変更、削除、付加等の改変乃至修飾が可能
である。かかる改変、修飾等の行なわれた塩基配列もま
た、これが前記式［１］の塩基配列と同一のｈＡＦＰド
メインＩ遺伝情報を有する限り、本発明遺伝子に包含さ
れる。

上記塩基配列の改変乃至修飾は、当業界で知られている
。その具体例は、前記式［１］の塩基配列によりコード
されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする
遺伝暗号（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｏｄｏｎ　）の採用にあ
る。

また、上記塩基配列の修飾（付加）には、これにより得
られる塩基配列を実際に適当なベクターに挿入し、微生
物等で発現させるために必要なプロモーター等の各種調
節因子との結合を行なうための各種制限酵素認識部位の
付与が包含される。

即ち、本発明遺伝子は、これを利用して遺伝子工学的手
法により目的のｈＡＦＰドメインＩ発現ベクターを構築
するに当たって、ｈＡＦＰドメインＩ遺伝子に更に、プ
ロモーター、シャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｌｎｅ−Ｄ
ａ１ｇａｒｎｏ配列、ＳＤ配列）、タンパク合成の開始
コドン、終止コドン等の各種調節因子を適宜結合させる
必要があるが、之等各塩基配列の切断、結合等の操作は
いずれも制限酵素の利用により行なわれるため、上記遺
伝子には、その前後に適当な制限酵素認識部位の付与が
必須となる。

かかる適当な゛制限酵素認識部位の付与された遺伝子も
また、本発明遺伝子に包含される。その−具体例として
は、下記式［２］で表わされるものを例示できる。これ
は、前記式［Ａ］の１９６アミノ酸残基をコードする前
記式［１］で表わされる塩基配列の前部にメチオニンの
コドン（開始コドン）を加え、後部に蛋白合成終結を確
実にするために終止コドン２種類を直列に加えて、ｈＡ
ＦＰドメインＩの構造遺伝子とし、更に該遺伝子をプラ
スミドベクターに挿入するために、その前後末端に制限
酵素Ｃ１ａ　Ｉと５ａｌＩの制限酵素認識部位を付加し
たものであり、引続く当該遺伝子発現ベクターの構築に
特に好適である。下記式［２］には、該塩基配列中の制
限酵素認識部位及び該塩基配列でコードされるアミノ酸
配列をも併記する。

ＴＧＴ　ＧＡＣＧＴＡ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＣＴＣＡＴＡ
　ＣＣＴ　ＴＡＧ　ＣＧＡＡＡＡ　ＡＡＧ　ＣＧＣＧＴ
ＣＡＡＡ　ＣＡＡ　ＧＴＣＣＴＴ　ＣＧＣＴＧＧＧＴＧ
　ＧＧＣＡＡＧ　ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＣＧＧ　ＧＧＡ　Ｔ
ＧＴ　ＴＡＧ　ＧＡＣＧＴＧ　ＡＧＴ　ＣＴＡ　ＡＣＧ
　ＡＣＧ　ＴＣＧ　ＧＴＣＴＣＧ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＡ
Ａ　ＡＣＣＣＧＣＣＧＡ　ＧＣＧ　ＡＴＧ　ＣＴＡ　Ｔ
ＴＴ　ＴＡＧ　ＴＡＧＣＣＡ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＴＴＧ
　ＡＣＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＣＧＴ　ＧＴＡ　ＴＴＣＴ
ＴＴ　ＧＧＣＴＧＡ　ＧＧＣＣＧＴ　ＡＧＣＴＡＧ　Ｇ
ＧＴ　ＧＡＣＡＡＡＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＡＧ　ＧＴＣＴ
ＧＧ　ＴＴＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＴＧＧ　ＣＡＡ［２］ 前記式［１］及び［２］で表わされる特定の塩基配列を
有する遺伝子を代表として、本発明の遺伝子は、之等の
塩基配列に従って、各核酸を順次反応させることにより
合成できる。この反応は通常の方法、例えば固相リン酸
トリエステル法［Ｋ、Ｍｉｙｏｓｈｉ　　ら、　　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｆ１ａ５．、　８゜５５０７
　（１９８０）］等により行ない得る。また、得られる
各塩基配列の単離精製は、例えば高速液体クロマトグラ
フィー等の常法に従うことができ、精製された各塩基配
列の確認は、必要に応じて、例えばホモクロマトグラフ
ィーによる二次元展開法［Ｅ、Ｊａｙ、Ｒ，Ａ、Ｂａｍ
ｂａｒａ、Ｒ，Ｐａｄｍａｎｂｈａｎ　ａｎｄＲ，Ｗｕ
、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１　、　
３３１（１９７４）コやマキサム−ギルバート法［Ａ、
Ｍ。

ＭａｘａＩＩｌａｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ。

７４、　５６０　（１９７７）　　；Ａ、Ｍ、Ｍａｘａ
ｍ　ａｎｄ　Ｗ。

Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、、ｖｏｌ、６５．　Ｉ）ｐ４９９、　Ａｃａｄ、Ｐ
ｒｅｓｓ　（１９８０）　］等により、それぞれ行なう
ことができる。

前記式［２］で表わされる塩基配列の本発明遺伝子は、
第１図に示されるように、例えば塩基数３４〜４３個の
オリゴヌクレオチドＵ１〜１５及び塩基数３２〜４６個
のオリゴヌクレオチドし１〜１５の３０個のオリゴヌク
レオチドを合成し、これをリン酸化及びアニーリングし
た後、結合して５つのブロックとし、これらを更に結合
することにより、好適に合成できる。

上記３０個のオリゴヌクレオチドを、第１表に示す。

本発明のｈＡＦＰドメインＩ遺伝子であるアミノ酸配列
［Ａ［をコードする遺伝子を含有する遺伝子であって前
記特定の８ケ所の制限酵素認識配列を有する遺伝子、そ
の具体例である前記式［１］及び［２］で表わされる遺
伝子は、次いで適当なプラスミドベクターに挿入してプ
ラスミド組換体（発現ベクター）とする。

上記プラスミド組換体は、これを導入して得られる形質
転換体が目的とするｈＡＦＰドメイン■を発現するため
には、本発明遺伝子と共に、その発現のための各種調節
因子、例えばプロモーターＳＤ配列、翻訳停止シグナル
、転写終結信号等を保有する必要がある。之等を保有す
るベクターにおける本発明遺伝子の発現様式及びそのた
めに用いられる各種調節因子は、特に限定はなく、例え
ば大腸菌を宿主細胞として利用する場合、その菌体内に
直接発現させる系、ペリプラズム層に分泌発現させる系
等を任意に採用できる。

上記各発現系の構築等の際に用いられる遺伝子工学的手
法は、いずれも常法に従うことができ、各種制限酵素に
よるＤＮＡの切断処理、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ等を用いたＤＮＡの結合処理、アガロースゲル
電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等によ
るＤＮＡの単離、精製、フェノール抽出法によるＤＮＡ
の回収、精製等を包含する。

また、前記各種調節因子を有しているプラスミドベクタ
ーを用い、これに本発明遺伝子を挿入することにより、
好適にプラスミド組換体（発現ベクター）を得ることが
できる。特に好ましく使用できるプラスミドベクターと
してｐＲＧ−１２を挙げることができる。プラスミドベ
クターｐＲＧ−１２は、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を高い
効率で発現してｒ’ａｓ蛋白質を与えるものであり、ま
たアンピシリン耐性情報を有しており、更にこれが含む
高発現プロモーターはトリプトファンプロモーターのリ
プレッサー領域を欠失し、ＳＤ配列と開始コドンの間の
ヌクレオチド鎖長が９ヌクレオチドであるという特徴を
有している［５ｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　
ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｇｒｏｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ａ
ｎｄ　Ｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｍ、Ｉｋｅｈａｒａ、ｏｔａｌ
、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
、８１．５９５６−５９６０（１９８４）］。また、こ
のベクターを用いることにより、３−インドールアクリ
ル酸を用いて容易にインダクションを行なうことができ
るという利点がある。

本発明における好適なプラスミド組換体（発現ベクター
）として、第１図に示すように、ベクターｐＲＧ−１２
のＣ１ａＩと５ａｌＩの制限酵素認識部位間に前記式［
２］で表わされる本発明ｈＡＦＰドメインＩ遺伝子を挿
入したベクターであるｐｐＴＡＦＰ−Ｉを挙げることが
できる。

上記本発明プラスミド組換体（発現ベクター）で形質転
換される宿主細胞としては、例えば大腸菌等のダラム陰
性菌、枯草菌等のダラム陽性菌、放線菌等の原核生物細
胞及び酵母等の真核生物細胞を例示できる。之等のうち
では特に大腸菌が好適である。その具体例としては、例
えば大腸菌に１２株由来のＨ８１０１株（ＩＩ、Ｗ、Ｂ
ｏｙｅｒ　ａｎｄ　Ｄ。

Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、、　Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、、　４１．４５９−４７２（１９６９）］及
びＪＭ１０３株［Ｊ、にｅｓｓｉｎｇ　ａｔ　ａｌ、＋
Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｒｅｓ、、　９．３０９
（１９８１）］等を例示できる。

また、形質転換の方法としては、カルシウム法［Ｅ、Ｌ
ｅｄｅｒｂｅｒｇ・Ｓ、Ｃｏｈｅｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｌｏｌ、、　１１９　。

１０７２（１９７４）３等の通常の方法に従うことがで
きる。

また、形質転換体が所期のプラスミドを有していること
の確認も、ラピッド　ボイリング法［Ｄ、８゜１１ｏ１
ｍｓ　ａｎｄ　Ｍ、Ｑｕｌｑｌｅｙ、Ａｎａｌ、Ｂｌｏ
ｃｈｅｍ、、ｌ１４．１９３（１９８１）］　、ジデオ
キシ法（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ、５ｃｉｅｎｃｅ。

２１４．１２０５（１９８１）　１等の常法に従い行な
うことができる。

本発明によれば、次いで上記により得られた形質転換体
を培養し、発現されたｈＡＦＰドメインＩを回収するこ
とにより、目的の該ドメインＩを好適に収得することが
できる。

形質転換体の培養は、常法に従い行なうことができる。

培地としては、例えばＬ　−ｂｒｏｔｈ培地のほか、Ｅ
培地、Ｍ９培地、Ｍ６３培地等の各種のものを利用でき
る。之等の培地には、更に通常知られている各種の栄養
を添加することもできる。

培養条件としては、微生物等の生育に適したｐＨ。

温度、通気、攪拌条件等を適宜選択して採用できる。例
えば大腸菌の場合には、ｐＨ約５〜８の範囲、特に約７
が適当であり、約２０〜４３℃の温度で、通気攪拌培養
すればよい。この培養により、上記した通り直接発現系
では目的タンパク質は細胞内に生産、蓄積され、分泌発
現系ではべりプラズム層に生産、蓄積される。

かくして生産された目的タンパク質は、これを常法に従
い分離、精製できる。この分離、精製操作としては、例
えばゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等が単
独で又は適宜組合わせて採用できる。

また精製された目的タンパク質の確認は、高速液体クロ
マトグラフィーによる単一ピークの出現、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による単一バンドの出現等により
行ない得る。更に目的タンパク質の同定は、通常のタン
パク質乃至ポリペプチドの構造解析手段と同様にして、
例えば５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の分析、アミノ酸
分析器によるアミノ酸組成の測定、アミノ酸シークエン
サーによるアミノ酸配列の解析、特異抗体との抗原抗体
反応等により行なうことができる。

本発明により、所望のｈＡＦＰドメインエを大量にしか
も高純度で採取することができる。また、後記の通り、
本発明に従い遺伝子工学的手法により得たｈＡＦＰドメ
インエについて生物活性を測定したところ、ビリルビン
、ニストロジエンと結合する活性を検出した。従って、
ドメインエ領域のみでもｈＡＦＰが持つ生化学的性質を
示すことが確認でき、免疫抑制剤の開発への展望が得ら
れた。また、抗ｈＡＦＰドメインＩ抗体を作成すれば、
極めて特異的な抗体が得られ、抗ｈＡＦＰドメイン■抗
体を用いた肝癌などの診断法の開発ができると期待され
る。

実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

実施例１　　ｈＡＦＰドメインＩ遺伝子の構築（１）オ
リゴヌクレオチドの合成 ｈＡＦＰドメインＩ遺伝子の構築に必要な前記第１表に
示す３０種のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機により
合成し、逆相ＨＰＬＣ，イオン交換ＨＰＬＣにより精製
単離した。合成には、アプライドバイオシステム社が市
販している１μｍｏｌのデオキシヌクレオシドが結合し
たＣＰ、Ｇ固相支持体を使用し、０．２５〜１ｍｇの各
精製オリゴヌクレオチドを得た。

（２）遺伝子の構築 第１図に示されるように、前記式［２］で表わされるｈ
ＡＦＰドメインＩ遺伝子の構築は、最初に３０種のオリ
ゴヌクレオチドを５つのブロックに分けてオリゴヌクレ
オチドの結合を行ない５つのＤＮＡフラグメントを得た
後、これらの５種のＤＮＡフラグメントを結合して求め
る遺伝子を構築した。

二本鎖ＤＮＡの５′末端に対応する２種のオリゴヌクレ
オチド（Ｕｌ、Ｌｌ）を除いて、各１０μｇのオリゴヌ
クレオチドを９．５μｌの５０ｍＭトリス−ＨＣＪ　　
（ｐＨ８，０）−１０ｍＭＭｇＣ１２１０ｍＭ　　２−
メルカプトエタノール−１ｍＭスペルミン−１ｍＭ　　
ＡＴＰに溶解し、３ユニツト（０，５μｌ）のＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加えて３７℃で９０分放置して
、オリゴヌクレオチドの５′末端のリン酸化を行なった
。

つづいて、リン酸化していない２種のオリゴヌクレオチ
ドも含めて約１２０ヌクレオチド鎖長の二本鎖ＤＮＡフ
ラグメントを構成するようにオリゴヌクレオチドを混合
した。これに緩衝液を加えて６６ｍＭ　　トリス−ＨＯ
２（ｐＨ７，６）−６，６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２−０．５
ｍＭ　　ＡＴＰとし、９０分で３分間加熱し、氷水中で
急冷し、再び７５℃に加熱し徐冷して二本鎖を形成させ
た。

混合物の温度が室温に到達したならば、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを加えて混合物を１５℃で２時間保ちオリゴヌクレ
オチドを結合させて約１２０ヌクレオチド鎖長のＤＮＡ
フラグメントとした。反応混合物についてフェノール抽
出、エタノール沈澱を行なってＤＮＡを回収し、１０％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なって目的のＤＮ
Ａフラグメントを単離した。

次に５種のＤＮＡフラグメントを混合し、第−段階口の
リゲーションと同じ緩衝液の条件とした。

これにＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて２０℃で放置した。

２時間後にフェノール抽出、エタノール沈澱を行なって
ＤＮＡを回収した。このＤＮＡについて５％ポリアクリ
ルアミド電気泳動を行なって目的の鎖長のＤＮＡ　（６
０２塩基対）を分離し、ゲルから抽出してＤＮＡを回収
した。以上の操作により約６ｐｍｏｌ　（１０ａ　ｇ）
のｈＡＦＰドメインＩ遺伝子が得られた。

実施例２　　ｈＡＦＰドメインＩ遺伝子を含むプラスミ
ドの構築 実施例１で得たｈＡＦＰドメインＩ遺伝子の発現は、大
腸菌で行ない、プロモーターにはトリプトファン（Ｔ　
ｒ　ｐ）プロモーターを使用することにした。従って、
プラスミドｐＲＧ−１２はＴｒｐプロモーターを含むの
で、ｐＲＧ−１２よりｈＡＦＰドメインＩ遺伝子挿入の
ためのベクターを得ることにした。

目的プラスミドは、第１図に示すようにして構築した。

プラスミドｐＲＧ−１２を制限酵素Ｃ１ａＩ及び５ａｌ
Ｉで消化し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行なうと、ｐＲＧ−１２のＴｒｐプロモーターの下流に
あるＤＮＡ配列を除去し、両末端にＣ１ａＩ及び５ａｌ
Ｉ接着末端を持つプラスミドベクターが得られた。一方
、先に得たｈＡＦＰドメインＩ遺伝子の５′末端を前述
のようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを用い
てリン酸化した。

続いてアルカリ性ホスファターゼで処理したプラスミド
ベクター（３μｇ、　１．　８μｍｏｌ）と、リン酸化
したｈＡＦＰドメインＩ遺伝子（３ｐｍｏｌ）を混合し
、６６ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）６．６ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２−０．５ｍＭ　　ＡＴＰ−１０ｍＭ２−
メルカプトエタノール−３５０ユニツト　Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ中で２０℃、２時間放置した。

これによりＴｒｐプロモーターの下流にｈＡＦＰドメイ
ンＩ遺伝子を組込んだプラスミドｐＴＡＦＰ−Ｉが得ら
れるので、エタノール沈澱によりプラスミドを回収した
。

実施例３　　ｈＡＦＰドメイン■遺伝子の発現（１）ｐ
ＴＡＦＰ−Ｉによる大腸菌のトランスフォーメーション Ｃａ＋＋処理した大腸菌Ｈ８１０１株の懸濁液１００μ
ｌに、氷冷下ｐＴＡＦＰ−Ｉプラスミドを加え、水冷下
１０分放置した。続いて、４２℃で６０秒間加熱して熱
ショックを与えた。混合液を室温に戻したあとに、１或
のＬ　−Ｂ　ｒｏｔｈ培養液（１％バクトドリプトン、
０．５％バクトイ−ストエキストラクト、０．５％塩化
ナトリウム）を加えて３７℃で３０分培養し、冷却遠心
機により集菌して上清を捨て、再び０．３誰のＬ　−Ｂ
　ｒｏｔｈ培養液に懸濁した。この懸濁液を寒天培地に
拡散して（１００μｌ／プレート）、３７℃で一昼夜培
養した。この操作によりｐＴＡＦＰ−Ｉでトランスフオ
ームした大腸菌は寒天培地上にコロニーを形成した。３
μｇのベクターから出発して得たｐＴＡＦＰ−Ｉによっ
てアンピシリン耐性を持つ２４００個のコロニーが得ら
れた。これらのコロニーから２０個のコロニーを採取し
、ｒａｐｌｄｂｏｉｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄによりプラ
スミドを単離し、Ｃｌａ■、５ａｌＩ及びＥ　ｃｏＲＶ
を使用して制限酵素マツピングを行ないｈＡＦＰドメイ
ン■遺伝子の存在を分析し、１０種のトランスフォーマ
ントがｈＡＦＰドメイン■遺伝子を含むことを確認した
。さらにサンガーのジデオキシ法によりｈＡＦＰドメイ
ンＩ遺伝子のヌクレオチド配列を分析し、それが正しい
ことを確認した。

（２）ｈＡＦＰドメインエ遺伝子の発現ｈＡＦＰドメイ
ンＩ遺伝子の存在が認められた大腸菌トランスフォーマ
ント１０種について、ｈＡＦＰ下メインＩ産生の有無を
調べた。大腸菌をＭ９ＣＡ液体培地（５鶴）で−晩培養
（３７℃）し、培養液１００μｌを新しい５軛のＭ９Ｃ
Ａ培地に移植した。Ｍ９ＣＡ培地の組成は、第２表の通
りである。

第 表 但し表中８印は、別途オートクレーブ滅菌処理（１２１
℃で１５分間）した試薬を使用したことを示す。

これを１時間、３７℃で培養後、発現の誘導のため、３
−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）のエタノール溶液（
１０ｍｇ／ｍ９）を加えて（終濃度４０μｇ／ｍｅ）培
養を続けた。この間、適当な時間に６６０ｎｍでの濁度
を測定して大腸菌の増殖を観察した。１〜２時間程度で
対数増殖期に入り、８時間程度で定常期となった。一方
、ＩＡＡ添加添加後間時間時間、２３時間で培養液の１
００μｌを取り、遠心分離により集菌して、大腸菌産生
蛋白質の分析に供した。すなわち、上記で得た大腸菌を
ＳＤＳを含む溶液（２０μ！りに懸濁し、沸騰水浴中で
５分間加熱して溶菌し、冷却遠心後、蛋白質を５ＤＳ−
１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した
。その結果、トランスフォーマントＮｏ、２７．３３．
４０の菌株について、２３時間目のサンプルにゲル電気
泳動上ｈＡＦＰドメイン■の分子量的２３０００に相当
する位置に泳動される大量の蛋白質の産生が認められた
。

これらの菌株のうち、Ｎα４０の菌株であるプラスミド
ベクターｐＴＡＦＰ−Ｉを保有する大腸菌Ｈ８１０１株
は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）にｒＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔｌｌＢ　１
０１　ｐＴＡＦＰ−１）　Ｊなる表示で寄託番号「微工
研菌寄第１００７８号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１００７８）
Ｊとして寄託されている。

実施例４　　ｈＡＦＰドメインＩ蛋白質の調製ｈＡＦＰ
ドメイン■蛋白質の産生が認められた大腸菌トランスフ
ォーマントＮ１１Ｌ４０について大量培養を行なって目
的の蛋白質の調製を行なった。

大腸菌株Ｎｏ、４０を５０軛のＭ９ＣＡ液体培地中で一
晩、３７℃で前培養した。これを２ｊのＭ９ＣＡ培地に
移し、３７℃で１時間培養した後に■ＡＡのエタノール
溶液（８０■／８軛）を加えて培養を続けた。１７時間
後に遠心分離により集菌し、大腸菌を５００ｍの５０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣ２（ｐＨ７，５）−２５％シュークロー
スに懸濁して、再び遠心分離により集菌した。菌体７．
８ｇが得られた。これを１９０ｖ１の５０ｍＭ）リス−
ＨＣ／！　（ｐＨ７，５）−２５％シュークロース−０
，０２％ノニデートＰ−４０（シグマ社製）−蛋白質分
解酵素阻害剤（キモスタチン、ロイペプチン、アンチパ
イン、ペプスタチン、各０．　５ｍｇ）に懸濁し、リゾ
チーム２０■ｇを加え、０℃で１５分放置して溶菌した
。続いて、１或のノニデートＰ−４０，１０製の０．１
Ｍ　　ＭｇＣｌ２．２０ｍｇのＤＮａｓｅＩを加えて０
℃で１５分間放置した後、溶菌液を１４０００回転で１
０分間遠心して上清と沈澱を分離した。この上清と沈澱
について５ＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行なって目的の蛋白質の存在を確認した。その結果
、目的の蛋白質は不溶性蛋白質として沈澱中に存在した
。そこで、沈澱を７Ｍ尿素を含む５０ｍＭ）リス−ＨＣ
Ｊ　（ｐＨ７，５）　−１ｍＭＥＤＴＡ−１０ｍＭ　　
２−メルカプトエタノール（緩衝液Ａ）の緩衝液２００
絨に懸濁し、可溶成分を溶解し、再び１４０００回転、
１０分間遠心分離した。再び、上清（７Ｍ尿素溶液）と
沈澱についてゲル電気泳動を行なって分析し、目的の蛋
白質が上清に存在することを確認した。続いて、この７
Ｍ尿素溶出画分についてファルマシア社製のＤ　Ｅ　Ａ
　Ｅ　−Ｓ　ｅｐｈａｃｅｌを支持体としたカラムクロ
マトグラフィーを行なった。７Ｍ尿素を含む緩衝液Ａで
平衡化したＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−Ｓ　ｅｐｈａｃｅｌカラ
ムに上清画分をアプライし、７Ｍ尿素−緩衝液Ａ２００
蓋で洗った後、０から０．６Ｍ　　ＮａＣ１の直線濃度
勾配により蛋白質を溶出し分画した（２０ｖｆｌ／フラ
クシヨン）。第２図に示される様に、フラクションＮα
５４〜６０を目的蛋白質画分として得た。得られた両分
について５ＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行なって目的の蛋白質を含む両分を確認した。続い
て、この両分についてＳ　ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７５
のゲル濾過を行ない、殆んど単一のバンドとして目的の
蛋白質が含まれる両分を得た。この両分を、透析膜を用
いてＳ　ｃｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００粉末により濃縮
し、０．７５ｍｇ／ｌｌ５２の溶液が８観得られた。即
ち、２１の培養から約６ｍｇの高純度ｈＡＦＰドメイン
Ｉを得た。

実施例５　　ｈＡＦＰドメインエ蛋白質の同定実施例４
により得られたｈＡＦＰドメインＩを同定するためにア
ミノ酸配列分析を行なった。アプライドバイオシステム
社のアミノ酸配列分析機によりエドマン分解法により行
なった。最初にｈＡＦＰドメインＩについて分析を行な
ったところ、全くアミノ酸配列のデータが得られなかっ
た。これはエドマン分解が進行せず、アミノ酸配列の１
番目のスレオニンに結合したＮ−末端メチオニンのアミ
ノ基がアシル化されていることによると推定した。そこ
で、シアノジエンプロミド分解を行なってｈＡＦＰドメ
インＩをメチオニン部位で開裂して得られるペプチドに
ついてエドマン分解法による配列分析を行なった。即ち
、このｈＡＦＰドメインエをシアノジエンプロミドで分
解しペプチドの混合物を得た。このｈＡＦＰドメインＩ
の配列中にはＮ−末端（−１番目）、４７番目、１４０
４０番目箇所にメチオニンが存在することから３種のペ
プチドの混合物であると予想した。

アミノ酸配列分析機により順次５段階のエドマン分解を
行なった結果、■Ｖａ　１＋Ａｓｐ　（Ａｓｎ）、■Ｌ
ｙｓ、■Ａｓｐ　（Ａｓｎ）＋Ｐｈｅ、■Ａ１ａ＋１１
ｅ、■Ｌｅｕ＋Ｔｙｒという、各段階で２つのアミノ酸
の混合物として配列が分析された。このことは、２種類
のペプチドからデータが得られていることを示しており
、この配列をｈＡＦＰドメイン■のアミノ酸配列を参照
して、再配列したところ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａ
ｌ　ａ−Ｌｅｕ　（４８−５２）　、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−
Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｔｙｒ（１４１−１４５）となり、そ
れぞれ４８番目と１４１番目以降のアミノ酸配列と一致
した。従って、大腸菌から得た蛋白質はｈＡＦＰドメイ
ンＩであり、設計した遺伝子の指示通りの正しいアミノ
酸配列であることが確認された。続いて、このｈＡＦＰ
ドメインＩについてアミノ酸組成分析を行なったところ
第３表に示す結果が得られ、実験値と理論値がよく一致
しており、この結果もｈＡＦＰドメインＩ蛋白質が得ら
れていることを支持するものである。

尚、Ｎ−末端（−１番目）のメチオニンは、酵素により
、容易【二定量的に除去できる。

第 表 一方、抗ｈＡＦＰモノクローナル抗体を用いて、実施例
４により得たｈＡＦＰドメインＩが、抗ＩｇＧ抗体に対
する抗原性を有するかどうかを、酵素免疫測定法により
分析した。ｈＡＦＰドメイン■をＥＬＩ　ＳＡプレート
に吸着させ、これに抗ｈＡＦＰモノクローナル抗体を反
応させ、アルカリ性ホスファターゼを結合した抗ＩｇＧ
抗体を反応させ、アルカリ性ホスファターゼの基質を加
えて、呈色反応を行なった。ｈＡＦＰドメインＩと抗ｈ
ＡＦＰモノクローナル抗体が結合すれば、この分析法に
より黄色の呈色が見られるが、実験の結果、黄色呈色が
あった。このことは、抗ｈＡＦＰモノクローナル抗体に
よりｈＡＦＰドメイン■が認識されたことになり、この
結果も、ｈＡＦＰドメインＩの構造を支持するものであ
る。以上により、大腸菌で産生じた蛋白質がｈＡＦＰド
メインＩであることが同定できた。

実施例６　ｈＡＦＰドメインＩの生化学的性質ｈＡＦＰ
は、ビリルビンやエストラジオールなどと結合すること
が知られているので、ｈＡＦＰドメイン■についてもこ
れらのリガンドとの結合能を調べた。

ｈＡＦＰドメインＩとビリルビンとの結合については、
ｈＡＦＰドメインエによるビリルビンの水への溶解度を
調べる方法により分析した。その結果、０．　１２５ｎ
ｍｏｌのｈＡＦＰドメイン■に対して、０．　０３４ｎ
ｏ＋ｏｌ、０　、　５　ｎｍｏｌに対して０、　１２８
ｎｍｏｌのビリルビンが結合するという結果を得た。

エストラジオールとの結合能については、ｈＡＦＰドメ
インＩをニトロセルロースアセテートろ紙切片（ｌｘｌ
ｃｍ）に吸着させ、これｉこ放射性エストラジオールを
反応させ、その結合量を調べた。その結果、エストラジ
オールの結合活性が認められ、１０．　９ｐｍｏｌのｈ
ＡＦＰドメインＩに対し２４１　ｐｍｏｌのエストラジ
オールが結合した。

以上の結果、ｈＡＦＰドメインＩにビリルビンやエスト
ラジオールとの結合部位が存在することが判明した。こ
のことは、ビリルビン、エストラジオールの結合に関し
てはｈＡＦＰドメインＩがｈＡＦＰの代用となりうろこ
とを示しており、ｈＡＦＰの持つ免疫抑制活性が、ドメ
インＩにも存在する可能性がある。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明ｈＡＦＰドメインＩ遺伝子の構築、及
び該遺伝子のプラスミドｐＲＧ−１２への挿入によるプ
ラスミドｐＴＡＦＰ−Ｉの構築を示すものである。第２
図は、実施例４で培養により得られたｈＡＦＰドメイン
Ｉの精製の一例を示すものである。 （以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記アミノ酸配列［Ａ］ 【遺伝子配列があります】［Ａ］ で表わされるヒトアルファフェトプロテインドメイン
   I をコードする遺伝子を含有する遺伝子であって、【遺
   伝子配列があります】に対応する塩基配列が５′端から
   【遺伝子配列があります】であり、【遺伝子配列があり
   ます】に対応する塩基配列が５′端から【遺伝子配列が
   あります】であり、【遺伝子配列があります】に対応す
   る塩基配列が５′端から【遺伝子配列があります】であ
   り、【遺伝子配列があります】に対応する塩基配列が５
   ′端から【遺伝子配列があります】であり、【遺伝子配
   列があります】に対応する塩基配列が５′端から【遺伝
   子配列があります】であり、【遺伝子配列があります】
   に対応する塩基配列が５′端から【遺伝子配列がありま
   す】であり、【遺伝子配列があります】に対応する塩基
   配列が５′端から【遺伝子配列があります】であり、且
   つ【遺伝子配列があります】に対応する塩基配列が５′
   端から【遺伝子配列があります】であることを特徴とす
   るヒトアルファフェトプロテインドメイン I 遺伝子。 ［２］ヒトアルファフェトプロテインドメイン I のア
   ミノ酸配列に対応する塩基配列が、下記式［１］ 【遺伝子配列があります】［１］ で表わされることを特徴とする請求項１記載の遺伝子。 ［３］塩基性配列が、下記式［２］ 【遺伝子配列があります】［２］ で表わされることを特徴とする請求項１記載の遺伝子。 ［４］請求項１、２又は３に記載の遺伝子をプラスミド
   ベクターに挿入してなるプラスミド組換体。 ［５］プラスミドベクターがｐＲＧ−１２である請求項
   ４に記載の組換体。 ［６］請求項４又は５に記載のプラスミド組換体を宿主
   細胞に形質転換させた形質転換体。 ［７］宿主細胞が大腸菌である請求項６に記載の形質転
   換体。 ［８］ヒトアルファフェトプロテインドメイン I 遺伝
   子を発現し得るプラスミド組換体を宿主細胞に形質転換
   させ、次いでその形質転換体を培養し、発現されたヒト
   アルファフェトプロテインドメイン I を回収すること
   を特徴とするヒトアルファフェトプロテインドメイン
   I の製造法。 ［９］請求項８記載の製造法により得られる遺伝子工学
   的手法により製造されたヒトアルファフェトプロテイン
   ドメイン I 。