JP2561122B2 - 機能性ポリペプチド - Google Patents

機能性ポリペプチド

Info

Publication number
JP2561122B2
JP2561122B2 JP63089112A JP8911288A JP2561122B2 JP 2561122 B2 JP2561122 B2 JP 2561122B2 JP 63089112 A JP63089112 A JP 63089112A JP 8911288 A JP8911288 A JP 8911288A JP 2561122 B2 JP2561122 B2 JP 2561122B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fibrin
amino acid
fragment
polypeptide
cell adhesion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP63089112A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH01261398A (ja
Inventor
房夫 君塚
立 木下
洋一 大館
由起 菅原
郁之進 加藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Shuzo Co Ltd
Original Assignee
Takara Shuzo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Shuzo Co Ltd filed Critical Takara Shuzo Co Ltd
Priority to JP63089112A priority Critical patent/JP2561122B2/ja
Publication of JPH01261398A publication Critical patent/JPH01261398A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2561122B2 publication Critical patent/JP2561122B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、機能性ポリペプチド、特にヒトフイプロネ
クチン（以下、FN）と略記する）の機能性ポリペプチ
ド、並びにそれらをコードする遺伝子、及びその遺伝子
を用いた遺伝子工学的な製造方法に関する。
〔従来の技術〕
フイプロネクチンは、ヒト及び動物の血液や組織に広
く分布する多機能糖タンパク質であり、細胞の接着、伸
展、移動、分化、増殖、貪食などの生理作用に関与し、
組織の構築と修復、血液凝固、生体防御などに重要な役
割を果していることが知られている。
最近の分子生物学の進歩により、FNの全アミノ酸配列
及び遺伝子構造が解明された〔ジ エムボ ジヤーナル
（The EMBO Journal）第４巻、第1755〜1759頁（198
5）〕。
FNは、最大2327アミノ酸から成る分子量約25万のポリ
ペプチドがＣ末端付近で２つのＳ−Ｓ結合で２量体を形
成している。分子内アミノ酸配列はＩ型、II型、III型
の繰返し構造を有し、更に、細胞、コラーゲン、ヘパリ
ン及びフイブリン等に対する結合領域（ドメイン）がそ
れぞれ独立に存在する。
FNのこれらの機能は、産業上有用であり、例えば細胞
接着機能は細胞培養基質のコーテイング剤、あるいは創
傷治療剤として利用できる。またフイブリン結合能は、
血小板とフイブリンの結合を阻止することによる血液凝
固阻止剤としての用途が考えられる。逆に、細胞接着活
性とフイブリン結合活性の両方の機能を持つペプチド
は、血小板とフイブリンの結合を促進し、創傷治療効果
を高める。更に、最近の知見から、FNのフイブリン結合
ドメインがインスリン結合活性を有することが明らかに
され（第46回日本癌学会総会記事、第181頁）、細胞接
着活性とインスリン結合活性の両方の機能を有するポリ
ペプチドは、ドラツグデリバリーシステムとしての用途
も考えられる。
〔発明が解決しようとする課題〕
このように、FNはそれ自体あるいはその機能的断片と
して有用であるが、血液から採取するために、高価で採
取量にも限界がある。また、ウイルス感染等の問題もあ
ることから、その利用は大幅に制限されていた。
更にFNから特定の機能を有する領域を取出す方法とし
ては、酵素による限定分解あるいは、プロモシアン等に
よる限界分解等が知られているが、いずれも操作が煩雑
で収率も非常に低く実用的とは言い難い。
本発明の目的は、細胞接着活性とフイブリン結合活性
を合せ持つ新規な機能性ポリペプチドを構築し、その遺
伝子工学的な製造方法を提供することにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は機能性ポ
リペプチドに関する発明であつて、下記一般式I: Ａ−Ｂ ……〔Ｉ〕 〔式中Ａは、フイブロネクチンの細胞接着活性を有する
ペプチド残基で、Ala1235−Gln1516（282アミノ酸残
基）又はIle1410−Gln1516（107アミノ酸残基）を示
し、Ｂはフイブロネクチンのフイブリン結合ドメインペ
プチド残基で、Asn2133−Glu2324（192アミノ酸残基）
を示す〕で表されることを特徴とする。
本発明の第２の発明は、第１の発明の機能性ポリペプ
チドをコードする遺伝子に関する。
また本発明の第３の発明は、上記第１の発明の機能性
ポリペプチドをコードする遺伝子を組込んだプラスミド
に関する。
更に、本発明の第４の発明は、上記第１の発明の機能
性ポリペプチドの製造方法に関する発明であつて、上記
第３の発明のプラスミドを導入した宿主細胞を培養し、
該培養物より目的とする機能性ポリペプチドを採取する
ことを特徴とする。
本発明者らは、FNの細胞接着活性ポリペプチドに関
し、実質的にFNと同等の活性を有するポリペプチドの配
列を明らかにし、その遺伝子工学的製造方法を開発して
特許出願した（特願昭63−148号、及び同63−31820
号）。
その後、更に研究を進め、細胞接着活性と他の機能を
合せ持つ機能性ポリペプチドについて研究を重ねた結
果、細胞接着活性ポリペプチドとフイブリン結合ドメイ
ンペプチドとのハイブリツドポリペプチドを遺伝子工学
的に製造することに成功した。このハイブリツドポリペ
プチドを単離して、その生物活性を調べた結果、細胞接
着活性とフイブリン結合活性を合せ持つ多機能性ポリペ
プチドとしての生物活性を有することがわかつた。本発
明は以上の知見に基づいて完成された。
以下、本発明を具体的に説明する。
FNの細胞接着活性ポリペプチドとフイブリン結合ドメ
インペプチドとのハイブリツドペプチドを遺伝子工学的
に調製する手段としては、細胞接着活性ポリペプチドを
コードするDNAを含むプラスミド及びフイブリン結合ド
メインペプチドをコードするDNAを含むプラスミドか
ら、それぞれ必要な断片を取出し、両DNA断片をつなぎ
合せた後、適当な発現ベクターに読取りフレームが合う
ように接続することによつて達成される。細胞接着活性
ポリペプチドをコードするDNA断片は、既に種々の断片
がクローン化されている（特願昭63−148号、及び同63
−31820号）。これらのプラスミドから、必要な部分を
切出すことができる。
一方、フイブリンドメインをコードするDNA断片は、p
LF5、pLF3、pLF4及びpLF2のFNcDNA部分をつなぎ合せて
構築されたpLF2435〔バイオケミストリー（Biochemistr
y）第25巻、第4936−4941頁（1986）〕から必要な断片
を切出すことによつて調製することができる。
細胞接着活性ポリペプチドとフイブリンドメインポリ
ペプチドのハイブリツドペプチドをコードするDNA断片
を適当な発現ペクターに接続し、大腸菌に導入すること
により、ハイブリツドペプチドを大腸菌で発現させるこ
とができる。発現ベクターとしては、既存のすべてのベ
クターを使用することができる。
大腸菌によるハイブリツドペプチドの確認はイムノプ
ロツテイングによつて調べられる。全菌体タンパク質を
SDS−PAGE（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で
分離した後、泳動パターンをニトロセルロースフイルタ
ーに移し取り、FNの細胞接着ダメインを認識するモノク
ローナル抗体とフイブリンドメインを認識するモノクロ
ーナル抗体の両方に反応するバンドを検出することがで
きる。
発現されたペプチドの精製には通常のクロマトグラフ
イーの技術が用いられる。例えば菌体ペレツトをバツフ
アーに懸濁し、超音波処理により可溶性画分を得る。こ
れを、イムノブロツテイングに用いた抗体を結合させた
セフアロース4Bのカラムにかけ、アフイニテイ精製を行
う。イムノブロツテイングにより目的画分を集めること
によつて、細胞接着活性とフイブリン結合活性の両方の
機能を持つ機能性ポリペプチドを得ることができる。必
要とあれば、FPLC又はHPLCで更に精製することができ
る。
このようにして得られた機能性ポリペプチドは、細胞
接着活性、フイブリン結合活性及びインスリン結合活性
等の生物活性の測定に用いる。
細胞接着活性の測定には、NRK細胞を用い、例えば、
試料をバツフアーに溶かして、マイクロプレートに吸着
させた後、NRK細胞を添加して37℃で一定時間インキユ
ベートする。顕微鏡下で細胞の伸展を観察し、伸展の発
現に必要な最少量を天然のFNと比較することにより細胞
接着活性の強さを表わすことができる。フイブリン結合
活性の測定にはフイブリンを結合させたセフアロース4B
〔文献 トロムボシス リサーチ（Thrombosis Researc
h）第２巻、第137−154頁（1973）〕を用いることがで
きる。すなわち試料をフイブリン結合カラムに通した
後、通過液のSDS−PAGEを行うことにより、フイブリン
結合活性の有無を判定する。インスリン結合活性は、イ
ムノブロツテイングの手法に準拠して行うことができ
る。すなわち、試料をSDS−PAGEで分離した後、ニトロ
セルロースフイルターに移し取り、酵素標識したインス
リンを作用させる。フイルターを洗浄後、結合したイン
スリンを酵素活性により判定することができる。
このようにして、得られるペプチドの好適な例として
は、FNの細胞接着活性を有するAla1235−Gln1516（282
アミノ酸残基ペプチド）又は、Ile1410−Gln1516（107
アミノ酸残基ペプチド）と、フイブリン結合ドメインペ
プチドAsn2133−Glu2324（192アミノ酸残基）の結合し
たハイブリツドポリペプチドが挙げられる。
上記FNの細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ
酸配列は下記のとおりである： また、上記したFNのフイブリン結合ドメインペプチド
のアミノ酸配列は下記のとおりである： 〔実例例〕 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ FNの細胞接着ドメインIle1410−Met1517（108アミノ
酸残基）及びフイブリン結合ドメインAsn2133−Glu2324
（192アミノ酸残基）をコードするcDNA断片のクローニ
ング（第１図参照） 第１図は、本発明によるpTF1301構築の工程図であ
る。
（１−１）cDNA断片の調製 FNの細胞接着ドレインIle1410−Met1517（108アミノ
酸残基）をコードするcDNA断片を含む7.8kbのブラスミ
ドpTF201（特願昭63−148号）100μｇを制限酵素XbaI用
バツフアー、100ユニツトのXba I及び100ユニットのEco
R Iを含む100μｌの反応液中、37℃、２時間インキユベ
ートした。反応液をダイアジエン（DIAGEN）社製HPLCカ
ラム、ニユクレオジエン（Nucleogen）DEAE−4000（６
×125mm）にかけ、0.41kb断片２μｇを得た。次に、こ
の断片を20ユニツトのFckIで37℃、１時間処理し、同様
の精製法でXba I−Fck I断片（180bp）、Fok I−Fok I
断片（203bp）をそれぞれ250ngずつ得た。
一方、フイブリン配合ドメインAsn2133−Glu2324（19
2アミノ酸残基）をコードするcDNA断片を含む5.9kbのプ
ラスミドpLF2435〔バイオケミストリー第25巻、第4936
〜4941頁（1986）〕100μｇをHind III用バツフアー、1
00ユニツトのHind III及び100ユニツトのHinc IIを含む
100μｌの反応液中、37℃、２時間インキユベートし
た。これをアガロース電気泳動にかけ、1.2kbの断片を
切出した（収量２μｇ）。この断片１μｇをSau3A Iで3
7℃、１時間処理し、ニユクレオジエンDEAE−4000カラ
ムにかけ、Hinc II−Sau3A I断片（621bp）を200ng得
た。
（１−２）合成DNAアダプターの調製 細胞接着ドメインとフイブリン結合ドメインのcDNA断
片を接続するためのアダプター（鎖長24及び20、第１図
参照）をアプライドバイオシステムズ社のDNA合成機を
用いて合成し、それぞれ2.7μｇ、2.3μｇ得た。それぞ
れ100ngをアニーリング操作により２重鎖とした。
（１−３）cDNA断片とベクターの結合 （１−１）で得たcDNA断片を分泌型発現ベクターpIN
III−omp AI〔ジ エムボ ジヤーナル、第３巻、第243
7〜2442頁（1984）〕と結合させた。
すなわち、Xba I−Fok I断片（180bp）10ng、Fok I−
Fok I断片（203bp）10ng、Hinc II−Sau3A I断片（621b
p）30ng、（１−２）で得た合成DNAアダプター10ng、あ
らかじめXba I−BamH I挿入断片を除去したpIN III−om
pA Iベクター50ngをT4DNAリガーゼ用バツフアー0.5mMAT
P、10mM DTT及び2.8ユニツトのT4DNAリガーゼを含む20
μｌの反応液中、16℃、一夜インキユベートした。この
反応液を大腸菌の形質転換に使用した。
（１−４）大腸菌の形質転換とプラシミドの確認 （１−３）で得た反応液20μｌを用いて大腸菌HB101
を形質転換させた。得られた形質転換体21クローンにつ
いてプラスミドの分析を行つた。すなわち、各クローン
について50μg/mlアンピシリンを含む1.5mlのＬ−ブロ
スで一夜振とう培養し、ラピツド法によりプラスミドを
調製し、その一部をXba IとSal Iで２重消化した。これ
をアガロース電気泳動で分離し、予想されるXba I−Xba
I断片（0.56kb）及びXba I−Sal I断片（1.5kb）のバ
ンドの生成を調べた。その結果、12クローンに目的のバ
ンドが認められた。更に、その塩基配列をダイデオキシ
法で決定したところ、細胞接着ドメインの108アミノ酸
のｃ末端のメチオニンのコドンが欠落している以外は正
しい塩基配列を持つことを確認した。
この組換え体プラスミドをpTF1301と命名した。また
このプラスミドを保持する大腸菌HB101をEscherichia c
oli HB101/pTF1301と表示し、工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託した〔微工研菌寄第9947号（FERM P−99
47）〕。
実施例２ FMの細胞接着ドメインAla1235−Gln1516（282アミノ酸
残基）及びフイブリン結合ドメインAsn2133−Glu
2324（192アミノ酸残基）をコードするcDNA断片のクロ
ーニング（第２図参照） 第２図は、本発明によるpTF1801構築の工程図であ
る。
（２−１）pTF901のXba I−Pvu II断片の調製 細胞接着ドメインAla1235−Met1517をコードするcDNA
断片を含むプラスミドpTF901（特願昭63−148号）20μ
ｇを50ユニツトのXba I及び50ユニツトのPvu IIを含む2
00μｌの反応液中、37℃、１時間インキユベートした。
この反応液をアガロース電気泳動にかけ、Xba I−Pvu I
I挿入断片（0.61kb）を切出した（収量400ng）。
（２−２）pTF1301のXba I−Pvu II断片の調製 実施例１で得たプラスミドpTF1301 25μｇを50ユニツ
トのXba I及び50ユニツトのPvu IIを含む200μｌの反応
液中、37℃、１時間インキユベートした。この反応液を
アガロース電気泳動にかけ、Xba I−Pvu II挿入断片
（0.40kb）を切出した（収量400ng）。
また、Xba I−Xba I挿入断片を欠く8.0kbのペクター
を同時に切出し（収量２μｇ）、脱リン酸後、クローニ
ングに使用した。
（２−３）Xba I−Pvu II断片（0.61kb及び0.40kb）の
結合 （２−１）で得た0.61kb断片400ngと（２−２）で得
た0.40kb断片400ngをT4DNAリガーゼ用バツフアー、0.5m
M ATP、10mM DTT及び2.8ユニツトのT4DNAリガーゼを含
む20μｌの反応液中16℃、３時間インキユベートした。
65℃、10分間の処理で反応を止め、バツフアーをXba I
至適条件にし、10ユニツトのXba Iを加えて、37℃、２
時間反応させた。反応液をアガロース電気泳動にかけ、
Xba I−Xba I断片（1.01kb）を切出した（収量20ng）。
（２−４）Xba I−Xba I断片（1.01kb）とベクターの結
合 （２−３）で得たXba I−Xba I断片（1.01kb）20ngと
（２−２）で得た8.0kbのベクター20ngをT4DNAリガーゼ
用バツフアー、0.5mM ATP、10mM DTT及び2.8ユニツトの
T4DNAリガーゼを含む20μｌの反応液中、16℃、３時間
インキユベートした。この反応液を大腸菌の形質転換に
使用した。
（２−５）大腸菌の形質転換とプラスミドの確認 （２−４）で得た反応液20μｌを用いて大腸菌HB101
を形質転換させた。得られた形質転換体中12クローンに
ついてプラスミドの確認を行つた。ラピツド法で調製し
たプラズミドをXba I−Pvu IIの２重消化を行い、アガ
ロース電気泳動にかけ、予想される挿入断片（0.61kb及
び0.40kb）の生成を調べた。その結果１クローンに目的
のバンドが認められた。このクローンについて、更にEc
oR I消化を行い、挿入断片の方向性を調べたところ、正
しい方向に挿入されていることを確認した。また、ダイ
デオキシ法により塩基配列を決定し、目的の配列を含む
ことを確認した。
この組換え体プラスミドをpTF1801と命名した。ま
た、このプラスミドを保持する大腸菌HB101をEscherich
ia coli HB101/pTF1801と表示し、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第9948号（FERM P
−9948）〕。
実施例３ FNのキメラポリペプチドIle1410−Gln1516/Asn2133−Gl
u2324（299アミノ酸残基）の生産と精製 実施例１で得たHB101/pTF1301を50μg/mlのアンピシ
リンを添加した5mlのＬ−ブロスを含む試験管２本に接
種し、37℃、一夜振とう培養した。これを500mlの同培
地を含む2lの三角フラスコにそれぞれ接種して培養を続
け、660nmの吸光度が0.3となつたところで2mMのIPTG
（イソプロピルβ−チオガラクトシド）を添加し、20時
間後に集菌した。全菌体ペレツトを10mMトリス−HCl（p
H7.5）、5mM EDTAを含む溶液に懸濁して、超音波処理を
行い、12000rpm、30分間遠心して上済40mlを得た。これ
を抗FNモノクローナル抗体（FN−12、宝酒造）を結合さ
せたセフアロース4Bカラム（8ml）に通した。カラムを
洗浄ハツフアーＡ（20mMトリスHCl、pH 7.5）で洗浄
し、更に洗浄ハツフアーＢ（20mMトリスHCl、pH8.0、0.
1MKSl）で洗浄した。最後に溶出バツフアー（50mMグリ
シンHCl、pH2.3、0.2M KCl）で溶出した。溶出画分を集
め、電気泳動的にほぼ単一な34kdポリペプチド500μｇ
を得た。
実施例４ FNのキメラポリペプチドAls1235−Gln1516/Asn2133−Gl
u2324（474アミノ酸残基）の生産と精製 実施例２で得たHB101/pTF1801を実施例３と同様の方
法で2l培養し、抗FNモノクローナル抗体（FN−12）セフ
アロース4Bカラムにより精製した。この抗体カラム溶出
画分には55kdの目的のポリペプチドのほかに、その分解
物である35kdのポリペプチドを含んでいた。そこで続い
てフイブリン−セフアロース4Bカラムにより精製した。
すなわちD.L.ヘーン（D.L.Heene）らの方法〔トロムボ
シスリサーチ、第２巻、第137〜154頁（1973）〕により
作製したフイブリン−セフアロース4Bカラム（10ml）に
抗体カラム溶出画分を通した。カラムを洗浄バツフアー
（10mMトリスHCl、pH7.6、50mM NaCl、0.5mM EDTA）で
洗浄後、溶出バツフアー（25mMトリスHCl、pH7.6、6M尿
素）で溶出した。溶出画分を集め、電気泳動的に単一な
55kdのポリペプチド100μｇを得た。
実施例５ 生物活性の測定 実施例3,4で得られたキメラポリペプチドIle1410−Gl
n1516/Asn2133−Glu2324（107CBP/192FBP、299アミノ酸
残基）、 Ala1235−Gln1516/Asn2133−Glu2324（282CBP/192FBP、
474アミノ酸残基）を用いて以下の生物活性を測定し
た。
（５−１）細胞接着活性 ルオスラーテイー（Ruoslahti）らの方法〔メンツズ
イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology）
第82巻、第803〜831頁（1981）〕に準じて細胞接着活性
を測定した。すなわち試料を生理食塩水又は蒸留水で段
階的に希釈し、その50μｌを96穴マイクロプレートに分
注し、４℃、一夜インキユベートして試料をプレートに
付着させた。次にPBSバツフアーでプレートを２回洗浄
し、３％BSAを100μｌ加え37℃、１時間インキユベート
してプレートをフロツクした。プレートをPBSバツフア
ーで２回洗浄した後、あらかじめ、イーグルの最小培地
（MEM）に106細胞/mlとなるように懸濁させたラツト腎
細胞（NRK−49F）を100μl/ウエルの割合で分注し、37
℃、２〜３時間インキユベートした。
なお、使用したNRK−49F細胞は凍結保存した株を前培
養した後、トリプシン処理したものを用いた。
顕微鏡下で細胞の伸展を観察し、伸展に必要な最少量
を最少細胞接着活性として示す。結果を他の活性と共
に、後記第１表に示す。
108アミノ酸残基及び283アミノ酸残基の細胞接着ドメ
インのみを有するポリペプチド〔108CBP及び283CBP（Il
e1410−Met1517及びAle1235−Met1517）特願昭63−148
号〕を同時に測定し、キメラポリペプチドと比較検討し
た。
その結果、107CBP/192FBPは、108CBPに比し、約52倍
以上の活性が認められた。282CBP/192FBPは283CBPと同
等の活性が認められた。
（５−２）フイブリン結合活性 関口らの方法〔ジヤーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）第2
56巻、第6452〜6462頁（1981）〕に従い、フイブリン−
セフアロース4Bカラムへの吸着によりフイブリン結合活
性を調べた。前記D.L.ヘーンらの方法〔トロムボシス
リサーチ、第２巻、第137〜154頁（1973）〕により作製
したフイブリン−セフアロース4Bカラム（1.4ml）にキ
メラポリペプチドIle1410−Gln1516/Asn2133−Glu2324
（107CBP/192FBP、299アミノ酸残基）５μｇを通した。
7.5mlの洗浄バツフアー（10mMトリスHCl、pH7.6、50mM
NaCl、0.5mM EDTA）で非吸着画分を除いた後、溶出バツ
フアー（25mMトリスHCl、pH7.6、6M尿素）で吸着画分を
溶出させた。各画分を0.5mlずつ分画し、107CBP/192FBP
の溶出位置を抗FNモノクローナル抗体（FN−12、宝酒
造）を用いたELISA法により調べた。その結果、107CBP/
192FBPは吸着画分に認められ、フイブリン結合活性を有
することが確認された。同様の結果はAla1235−Gln1516
/Asn2133/Glu2324（282CBP/192FBP、474アミノ酸残基）
でも確認された。また、フイブリン結合ドメインを有し
ないIle1410−Met1516（108CBP）及びAla1235−Met1516
（283CBP）は、フイブリン−セフアロース4Bへの吸着は
認められなかつた。（第１表参照） （５−３）インスリン結合活性 FNのフイブリン結合ドメインにはインスリンの結合活
性があることが知られている（第46回日本癌学会総会記
事、第181頁）。
そこでキメラポリペプチドのインスリン結合活性を調
べた。107CBP/192FBP、282CBP/192FBP、108CBP、283CBP
を20μｇより順次1/2希釈したものをバイオラツド社製B
IO−DOTTMを用いてニトロセルロース膜に吸着させた。
このニトロセルロース膜を３％BSAを含むPBSバツフアー
でプロツキング操作を行つた後、50μg/mlのパーオキシ
ダーゼ標識したインスリン（シズマ社）を含むPBSバツ
フアー中室温、２時間放置した。次にこのニトロセルロ
ース膜をPBSで５分間、２回洗浄した後、結合したパー
オキシダーゼ−インスリンを４−クロロ−１−ナフトー
ル及び過酸化水素を基質として検出した。その結果108C
BP及び283CBPでは全く発色がみられないのに対して、10
7CBP/192FBP及び282CBP/192FBPでは濃度に対応した発色
がみられた。したがつて、107CBP/192FBP及び282CBP/19
2FBPにはインスリン結合活性があることが確認された
（第１表参照）。
〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明により、少なくと
も細胞接着活性とフイブリン結合活性とを合せ持つ機能
性ポリペプチド、並びにそれらをコードする遺伝子、及
びその遺伝子を用いて、該機能性ポリペプチドの大量生
産を可能とする遺伝子工学的な製造方法が提供された。
上記ポリペプチドは、創傷治療、ドラツグデリバリー
システムとしてなど各種の用途に有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第２図は本発明のプラスミド構築の工程図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 菅原 由起 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−89699（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−272975（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−282593（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−236485（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−82197（ＪＰ，Ａ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記一般式I: Ａ−Ｂ ……〔Ｉ〕 〔式中Ａは、フイブロネクチンの細胞接着活性を有する
    ペプチド残基で、Ala1235−Gln1516（282アミノ酸残
    基）又はIle1410−Gln1516（107アミノ酸残基）を示
    し、Ｂはフイブロネクチンのフイブリン結合ドメインペ
    プチド残基で、Asn2133−Glu2324（192アミノ酸残基）
    を示す〕で表されることを特徴とする機能性ポリペプチ
    ド。
  2. 【請求項２】請求項１記載の機能性ポリペプチドをコー
    ドする遺伝子。
  3. 【請求項３】請求項２記載の機能性ポリペプチドをコー
    ドする遺伝子を組込んだプラスミド。
  4. 【請求項４】請求項３記載のプラスミドを導入した宿主
    細胞を培養し、該培養物より請求項１記載の機能性ポリ
    ペプチドを採取することを特徴とする請求項１記載の機
    能性ポリペプチドの製造方法。
JP63089112A 1988-04-13 1988-04-13 機能性ポリペプチド Expired - Fee Related JP2561122B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63089112A JP2561122B2 (ja) 1988-04-13 1988-04-13 機能性ポリペプチド

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63089112A JP2561122B2 (ja) 1988-04-13 1988-04-13 機能性ポリペプチド

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8122797A Division JP2777986B2 (ja) 1996-04-22 1996-04-22 機能性ポリペプチド

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH01261398A JPH01261398A (ja) 1989-10-18
JP2561122B2 true JP2561122B2 (ja) 1996-12-04

Family

ID=13961808

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63089112A Expired - Fee Related JP2561122B2 (ja) 1988-04-13 1988-04-13 機能性ポリペプチド

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2561122B2 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5679320A (en) * 1988-12-29 1997-10-21 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
US5270030A (en) * 1988-12-29 1993-12-14 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptide and method of producing
US7087722B1 (en) 1988-12-29 2006-08-08 Savient Pharmaceuticals, Inc. Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
US5792742A (en) * 1991-06-14 1998-08-11 New York University Fibrin-binding peptide fragments of fibronectin
EP0611306B1 (en) * 1991-11-08 1998-07-08 Somatogen, Inc. Hemoglobins as drug delivery agents
WO1993020228A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Toray Industries, Inc. Novel, physiologically active protein and hemopoietic stem cell growth promoter

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8516421D0 (en) * 1985-06-28 1985-07-31 Biotechnology Interface Ltd Fibronectins
FI853760L (fi) * 1985-09-30 1987-03-31 Tampella Oy Ab Foerfarande foer styrning av ett borrverktyg vid bergborrning.
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
EP0231883B1 (en) * 1986-01-31 1992-09-02 Sagami Chemical Research Center Hybrid plasminogen activator-like polypeptide
JPH0636744B2 (ja) * 1986-04-04 1994-05-18 工業技術院長 キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子

Also Published As

Publication number Publication date
JPH01261398A (ja) 1989-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH07503369A (ja) 血小板及び／又は内皮下層へのｖＷＦの結合の拮抗剤である抗血栓性ポリペプチド
JP2561131B2 (ja) 細胞接着活性ポリペプチド
CN110950967B (zh) 抗人血清白蛋白纳米抗体与il-2融合蛋白及制备方法
EP0269455A2 (en) Highly purified fused protein comprising human IgE Fc fragment and production thereof
JP2829405B2 (ja) 機能性ポリペプチド
JP2561122B2 (ja) 機能性ポリペプチド
JP2561113B2 (ja) 細胞接着活性ポリペプチド
JPH01180900A (ja) 細胞接着活性ポリペプチド
CN110777148B (zh) 用于表达fgf-2的dna序列和制备fgf-2的方法
JP2005506319A (ja) 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。
CN110777165B (zh) 增强子序列和质粒载体及其制备方法和应用与转化体
JP2561149B2 (ja) 機能性ポリペプチド
JP2000247999A (ja) 固定化蛋白質の製造法
CN112521480A (zh) 一种人干扰素-κ突变体及其制备方法
JP2829397B2 (ja) フィブリン結合活性ポリペプチド
JP2777986B2 (ja) 機能性ポリペプチド
EP0261625A2 (en) Human B-cell differentiation factor and process of producing said factor
JP2516048B2 (ja) 化粧料
CN113527508B (zh) 一种血小板生成素拟肽-Fc融合蛋白的制备方法
JP2657256B2 (ja) 機能性ポリペプチド
JP2864152B2 (ja) 機能性ポリペプチド
JPH1042878A (ja) 機能性ポリペプチドの製造方法
JP2623807B2 (ja) セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子
JP2780160B2 (ja) 機能性ポリペプチド
JP2562951B2 (ja) 細胞接着活性ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees