JPH03128400A - 固定化プロテインｇ変異体およびその用途 - Google Patents
固定化プロテインｇ変異体およびその用途Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
発明の分野
本発明は固定化プロティンＧ変異体、およびその用途に
関する。 従来技術 近年、非免疫メカニズムによって抗体と結合する細菌１
ｇ（免疫グロブリン）レセプターの分子が非常に注目さ
れている。この結合は、抗体分子の可変部に位置する抗
原認識部位に対するものでなく、抗体の定常部に対する
ものである。この定常領域は多くのタイプの抗体で共通
しており、したがって細菌１ｇレセプターは多くのタイ
プの抗体と結合することができる。この性質故に、細菌
１ｇレセプターは多くの免疫化学的応用が可能である。 細菌Ｉｇレセプターは、まず第１に抗体の検出、抗体の
精製、および疾患の処置において有用に、または潜在的
に有用に応用し得る。抗体の検出は、特異的モノクロー
ナル抗体の分泌についてバイプリドーマクローンをスク
リーニングする、免疫した動物の免疫応答性を測定する
、および拮抗性結合検定によって抗原を定量するなど、
免疫学における実験室レベルの研究の幾つかの局面で必
要である。細菌１ｇレセプターを使用して抗体を検出す
る方法は、他の検出方法よりも感度が高く、妨害および
高いバックグランドシグナルを示しにくい傾向にあるこ
とが見いだされた［ボイル（Ｂｏｙｌｅ。 Ｍ、Ｄ、Ｐ、）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２：
３３４−３４０（１９８４）コ。 １ｇレセプターはまた、タンパク性薬物の精製に使用し
得る抗体の精製に、および治療物質としても有用である
。多くの方法が知られているか、通常の方法は固定化綿
ｍ１ｇレセプター〇カラムを使用したアフィニティーク
ロマトグラフィーの使用に関連する。この方法は、カラ
ムが何度でも再使用できるので、精製費用を低く抑えら
れる点から、好ましい方法である。 細菌ｒｇレセプターを臨床的に使用することにおけるそ
の多くの用途が、現在研究されている。 それには、固定化ｒｇレセプターの生体外カラムに血漿
を通し、その処置血漿を再注入することがある。たとえ
ば、テナン（Ｔｅｎａｎ、 Ｄ、 Ｓ、 ）らのＮ、
Ｅｎｇ。 Ｊ、 Ｍｅｄ、 ３０５：１１９５−１２００（１９８
１）を参照のこと。 最もよく知られている細菌１ｇレセプターは、スタフィ
ロコッカス・アウレウスのプロティンＡであり、これは
免疫グロブリンＩｇＧの定常部Ｆｃドメインに結合する
。他の細菌ｒｇレセプターも同定されている。これらの
中には、連鎖球菌（ストレプトコッカス）（ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｉ） ＧグループのプロティンＧとして知
られているものがある。プロティンＧはプロティンＡと
類似しているが、プロティンＧは重要な利点を幾つか有
している。たとえば、プロティンＧはヒトＩｇＧのすべ
てのサブクラスと結合するが、プロティンＡはＩｇＧ３
サブクラスとは結合しない［レイス（Ｒｅｉｓ、 Ｋ、
Ｊ、 ）らのＪ、 Ｉｍｍｕｎｏ１、 １３２：３０
９８−３１０２（１９８４）コ。プロティンＧはまたＩ
ｇＧに特異的であり、プロティンＡのようにＩｇＡおよ
び１ｇＭタイプのヒト抗体とは交差反応しない［メイル
（Ｍｙｈｒｅ、 Ｅ、 Ｂ、 ）およびロンパル（Ｋｒ
ｏｎｖａｌ１、 Ｇ、 ）の「連鎖法菌属のｒｇレセプ
ターの規定化タイプにおける免疫グロブリン特異性−」
：連鎖球菌および連鎖球菌疾患の基礎概念；ホーム（Ｊ
、 Ｅ、 Ｈｏ１ｍ）およびクラステンセン（Ｐ、 Ｃ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）編；レッドブック、 Ｌｔｄ、
チャートセイ、サロー； ２０９−２１０頁（１９８３
）］。さらに、プロティンＧは、プロティンＡでは弱く
しか結合しないか、またはまったく結合しない特定の動
物のＩｇＧと結合する。それには、ウシ、ヒツジおよび
ヤギＩｇＧ１ならびにウマＩｇＧの幾つかのサブクラス
がある［レイスら、前掲］。プロティンＧはまた、ネズ
ミモノクローナル抗体の幾つかのサブクラスとの結合性
の点で、プロティンＡよりも優れていることがさらに見
いだされた［ジョーク（Ｂｊｏｒｃｋ、 Ｌ、 ）およ
びロンパル（Ｋｒｏｎｖａｌ １、 Ｇ、 ）のＪ、
ｌ＋＋ｍｕｎｏ１．１３３：９６９−９７４（１９８４
）］。このような理由から、プロティンＧは種々の適用
で選択され得る細菌ｒｇレセプターとなると考えられる
。 プロティンＧは、研究目的では、天然でそれを産生ずる
ストレプトコッカス（連鎖球菌）株から精製することに
よって得ることができる。たとえば、ストレプトフッカ
スの細胞をタンパク質分解酵素（たとえば、パパインま
たはトリプシン）で処理してプロティンＧ（これは細胞
壁タンパク質である）を可溶化させ、次いで既知のタン
パク質精製法（たとえば、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、およびアフィニティークロマトグラフィ
ー）によってさらに、得られたプロティンＧを精製する
［欧州特許出願、公開番号第０１３１１４２号］。 プロティンＧおよびその変異体の利点、用途および潜在
的な用途を考えれば、組換えＤＮＡ法によって変異体が
生産でき、さらにクロマトグラフィーに（Φ用するため
には、その変異体が固定化できることが望ましいであろ
う。したがって、本発明の目的は、プロティンＧおよび
その変異体をコートしている遺伝子の構築およびクロー
ン、ならびに微生物宿主細胞をそのクローンした遺伝子
で形質転換し、プロティンＧの産生条件下でその形質転
換宿主を培養することによりプロティンＧおよびその変
異体を生産することである。さらに、本発明の目的は、
プロティンＧおよびその変異体を固体支持体に固定化す
ること、およびその固定化変異体をクロマトグラフィー
の分離操作に使用することである。 本発明の要約 本発明は、固相支持体に固定化されたプロティンＧ変異
体、およびその用途に関する。具体的には、本発明は本
発明の固定化プロティンＧ変異体を使用する、免疫グロ
ブリンおよび免疫グロブリンフラグメントの検出、単離
および精製方法をも目的とする。 意外にも、本発明の固定化プロティンＧ変異体は、プロ
ティンＧとは類似していない免疫グロブリンおよび免疫
グロブリンフラグメントとの結合性を有していることが
発見された。したがって、本発明の固定化プロティンＧ
変異体は、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグ
メントの検出、単離および精製を行うための新規かつ予
想外の方法に使用することかできる。 図面の説明 第１図は、プロティンＧをコードしているＤＮＡ断片の
クローニングに使用するのに適したベクターであるプラ
スミドｐｃｘｔｏｅｅの特徴を示している模式図である
。 第２図は、プロティンＧをコードしているＤＮＡ断片を
含有する組換えプラスミドベクターであるプラスミドｐ
ＧＸ４５３３の部分的な制限地図を示すものである。 第３図および第３Ａ−Ｃ図は、プロティンＧ遺伝子のＤ
ＮＡ配列、およびその遺伝子によってコードされている
アミノ酸配列を示すものである。 第４図は、クローンされたプロティンＧ遺伝子の制限地
図、およびｒｇＧ結合に関与するタンパク質産物の反復
構造を示すものである。 第５図は、プロティンＧをコードしている断片を含有す
るバクテリオファージベクターであるｍＧＸ４５４７の
部分的な制限地図を示すものである。 第６図は、Ｂ構造の２つの完全なコピーを含有するが、
ＢｌおよびＢ２に近接するすべての末端アミノ酸配列を
欠いているバクテリオファージベクターであるｍＧＸ７
８８０の部分的な制限地図を示すものである。 第７図は、プロティンＧをコードしている断片を含有す
る、Ｂ、ズブチリスを形質転換するのに使用される組換
えプラスミドベクターであるｐＧＸ４５８２の制限地図
を示すものである。 第８図および第８Ａ−Ｃ図は、ストレプトコッカスＧＸ
７８０９から誘導されたクローン化プロティンＧ遺伝子
によってコードされているプロティンＧ上における、活
性部位Ｂ１およびＢ２の位置を示すものである。 第９図および第９Ａ図は、ストレプトコッカスＧＸ７８
０５から誘導されたクローン化プロテ、インＧ遺伝子の
ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示すものである。この遺伝
子は３つの活性部位を含有するプロティンＧをコードし
ている。 第１０図は、菌株ＧＸ７８０５およびＧＸ７８０９から
誘導されたプロティンＧ遺伝子の反復構造間の関係を示
すものである。 第１１図は、活性部位配列から上流のコード化配列が欠
失しているプラスミドｐＧＸ４５８２からのプラスミド
ｐＧＸ４５９５の構築を説明するものである。 第１２図は、活性部位から下流のコード化配列が欠失し
ているプラスミドｍＧＸ７８７２からのブラスミｔ’ｐ
ＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９の構築を説明するも
のである。 第１３図は、プロモーターＯＬ／Ｐ Ｒを含有するプラ
スミドｐＧＸ２６０６ならびにプラスミドｐＧＸ４５９
７およびｐＧＸ４５９９からのそれぞれプラスミドｐＧ
Ｘ５２０３（プロティンＧ変異体タイプ３を発現する）
およびｐＧＸ５２０４（プロティンＧ変異体タイプ２を
発現する）の構築を説明するものである。 第１４図は、プロティンＧ変異体タイプ１をコードして
いる遺伝子を含有するプラスミドｐＧｘ４５９２の構築
を説明するものである。 第１５図は、プロティンＧ変異体タイプ５をコードして
いる遺伝子を含有するプラスミドｐＧＸ５２４５の構築
を説明するものである。 第１６図は、プロティンＧ変異体タイプ６およびタイプ
１１をコードしている遺伝子を含有するそれぞれプラス
ミドｐＧＸ５２４７およびｐＧＸ５２４６の構築を説明
するものである。 第１７図は、プロティンＧ変異体タイプ７をコードして
いる遺伝子を含有するプラスミドｐＧＸ５２４４の構築
を説明するものである。 第１８図は、プロティンＧ変異体タイプ８およびタイプ
９をコードしてい漬遺伝子を含有するそれぞれプラスミ
ドｐＧＸ５２５５およびｐＧＸ５２６８の構築を説明す
るものである。 第１９図は、プロティンＧ変異体タイプＩＯをコードし
ている遺伝子を含有するプラスミドｐＧＸ５２６６の構
築を説明するものである。 好ましい態様の詳細な説明 本発明は、プロティンＧ変異体をコードしているクロー
ン化遺伝子を提供するものである。「プロティンＧ変異
体」なる用語は、プロティンＧの１つまたはそれ以上の
天然［ｇＧ結合性ドメイン、天然■ｇＧ結合性ドメイン
のハイブリッド（雑種）を含有するタンパク質、および
変異体が［ｇまたはそのフラグメントの結合能を保持し
ている突然変異体を意味する。 「雑種配列（ハイブリッド配列）」なる用語は、Ｂ１お
よびＢ２に相当する配列部分をそれぞれ含有し、かつ免
疫グロブリン結合性を保持しているＤＮＡまたはアミノ
酸の配列を意味するものとする。このような雑種配列を
第９図に示し、それをＢ３と命名する。この雑種配列は
、Ｂｌドメインの最後の４９個アミノ酸と融合された結
合性ドメインＢ２の最初の６個のアミノ酸を含有してい
る。 したがって、免疫グロブリン結合性を保持しているこの
ような雑種配列はすべて本発明の範囲内に属すものであ
る。 このようなプロティンＧ変異体を得る方法を以下の実施
例に詳細に記載している。当業者は、通常行うスクリー
ニング法のみによって、Ｉｇまた。 はそのフラグメントの結合能についてプロティンＧ変異
体をスクリーニングすることができる。たとえば、プロ
ティンＧ変異体をｒｇまたはそのフラグメントと接触さ
せ、次いでプロティンＧ変異体とＩｇまたはそのフラグ
メントとの結合性を検出すればよい。２つのタンパク質
の結合性を検出する方法は、当業界では周知である。 プロティンＧ遺伝子はストレプトコッカス種のランスフ
ィールドグループ０株、またはＧ１４８株のプロティン
Ｇ遺伝子から得ることができる。 本発明はさらに、クローニングベクターに挿入されたプ
ロティンＧ遺伝子を提供するものである。 組換えベクターが安定に導入された原核生物の細胞は開
示されている。 本発明はまた、プロティンＧ分子の活性結合性部位のヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列の同定方法を提供す
るものである。さらに、プロティンＧ変異体の単一ドメ
インをコードしている１１個の遺伝子も提供するもので
ある。それから発現されるプロティンＧ変異体は固相支
持体に固定化された場合、プロティンＧとは異なる改変
Ｉｇ結合特性を示す。プロティンＧ変異体は、天然でプ
ロティンＧ遺伝子の両側に位置しくフランキング）、組
換え宿主から発現され得るプロティンＧの量を限定する
致死性配列を含有していない。 本発明の方法にしたがえば、プロティンＧ遺伝子をクロ
ーニングし、また組換えＤＮＡ技術により大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）またはバシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌宿主からプロティ
ンＧおよびプロティンＧ変異体を生産すれば、このよう
なタンパク質を得るための現在の方法よりも非常に多（
の利点を享受することができる。本発明の方法によって
、微生物プロティンＧおよびプロティンＧ変異体が相対
的に高い生産レベルで得ることかできる。さらに、本タ
ンパク質はより容易に単離できる条件下で生産すること
ができ、また本タンパク質は非病原性の宿主において生
産することができる。クローン化遺伝子を種々の多重コ
ピー発現ベクターに挿入すれば、その組換え発現ベクタ
ーで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ細胞の培養物中に、こ
れら価値あるＩｇＧ結合性タンパク質を増大したレベル
で得ることができる。通常は病原性菌株であるプロティ
ンＧ産生性ストレブトコ、カス株を培養するよりも、Ｅ
、ｃｏｌｉまたはバフラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）細胞でフロティンＧおよびプ
ロティンＧ変異体を生産するほうが良い。 プロティンＧ遺伝子をクローニングするための第１の工
程は、プロティンＧを産生ずるストレプトフッカス株の
単離である。これは、種々の株について適当な免疫検定
法を行いＩｇＧ結合活性を測定することによって行うこ
とができる。本発明者の行った方法は、以下の実施例で
詳細に記載しているコロニー免疫検定法である。Ｉ ｇ
Ｇ ３との結合能はプロティンＧに付随する望ましい性
質であるので、次に、ＩｇＧ結合活性を有することが判
明した株についてＩ ｇｃ； ３および非分画化ＩｇＧ
との結合能を試験する。Ｉ ｇＧ ３または非分画化Ｉ
ｇＧのいずれかで被覆した赤血球細胞を使用する血球凝
集試験（以下の実施例で詳細に説明する）は、プロティ
ンＧ産生株を同定するための常法である。プロティンＡ
は非分画化ＩｇＧとは結合するが、Ｉ ｇＧ ３とは結
合しないので、スタフィロコッカス・アウレウス コー
ワン（Ｃｏｖａｎ） Ｉなどの既知のプロティンＡ産生
株［スジョクイスト（Ｓｊｏｑｕｉｓｔ、 Ｊ、 ）の
Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 ７８：４７１
−４９０（１９７７）］を対照として使用することがで
きる。 栄養培地中で所望の細胞密度にまで培養し、次いで得ら
れた細胞を当業界既知である化学的、機械的および／ま
たは酵素学的方法によって細胞溶解することにより、プ
ロティンＧを産生ずることが見いだされた菌株から染色
体ＤＮＡを単離する。 この染色体ＤＮＡの単離には、通常の抽出法、および沈
澱法を使用する。そして、音波処理もしくは撹拌機中で
の高速撹拌などの既知の機械的方法、またはランダムな
断片が得られるＤＮＡ５ｅｌもしくは特定部位で開裂さ
せる制限エンドヌクレアーゼによる部分消化などの酵素
学的方法によって、クローニングするのに適した大きさ
のＤＮＡ断片を得る。 次いで、得られた染色体ＤＮＡ断片をクローニングベク
ターに挿入する。適当なプラスミドまたはバクテリオフ
ァージクローニングベクターを使用することができる。 ベクターが適当であるためには、幾つかの有用な性質を
有する必要がある。 目的とする微生物宿主細胞内で機能する複製起点、およ
びベクターにより形質転換された宿主細胞の同定に役立
つ選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子など）を含有して
いるべきである。また、挿入されたＤＮＡ断片を許容で
き、変わらず正常に複製できるべきである。好ましいベ
クターは、ベクターの複製能を破壊することなくＤＮＡ
断片を挿入できる独特の制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を１つまたはそれ以上含有するベクターである。 適当なりローニングベクターには、ラムダｇｔ１１ ［
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、
Ｕ、 Ｓ、 Ａ、 、 ８０ ： １１９４−１１９
８（１９８３）］などのファージ誘導体、Ｍ１３ｍｐ９
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒａｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
）などの種々のＭ２Ｓ−誘導ベクター、ｐＢＲ３２２な
どのプラスミド、および池の多くのもの［オールド（Ｏ
ｌｄ）およびプリムローズ（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）のＰｒ
１ｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔ
ｉｏｎ、 ２版＋ Ｕｎｉｖ、 ｏｆ、 Ｃａ１ｉｒ、
Ｐｒｅｓｓ、 ３２−３５および４６−４７頁（１９
８１）］がある。本発明者は、第１図に示している、ｐ
ＢＲ３２２誘導プラスミドベクターのｐｃｘ １０６６
を使用した。 ホモポリマー・テーリング法などの方法またはリンカ−
分子を使用することによって、ストレプトコッカスＤＮ
Ａをクローニングベクターに挿入する［オールドおよび
ブリムローズ、前掲、９２２ｉｒ制限エンドヌクレアー
ゼでベクターを線状化し、その線状化ベクター分子の末
端と連結できるＤＮＡ断片を生ぜしめる制限エンドヌク
レアーゼにより染色体ＤＮＡも消化するのが好都合であ
る。このようにして、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使
用する標準的な反応において、ストレプトコッカス誘導
化ＤＮＡ断片をクローニングベクターに挿入するのが好
都合である。 細菌細胞を標準的な方法により組換えクローニングベク
ターで形質転換し、プロティンＧの産生について細菌コ
ロニーをスクリーニングする。以下の実施例で記載する
コロニー免疫検定および作法凝集検定などの検定法は、
プロティンＧを産生ずる組換え菌株の同定に適している
。以下の実施例１でより詳細に説明しているが、同定さ
れた最初の陽性コロニーは不安定であった。このクロー
ンを数回、再画線培養（ｒｅｓｔｒｅａｋｉｎｇ）する
精製方法により、安定でありかつプロティンＧを産生ず
ると考えられるクローン誘導体を得た。この菌株をＥ、
ｃｏｌｉ ＧＸ ７８２０と命名した。 この菌株から得たプラスミドＤＮＡを単離した後、制限
分析、次いで電気泳動法によって分析した。この菌株は
２つのプラスミドを含有していると決定された。１つの
プラスミドは、ｐＧＸ１０６６クローニングベクターと
ほぼ同じ大きさであるとみなされ、それをｐＧＸ１０６
６Ｘと命名し、他方のプラスミドは１１キロ塩基対（ｋ
ｂｐ）の挿入体を含有するｐＧＸ１０６６とみなされ、
それをｐＧＸ４５３０と命名した。特定の理論にこだわ
るつもりはないが、本発明者らは以下の実施例によって
より詳細に説明するように、ｐＧＸ１０６６Ｘは、アン
ピシリン耐性遺伝子がもはや無傷ではないｐＧＸ１０６
６誘導体である「クリブチツク（ｃｒｙｐｔｉｃ）ヘル
パープラスミド」と考える。最初の形質転換株は、おそ
ら＜ｐＧＸ１０６６およびｐＧＸ４５３０を含有してお
り、またｐｃｘｔ０６６がアンピシリン耐性を付与して
存在する場合、プラスミドを保持する選択圧（ｓｅｌｅ
ｃＬｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｅｒ）が欠如していることに
より細胞からｐＧＸ４５３０が喪失され、したがって該
菌株は不安定であった。そのアンピシリン耐性遺伝子を
不活化する突然変異を有するｐＧＸ１０６６Ｘが現れた
なら、ｐＧＸ４５３０（無傷のアンピシリン耐性遺伝子
を有する）を保持した宿主細胞しかアンピシリン平板上
では生存できないであろう。ブラスミ）’ｐＧＸ１０６
６Ｘは、細胞内でｐＧＸ４５３０のコピー数を制限する
のに役立つと想像されるので、上記両プラスミドを含有
する細胞内にこのプラスミドを保持させる。プラスミド
ｐＧＸ４５３０は宿主にとって致死性のＤＮＡ配列を有
しているので、それ単独では宿主細胞にとっては致死的
である（実施例１参照）。しかし、ｐＧＸ１０６６Ｘを
その同じ宿主細胞に存在させれば、ｐＧＸ４５３０のコ
ピー数が許容レベルにまで減少される。これらプラスミ
ドは同じ「不和合性グループ」由来であり、すなわち各
プラスミドが宿主細胞内で他のプラスミドのコピー数を
制限するというように、細胞内で生存するために互いの
プラスミドと競合し合うのである。Ｅ 、 ｃｏｌ ｉ
菌株ＧＸ７８２０はアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクシコン（ロックビレ、メリーランド）に寄託され
、受託番号５３４６０が付されている。 菌株ＧＸ７８２０から単離したプラスミドの混合物でＥ
、ｃｏｌｉ菌株を形質転換した。この形質転換により、
小さいが強い陽性の多くのコロニーが得られた（幾つか
（約２０％）はＧＸ７８２０に類似していた）。これら
の小さいが陽性のコロニーから、ヘルパープラスミドを
有しない、かつ最初のＧＸ７８２０よりも強いプロティ
ンＧについての陽性を示す２つの安定な変異体を単離し
た。ＧＸ７８２３と命名した一方の菌株は、プラスミド
ｐＧＸ４５３０内の挿入体の２キロ塩基対（ｋｂｐ）断
片が欠失したプラスミド（ｐＧＸ４５３３）を有してい
る。Ｅ 、 ｃｏｌｉ株ＧＸ７８２３はアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号
５３４６１が付されている。ＧＸ７Ｂ２２と命名した他
方の菌株は、ＧＸ７８２３株が有するプラスミド内の欠
失部の一端に非常に近接した部位で最初の挿入体内に３
ｋｂｐＤＮＡ挿人体を獲得したプラスミドを有している
。プロティンＧ遺伝子は、ｐＧＸ４５３３上における１
、 ９ ｋｂｐ断片のストレプトコッカスＤＮＡ挿入
体上に位置されていた。 プロティンＧの生産レベルを改善するためには、クロー
ン化プロティンＧ遺伝子を種々の発現ベクターに挿入す
ればよい。発現ベクターは、遺伝子の発現、すなわちＤ
ＮＡからｍＲＮＡへの転写、その後のｍＲＮＡからその
遺伝子がコードしているタンパク質への翻訳に必須であ
るＤＮＡ配列を含む「調節領域」を含有している。プロ
ティンＧ遺伝子はその天然の発現シグナルを含有してい
てもよく、あるいはそれらのシグナルを除去し、クロー
ン化プロティンＧ遺伝子の構造部（すなわちタンパク質
をコードしている遺伝子部分）を、選択した宿主生物内
でプロティンＧ遺伝子を指令することのできる、発現ベ
クターに含有された池の発現シグナルと常法によって機
能的に融合することもできる。たとえば、宿主微生物が
Ｅ、ｃｏｌｉの場合、発現ベクターはｔｒｐプロモータ
ー／オペレーター、ｌａｃプロモーター／オペレーター
バクテリオファージラムダＰ、プロモーター／オペレ
ーターなどのような既知の調節領域を含有していればよ
い。 本発明の１つの態様では、発現ベクターはさらに、宿主
微生物の染色体領域とホモローガスなりＮＡ配列を含有
する。このような構築により、ベクターは宿主の染色体
の相同性領域において線形の組込み（ｌｉｎｅａｒ ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が可能となる。ベクター不含の
細胞に指向したネガティブ選択であるため、この方法の
利点はプロティンＧ配列が宿主から喪失される可能性が
低いことである。 このような組換え発現ベクターで形質転換した細菌細胞
においては、プロティンＧは高レベルで生産され得る。 さらに、所望の細胞密度に誘導することができる（遺伝
子発現し得る）、または組換え細菌細胞の培養物内の細
胞密度が所望のレベルに達成するまで遺伝子発現を可逆
的に抑制することのできるプロモーター／オペレーター
系を使用することにより、細胞内のプロティンＧ生産性
を制御することができる。したがって、ヘテロローガス
なタンパク質が産生されることによる、細胞増殖に対す
る潜在的にネガティブな効果を回避することができる。 クローン化プロティンＧまたはプロティンＧ変異体遺伝
子を含有する形質転換細胞を、プロティンＧまたはプロ
ティンＧ変異体がその細胞から産生されるようなタンパ
ク質産生の条件下で趙養する。大規模な発酵法などの培
養条件は、当業界周知である。細胞は、細胞増殖を促す
炭素、窒素および必須ミネラルの同化性供給源を含有す
る適当な栄養培地中、ｐＨおよび温度の生理学的に適合
し得る条件下で培養すればよい。タンパク質産生の培養
条件は、宿主細胞を形質転換するのに使用するベクター
のタイプに応じて変動する。たとえば、ある種の発現ベ
クターは、プロティンＧまたはプロティンＧ変異体の産
生を招来する遺伝子発現を開始するために、特定の温度
における細胞増殖、または細胞増殖培地に特定の化学物
質を添加することを必要とする調節領域を含んでいる。 このように、本明細書で使用している「タンパク質の産
生条件」なる用語は、ただ１つの培養条件のみを意味す
るものではない。 米国特許第４．６１７．２６６号（１９８６）に記載さ
れている、プロティンＡをコードする遺伝子に従来から
適用されている方法によって、クローン化遺伝子をＢ、
ズブチリスに移入すると都合よい。この方法によれば、
プロティンＧはＢ、ズブチリス内で合成することができ
る。 修飾形態にあるクローン化プロティンＧ遺伝子を有する
Ｅ、ｃｏｌｉ株から産生されたタンパク質のｒｇＧ結合
活性を試験することにより、プロティンＧの機能的に活
性な部分は、反復構造に配置されていた。好ましい態様
として、本発明はさらに、プロティンＧ（プロティンＧ
変異体）の１つまたはそれ以上のＩｇ結合部分をコード
しているクローン化遺伝子、およびそれにより産生され
た、免疫グロブリン結合性を有するタンパク質を提供す
るものである。プロティンＧの活性結合部位をコードし
ている遺伝子の同定および単離の詳細は、以下の実施例
３に記載する。プロティンＧ分子１つ当たりそれぞれ２
個および３個の活性部位をコートしている２つの遺伝子
のＤＮＡ配列、およびそれによってコードされているア
ミノ酸配列は第８図および第９図に示している。この情
報に基づけば、１つまたはそれ以上のプロティンＧ結合
部位を含有するプロティンＧ変異体を調製することがで
きる。特定のアミノ酸配列内に１つから２０個、または
それ以上の活性部位をコードしている合成遺伝子は、既
知の合成方法によって構築することができ、それにより
得られた物質の結合効率、結合能、および特異性はより
高められる。好ましいプロティンＧ変異体は１から１０
個の活性結合部位を含有するものであり、より好ましい
ものは１つの活性結合部位を含有するものである。 本発明は、免疫グロブリン結合性を有するプロティンＧ
変Ｎ体であって、アミノ酸の欠失もしくは置換、または
そのアミノ末端もしくはカルボキン末端において付加ア
ミノ酸を有する変異体をも発明の範囲内に包含するもの
である。 プロティンＧの好ましい形態は、活性部位（Ｂｌおよび
Ｂ２）の上流および下流のコード化配列が欠失されてい
る遺１云子によってフードされたものである。このよう
なコード化配列の欠失に関しては、以下の実施例に詳細
に記載する。 本発明を実施する上で使用することができる、Ｂ１およ
びＢ２ドメインを含有する部分をフードするプロティン
Ｇ変異体（タイプｌ）をコードしている、好ましい態様
としてのクローン化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を有し
ている またはその同義性変異体。 上記の配列から発現されるプロティンＧ変異体タイプＩ
は、以下のアミノ酸配列を有する：１２１１ＪＴマＯＤ
＾ＴＩＣＴＦＴＶＩヒＭＶ Ｉ ｅＶＰＶＡａＬＩ’１
ｋｃｌＪ。 本発明を実施する上で使用可能な、Ｂ１およびＢ２結合
性ドメインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ２）
をコードしている第２のクローン化遺伝子は、以下のＤ
ＮＡ配列を有している：遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を
有しているまたはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第２のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ２は、以下のアミノ
酸配列を有している： またはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第３のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ３は、以下のアミノ
酸配列を有している： 本発明を実施する上で使用可能な、ＢｌおよびＢ２結合
性ドメインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ３）
をコードしている第３のクローン化本発明を実施する上
で使用可能な、Ｂ［およびＢ２ドメインを含有するプロ
ティンＧ変異体（タイプ４）をコードしている第４のク
ローン化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を有している・ま
たはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第４のクローン・化遺伝子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプ４は、以下のアミ
ノ酸配列（これは３ｏアミノ酸の分泌配列を含有してい
ない）を有している・本発明を実施する上で使用可能な
、ただ１つの結合性ドメインＢ２（単一８２結合性ドメ
イン）を含有するプロティンＧ変異体（タイプ５）をコ
ードまたはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第６のクローン化遺（云子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプ６は、以下のアミ
ノ酸配列を有している 本発明を実施する上で使用可能な、単一のＢ２結合性ド
メインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ７）をコ
ードしている第７のりａ−ン化遺伝している第５のクロ
ーン化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を有している またはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第５のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ５は、以下のアミノ
酸配列を有している。 本発明を実施する上で使用可能な、Ｂ１、Ｂｌ／Ｂ２雑
種ドメイン、およびＢ２ドメインを含有するプロティン
Ｇ変異体（タイプ６）をコードしている第６のクローン
化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を宵している： 子は、以下のＤＮＡ配列を有している：またはその同義
性変異体。 上記の配列を有するこの第７のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ７は、以下のアミノ
酸配列を有している： 本発明を実施する上で使用可能な、Ｂ１およびＢ２結合
性ドメインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ８）
をコードしている第８のクローン化遺１云子は、以下の
ＤＮＡ配列を有しているまたはその同義性変異体。 上記０配列を冑するこの第８のクローン化遺（云子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプ８は、以下のアミ
ノ酸配列を有している 本発明を実施する上で使用可能な、ＢｌおよびＢ２結合
性ドメインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ９）
をコードしている第９のクローン化遺伝子は、以下のＤ
ＮＡ配列を有している：またはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第１０のクローン化遺伝子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプＩＯは、以下のア
ミノ酸配列を有している：本発明を実施する上で使用可
能な、Ｂｌ’／Ｂ２雑種結合性ドメインを含有するプロ
ティンＧ変異体（タイプ１１）をコードしている第１１
のクローン化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を有している またはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第１１のクローン化遺伝子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプｌまたはその同義
性変異体。 上記の配列を有するこの第９のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ９は、以下のアミノ
酸配列を有している。 本発明を実施する上で使用可能な、単一Ｂｌ結合性ドメ
インを含有するプロティンＧ変異体（タイプ１０）をコ
ードしている第１ｏのクローン化遺伝子は、以下のＤ
Ｎ Ａ配列を有している・Ｌは、以下のアミノ酸配列を
有している：「同義性変異体」なる用語は、塩基の置換
を有するが、同一のタンパク質をフードしているＤＮＡ
配列を意味する。 当業者であれば理解されようが、本発明のプロティンＧ
変異体遺伝子は、類似の方法によって、さらに欠失およ
び構造的修飾を行うことができる。 さらには、種々の上流欠失および種々の下流欠失をイン
ビトロで種々組み合わせて組換え、新規な遺伝子構造体
を調製することができ−ることも理解されよう。このよ
うな組換えは、Ｓ ｍａ Ｉ （ａｐｒプロモーターの
上流）、Ｋｐｎ［（ドメインＢ１をコードしている配列
の直ぐ上流）、およびＨｉｎｄｌＩ［（コード化配列の
下流）という唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用
し、Ｓｍａ［−Ｋｐｎｌ断片およびＫ ｐｎ Ｉ −Ｈ
１ｎｄＩ［Ｉ断片を適合させることによって、容易に行
うことができる。このようにして構築した新規な組合わ
せ物は、Ｂドメインをコードしている配列を保持し、し
たがってＩｇＧ結合活性を保持する。さらに、ａｐｒプ
ロモーターおよびシグナルのコード化配列を含有するプ
ラスミドのＳｍａｌ−ＢａｍＨＩ断片は、Ｂ、ズブチリ
ス内における外来性タンパク質の合成および分泌をプロ
モートする活性を示す他のプロモーターおよびシグナル
のコード化配列を含をした類似の断片と置換できること
は、理解されよう。 従来知られている適当なタンパク質の精製方法を使用し
、宿主細胞からプロティンＧ変異体を回収し、精製する
ことができる。要すれば、既知の化学的、物理的および
／または酵素学的手段を用いて細胞を細胞溶解してもよ
い。次ぎに、スジヨークイスト（Ｓｊｏｑｕ ｉｓ ｔ
）らの米国特許第３．８５０．７９８号（１９７４）
に記載されているような固定化免疫グロブリンへの吸着
、イオン交換またはゲルクロマトグラフィー、沈降（た
とえば、硫安を用いた沈降）、透析、濾過、またはこれ
らを組み合わせた方法などの標準的な方法によって、そ
の細胞溶解物からプロティンＧ変異体を精製することが
できる。 「固相支持体」なる用語は、本発明のプロティンＧ変異
体を共有結合または吸着のいずれかによって固定化する
ことのできる支持体を意味する。本発明のプロティンＧ
の固定化に使用することのできる固相支持体には、遊離
形態またはエステル化形態のヒドロキシ基を含有するポ
リマー、たとえば硝酸セルロース、ジアザセルロース、
酢酸セルロース、プロピオン酸セルロースなどのセルロ
ースエステルを包含スるセルロース、アガロース、なら
びにポリアクリルアミドおよびアクリルアミドなどのア
クリルアミドポリマーおよびコポリマー、マイクロタイ
タープレート、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン
、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、寒天、澱粉
、または本発明のプロティンＧ変異体を、固定化できる
活性化剤の残基と化学的に結合した疎水性、微孔性、皮
の無いポリアミド膜からなる広い表面を有する化学的に
活性な膜、があるが、これらに限定されない。デーゲン
（Ｄｅｇｅｎ）らの米国特許第４．６９３．９８５号（
１９８７）を参照のこと。 本発明のプロティンＧ変異体は、当業界既知のタンパク
質固定化法によって固相支持体に固定化することができ
る。たとえば、プロティンＧ変異体は、共有結合または
吸着によって固相に被覆または結合することができる。 固相支持体にタンパク質を固定化する方法は、たとえば
米国特許第３゜６５２、７６１号、第３．８７９．２６
２号、第３．９８６．２１７号、および第４．６９３．
９８５号に教示されている。本出願では、実施例１５お
よび１７を参照のこと。好ましくは、プロティンＧ変異
体の固定化は、トレシル活性化または臭化シアン活性化
アガロースに行う。 プロティンＧ変異体が１つまたはそれ以上のシスティン
残基を含む場合、好ましいプロティンＧ変異体の固定化
法は、それをマレイミド活性化アガロース支持体に結合
させることである。この支持体は、１級アミノ基を含有
するよう修飾したアガロース（具体的にはＡＨ−セファ
ロース、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏ、）
）をスルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）ブチレートで処理することによって調製するこ
とができる。次いで、得られた活性化ゲルをプロティン
Ｇ変異体で処理し、固定化プロティンＧ変異体の生成物
を得る。 実施例１７に記載しているように、マレイミド活性化セ
ファロース誘導体を使用してシスティンを含有する変異
体を固定化すると、予想外に高いレベルのタンパク質の
固定化、および予想外に高いＬ／４／Ｌ／（７） Ｉ
ｇ結合ｆＬ 特にマウスモノクローナル抗体との高いレ
ベルの結合性が達成される。プロティンＧ変異体がシス
ティン残基を含有しない場合は、トレシル活性化アガロ
ースに結合させてプロティンＧ変異体を固定化するのが
好ましい方法である。 本発明の固定化プロティンＧ変異体は、ＩｇＧまたはそ
のフラグメントを分離または結合するのに使用すること
ができる。意外にも、本発明者は、特定の固定化プロテ
ィンＧ変異体が予想外の結合性プロフィルを示すことを
発見した。詳細には、固定化した単一ドメインの変異体
が、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｔフラグメントよりもＩ
ｇＧおよびＦｃフラグメントとより良好に結合すること
を発見したのである。したがって、これらの固定化変異
体は、ＩｇＧおよびＦｃフラグメントをＦａｂおよびＦ
（ａｂ’ ）、フラグメントから分離するのに有用で
ある。 本発明の固定化単一ドメインプロティンＧ変異体は、Ｆ
ａｂまたはＦ （ａｂ’ ）、フラグメントをＩｇＧお
よびＦｃフラグメントから分離するための方法てあって
、 （ａ）Ｆｃフラグメント、ＩｇＧおよび少なくとも１つ
のＦａｂまたはＦ （ａｂ’ ）２フラグメントを含有
する試料を、固相支持体に固定化した単一ドメインのプ
ロティンＧ変異体と接触させ、 （ｂ）工程（ａ）で得られた固相支持体をｐ Ｈ５から
８の緩衝液で洗浄し、溶出液にＦａｂおよびＦ（ａｂｏ
）、フラグメントを溶出させると共に、Ｆｃフラグメン
トおよび［ｇＧが結合した固相支持体を得る ことを特徴とする方法に使用することができる。 ｐＨ５から８の緩衝液の例としては、リン酸、トリス、
ホウ酸および重炭酸緩衝液が挙げられる、これらに限定
されない。 次ぎに、固定化プロティンＧ変異体に結合したＦｃフラ
グメントおよびＩｇＧを回収するには、（Ｃ）工程（ｂ
）で得られた固相支持体をｐ Ｈ３。 ５から２．４の緩衝液で洗浄し、Ｆｅフラグメントおよ
びＩｇＧを溶出させればよい。 ｐＨ３，５から２．４の緩衝液の例としては、酢酸、ク
エン酸およびグリシンが挙げられるが、これらに限定さ
れない。 より詳細には、アガロースに固定化したタイプ５のプロ
ティンＧ変異体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）。 フラグメントとは殆どまたはまったく親和性を示さない
が、ＩｇＧおよびＦｃフラグメントとは堅く、かつ可逆
的に結合する。ｐＨ約５から８ではＩｇＧおよびＦｅフ
ラグメントは結合するが、ＦａｂおよびＦ （ａｂ’
）２フラグメントは結合しない。ＩｇＧおよびＦｃフラ
グメントは、ｐＨを約３４５から２４に低下させれば溶
出させることができる。 本発明者らはさらに、アガロースに固定化された単一ド
メインプロティンＧ変異体タイプ１０がＩｇＧと不可逆
的に結合しくこのＩｇＧは、溶出液のｐＨを低下させて
も溶出することができない）、ＦａｂおよびＦ （ａｂ
’ ）２とはｐＨ５から８で少ない量で結合し、そして
Ｆｃとは結合することを発見した。たとえば、ｐ Ｈ５
から８においてＦｅが結合されるが、ｐＨを３．５から
２．４に低下させれば、溶出させることができる。 固定化タイプ１０変異体は個々の標的分子に特異性を示
すＴｇＧと不可逆的に結合するため、それに固定化され
たタイプｌＯ変異体は、アフィニティークロマトグラフ
ィーに使用することができる。この態様における本発明
では、標的分子に特異的なＩｇＧに結合するその標的分
子は、得られた固相をｐＨ３，５から２．４の緩衝液で
洗浄することにより、ＩｇＧを溶出することなく、選択
的に溶出することができる。 この目的において本発明は、標的分子のアフィニティー
クロマトグラフィーの方法であって、（ａ）標的分子に
特異的なＩｇＧを含有する第１の試料を、プロティンＧ
変異体タイプ１０が固定化された固相支持体と接触させ
、その固相支持体に不可逆的に結合された［ｇＧを得、 （ｂ）標的分子を含有する第２の試料を、工程（ａ）に
より得られた、標的分子に特異的なＩｇＧが固定化され
た固体支持体と接触させ、 （Ｃ）工程（ｂ）により得られた同相支持体をｐＨ５か
ら８の緩衝液で洗浄し、結合しなかった溶質を溶出させ
、 （ｄ）工程（Ｃ）により得られた固相支持体をｐＨ３，
５から２４４の緩衝液で洗浄し、標的分子を溶出させる ことを特徴とする方法を提供する。 標的分子に特異的なＩｇＧ抗体は、当業者に既知の方法
によって得ることができる。抗体の調製方法については
、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）らのＮａｔｕｒｅ ２５６
：４９５（１９７５）を参照のこと。 本発明者らはさらに、アガロースに固定化された雑種単
一ドメインプロティンＧタイプ１１変異体がｐＨ５から
８において中等度でＩｇＧに結合し、ｐＨ６から８でＦ
ａｂにそれよりも少ない量で結合し、そしてＦｃに結合
することを発見した。 たとえば、ｐ ＋（５から８では、Ｆｃフラグメントを
結合できるが、ｐＨを３．５から２，４に低下すれば溶
出させることかできる。 本発明者らは、固相支持体に固定化されたプロティンＧ
変異体タイプ１１を使用することによって、ＩｇＧの種
々のサブクラス、たとえばＩｇＧ１．ＩｇＧ２、ｌ ｇ
ｃ ３およびＩｇＧ４を分画てき、単離することができ
ることを予期せず発見した。 この態様において、本発明は、ＩｇＧの種々のサブクラ
スを分画するための方法であって、（ａ）少な（とも２
つのサブクラスのＩｇＧを含有する試料を、固相支持体
に固定化されたプロティンＧ変異体タイプ１１を含有す
るカラムの上部に適用し、 （ｂ）ｐＨ８から２．４の緩衝液の連続または不連続グ
ラジェントでカラムを溶出し、 （ｃ）ＩｇＧサブクラスを含有する溶出液の分画を採取
する、 ことを特徴とする方法を提供するものである。 種々のＩｇＧサブクラスは、当業界既知の方法によって
溶出液中に検出することができる。たとえば、ＩｇＧサ
ブクラスは、市販されているアイソタイピング・キット
しアメルシャン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を使用し、また
はＥＬＩＳＡもしくは免疫拡散検定法によって検出する
ことができる。 ｐＨ８から２４４のグラジェントに使用できる緩衝液と
しては、たとえば酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グ
リシンおよびホウ酸緩衝液があるが、これらに限定され
ない。 本発明者らはまた、システィンを含有するプロティンＧ
変異体をマレイミド活性化アガロースに固定化させた場
合、ＩｇＧおよびそのフラグメントに対する高い結合能
が達成されることを発見した。この目的に照らし、本発
明は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）、フラグメントをＩｇ
ＧおよびＦｅフラグメントから分離するための方法であ
って、 （ａ）Ｆｃフラグメント、ＩｇＧおよび少なくとも１つ
のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）ｔフラグメントを含有する
試料を、マレイミド活性化アガロースに固定化した少な
くとも１つのシスティン残基を含有するプロティンＧ変
異体と接触させ、 （ｂ）工程（ａ）で得られたアガロースをｐＨ５から８
の緩衝液で洗浄し、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）、フラグ
メントを溶出させると共に、ＦｃフラグメントおよびＩ
ｇＧか結合したアガロースを得ることを特徴とする方法
を提供するものである。 本発明は一般に、ＩｇＧを、天然で付随する不純物から
分離するための方法をも提供するものである。この目的
について、本発明は、天然で付随する不純物からＩｇＧ
を分離するための方法であって、 （ａ）ＩｇＧを含有するの試料を、固相支持体に固定化
されたプロティンＧ変異体と接触させ、（ｂ）工程（ａ
）により得られた固相支持体をｐＨ５から８の緩衝液で
洗浄し、不純物を溶出させ、固相支持体に結合したＩｇ
Ｇを得、 （Ｃ）工程（ｂ）により得られた固相支持体をｐＨ３４
５から２．４の緩衝液で洗浄し、天然で付随する不純物
を含まない溶出液中にＩｇＧを得ることを特徴とする方
法を提供する。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、これ
らは本発明の範囲の限定を意図するものと解してはなら
ない。 実施例１ ストレプトコッカス・ランスフィールドグループＧを病
院から人手し、臨床単離物から１１個の独立した菌株単
離体を誘導した。各菌株を以下のコロニー免疫検定法に
したがい、ＴｇＧとの結合能について試験した。ニトロ
セルロースのシートおよび（上層）酢酸セルロースのシ
ートを重層したし一ブロス寒天平板（免疫検定用平板）
上で画線培養した。得られた平板を３７℃でインキコベ
ートし、細菌コロニーを酢酸セルロースシート上で視覚
化した。 次いで、ニトロセルロースシートを平板かう取り出し、
以下のような免疫化学的方法でＩｇＧ結合タンパク質を
その平板上に検出した：そのシートをまずウシ血清アル
ブミン（トリス−食塩水中３０％ｗ／ｖ； Ｏ，ＯＩＭ
トリスートＩＣ（ｌ ｐ）（８，０および０．１５
Ｍ ＮａＣＱを含有）で処理し、以後の工程においてニ
トロセルロースとの抗体の非特異的結合性を最小に抑え
るため、ニトロセルロース部位を阻害した。次いで、そ
のシートを２３６Ｃで１時間、正常ウサギ血清（３，０
％ｗ／ｖウシ血清アルブミンを含有するトリス−食塩水
で１：１０００に希釈）で処理し、次いでペルオキシダ
ーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（同様に希釈）、最後に４
クロロ−１−ナフトール（０，６ＩＩＩｇ／ａＱ）およ
び過酸化水素（０，２容量メタノールを含有するトリス
食塩水中、０．０６％ｗ／ｖ）で処理し、インキュベー
ト工程間にはシートをトリス−食塩水で洗浄した。ニト
ロセルロースシート上の青色スポットは、ＩｇＧ結合性
タンパク質が存在することを示すものであり、青い領域
は、ＩｇＧ結合性タンパク質を産生ずる細菌コロニーに
相当する。 ９個の菌株が陽性、すなわち程度は異なるがＩｇＧと結
合していることが見いだされた。次ぎに、以下の血液凝
集試験を行うことで、幾つかの菌株を［ｇＧ３との結合
能について試験した。アドラ−（Ａｄｌｅｒ）およびア
ドラーのＭｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏ１、 ７０ ：４５
５−４６６（１９８０）にだいたい記載されているよう
にして、ヒツジ赤血球細胞（ＲＢＣ）［カペル・ラボラ
トリーズ（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
、マルベルン、ペンシルバニア］を免疫グロブリンで被
覆した。ＲＢＣをリン酸緩衝化食塩水（Ｐ Ｂ Ｓ、
８．４ ｇ／ Ｑ ＮａＣＱ、 １．１ ｇ／＆ Ｎａ
２ＨＰＯ，、および０．２７ ｇ／ＱＮａＨ，ＰＯ４を
含有）で洗浄し、３７°Ｃで１５分間、ＰＢＳ中゛中度
濃度２Ｒｇ／ｗｅのタンニン酸溶液で処理した。細胞を
遠心して回収し、（ａ）全ヒト免疫グロブリンＧ（シグ
マ・ケミカル、カンパニー、ルイス、Ｍｏ、から人手）
もしくは（ｂ）ＩｇＧ３骨髄腫タンパク質のいずれかを
濃度０．２ｍｇ／ｘＱで含有するＰＢＳ、または（ｃ）
ＰＢＳのみに再懸濁した。３７６Ｃで３０分間インキュ
ベートした後、ＲＢＣを遠心によって回収し、ＰＢＳで
洗浄した。血球凝集検定のため、多つェル皿の円錐形ウ
ェル中で、被覆化ＲＢＣの１％懸濁液５０μｅを、ＰＢ
Ｓで連続希釈した試験細胞エキス５０μＱと混合した。 凝集しないＲＢＣはウェルの底に沈澱して小さなペレッ
トとなり、他方、凝集したＲＢＣはより分散した沈澱物
をウェルの壁に形成する。 ストレプトコッカス株の陽性グループＧはそれぞれ、プ
ロティンＧ産生株から抽出した非分画化ＩｇＧで被覆し
た赤血球と同様の効率で、ＩｇＧ３彼覆化赤血球を凝集
した。これとは対照的に、プロティンＡを産生ずる菌株
であるストレプトコッカス・アウレウス コーワン■の
細胞は、非分画ｒｇＧで被覆された赤面法細胞を凝集し
たが、ＩｇＧ３被覆細胞に対しては予想通り全く活性を
示さなかった。ＰＢＳのみでインキュベートした赤血球
、すなわち非被覆赤血球細胞は凝集されなかった。 次いで、ストレプトコッカス単離体の培養物から得た上
清分画および細胞エキスについて、同一の凝集試験を行
い、単離体がＩｇＧ結合活性について異なる局在性を有
しているのを見いだした。 活性が結合細胞に優勢であることを示している菌株があ
れば、培養上清に優勢な活性を示す菌株もあり、またそ
の中間を示す菌株もあった。ＩｇＧ結合活性の異なる局
在化を示す３つの菌株をＤＮＡの供給源として選択し、
プロティンＧ遺伝子をクローニングした。 各菌株から得た細胞を、２０ｍＭ Ｄ、Ｌ−）レオニン
を含有するトッドーホイット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ
）ブロス［フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉ
ｓｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リッチモンド、Ｖ
ａ］２５０ｉ（！中で培養した。培養４時間後、グリシ
ンを培養培地中５％ｗ／ｖの終濃度で加えた。細胞密度
について、６００ ｎｒａにおける吸光度が約０．５か
ら１．０になった、培養５時間後に、遠心によって細胞
を採取した。細胞ベレットをＰＢＳで洗浄し、次いで液
体窒素で凍結して一７０°Ｃで保存した。解凍後、得ら
れた細胞を、５ｘｇ／ｉ＆ ミュータノリシン（ｍｕｔ
ａｎｏｌｙｓ ｉｎ） ［シグマ・ケミカル、カンパニ
ーから市販されている］２００μρを加えておいた０、
５Ｍショ糖を含有するＳ７培地〔バサンザ（Ｖａｓａｎ
ｔｈａ）およびフリース（Ｆｒｅｅｓｅ）のＪ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １４４：１１１９−１１２５（＋
９８０）］で洗浄した後、それと同じ培地ＩＣＪｙｔり
に再懸濁した。３７°Ｃで４５分間インキュベートした
後、得られたプロトプラストを遠心によってペレ・ノド
化し、次いで１００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、ｌ
５０ｍＭ ＮａＣ（！、および０，５μｇ／ｍＱプロテ
イナーゼＫを含有する溶液中に再懸濁することにより浸
透圧的に細胞溶解した。３７°Ｃで５５分間インキュベ
ートした後、α−トルエンスルホニル・フルオライド（
これはフェニルメタンスルホニル・フルオライドまたは
ＰＭＳ Ｆとも呼ばれ、たとえばシグマ・ケミカル、カ
ンパニーから市販されている）を終濃度２ｍＭで加え、
得られた混合物を７０°Ｃで１５分間インキュベートし
、プロテイナーゼＫを不活化した。細胞溶解物ヲクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４１）で３回抽出し
、さらに除タンパクし、その水相に等量のイソプロパツ
ールを加え、ＤＮＡを沈澱させた。 沈澱したＤＮＡをスプールの巻き上げにより採取し、次
いで７０％エタノールで洗浄して減圧下に乾燥した。 得られたＤＮＡペレット（各３菌株から得た）を０、Ｏ
ＩＭ トリス−ＨＣ（ｌ ｐＨ７，８／１ｍＭ ＥＤ
ＴＡｌｏ、０５Ｍ ＮａＣＱ溶液０．５ｉ＆にそれぞれ
懸濁した。１００ｍＭ トリス−ＨＣρｐ Ｈ７。 ８．１５０ｍＭ ＮａＣｌ２および１０ｍＭ ＭｇＣＱ
２を含有する緩衝液１００μσ中に懸濁したＤＮＡ２５
μＱに２単位のＭｂｏｒを加えることにより、この単離
した染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＭｂｏｌ（
市販品）で部分消化した。得られた反応混合物を３７°
Ｃで１３分間インキュベートした後、７０°Ｃで１０分
間インキュベートした。消化ＤＮＡを０．８％アガロー
スゲルの電気泳動に１５時間かけた（０．３５ボルト／
Ｃ１１）。得られたゲルから約４から９キロ塩基対（ｋ
ｂｐ）の長さのＤＮＡ断片を含有するゲル切片を切除し
、ＤＮＡを回収するため粉砕した。等容量の水−飽和フ
ェノールをその粉砕ゲルに加え、得られた混合物を一７
０’Ｃで１時間凍結した。事前に解凍することなく、エ
ッベンドルフ遠心器により、混合物を室温で１５分間遠
心し、得られた水相を等量のフェノールで２回、等量の
フエ／−ル／クロロホルム／イソアミアルコール（２５
’：２４：１）で１回抽出した。２．５容量の９５％エ
タノール、および担体としてグリコーゲン３０μｇを加
えることにより、ＤＮＡを水相から沈澱させた。 染色体ＤＮＡ断片を挿入するクローニングベクターは、
第１図に示すプラスミドｐＧＸ１０６６であった。この
プラスミドは、クローン化するＤＮＡ断片の挿入に有用
である近接した制限エンドヌクレアーゼ認識部位群のバ
ンク（銀行）を含有している。このクローニング部位の
バンクは２つの転写ターミネータ−によって画されてい
る。プラスミドｐＧＸ１０６６により形質転換された菌
株ＧＸ１１７０を構成するＥ、ｃｏｌｉ菌株ＧＸ１１８
６は、Ｎｏ、３９９５５の下にＡＴＣＣに寄託されテイ
ル。ブ５スミ）’ｐＧＸ１０６６ＤＮＡ３μｇを制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨ［（市販品を入手し、取り扱
い説明書にしたがって使用した）で部分消化した。次い
で、消化したプラスミドＤＮＡを１単位の子ウシ腸内ア
ルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイムから
入手し、取り扱い説明書にしたがって使用した）で３７
℃、３０分間処理した。得られた反応混合物をフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４
：１）で抽出した後、０．１容量２Ｍ酢酸ナトリウム、
１０ｍＭＥＤＴＡおよび２，５容量９５％エタノール、
および担体としてグリコーゲン１０μｇを加えてＤＮＡ
を沈澱させた。次いで、ｐＧＸ１０６６ベクターＤＮＡ
（ＢａｎＨＩ消化およびリン酸化処理した）０．５μｇ
を、上記のように調製したＭｂｏ［部分消化したストレ
プトフッカス染色体ＤＮＡ０．２μｇに連結した。反応
混合物１０μＣにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（市販品を得
、取り扱い説明書にしたがって使用した）Ｉ単位を含有
させ、４℃で２０時間インキュベートした。 Ｅ、ｃｏｌｉ Ｓ Ｋ ２２６７ （Ｅ、ｃｏｌｉジェ
ネティソク・ストック・センター、エール大学＋ ニュ
ー・ヘブン、Ｃｏｎｎ、から入手したＦ”−ｇａｌ ｔ
ｈｉ Ｔ １ ’ ｈｓｄＲ４ｃｎｄＡ ５ｂｃＢ １
５）細胞を標準的な塩化カルシウム処理によって形質転
換に対して受容性（コンピーテント）にし、得られた感
応細胞０．２５＋ａを、標準的な形質転換法にしたかっ
たライゲーションｌ昆合物２０μσと混合した［レダー
ベルブら（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ）
のＪ、 ｌ３ａｃｔｅｒｉｏ１．１１９：１０７２−＋
０７４（１９７４）］。次いで、得られた細胞を遠心に
よってペレｙト化し、Ｌブロス０．３ｍρに再懸濁した
。次いで細胞０．１；ｎＱを、ニトロセルロースのシー
トおよび（上層）酢酸セルロースのシートを重層してお
いた１００μｇ／ｘＱアンピシリンを含有する３つのし
ブロス寒天平板（免疫検定用平板）のそれぞれにプレー
トした。この平板を３７００でインキュベートし、細菌
コロニーを酢酸セルロースノート上に視覚化した。 次いで、その平板からニトロセルロースシートを取り出
し、シート上においてＩｇＧ結合性タンパク質を既述の
免疫化学的方法によって検出した。 まず、そのシートをウシ血清アルブミン（トリス食塩水
中３４０％Ｗ／Ｖ）で処理してニトロセルロース部位ヲ
阻害し、以後の工程においてニトロセルロースとの抗体
の非特異的結合性を最小に抑えた。 次いで、そのシートを２３°Ｃで１時間、３．０％Ｗ／
Ｖつ／血清アルブミンを含有するトリス−食塩水でｌ：
１０００に希釈した正常ウサギ面請で処理し、次いでペ
ルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（同様に希釈）
で処理し、最後に４−クロロ−１−ナフトール（０，６
＋ｇ／ｚのおよび過酸化水素（０，２容量メタノールを
含有するトリス−食塩水中、０．０６％Ｗ／Ｖ）で処理
し、インキュベート工程間にシートをトリス−食塩水で
洗浄した。 １つの陽性コロニーを同定し、ストレブトフ。 カス株ＧＸ７８０９（クローニング用にＤＮＡを単離し
た３つのストレプトコッカス株のうちの１つ）から誘導
された形質転換体を含有する平板上に置いた。陽性コロ
ニーを免疫検定用平板（上記のように１００μｇ／ｘσ
アンピシリンを含有）上に画線培養し、精製された形質
転換株を得た。ニトロセルロースシートを上記のように
加工したが、数百の陰性コロニーの中に数個の陽性コロ
ニーしか見いだせなかった。最初の形質転換体は明らか
に不安定であるので、再画線培養を繰り返すと、数百の
陰性コロニーの中に１個の陽性コロニーしか見いたせな
かった。もう１同温画線培養すると、殆ど陽性を示すコ
ロニーを含有する平板が得られた。明らかに最初の陽性
形質転換体よりも安定である誘導体の陽性コロニーの１
つを単離し、それをＥ 、 ｃｏｌ ｉ株ＧＸ７８２０
と命名した。Ｅ、ｃｏｌｉＧＸ７８２０の試料は、メリ
ーランド、ロックビレにあるアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ５３４６０の
下で寄託されている。 最初の陽性コロニーに加え、コロニーと相関することが
できない、小さいが強い陽性のスポットが幾つか観察さ
れた。これらのスボ／トは、再度の画線培養では陽性の
後代菌を産しなかった。 標準的な方法を使用し、Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ ７８２０
からプラスミドＤＮＡを単離し、得られたプラスミドＤ
ＮＡを制限分析、次いでゲル電気泳動によって分析した
。菌株は、２つのタイプのプラスミドを含有しているこ
とが判明した。一方のプラスミド（ｐＧＸ１０６６Ｘと
命名）は明らかにｐＧＸ１０６６クローニングベクター
と同サイズであり、他方（ｐＧＸ４５３０と命名）は１
ｌｋｂｐの挿入体を含有するｐＧＸ１０６６であること
は明らかであった。次いで、受容性Ｅ、ｃｏｌｉ ５Ｋ
２２６７細胞を、ＧＸ７Ｂ２０から単離したプラスミド
混合物で再度形質転換し、得られた形質転換体を１００
μｇ／ｙｘＱ、アンピシリンを含有する免疫検定用平板
上で選択した。２つのタイプの陽性形質転換体が得られ
た。大部分は小さいが強い陽性コロニーであり、その殆
どは増殖することができなかった。少数のコロニーは、
より正常なサイズであり、かつより容易に増殖し得るも
のである点からＧＸ７８２０に類似していた。これらの
結果の原因を究明するため、下記のように、受容性Ｅ、
ｃｏｌｉ ５Ｋ２２６７細胞をさらにゲル精製プラスミ
ドで形質転換した： 形質転換Ａ：ｐＧＸ４５３０単独 形質転換Ｂ：ｐＧＸ１０６６Ｘ単独 形質転換Ｃ：ｐＧＸ４．５３０およびｐｃｘｉ。 ６６Ｘの混合物 得られた結果は以下のようであった： 形質転換Ａ：小さいが強い陽性コロニーであり、その殆
どは増殖することができなかった。 形質転換Ｂ：形質転換体は得られなかった。 形質転換Ｃ：小さいが強い陽性の非増殖性コロニー（形
質転換Ａに類似）であり、その陽性コロニーの約２０％
はＧＸ７８２０に類似し、すなわち正常サイズの増殖可
能なものであった。 幾つかの小さ・いが強い陽性コロニーを上記の再形質転
換平板から選択しくすなわち、ｐｃｘ １０６６Ｘおよ
びｐＧＸ４５３０の混合物を含有するＧＸ７８２０株か
ら得た非分画化プラスミド調製物で形質転換したＥ、ｃ
ｏｌｉである形質転換体）、再画線培養して増殖可能な
菌株を単離した。２つの菌株からプラスミドＤＮＡを単
離し、両者共にｐＧＸ１０６６Ｘヘルパープラスミドを
喪失していたことが見いだされた。１つの菌株（Ｅ、ｃ
ｏｌｉＧＸ７８２３と命名）は、ｐＧＸ４５３０内で見
いだされる１ｌｋｂｐ挿入体内で約２ ｋｂ＋）の欠失
か起こっているプラスミドｐ Ｇ Ｘ ４５３３を含有
していた。Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ ７８２３の試料は、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番
号ＡＴＣＣ５３４６１の下で寄託されている。第２の菌
株（Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ ７８２２と命名）は、ｐｃＸ
４５３３内の欠失部の一端に非常に近接した部位で、最
初の１ｌｋｂｐ挿入体内に挿入された未同定の付加的な
３ ｋｂｐＤ Ｎ Ａを獲得しているプラスミドｐＧＸ
４５３２を含有していた。 Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ７８２３（ｐＧＸ４５３３を含有）
およびＥ、ｃｏｌｉ ＧＸ７８２０（ｐＧＸ４５３０を
含有〉菌株を、アンピンリンを加えたし一グロス中で培
養した。遠心によって細胞をペレット化し、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ ｐＨ８，０および２ｍＭＰＭＳＦを含有する
緩衝液中、０．５ｘｇ／Ｊ リゾチームの存在下に３７
°Ｃで３０分間インキュベートすることによって細胞溶
解した。スチニーダー（Ｓｔｕｄｉｅｒ）のＪ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏ１、 ７９ ：２３７−２４８（１９７３
）に記載されている緩衝液中、１．００℃に５分間加熱
することにより、電気泳動用の抽出物試料を調製し、そ
の試料をスチューブ−（前掲）に記載のように１２．５
％アクリルアミド−３ＤＳゲルの電気泳動にかけ、タン
パク質を分離した。標準的な電気泳動法（ウェスターン
・ブロッティング）により、タンパク質バンドをゲルか
らニトロセルロース紙に移シた。次いで、そのニトロセ
ルロースをＢＳＡ、正常ウサギ直情、ペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗ウサギ■ｇＧ、および過酸化水素を加えた４
−クロロ−１−ナフトールと共に（連続して）インキュ
ベートした（上記の免疫化学的方法におけるニトロセル
ロース処置と同じ方法である）。両菌株は、約９０．０
００から約３０，０００の分子量に相当する移動度を示
し、５７．０００に主要バンドを有する同一の■ｇＧ結
合性タンパク質のバンドを示すことが見いだされた。 プラスミドｐＧＸ４５３３を制限分析に供したので、そ
の部分的な制限地図を第２図に示す。 本線は、ベクター（ｐＧＸ １０６６）の配列を表し、
斜線部は、そのプラスミドベクターに挿入された、プロ
ティンＧ遺伝子を含有するＤＮＡを表している。 挿入体内の１．９ ｋｐｂ Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片をｐＧ
Ｘ１０６６にサブクローンし、得られた組換えプラスミ
ド（ｐＧＸ４５４７）をＥ、ｃｏｌｉに導入した。この
形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ ７８４１ ）から産
生されるタンパク質のウェスターン・プロッティングを
既述のように行うと、主要な５７，０００のバンドを含
む同一のＩｇＧ結合性タンパク質のバンドが示された。 得られた形質転換体もまた既述のように血球凝集検定に
より分析した。この形質転換体の抽出物は、ＩｇＧ３（
ヒト骨髄腫タンパク質）および非分画化ヒトＩｇＧで被
覆した、タンニン酸処理したヒツジ赤血球を凝集したが
、非被覆化赤血球は凝集しなかった。プロティンＡ産生
Ｅ、ｃｏｌｉ株由来の抽出物は、非分画化ＩｇＧで被覆
した赤血球を凝集したが、ｒｇＧ３被覆化赤面球または
非被覆化赤血球を凝集しなかった。プロティンＡまたは
プロティンＧのいずれも産生じない対照Ｅ 、 ｃｏｌ
ｉ株は、いずれの赤血球試料も凝集しなかった。 これらの結果は、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＧＸ７８４１、ＧＸ７
８２０、およびＧＸ７８２３が、プロティンＧの特徴で
ある性質を有するＩｇＧ結合性タンパク質を産生ずるこ
とを証明するものである。 実施例２ ＤＮＡおよびアミノ酸配列のデータ クローン化遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。この配列を
そのＤＮＡ配列によって特定されるアミノ酸配列と共に
第３図に示す。第３図のデータは、既述のような、クロ
ーン化プロティンＧ遺伝子を含有するＩ 、 ９ ｋｐ
ｂ Ｈ１ｎｄｆｆｌ断片の全体についてのらのである。 遺伝子コードの同義性から、本遺伝子のヌクレオチド配
列は実質的に変わり得ることは理解できるであろう。た
とえば、この遺伝子の一部または全部は化学的に合成し
、第３図に示した配列とは異なるヌクレオチド配列を有
するＤＮＡを得たとしても、適切なコドン−アミノ酸の
帰属が行われている限り、アミノ酸配列は保持されるで
あろう。 プロティンＧ遺伝子のヌクレオチド配列およびそのタン
パク質のアミノ酸配列は確立されているか、本発明の遺
伝子は特定のヌクレオチド配列に限定されるものでなく
、遺伝子コードによって許容されるすべてのその変異体
を包含するものである。 本発明のプロティンＧタンパク質は第３図に示した正確
なアミノ酸配列を有するタンパク質に限定されない。第
３図に示した配列中に欠失または置換を包含するタンパ
ク質、またはタンパク質のアミノもしくはカルボキシ末
端に付加的なアミノ酸を有するタンパク質も、既述のよ
うな、そのタンパク質がプロティンＧの所望のＩｇＧ結
合性を保持している限り、本発明の範囲内に包含される
。 これらのアミノ酸配列の変動は、たとえば遺伝子の化学
的合成、または既知のインビトロ突然変異法によって行
うことができる。 第３図には以下の略語を使用している：Ａ＝デオキシア
デニル、 Ｔ＝チミジル Ｇ＝ニブオキシグアニル Ｃ−デオキシシトシル ＧＬＹ＝グリシン、 ＣＹＳ＝システィン、Ａ
ＬＡ＝アラニン、 ＭＥＴ＝メチオニン、Ｖ Ａ
Ｌ ＝バリン、 ＡＳＰ＝アスパラギン酸
、ＬＥＵ＝ロイシン、 ＧＬＵ＝グルタミン酸
、ＩＬＥ＝インロイシン、 ＬＹＳ＝リジン、５Ｅ
Ｒ−セリン、 ＡＲＧ＝アルギニン、Ｔ Ｈ
Ｒ＝スレオニン、 ＨｒＳ＝ヒスチジン、ＰＨＥ
−フヱニルアラニン、ＰＲＯ＝７’ロリンＴＹＲ＝チロ
シン、 ＧＬＮ＝グルタミン、ＴＲＰ＝Ｉ−リブ
トファン、 ＡＳＮ＝アスパラギン実施例３ ＩｇＧ結合活性に関与しているプロティンＧ分子部分の
同定 欠失した修飾形態のクローン化プロティンＧ遺伝子を有
するＥ、ｃｏｌｉ株から産生されるタンパク質のＩｇＧ
結合活性を試験すると、その活性はアミノ酸残基２２８
から３５２の間の反ＩＮ配列に位置していた（第８図）
。Ｂ１およびＢ２領域のアミノ酸配列は、それぞれ５５
個の対応部分のうち４９個が同一であった。 プロティンＧの全コード化配列を含有する、第２図に示
した１ 、 ９ ｋｐｂ Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ断片をまず始
めにストレプトコッカスＧＸ７８０９から単離し、それ
をバクテリオファージＭ１３＋＋ｐ９にサブクローンし
た［メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ）、 Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ。 １、１０１：２０（１９８３）］。ブラフ、 ミＦｐＧ
Ｘ４５４７をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ［で消化
し、同様に２本鎖の謹製型のバクテリオファージＭ１３
ｍｐ９ＤＮＡも消化した。これも、ＨｉｎｄＩ［Ｉでの
消化の間、子ウシアルカリホスファターゼ（１５μＣ中
２単位）で処理し、本ベクターの再環状化を防止した。 フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた後、得ら
れた２つの消化ＤＮＡ調製物を混合し、ライゲーション
条件下でＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。連
結したＤＮＡＸＩＩ製物をＥ 、 ｃｏｌ ｉ株ＧＸ
１２１０（Ｆ’ ｔｒａＤ ３６ ｐｒｏＡ＋Ｂ ＋
ｌａｃ Ｉ ｑ／ｄｅｌｔａ−１ａｃＺ Ｍ ｌ ５
ｄｅｌｔａ−（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｓｕｐＥ ｔｈｉ ｚ
ｉｇ：：Ｔｎｌ ＯｈｓｄＲ２）にトランスフェクトし
た。プラーク由来のトランスフェクト細胞をコロニー免
疫検定法によってプロティンＧの産生に関してスクリー
ニングした。陽性の検定応答を示した１つをｍＧＸ４５
４７と命名し、それは第５図に示した部分的制限地図を
有することが判明した。 ｍＧＸ４５４７に感染されたＥ、ｃｏｌｉから単離した
２本鎖の複製型のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｓｔｌ
で消化した。フェノールで抽出し、エタノール沈殿した
後、得られた消化ＤＮＡを、希釈溶液（１ｙ（ｌ当たり
消化ＤＮＡ約５μｇ）中、ライゲーション条件下で、Ｄ
Ｎ Ａ ＩＪガーゼと共にインキユベートした。次い
で、再連結ＤＮＡ調製物をＥ、ｃｏｌｉ ＧＸ １２１
０にトランスフェクトした。 １Ｖ製型ＤＮＡを、幾つかのプラーク由来の感染細胞か
ら調製し、コロニー免疫検定法によってＩｇＧ結合性タ
ンパク質の産生について、その同一の感染細胞を検定し
た。制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌを用いたＲＦ
ＤＮＡの分析によって、幾つかのクローンは第５図およ
び第６図に示した２１０ｂｐおよび４１５ｂｐ Ｐｓｔ
ｌ断片を共に喪失していることが見いだされた。これら
のクローンは、コロニー免疫検定で示されるように、活
性なＩｇＧ結合性タンパク質をなんら産生じなかった。 これらのクローンから産生された切頭（トランケート）
タンパク質はＢ１構造の部分しか含有しておらず、Ｂ１
に近接するアミノ酸配列をすべて欠いていると予想され
よう。 上記のトランスフェクションにより得られたクローンの
１つは、コロニー免疫検定によって陽性の結果を示した
。このクローン由来のＲＦ ＤＮＡの制限分析により
、ファージＤＮＡは４１５ｂｐＰｓＬＩ断片を欠いてい
るが、２１０ｂｐ断片は保持していることが判明した。 さらに、臭化エチジウム染色のアガロースゲル電気泳動
上における２１０ｂｐＰｓｔｌ断片の相対的強度は、そ
のＤＮＡが２ｉｏｂｐ断片の２つのコピーを有している
ことを示唆するものであった。ＤＮＡの配列決定により
、このファージＤＮＡ（ｍＧＸ７８８０）の構造は第６
図に示されているものであることを確認した。このファ
ージＤＮＡ上にあるプロティンＧ遺伝子によってコード
されているタンパク質は、Ｂ構造の２つの完全なコピー
、すなわち無傷のＢ１配列、次にＢ１およびＢ２のキメ
ラを含有していると予想されよう。Ｂ２に近接するすべ
てのアミノ酸配列は欠失していよう。この構造は、２１
ｏｂｐ断片を規定するＰｓｔ１部位群が、Ｂ反復構造内
のホモローガスな配列に相当する位置にあり、かつその
タンパク質の解読フレームと同一の関係にある、という
事実に基づくものである。ポリアクリルアミドゲル電気
泳動分析は、このＤＮＡを有するＥ、ｃｏｌｉ ｈ＜
Ｉ ｇＧ結合活性を有するほぼ正確な大きさのタンパク
質を産生じていることを示した［ファネストック（Ｆａ
ｈｎｅｓｔｏｃｋ）らのＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｆ、
１６７：８７０−８８０（１９８６）］。 これらの結果は、Ｂ反復構造の存在性がプロティンＧの
ＩｇＧ結合活性に必要十分な条件であることを示唆して
いる。したがって、８反（Ｍ構造は分子内におけるＩｇ
Ｇ結合活性の中心点であると結論された。 実施例４ バシラス・ズブチリス内におけるプロティンＧまず始め
に、転写ターミネータ−に類似した配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドをｍＧＸ４５４７に挿入した。そのオ
リゴヌクレオチドの配列は： ５’ −ｐＴＣＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡ
ＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＴ−３’であった。これは
自己相補性であり、２本鎖になった場合、エンドヌクレ
アーゼ５ａｌｔによって得られるものと同一の配列を有
する１本鎖末端が得られる。それをｍＧＸ４５４７に挿
入するため、ファージＤＮＡをエンドヌクレアーゼ５ａ
ｌｌで消化し、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿
し、次いでその合成オリゴヌクレオチド（７０°Ｃに加
熱して変性し、２３°Ｃにゆっくりと冷却しておいた）
およびＤＮＡリガーゼと共にライゲーション条件下にイ
ンキユベートした。連結ＤＮＡをＥ 、 ｃｏｌ １Ｇ
Ｘ１２１０にトランスフェクトし、得られたクローンを
５ａｌ１部位の喪失および合成オリゴヌクレオチドに存
在する認識配列であるＥｃｏＲＶ部位の表出についてス
クリーニングした。所望の構造体を合する１つのクロー
ンをｍＧＸ７８７２と命名した。 次いで、Ｂ２反復配列に近接する配列をｍＧＸ７８７２
から切除した。これは、オリゴヌクレオチド特異的イン
ビトロ突然変異によって行った。 以下の配列： ５°−ｐＣＧＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＧＧＡＡＣＣ
ＴＣＴＧＴＡＡＣＣ−３゜を有するオリゴヌクレオチド
を合成した。この配列は、半分はＢ２配列に直接隣接す
るｍＧＸ４５４７内の配列と相捕的であり、他の半分は
プロティンＧのＣ末端をコードしている配列近くの配列
と＋Ｈ１山Ω勺である。このオリゴヌクレオチドを２本
漬ＲＦ ＤＮＡのインビトロ合成のためのプライマー
として、またｍＧＸ４５４７ＤＮＡを鋳型として常法通
りに使用した。このＤ Ｎ ＡをＥ、ｃｏｌｉＧＸＩ２
１０にトランスフェクトした。プラークか産生ずるファ
ージＤＮＡが所望の欠失配列に相捕的である放射活性オ
リゴヌクレオチド：５’−（３２Ｐ）ＡＧＣＧＡＣＣＧ
ＧＡＡＣＣＴＣ−３’とハイブリタイズするその能力に
ついて、プラークをその場てスクリーニングした。所望
の構造体を有する１つのクローンを同定し、ｍＧＸ７８
７７と命名した。その構造をＤＮＡ配列分析によって確
認した。欠失部は第３図に示したヌクレオチド１６５１
−１８９６の配列を包含している。 プロティンＧコード化配列を発現および分泌ベクターに
融合させるため、オリゴヌクレオチド特異的インビトロ
突然変異によってＢａｍ８１部位をｍＧＸ７８７７の配
列内に作成した。配列５’ −ｐＧＧＴＡＴＣＴＴＣＧ
ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＡ
ＡＴＡＣＣＧ−３’を有するプライマーオリゴヌクレオ
チドを使用し、インビトロにおけるｍＧＸ７８７７の１
本鎖ＤＮＡ（Ｄ２本鎖ＤＮＡへの変換を促進した。この
オリゴヌクレオチドは、プロティンＧをコードしている
ｍＧＸ７８７７内の配列と相捕的であるが、成熟プロテ
ィンＧをコードしている配列の始部付近に挿入された、
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識配列を構成する６
個の付加的なヌクレオチド、Ｇ Ｇ Ａ Ｔ ＣＣを含
有している（分泌シグナル配列を除去した産物）。この
得られた２本鎖ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ ＧＸ ｌ ２１
０にトランスフェクトした。 プラーク由来の感染細胞から回収したＲＦ ＤＮＡを
、ＢａｍＨ１部位の存在に関してスクリーニングした。 所望の構造体を有するものをｍＧＸ８４Ｏ２と命名した
。 ズブチリシン（ａｐｒ）をコードしているバシラス・ア
ミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）遺伝子から誘導したプロ
モーターおよび分泌シグナル配列を含有する分泌ベクタ
ーは、バサンタ（Ｖａｓａｎｔｈａ）およびトンプソン
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）のＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ１、
１６５：８３７−８４２（１９８４）、および１９８４
年６月８日出願の米国特許出願第６１８．９０２号およ
び１９８５年３月２９日出願のその一部継続出願第７１
７．８００号に記載されている。このベクターｐＧＸ２
１３４は、分泌シグナル配列をコードしている配列の末
端付近にＢａｍＨ１部位を含有しており、そこにヘテロ
ローガスな遺伝子を融合することができ、それによりＢ
、ズブチリスでの発現およびその細胞からのタンパク質
産物の分泌を促進することができる。 プロティンＧ遺伝子のコード化配列をこのベクターに融
合スルタメ、ｐＧＸ２１３４ＤＮＡをエンドヌクレアー
ゼＢａｍＨ［およびＰｖｕｌｌで消化した。 ｍＧＸ８４０２由来のＲＦ ＤＮＡをエンドヌクレアー
ゼＢａｍＨＩおよびＳ ｍａ Ｉで消化した。フェノー
ルで抽出し、エタノールで沈殿させた後、得られた消化
ＤＮＡ調製物を混合し、ＤＮＡＩＪガーゼと共にライゲ
ーション条件下でインキュベートし、次いで得られた連
結ＤＮＡをＢ、ズブチリスＧＸ８００ Ｂ （ａｐｒ欠
失、ｎｐｒ欠失、５ｐｏＯＡ６７７）プロトプラストに
常法により導入した。クロランフェニコールの耐性によ
り形質転換体を選択し、コロニー免疫検定法によってプ
ロティンＧの産生についてスクリーニングした。陽性の
形質転換体を同定し、ＧＸ８４０８（ｐＧＸ４５８２）
と命名した。 制限分析により、このプラスミドｐＧＸ４５８２は、第
７図に示している構造を有することを確認した。これは
、プロティンＧフード化配列、およびｍＧＸ８４０２内
のコード化配列に近接した小さなりａｍＨＩ−３ｍａｌ
断片を有するｍＧＸ８４０２のＢａｍＨＩ断片をｐＧＸ
２１３４のＢａｍＨＩおよびＰｖｕｎ部位間に挿入する
ことによっておそらく形成されたものであろう。 ＧＸ８．４０８株は、プロティンＧのＩｇＧ結合活性を
有するタンパク質を産生ずることが示された。Ｂ２配列
に近接した配列が欠失しているこの菌株は、プロティン
Ｇ様物質の分泌が高められていた。適当な培地［ファ不
ストックおよびフィッシャーのＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
１、 １６５ニア９６−８０４（ｔ９８４）］中で増殖
させた後、培養上清および細胞関連分画を回収し、ドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
分析にかけた。電気泳動の分離後、タンパク質バンドを
ニトロセルロースに移し、実施例１に記載のように免疫
化学的に染色した。■ｇｃ結合活性を有する物質が、培
養上清および細胞関連物質の両者に見いだされた。 実施例５ グ 実施例１記載のごとく、ＧＸ７８０５と称するストレプ
トコッカスのグル−７’Ｇ臨床単離体から、染色体ＤＮ
Ａを単離した。一個のＤＮＡ試料を制限エンドヌクレア
ーゼＨｉｎｄ■で消化し、標準的な条件下で１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。この目的に）ｌｉｎｄ■が
有用であることは、ｐＧＸ４５３３の制限分析により（
実施例１、第２図）、Ｈｉｎｄ［１１部位が、大腸菌の
マルチコピー（多重コピー）プラスミド上で、大きい断
片を達成することを妨げる働きをすることが明らかな、
下流側の隣接配列とプロティンＧ遺伝子とを分離する部
位であるとの決定から示唆された。電気泳動後、サザー
ンら（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１、
、９８ ： ５０３（１９７５））の記載に従い、ＤＮ
Ａ断片をニトロセルロースに移した。 ストレプトコッカスＧＸ７８０５株から単離された第２
図記載の１ 、９ ｋｂｐＨ１ｎｄＩＩＩ断片からなる
放射活性なプローブとのハイブリザイゼーンヨンによっ
てプロティンＧをコードする配列を含んだ約２．４ｋｂ
ｐのバンドの位置が決定された。この１ 、９ ｋｂｐ
断片プローブは実施例１記載のごとく、アガロースゲル
電気泳動にかけてゲルから溶離して精製した後、基本的
にはリグビー（Ｒｉｇｂｙ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１
、。 １１３：２３７（１９７７）の方法に従い、ニックトラ
ンスレーションにより３２Ｐで放射活性に標識された。 実質上、ウオールら［Ｗａｈｌ。 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
Ｓ Ａ、 ７６ ： ３６８３−３６８７（１９７９
）］の方法に従い、ハイブリザイゼーションを行った。 ハイブリザイゼーションし、洗浄してハイプリザイスし
なかったプローブを除去した後、２．４ｋｂｐに相当す
る放射活性なバンドの位置をオートラジオグラフィーで
位置決定した。 より多量の、同じＧＸ７８０５染色体ＤＮ入試料（６μ
のをエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、１％
アガロースゲル電気泳動にかけて断片を分離した（０．
３５ボルト／ｃｍで１６時間）。臭化エチジウムで染色
した後、長さ２−３ ｋｂｐのバンドを含有するゲルの
一部（比較標準としてエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ
Ｉでｌ肖化したバクテリオファージラムダＤＮＡを用い
て位置決定）を切りとり、ＤＮＡの回収のために砕いた
。実施例１記載のごとく、フェノール抽出の後、ＤＮＡ
を回収した。 プラスミドベクターｐＧＸ １０６６ ＤＮＡ（１μｇ
）をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ［で消化した。反応混
合物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル、２５：２４：１）で抽出した後、０．１容量の４Ｍ
ＬｉＣρ、１０ｍＭＥＤＴＡ、 グリコーゲン担体２
０μ７、および２．５容量の９５％エタノールを加えて
ＤＮＡを沈澱させた。／ｉ４化ベクターＤＮＡ０．４μ
９、回収したＧＸ７８０５．ＤＮＡのＨｉｎｄ１ｍ断片
（染色体ＤＮＡ６μ９からの回収率９０％の物質）およ
びＴ４ＤＮΔリカーゼ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
ＢｉｏＬｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ、、
Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、 ＣＴ）を、該供給業者の指示に
従い、２０ｕ（ｌ中、１５°Ｃで１６時間イン−１−ユ
ベートした。 実施例１記載のごとく、結合（ライゲーショ７）Ｄ Ｎ
Ａ ｌ ５ ｔｔ（ＩＴ：大腸ａｓ Ｋ ２２６７ｍ
胞を形質転換し、形質転換細胞をコロニーイムノアッセ
イプレート上で培養し、実施例１記載のごとく、免疫グ
ロブリンと結合したタンパク質の生産について分析した
。陽性コロニーを同定した。この形質転換体から単離し
たプラスミドＤＮＡは２．４ｋｂｐのＤＮＡ挿入体を有
するｐＧＸ１０６６であることが分かった。この挿入体
を構成するエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ［断片をバ
クテリオファージＭ１３ｍｐ９ベクターにサブクローニ
ングした。２．４ｋｂｐＨｉｎｄ［ＩＩ断片のＤＮＡ配
列を決定し、第９図に示した。 実施例６ Ｂ、サブチリスによる分泌に好ましい形の好ましい形の
プロティンＧは、活性なりリピート（実施例３）の上流
および下流をコードする配列を欠失した遺伝子によりコ
ードされている。プロティンＧの免疫グロブリン結合活
性を有するそのようなタンパク質は、タンパク分解に対
する安定性が改善されている。 Ａ、上流配列の欠失 上流配列を欠失するために、プラスミドｐＧＸ４５８２
（実施例４）をまず、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎｌ
に対スるユニーク（唯一の）開裂部位（第１１図参照）
を有するように修飾した。いずれもＡリピートの上流に
ある２カ所を切断するエンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで
ｐＧＸ４５８２ＤＮＡを消化した。フェノール抽出、エ
タノール沈澱の後、線状プラスミド断片を、エンドヌク
レアーゼＫｐｎＩの認識部位を担持する、配列： ５°−Ｐ−ＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣΔＧ で示される、５゛りん酸化自己相補的オリゴヌクレオチ
ドの存在下、ライゲーション条件下に、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで処理し、再環化した。結合ＤＮＡを用いて大腸菌
５Ｋ２２６７を形質転換し、単一のＰ ｖｕ １１部位
を獲得した所望の構造を持つプラスミドを含有するアン
ピシリン耐性形質転換体を単離した。このプラスミドを
ｐＧＸ４５９０と命名した。 次いで、ｐＧＸ４５９０に担持された、修飾プロティン
Ｇ遺伝子をバクテリオファージＭ１３ベクターに移した
。ｐＧＸ４５９０のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳ ｍ
ａ Ｉおよび５ａｌｌで消化し、全プロティンＧをコー
ドする遺伝子を含有する断片を切り出した。バタテリオ
ファージＭ１３ｍｐ８の２本漬ＲＦ型ＤＮＡもＳ ｍａ
Ｉおよび５ａｉｌで消化し、両消化ＤＮＡ標品をフェ
ノール抽出し、エタノール沈澱に付した。２個の標品を
混合しライゲーション条件下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一
緒にインキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌Ｇ
Ｘ１２１０を形質転換（トランスフェクション）し、適
当な大きさの挿入断片の存在に関してクローンをスクリ
ーニングした。所望の断片を含有するクローンを同定し
ｍＧＸ８４３４と命名した。 次いでオリゴヌクレオチド−指向突然変異誘発法を用い
、ｍＧＸ８４３４に担持されているプロティンＧ暗号配
列に第２のＫｐｎ１部位を形成した。配列； ５’ −ＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＧＧＴＡＡＴＧＧＧＴＡ
ＣＣＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＧを
有し、ｍＧＸ８４３４においてドメインＢｌをフードす
る配列に隣接した配列と相捕的であるがエンドヌクレア
ーゼＫｐｎｌの認識部位を含んだ６ヌクレオチドの挿入
体をも担持しているオリゴヌクレオチドを合成した。フ
ァージｌ１ｌＧＸ８４３４から単離された１本鎖ＤＮＡ
を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとし
て標準的手法でインビトロにて２本漬ＲＦ ＤＮＡを
合成した。 このＤＮＡを用いて大腸１ＧＸ１２１０をトランスフェ
クションし、第２ＫｐｎＩ部位の存在に関してクローン
をスクリーニングした。所望の構造を有するクローンを
同定しｍＧＸ８４４１と命名した。 ｍＧＸ８４４１ＤＮＡは上記のごとく、２個のＫｐｎ１
ｐ位の間の配列を欠失すると第１部位の上流と第２部位
の下流の配列がインフレーム（枠内）融合するよう作成
された２カ所のＫｐｎｒｐ位を含有する。この欠失は、
ｍＧＸ８４４１のＲＦ型ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＫ
ｐｎｌで消化し、消化Ｄ Ｎ Ａをフェノール抽出し、
エタノール沈澱させた後、希釈溶液中、ライゲーション
条件下にＴ４ＤＮＡＩ、Ｉガーゼで大きいＲＦ断片を再
度環化することにより達成された。結合ＤＮＡを用いて
大腸菌ＧＸ１２１０を形質転換し、小さいＫｐｎｌｐ片
が失われたクローンをスクリーニングした。所望の構造
を有するクローンをｍＧＸ８４４２と命名した。ｍＧＸ
８４４２の欠失部位の構造をＤＮＡ配列決定で確認した
。それは、プロティンＧのＮ末端からアミノ酸残基Ａ１
ａ３Ｂまでの、ｐＧＸ４５８２によってコードされてい
るタンパク質と同一と思われるタンパク質をコードして
おり、Ｋｐ口口語認識配列よりコードされているＧｌｙ
ＴｙｒＰｒ。 が続き、さらにｐＧＸ４５８２の配列ＬｕｅＰｒｏＬｙ
ｓＴｈｒＡｓｐ（ドメインＢ１に先行する）およびｐｃ
ｘ４５８２の残りの配列が続く。 ｍＧＸ８４２２の暗号配列をＢ、サブチリス内で樹立す
るためのベクターとしてプラスミドｐＧＸ４３７０を用
いた。このプラスミドはＢ、アミロリフファシェンスの
サブチリシンをコードする遺伝子から導かれた配列をも
含有することを除き、ブライアン（Ｐ 、 ｂｒｙａｎ
）らが米国特許出願８２８゜５４５（１９８６年２月１
２日出願）に記載したプラスミドｐＧＸ４３１２と同様
のプラスミドである。これらの配列はプロモーター、翻
訳開始配列、および分泌シグナル配列をコードしており
、これにＢａｍ）（Ｉ認識配列が続く。これらは実施例
４記載）ｐｃｘ ２１３４から導かれた。このベクター
はまた、Ｂ、サブチリスおよび大腸菌内で活性な複製起
点、並びに両微生物内で選択されるマーカー（Ｂ、サブ
チリス内ではカナマイシン耐性、大腸菌内ではアンピシ
リン耐性）をも担持している。 プラスミドｐＧＸ４３７０ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、フェノール
抽出およびエタノール沈澱を行った。同様に、ｍＧＸ８
４２２ＲＦ ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨｒ
およびＨｉｎｄｌ［Ｉで消化し、フェノール抽出および
エタノール沈澱に付した。消化ＤＮＡ標品を混合しライ
ゲーション条件下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインフレ
−ムした。結合ＤＮＡ・を用いて大腸菌５Ｋ２２６７を
形質転換し、所望の構造を有するアンピシリン耐性形質
転換体を制限分析で確認し、ｐＧＸ４５９５と命名した
。次いでプラスミドｐＧＸ４５９５ＤＮＡを用いてＢ、
サブチリスＧＸ８００８のプロトプラストを形質転換し
た。ＧＸ８４４６と命名したカナマイシン耐性形質転換
体は、実施例４にその概要を示したと同様の分析により
、プロティンＧの免疫グロブリン結合活性を持ったタン
パク質を産生ずることが示され、このタンパク質は細胞
外培地と細胞溶解画分の両方に検出された。 Ｂ、下流配列の欠失 下流配列が様々に欠失した構築物の出発物質はドメイン
Ｂ２をコードする配列の次にエンドヌクレアーゼＸｈｏ
ｒのための部位がオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発
法によって挿入されたｍＧＸ７８７２（実施例４）誘導
体である（第１２図参照）。 この目的のために、ｍＧＸ７８７２のプロティンＧをコ
ードする配列の、ドメインＢ２をコードする配列の直ぐ
下流の配列と相捕的であるがＸｈｏ１部位を作成する３
ヌクレオチド挿入を含有している式・ ５’ −ＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＴＣＡＣＣ丁ＣＧＡＧ
ＧＡＡＣＣ丁ＣＴＧＴＡＡＣＣで示されるオリゴヌクレ
オチドを合成した。ｍＧＸ７８７２から単離された１本
鎖ＤＮＡを鋳型とし、このオリゴヌクレオチドをプライ
マーとし、標準的手法で２本漬ＲＦ ＤＮＡをインビ
トロで合成し、大腸菌ＧＸ１２１０のトランスフェクシ
ョンに用いた。一個のＸｈｏ１部位の存在に関してクロ
ーンをスクリーニングし、所望の構造のものをｍＧＸ７
８７５と命名した。ｍＧＸ７８７５内の変更配列をＤＮ
Ａ配列決定によって確認し、所望のものであることを確
認した。 次いでＫｐｎ１部位を、上記のｍＧＸ８４３４への第２
ＫｐｎＩの挿入位置に類似した、ｍＧＸ７８７５のドメ
インＢ１をコードする配列に接近した位置に挿入した。 上記（ｍＧＸ８４４１の構築）と同じオリゴヌクレオチ
ド、および同様の方法を用いた。所望の構造を有するク
ロンーンをｍＧＸ８４１１７と命名した。 次いでｍＧＸ８４４７から得た下流配列を用いてｐＧＸ
４５９５内の配列と置換した。この目的のためにｍＧＸ
８４４７のＲＦ ＤＮＡとｐＧＸ４５９５とをエンド
ヌクレアーゼＫｐｎｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで別々に消
化し、フェノール抽出、エタノール沈澱に付した。消化
ＤＮＡ標品を混合し、ライゲーション条件下、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼの存在下でインキュベートした。結合ＤＮＡ
を用いて大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し所望の構造の
プラスミドを担持するアンピシリン耐性形質転換体を制
限分析で同定し、ｐＧＸ４５９６と命名した。このプラ
スミドはプロティンＧの活性部分をコードしていること
と下流配列（Ｂｌの前のＫｐｎ１部位からＣ−末端をコ
ードする配列の後方のＨｉｎｄｌ１１部位まで）がｍＧ
Ｘ８４４７から導かれたものである点を除きｐＧＸ４５
９５と同様である。 次いでプラスミドｐＧＸ４５９６を出発物質として下流
配列をも含む様々な欠失を行った。まず、ｐＧＸ４５９
５ＤＮＡをドメインＢ２をコートする配列の下流末端に
近い、上記オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発で作成
された部位を切断するエンドヌクレアーゼＸｈｏ１、お
よび暗号配列の下流末端を切断するＨｉｎｄＦＩＩで切
断した。この消化ＤＮＡを０．７％アガロースゲルによ
る分取用電気泳動分画にかけ、生成した大きい２断片を
ゲルから溶出させ回収した。配列： で示される構造を有する２本鎖アダプターを構築した。 ｐＧＸ４５６９から導かれた、精製した大きいＸｈｏ
Ｉ −Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片を、その１本鎖末端が大断片
の１本鎖末端と相補的なこのアダプターの存在下で再環
化した。これは、該断片とアダプターとをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下、ライゲーション条件下でインキュベー
トすることにより達成された。結合ＤＮＡを用いて大腸
菌５Ｋ２２６７を形質転換し、所望の構造のプラスミド
を担持するアンビンリン耐性形質転換体を、アタプター
に含まれているＰｖｕ［［部位の存在に関してスクリー
ニングすることにより同定した。このプラスミドをｐＧ
Ｘ４５９７と命名した。これは配列：、 、 ［Ｂ２
］ＭｅｔＶａｌＴｈｒＧｌｕＶａｌＰｒｏＡｒｇＳｅｒ
ＣｙｓＥＮＤ、 、 、ＡＴＧＧＴＴＡＣＡＧＡＧ
ＧＴＴＣＣＴＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＴ、
。 て示される構造を持った先端を切除されたプロティンＧ
遺伝子を担持している。この構築における合成アダプタ
ーに担持されているＣ−末端Ｃｙｓ残基はこの遺伝子に
よってコードされているプロティンＧ配列においてユニ
ークである。当業者ならば、そのようなユニークな残基
は、タンパク質を固体マトリックスに固定化する、ある
いは種々の化学機能性物質や他のタンパク質を付加する
ことを意図した、化学反応を行う上で好適な部位を提供
するものであることを認識するであろう。 第２の下流欠失はリピートＣ５から下流の配列を含む。 この構築には、第８図記載のＤＮＡ配列の１８１５位の
残基位置の配列から導かれたエンドヌクレアーゼＸｍｎ
１部位を利用した。プラスミドｐＧＸ４５９６は合計４
個のＸｍｎ１部位を有する。プロティンＧ暗号配列中の
所望の部位のみか開裂された分子を得るために、ｐＧＸ
４５９６ＤＮＡ（５μｇＺＩＩ１１）を臭化エチジウム
（４０μｇ／ｍＮ）の存在下、３７°Ｃで６０分間、Ｘ
ｍｎ１部分消化（１００ユニツト／ｌｌＬｉりシた。こ
れらの条件下、消化は主として１カ所の切断に限定され
、４部位のいずれかが切断されて生成した線状分子の混
合物が得うした。？ｉｌ化ＤＮＡをフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２５： ２４ ： ｌ
）”？？油抽出、エタノール沈澱し、臭化エチジウムと
ＸｍｎＩ酵素を除去した。線状ＤＮＡ混合物を次いでＨ
ｉｎｄＩＩＩ消化した。プロティンＧ暗号配列中ではＨ
ｉｎｄＩ１１部位とＸｍｎ１とが、他のいずれのＸｍｎ
１部位よりも接近した位置にある。従って、Ｘｍｎ１線
状混合物のＨｉｎｄＩＩＩ？ｍ化によって生成した最大
のＨｉｎｄｌ−Ｘｍｎｌ断片がｐＧＸ４５９６分子から
導かれた、プロティンＧ暗号配列のＸｍｎ１部位のみが
切断された断片である。分取用０．７％アガースケル電
気泳動分画でこの断片を精製した。移動度が最も低いバ
ンドをゲルから切り出して溶出し、回収した。 配列 ５ Ｐ−ＴＧＣＣＧＧＣＴＡ ＡＣＧＧＣＣＧＡＴＴＣＧＡ−５°Ｐ で示される構造を有する２本鎖アダプターを構築した。 このオリゴヌクレオチドの１本鎖末端はｐＧＸ４５９６
断片のＨｉｎｄｌＩＩ開裂で生成した１本鎖末端と相捕
的である。精製断片を、このアダプターの存在下、ライ
ゲーション条件下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュ
ベートすることにより再環化した。結合ＤＮＡを用いて
大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し、所望の構造のプラス
ミドを担持するアンビンリン耐性形質転換体を、制限分
析で同定した。このプラスミドをｐＧＸ４５９９と命名
した。これは配列： で示される構造を持った先端を切除されたプロティンＧ
遺伝子を担持している。プラスミドｐＧＸ、４５９７お
よびｐＧＸ４５９９を別々ニ用い、ＢサブチリスＧＸ８
００８のプロトプラストを形質転換した。カナマイシン
耐性形質転換体を選択しＧＸ８４５５（ｐＧＸ４５９７
）およびＧＸ８４５７（ｐＧＸ４５９９）と命名した。 いずれの株もプロティンＧの免疫グロブリン結合活性を
有し、いずれの場合もこのタンパク質が細胞外培地と細
胞溶解画分の両方に見いだされた。 実施例７ 種々の欠失を有するプロティンＧ遺伝子の誘導体を大腸
菌内での発現に好都合な調節可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂ
ｌｅ）プロモーター系と融合させた。用いたプロモータ
ーはマツケ二一ら（Ｍｅ Ｋ ｅｎｎｙ）が米国特許出
願５３４９８２（１９８３年９月２３日出願）に記載し
た、インビトロ法で構築されたハイブリットバクテリオ
ファージラムダプロモーター（ＯＬ／Ｐ Ｒ）である。 このプロモーターはプラスミドｐＧＸ２６０６に担持さ
れており、以下のように配置されたＢａｍＨ１部位を有
するファージラムダＣｒＯ遺伝子の翻訳開始部位を含有
している：Ｂａｍ１ｌ １ 、 ＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧ印ＧＴ
ＧＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＣＡＴＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧ
ＧＴＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣ，、。 ３５ −１０
翻訳ファージｍＧＸ７８７７（実施例４）から
導かれた°゛ＢＢドメイグードする配列を大腸菌発現ベ
クターｐＧＸ２６０６と融合させるためにインビトロの
オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発法でＢａｍ８１部
位をｍＧＸ７８７７ＤＮＡの適正なフレーム（枠）内に
挿入した（第１４図参照）。以下のオリゴヌクレオチド
を合成した： ５’ −ｐＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧ
ＧＡＴＣＣＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＧ
−３’ａｍｌｌｌ このオリゴヌクレオチドの配列はｍＧＸ７８７７のドメ
インＡ２からＢ１の間の領域の配列と相捕的であるが、
以後のｐＧＸ２６０６内での発現シグナルとの融合のた
めに、正しいフレーム内に挿入された、エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩの認識部位を構成する６ヌクレオチドを
も含有する。 このオリゴヌクレオチドを１本鎖ｍＧＸ７８７７ＤＮＡ
をインビトロで２本鎖ＤＮＡに変換するのに用いた。得
られた２本鎖ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２１０をトラ
ンスフェクションした。プラークから得た感染細胞から
回収したＲＦ ＤＮＡをＢａｍＨ１部位の存在に関し
てスクリーニングした。所望の構造を有するものをｍＧ
Ｘ７８９３と命名した。 ｍＧＸ７８９３の２本漬ＲＦ ＤＮＡをエンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ［ＩＩで消化し、消化
ＤＮＡをアガロースゲル（１％）電気泳動にかけて分画
した。生成した２本の線状ＤＮＡバンドの内、プロティ
ンＧのＢｌおよびＢ２ドメインをコードする配列を含有
する小さいバンドをゲルから溶出して回収した。ｐＧＸ
２６０６のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、長い線状断片をフェノール
抽出とエタノール化、殿により回収した。精製ｍＧＸ
７８９３断片を回収したｐＧＸ２６０６ＤＮＡと混合し
、ライゲーション条件下、Ｔ４ＤＮΔリガーゼと共にイ
ンキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２
０１を形質転換し、３００Ｃでのアンピシリン耐性に関
してスクリーニングした。形質転換体を実施例７記載の
ごとく４２°ＣでのＩｇＧ結合タンパク質の生産に関し
てスクリーニングした。１個の陽性形質転換体をＧＸ８
４３６と命名し、これは所望の構造のプラスミドｐＧＸ
４５９２を含有していることが分かった。 ｐＧＸ４５９２のＮ−末端暗号配列は以下の如く、ＤＮ
Ａ配列決定によって直接、確認された。 適当な発酵条件下、４２°Ｃで発現を誘導し、３９°Ｃ
で継続するとＧＸ８４３６株は予測された大きさのヒト
ＩｇＧと結合活性を有するタンパク質を産生じた。結合
領域ＢｌおよびＢ２を含有するこのタンパク質をプロテ
ィンＧ変異体タイプｌと命名した。この変異体のアミノ
酸配列を以下に示す。 実施例８ このプロティンＧ変異体をコードする全遺伝子のＤＮＡ
配列は以下の通りである。 Ｇ遺伝子の構築 種々の欠失を有するプロティンＧ遺伝子の誘導体を大腸
菌内での発現に好都合な調節可能なプロモーター系と融
合させた。用いたプロモーターはマツケ二一ら（Ｍ ｃ
Ｋ ｅｎｎｙ）が米国特許出願５３４９８２（１９８
３年９月２３日出願）に記載した、インビトロ法で構築
されたノ１イブ肝ッドノイクテリオファージラムダプロ
モーター（ＯＬ／ＰＲ）である。このプロモーターはプ
ラスミドｐＧＸ２６０６に担持されており、以下のよう
に配置されたＢａｍＨＩ部位を有するファージラムダｃ
ｒｏ遺伝子の翻訳開始部位を含有している・ ＢａｍＨＩ ｐＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９に担持されている
ものから導かれた改良プロティンＧ遺伝子をベクターｐ
ＧＸ２６０６のＢａｍＨＩ部位に融合させるために、ｐ
ＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９の唯一のＫｐｎ１部
位にＢａｍ８１部位を作成した。 この目的のために以下の構造を有する自己−相補的オリ
ゴヌクレオチドリン力−を合成した：５’ Ｐ−ＧＧ
ＡＴＣＣＧＴＡＣ ＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧ−５’ Ｐ この２本鎖リンカ−の１本鎖末端はプラスミド類をエン
ドヌクレアーゼＫｐｎｌによって消化した場合に生じる
１本鎖末端と相補的であり、このリンカ−にはエンドヌ
クレアーゼＢａａ＋ＨＩの認識部位が挿入されている。 プラスミドｐＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９のＤＮ
Ａを別々にエンドヌクレアーゼＫｐｎｌで消化し、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱に付した（第１３図）。次
いで消化ＤＮＡ標品をりん酸化リンカ−すりゴヌクレオ
チドおよびＴ４ＤＮＡリガーゼと共にライゲーション条
件下でインキュベートした。７０℃で３分間インキュベ
ートしてリガーゼＤＮＡを不活化し、結合ＤＮＡ標品を
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
消化した。 各消化ＤＮＡ標品を分取用アガロースゲル（１％）電気
泳動にかけて分画した。長さ４００から７０ｏｂｐに相
当する移動度の断片をゲルから切り取って溶出し、回収
した。プラスミドｐＧＸ２６０６のＤＮＡをエンドヌク
レアーゼＢａａｉＨｒおよびＨ１ｎｄｌｌＩで消化し、
０４７％アガロースゲル電気泳切にかけて小さいＢ ａ
ｍＨ［−Ｈ１ｎｄｌｌＩ断片を除去した。大きいバンド
を切り取り、溶出し回収した。 回収したｐＧＸ２６０６断片を回収したｐＧＸ４５９７
およびｐＧＸ４５９９断片と別々に混合し、ライゲーシ
ョン条件下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベート
した。結合ＤＮＡ標品を別々に用いて大腸菌ＧＸ １２
０１ （ｎａｄＡ：：Ｔｎｌ Ｏｄｅｌｔａ ４ （ｃ
ｈｉ Ｄ−ｂｌｕ）（ｌａｍｂｄａ ｃｌ ８５７ ｄ
ｅｌｔａ ＢａｍＨＩ））、易熱性リプレッサープロテ
ィンをコードするｃ１８５７遺伝子を担持するファージ
ラムタ溶原閑、を形質転換した。形質転換体を３０’Ｃ
でのアンピシリン耐性に基づいて選択し、実施例１記載
のイムノアッセイの変法によりスクリーニングした。細
胞を通常の栄養寒天プレート上、上にニトロセルロース
フィルターを付した酢酸セルロースフィルター上で３０
６０にて培養した。可視コロニーの出現後、プレートを
４２℃で４−６時間インキュベートし、実施例１記載の
ごとく、ニトロセルロースフィルターを展開した。この
ようにして同定した陽性形質転換体は制限分析により所
望の構造のプラスミドを含有することか分かった。 ｐＧＸ４５９７誘導配列を含有するプラスミドをｐＧＸ
５２０３と命名し、このプラスミドを含有する大腸菌株
をＧＸ８４６４と命名した。ｐＧＸ４５９９−誘導配列
を含有するプラスミドをｐＧｘ５２０４と命名し、この
プラスミドを含有する大腸菌株をＧＸ８４６５と命名し
た。 ｐＧＸ５２０３およびｐＧＸ５２０４によって担持され
ている改良プロティンＧ遺伝子の設計構造のＮ−末端は
以下のごとく同一である。 ｆＭｅＬＡｓｐＰｒｏＴｙｒＰｒｏＬｅｕＰｒｏＬｙｓ
ＴｈｒＡｓｐ［Ｂｌ ］Ａ ＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＡＴ
ＧＧ ＡＴＣＣＧＴＡＣＣＣＡＴＴ Ａ ＣＣＴＡ Ａ
ＧＡＣＴＧＡ ＣＡ ＣＴＴＡ Ｃ。 Ｃ−末端配列はそれぞれ、ｐＧＸ４５９７およびｐＧＸ
４５９９のＣ−末端配列と同一である（実施例６）。 ＧＸ８４６４およびＧＸ８４６５はいずれもプロティン
Ｇの免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質変異体
を産生ずる。さらに、雨林の生産性は高められており、
細菌培養１ｇあたりのプロティンＧ様物質回収率が約２
００ｏ＋９の生産を示した。このタンパク質の合成は３
０℃で制御され、４２°Ｃで誘導され、制御モードはｃ
１８５７遺伝子にフードされている易熱性レプレッサー
の存在下、ハイブリッドファージラムダプロモーター（
ＯＬ／ＰＲ）のフントロール下にある遺伝子によると予
測された。 このプロティンＧ変異体のアミノ酸配列は下記のごと（
ＧＸ８４６５によって産生されたＢ１およびＢ２結合ド
メイン（タイプ２）を含有する。 ＧＸ８４６５によって産生され、ＢｌおよびＢ２結合ド
メインを有するプロティンＧ変異体（タイプ３）のアミ
ノ酸配列を以下に示す。 このプロティンＧ変異体くタイプ３）をフードする遺伝
子のＤＮＡ配列を以下に示す。 このプロティンＧ変異体（タイプ２）をフードする遺伝
子のＤ Ｎ Ａ配列を以下に示す。 実施例９ プラスミドｐＧＸ４５９９を用いてｄａｍメチラーゼを
欠く菌株、大腸菌ＧＭ２７２を形質転換した。 そのような形質転換体から得たＩＩのプラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで消化シた。このＤ
ＮＡはｄａｍ誘導メチル化が失われているので消化によ
り２断片が生成した。これらの断片をフェノール抽出と
エタノール沈澱により回収した。 以下の配列を有する自己−相補的オリゴヌクレオチドア
ダプターを合成した この２本鎖オリゴヌクレオチドの１本鎖末端はエンドヌ
クレアーゼＣ１ａｌ消化により生成された１本鎖末端と
相補的であり、エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の認識部
位を含有している。 ５”りん酸化オリゴヌクレオチドアダプターを回収した
ｐＧＸ４５９９ＤＮＡ断片と混合した。 この混合物とＴ４ＤＮＡリガーゼとを、ＤＮＡ濃度約１
０μ９／ｍβにてライゲーション条件下でインキュベー
トした。結合反応後、再環化したＤＮＡを用いて大腸菌
５Ｋ２２６７を形質転換し、アンピシリン耐性に関して
選択した。２個の断片の内、１個のみが大腸菌内で活性
な複製起点と選択可能なアンピシリン耐性マーカーを有
しているのでこの断片を含有している再環化ＤＮＡのみ
か大腸菌を形質転換することができた。形質転換体をプ
ラスミドＤＮＡの制限分析によりスクリーニングし、所
望の構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４１）を含有するも
のを同定した。 プラスミｔ’ｐＧＸ５２４１およびｐＧＸ２６０６を共
にエンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨｌ
て消化した。消化り、Ｎ Ａをフェノール抽出およびエ
タノール沈澱により回収した。２個の消化プラスミドを
ライゲーションバッファー中、ＤＮＡ濃度約５０μｇ／
ω！で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、結合させ
た。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換
し、３０’Ｃでのアンピシリン耐性に基づいて選択し、
形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析でスクリーニ
ングした。 所望の構造のプラスミド（ｐＧＸ ５２４５）を含有す
るものをＧＸ８８２２株と命名した。正確な構造をＤＮ
Ａ配列決定により確認した。このプロティンＧ変異体を
コードする遺伝子のＤＮＡ配列を以下に示す。 ＧＸ８８２２株はヒ）ＩｇＧ結合能力を有する予測され
た大きさのタンパク質を産生ずることが分かった。この
プロティンＧ変異体は単一のＩｇＧ結合配列Ｂ２（ＧＸ
７８０９、プロティンＧかろ）、隣接するプロリン豊富
領域、および“Ｃ−リピート”を含有する。このプロテ
ィンＧ変異体タイプ５の推定のアミノ酸配列を以下に示
す。 実施例１０ プラスミドｐＧＸ５２０４ＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼＰｓｔｌで消化し、１％アガロースゲル電気泳動に
かけ、ゲルから精製断片を溶離することで長い線状断片
を単離した。プラスミドｐｃｘ４５８４（ベクターｐＧ
Ｘ１０６６＋ストレプトコッカスＧＸ７８０５から単離
されたプロティンＧ遺伝子を含む２．４ｋｂｐのＤＮＡ
挿入体から成る（実施例５参照））を、プロティンＧの
ＩｇＧ結合ドメインをコードする領域に由来する４２０
ｂｐ断片が充分量得られるような条件下で、Ｐｓｔｌに
より部分消化した。アガロースゲル（１，５％）電気泳
動し、ゲルを溶出することでこの４２０ｂｐＰｓｔ１断
片を単離した。 ｐＧＸ５２０４の長いＰｓｔｌ断片とｐＧＸ４５８３の
ＰｓｔＴ部分消化断片とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で結合させた。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０．
１を形質転換し、形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限
分析でスクリーニングした。 ２つのタイプのプラスミドが同定された。１個（ｐＧＸ
５２４７）はプラスミドｐＧＸ５２０４から誘導された
しのであって、プラスミドｐＧＸ５２０４の２１０ｂｐ
断片をｐＧＸ４５８３の４２０ｂｐＰｓＮ断片で置換し
たものである。ｐＧＸ５２４７を含有する株をＧＸ８８
２５と命名し、予測されたサイズのＩｇＧ結合タンパク
質を産生ずることが分かった。このタンパク質（タイプ
６）の推定の構造を以下に示す。 このプロティンＧ変異体（タイプ６）をコードする遺伝
子のＤＮＡ配列を以下に示す。 ＡＡＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＣＴＡＡイブ１１）
のＤＮＡ配列を以下に示す。 この配列はＧＸ７８０９プロティンＧから導かれた配列
ＢｌおよびＢ２のキメラ配列である、単一の“Ｂリピー
ビを含有している。 プラスミドｐＧＸ４５９５を用いてｄａｔａメチラーゼ
を欠く菌株、大腸菌ＧＭ２７２を形質転換した。 そのような形質転換体から得た１個のプラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで消化した。このＤ
ＮＡはｄａｍ誘導メチル化が失われているので消化によ
り２断片が生成した。これらの断片をフェノール抽出と
エタノール沈澱により回収した。 この配列はＢ１、Ｂｌ／Ｂ２、およびＢ３結合ドメイン
を含有し、そのアミノ酸配列はストレフトコツカスＧＸ
７８０５から導かれたプロティンＧのアミノ酸配列、並
びにプロティンＧの隣接プロリン豊富領域および゛Ｃ−
リピービと同一である。 上記の形質転換体から単離された第２のタイプのプラス
ミド（ｐＧＸ５２４６）ｌ；！ｐＧＸ５２０４から、該
プラスミドの長いＰｓｔｌ断片を挿入なしに再環化する
ことにより得られた。従って、プラスミ）’ｐＧＸ５２
０４（７）短い２１０ｂｐ Ｐｓｔｌ［ｒ片１；！欠失
された。ｐＧＸ５２４６を含有する株をＧＸ８８２４と
命名した。ＧＸ８８２４によって産生されるタンパク質
（タイプ１１）の推定の構造を以下に示す。 このプロティンＧ変異体をフードする遺伝子（７以下の
配列を有する自己−相補的オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを合成した： この２本鎖オリゴヌクレオチドの１本鎖末端はエンドヌ
クレアーゼＣ１ａｒ消化により生成された１本鎖末端と
相補的であり、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部
位を含有している。 ５°−りん酸化オリゴヌクレオチドアダプターを回収し
たｐＧＸ４５９５ＤＮＡ断片と混合した。 この混合物とＴ４ＤＮＡリガーゼとを、Ｄ Ｎ Ａ ｉ
ｐ４度約１Ｏμｇ／ｍ（ｌにてライゲーション条件下で
インキュベートした。結合反応後、再環化したＤＮＡを
用いて大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し、アンピシリン
耐性に関して選択した。２個の断片の内、１個のみが大
腸菌内で活性な複製起点と選択可能なアンピシリン耐性
マーカーを有しているので、この断片を含有している再
環化ＤＮＡのみが大腸菌を形質転換することができた。 形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析によりスクリ
ーニングし、所望の構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４０
）を含有するものを同定した。 プラスミｔ’ｐＧＸ５２４０およびｐＧＸ２６０６を共
にエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ
で消化した。消化ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノ
ール沈澱により回収した。２個の消化プラスミドをライ
ゲーションバッファー中、ＤＮＩｉ度約５０μｇ／ｍρ
で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、結合させた。 結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、
３０°Ｃにおけるアンビンリン耐性により選択し、形質
転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析でスクリーニング
した。 所望の構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４４）を含有する
ものをＧＸ８８２１株と命名した。正確な構造をＤ Ｎ
Ａ配列決定により確認した。このプロティンＧ変異体
をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を以下に示す。 ＧＸ８８２１株はヒトＩｇＧ結合能力を有する予測され
た大きさのタンパク質を産生ずることが分かった。この
タンパク質の推定の構造を以下に示す。 この構造には単一の［ｇＧ結合配列Ｂ２（ＧＸ７８０９
、プロティンＧから）および天然のタンパク質に由来す
る幾つかのアミノ酸残基が含まれている。 実施例１２ プラスミドｐＧＸ５２０４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、線状ＤＮＡをフェノール抽出
とエタノール沈澱により回収した。以下の配列を有する
自己−相補的オリゴヌクレオチドアダプターを合成した
： ５’ −ＡＧＣＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＡ
ＴＧＣＴＡ−３゜３°−ＡＴＣＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＡ
ＡＧＴＡＣＧＡＴＴＣＧＡ −５゜この２本鎖オリゴヌ
クレオチドの１本鎖末端はエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ
Ｉ［ｒ消化により生成された１本鎖末端と相補的であり
、エンドヌクレアーゼ５ｔｕｌの認識部位を含有してい
る。線状化ｐＧＸ５２０４ＤＮＡと５゛−りん酸化オリ
ゴヌクレオチドとをライゲーションバッファー中で混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。 結合反応後、再環化したＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２
０１を形質転換し、形質転換体をプラスミドＤＮＡの制
限分析（Ｓｔｕ１部位の存在）に関してスクリーニング
した。所望のプラスミド（ｐＧ Ｘ ５２５４）を含有
する形質転換体を同定した。 ｐＧＸ５２５４のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＮａｅｌ
で消化した。消化が不完全であることが分かったので、
線状分子をアガロースゲル（１％）電気泳動にかけ、ゲ
ルから溶出させ、精製し回収した。回収した線状分子を
次いで５ｔｕｌ消化し、長い線状断片をフェノール抽出
およびエタノ、−ル沈澱により回収した。これらの酵素
はいずれも平滑末端を生成した。次いで線状ＤＮＡをラ
イゲーションバッファー中、約１０μｇ／ｍ１で、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートして再環化した。 ＤＮＡ結合における所望の効果は以下の通りである。 、、、 Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａ
ｌｅ Ｇｌｙ ＥＮＤ ＜−−−−−−リンカー−−−
−−＞↓ 、、、Ｌｙｓ Ｌｙｓ＾ｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ＥＮＤ４６．＾ＡＧ ＡＡ
Ａ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＣＣＣＣＴ ＴＣＡ
ＴＧＣＴ＾＾ＧＣＴＴ、 、 。 ｐＧＸ５２０４にコードされているＣ−末端Ｇｌｙの代
わりにＰ ｒｏＳ ｅｒＣｙｓ配列をＣ−末端に置換す
るよう作用するインフレーム融合を行う。 再環化したＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転
換し、形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析（Ｎａ
ｅ１部位の喪失）に関してスクリーニングした。所望の
構造（ｐＧＸ ５２５５）を含有する形質転換体をＧＸ
８８３３と命名した。この株は予測されたサイズの、１
分子当たり約１個のＣｙｓ残基を有するＩｇＧ結合タン
パク質を産生ずることが分かった。ｐＧＸ５２５５のＣ
−末端暗号領域をＤＮＡ配列決定で直接確認した。この
プロティンＧ変異体をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を
以下に示す。 実施例１３ プラスミドｐＧＸ５２０４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄＩＩ［で消化し、線状ＤＮＡをフェノール抽出
とエタノール沈澱により回収した。以下の配列を有する
自己−相補的オリゴヌクレオチドアダプターを合成した
： ６０１ ＴＧＣＴＡＡ この遺伝子によって発現されるＢ１およびＢ２ドメイン
を含有するプロティンＧ変異体の推定のアミノ酸配列を
以下に示す。 この２本鎖オリゴヌクレオチドの１本鎖末端はエンドヌ
クレアーゼ）ｌｉｎｄｌＩｒ消化により生成された１本
鎖末端と相補的であり、エンドヌクレアーゼＨｐａｌお
よびＰ ｖｕ ［の認識部位を含有している。 線状化ｐＧＸ５２０４ＤＮＡと５°−りん酸化オリゴヌ
クレオチドとをライゲーションバッファー中−で混合し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキユベートシた。結合
ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、形質
転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析（Ｐ ｖｕ Ｕ部
位の存在）に関してスクリーニングした。リンカ−は線
状プラスミドＤＮＡと２方向の内のいずれかの方向で結
合し得る。従ってリンカ−（Ｐ ｖｕ ■部位）を獲得
したプラスミドを含有する数個の形質転換体が同定され
、その内の幾つかが所望の方向でリンカ−を含有すると
予測されたく例えばｐＧＸ５２６７）。 ｐＧＸ５２６７のＤＮＡをエンドヌクレアーゼ［（ｐａ
ｌで消化し、線状ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノ
ール沈澱により回収した。次いで線状ＤＮＡをライゲー
ションバッファー中、約１０μｇ／ｍ（ｌで、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼと共にインキユベートシて再環化した。ＤＮ
Ａ構造における所望の効果は以下の通りである。 、、 Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ 、、
、＾ｌａ Ｇｌｙ ＥＮＤ ＜−−−−−−リンカ−↓ 、、 Ｍａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙ
ｓ ＥＮＤ−■ 旺叫■ ＧＸ５２０４がコードするタンパク質中に存在〉 するＣ−リピートを欠失し、Ｃ−末端のＳ ｅｒＣｙｓ
配列を置換するよう作用するインフレーム融合を行う。 これによりタンパク質に唯一のＣｙｓ残基が作成される
。もしもリンカ−が逆の方向にあれば２個のＨｐａＩ部
位間の欠失によってＰｖｕ［部位とＨｉｎｄＩ１１部位
が除去されるということに注目されたい。 再環化したＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転
換し、形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析（プロ
ティンＧをコードする配列を含有スルＢ ａｎ＋ＨＩ−
Ｈ１ｎｄｌＩ［断片の短縮）に関してスクリーニングし
た。そのような欠失を有する数個のプラスミドが同定さ
れた。所望の方向でＤＮＡリンカ−を獲得した元のプラ
スミドがどれであるかを決定するためにプラスミドをＨ
ｉｎｄＩ［およびＰｖｕｌＩ部位の存在に関してスクリ
ーニングした。所望の構造（ｐＧＸ ５２８８）を含有
する形質転換体をＧＸ８８４６株と命名した。このプロ
ティンＧ変異体をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を以下
に示す。 この株に゛よって発現されるＢｌおよびＢ２ドメインを
含有するプロティンＧ変異体の推定のアミノ酸配列を以
下に示す。 実施例１４ プラスミドｐＧＸ４５９９を用いてｄａ−メチラーゼを
欠く菌株、大腸菌ＧＭ２７２を形質転換した。そのよう
な形質転換体から得た１個のプラスミドＤＮＡを、有意
量の完全長さの線状ＤＮＡが形成されるような条件下、
制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで部分消化した。この
ＤＮＡはｄａｍ誘導メチル化が失われているのでＣ１ａ
ｌ開裂にこれらの部位の両者が利用され得る。従って、
１カ所切断線状ＤＮＡには２タイプが存在する。この線
状ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で精製しゲルから溶
出した後、エンドヌクレアーゼＸｈｏｌで消化した。生
成した最長断片を再度アガロースゲル電気泳動で精製し
、溶出させて回収した。 以下の配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを合成した： ５°−ＣＧＡＣＧＴＣＣＣ−３’ ３° −ＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴ−５″このオリゴヌク
レオチドの１本鎖末端はそれぞれ、エンドヌクレアーゼ
Ｃ１ａｌおよびＸｈｏ！消化により生成された１本鎖末
端と相補的であり、エンドヌクレアーゼＡａｔｆｆの認
識部位を含有している。 ５′りん酸化オリゴヌクレオチドアダプターと精製した
ｐＧＸ４５９９のＣ１ａｒ−Ｘｈｏｌ断片とをライゲー
ションバッファー中で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共
にインキュベートした。結合したＤＮＡを用い大腸菌Ｄ
Ｈ５ａ １ ｐｈａ（Ｆ −、ｅｎｄＡ １． ｈｓ
ｄＲ１７，５ｕｐＥ ４４． ｔｈｉ−１，ｒｅｃＡ
１゜ｇｙｒＡ ９６． ｒｅｌ Ａ １ 、 ｄｅｌ
ｔａ（ａｒｇＦ −１ａｃＺ ＹＡ）Ｕ １６９． ｐ
ｈａ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ １５ ；Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉ ｎｃ、から入手可能）を形質転換し、形質転換
体をプラスミドＤＮＡの制限分析（プロティンＧ暗号配
列を含有するＢａｌ１１Ｈ［−Ｈ１ｎｄｌ断片のサイズ
の減少）に関してスクリーニングした。所望の構造を含
有するプラスミド（ｐＧＸ ５２６５）を同定した。 線状分子のＣ１ａｌおよびＸｈｏ１部位をアダプターオ
リゴヌクレオチドを介して結合させることで以下のイン
フレーム融合を生じた。 、、、 Ｇｌｕ Ｖａｌ ｌｉｅ Ａｓｐ Ａｌａ 、
、、 Ｍａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ 、、
。 ↓ 、、、 Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ 、、。 、、、 ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣＴ
ＣＧＡ ＧＧＴ ＧＡＴ 、、。 ａｔ Ｕ ｐＧＸ５２６５に担持されている修飾プロティンＧ遺伝
子をベクターｐＧＸ２６０６のＢａｎ＋ＨＩ部位に融合
させるためにｐＧＸ５２６５の該プラスミドに唯一のＫ
ｐｎ（部位にＢａ＋ａＨ１部位を作成した。この目的の
ために、以下の配列を有する自己−相補的オリゴヌクレ
オチドリン力−を合成した： ５’ Ｐ−ＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣ ＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧ−５° Ｐ この２本鎖オリゴヌクレオチドの１本鎖末端はプラスミ
ドをエンドヌクレアーゼＫｐｎｌで消化して生成された
１本鎖末端と相補的であり、このリンカ−はエンドヌク
レアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含有している。 プラスミドｐＧＸ５２６５ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
Ｋｐｎｌで消化し、フェノール抽出およびエタノール沈
澱に付した。次いで消化ＤＮＡ１品を５゛−りん酸化オ
リゴヌクレオチドおよびＴ４ＤＮＡリガーゼと共に、ラ
イゲーション条件下でインキュベートした。７０°Ｃで
５分間インキュベ−トシてＤＮＡリガーゼを不活化した
後、結１ｚＤＮΔ標品をエンドヌクレアーゼＢａｍ１刊
およびＨｉｎｄｌｌｌで消化した。次いで消化ＤＮＡ標
品を１．４％アカロースゲルによる分取用電気泳動分画
にかけた。臭化エチジウム染色ゲルに２個のＤＮＡ断片
が観察され、移動度の大きい方の断片を切り取り、ゲル
から抽出し回収した。プラスミドｐＧＸ２６０６のＤＮ
ＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩ
Ｉ消化し、大きい線状断片をフェノール抽出、エタノー
ル沈澱で回収した。 回収したｐＧＸ２６０６断片を回収したｐＧＸ５２６５
断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一緒にライゲーシ
ョン条件下、インキュベートシタ。 結合したＤＮＡ標品を用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質
転換した。形質転換体を３０°Ｃてアンピシリン耐性に
関して選択し、プラスミドＤＮＡの制限分析（正しいサ
イズのＢ ａｍＨＩ −Ｈ１ｎｄｌＩ［断片ニ関し）に
よりスクリーニングした。所望の構造のプラスミド（ｐ
ＧＸ ５２６６）を含有するものを同定した。この株を
ＧＸ８８４４と命名した。 このプロティンＧ変異体をコードする遺伝子のＤＮＡ配
列を以下に示す。 この株によって発現される、単一のＢｌドメインを有す
るプロティンＧ変異体の推定のアミノ酸配列を以下に示
す。 実施例１５ Ｔ ｒｅｓｙｌ−活性化セファロース４Ｂの凍結乾燥粉
末（ファルマシア）をｌ＋ＭＨｃｆ２に懸濁した。 ゲルを内張すしたガラスフィルター上、１ｍＭＨＣａで
洗浄した後、吸引乾燥した。プロティンＧ変異体を０．
５Ｎ ＮａＣｌ２含有０．ＩＭ ＮａＨＣＯｓ（ｐＨ８
，０）に濃度５ ｍｙ／ ｍｌで溶解した。約１ｍｌ＋
のタンパク質溶液にｄａｍｐゲル約１９を加えた。この
懸濁液を４℃または室温で１夜、転倒させた（エンドオ
ーバーエンド）。次いで、ゲルを０．１Ｍトリスバッフ
ァー（ｐＨ８，０）で数時間処理した。 次いゲルをカップリングバッファーで洗浄し、３サイク
ルのｐＨ４バツフアー（０，１Ｍ酢酸Ｎａ、 ０゜５Ｍ
ＮａＣｆｆ）およびｐＨ８バツフアー（０，１Ｍトリ
スおよび０．５Ｍ ＮａＣ１２）で洗浄した。次いでゲ
ルをりん酸緩衝化食塩水（５０ｍＭ りん酸、０４１５
ＭＮａＣｌ２．０． Ｏ０５％ＮａＮ３ｐＨ７７゜４）
で４°Ｃで保存した。 実施例１６ 固定化プロティンＧ変異体の特性化 ３個の単一ドメインプロティンＧ変異体−−タイブ５（
Ｂ２）、タイプ１０（Ｂｌ）およびタイプ１１ （Ｂ
ｌ／Ｂ ２）−一の特性化を行った。一般に、実施例１
５の固定化タンパク質を中圧ガラスクロマトグラフィー
カラムに充填しＨＰＬＣシステムに連結した。 固定化の程度を固定化の前および後の２８Ｏｒ＋ｏ＋に
おける吸光度の変化に基づいて測定した。反応における
干渉要素は透析で除いた。あるいはなんらかの標準タン
パク質定量アッセイ（例えばＢＣＡ 、 Ｌ ｏｗｒ
ｙまたはＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）を用いてタン
パク質固定化の程度を測定してもよい。カンプリングお
よび得られた能力を表１に示す。ＩｇＧ結合能力の決定
にはヒト血清をカラム頂上に適用した。ＰＢＳで充分に
カラムを洗浄した後、結合したＩｇＧを５ｎ＋Ｍ酢酸ア
ンモニウム（ｐＨ５）、１．０Ｍ酢酸で溶出し、最後に
ＰＢＳで平衡化した。溶出したＩｇＧの量を吸光係数１
．４を用い、２８０ｎｍにおける吸光度に基づいて定量
した。 表１ ５ ３．５７１ ７５％ １６．６ｒ
７１０ ４．０４１１ｇ ７８％
１０．１π９１１ ３．８４ｘ９ ８１％
１１．１２ｘｇ次いで、固定化変異体のＦ ｃ、
Ｆ ａｂ、 Ｆ （ａｂ’ ）２およびＩｇＧへの結
合特性を試験した。カラムをＰＢＳで平衡化した後、Ｉ
ｇＧまたはそのタンパク分解フラグメントまたはその混
合物をカラムに適用した。次いで充分な洗浄を行った。 次いでカラムを５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５，０４
５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ３，１，０Ｍ酢酸で溶離し
、さらに最後にＰＢＳ ｐＨ７，０で平衡化した。２８
０ｎｍの吸光度を測定してタンパク質量を定量した。両
分（フラクション）をまた５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し生
成物の性質を評価した。 Ｆｃフラグメント（１，０から１．３ｍｇ充填）を固定
化変異体タイプ５．１０および１１に適用した。 固定化したタイプ５変異体は１．１５−カラムに入って
おり、タイプ１０およびタイプ１１変異体は０．７５Ｍ
１カラムに人っていた。結果を表２に示す。 表２ 初期通過流 ０．１７ １８ Ｑ、０５ ５
０．１ｉｐ）（＝５ ０．０４ ４ ０．０
０ ０ ０．００ｐＨ＝３ ０．１３ １４
０．３１ ２９ ０．３４１．０Ｍ酢酸 ０．３５
３８ ０．３９ ３７ ０．４１ＰＢＳ平衡化 ０．
２４ ２６ ０．３１ ２９ ０．４９１：Ａ＝ｓｏ
に基づく ２：全回収物質の％として表した値 タイプ１０およびタイプ１１に関して、充填したＦｃフ
ラグメントの１００％が様々な画分に回収された。タイ
プ５に関して、充填したＦｅフラグメントの９３％が様
々な画分に回収された。 固定化変異体タイプ５（１，１６ｍ１カラム）、タイプ
１０およびタイプ１１（０，７５ｍ＆カラム）ニ対する
Ｉ ｇＧ（１，０〜４．６ｎ＋９充填）結合の結果を表
３に示す。 ４に示す。 ｉ４ の結合 初期通過流 ０、ｏｏ ｏ ｏ、ｏ。 ｐＨ＝５ ＮＤ” ＮＤ Ｏ，００ｐＨ＝
３ ０．０２ ２ ０．００１．０Ｍ酢酸
０．４０ ５１ ０．１６ＰＢＳ平衡化 ０．３７
４７ Ｇ、００にＡｘｉａｌこ基づく ２：全回収物質の％として表した値 ３ ： ＮＤ＝測定せず ０．４９ ＮＤ １．６２ １．８７ ０．６６ タイプ５に関して、充填したＩｇＧの７９％が様々な両
分に回収された。タイプ１０に関して、充填したＩｇＧ
の１６％が様々な画分に回収された。タイプ１１に関し
て、充填したＩｇＧの１００％が様々な両分に回収され
た。 固定化変異体タイプ５（１，１６ｍ１カラム）、タイプ
１０およびタイプ１１（０，７ＥＭｔカラム）に対する
Ｆ ａｂ（１、０〜１．１ｍ９充填）結合の結果を表タ
イプ５ タイプ１０ ｍｙ ｌ ％２ ＝９ ％ 初期通過流 ０．５７ ８３ ０．２９ ６６ｐＨ
＝５ ０．００ ０ ０．００ ０ｐＨ＝３
０．００ ０ ０．ＯＯ０１，０Ｍ酢酸 ｏ
、ｏｏ ｏ ｏ、ｏｏ 。 ＰＢＳ平衡化 ０．１２ １７ ０．１５ ３４１：
Ａｙｓ。に基づく ２：全回収物質の％として表しだ値 タイプ１１ ＝９ ％ ０．５９ ４８ ０．０７ １４ ｏ、ｏｏ 。 ｏ、ｏｏ 。 Ｏ，３３３８ タイプ５に関して、充填したＦａｂの６９％が様々な画
分に回収された。タイプ１０に関して、充填したＦａｂ
の４４％が様々な画分に回収された。 タイプ１１に関して、充填したＦａｂの８７％が様々な
画分に回収された。 固定化変異体タイプ５（１，１６ｄカラム）、タイプ１
０およびタイプ１１（０，７５ｍ＆カラム）に対するＦ
（ａｂ’ ）２（１、０ｍ９充填）結合の結果を表５
に示す。 表−五 タイプ５ タイプ１０ タイプ１１ｔｎｇ１ ％
２ＲＬｉ ％ ｍｇ ％初期通過流 ０．
３２ ７５ ０．１８ ５５ ０．４２ ６０ｐＨ＝
５ ０．０４ ９ ０．００ ０ ０．１２
６ｐＨ＝３ ０．００ ０ ０．００
０ ０．００ ０１．０Ｍ酢酸 ０．００ ０
０．００ ０ ０．００ ０ＰＢＳ平衡化 ０．０
？ １６ ０．１４ ４５ ０Ｊ３ ３４１：Ａ２
８０に基づく ２：全回収物質の％として表した値 タイプ５に関して、充填したＦ （ａｂ’ ）ｚの４３
％が様々な画分に回収された。タイプ１０に関して、充
填したＦ （ａｂ’ ）２の３１％が様々な画分に回収
された。タイプ１１に関して、充填したＦ （ａｂ’
）ｚの８６％が様々な画分に回収された。 表２に示すように、Ｆｃのこれら３種の固定化変異体へ
の結合は全く同様である。しかしながら、ＩｇＧのこれ
ら変異体との相互作用の仕方には注意すべき相違がある
。タイプ１０（Ｂｌ）は溶出条件下でＩｇＧと非常に緊
密に非可逆的に結合する。 タイプ５（Ｂ２）もＩｇＧと緊密に結合するが可逆的で
ある。タイプ１１に関しては、ＩｇＧが様々な画分に溶
出していることから、結合は緩やかでありＩｇＧの分別
する傾向が認められる。 全ケースで、固定化変異体はＩｇＧおよびＦｃフラグメ
ントに比較してＦａｂおよびＦ（ａｂ’）、フラグメン
トとの結合ははるかに弱い。従って、これら固定化変異
体はＩｇＧおよびＦｃフラグメントをＦａｂおよびＦ
（ａｂ’ ）２フラグメントから分離するのに有用であ
る。 固定化タイプ１０およびタイプ１１変異体は幾分Ｆａｂ
フラグメントに親和性を有するようなので、固定化タイ
プ５変異体がＦ ａｂ’類の単離の候補者として注目さ
れた。Ｆ ａｂ’類の精製の可能性を例示するために、
Ｆ ｅ、 Ｆ （ａｂ’）ｔ、ＩｇＧおよびフルオレス
セインでラベルしたＦａｂからなる混合物をタイプ５カ
ラムに適用した。おおむね全てのフルオレスセインが通
過流に回収された。結合の欠如がフルオレスセイン修飾
によるものでないことを証明するために、別の実験でフ
ルオレスセインラベルＦｅフラグメントをカラムクロマ
トグラフィーにかけた。この場合には大多数のフルオレ
スセインがカラムに結合し、フルオレスセインによる修
飾がカラムの結合特性に影響を及ぼさないことが示され
た。 実施例１７ ＡＨ−セファロース（ファルマシア）を水に膨潤させ、
０．５Ｍ塩化ナトリウム、水および０．１Ｍりん酸ナト
リウム、ｐＨ７，０で洗浄した。このゲル懸濁液にスル
ホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チレート（ピアス）を加え、室温で１時間撹拌した。次
いでゲルを０．１Ｍりん酸ナトリウムｐＨ７，０バッフ
ァーで洗浄した。 約６ｍ９のシスティン含有変異体タイプ３をｐ）１７゜
Ｏバッファー１．１−に溶解した。次いで、吸引乾燥し
た活性化ゲルをこのタンパク質溶液に加えた。この懸濁
液を室温で１夜、逆転させた（エンドオーバーエンド）
。この時点で懸濁液にトリスおよびβ−メルカプトエタ
ノールを加えて室温で３時間回転させることにより過剰
の反応性残基を遮断（ブロック）した。インキュベーシ
ョン後、ゲルをカップリングバッファーで洗浄し、３サ
イクルのｐＨ４バツフアー（０，１Ｍ酢酸、０．５ＭＮ
ａＣのおよびｐＨ８バツフアー（０，１Ｍ）リスおよび
０．５Ｍ ＮａＣＱ）で洗浄した。次いでゲルをりん酸
緩衝化食塩水中、４℃で保存した。 固定化の程度を固定化の前および後の２８０ｎａ＋にお
ける吸光度の変化に基づいて測定した。反応における干
渉要素は透析で除いた。あるいはなんらかの標準タンパ
ク質定量アッセイ（例えばＢＣＡ 、 Ｌ ｏｖｒｙ
またはＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）を用いてタンパ
ク質固定化の程度を測定してもよい。 実施例１８ マレイミド固定化プロティンＧ変異体の結合能力の測定 固定化タンパク質をカラム（０，７Ｘ２．６ｃｍ）に充
填した後、１，０Ｍ酢酸で洗浄し、Ｐ Ｂ Ｓ （ｐＨ
７，０）で再度平衡化した。次いで、精製モノクローナ
ル抗体、血清または他の粗出発物質をカラムに適用した
。ＰＢＳで充分にカラムを洗浄した後、５ｍＭ酢酸アン
モニウム（ｐＨ５）、１．０Ｍ酢酸で溶出し、最後にＰ
ＢＳで平衡化した。タンパク質量は、それぞれ、ヒトお
よびマウス抗体に関する吸光係数１４４および１．４９
を用い、２８０ｎｍにおける吸光度に基づいて定量した
。 この１ｍ＆カラムには４．８９ｍ９のプロティンＧ変異
体タイプ３が含有されており、２９．５ｍｇのヒト［ｇ
Ｇおよび２０ｍｇのマウスモノクローナルＩｇＧ１が結
合している。 システィン残基をタンパク質に導入しチオールに特異的
な固定化化学反応を利用することにより、広範な修飾が
なされないタンパク産物が得られると考えられている。 即ち、その抗体結合能力が大きく高めらる。 比較のために種々の固定化の化学を用いた場合にゲル１
−に固定化されたプロティンＧ変異体２および３の量を
表６に示す。また表６には、固定化変異体２および３の
ヒトＩｇＧおよびマウスモノクローナルＩｇＧへの結合
能力も示されている。 表６から分かるように、タイプ３変異体はマレイミド化
学を利用するとはるかに高度に固定化される。しかもマ
レイミド化学によって固定化されたタイプ３変異体のヒ
トＩｇＧおよびマウスモノクローナルＩｇＧへの結合能
力は予想外に高い。 人−１ ２アルデヒド ３．３３ｘ９ １２．４ｘ９２ トレ
シル ２．５０ｍ９１２．５ｍ９３ トレシル
２．８５３１１９１６．７゜３ マレイミド ４
．８１ｍ９ ２９．５Ｒ９３、ｈｔｇ １、８ｍ９ ５、 ｈｇ ２０、０ｍｇ 本明細書において完全に本発明を記載したので、当業者
は製造の組成、条件および方法について広範囲に及ぶ等
価パラメーターを用い、本発明またはその実施態様の技
術的思想または範囲を逸脱することなく同様のことを実
施し得ることを認識するであろう。 ３、
関する。 従来技術 近年、非免疫メカニズムによって抗体と結合する細菌１
ｇ（免疫グロブリン）レセプターの分子が非常に注目さ
れている。この結合は、抗体分子の可変部に位置する抗
原認識部位に対するものでなく、抗体の定常部に対する
ものである。この定常領域は多くのタイプの抗体で共通
しており、したがって細菌１ｇレセプターは多くのタイ
プの抗体と結合することができる。この性質故に、細菌
１ｇレセプターは多くの免疫化学的応用が可能である。 細菌Ｉｇレセプターは、まず第１に抗体の検出、抗体の
精製、および疾患の処置において有用に、または潜在的
に有用に応用し得る。抗体の検出は、特異的モノクロー
ナル抗体の分泌についてバイプリドーマクローンをスク
リーニングする、免疫した動物の免疫応答性を測定する
、および拮抗性結合検定によって抗原を定量するなど、
免疫学における実験室レベルの研究の幾つかの局面で必
要である。細菌１ｇレセプターを使用して抗体を検出す
る方法は、他の検出方法よりも感度が高く、妨害および
高いバックグランドシグナルを示しにくい傾向にあるこ
とが見いだされた［ボイル（Ｂｏｙｌｅ。 Ｍ、Ｄ、Ｐ、）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２：
３３４−３４０（１９８４）コ。 １ｇレセプターはまた、タンパク性薬物の精製に使用し
得る抗体の精製に、および治療物質としても有用である
。多くの方法が知られているか、通常の方法は固定化綿
ｍ１ｇレセプター〇カラムを使用したアフィニティーク
ロマトグラフィーの使用に関連する。この方法は、カラ
ムが何度でも再使用できるので、精製費用を低く抑えら
れる点から、好ましい方法である。 細菌ｒｇレセプターを臨床的に使用することにおけるそ
の多くの用途が、現在研究されている。 それには、固定化ｒｇレセプターの生体外カラムに血漿
を通し、その処置血漿を再注入することがある。たとえ
ば、テナン（Ｔｅｎａｎ、 Ｄ、 Ｓ、 ）らのＮ、
Ｅｎｇ。 Ｊ、 Ｍｅｄ、 ３０５：１１９５−１２００（１９８
１）を参照のこと。 最もよく知られている細菌１ｇレセプターは、スタフィ
ロコッカス・アウレウスのプロティンＡであり、これは
免疫グロブリンＩｇＧの定常部Ｆｃドメインに結合する
。他の細菌ｒｇレセプターも同定されている。これらの
中には、連鎖球菌（ストレプトコッカス）（ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｉ） ＧグループのプロティンＧとして知
られているものがある。プロティンＧはプロティンＡと
類似しているが、プロティンＧは重要な利点を幾つか有
している。たとえば、プロティンＧはヒトＩｇＧのすべ
てのサブクラスと結合するが、プロティンＡはＩｇＧ３
サブクラスとは結合しない［レイス（Ｒｅｉｓ、 Ｋ、
Ｊ、 ）らのＪ、 Ｉｍｍｕｎｏ１、 １３２：３０
９８−３１０２（１９８４）コ。プロティンＧはまたＩ
ｇＧに特異的であり、プロティンＡのようにＩｇＡおよ
び１ｇＭタイプのヒト抗体とは交差反応しない［メイル
（Ｍｙｈｒｅ、 Ｅ、 Ｂ、 ）およびロンパル（Ｋｒ
ｏｎｖａｌ１、 Ｇ、 ）の「連鎖法菌属のｒｇレセプ
ターの規定化タイプにおける免疫グロブリン特異性−」
：連鎖球菌および連鎖球菌疾患の基礎概念；ホーム（Ｊ
、 Ｅ、 Ｈｏ１ｍ）およびクラステンセン（Ｐ、 Ｃ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）編；レッドブック、 Ｌｔｄ、
チャートセイ、サロー； ２０９−２１０頁（１９８３
）］。さらに、プロティンＧは、プロティンＡでは弱く
しか結合しないか、またはまったく結合しない特定の動
物のＩｇＧと結合する。それには、ウシ、ヒツジおよび
ヤギＩｇＧ１ならびにウマＩｇＧの幾つかのサブクラス
がある［レイスら、前掲］。プロティンＧはまた、ネズ
ミモノクローナル抗体の幾つかのサブクラスとの結合性
の点で、プロティンＡよりも優れていることがさらに見
いだされた［ジョーク（Ｂｊｏｒｃｋ、 Ｌ、 ）およ
びロンパル（Ｋｒｏｎｖａｌ １、 Ｇ、 ）のＪ、
ｌ＋＋ｍｕｎｏ１．１３３：９６９−９７４（１９８４
）］。このような理由から、プロティンＧは種々の適用
で選択され得る細菌ｒｇレセプターとなると考えられる
。 プロティンＧは、研究目的では、天然でそれを産生ずる
ストレプトコッカス（連鎖球菌）株から精製することに
よって得ることができる。たとえば、ストレプトフッカ
スの細胞をタンパク質分解酵素（たとえば、パパインま
たはトリプシン）で処理してプロティンＧ（これは細胞
壁タンパク質である）を可溶化させ、次いで既知のタン
パク質精製法（たとえば、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、およびアフィニティークロマトグラフィ
ー）によってさらに、得られたプロティンＧを精製する
［欧州特許出願、公開番号第０１３１１４２号］。 プロティンＧおよびその変異体の利点、用途および潜在
的な用途を考えれば、組換えＤＮＡ法によって変異体が
生産でき、さらにクロマトグラフィーに（Φ用するため
には、その変異体が固定化できることが望ましいであろ
う。したがって、本発明の目的は、プロティンＧおよび
その変異体をコートしている遺伝子の構築およびクロー
ン、ならびに微生物宿主細胞をそのクローンした遺伝子
で形質転換し、プロティンＧの産生条件下でその形質転
換宿主を培養することによりプロティンＧおよびその変
異体を生産することである。さらに、本発明の目的は、
プロティンＧおよびその変異体を固体支持体に固定化す
ること、およびその固定化変異体をクロマトグラフィー
の分離操作に使用することである。 本発明の要約 本発明は、固相支持体に固定化されたプロティンＧ変異
体、およびその用途に関する。具体的には、本発明は本
発明の固定化プロティンＧ変異体を使用する、免疫グロ
ブリンおよび免疫グロブリンフラグメントの検出、単離
および精製方法をも目的とする。 意外にも、本発明の固定化プロティンＧ変異体は、プロ
ティンＧとは類似していない免疫グロブリンおよび免疫
グロブリンフラグメントとの結合性を有していることが
発見された。したがって、本発明の固定化プロティンＧ
変異体は、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグ
メントの検出、単離および精製を行うための新規かつ予
想外の方法に使用することかできる。 図面の説明 第１図は、プロティンＧをコードしているＤＮＡ断片の
クローニングに使用するのに適したベクターであるプラ
スミドｐｃｘｔｏｅｅの特徴を示している模式図である
。 第２図は、プロティンＧをコードしているＤＮＡ断片を
含有する組換えプラスミドベクターであるプラスミドｐ
ＧＸ４５３３の部分的な制限地図を示すものである。 第３図および第３Ａ−Ｃ図は、プロティンＧ遺伝子のＤ
ＮＡ配列、およびその遺伝子によってコードされている
アミノ酸配列を示すものである。 第４図は、クローンされたプロティンＧ遺伝子の制限地
図、およびｒｇＧ結合に関与するタンパク質産物の反復
構造を示すものである。 第５図は、プロティンＧをコードしている断片を含有す
るバクテリオファージベクターであるｍＧＸ４５４７の
部分的な制限地図を示すものである。 第６図は、Ｂ構造の２つの完全なコピーを含有するが、
ＢｌおよびＢ２に近接するすべての末端アミノ酸配列を
欠いているバクテリオファージベクターであるｍＧＸ７
８８０の部分的な制限地図を示すものである。 第７図は、プロティンＧをコードしている断片を含有す
る、Ｂ、ズブチリスを形質転換するのに使用される組換
えプラスミドベクターであるｐＧＸ４５８２の制限地図
を示すものである。 第８図および第８Ａ−Ｃ図は、ストレプトコッカスＧＸ
７８０９から誘導されたクローン化プロティンＧ遺伝子
によってコードされているプロティンＧ上における、活
性部位Ｂ１およびＢ２の位置を示すものである。 第９図および第９Ａ図は、ストレプトコッカスＧＸ７８
０５から誘導されたクローン化プロテ、インＧ遺伝子の
ＤＮＡおよびアミノ酸配列を示すものである。この遺伝
子は３つの活性部位を含有するプロティンＧをコードし
ている。 第１０図は、菌株ＧＸ７８０５およびＧＸ７８０９から
誘導されたプロティンＧ遺伝子の反復構造間の関係を示
すものである。 第１１図は、活性部位配列から上流のコード化配列が欠
失しているプラスミドｐＧＸ４５８２からのプラスミド
ｐＧＸ４５９５の構築を説明するものである。 第１２図は、活性部位から下流のコード化配列が欠失し
ているプラスミドｍＧＸ７８７２からのブラスミｔ’ｐ
ＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９の構築を説明するも
のである。 第１３図は、プロモーターＯＬ／Ｐ Ｒを含有するプラ
スミドｐＧＸ２６０６ならびにプラスミドｐＧＸ４５９
７およびｐＧＸ４５９９からのそれぞれプラスミドｐＧ
Ｘ５２０３（プロティンＧ変異体タイプ３を発現する）
およびｐＧＸ５２０４（プロティンＧ変異体タイプ２を
発現する）の構築を説明するものである。 第１４図は、プロティンＧ変異体タイプ１をコードして
いる遺伝子を含有するプラスミドｐＧｘ４５９２の構築
を説明するものである。 第１５図は、プロティンＧ変異体タイプ５をコードして
いる遺伝子を含有するプラスミドｐＧＸ５２４５の構築
を説明するものである。 第１６図は、プロティンＧ変異体タイプ６およびタイプ
１１をコードしている遺伝子を含有するそれぞれプラス
ミドｐＧＸ５２４７およびｐＧＸ５２４６の構築を説明
するものである。 第１７図は、プロティンＧ変異体タイプ７をコードして
いる遺伝子を含有するプラスミドｐＧＸ５２４４の構築
を説明するものである。 第１８図は、プロティンＧ変異体タイプ８およびタイプ
９をコードしてい漬遺伝子を含有するそれぞれプラスミ
ドｐＧＸ５２５５およびｐＧＸ５２６８の構築を説明す
るものである。 第１９図は、プロティンＧ変異体タイプＩＯをコードし
ている遺伝子を含有するプラスミドｐＧＸ５２６６の構
築を説明するものである。 好ましい態様の詳細な説明 本発明は、プロティンＧ変異体をコードしているクロー
ン化遺伝子を提供するものである。「プロティンＧ変異
体」なる用語は、プロティンＧの１つまたはそれ以上の
天然［ｇＧ結合性ドメイン、天然■ｇＧ結合性ドメイン
のハイブリッド（雑種）を含有するタンパク質、および
変異体が［ｇまたはそのフラグメントの結合能を保持し
ている突然変異体を意味する。 「雑種配列（ハイブリッド配列）」なる用語は、Ｂ１お
よびＢ２に相当する配列部分をそれぞれ含有し、かつ免
疫グロブリン結合性を保持しているＤＮＡまたはアミノ
酸の配列を意味するものとする。このような雑種配列を
第９図に示し、それをＢ３と命名する。この雑種配列は
、Ｂｌドメインの最後の４９個アミノ酸と融合された結
合性ドメインＢ２の最初の６個のアミノ酸を含有してい
る。 したがって、免疫グロブリン結合性を保持しているこの
ような雑種配列はすべて本発明の範囲内に属すものであ
る。 このようなプロティンＧ変異体を得る方法を以下の実施
例に詳細に記載している。当業者は、通常行うスクリー
ニング法のみによって、Ｉｇまた。 はそのフラグメントの結合能についてプロティンＧ変異
体をスクリーニングすることができる。たとえば、プロ
ティンＧ変異体をｒｇまたはそのフラグメントと接触さ
せ、次いでプロティンＧ変異体とＩｇまたはそのフラグ
メントとの結合性を検出すればよい。２つのタンパク質
の結合性を検出する方法は、当業界では周知である。 プロティンＧ遺伝子はストレプトコッカス種のランスフ
ィールドグループ０株、またはＧ１４８株のプロティン
Ｇ遺伝子から得ることができる。 本発明はさらに、クローニングベクターに挿入されたプ
ロティンＧ遺伝子を提供するものである。 組換えベクターが安定に導入された原核生物の細胞は開
示されている。 本発明はまた、プロティンＧ分子の活性結合性部位のヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列の同定方法を提供す
るものである。さらに、プロティンＧ変異体の単一ドメ
インをコードしている１１個の遺伝子も提供するもので
ある。それから発現されるプロティンＧ変異体は固相支
持体に固定化された場合、プロティンＧとは異なる改変
Ｉｇ結合特性を示す。プロティンＧ変異体は、天然でプ
ロティンＧ遺伝子の両側に位置しくフランキング）、組
換え宿主から発現され得るプロティンＧの量を限定する
致死性配列を含有していない。 本発明の方法にしたがえば、プロティンＧ遺伝子をクロ
ーニングし、また組換えＤＮＡ技術により大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）またはバシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌宿主からプロティ
ンＧおよびプロティンＧ変異体を生産すれば、このよう
なタンパク質を得るための現在の方法よりも非常に多（
の利点を享受することができる。本発明の方法によって
、微生物プロティンＧおよびプロティンＧ変異体が相対
的に高い生産レベルで得ることかできる。さらに、本タ
ンパク質はより容易に単離できる条件下で生産すること
ができ、また本タンパク質は非病原性の宿主において生
産することができる。クローン化遺伝子を種々の多重コ
ピー発現ベクターに挿入すれば、その組換え発現ベクタ
ーで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ細胞の培養物中に、こ
れら価値あるＩｇＧ結合性タンパク質を増大したレベル
で得ることができる。通常は病原性菌株であるプロティ
ンＧ産生性ストレブトコ、カス株を培養するよりも、Ｅ
、ｃｏｌｉまたはバフラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）細胞でフロティンＧおよびプ
ロティンＧ変異体を生産するほうが良い。 プロティンＧ遺伝子をクローニングするための第１の工
程は、プロティンＧを産生ずるストレプトフッカス株の
単離である。これは、種々の株について適当な免疫検定
法を行いＩｇＧ結合活性を測定することによって行うこ
とができる。本発明者の行った方法は、以下の実施例で
詳細に記載しているコロニー免疫検定法である。Ｉ ｇ
Ｇ ３との結合能はプロティンＧに付随する望ましい性
質であるので、次に、ＩｇＧ結合活性を有することが判
明した株についてＩ ｇｃ； ３および非分画化ＩｇＧ
との結合能を試験する。Ｉ ｇＧ ３または非分画化Ｉ
ｇＧのいずれかで被覆した赤血球細胞を使用する血球凝
集試験（以下の実施例で詳細に説明する）は、プロティ
ンＧ産生株を同定するための常法である。プロティンＡ
は非分画化ＩｇＧとは結合するが、Ｉ ｇＧ ３とは結
合しないので、スタフィロコッカス・アウレウス コー
ワン（Ｃｏｖａｎ） Ｉなどの既知のプロティンＡ産生
株［スジョクイスト（Ｓｊｏｑｕｉｓｔ、 Ｊ、 ）の
Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 ７８：４７１
−４９０（１９７７）］を対照として使用することがで
きる。 栄養培地中で所望の細胞密度にまで培養し、次いで得ら
れた細胞を当業界既知である化学的、機械的および／ま
たは酵素学的方法によって細胞溶解することにより、プ
ロティンＧを産生ずることが見いだされた菌株から染色
体ＤＮＡを単離する。 この染色体ＤＮＡの単離には、通常の抽出法、および沈
澱法を使用する。そして、音波処理もしくは撹拌機中で
の高速撹拌などの既知の機械的方法、またはランダムな
断片が得られるＤＮＡ５ｅｌもしくは特定部位で開裂さ
せる制限エンドヌクレアーゼによる部分消化などの酵素
学的方法によって、クローニングするのに適した大きさ
のＤＮＡ断片を得る。 次いで、得られた染色体ＤＮＡ断片をクローニングベク
ターに挿入する。適当なプラスミドまたはバクテリオフ
ァージクローニングベクターを使用することができる。 ベクターが適当であるためには、幾つかの有用な性質を
有する必要がある。 目的とする微生物宿主細胞内で機能する複製起点、およ
びベクターにより形質転換された宿主細胞の同定に役立
つ選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子など）を含有して
いるべきである。また、挿入されたＤＮＡ断片を許容で
き、変わらず正常に複製できるべきである。好ましいベ
クターは、ベクターの複製能を破壊することなくＤＮＡ
断片を挿入できる独特の制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を１つまたはそれ以上含有するベクターである。 適当なりローニングベクターには、ラムダｇｔ１１ ［
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、
Ｕ、 Ｓ、 Ａ、 、 ８０ ： １１９４−１１９
８（１９８３）］などのファージ誘導体、Ｍ１３ｍｐ９
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒａｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
）などの種々のＭ２Ｓ−誘導ベクター、ｐＢＲ３２２な
どのプラスミド、および池の多くのもの［オールド（Ｏ
ｌｄ）およびプリムローズ（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）のＰｒ
１ｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔ
ｉｏｎ、 ２版＋ Ｕｎｉｖ、 ｏｆ、 Ｃａ１ｉｒ、
Ｐｒｅｓｓ、 ３２−３５および４６−４７頁（１９
８１）］がある。本発明者は、第１図に示している、ｐ
ＢＲ３２２誘導プラスミドベクターのｐｃｘ １０６６
を使用した。 ホモポリマー・テーリング法などの方法またはリンカ−
分子を使用することによって、ストレプトコッカスＤＮ
Ａをクローニングベクターに挿入する［オールドおよび
ブリムローズ、前掲、９２２ｉｒ制限エンドヌクレアー
ゼでベクターを線状化し、その線状化ベクター分子の末
端と連結できるＤＮＡ断片を生ぜしめる制限エンドヌク
レアーゼにより染色体ＤＮＡも消化するのが好都合であ
る。このようにして、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使
用する標準的な反応において、ストレプトコッカス誘導
化ＤＮＡ断片をクローニングベクターに挿入するのが好
都合である。 細菌細胞を標準的な方法により組換えクローニングベク
ターで形質転換し、プロティンＧの産生について細菌コ
ロニーをスクリーニングする。以下の実施例で記載する
コロニー免疫検定および作法凝集検定などの検定法は、
プロティンＧを産生ずる組換え菌株の同定に適している
。以下の実施例１でより詳細に説明しているが、同定さ
れた最初の陽性コロニーは不安定であった。このクロー
ンを数回、再画線培養（ｒｅｓｔｒｅａｋｉｎｇ）する
精製方法により、安定でありかつプロティンＧを産生ず
ると考えられるクローン誘導体を得た。この菌株をＥ、
ｃｏｌｉ ＧＸ ７８２０と命名した。 この菌株から得たプラスミドＤＮＡを単離した後、制限
分析、次いで電気泳動法によって分析した。この菌株は
２つのプラスミドを含有していると決定された。１つの
プラスミドは、ｐＧＸ１０６６クローニングベクターと
ほぼ同じ大きさであるとみなされ、それをｐＧＸ１０６
６Ｘと命名し、他方のプラスミドは１１キロ塩基対（ｋ
ｂｐ）の挿入体を含有するｐＧＸ１０６６とみなされ、
それをｐＧＸ４５３０と命名した。特定の理論にこだわ
るつもりはないが、本発明者らは以下の実施例によって
より詳細に説明するように、ｐＧＸ１０６６Ｘは、アン
ピシリン耐性遺伝子がもはや無傷ではないｐＧＸ１０６
６誘導体である「クリブチツク（ｃｒｙｐｔｉｃ）ヘル
パープラスミド」と考える。最初の形質転換株は、おそ
ら＜ｐＧＸ１０６６およびｐＧＸ４５３０を含有してお
り、またｐｃｘｔ０６６がアンピシリン耐性を付与して
存在する場合、プラスミドを保持する選択圧（ｓｅｌｅ
ｃＬｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｅｒ）が欠如していることに
より細胞からｐＧＸ４５３０が喪失され、したがって該
菌株は不安定であった。そのアンピシリン耐性遺伝子を
不活化する突然変異を有するｐＧＸ１０６６Ｘが現れた
なら、ｐＧＸ４５３０（無傷のアンピシリン耐性遺伝子
を有する）を保持した宿主細胞しかアンピシリン平板上
では生存できないであろう。ブラスミ）’ｐＧＸ１０６
６Ｘは、細胞内でｐＧＸ４５３０のコピー数を制限する
のに役立つと想像されるので、上記両プラスミドを含有
する細胞内にこのプラスミドを保持させる。プラスミド
ｐＧＸ４５３０は宿主にとって致死性のＤＮＡ配列を有
しているので、それ単独では宿主細胞にとっては致死的
である（実施例１参照）。しかし、ｐＧＸ１０６６Ｘを
その同じ宿主細胞に存在させれば、ｐＧＸ４５３０のコ
ピー数が許容レベルにまで減少される。これらプラスミ
ドは同じ「不和合性グループ」由来であり、すなわち各
プラスミドが宿主細胞内で他のプラスミドのコピー数を
制限するというように、細胞内で生存するために互いの
プラスミドと競合し合うのである。Ｅ 、 ｃｏｌ ｉ
菌株ＧＸ７８２０はアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクシコン（ロックビレ、メリーランド）に寄託され
、受託番号５３４６０が付されている。 菌株ＧＸ７８２０から単離したプラスミドの混合物でＥ
、ｃｏｌｉ菌株を形質転換した。この形質転換により、
小さいが強い陽性の多くのコロニーが得られた（幾つか
（約２０％）はＧＸ７８２０に類似していた）。これら
の小さいが陽性のコロニーから、ヘルパープラスミドを
有しない、かつ最初のＧＸ７８２０よりも強いプロティ
ンＧについての陽性を示す２つの安定な変異体を単離し
た。ＧＸ７８２３と命名した一方の菌株は、プラスミド
ｐＧＸ４５３０内の挿入体の２キロ塩基対（ｋｂｐ）断
片が欠失したプラスミド（ｐＧＸ４５３３）を有してい
る。Ｅ 、 ｃｏｌｉ株ＧＸ７８２３はアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号
５３４６１が付されている。ＧＸ７Ｂ２２と命名した他
方の菌株は、ＧＸ７８２３株が有するプラスミド内の欠
失部の一端に非常に近接した部位で最初の挿入体内に３
ｋｂｐＤＮＡ挿人体を獲得したプラスミドを有している
。プロティンＧ遺伝子は、ｐＧＸ４５３３上における１
、 ９ ｋｂｐ断片のストレプトコッカスＤＮＡ挿入
体上に位置されていた。 プロティンＧの生産レベルを改善するためには、クロー
ン化プロティンＧ遺伝子を種々の発現ベクターに挿入す
ればよい。発現ベクターは、遺伝子の発現、すなわちＤ
ＮＡからｍＲＮＡへの転写、その後のｍＲＮＡからその
遺伝子がコードしているタンパク質への翻訳に必須であ
るＤＮＡ配列を含む「調節領域」を含有している。プロ
ティンＧ遺伝子はその天然の発現シグナルを含有してい
てもよく、あるいはそれらのシグナルを除去し、クロー
ン化プロティンＧ遺伝子の構造部（すなわちタンパク質
をコードしている遺伝子部分）を、選択した宿主生物内
でプロティンＧ遺伝子を指令することのできる、発現ベ
クターに含有された池の発現シグナルと常法によって機
能的に融合することもできる。たとえば、宿主微生物が
Ｅ、ｃｏｌｉの場合、発現ベクターはｔｒｐプロモータ
ー／オペレーター、ｌａｃプロモーター／オペレーター
バクテリオファージラムダＰ、プロモーター／オペレ
ーターなどのような既知の調節領域を含有していればよ
い。 本発明の１つの態様では、発現ベクターはさらに、宿主
微生物の染色体領域とホモローガスなりＮＡ配列を含有
する。このような構築により、ベクターは宿主の染色体
の相同性領域において線形の組込み（ｌｉｎｅａｒ ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が可能となる。ベクター不含の
細胞に指向したネガティブ選択であるため、この方法の
利点はプロティンＧ配列が宿主から喪失される可能性が
低いことである。 このような組換え発現ベクターで形質転換した細菌細胞
においては、プロティンＧは高レベルで生産され得る。 さらに、所望の細胞密度に誘導することができる（遺伝
子発現し得る）、または組換え細菌細胞の培養物内の細
胞密度が所望のレベルに達成するまで遺伝子発現を可逆
的に抑制することのできるプロモーター／オペレーター
系を使用することにより、細胞内のプロティンＧ生産性
を制御することができる。したがって、ヘテロローガス
なタンパク質が産生されることによる、細胞増殖に対す
る潜在的にネガティブな効果を回避することができる。 クローン化プロティンＧまたはプロティンＧ変異体遺伝
子を含有する形質転換細胞を、プロティンＧまたはプロ
ティンＧ変異体がその細胞から産生されるようなタンパ
ク質産生の条件下で趙養する。大規模な発酵法などの培
養条件は、当業界周知である。細胞は、細胞増殖を促す
炭素、窒素および必須ミネラルの同化性供給源を含有す
る適当な栄養培地中、ｐＨおよび温度の生理学的に適合
し得る条件下で培養すればよい。タンパク質産生の培養
条件は、宿主細胞を形質転換するのに使用するベクター
のタイプに応じて変動する。たとえば、ある種の発現ベ
クターは、プロティンＧまたはプロティンＧ変異体の産
生を招来する遺伝子発現を開始するために、特定の温度
における細胞増殖、または細胞増殖培地に特定の化学物
質を添加することを必要とする調節領域を含んでいる。 このように、本明細書で使用している「タンパク質の産
生条件」なる用語は、ただ１つの培養条件のみを意味す
るものではない。 米国特許第４．６１７．２６６号（１９８６）に記載さ
れている、プロティンＡをコードする遺伝子に従来から
適用されている方法によって、クローン化遺伝子をＢ、
ズブチリスに移入すると都合よい。この方法によれば、
プロティンＧはＢ、ズブチリス内で合成することができ
る。 修飾形態にあるクローン化プロティンＧ遺伝子を有する
Ｅ、ｃｏｌｉ株から産生されたタンパク質のｒｇＧ結合
活性を試験することにより、プロティンＧの機能的に活
性な部分は、反復構造に配置されていた。好ましい態様
として、本発明はさらに、プロティンＧ（プロティンＧ
変異体）の１つまたはそれ以上のＩｇ結合部分をコード
しているクローン化遺伝子、およびそれにより産生され
た、免疫グロブリン結合性を有するタンパク質を提供す
るものである。プロティンＧの活性結合部位をコードし
ている遺伝子の同定および単離の詳細は、以下の実施例
３に記載する。プロティンＧ分子１つ当たりそれぞれ２
個および３個の活性部位をコートしている２つの遺伝子
のＤＮＡ配列、およびそれによってコードされているア
ミノ酸配列は第８図および第９図に示している。この情
報に基づけば、１つまたはそれ以上のプロティンＧ結合
部位を含有するプロティンＧ変異体を調製することがで
きる。特定のアミノ酸配列内に１つから２０個、または
それ以上の活性部位をコードしている合成遺伝子は、既
知の合成方法によって構築することができ、それにより
得られた物質の結合効率、結合能、および特異性はより
高められる。好ましいプロティンＧ変異体は１から１０
個の活性結合部位を含有するものであり、より好ましい
ものは１つの活性結合部位を含有するものである。 本発明は、免疫グロブリン結合性を有するプロティンＧ
変Ｎ体であって、アミノ酸の欠失もしくは置換、または
そのアミノ末端もしくはカルボキン末端において付加ア
ミノ酸を有する変異体をも発明の範囲内に包含するもの
である。 プロティンＧの好ましい形態は、活性部位（Ｂｌおよび
Ｂ２）の上流および下流のコード化配列が欠失されてい
る遺１云子によってフードされたものである。このよう
なコード化配列の欠失に関しては、以下の実施例に詳細
に記載する。 本発明を実施する上で使用することができる、Ｂ１およ
びＢ２ドメインを含有する部分をフードするプロティン
Ｇ変異体（タイプｌ）をコードしている、好ましい態様
としてのクローン化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を有し
ている またはその同義性変異体。 上記の配列から発現されるプロティンＧ変異体タイプＩ
は、以下のアミノ酸配列を有する：１２１１ＪＴマＯＤ
＾ＴＩＣＴＦＴＶＩヒＭＶ Ｉ ｅＶＰＶＡａＬＩ’１
ｋｃｌＪ。 本発明を実施する上で使用可能な、Ｂ１およびＢ２結合
性ドメインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ２）
をコードしている第２のクローン化遺伝子は、以下のＤ
ＮＡ配列を有している：遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を
有しているまたはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第２のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ２は、以下のアミノ
酸配列を有している： またはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第３のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ３は、以下のアミノ
酸配列を有している： 本発明を実施する上で使用可能な、ＢｌおよびＢ２結合
性ドメインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ３）
をコードしている第３のクローン化本発明を実施する上
で使用可能な、Ｂ［およびＢ２ドメインを含有するプロ
ティンＧ変異体（タイプ４）をコードしている第４のク
ローン化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を有している・ま
たはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第４のクローン・化遺伝子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプ４は、以下のアミ
ノ酸配列（これは３ｏアミノ酸の分泌配列を含有してい
ない）を有している・本発明を実施する上で使用可能な
、ただ１つの結合性ドメインＢ２（単一８２結合性ドメ
イン）を含有するプロティンＧ変異体（タイプ５）をコ
ードまたはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第６のクローン化遺（云子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプ６は、以下のアミ
ノ酸配列を有している 本発明を実施する上で使用可能な、単一のＢ２結合性ド
メインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ７）をコ
ードしている第７のりａ−ン化遺伝している第５のクロ
ーン化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を有している またはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第５のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ５は、以下のアミノ
酸配列を有している。 本発明を実施する上で使用可能な、Ｂ１、Ｂｌ／Ｂ２雑
種ドメイン、およびＢ２ドメインを含有するプロティン
Ｇ変異体（タイプ６）をコードしている第６のクローン
化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を宵している： 子は、以下のＤＮＡ配列を有している：またはその同義
性変異体。 上記の配列を有するこの第７のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ７は、以下のアミノ
酸配列を有している： 本発明を実施する上で使用可能な、Ｂ１およびＢ２結合
性ドメインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ８）
をコードしている第８のクローン化遺１云子は、以下の
ＤＮＡ配列を有しているまたはその同義性変異体。 上記０配列を冑するこの第８のクローン化遺（云子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプ８は、以下のアミ
ノ酸配列を有している 本発明を実施する上で使用可能な、ＢｌおよびＢ２結合
性ドメインを含有するプロティンＧ変異体（タイプ９）
をコードしている第９のクローン化遺伝子は、以下のＤ
ＮＡ配列を有している：またはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第１０のクローン化遺伝子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプＩＯは、以下のア
ミノ酸配列を有している：本発明を実施する上で使用可
能な、Ｂｌ’／Ｂ２雑種結合性ドメインを含有するプロ
ティンＧ変異体（タイプ１１）をコードしている第１１
のクローン化遺伝子は、以下のＤＮＡ配列を有している またはその同義性変異体。 上記の配列を有するこの第１１のクローン化遺伝子から
発現されるプロティンＧ変異体タイプｌまたはその同義
性変異体。 上記の配列を有するこの第９のクローン化遺伝子から発
現されるプロティンＧ変異体タイプ９は、以下のアミノ
酸配列を有している。 本発明を実施する上で使用可能な、単一Ｂｌ結合性ドメ
インを含有するプロティンＧ変異体（タイプ１０）をコ
ードしている第１ｏのクローン化遺伝子は、以下のＤ
Ｎ Ａ配列を有している・Ｌは、以下のアミノ酸配列を
有している：「同義性変異体」なる用語は、塩基の置換
を有するが、同一のタンパク質をフードしているＤＮＡ
配列を意味する。 当業者であれば理解されようが、本発明のプロティンＧ
変異体遺伝子は、類似の方法によって、さらに欠失およ
び構造的修飾を行うことができる。 さらには、種々の上流欠失および種々の下流欠失をイン
ビトロで種々組み合わせて組換え、新規な遺伝子構造体
を調製することができ−ることも理解されよう。このよ
うな組換えは、Ｓ ｍａ Ｉ （ａｐｒプロモーターの
上流）、Ｋｐｎ［（ドメインＢ１をコードしている配列
の直ぐ上流）、およびＨｉｎｄｌＩ［（コード化配列の
下流）という唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用
し、Ｓｍａ［−Ｋｐｎｌ断片およびＫ ｐｎ Ｉ −Ｈ
１ｎｄＩ［Ｉ断片を適合させることによって、容易に行
うことができる。このようにして構築した新規な組合わ
せ物は、Ｂドメインをコードしている配列を保持し、し
たがってＩｇＧ結合活性を保持する。さらに、ａｐｒプ
ロモーターおよびシグナルのコード化配列を含有するプ
ラスミドのＳｍａｌ−ＢａｍＨＩ断片は、Ｂ、ズブチリ
ス内における外来性タンパク質の合成および分泌をプロ
モートする活性を示す他のプロモーターおよびシグナル
のコード化配列を含をした類似の断片と置換できること
は、理解されよう。 従来知られている適当なタンパク質の精製方法を使用し
、宿主細胞からプロティンＧ変異体を回収し、精製する
ことができる。要すれば、既知の化学的、物理的および
／または酵素学的手段を用いて細胞を細胞溶解してもよ
い。次ぎに、スジヨークイスト（Ｓｊｏｑｕ ｉｓ ｔ
）らの米国特許第３．８５０．７９８号（１９７４）
に記載されているような固定化免疫グロブリンへの吸着
、イオン交換またはゲルクロマトグラフィー、沈降（た
とえば、硫安を用いた沈降）、透析、濾過、またはこれ
らを組み合わせた方法などの標準的な方法によって、そ
の細胞溶解物からプロティンＧ変異体を精製することが
できる。 「固相支持体」なる用語は、本発明のプロティンＧ変異
体を共有結合または吸着のいずれかによって固定化する
ことのできる支持体を意味する。本発明のプロティンＧ
の固定化に使用することのできる固相支持体には、遊離
形態またはエステル化形態のヒドロキシ基を含有するポ
リマー、たとえば硝酸セルロース、ジアザセルロース、
酢酸セルロース、プロピオン酸セルロースなどのセルロ
ースエステルを包含スるセルロース、アガロース、なら
びにポリアクリルアミドおよびアクリルアミドなどのア
クリルアミドポリマーおよびコポリマー、マイクロタイ
タープレート、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン
、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、寒天、澱粉
、または本発明のプロティンＧ変異体を、固定化できる
活性化剤の残基と化学的に結合した疎水性、微孔性、皮
の無いポリアミド膜からなる広い表面を有する化学的に
活性な膜、があるが、これらに限定されない。デーゲン
（Ｄｅｇｅｎ）らの米国特許第４．６９３．９８５号（
１９８７）を参照のこと。 本発明のプロティンＧ変異体は、当業界既知のタンパク
質固定化法によって固相支持体に固定化することができ
る。たとえば、プロティンＧ変異体は、共有結合または
吸着によって固相に被覆または結合することができる。 固相支持体にタンパク質を固定化する方法は、たとえば
米国特許第３゜６５２、７６１号、第３．８７９．２６
２号、第３．９８６．２１７号、および第４．６９３．
９８５号に教示されている。本出願では、実施例１５お
よび１７を参照のこと。好ましくは、プロティンＧ変異
体の固定化は、トレシル活性化または臭化シアン活性化
アガロースに行う。 プロティンＧ変異体が１つまたはそれ以上のシスティン
残基を含む場合、好ましいプロティンＧ変異体の固定化
法は、それをマレイミド活性化アガロース支持体に結合
させることである。この支持体は、１級アミノ基を含有
するよう修飾したアガロース（具体的にはＡＨ−セファ
ロース、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏ、）
）をスルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）ブチレートで処理することによって調製するこ
とができる。次いで、得られた活性化ゲルをプロティン
Ｇ変異体で処理し、固定化プロティンＧ変異体の生成物
を得る。 実施例１７に記載しているように、マレイミド活性化セ
ファロース誘導体を使用してシスティンを含有する変異
体を固定化すると、予想外に高いレベルのタンパク質の
固定化、および予想外に高いＬ／４／Ｌ／（７） Ｉ
ｇ結合ｆＬ 特にマウスモノクローナル抗体との高いレ
ベルの結合性が達成される。プロティンＧ変異体がシス
ティン残基を含有しない場合は、トレシル活性化アガロ
ースに結合させてプロティンＧ変異体を固定化するのが
好ましい方法である。 本発明の固定化プロティンＧ変異体は、ＩｇＧまたはそ
のフラグメントを分離または結合するのに使用すること
ができる。意外にも、本発明者は、特定の固定化プロテ
ィンＧ変異体が予想外の結合性プロフィルを示すことを
発見した。詳細には、固定化した単一ドメインの変異体
が、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｔフラグメントよりもＩ
ｇＧおよびＦｃフラグメントとより良好に結合すること
を発見したのである。したがって、これらの固定化変異
体は、ＩｇＧおよびＦｃフラグメントをＦａｂおよびＦ
（ａｂ’ ）、フラグメントから分離するのに有用で
ある。 本発明の固定化単一ドメインプロティンＧ変異体は、Ｆ
ａｂまたはＦ （ａｂ’ ）、フラグメントをＩｇＧお
よびＦｃフラグメントから分離するための方法てあって
、 （ａ）Ｆｃフラグメント、ＩｇＧおよび少なくとも１つ
のＦａｂまたはＦ （ａｂ’ ）２フラグメントを含有
する試料を、固相支持体に固定化した単一ドメインのプ
ロティンＧ変異体と接触させ、 （ｂ）工程（ａ）で得られた固相支持体をｐ Ｈ５から
８の緩衝液で洗浄し、溶出液にＦａｂおよびＦ（ａｂｏ
）、フラグメントを溶出させると共に、Ｆｃフラグメン
トおよび［ｇＧが結合した固相支持体を得る ことを特徴とする方法に使用することができる。 ｐＨ５から８の緩衝液の例としては、リン酸、トリス、
ホウ酸および重炭酸緩衝液が挙げられる、これらに限定
されない。 次ぎに、固定化プロティンＧ変異体に結合したＦｃフラ
グメントおよびＩｇＧを回収するには、（Ｃ）工程（ｂ
）で得られた固相支持体をｐ Ｈ３。 ５から２．４の緩衝液で洗浄し、Ｆｅフラグメントおよ
びＩｇＧを溶出させればよい。 ｐＨ３，５から２．４の緩衝液の例としては、酢酸、ク
エン酸およびグリシンが挙げられるが、これらに限定さ
れない。 より詳細には、アガロースに固定化したタイプ５のプロ
ティンＧ変異体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）。 フラグメントとは殆どまたはまったく親和性を示さない
が、ＩｇＧおよびＦｃフラグメントとは堅く、かつ可逆
的に結合する。ｐＨ約５から８ではＩｇＧおよびＦｅフ
ラグメントは結合するが、ＦａｂおよびＦ （ａｂ’
）２フラグメントは結合しない。ＩｇＧおよびＦｃフラ
グメントは、ｐＨを約３４５から２４に低下させれば溶
出させることができる。 本発明者らはさらに、アガロースに固定化された単一ド
メインプロティンＧ変異体タイプ１０がＩｇＧと不可逆
的に結合しくこのＩｇＧは、溶出液のｐＨを低下させて
も溶出することができない）、ＦａｂおよびＦ （ａｂ
’ ）２とはｐＨ５から８で少ない量で結合し、そして
Ｆｃとは結合することを発見した。たとえば、ｐ Ｈ５
から８においてＦｅが結合されるが、ｐＨを３．５から
２．４に低下させれば、溶出させることができる。 固定化タイプ１０変異体は個々の標的分子に特異性を示
すＴｇＧと不可逆的に結合するため、それに固定化され
たタイプｌＯ変異体は、アフィニティークロマトグラフ
ィーに使用することができる。この態様における本発明
では、標的分子に特異的なＩｇＧに結合するその標的分
子は、得られた固相をｐＨ３，５から２．４の緩衝液で
洗浄することにより、ＩｇＧを溶出することなく、選択
的に溶出することができる。 この目的において本発明は、標的分子のアフィニティー
クロマトグラフィーの方法であって、（ａ）標的分子に
特異的なＩｇＧを含有する第１の試料を、プロティンＧ
変異体タイプ１０が固定化された固相支持体と接触させ
、その固相支持体に不可逆的に結合された［ｇＧを得、 （ｂ）標的分子を含有する第２の試料を、工程（ａ）に
より得られた、標的分子に特異的なＩｇＧが固定化され
た固体支持体と接触させ、 （Ｃ）工程（ｂ）により得られた同相支持体をｐＨ５か
ら８の緩衝液で洗浄し、結合しなかった溶質を溶出させ
、 （ｄ）工程（Ｃ）により得られた固相支持体をｐＨ３，
５から２４４の緩衝液で洗浄し、標的分子を溶出させる ことを特徴とする方法を提供する。 標的分子に特異的なＩｇＧ抗体は、当業者に既知の方法
によって得ることができる。抗体の調製方法については
、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）らのＮａｔｕｒｅ ２５６
：４９５（１９７５）を参照のこと。 本発明者らはさらに、アガロースに固定化された雑種単
一ドメインプロティンＧタイプ１１変異体がｐＨ５から
８において中等度でＩｇＧに結合し、ｐＨ６から８でＦ
ａｂにそれよりも少ない量で結合し、そしてＦｃに結合
することを発見した。 たとえば、ｐ ＋（５から８では、Ｆｃフラグメントを
結合できるが、ｐＨを３．５から２，４に低下すれば溶
出させることかできる。 本発明者らは、固相支持体に固定化されたプロティンＧ
変異体タイプ１１を使用することによって、ＩｇＧの種
々のサブクラス、たとえばＩｇＧ１．ＩｇＧ２、ｌ ｇ
ｃ ３およびＩｇＧ４を分画てき、単離することができ
ることを予期せず発見した。 この態様において、本発明は、ＩｇＧの種々のサブクラ
スを分画するための方法であって、（ａ）少な（とも２
つのサブクラスのＩｇＧを含有する試料を、固相支持体
に固定化されたプロティンＧ変異体タイプ１１を含有す
るカラムの上部に適用し、 （ｂ）ｐＨ８から２．４の緩衝液の連続または不連続グ
ラジェントでカラムを溶出し、 （ｃ）ＩｇＧサブクラスを含有する溶出液の分画を採取
する、 ことを特徴とする方法を提供するものである。 種々のＩｇＧサブクラスは、当業界既知の方法によって
溶出液中に検出することができる。たとえば、ＩｇＧサ
ブクラスは、市販されているアイソタイピング・キット
しアメルシャン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を使用し、また
はＥＬＩＳＡもしくは免疫拡散検定法によって検出する
ことができる。 ｐＨ８から２４４のグラジェントに使用できる緩衝液と
しては、たとえば酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グ
リシンおよびホウ酸緩衝液があるが、これらに限定され
ない。 本発明者らはまた、システィンを含有するプロティンＧ
変異体をマレイミド活性化アガロースに固定化させた場
合、ＩｇＧおよびそのフラグメントに対する高い結合能
が達成されることを発見した。この目的に照らし、本発
明は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）、フラグメントをＩｇ
ＧおよびＦｅフラグメントから分離するための方法であ
って、 （ａ）Ｆｃフラグメント、ＩｇＧおよび少なくとも１つ
のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）ｔフラグメントを含有する
試料を、マレイミド活性化アガロースに固定化した少な
くとも１つのシスティン残基を含有するプロティンＧ変
異体と接触させ、 （ｂ）工程（ａ）で得られたアガロースをｐＨ５から８
の緩衝液で洗浄し、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）、フラグ
メントを溶出させると共に、ＦｃフラグメントおよびＩ
ｇＧか結合したアガロースを得ることを特徴とする方法
を提供するものである。 本発明は一般に、ＩｇＧを、天然で付随する不純物から
分離するための方法をも提供するものである。この目的
について、本発明は、天然で付随する不純物からＩｇＧ
を分離するための方法であって、 （ａ）ＩｇＧを含有するの試料を、固相支持体に固定化
されたプロティンＧ変異体と接触させ、（ｂ）工程（ａ
）により得られた固相支持体をｐＨ５から８の緩衝液で
洗浄し、不純物を溶出させ、固相支持体に結合したＩｇ
Ｇを得、 （Ｃ）工程（ｂ）により得られた固相支持体をｐＨ３４
５から２．４の緩衝液で洗浄し、天然で付随する不純物
を含まない溶出液中にＩｇＧを得ることを特徴とする方
法を提供する。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、これ
らは本発明の範囲の限定を意図するものと解してはなら
ない。 実施例１ ストレプトコッカス・ランスフィールドグループＧを病
院から人手し、臨床単離物から１１個の独立した菌株単
離体を誘導した。各菌株を以下のコロニー免疫検定法に
したがい、ＴｇＧとの結合能について試験した。ニトロ
セルロースのシートおよび（上層）酢酸セルロースのシ
ートを重層したし一ブロス寒天平板（免疫検定用平板）
上で画線培養した。得られた平板を３７℃でインキコベ
ートし、細菌コロニーを酢酸セルロースシート上で視覚
化した。 次いで、ニトロセルロースシートを平板かう取り出し、
以下のような免疫化学的方法でＩｇＧ結合タンパク質を
その平板上に検出した：そのシートをまずウシ血清アル
ブミン（トリス−食塩水中３０％ｗ／ｖ； Ｏ，ＯＩＭ
トリスートＩＣ（ｌ ｐ）（８，０および０．１５
Ｍ ＮａＣＱを含有）で処理し、以後の工程においてニ
トロセルロースとの抗体の非特異的結合性を最小に抑え
るため、ニトロセルロース部位を阻害した。次いで、そ
のシートを２３６Ｃで１時間、正常ウサギ血清（３，０
％ｗ／ｖウシ血清アルブミンを含有するトリス−食塩水
で１：１０００に希釈）で処理し、次いでペルオキシダ
ーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（同様に希釈）、最後に４
クロロ−１−ナフトール（０，６ＩＩＩｇ／ａＱ）およ
び過酸化水素（０，２容量メタノールを含有するトリス
食塩水中、０．０６％ｗ／ｖ）で処理し、インキュベー
ト工程間にはシートをトリス−食塩水で洗浄した。ニト
ロセルロースシート上の青色スポットは、ＩｇＧ結合性
タンパク質が存在することを示すものであり、青い領域
は、ＩｇＧ結合性タンパク質を産生ずる細菌コロニーに
相当する。 ９個の菌株が陽性、すなわち程度は異なるがＩｇＧと結
合していることが見いだされた。次ぎに、以下の血液凝
集試験を行うことで、幾つかの菌株を［ｇＧ３との結合
能について試験した。アドラ−（Ａｄｌｅｒ）およびア
ドラーのＭｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏ１、 ７０ ：４５
５−４６６（１９８０）にだいたい記載されているよう
にして、ヒツジ赤血球細胞（ＲＢＣ）［カペル・ラボラ
トリーズ（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
、マルベルン、ペンシルバニア］を免疫グロブリンで被
覆した。ＲＢＣをリン酸緩衝化食塩水（Ｐ Ｂ Ｓ、
８．４ ｇ／ Ｑ ＮａＣＱ、 １．１ ｇ／＆ Ｎａ
２ＨＰＯ，、および０．２７ ｇ／ＱＮａＨ，ＰＯ４を
含有）で洗浄し、３７°Ｃで１５分間、ＰＢＳ中゛中度
濃度２Ｒｇ／ｗｅのタンニン酸溶液で処理した。細胞を
遠心して回収し、（ａ）全ヒト免疫グロブリンＧ（シグ
マ・ケミカル、カンパニー、ルイス、Ｍｏ、から人手）
もしくは（ｂ）ＩｇＧ３骨髄腫タンパク質のいずれかを
濃度０．２ｍｇ／ｘＱで含有するＰＢＳ、または（ｃ）
ＰＢＳのみに再懸濁した。３７６Ｃで３０分間インキュ
ベートした後、ＲＢＣを遠心によって回収し、ＰＢＳで
洗浄した。血球凝集検定のため、多つェル皿の円錐形ウ
ェル中で、被覆化ＲＢＣの１％懸濁液５０μｅを、ＰＢ
Ｓで連続希釈した試験細胞エキス５０μＱと混合した。 凝集しないＲＢＣはウェルの底に沈澱して小さなペレッ
トとなり、他方、凝集したＲＢＣはより分散した沈澱物
をウェルの壁に形成する。 ストレプトコッカス株の陽性グループＧはそれぞれ、プ
ロティンＧ産生株から抽出した非分画化ＩｇＧで被覆し
た赤血球と同様の効率で、ＩｇＧ３彼覆化赤血球を凝集
した。これとは対照的に、プロティンＡを産生ずる菌株
であるストレプトコッカス・アウレウス コーワン■の
細胞は、非分画ｒｇＧで被覆された赤面法細胞を凝集し
たが、ＩｇＧ３被覆細胞に対しては予想通り全く活性を
示さなかった。ＰＢＳのみでインキュベートした赤血球
、すなわち非被覆赤血球細胞は凝集されなかった。 次いで、ストレプトコッカス単離体の培養物から得た上
清分画および細胞エキスについて、同一の凝集試験を行
い、単離体がＩｇＧ結合活性について異なる局在性を有
しているのを見いだした。 活性が結合細胞に優勢であることを示している菌株があ
れば、培養上清に優勢な活性を示す菌株もあり、またそ
の中間を示す菌株もあった。ＩｇＧ結合活性の異なる局
在化を示す３つの菌株をＤＮＡの供給源として選択し、
プロティンＧ遺伝子をクローニングした。 各菌株から得た細胞を、２０ｍＭ Ｄ、Ｌ−）レオニン
を含有するトッドーホイット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ
）ブロス［フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉ
ｓｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リッチモンド、Ｖ
ａ］２５０ｉ（！中で培養した。培養４時間後、グリシ
ンを培養培地中５％ｗ／ｖの終濃度で加えた。細胞密度
について、６００ ｎｒａにおける吸光度が約０．５か
ら１．０になった、培養５時間後に、遠心によって細胞
を採取した。細胞ベレットをＰＢＳで洗浄し、次いで液
体窒素で凍結して一７０°Ｃで保存した。解凍後、得ら
れた細胞を、５ｘｇ／ｉ＆ ミュータノリシン（ｍｕｔ
ａｎｏｌｙｓ ｉｎ） ［シグマ・ケミカル、カンパニ
ーから市販されている］２００μρを加えておいた０、
５Ｍショ糖を含有するＳ７培地〔バサンザ（Ｖａｓａｎ
ｔｈａ）およびフリース（Ｆｒｅｅｓｅ）のＪ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １４４：１１１９−１１２５（＋
９８０）］で洗浄した後、それと同じ培地ＩＣＪｙｔり
に再懸濁した。３７°Ｃで４５分間インキュベートした
後、得られたプロトプラストを遠心によってペレ・ノド
化し、次いで１００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、ｌ
５０ｍＭ ＮａＣ（！、および０，５μｇ／ｍＱプロテ
イナーゼＫを含有する溶液中に再懸濁することにより浸
透圧的に細胞溶解した。３７°Ｃで５５分間インキュベ
ートした後、α−トルエンスルホニル・フルオライド（
これはフェニルメタンスルホニル・フルオライドまたは
ＰＭＳ Ｆとも呼ばれ、たとえばシグマ・ケミカル、カ
ンパニーから市販されている）を終濃度２ｍＭで加え、
得られた混合物を７０°Ｃで１５分間インキュベートし
、プロテイナーゼＫを不活化した。細胞溶解物ヲクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４１）で３回抽出し
、さらに除タンパクし、その水相に等量のイソプロパツ
ールを加え、ＤＮＡを沈澱させた。 沈澱したＤＮＡをスプールの巻き上げにより採取し、次
いで７０％エタノールで洗浄して減圧下に乾燥した。 得られたＤＮＡペレット（各３菌株から得た）を０、Ｏ
ＩＭ トリス−ＨＣ（ｌ ｐＨ７，８／１ｍＭ ＥＤ
ＴＡｌｏ、０５Ｍ ＮａＣＱ溶液０．５ｉ＆にそれぞれ
懸濁した。１００ｍＭ トリス−ＨＣρｐ Ｈ７。 ８．１５０ｍＭ ＮａＣｌ２および１０ｍＭ ＭｇＣＱ
２を含有する緩衝液１００μσ中に懸濁したＤＮＡ２５
μＱに２単位のＭｂｏｒを加えることにより、この単離
した染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＭｂｏｌ（
市販品）で部分消化した。得られた反応混合物を３７°
Ｃで１３分間インキュベートした後、７０°Ｃで１０分
間インキュベートした。消化ＤＮＡを０．８％アガロー
スゲルの電気泳動に１５時間かけた（０．３５ボルト／
Ｃ１１）。得られたゲルから約４から９キロ塩基対（ｋ
ｂｐ）の長さのＤＮＡ断片を含有するゲル切片を切除し
、ＤＮＡを回収するため粉砕した。等容量の水−飽和フ
ェノールをその粉砕ゲルに加え、得られた混合物を一７
０’Ｃで１時間凍結した。事前に解凍することなく、エ
ッベンドルフ遠心器により、混合物を室温で１５分間遠
心し、得られた水相を等量のフェノールで２回、等量の
フエ／−ル／クロロホルム／イソアミアルコール（２５
’：２４：１）で１回抽出した。２．５容量の９５％エ
タノール、および担体としてグリコーゲン３０μｇを加
えることにより、ＤＮＡを水相から沈澱させた。 染色体ＤＮＡ断片を挿入するクローニングベクターは、
第１図に示すプラスミドｐＧＸ１０６６であった。この
プラスミドは、クローン化するＤＮＡ断片の挿入に有用
である近接した制限エンドヌクレアーゼ認識部位群のバ
ンク（銀行）を含有している。このクローニング部位の
バンクは２つの転写ターミネータ−によって画されてい
る。プラスミドｐＧＸ１０６６により形質転換された菌
株ＧＸ１１７０を構成するＥ、ｃｏｌｉ菌株ＧＸ１１８
６は、Ｎｏ、３９９５５の下にＡＴＣＣに寄託されテイ
ル。ブ５スミ）’ｐＧＸ１０６６ＤＮＡ３μｇを制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨ［（市販品を入手し、取り扱
い説明書にしたがって使用した）で部分消化した。次い
で、消化したプラスミドＤＮＡを１単位の子ウシ腸内ア
ルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイムから
入手し、取り扱い説明書にしたがって使用した）で３７
℃、３０分間処理した。得られた反応混合物をフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４
：１）で抽出した後、０．１容量２Ｍ酢酸ナトリウム、
１０ｍＭＥＤＴＡおよび２，５容量９５％エタノール、
および担体としてグリコーゲン１０μｇを加えてＤＮＡ
を沈澱させた。次いで、ｐＧＸ１０６６ベクターＤＮＡ
（ＢａｎＨＩ消化およびリン酸化処理した）０．５μｇ
を、上記のように調製したＭｂｏ［部分消化したストレ
プトフッカス染色体ＤＮＡ０．２μｇに連結した。反応
混合物１０μＣにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（市販品を得
、取り扱い説明書にしたがって使用した）Ｉ単位を含有
させ、４℃で２０時間インキュベートした。 Ｅ、ｃｏｌｉ Ｓ Ｋ ２２６７ （Ｅ、ｃｏｌｉジェ
ネティソク・ストック・センター、エール大学＋ ニュ
ー・ヘブン、Ｃｏｎｎ、から入手したＦ”−ｇａｌ ｔ
ｈｉ Ｔ １ ’ ｈｓｄＲ４ｃｎｄＡ ５ｂｃＢ １
５）細胞を標準的な塩化カルシウム処理によって形質転
換に対して受容性（コンピーテント）にし、得られた感
応細胞０．２５＋ａを、標準的な形質転換法にしたかっ
たライゲーションｌ昆合物２０μσと混合した［レダー
ベルブら（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ）
のＪ、 ｌ３ａｃｔｅｒｉｏ１．１１９：１０７２−＋
０７４（１９７４）］。次いで、得られた細胞を遠心に
よってペレｙト化し、Ｌブロス０．３ｍρに再懸濁した
。次いで細胞０．１；ｎＱを、ニトロセルロースのシー
トおよび（上層）酢酸セルロースのシートを重層してお
いた１００μｇ／ｘＱアンピシリンを含有する３つのし
ブロス寒天平板（免疫検定用平板）のそれぞれにプレー
トした。この平板を３７００でインキュベートし、細菌
コロニーを酢酸セルロースノート上に視覚化した。 次いで、その平板からニトロセルロースシートを取り出
し、シート上においてＩｇＧ結合性タンパク質を既述の
免疫化学的方法によって検出した。 まず、そのシートをウシ血清アルブミン（トリス食塩水
中３４０％Ｗ／Ｖ）で処理してニトロセルロース部位ヲ
阻害し、以後の工程においてニトロセルロースとの抗体
の非特異的結合性を最小に抑えた。 次いで、そのシートを２３°Ｃで１時間、３．０％Ｗ／
Ｖつ／血清アルブミンを含有するトリス−食塩水でｌ：
１０００に希釈した正常ウサギ面請で処理し、次いでペ
ルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（同様に希釈）
で処理し、最後に４−クロロ−１−ナフトール（０，６
＋ｇ／ｚのおよび過酸化水素（０，２容量メタノールを
含有するトリス−食塩水中、０．０６％Ｗ／Ｖ）で処理
し、インキュベート工程間にシートをトリス−食塩水で
洗浄した。 １つの陽性コロニーを同定し、ストレブトフ。 カス株ＧＸ７８０９（クローニング用にＤＮＡを単離し
た３つのストレプトコッカス株のうちの１つ）から誘導
された形質転換体を含有する平板上に置いた。陽性コロ
ニーを免疫検定用平板（上記のように１００μｇ／ｘσ
アンピシリンを含有）上に画線培養し、精製された形質
転換株を得た。ニトロセルロースシートを上記のように
加工したが、数百の陰性コロニーの中に数個の陽性コロ
ニーしか見いだせなかった。最初の形質転換体は明らか
に不安定であるので、再画線培養を繰り返すと、数百の
陰性コロニーの中に１個の陽性コロニーしか見いたせな
かった。もう１同温画線培養すると、殆ど陽性を示すコ
ロニーを含有する平板が得られた。明らかに最初の陽性
形質転換体よりも安定である誘導体の陽性コロニーの１
つを単離し、それをＥ 、 ｃｏｌ ｉ株ＧＸ７８２０
と命名した。Ｅ、ｃｏｌｉＧＸ７８２０の試料は、メリ
ーランド、ロックビレにあるアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ５３４６０の
下で寄託されている。 最初の陽性コロニーに加え、コロニーと相関することが
できない、小さいが強い陽性のスポットが幾つか観察さ
れた。これらのスボ／トは、再度の画線培養では陽性の
後代菌を産しなかった。 標準的な方法を使用し、Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ ７８２０
からプラスミドＤＮＡを単離し、得られたプラスミドＤ
ＮＡを制限分析、次いでゲル電気泳動によって分析した
。菌株は、２つのタイプのプラスミドを含有しているこ
とが判明した。一方のプラスミド（ｐＧＸ１０６６Ｘと
命名）は明らかにｐＧＸ１０６６クローニングベクター
と同サイズであり、他方（ｐＧＸ４５３０と命名）は１
ｌｋｂｐの挿入体を含有するｐＧＸ１０６６であること
は明らかであった。次いで、受容性Ｅ、ｃｏｌｉ ５Ｋ
２２６７細胞を、ＧＸ７Ｂ２０から単離したプラスミド
混合物で再度形質転換し、得られた形質転換体を１００
μｇ／ｙｘＱ、アンピシリンを含有する免疫検定用平板
上で選択した。２つのタイプの陽性形質転換体が得られ
た。大部分は小さいが強い陽性コロニーであり、その殆
どは増殖することができなかった。少数のコロニーは、
より正常なサイズであり、かつより容易に増殖し得るも
のである点からＧＸ７８２０に類似していた。これらの
結果の原因を究明するため、下記のように、受容性Ｅ、
ｃｏｌｉ ５Ｋ２２６７細胞をさらにゲル精製プラスミ
ドで形質転換した： 形質転換Ａ：ｐＧＸ４５３０単独 形質転換Ｂ：ｐＧＸ１０６６Ｘ単独 形質転換Ｃ：ｐＧＸ４．５３０およびｐｃｘｉ。 ６６Ｘの混合物 得られた結果は以下のようであった： 形質転換Ａ：小さいが強い陽性コロニーであり、その殆
どは増殖することができなかった。 形質転換Ｂ：形質転換体は得られなかった。 形質転換Ｃ：小さいが強い陽性の非増殖性コロニー（形
質転換Ａに類似）であり、その陽性コロニーの約２０％
はＧＸ７８２０に類似し、すなわち正常サイズの増殖可
能なものであった。 幾つかの小さ・いが強い陽性コロニーを上記の再形質転
換平板から選択しくすなわち、ｐｃｘ １０６６Ｘおよ
びｐＧＸ４５３０の混合物を含有するＧＸ７８２０株か
ら得た非分画化プラスミド調製物で形質転換したＥ、ｃ
ｏｌｉである形質転換体）、再画線培養して増殖可能な
菌株を単離した。２つの菌株からプラスミドＤＮＡを単
離し、両者共にｐＧＸ１０６６Ｘヘルパープラスミドを
喪失していたことが見いだされた。１つの菌株（Ｅ、ｃ
ｏｌｉＧＸ７８２３と命名）は、ｐＧＸ４５３０内で見
いだされる１ｌｋｂｐ挿入体内で約２ ｋｂ＋）の欠失
か起こっているプラスミドｐ Ｇ Ｘ ４５３３を含有
していた。Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ ７８２３の試料は、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番
号ＡＴＣＣ５３４６１の下で寄託されている。第２の菌
株（Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ ７８２２と命名）は、ｐｃＸ
４５３３内の欠失部の一端に非常に近接した部位で、最
初の１ｌｋｂｐ挿入体内に挿入された未同定の付加的な
３ ｋｂｐＤ Ｎ Ａを獲得しているプラスミドｐＧＸ
４５３２を含有していた。 Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ７８２３（ｐＧＸ４５３３を含有）
およびＥ、ｃｏｌｉ ＧＸ７８２０（ｐＧＸ４５３０を
含有〉菌株を、アンピンリンを加えたし一グロス中で培
養した。遠心によって細胞をペレット化し、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ ｐＨ８，０および２ｍＭＰＭＳＦを含有する
緩衝液中、０．５ｘｇ／Ｊ リゾチームの存在下に３７
°Ｃで３０分間インキュベートすることによって細胞溶
解した。スチニーダー（Ｓｔｕｄｉｅｒ）のＪ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏ１、 ７９ ：２３７−２４８（１９７３
）に記載されている緩衝液中、１．００℃に５分間加熱
することにより、電気泳動用の抽出物試料を調製し、そ
の試料をスチューブ−（前掲）に記載のように１２．５
％アクリルアミド−３ＤＳゲルの電気泳動にかけ、タン
パク質を分離した。標準的な電気泳動法（ウェスターン
・ブロッティング）により、タンパク質バンドをゲルか
らニトロセルロース紙に移シた。次いで、そのニトロセ
ルロースをＢＳＡ、正常ウサギ直情、ペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗ウサギ■ｇＧ、および過酸化水素を加えた４
−クロロ−１−ナフトールと共に（連続して）インキュ
ベートした（上記の免疫化学的方法におけるニトロセル
ロース処置と同じ方法である）。両菌株は、約９０．０
００から約３０，０００の分子量に相当する移動度を示
し、５７．０００に主要バンドを有する同一の■ｇＧ結
合性タンパク質のバンドを示すことが見いだされた。 プラスミドｐＧＸ４５３３を制限分析に供したので、そ
の部分的な制限地図を第２図に示す。 本線は、ベクター（ｐＧＸ １０６６）の配列を表し、
斜線部は、そのプラスミドベクターに挿入された、プロ
ティンＧ遺伝子を含有するＤＮＡを表している。 挿入体内の１．９ ｋｐｂ Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片をｐＧ
Ｘ１０６６にサブクローンし、得られた組換えプラスミ
ド（ｐＧＸ４５４７）をＥ、ｃｏｌｉに導入した。この
形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ ７８４１ ）から産
生されるタンパク質のウェスターン・プロッティングを
既述のように行うと、主要な５７，０００のバンドを含
む同一のＩｇＧ結合性タンパク質のバンドが示された。 得られた形質転換体もまた既述のように血球凝集検定に
より分析した。この形質転換体の抽出物は、ＩｇＧ３（
ヒト骨髄腫タンパク質）および非分画化ヒトＩｇＧで被
覆した、タンニン酸処理したヒツジ赤血球を凝集したが
、非被覆化赤血球は凝集しなかった。プロティンＡ産生
Ｅ、ｃｏｌｉ株由来の抽出物は、非分画化ＩｇＧで被覆
した赤血球を凝集したが、ｒｇＧ３被覆化赤面球または
非被覆化赤血球を凝集しなかった。プロティンＡまたは
プロティンＧのいずれも産生じない対照Ｅ 、 ｃｏｌ
ｉ株は、いずれの赤血球試料も凝集しなかった。 これらの結果は、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＧＸ７８４１、ＧＸ７
８２０、およびＧＸ７８２３が、プロティンＧの特徴で
ある性質を有するＩｇＧ結合性タンパク質を産生ずるこ
とを証明するものである。 実施例２ ＤＮＡおよびアミノ酸配列のデータ クローン化遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。この配列を
そのＤＮＡ配列によって特定されるアミノ酸配列と共に
第３図に示す。第３図のデータは、既述のような、クロ
ーン化プロティンＧ遺伝子を含有するＩ 、 ９ ｋｐ
ｂ Ｈ１ｎｄｆｆｌ断片の全体についてのらのである。 遺伝子コードの同義性から、本遺伝子のヌクレオチド配
列は実質的に変わり得ることは理解できるであろう。た
とえば、この遺伝子の一部または全部は化学的に合成し
、第３図に示した配列とは異なるヌクレオチド配列を有
するＤＮＡを得たとしても、適切なコドン−アミノ酸の
帰属が行われている限り、アミノ酸配列は保持されるで
あろう。 プロティンＧ遺伝子のヌクレオチド配列およびそのタン
パク質のアミノ酸配列は確立されているか、本発明の遺
伝子は特定のヌクレオチド配列に限定されるものでなく
、遺伝子コードによって許容されるすべてのその変異体
を包含するものである。 本発明のプロティンＧタンパク質は第３図に示した正確
なアミノ酸配列を有するタンパク質に限定されない。第
３図に示した配列中に欠失または置換を包含するタンパ
ク質、またはタンパク質のアミノもしくはカルボキシ末
端に付加的なアミノ酸を有するタンパク質も、既述のよ
うな、そのタンパク質がプロティンＧの所望のＩｇＧ結
合性を保持している限り、本発明の範囲内に包含される
。 これらのアミノ酸配列の変動は、たとえば遺伝子の化学
的合成、または既知のインビトロ突然変異法によって行
うことができる。 第３図には以下の略語を使用している：Ａ＝デオキシア
デニル、 Ｔ＝チミジル Ｇ＝ニブオキシグアニル Ｃ−デオキシシトシル ＧＬＹ＝グリシン、 ＣＹＳ＝システィン、Ａ
ＬＡ＝アラニン、 ＭＥＴ＝メチオニン、Ｖ Ａ
Ｌ ＝バリン、 ＡＳＰ＝アスパラギン酸
、ＬＥＵ＝ロイシン、 ＧＬＵ＝グルタミン酸
、ＩＬＥ＝インロイシン、 ＬＹＳ＝リジン、５Ｅ
Ｒ−セリン、 ＡＲＧ＝アルギニン、Ｔ Ｈ
Ｒ＝スレオニン、 ＨｒＳ＝ヒスチジン、ＰＨＥ
−フヱニルアラニン、ＰＲＯ＝７’ロリンＴＹＲ＝チロ
シン、 ＧＬＮ＝グルタミン、ＴＲＰ＝Ｉ−リブ
トファン、 ＡＳＮ＝アスパラギン実施例３ ＩｇＧ結合活性に関与しているプロティンＧ分子部分の
同定 欠失した修飾形態のクローン化プロティンＧ遺伝子を有
するＥ、ｃｏｌｉ株から産生されるタンパク質のＩｇＧ
結合活性を試験すると、その活性はアミノ酸残基２２８
から３５２の間の反ＩＮ配列に位置していた（第８図）
。Ｂ１およびＢ２領域のアミノ酸配列は、それぞれ５５
個の対応部分のうち４９個が同一であった。 プロティンＧの全コード化配列を含有する、第２図に示
した１ 、 ９ ｋｐｂ Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ断片をまず始
めにストレプトコッカスＧＸ７８０９から単離し、それ
をバクテリオファージＭ１３＋＋ｐ９にサブクローンし
た［メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ）、 Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ。 １、１０１：２０（１９８３）］。ブラフ、 ミＦｐＧ
Ｘ４５４７をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ［で消化
し、同様に２本鎖の謹製型のバクテリオファージＭ１３
ｍｐ９ＤＮＡも消化した。これも、ＨｉｎｄＩ［Ｉでの
消化の間、子ウシアルカリホスファターゼ（１５μＣ中
２単位）で処理し、本ベクターの再環状化を防止した。 フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた後、得ら
れた２つの消化ＤＮＡ調製物を混合し、ライゲーション
条件下でＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。連
結したＤＮＡＸＩＩ製物をＥ 、 ｃｏｌ ｉ株ＧＸ
１２１０（Ｆ’ ｔｒａＤ ３６ ｐｒｏＡ＋Ｂ ＋
ｌａｃ Ｉ ｑ／ｄｅｌｔａ−１ａｃＺ Ｍ ｌ ５
ｄｅｌｔａ−（ｌａｃ−ｐｒｏ）ｓｕｐＥ ｔｈｉ ｚ
ｉｇ：：Ｔｎｌ ＯｈｓｄＲ２）にトランスフェクトし
た。プラーク由来のトランスフェクト細胞をコロニー免
疫検定法によってプロティンＧの産生に関してスクリー
ニングした。陽性の検定応答を示した１つをｍＧＸ４５
４７と命名し、それは第５図に示した部分的制限地図を
有することが判明した。 ｍＧＸ４５４７に感染されたＥ、ｃｏｌｉから単離した
２本鎖の複製型のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｓｔｌ
で消化した。フェノールで抽出し、エタノール沈殿した
後、得られた消化ＤＮＡを、希釈溶液（１ｙ（ｌ当たり
消化ＤＮＡ約５μｇ）中、ライゲーション条件下で、Ｄ
Ｎ Ａ ＩＪガーゼと共にインキユベートした。次い
で、再連結ＤＮＡ調製物をＥ、ｃｏｌｉ ＧＸ １２１
０にトランスフェクトした。 １Ｖ製型ＤＮＡを、幾つかのプラーク由来の感染細胞か
ら調製し、コロニー免疫検定法によってＩｇＧ結合性タ
ンパク質の産生について、その同一の感染細胞を検定し
た。制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌを用いたＲＦ
ＤＮＡの分析によって、幾つかのクローンは第５図およ
び第６図に示した２１０ｂｐおよび４１５ｂｐ Ｐｓｔ
ｌ断片を共に喪失していることが見いだされた。これら
のクローンは、コロニー免疫検定で示されるように、活
性なＩｇＧ結合性タンパク質をなんら産生じなかった。 これらのクローンから産生された切頭（トランケート）
タンパク質はＢ１構造の部分しか含有しておらず、Ｂ１
に近接するアミノ酸配列をすべて欠いていると予想され
よう。 上記のトランスフェクションにより得られたクローンの
１つは、コロニー免疫検定によって陽性の結果を示した
。このクローン由来のＲＦ ＤＮＡの制限分析により
、ファージＤＮＡは４１５ｂｐＰｓＬＩ断片を欠いてい
るが、２１０ｂｐ断片は保持していることが判明した。 さらに、臭化エチジウム染色のアガロースゲル電気泳動
上における２１０ｂｐＰｓｔｌ断片の相対的強度は、そ
のＤＮＡが２ｉｏｂｐ断片の２つのコピーを有している
ことを示唆するものであった。ＤＮＡの配列決定により
、このファージＤＮＡ（ｍＧＸ７８８０）の構造は第６
図に示されているものであることを確認した。このファ
ージＤＮＡ上にあるプロティンＧ遺伝子によってコード
されているタンパク質は、Ｂ構造の２つの完全なコピー
、すなわち無傷のＢ１配列、次にＢ１およびＢ２のキメ
ラを含有していると予想されよう。Ｂ２に近接するすべ
てのアミノ酸配列は欠失していよう。この構造は、２１
ｏｂｐ断片を規定するＰｓｔ１部位群が、Ｂ反復構造内
のホモローガスな配列に相当する位置にあり、かつその
タンパク質の解読フレームと同一の関係にある、という
事実に基づくものである。ポリアクリルアミドゲル電気
泳動分析は、このＤＮＡを有するＥ、ｃｏｌｉ ｈ＜
Ｉ ｇＧ結合活性を有するほぼ正確な大きさのタンパク
質を産生じていることを示した［ファネストック（Ｆａ
ｈｎｅｓｔｏｃｋ）らのＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｆ、
１６７：８７０−８８０（１９８６）］。 これらの結果は、Ｂ反復構造の存在性がプロティンＧの
ＩｇＧ結合活性に必要十分な条件であることを示唆して
いる。したがって、８反（Ｍ構造は分子内におけるＩｇ
Ｇ結合活性の中心点であると結論された。 実施例４ バシラス・ズブチリス内におけるプロティンＧまず始め
に、転写ターミネータ−に類似した配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドをｍＧＸ４５４７に挿入した。そのオ
リゴヌクレオチドの配列は： ５’ −ｐＴＣＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡ
ＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＴ−３’であった。これは
自己相補性であり、２本鎖になった場合、エンドヌクレ
アーゼ５ａｌｔによって得られるものと同一の配列を有
する１本鎖末端が得られる。それをｍＧＸ４５４７に挿
入するため、ファージＤＮＡをエンドヌクレアーゼ５ａ
ｌｌで消化し、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿
し、次いでその合成オリゴヌクレオチド（７０°Ｃに加
熱して変性し、２３°Ｃにゆっくりと冷却しておいた）
およびＤＮＡリガーゼと共にライゲーション条件下にイ
ンキユベートした。連結ＤＮＡをＥ 、 ｃｏｌ １Ｇ
Ｘ１２１０にトランスフェクトし、得られたクローンを
５ａｌ１部位の喪失および合成オリゴヌクレオチドに存
在する認識配列であるＥｃｏＲＶ部位の表出についてス
クリーニングした。所望の構造体を合する１つのクロー
ンをｍＧＸ７８７２と命名した。 次いで、Ｂ２反復配列に近接する配列をｍＧＸ７８７２
から切除した。これは、オリゴヌクレオチド特異的イン
ビトロ突然変異によって行った。 以下の配列： ５°−ｐＣＧＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＧＧＡＡＣＣ
ＴＣＴＧＴＡＡＣＣ−３゜を有するオリゴヌクレオチド
を合成した。この配列は、半分はＢ２配列に直接隣接す
るｍＧＸ４５４７内の配列と相捕的であり、他の半分は
プロティンＧのＣ末端をコードしている配列近くの配列
と＋Ｈ１山Ω勺である。このオリゴヌクレオチドを２本
漬ＲＦ ＤＮＡのインビトロ合成のためのプライマー
として、またｍＧＸ４５４７ＤＮＡを鋳型として常法通
りに使用した。このＤ Ｎ ＡをＥ、ｃｏｌｉＧＸＩ２
１０にトランスフェクトした。プラークか産生ずるファ
ージＤＮＡが所望の欠失配列に相捕的である放射活性オ
リゴヌクレオチド：５’−（３２Ｐ）ＡＧＣＧＡＣＣＧ
ＧＡＡＣＣＴＣ−３’とハイブリタイズするその能力に
ついて、プラークをその場てスクリーニングした。所望
の構造体を有する１つのクローンを同定し、ｍＧＸ７８
７７と命名した。その構造をＤＮＡ配列分析によって確
認した。欠失部は第３図に示したヌクレオチド１６５１
−１８９６の配列を包含している。 プロティンＧコード化配列を発現および分泌ベクターに
融合させるため、オリゴヌクレオチド特異的インビトロ
突然変異によってＢａｍ８１部位をｍＧＸ７８７７の配
列内に作成した。配列５’ −ｐＧＧＴＡＴＣＴＴＣＧ
ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＡ
ＡＴＡＣＣＧ−３’を有するプライマーオリゴヌクレオ
チドを使用し、インビトロにおけるｍＧＸ７８７７の１
本鎖ＤＮＡ（Ｄ２本鎖ＤＮＡへの変換を促進した。この
オリゴヌクレオチドは、プロティンＧをコードしている
ｍＧＸ７８７７内の配列と相捕的であるが、成熟プロテ
ィンＧをコードしている配列の始部付近に挿入された、
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識配列を構成する６
個の付加的なヌクレオチド、Ｇ Ｇ Ａ Ｔ ＣＣを含
有している（分泌シグナル配列を除去した産物）。この
得られた２本鎖ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ ＧＸ ｌ ２１
０にトランスフェクトした。 プラーク由来の感染細胞から回収したＲＦ ＤＮＡを
、ＢａｍＨ１部位の存在に関してスクリーニングした。 所望の構造体を有するものをｍＧＸ８４Ｏ２と命名した
。 ズブチリシン（ａｐｒ）をコードしているバシラス・ア
ミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）遺伝子から誘導したプロ
モーターおよび分泌シグナル配列を含有する分泌ベクタ
ーは、バサンタ（Ｖａｓａｎｔｈａ）およびトンプソン
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）のＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ１、
１６５：８３７−８４２（１９８４）、および１９８４
年６月８日出願の米国特許出願第６１８．９０２号およ
び１９８５年３月２９日出願のその一部継続出願第７１
７．８００号に記載されている。このベクターｐＧＸ２
１３４は、分泌シグナル配列をコードしている配列の末
端付近にＢａｍＨ１部位を含有しており、そこにヘテロ
ローガスな遺伝子を融合することができ、それによりＢ
、ズブチリスでの発現およびその細胞からのタンパク質
産物の分泌を促進することができる。 プロティンＧ遺伝子のコード化配列をこのベクターに融
合スルタメ、ｐＧＸ２１３４ＤＮＡをエンドヌクレアー
ゼＢａｍＨ［およびＰｖｕｌｌで消化した。 ｍＧＸ８４０２由来のＲＦ ＤＮＡをエンドヌクレアー
ゼＢａｍＨＩおよびＳ ｍａ Ｉで消化した。フェノー
ルで抽出し、エタノールで沈殿させた後、得られた消化
ＤＮＡ調製物を混合し、ＤＮＡＩＪガーゼと共にライゲ
ーション条件下でインキュベートし、次いで得られた連
結ＤＮＡをＢ、ズブチリスＧＸ８００ Ｂ （ａｐｒ欠
失、ｎｐｒ欠失、５ｐｏＯＡ６７７）プロトプラストに
常法により導入した。クロランフェニコールの耐性によ
り形質転換体を選択し、コロニー免疫検定法によってプ
ロティンＧの産生についてスクリーニングした。陽性の
形質転換体を同定し、ＧＸ８４０８（ｐＧＸ４５８２）
と命名した。 制限分析により、このプラスミドｐＧＸ４５８２は、第
７図に示している構造を有することを確認した。これは
、プロティンＧフード化配列、およびｍＧＸ８４０２内
のコード化配列に近接した小さなりａｍＨＩ−３ｍａｌ
断片を有するｍＧＸ８４０２のＢａｍＨＩ断片をｐＧＸ
２１３４のＢａｍＨＩおよびＰｖｕｎ部位間に挿入する
ことによっておそらく形成されたものであろう。 ＧＸ８．４０８株は、プロティンＧのＩｇＧ結合活性を
有するタンパク質を産生ずることが示された。Ｂ２配列
に近接した配列が欠失しているこの菌株は、プロティン
Ｇ様物質の分泌が高められていた。適当な培地［ファ不
ストックおよびフィッシャーのＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
１、 １６５ニア９６−８０４（ｔ９８４）］中で増殖
させた後、培養上清および細胞関連分画を回収し、ドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
分析にかけた。電気泳動の分離後、タンパク質バンドを
ニトロセルロースに移し、実施例１に記載のように免疫
化学的に染色した。■ｇｃ結合活性を有する物質が、培
養上清および細胞関連物質の両者に見いだされた。 実施例５ グ 実施例１記載のごとく、ＧＸ７８０５と称するストレプ
トコッカスのグル−７’Ｇ臨床単離体から、染色体ＤＮ
Ａを単離した。一個のＤＮＡ試料を制限エンドヌクレア
ーゼＨｉｎｄ■で消化し、標準的な条件下で１％アガロ
ースゲル電気泳動にかけた。この目的に）ｌｉｎｄ■が
有用であることは、ｐＧＸ４５３３の制限分析により（
実施例１、第２図）、Ｈｉｎｄ［１１部位が、大腸菌の
マルチコピー（多重コピー）プラスミド上で、大きい断
片を達成することを妨げる働きをすることが明らかな、
下流側の隣接配列とプロティンＧ遺伝子とを分離する部
位であるとの決定から示唆された。電気泳動後、サザー
ンら（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１、
、９８ ： ５０３（１９７５））の記載に従い、ＤＮ
Ａ断片をニトロセルロースに移した。 ストレプトコッカスＧＸ７８０５株から単離された第２
図記載の１ 、９ ｋｂｐＨ１ｎｄＩＩＩ断片からなる
放射活性なプローブとのハイブリザイゼーンヨンによっ
てプロティンＧをコードする配列を含んだ約２．４ｋｂ
ｐのバンドの位置が決定された。この１ 、９ ｋｂｐ
断片プローブは実施例１記載のごとく、アガロースゲル
電気泳動にかけてゲルから溶離して精製した後、基本的
にはリグビー（Ｒｉｇｂｙ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１
、。 １１３：２３７（１９７７）の方法に従い、ニックトラ
ンスレーションにより３２Ｐで放射活性に標識された。 実質上、ウオールら［Ｗａｈｌ。 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
Ｓ Ａ、 ７６ ： ３６８３−３６８７（１９７９
）］の方法に従い、ハイブリザイゼーションを行った。 ハイブリザイゼーションし、洗浄してハイプリザイスし
なかったプローブを除去した後、２．４ｋｂｐに相当す
る放射活性なバンドの位置をオートラジオグラフィーで
位置決定した。 より多量の、同じＧＸ７８０５染色体ＤＮ入試料（６μ
のをエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、１％
アガロースゲル電気泳動にかけて断片を分離した（０．
３５ボルト／ｃｍで１６時間）。臭化エチジウムで染色
した後、長さ２−３ ｋｂｐのバンドを含有するゲルの
一部（比較標準としてエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ
Ｉでｌ肖化したバクテリオファージラムダＤＮＡを用い
て位置決定）を切りとり、ＤＮＡの回収のために砕いた
。実施例１記載のごとく、フェノール抽出の後、ＤＮＡ
を回収した。 プラスミドベクターｐＧＸ １０６６ ＤＮＡ（１μｇ
）をエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ［で消化した。反応混
合物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル、２５：２４：１）で抽出した後、０．１容量の４Ｍ
ＬｉＣρ、１０ｍＭＥＤＴＡ、 グリコーゲン担体２
０μ７、および２．５容量の９５％エタノールを加えて
ＤＮＡを沈澱させた。／ｉ４化ベクターＤＮＡ０．４μ
９、回収したＧＸ７８０５．ＤＮＡのＨｉｎｄ１ｍ断片
（染色体ＤＮＡ６μ９からの回収率９０％の物質）およ
びＴ４ＤＮΔリカーゼ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
ＢｉｏＬｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ、、
Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、 ＣＴ）を、該供給業者の指示に
従い、２０ｕ（ｌ中、１５°Ｃで１６時間イン−１−ユ
ベートした。 実施例１記載のごとく、結合（ライゲーショ７）Ｄ Ｎ
Ａ ｌ ５ ｔｔ（ＩＴ：大腸ａｓ Ｋ ２２６７ｍ
胞を形質転換し、形質転換細胞をコロニーイムノアッセ
イプレート上で培養し、実施例１記載のごとく、免疫グ
ロブリンと結合したタンパク質の生産について分析した
。陽性コロニーを同定した。この形質転換体から単離し
たプラスミドＤＮＡは２．４ｋｂｐのＤＮＡ挿入体を有
するｐＧＸ１０６６であることが分かった。この挿入体
を構成するエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ［断片をバ
クテリオファージＭ１３ｍｐ９ベクターにサブクローニ
ングした。２．４ｋｂｐＨｉｎｄ［ＩＩ断片のＤＮＡ配
列を決定し、第９図に示した。 実施例６ Ｂ、サブチリスによる分泌に好ましい形の好ましい形の
プロティンＧは、活性なりリピート（実施例３）の上流
および下流をコードする配列を欠失した遺伝子によりコ
ードされている。プロティンＧの免疫グロブリン結合活
性を有するそのようなタンパク質は、タンパク分解に対
する安定性が改善されている。 Ａ、上流配列の欠失 上流配列を欠失するために、プラスミドｐＧＸ４５８２
（実施例４）をまず、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎｌ
に対スるユニーク（唯一の）開裂部位（第１１図参照）
を有するように修飾した。いずれもＡリピートの上流に
ある２カ所を切断するエンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで
ｐＧＸ４５８２ＤＮＡを消化した。フェノール抽出、エ
タノール沈澱の後、線状プラスミド断片を、エンドヌク
レアーゼＫｐｎＩの認識部位を担持する、配列： ５°−Ｐ−ＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣΔＧ で示される、５゛りん酸化自己相補的オリゴヌクレオチ
ドの存在下、ライゲーション条件下に、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで処理し、再環化した。結合ＤＮＡを用いて大腸菌
５Ｋ２２６７を形質転換し、単一のＰ ｖｕ １１部位
を獲得した所望の構造を持つプラスミドを含有するアン
ピシリン耐性形質転換体を単離した。このプラスミドを
ｐＧＸ４５９０と命名した。 次いで、ｐＧＸ４５９０に担持された、修飾プロティン
Ｇ遺伝子をバクテリオファージＭ１３ベクターに移した
。ｐＧＸ４５９０のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳ ｍ
ａ Ｉおよび５ａｌｌで消化し、全プロティンＧをコー
ドする遺伝子を含有する断片を切り出した。バタテリオ
ファージＭ１３ｍｐ８の２本漬ＲＦ型ＤＮＡもＳ ｍａ
Ｉおよび５ａｉｌで消化し、両消化ＤＮＡ標品をフェ
ノール抽出し、エタノール沈澱に付した。２個の標品を
混合しライゲーション条件下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一
緒にインキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌Ｇ
Ｘ１２１０を形質転換（トランスフェクション）し、適
当な大きさの挿入断片の存在に関してクローンをスクリ
ーニングした。所望の断片を含有するクローンを同定し
ｍＧＸ８４３４と命名した。 次いでオリゴヌクレオチド−指向突然変異誘発法を用い
、ｍＧＸ８４３４に担持されているプロティンＧ暗号配
列に第２のＫｐｎ１部位を形成した。配列； ５’ −ＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＧＧＴＡＡＴＧＧＧＴＡ
ＣＣＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＧを
有し、ｍＧＸ８４３４においてドメインＢｌをフードす
る配列に隣接した配列と相捕的であるがエンドヌクレア
ーゼＫｐｎｌの認識部位を含んだ６ヌクレオチドの挿入
体をも担持しているオリゴヌクレオチドを合成した。フ
ァージｌ１ｌＧＸ８４３４から単離された１本鎖ＤＮＡ
を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとし
て標準的手法でインビトロにて２本漬ＲＦ ＤＮＡを
合成した。 このＤＮＡを用いて大腸１ＧＸ１２１０をトランスフェ
クションし、第２ＫｐｎＩ部位の存在に関してクローン
をスクリーニングした。所望の構造を有するクローンを
同定しｍＧＸ８４４１と命名した。 ｍＧＸ８４４１ＤＮＡは上記のごとく、２個のＫｐｎ１
ｐ位の間の配列を欠失すると第１部位の上流と第２部位
の下流の配列がインフレーム（枠内）融合するよう作成
された２カ所のＫｐｎｒｐ位を含有する。この欠失は、
ｍＧＸ８４４１のＲＦ型ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＫ
ｐｎｌで消化し、消化Ｄ Ｎ Ａをフェノール抽出し、
エタノール沈澱させた後、希釈溶液中、ライゲーション
条件下にＴ４ＤＮＡＩ、Ｉガーゼで大きいＲＦ断片を再
度環化することにより達成された。結合ＤＮＡを用いて
大腸菌ＧＸ１２１０を形質転換し、小さいＫｐｎｌｐ片
が失われたクローンをスクリーニングした。所望の構造
を有するクローンをｍＧＸ８４４２と命名した。ｍＧＸ
８４４２の欠失部位の構造をＤＮＡ配列決定で確認した
。それは、プロティンＧのＮ末端からアミノ酸残基Ａ１
ａ３Ｂまでの、ｐＧＸ４５８２によってコードされてい
るタンパク質と同一と思われるタンパク質をコードして
おり、Ｋｐ口口語認識配列よりコードされているＧｌｙ
ＴｙｒＰｒ。 が続き、さらにｐＧＸ４５８２の配列ＬｕｅＰｒｏＬｙ
ｓＴｈｒＡｓｐ（ドメインＢ１に先行する）およびｐｃ
ｘ４５８２の残りの配列が続く。 ｍＧＸ８４２２の暗号配列をＢ、サブチリス内で樹立す
るためのベクターとしてプラスミドｐＧＸ４３７０を用
いた。このプラスミドはＢ、アミロリフファシェンスの
サブチリシンをコードする遺伝子から導かれた配列をも
含有することを除き、ブライアン（Ｐ 、 ｂｒｙａｎ
）らが米国特許出願８２８゜５４５（１９８６年２月１
２日出願）に記載したプラスミドｐＧＸ４３１２と同様
のプラスミドである。これらの配列はプロモーター、翻
訳開始配列、および分泌シグナル配列をコードしており
、これにＢａｍ）（Ｉ認識配列が続く。これらは実施例
４記載）ｐｃｘ ２１３４から導かれた。このベクター
はまた、Ｂ、サブチリスおよび大腸菌内で活性な複製起
点、並びに両微生物内で選択されるマーカー（Ｂ、サブ
チリス内ではカナマイシン耐性、大腸菌内ではアンピシ
リン耐性）をも担持している。 プラスミドｐＧＸ４３７０ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、フェノール
抽出およびエタノール沈澱を行った。同様に、ｍＧＸ８
４２２ＲＦ ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨｒ
およびＨｉｎｄｌ［Ｉで消化し、フェノール抽出および
エタノール沈澱に付した。消化ＤＮＡ標品を混合しライ
ゲーション条件下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインフレ
−ムした。結合ＤＮＡ・を用いて大腸菌５Ｋ２２６７を
形質転換し、所望の構造を有するアンピシリン耐性形質
転換体を制限分析で確認し、ｐＧＸ４５９５と命名した
。次いでプラスミドｐＧＸ４５９５ＤＮＡを用いてＢ、
サブチリスＧＸ８００８のプロトプラストを形質転換し
た。ＧＸ８４４６と命名したカナマイシン耐性形質転換
体は、実施例４にその概要を示したと同様の分析により
、プロティンＧの免疫グロブリン結合活性を持ったタン
パク質を産生ずることが示され、このタンパク質は細胞
外培地と細胞溶解画分の両方に検出された。 Ｂ、下流配列の欠失 下流配列が様々に欠失した構築物の出発物質はドメイン
Ｂ２をコードする配列の次にエンドヌクレアーゼＸｈｏ
ｒのための部位がオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発
法によって挿入されたｍＧＸ７８７２（実施例４）誘導
体である（第１２図参照）。 この目的のために、ｍＧＸ７８７２のプロティンＧをコ
ードする配列の、ドメインＢ２をコードする配列の直ぐ
下流の配列と相捕的であるがＸｈｏ１部位を作成する３
ヌクレオチド挿入を含有している式・ ５’ −ＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＴＣＡＣＣ丁ＣＧＡＧ
ＧＡＡＣＣ丁ＣＴＧＴＡＡＣＣで示されるオリゴヌクレ
オチドを合成した。ｍＧＸ７８７２から単離された１本
鎖ＤＮＡを鋳型とし、このオリゴヌクレオチドをプライ
マーとし、標準的手法で２本漬ＲＦ ＤＮＡをインビ
トロで合成し、大腸菌ＧＸ１２１０のトランスフェクシ
ョンに用いた。一個のＸｈｏ１部位の存在に関してクロ
ーンをスクリーニングし、所望の構造のものをｍＧＸ７
８７５と命名した。ｍＧＸ７８７５内の変更配列をＤＮ
Ａ配列決定によって確認し、所望のものであることを確
認した。 次いでＫｐｎ１部位を、上記のｍＧＸ８４３４への第２
ＫｐｎＩの挿入位置に類似した、ｍＧＸ７８７５のドメ
インＢ１をコードする配列に接近した位置に挿入した。 上記（ｍＧＸ８４４１の構築）と同じオリゴヌクレオチ
ド、および同様の方法を用いた。所望の構造を有するク
ロンーンをｍＧＸ８４１１７と命名した。 次いでｍＧＸ８４４７から得た下流配列を用いてｐＧＸ
４５９５内の配列と置換した。この目的のためにｍＧＸ
８４４７のＲＦ ＤＮＡとｐＧＸ４５９５とをエンド
ヌクレアーゼＫｐｎｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで別々に消
化し、フェノール抽出、エタノール沈澱に付した。消化
ＤＮＡ標品を混合し、ライゲーション条件下、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼの存在下でインキュベートした。結合ＤＮＡ
を用いて大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し所望の構造の
プラスミドを担持するアンピシリン耐性形質転換体を制
限分析で同定し、ｐＧＸ４５９６と命名した。このプラ
スミドはプロティンＧの活性部分をコードしていること
と下流配列（Ｂｌの前のＫｐｎ１部位からＣ−末端をコ
ードする配列の後方のＨｉｎｄｌ１１部位まで）がｍＧ
Ｘ８４４７から導かれたものである点を除きｐＧＸ４５
９５と同様である。 次いでプラスミドｐＧＸ４５９６を出発物質として下流
配列をも含む様々な欠失を行った。まず、ｐＧＸ４５９
５ＤＮＡをドメインＢ２をコートする配列の下流末端に
近い、上記オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発で作成
された部位を切断するエンドヌクレアーゼＸｈｏ１、お
よび暗号配列の下流末端を切断するＨｉｎｄＦＩＩで切
断した。この消化ＤＮＡを０．７％アガロースゲルによ
る分取用電気泳動分画にかけ、生成した大きい２断片を
ゲルから溶出させ回収した。配列： で示される構造を有する２本鎖アダプターを構築した。 ｐＧＸ４５６９から導かれた、精製した大きいＸｈｏ
Ｉ −Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片を、その１本鎖末端が大断片
の１本鎖末端と相補的なこのアダプターの存在下で再環
化した。これは、該断片とアダプターとをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下、ライゲーション条件下でインキュベー
トすることにより達成された。結合ＤＮＡを用いて大腸
菌５Ｋ２２６７を形質転換し、所望の構造のプラスミド
を担持するアンビンリン耐性形質転換体を、アタプター
に含まれているＰｖｕ［［部位の存在に関してスクリー
ニングすることにより同定した。このプラスミドをｐＧ
Ｘ４５９７と命名した。これは配列：、 、 ［Ｂ２
］ＭｅｔＶａｌＴｈｒＧｌｕＶａｌＰｒｏＡｒｇＳｅｒ
ＣｙｓＥＮＤ、 、 、ＡＴＧＧＴＴＡＣＡＧＡＧ
ＧＴＴＣＣＴＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＴ、
。 て示される構造を持った先端を切除されたプロティンＧ
遺伝子を担持している。この構築における合成アダプタ
ーに担持されているＣ−末端Ｃｙｓ残基はこの遺伝子に
よってコードされているプロティンＧ配列においてユニ
ークである。当業者ならば、そのようなユニークな残基
は、タンパク質を固体マトリックスに固定化する、ある
いは種々の化学機能性物質や他のタンパク質を付加する
ことを意図した、化学反応を行う上で好適な部位を提供
するものであることを認識するであろう。 第２の下流欠失はリピートＣ５から下流の配列を含む。 この構築には、第８図記載のＤＮＡ配列の１８１５位の
残基位置の配列から導かれたエンドヌクレアーゼＸｍｎ
１部位を利用した。プラスミドｐＧＸ４５９６は合計４
個のＸｍｎ１部位を有する。プロティンＧ暗号配列中の
所望の部位のみか開裂された分子を得るために、ｐＧＸ
４５９６ＤＮＡ（５μｇＺＩＩ１１）を臭化エチジウム
（４０μｇ／ｍＮ）の存在下、３７°Ｃで６０分間、Ｘ
ｍｎ１部分消化（１００ユニツト／ｌｌＬｉりシた。こ
れらの条件下、消化は主として１カ所の切断に限定され
、４部位のいずれかが切断されて生成した線状分子の混
合物が得うした。？ｉｌ化ＤＮＡをフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２５： ２４ ： ｌ
）”？？油抽出、エタノール沈澱し、臭化エチジウムと
ＸｍｎＩ酵素を除去した。線状ＤＮＡ混合物を次いでＨ
ｉｎｄＩＩＩ消化した。プロティンＧ暗号配列中ではＨ
ｉｎｄＩ１１部位とＸｍｎ１とが、他のいずれのＸｍｎ
１部位よりも接近した位置にある。従って、Ｘｍｎ１線
状混合物のＨｉｎｄＩＩＩ？ｍ化によって生成した最大
のＨｉｎｄｌ−Ｘｍｎｌ断片がｐＧＸ４５９６分子から
導かれた、プロティンＧ暗号配列のＸｍｎ１部位のみが
切断された断片である。分取用０．７％アガースケル電
気泳動分画でこの断片を精製した。移動度が最も低いバ
ンドをゲルから切り出して溶出し、回収した。 配列 ５ Ｐ−ＴＧＣＣＧＧＣＴＡ ＡＣＧＧＣＣＧＡＴＴＣＧＡ−５°Ｐ で示される構造を有する２本鎖アダプターを構築した。 このオリゴヌクレオチドの１本鎖末端はｐＧＸ４５９６
断片のＨｉｎｄｌＩＩ開裂で生成した１本鎖末端と相捕
的である。精製断片を、このアダプターの存在下、ライ
ゲーション条件下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュ
ベートすることにより再環化した。結合ＤＮＡを用いて
大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し、所望の構造のプラス
ミドを担持するアンビンリン耐性形質転換体を、制限分
析で同定した。このプラスミドをｐＧＸ４５９９と命名
した。これは配列： で示される構造を持った先端を切除されたプロティンＧ
遺伝子を担持している。プラスミドｐＧＸ、４５９７お
よびｐＧＸ４５９９を別々ニ用い、ＢサブチリスＧＸ８
００８のプロトプラストを形質転換した。カナマイシン
耐性形質転換体を選択しＧＸ８４５５（ｐＧＸ４５９７
）およびＧＸ８４５７（ｐＧＸ４５９９）と命名した。 いずれの株もプロティンＧの免疫グロブリン結合活性を
有し、いずれの場合もこのタンパク質が細胞外培地と細
胞溶解画分の両方に見いだされた。 実施例７ 種々の欠失を有するプロティンＧ遺伝子の誘導体を大腸
菌内での発現に好都合な調節可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂ
ｌｅ）プロモーター系と融合させた。用いたプロモータ
ーはマツケ二一ら（Ｍｅ Ｋ ｅｎｎｙ）が米国特許出
願５３４９８２（１９８３年９月２３日出願）に記載し
た、インビトロ法で構築されたハイブリットバクテリオ
ファージラムダプロモーター（ＯＬ／Ｐ Ｒ）である。 このプロモーターはプラスミドｐＧＸ２６０６に担持さ
れており、以下のように配置されたＢａｍＨ１部位を有
するファージラムダＣｒＯ遺伝子の翻訳開始部位を含有
している：Ｂａｍ１ｌ １ 、 ＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧ印ＧＴ
ＧＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＣＡＴＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧ
ＧＴＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣ，、。 ３５ −１０
翻訳ファージｍＧＸ７８７７（実施例４）から
導かれた°゛ＢＢドメイグードする配列を大腸菌発現ベ
クターｐＧＸ２６０６と融合させるためにインビトロの
オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発法でＢａｍ８１部
位をｍＧＸ７８７７ＤＮＡの適正なフレーム（枠）内に
挿入した（第１４図参照）。以下のオリゴヌクレオチド
を合成した： ５’ −ｐＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧ
ＧＡＴＣＣＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＧ
−３’ａｍｌｌｌ このオリゴヌクレオチドの配列はｍＧＸ７８７７のドメ
インＡ２からＢ１の間の領域の配列と相捕的であるが、
以後のｐＧＸ２６０６内での発現シグナルとの融合のた
めに、正しいフレーム内に挿入された、エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩの認識部位を構成する６ヌクレオチドを
も含有する。 このオリゴヌクレオチドを１本鎖ｍＧＸ７８７７ＤＮＡ
をインビトロで２本鎖ＤＮＡに変換するのに用いた。得
られた２本鎖ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２１０をトラ
ンスフェクションした。プラークから得た感染細胞から
回収したＲＦ ＤＮＡをＢａｍＨ１部位の存在に関し
てスクリーニングした。所望の構造を有するものをｍＧ
Ｘ７８９３と命名した。 ｍＧＸ７８９３の２本漬ＲＦ ＤＮＡをエンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ［ＩＩで消化し、消化
ＤＮＡをアガロースゲル（１％）電気泳動にかけて分画
した。生成した２本の線状ＤＮＡバンドの内、プロティ
ンＧのＢｌおよびＢ２ドメインをコードする配列を含有
する小さいバンドをゲルから溶出して回収した。ｐＧＸ
２６０６のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、長い線状断片をフェノール
抽出とエタノール化、殿により回収した。精製ｍＧＸ
７８９３断片を回収したｐＧＸ２６０６ＤＮＡと混合し
、ライゲーション条件下、Ｔ４ＤＮΔリガーゼと共にイ
ンキュベートした。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２
０１を形質転換し、３００Ｃでのアンピシリン耐性に関
してスクリーニングした。形質転換体を実施例７記載の
ごとく４２°ＣでのＩｇＧ結合タンパク質の生産に関し
てスクリーニングした。１個の陽性形質転換体をＧＸ８
４３６と命名し、これは所望の構造のプラスミドｐＧＸ
４５９２を含有していることが分かった。 ｐＧＸ４５９２のＮ−末端暗号配列は以下の如く、ＤＮ
Ａ配列決定によって直接、確認された。 適当な発酵条件下、４２°Ｃで発現を誘導し、３９°Ｃ
で継続するとＧＸ８４３６株は予測された大きさのヒト
ＩｇＧと結合活性を有するタンパク質を産生じた。結合
領域ＢｌおよびＢ２を含有するこのタンパク質をプロテ
ィンＧ変異体タイプｌと命名した。この変異体のアミノ
酸配列を以下に示す。 実施例８ このプロティンＧ変異体をコードする全遺伝子のＤＮＡ
配列は以下の通りである。 Ｇ遺伝子の構築 種々の欠失を有するプロティンＧ遺伝子の誘導体を大腸
菌内での発現に好都合な調節可能なプロモーター系と融
合させた。用いたプロモーターはマツケ二一ら（Ｍ ｃ
Ｋ ｅｎｎｙ）が米国特許出願５３４９８２（１９８
３年９月２３日出願）に記載した、インビトロ法で構築
されたノ１イブ肝ッドノイクテリオファージラムダプロ
モーター（ＯＬ／ＰＲ）である。このプロモーターはプ
ラスミドｐＧＸ２６０６に担持されており、以下のよう
に配置されたＢａｍＨＩ部位を有するファージラムダｃ
ｒｏ遺伝子の翻訳開始部位を含有している・ ＢａｍＨＩ ｐＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９に担持されている
ものから導かれた改良プロティンＧ遺伝子をベクターｐ
ＧＸ２６０６のＢａｍＨＩ部位に融合させるために、ｐ
ＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９の唯一のＫｐｎ１部
位にＢａｍ８１部位を作成した。 この目的のために以下の構造を有する自己−相補的オリ
ゴヌクレオチドリン力−を合成した：５’ Ｐ−ＧＧ
ＡＴＣＣＧＴＡＣ ＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧ−５’ Ｐ この２本鎖リンカ−の１本鎖末端はプラスミド類をエン
ドヌクレアーゼＫｐｎｌによって消化した場合に生じる
１本鎖末端と相補的であり、このリンカ−にはエンドヌ
クレアーゼＢａａ＋ＨＩの認識部位が挿入されている。 プラスミドｐＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９のＤＮ
Ａを別々にエンドヌクレアーゼＫｐｎｌで消化し、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱に付した（第１３図）。次
いで消化ＤＮＡ標品をりん酸化リンカ−すりゴヌクレオ
チドおよびＴ４ＤＮＡリガーゼと共にライゲーション条
件下でインキュベートした。７０℃で３分間インキュベ
ートしてリガーゼＤＮＡを不活化し、結合ＤＮＡ標品を
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
消化した。 各消化ＤＮＡ標品を分取用アガロースゲル（１％）電気
泳動にかけて分画した。長さ４００から７０ｏｂｐに相
当する移動度の断片をゲルから切り取って溶出し、回収
した。プラスミドｐＧＸ２６０６のＤＮＡをエンドヌク
レアーゼＢａａｉＨｒおよびＨ１ｎｄｌｌＩで消化し、
０４７％アガロースゲル電気泳切にかけて小さいＢ ａ
ｍＨ［−Ｈ１ｎｄｌｌＩ断片を除去した。大きいバンド
を切り取り、溶出し回収した。 回収したｐＧＸ２６０６断片を回収したｐＧＸ４５９７
およびｐＧＸ４５９９断片と別々に混合し、ライゲーシ
ョン条件下、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベート
した。結合ＤＮＡ標品を別々に用いて大腸菌ＧＸ １２
０１ （ｎａｄＡ：：Ｔｎｌ Ｏｄｅｌｔａ ４ （ｃ
ｈｉ Ｄ−ｂｌｕ）（ｌａｍｂｄａ ｃｌ ８５７ ｄ
ｅｌｔａ ＢａｍＨＩ））、易熱性リプレッサープロテ
ィンをコードするｃ１８５７遺伝子を担持するファージ
ラムタ溶原閑、を形質転換した。形質転換体を３０’Ｃ
でのアンピシリン耐性に基づいて選択し、実施例１記載
のイムノアッセイの変法によりスクリーニングした。細
胞を通常の栄養寒天プレート上、上にニトロセルロース
フィルターを付した酢酸セルロースフィルター上で３０
６０にて培養した。可視コロニーの出現後、プレートを
４２℃で４−６時間インキュベートし、実施例１記載の
ごとく、ニトロセルロースフィルターを展開した。この
ようにして同定した陽性形質転換体は制限分析により所
望の構造のプラスミドを含有することか分かった。 ｐＧＸ４５９７誘導配列を含有するプラスミドをｐＧＸ
５２０３と命名し、このプラスミドを含有する大腸菌株
をＧＸ８４６４と命名した。ｐＧＸ４５９９−誘導配列
を含有するプラスミドをｐＧｘ５２０４と命名し、この
プラスミドを含有する大腸菌株をＧＸ８４６５と命名し
た。 ｐＧＸ５２０３およびｐＧＸ５２０４によって担持され
ている改良プロティンＧ遺伝子の設計構造のＮ−末端は
以下のごとく同一である。 ｆＭｅＬＡｓｐＰｒｏＴｙｒＰｒｏＬｅｕＰｒｏＬｙｓ
ＴｈｒＡｓｐ［Ｂｌ ］Ａ ＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＡＴ
ＧＧ ＡＴＣＣＧＴＡＣＣＣＡＴＴ Ａ ＣＣＴＡ Ａ
ＧＡＣＴＧＡ ＣＡ ＣＴＴＡ Ｃ。 Ｃ−末端配列はそれぞれ、ｐＧＸ４５９７およびｐＧＸ
４５９９のＣ−末端配列と同一である（実施例６）。 ＧＸ８４６４およびＧＸ８４６５はいずれもプロティン
Ｇの免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質変異体
を産生ずる。さらに、雨林の生産性は高められており、
細菌培養１ｇあたりのプロティンＧ様物質回収率が約２
００ｏ＋９の生産を示した。このタンパク質の合成は３
０℃で制御され、４２°Ｃで誘導され、制御モードはｃ
１８５７遺伝子にフードされている易熱性レプレッサー
の存在下、ハイブリッドファージラムダプロモーター（
ＯＬ／ＰＲ）のフントロール下にある遺伝子によると予
測された。 このプロティンＧ変異体のアミノ酸配列は下記のごと（
ＧＸ８４６５によって産生されたＢ１およびＢ２結合ド
メイン（タイプ２）を含有する。 ＧＸ８４６５によって産生され、ＢｌおよびＢ２結合ド
メインを有するプロティンＧ変異体（タイプ３）のアミ
ノ酸配列を以下に示す。 このプロティンＧ変異体くタイプ３）をフードする遺伝
子のＤＮＡ配列を以下に示す。 このプロティンＧ変異体（タイプ２）をフードする遺伝
子のＤ Ｎ Ａ配列を以下に示す。 実施例９ プラスミドｐＧＸ４５９９を用いてｄａｍメチラーゼを
欠く菌株、大腸菌ＧＭ２７２を形質転換した。 そのような形質転換体から得たＩＩのプラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで消化シた。このＤ
ＮＡはｄａｍ誘導メチル化が失われているので消化によ
り２断片が生成した。これらの断片をフェノール抽出と
エタノール沈澱により回収した。 以下の配列を有する自己−相補的オリゴヌクレオチドア
ダプターを合成した この２本鎖オリゴヌクレオチドの１本鎖末端はエンドヌ
クレアーゼＣ１ａｌ消化により生成された１本鎖末端と
相補的であり、エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の認識部
位を含有している。 ５”りん酸化オリゴヌクレオチドアダプターを回収した
ｐＧＸ４５９９ＤＮＡ断片と混合した。 この混合物とＴ４ＤＮＡリガーゼとを、ＤＮＡ濃度約１
０μ９／ｍβにてライゲーション条件下でインキュベー
トした。結合反応後、再環化したＤＮＡを用いて大腸菌
５Ｋ２２６７を形質転換し、アンピシリン耐性に関して
選択した。２個の断片の内、１個のみが大腸菌内で活性
な複製起点と選択可能なアンピシリン耐性マーカーを有
しているのでこの断片を含有している再環化ＤＮＡのみ
か大腸菌を形質転換することができた。形質転換体をプ
ラスミドＤＮＡの制限分析によりスクリーニングし、所
望の構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４１）を含有するも
のを同定した。 プラスミｔ’ｐＧＸ５２４１およびｐＧＸ２６０６を共
にエンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨｌ
て消化した。消化り、Ｎ Ａをフェノール抽出およびエ
タノール沈澱により回収した。２個の消化プラスミドを
ライゲーションバッファー中、ＤＮＡ濃度約５０μｇ／
ω！で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、結合させ
た。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換
し、３０’Ｃでのアンピシリン耐性に基づいて選択し、
形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析でスクリーニ
ングした。 所望の構造のプラスミド（ｐＧＸ ５２４５）を含有す
るものをＧＸ８８２２株と命名した。正確な構造をＤＮ
Ａ配列決定により確認した。このプロティンＧ変異体を
コードする遺伝子のＤＮＡ配列を以下に示す。 ＧＸ８８２２株はヒ）ＩｇＧ結合能力を有する予測され
た大きさのタンパク質を産生ずることが分かった。この
プロティンＧ変異体は単一のＩｇＧ結合配列Ｂ２（ＧＸ
７８０９、プロティンＧかろ）、隣接するプロリン豊富
領域、および“Ｃ−リピート”を含有する。このプロテ
ィンＧ変異体タイプ５の推定のアミノ酸配列を以下に示
す。 実施例１０ プラスミドｐＧＸ５２０４ＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼＰｓｔｌで消化し、１％アガロースゲル電気泳動に
かけ、ゲルから精製断片を溶離することで長い線状断片
を単離した。プラスミドｐｃｘ４５８４（ベクターｐＧ
Ｘ１０６６＋ストレプトコッカスＧＸ７８０５から単離
されたプロティンＧ遺伝子を含む２．４ｋｂｐのＤＮＡ
挿入体から成る（実施例５参照））を、プロティンＧの
ＩｇＧ結合ドメインをコードする領域に由来する４２０
ｂｐ断片が充分量得られるような条件下で、Ｐｓｔｌに
より部分消化した。アガロースゲル（１，５％）電気泳
動し、ゲルを溶出することでこの４２０ｂｐＰｓｔ１断
片を単離した。 ｐＧＸ５２０４の長いＰｓｔｌ断片とｐＧＸ４５８３の
ＰｓｔＴ部分消化断片とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で結合させた。結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０．
１を形質転換し、形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限
分析でスクリーニングした。 ２つのタイプのプラスミドが同定された。１個（ｐＧＸ
５２４７）はプラスミドｐＧＸ５２０４から誘導された
しのであって、プラスミドｐＧＸ５２０４の２１０ｂｐ
断片をｐＧＸ４５８３の４２０ｂｐＰｓＮ断片で置換し
たものである。ｐＧＸ５２４７を含有する株をＧＸ８８
２５と命名し、予測されたサイズのＩｇＧ結合タンパク
質を産生ずることが分かった。このタンパク質（タイプ
６）の推定の構造を以下に示す。 このプロティンＧ変異体（タイプ６）をコードする遺伝
子のＤＮＡ配列を以下に示す。 ＡＡＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＣＴＡＡイブ１１）
のＤＮＡ配列を以下に示す。 この配列はＧＸ７８０９プロティンＧから導かれた配列
ＢｌおよびＢ２のキメラ配列である、単一の“Ｂリピー
ビを含有している。 プラスミドｐＧＸ４５９５を用いてｄａｔａメチラーゼ
を欠く菌株、大腸菌ＧＭ２７２を形質転換した。 そのような形質転換体から得た１個のプラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで消化した。このＤ
ＮＡはｄａｍ誘導メチル化が失われているので消化によ
り２断片が生成した。これらの断片をフェノール抽出と
エタノール沈澱により回収した。 この配列はＢ１、Ｂｌ／Ｂ２、およびＢ３結合ドメイン
を含有し、そのアミノ酸配列はストレフトコツカスＧＸ
７８０５から導かれたプロティンＧのアミノ酸配列、並
びにプロティンＧの隣接プロリン豊富領域および゛Ｃ−
リピービと同一である。 上記の形質転換体から単離された第２のタイプのプラス
ミド（ｐＧＸ５２４６）ｌ；！ｐＧＸ５２０４から、該
プラスミドの長いＰｓｔｌ断片を挿入なしに再環化する
ことにより得られた。従って、プラスミ）’ｐＧＸ５２
０４（７）短い２１０ｂｐ Ｐｓｔｌ［ｒ片１；！欠失
された。ｐＧＸ５２４６を含有する株をＧＸ８８２４と
命名した。ＧＸ８８２４によって産生されるタンパク質
（タイプ１１）の推定の構造を以下に示す。 このプロティンＧ変異体をフードする遺伝子（７以下の
配列を有する自己−相補的オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを合成した： この２本鎖オリゴヌクレオチドの１本鎖末端はエンドヌ
クレアーゼＣ１ａｒ消化により生成された１本鎖末端と
相補的であり、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部
位を含有している。 ５°−りん酸化オリゴヌクレオチドアダプターを回収し
たｐＧＸ４５９５ＤＮＡ断片と混合した。 この混合物とＴ４ＤＮＡリガーゼとを、Ｄ Ｎ Ａ ｉ
ｐ４度約１Ｏμｇ／ｍ（ｌにてライゲーション条件下で
インキュベートした。結合反応後、再環化したＤＮＡを
用いて大腸菌５Ｋ２２６７を形質転換し、アンピシリン
耐性に関して選択した。２個の断片の内、１個のみが大
腸菌内で活性な複製起点と選択可能なアンピシリン耐性
マーカーを有しているので、この断片を含有している再
環化ＤＮＡのみが大腸菌を形質転換することができた。 形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析によりスクリ
ーニングし、所望の構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４０
）を含有するものを同定した。 プラスミｔ’ｐＧＸ５２４０およびｐＧＸ２６０６を共
にエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ
で消化した。消化ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノ
ール沈澱により回収した。２個の消化プラスミドをライ
ゲーションバッファー中、ＤＮＩｉ度約５０μｇ／ｍρ
で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、結合させた。 結合ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、
３０°Ｃにおけるアンビンリン耐性により選択し、形質
転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析でスクリーニング
した。 所望の構造のプラスミド（ｐＧＸ５２４４）を含有する
ものをＧＸ８８２１株と命名した。正確な構造をＤ Ｎ
Ａ配列決定により確認した。このプロティンＧ変異体
をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を以下に示す。 ＧＸ８８２１株はヒトＩｇＧ結合能力を有する予測され
た大きさのタンパク質を産生ずることが分かった。この
タンパク質の推定の構造を以下に示す。 この構造には単一の［ｇＧ結合配列Ｂ２（ＧＸ７８０９
、プロティンＧから）および天然のタンパク質に由来す
る幾つかのアミノ酸残基が含まれている。 実施例１２ プラスミドｐＧＸ５２０４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、線状ＤＮＡをフェノール抽出
とエタノール沈澱により回収した。以下の配列を有する
自己−相補的オリゴヌクレオチドアダプターを合成した
： ５’ −ＡＧＣＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＡ
ＴＧＣＴＡ−３゜３°−ＡＴＣＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＡ
ＡＧＴＡＣＧＡＴＴＣＧＡ −５゜この２本鎖オリゴヌ
クレオチドの１本鎖末端はエンドヌクレアーゼＨｉｎｄ
Ｉ［ｒ消化により生成された１本鎖末端と相補的であり
、エンドヌクレアーゼ５ｔｕｌの認識部位を含有してい
る。線状化ｐＧＸ５２０４ＤＮＡと５゛−りん酸化オリ
ゴヌクレオチドとをライゲーションバッファー中で混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。 結合反応後、再環化したＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２
０１を形質転換し、形質転換体をプラスミドＤＮＡの制
限分析（Ｓｔｕ１部位の存在）に関してスクリーニング
した。所望のプラスミド（ｐＧ Ｘ ５２５４）を含有
する形質転換体を同定した。 ｐＧＸ５２５４のＤＮＡをエンドヌクレアーゼＮａｅｌ
で消化した。消化が不完全であることが分かったので、
線状分子をアガロースゲル（１％）電気泳動にかけ、ゲ
ルから溶出させ、精製し回収した。回収した線状分子を
次いで５ｔｕｌ消化し、長い線状断片をフェノール抽出
およびエタノ、−ル沈澱により回収した。これらの酵素
はいずれも平滑末端を生成した。次いで線状ＤＮＡをラ
イゲーションバッファー中、約１０μｇ／ｍ１で、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートして再環化した。 ＤＮＡ結合における所望の効果は以下の通りである。 、、、 Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａ
ｌｅ Ｇｌｙ ＥＮＤ ＜−−−−−−リンカー−−−
−−＞↓ 、、、Ｌｙｓ Ｌｙｓ＾ｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ＥＮＤ４６．＾ＡＧ ＡＡ
Ａ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＣＣＣＣＴ ＴＣＡ
ＴＧＣＴ＾＾ＧＣＴＴ、 、 。 ｐＧＸ５２０４にコードされているＣ−末端Ｇｌｙの代
わりにＰ ｒｏＳ ｅｒＣｙｓ配列をＣ−末端に置換す
るよう作用するインフレーム融合を行う。 再環化したＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転
換し、形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析（Ｎａ
ｅ１部位の喪失）に関してスクリーニングした。所望の
構造（ｐＧＸ ５２５５）を含有する形質転換体をＧＸ
８８３３と命名した。この株は予測されたサイズの、１
分子当たり約１個のＣｙｓ残基を有するＩｇＧ結合タン
パク質を産生ずることが分かった。ｐＧＸ５２５５のＣ
−末端暗号領域をＤＮＡ配列決定で直接確認した。この
プロティンＧ変異体をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を
以下に示す。 実施例１３ プラスミドｐＧＸ５２０４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄＩＩ［で消化し、線状ＤＮＡをフェノール抽出
とエタノール沈澱により回収した。以下の配列を有する
自己−相補的オリゴヌクレオチドアダプターを合成した
： ６０１ ＴＧＣＴＡＡ この遺伝子によって発現されるＢ１およびＢ２ドメイン
を含有するプロティンＧ変異体の推定のアミノ酸配列を
以下に示す。 この２本鎖オリゴヌクレオチドの１本鎖末端はエンドヌ
クレアーゼ）ｌｉｎｄｌＩｒ消化により生成された１本
鎖末端と相補的であり、エンドヌクレアーゼＨｐａｌお
よびＰ ｖｕ ［の認識部位を含有している。 線状化ｐＧＸ５２０４ＤＮＡと５°−りん酸化オリゴヌ
クレオチドとをライゲーションバッファー中−で混合し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキユベートシた。結合
ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転換し、形質
転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析（Ｐ ｖｕ Ｕ部
位の存在）に関してスクリーニングした。リンカ−は線
状プラスミドＤＮＡと２方向の内のいずれかの方向で結
合し得る。従ってリンカ−（Ｐ ｖｕ ■部位）を獲得
したプラスミドを含有する数個の形質転換体が同定され
、その内の幾つかが所望の方向でリンカ−を含有すると
予測されたく例えばｐＧＸ５２６７）。 ｐＧＸ５２６７のＤＮＡをエンドヌクレアーゼ［（ｐａ
ｌで消化し、線状ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノ
ール沈澱により回収した。次いで線状ＤＮＡをライゲー
ションバッファー中、約１０μｇ／ｍ（ｌで、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼと共にインキユベートシて再環化した。ＤＮ
Ａ構造における所望の効果は以下の通りである。 、、 Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ 、、
、＾ｌａ Ｇｌｙ ＥＮＤ ＜−−−−−−リンカ−↓ 、、 Ｍａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙ
ｓ ＥＮＤ−■ 旺叫■ ＧＸ５２０４がコードするタンパク質中に存在〉 するＣ−リピートを欠失し、Ｃ−末端のＳ ｅｒＣｙｓ
配列を置換するよう作用するインフレーム融合を行う。 これによりタンパク質に唯一のＣｙｓ残基が作成される
。もしもリンカ−が逆の方向にあれば２個のＨｐａＩ部
位間の欠失によってＰｖｕ［部位とＨｉｎｄＩ１１部位
が除去されるということに注目されたい。 再環化したＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質転
換し、形質転換体をプラスミドＤＮＡの制限分析（プロ
ティンＧをコードする配列を含有スルＢ ａｎ＋ＨＩ−
Ｈ１ｎｄｌＩ［断片の短縮）に関してスクリーニングし
た。そのような欠失を有する数個のプラスミドが同定さ
れた。所望の方向でＤＮＡリンカ−を獲得した元のプラ
スミドがどれであるかを決定するためにプラスミドをＨ
ｉｎｄＩ［およびＰｖｕｌＩ部位の存在に関してスクリ
ーニングした。所望の構造（ｐＧＸ ５２８８）を含有
する形質転換体をＧＸ８８４６株と命名した。このプロ
ティンＧ変異体をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を以下
に示す。 この株に゛よって発現されるＢｌおよびＢ２ドメインを
含有するプロティンＧ変異体の推定のアミノ酸配列を以
下に示す。 実施例１４ プラスミドｐＧＸ４５９９を用いてｄａ−メチラーゼを
欠く菌株、大腸菌ＧＭ２７２を形質転換した。そのよう
な形質転換体から得た１個のプラスミドＤＮＡを、有意
量の完全長さの線状ＤＮＡが形成されるような条件下、
制限エンドヌクレアーゼＣ１ａｌで部分消化した。この
ＤＮＡはｄａｍ誘導メチル化が失われているのでＣ１ａ
ｌ開裂にこれらの部位の両者が利用され得る。従って、
１カ所切断線状ＤＮＡには２タイプが存在する。この線
状ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で精製しゲルから溶
出した後、エンドヌクレアーゼＸｈｏｌで消化した。生
成した最長断片を再度アガロースゲル電気泳動で精製し
、溶出させて回収した。 以下の配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを合成した： ５°−ＣＧＡＣＧＴＣＣＣ−３’ ３° −ＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴ−５″このオリゴヌク
レオチドの１本鎖末端はそれぞれ、エンドヌクレアーゼ
Ｃ１ａｌおよびＸｈｏ！消化により生成された１本鎖末
端と相補的であり、エンドヌクレアーゼＡａｔｆｆの認
識部位を含有している。 ５′りん酸化オリゴヌクレオチドアダプターと精製した
ｐＧＸ４５９９のＣ１ａｒ−Ｘｈｏｌ断片とをライゲー
ションバッファー中で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共
にインキュベートした。結合したＤＮＡを用い大腸菌Ｄ
Ｈ５ａ １ ｐｈａ（Ｆ −、ｅｎｄＡ １． ｈｓ
ｄＲ１７，５ｕｐＥ ４４． ｔｈｉ−１，ｒｅｃＡ
１゜ｇｙｒＡ ９６． ｒｅｌ Ａ １ 、 ｄｅｌ
ｔａ（ａｒｇＦ −１ａｃＺ ＹＡ）Ｕ １６９． ｐ
ｈａ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ １５ ；Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｉ ｎｃ、から入手可能）を形質転換し、形質転換
体をプラスミドＤＮＡの制限分析（プロティンＧ暗号配
列を含有するＢａｌ１１Ｈ［−Ｈ１ｎｄｌ断片のサイズ
の減少）に関してスクリーニングした。所望の構造を含
有するプラスミド（ｐＧＸ ５２６５）を同定した。 線状分子のＣ１ａｌおよびＸｈｏ１部位をアダプターオ
リゴヌクレオチドを介して結合させることで以下のイン
フレーム融合を生じた。 、、、 Ｇｌｕ Ｖａｌ ｌｉｅ Ａｓｐ Ａｌａ 、
、、 Ｍａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ 、、
。 ↓ 、、、 Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ 、、。 、、、 ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣＴ
ＣＧＡ ＧＧＴ ＧＡＴ 、、。 ａｔ Ｕ ｐＧＸ５２６５に担持されている修飾プロティンＧ遺伝
子をベクターｐＧＸ２６０６のＢａｎ＋ＨＩ部位に融合
させるためにｐＧＸ５２６５の該プラスミドに唯一のＫ
ｐｎ（部位にＢａ＋ａＨ１部位を作成した。この目的の
ために、以下の配列を有する自己−相補的オリゴヌクレ
オチドリン力−を合成した： ５’ Ｐ−ＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣ ＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧ−５° Ｐ この２本鎖オリゴヌクレオチドの１本鎖末端はプラスミ
ドをエンドヌクレアーゼＫｐｎｌで消化して生成された
１本鎖末端と相補的であり、このリンカ−はエンドヌク
レアーゼＢａｍＨＩの認識部位を含有している。 プラスミドｐＧＸ５２６５ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
Ｋｐｎｌで消化し、フェノール抽出およびエタノール沈
澱に付した。次いで消化ＤＮＡ１品を５゛−りん酸化オ
リゴヌクレオチドおよびＴ４ＤＮＡリガーゼと共に、ラ
イゲーション条件下でインキュベートした。７０°Ｃで
５分間インキュベ−トシてＤＮＡリガーゼを不活化した
後、結１ｚＤＮΔ標品をエンドヌクレアーゼＢａｍ１刊
およびＨｉｎｄｌｌｌで消化した。次いで消化ＤＮＡ標
品を１．４％アカロースゲルによる分取用電気泳動分画
にかけた。臭化エチジウム染色ゲルに２個のＤＮＡ断片
が観察され、移動度の大きい方の断片を切り取り、ゲル
から抽出し回収した。プラスミドｐＧＸ２６０６のＤＮ
ＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩ
Ｉ消化し、大きい線状断片をフェノール抽出、エタノー
ル沈澱で回収した。 回収したｐＧＸ２６０６断片を回収したｐＧＸ５２６５
断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと一緒にライゲーシ
ョン条件下、インキュベートシタ。 結合したＤＮＡ標品を用いて大腸菌ＧＸ１２０１を形質
転換した。形質転換体を３０°Ｃてアンピシリン耐性に
関して選択し、プラスミドＤＮＡの制限分析（正しいサ
イズのＢ ａｍＨＩ −Ｈ１ｎｄｌＩ［断片ニ関し）に
よりスクリーニングした。所望の構造のプラスミド（ｐ
ＧＸ ５２６６）を含有するものを同定した。この株を
ＧＸ８８４４と命名した。 このプロティンＧ変異体をコードする遺伝子のＤＮＡ配
列を以下に示す。 この株によって発現される、単一のＢｌドメインを有す
るプロティンＧ変異体の推定のアミノ酸配列を以下に示
す。 実施例１５ Ｔ ｒｅｓｙｌ−活性化セファロース４Ｂの凍結乾燥粉
末（ファルマシア）をｌ＋ＭＨｃｆ２に懸濁した。 ゲルを内張すしたガラスフィルター上、１ｍＭＨＣａで
洗浄した後、吸引乾燥した。プロティンＧ変異体を０．
５Ｎ ＮａＣｌ２含有０．ＩＭ ＮａＨＣＯｓ（ｐＨ８
，０）に濃度５ ｍｙ／ ｍｌで溶解した。約１ｍｌ＋
のタンパク質溶液にｄａｍｐゲル約１９を加えた。この
懸濁液を４℃または室温で１夜、転倒させた（エンドオ
ーバーエンド）。次いで、ゲルを０．１Ｍトリスバッフ
ァー（ｐＨ８，０）で数時間処理した。 次いゲルをカップリングバッファーで洗浄し、３サイク
ルのｐＨ４バツフアー（０，１Ｍ酢酸Ｎａ、 ０゜５Ｍ
ＮａＣｆｆ）およびｐＨ８バツフアー（０，１Ｍトリ
スおよび０．５Ｍ ＮａＣ１２）で洗浄した。次いでゲ
ルをりん酸緩衝化食塩水（５０ｍＭ りん酸、０４１５
ＭＮａＣｌ２．０． Ｏ０５％ＮａＮ３ｐＨ７７゜４）
で４°Ｃで保存した。 実施例１６ 固定化プロティンＧ変異体の特性化 ３個の単一ドメインプロティンＧ変異体−−タイブ５（
Ｂ２）、タイプ１０（Ｂｌ）およびタイプ１１ （Ｂ
ｌ／Ｂ ２）−一の特性化を行った。一般に、実施例１
５の固定化タンパク質を中圧ガラスクロマトグラフィー
カラムに充填しＨＰＬＣシステムに連結した。 固定化の程度を固定化の前および後の２８Ｏｒ＋ｏ＋に
おける吸光度の変化に基づいて測定した。反応における
干渉要素は透析で除いた。あるいはなんらかの標準タン
パク質定量アッセイ（例えばＢＣＡ 、 Ｌ ｏｗｒ
ｙまたはＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）を用いてタン
パク質固定化の程度を測定してもよい。カンプリングお
よび得られた能力を表１に示す。ＩｇＧ結合能力の決定
にはヒト血清をカラム頂上に適用した。ＰＢＳで充分に
カラムを洗浄した後、結合したＩｇＧを５ｎ＋Ｍ酢酸ア
ンモニウム（ｐＨ５）、１．０Ｍ酢酸で溶出し、最後に
ＰＢＳで平衡化した。溶出したＩｇＧの量を吸光係数１
．４を用い、２８０ｎｍにおける吸光度に基づいて定量
した。 表１ ５ ３．５７１ ７５％ １６．６ｒ
７１０ ４．０４１１ｇ ７８％
１０．１π９１１ ３．８４ｘ９ ８１％
１１．１２ｘｇ次いで、固定化変異体のＦ ｃ、
Ｆ ａｂ、 Ｆ （ａｂ’ ）２およびＩｇＧへの結
合特性を試験した。カラムをＰＢＳで平衡化した後、Ｉ
ｇＧまたはそのタンパク分解フラグメントまたはその混
合物をカラムに適用した。次いで充分な洗浄を行った。 次いでカラムを５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５，０４
５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ３，１，０Ｍ酢酸で溶離し
、さらに最後にＰＢＳ ｐＨ７，０で平衡化した。２８
０ｎｍの吸光度を測定してタンパク質量を定量した。両
分（フラクション）をまた５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し生
成物の性質を評価した。 Ｆｃフラグメント（１，０から１．３ｍｇ充填）を固定
化変異体タイプ５．１０および１１に適用した。 固定化したタイプ５変異体は１．１５−カラムに入って
おり、タイプ１０およびタイプ１１変異体は０．７５Ｍ
１カラムに人っていた。結果を表２に示す。 表２ 初期通過流 ０．１７ １８ Ｑ、０５ ５
０．１ｉｐ）（＝５ ０．０４ ４ ０．０
０ ０ ０．００ｐＨ＝３ ０．１３ １４
０．３１ ２９ ０．３４１．０Ｍ酢酸 ０．３５
３８ ０．３９ ３７ ０．４１ＰＢＳ平衡化 ０．
２４ ２６ ０．３１ ２９ ０．４９１：Ａ＝ｓｏ
に基づく ２：全回収物質の％として表した値 タイプ１０およびタイプ１１に関して、充填したＦｃフ
ラグメントの１００％が様々な画分に回収された。タイ
プ５に関して、充填したＦｅフラグメントの９３％が様
々な画分に回収された。 固定化変異体タイプ５（１，１６ｍ１カラム）、タイプ
１０およびタイプ１１（０，７５ｍ＆カラム）ニ対する
Ｉ ｇＧ（１，０〜４．６ｎ＋９充填）結合の結果を表
３に示す。 ４に示す。 ｉ４ の結合 初期通過流 ０、ｏｏ ｏ ｏ、ｏ。 ｐＨ＝５ ＮＤ” ＮＤ Ｏ，００ｐＨ＝
３ ０．０２ ２ ０．００１．０Ｍ酢酸
０．４０ ５１ ０．１６ＰＢＳ平衡化 ０．３７
４７ Ｇ、００にＡｘｉａｌこ基づく ２：全回収物質の％として表した値 ３ ： ＮＤ＝測定せず ０．４９ ＮＤ １．６２ １．８７ ０．６６ タイプ５に関して、充填したＩｇＧの７９％が様々な両
分に回収された。タイプ１０に関して、充填したＩｇＧ
の１６％が様々な画分に回収された。タイプ１１に関し
て、充填したＩｇＧの１００％が様々な両分に回収され
た。 固定化変異体タイプ５（１，１６ｍ１カラム）、タイプ
１０およびタイプ１１（０，７ＥＭｔカラム）に対する
Ｆ ａｂ（１、０〜１．１ｍ９充填）結合の結果を表タ
イプ５ タイプ１０ ｍｙ ｌ ％２ ＝９ ％ 初期通過流 ０．５７ ８３ ０．２９ ６６ｐＨ
＝５ ０．００ ０ ０．００ ０ｐＨ＝３
０．００ ０ ０．ＯＯ０１，０Ｍ酢酸 ｏ
、ｏｏ ｏ ｏ、ｏｏ 。 ＰＢＳ平衡化 ０．１２ １７ ０．１５ ３４１：
Ａｙｓ。に基づく ２：全回収物質の％として表しだ値 タイプ１１ ＝９ ％ ０．５９ ４８ ０．０７ １４ ｏ、ｏｏ 。 ｏ、ｏｏ 。 Ｏ，３３３８ タイプ５に関して、充填したＦａｂの６９％が様々な画
分に回収された。タイプ１０に関して、充填したＦａｂ
の４４％が様々な画分に回収された。 タイプ１１に関して、充填したＦａｂの８７％が様々な
画分に回収された。 固定化変異体タイプ５（１，１６ｄカラム）、タイプ１
０およびタイプ１１（０，７５ｍ＆カラム）に対するＦ
（ａｂ’ ）２（１、０ｍ９充填）結合の結果を表５
に示す。 表−五 タイプ５ タイプ１０ タイプ１１ｔｎｇ１ ％
２ＲＬｉ ％ ｍｇ ％初期通過流 ０．
３２ ７５ ０．１８ ５５ ０．４２ ６０ｐＨ＝
５ ０．０４ ９ ０．００ ０ ０．１２
６ｐＨ＝３ ０．００ ０ ０．００
０ ０．００ ０１．０Ｍ酢酸 ０．００ ０
０．００ ０ ０．００ ０ＰＢＳ平衡化 ０．０
？ １６ ０．１４ ４５ ０Ｊ３ ３４１：Ａ２
８０に基づく ２：全回収物質の％として表した値 タイプ５に関して、充填したＦ （ａｂ’ ）ｚの４３
％が様々な画分に回収された。タイプ１０に関して、充
填したＦ （ａｂ’ ）２の３１％が様々な画分に回収
された。タイプ１１に関して、充填したＦ （ａｂ’
）ｚの８６％が様々な画分に回収された。 表２に示すように、Ｆｃのこれら３種の固定化変異体へ
の結合は全く同様である。しかしながら、ＩｇＧのこれ
ら変異体との相互作用の仕方には注意すべき相違がある
。タイプ１０（Ｂｌ）は溶出条件下でＩｇＧと非常に緊
密に非可逆的に結合する。 タイプ５（Ｂ２）もＩｇＧと緊密に結合するが可逆的で
ある。タイプ１１に関しては、ＩｇＧが様々な画分に溶
出していることから、結合は緩やかでありＩｇＧの分別
する傾向が認められる。 全ケースで、固定化変異体はＩｇＧおよびＦｃフラグメ
ントに比較してＦａｂおよびＦ（ａｂ’）、フラグメン
トとの結合ははるかに弱い。従って、これら固定化変異
体はＩｇＧおよびＦｃフラグメントをＦａｂおよびＦ
（ａｂ’ ）２フラグメントから分離するのに有用であ
る。 固定化タイプ１０およびタイプ１１変異体は幾分Ｆａｂ
フラグメントに親和性を有するようなので、固定化タイ
プ５変異体がＦ ａｂ’類の単離の候補者として注目さ
れた。Ｆ ａｂ’類の精製の可能性を例示するために、
Ｆ ｅ、 Ｆ （ａｂ’）ｔ、ＩｇＧおよびフルオレス
セインでラベルしたＦａｂからなる混合物をタイプ５カ
ラムに適用した。おおむね全てのフルオレスセインが通
過流に回収された。結合の欠如がフルオレスセイン修飾
によるものでないことを証明するために、別の実験でフ
ルオレスセインラベルＦｅフラグメントをカラムクロマ
トグラフィーにかけた。この場合には大多数のフルオレ
スセインがカラムに結合し、フルオレスセインによる修
飾がカラムの結合特性に影響を及ぼさないことが示され
た。 実施例１７ ＡＨ−セファロース（ファルマシア）を水に膨潤させ、
０．５Ｍ塩化ナトリウム、水および０．１Ｍりん酸ナト
リウム、ｐＨ７，０で洗浄した。このゲル懸濁液にスル
ホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チレート（ピアス）を加え、室温で１時間撹拌した。次
いでゲルを０．１Ｍりん酸ナトリウムｐＨ７，０バッフ
ァーで洗浄した。 約６ｍ９のシスティン含有変異体タイプ３をｐ）１７゜
Ｏバッファー１．１−に溶解した。次いで、吸引乾燥し
た活性化ゲルをこのタンパク質溶液に加えた。この懸濁
液を室温で１夜、逆転させた（エンドオーバーエンド）
。この時点で懸濁液にトリスおよびβ−メルカプトエタ
ノールを加えて室温で３時間回転させることにより過剰
の反応性残基を遮断（ブロック）した。インキュベーシ
ョン後、ゲルをカップリングバッファーで洗浄し、３サ
イクルのｐＨ４バツフアー（０，１Ｍ酢酸、０．５ＭＮ
ａＣのおよびｐＨ８バツフアー（０，１Ｍ）リスおよび
０．５Ｍ ＮａＣＱ）で洗浄した。次いでゲルをりん酸
緩衝化食塩水中、４℃で保存した。 固定化の程度を固定化の前および後の２８０ｎａ＋にお
ける吸光度の変化に基づいて測定した。反応における干
渉要素は透析で除いた。あるいはなんらかの標準タンパ
ク質定量アッセイ（例えばＢＣＡ 、 Ｌ ｏｖｒｙ
またはＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）を用いてタンパ
ク質固定化の程度を測定してもよい。 実施例１８ マレイミド固定化プロティンＧ変異体の結合能力の測定 固定化タンパク質をカラム（０，７Ｘ２．６ｃｍ）に充
填した後、１，０Ｍ酢酸で洗浄し、Ｐ Ｂ Ｓ （ｐＨ
７，０）で再度平衡化した。次いで、精製モノクローナ
ル抗体、血清または他の粗出発物質をカラムに適用した
。ＰＢＳで充分にカラムを洗浄した後、５ｍＭ酢酸アン
モニウム（ｐＨ５）、１．０Ｍ酢酸で溶出し、最後にＰ
ＢＳで平衡化した。タンパク質量は、それぞれ、ヒトお
よびマウス抗体に関する吸光係数１４４および１．４９
を用い、２８０ｎｍにおける吸光度に基づいて定量した
。 この１ｍ＆カラムには４．８９ｍ９のプロティンＧ変異
体タイプ３が含有されており、２９．５ｍｇのヒト［ｇ
Ｇおよび２０ｍｇのマウスモノクローナルＩｇＧ１が結
合している。 システィン残基をタンパク質に導入しチオールに特異的
な固定化化学反応を利用することにより、広範な修飾が
なされないタンパク産物が得られると考えられている。 即ち、その抗体結合能力が大きく高めらる。 比較のために種々の固定化の化学を用いた場合にゲル１
−に固定化されたプロティンＧ変異体２および３の量を
表６に示す。また表６には、固定化変異体２および３の
ヒトＩｇＧおよびマウスモノクローナルＩｇＧへの結合
能力も示されている。 表６から分かるように、タイプ３変異体はマレイミド化
学を利用するとはるかに高度に固定化される。しかもマ
レイミド化学によって固定化されたタイプ３変異体のヒ
トＩｇＧおよびマウスモノクローナルＩｇＧへの結合能
力は予想外に高い。 人−１ ２アルデヒド ３．３３ｘ９ １２．４ｘ９２ トレ
シル ２．５０ｍ９１２．５ｍ９３ トレシル
２．８５３１１９１６．７゜３ マレイミド ４
．８１ｍ９ ２９．５Ｒ９３、ｈｔｇ １、８ｍ９ ５、 ｈｇ ２０、０ｍｇ 本明細書において完全に本発明を記載したので、当業者
は製造の組成、条件および方法について広範囲に及ぶ等
価パラメーターを用い、本発明またはその実施態様の技
術的思想または範囲を逸脱することなく同様のことを実
施し得ることを認識するであろう。 ３、
第１図は、プラスミドｐＧＸ１０６６の特徴を示してい
る模式図、第２図は、プラスミドｐＧＸ４５３３の部分
的な制限地図、第３図および第３Ａ−Ｃ図は、プロティ
ンＧ遺伝子のＤＮＡ配列およびプロティンＧのアミノ酸
配列模式図、第４図は、プロティンＧ遺伝子の制限地図
およびタンパク質産物の反復構造の模式図、第５図は、
ＩＩＩＧｘ４５４７の部分的な制限地図、第６図は、ｌ
１ｌＧＸ７８８０の部分的な制限地図、第７図は、ｐＧ
ｘ４５８２の制限地図、第８図および第８Ａ−Ｃ図は、
プロティンＧ上における活性部位Ｂ１およびＢ２の配列
模式図、第９図および第９Ａ図は、クローン化プロティ
ンＧ遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列、第１０図は、
プロティンＧ遺伝子の反復構造の模式図、第１１図は、
プラスミドｐＧＸ４５９５の構築を示す模式図、第１２
図は、プラスミドｐＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９
の構築を示す模式図、第１３図は、プラスミドｐＧＸ５
２０３およびｐＧＸ５２０４の構築を示す模式図、第１
４図は、プラスミドｐＧＸ４５９２の構築を示す模式図
、第１５図は、プラスミドｐＧｘ５２４５の構築を示す
模式図、第１６図は、プラスミドｐＧＸ５２４７および
ｐＧＸ５２４６の構築を示す模式図、第１７図は、プラ
スミドｐＧＸ５２４４の構築を示す模式図、第１８図は
、プラスミドｐＧＸ５２５５およびｐＧＸ５２６８の構
築を示す模式図、並びに第１９図は、プラスミドｐＧＸ
５２６６の構築を示す模式図である。 特許出願人 ジェネックス・コーポレーション代 理
人 弁理士 青 山 葆（外１名）図面の浄書（内容
に変更なし） ＧＬＹ ＧＬＵ ＴＨＲＴＨＲＴＨＲＧＧＣＧＭ
ＡＣ＾ ＾口 ＾σ ツ 嚢 ｈｏｌ
る模式図、第２図は、プラスミドｐＧＸ４５３３の部分
的な制限地図、第３図および第３Ａ−Ｃ図は、プロティ
ンＧ遺伝子のＤＮＡ配列およびプロティンＧのアミノ酸
配列模式図、第４図は、プロティンＧ遺伝子の制限地図
およびタンパク質産物の反復構造の模式図、第５図は、
ＩＩＩＧｘ４５４７の部分的な制限地図、第６図は、ｌ
１ｌＧＸ７８８０の部分的な制限地図、第７図は、ｐＧ
ｘ４５８２の制限地図、第８図および第８Ａ−Ｃ図は、
プロティンＧ上における活性部位Ｂ１およびＢ２の配列
模式図、第９図および第９Ａ図は、クローン化プロティ
ンＧ遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列、第１０図は、
プロティンＧ遺伝子の反復構造の模式図、第１１図は、
プラスミドｐＧＸ４５９５の構築を示す模式図、第１２
図は、プラスミドｐＧＸ４５９７およびｐＧＸ４５９９
の構築を示す模式図、第１３図は、プラスミドｐＧＸ５
２０３およびｐＧＸ５２０４の構築を示す模式図、第１
４図は、プラスミドｐＧＸ４５９２の構築を示す模式図
、第１５図は、プラスミドｐＧｘ５２４５の構築を示す
模式図、第１６図は、プラスミドｐＧＸ５２４７および
ｐＧＸ５２４６の構築を示す模式図、第１７図は、プラ
スミドｐＧＸ５２４４の構築を示す模式図、第１８図は
、プラスミドｐＧＸ５２５５およびｐＧＸ５２６８の構
築を示す模式図、並びに第１９図は、プラスミドｐＧＸ
５２６６の構築を示す模式図である。 特許出願人 ジェネックス・コーポレーション代 理
人 弁理士 青 山 葆（外１名）図面の浄書（内容
に変更なし） ＧＬＹ ＧＬＵ ＴＨＲＴＨＲＴＨＲＧＧＣＧＭ
ＡＣ＾ ＾口 ＾σ ツ 嚢 ｈｏｌ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、固相支持体に固定化された単一ドメインプロテイン
Ｇ変異体。 ２、該プロテインＧ変異体がＢ２結合性ドメイン（タイ
プ５）を含有し、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである請求項１記
載の固定化単一ドメインプロテインＧ変異体。 ３、該プロテインＧ変異体が結合性ドメインＢ２（タイ
プ７）を含有し、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである請求項１記
載の固定化単一ドメインプロテインＧ変異体。 ４、該プロテインＧ変異体がＢ１結合性ドメイン（タイ
プ１０）を含有し、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである請求項１記
載の固定化単一ドメインプロテインＧ変異体。 ５、該プロテインＧ変異体がハイブリッド結合性ドメイ
ンＢ１′／Ｂ２（タイプ１１）を含有し、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである請求項１記
載の固定化単一ドメインプロテインＧ変異体。 ６、該固相支持体がアガロースである請求項１記載の固
定化単一ドメインプロテインＧ変異体。 ７、固相支持体に固定化されたシステイン−含有プロテ
インＧ変異体であって、該プロテインＧ変異体がシステ
イン基を介する結合によって固相支持体に固定化されて
おり、該固定化プロテインＧ変異体がＩｇまたはそのフ
ラグメントに対して高い結合能力を有するものである、
固相支持体に固定化されたシステイン−含有プロテイン
Ｇ変異体。 ８、該固相支持体がマレイミド−活性化アガロースであ
る請求項７記載の固定化変異体。９、該プロテインＧ変
異体が結合性ドメインＢ１およびＢ２（タイプ３）を含
有し、式；【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである請求項７記
載の固定化変異体。 １０、該プロテインＧ変異体が結合性ドメインＢ１およ
びＢ２（タイプ８）を含有し、式：【遺伝子配列があり
ます】 で示されるアミノ酸配列を有するものである請求項７記
載の固定化変異体。 １１、該プロテインＧ変異体が結合部位Ｂ１およびＢ２
（タイプ９）を含有し、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである請求項７記
載の固定化変異体。 １２、固相支持体に固定化されたプロテインＧ変異体で
あって、該プロテインＧ変異体が結合性ドメインＢ１お
よびＢ２（タイプ１）を含有し、式：【遺伝子配列があ
ります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである固定化プロ
テインＧ変異体。 １３、固相支持体に固定化されたプロテインＧ変異体で
あって、該プロテインＧ変異体が結合性ドメインＢ１お
よびＢ２（タイプ２）を含有化、式：【遺伝子配列があ
ります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである固定化プロ
テインＧ変異体。 １４、固相支持体に固定化されたプロテインＧ変異体で
あって、該プロテインＧ変異体が結合性ドメインＢ１お
よびＢ２（タイプ４）を含有し、式：【遺伝子配列があ
ります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである固定化プロ
テインＧ変異体。 １５、固相支持体に固定化されたプロテインＧ変異体で
あって、該プロテインＧ変異体が結合性ドメインＢ１、
Ｂ１／Ｂ２、およびＢ２（タイプ６）を含有し、式 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するものである固定化プロ
テインＧ変異体。 １６、該固相支持体がアガロースである請求項１２から
請求項１５のいずれかに記載の固定化プロテインＧ変異
体。 １７、ＩｇＧおよびＦｃフラグメントからＦａｂまたは
Ｆ（ａｂ′）＿２フラグメントを単離する方法であって
、 （ａ）Ｆｃフラグメント、ＩｇＧ、および少なくとも１
個のＦａｂまたはＦ（ａｂ′）＿２フラグメントを含有
する試料を固相支持体に固定化した単一ドメインプロテ
インＧ変異体と接触させ；さらに （ｂ）工程（ａ）で得た固相支持体をｐＨ５〜８の緩衝
液で洗浄してＦａｂまたはＦ（ａｂ′）＿２フラグメン
トを溶出液中に得、ＦｃフラグメントおよびＩｇＧが結
合した固相支持体を得ることからなる方法。 １８、該固定化単一ドメインプロテインＧ変異体が請求
項２から請求項５項のいずれかに記載の固定化プロテイ
ンＧ変異体である請求項１７記載の方法。 １９、固定化プロテインＧ変異体と結合したＩｇＧおよ
びＦｃフラグメントを、 （ｃ）工程（ｂ）で得た固相支持体をｐＨ３．５〜２．
４の緩衝液で洗浄して溶出液中にＩｇＧおよびＦｃフラ
グメントを得ることにより回収する請求項１７記載の方
法。 ２０、標的分子のアフィニティークロマトグラフィー法
であって、 （ａ）標的分子に特異的なＩｇＧを含有する第１試料を
請求項４記載の固相支持体に固定化されたプロテインＧ
変異体と接触させて固相支持体に不可逆的に固定化され
た標的分子−特異的ＩｇＧを得； （ｂ）標的分子を含有する第２試料と、工程（ａ）で得
た、標的分子に特異的なＩｇＧが固定化されている固相
支持体とを接触させ； （ｃ）工程（ｂ）で得た固相支持体をｐＨ５〜８の緩衝
液で洗浄して結合しなかった溶質を溶出させ； （ｄ）標的分子をｐＨ３．５〜２．４の緩衝液で溶出さ
せて溶出液中に得ることからなる方法。 ２１、ＩｇＧサブクラスの分画法であって、 （ａ）少なくとも２つのＩｇＧサブクラスを含有する試
料を請求項５記載の固相支持体に固定化されたプロテイ
ンＧ変異体を含有するカラムに適用し； （ｂ）カラムをｐＨ８〜２．４の緩衝液からなる連続的
または非連続的グラジエントで溶離し； （ｃ）ＩｇＧサブクラスを含有する溶出液を含有する画
分を採取することからなる方法。２２、該固相支持体が
アガロースである請求項１７、１９、２０または２１の
いずれかに記載の方法。 ２３、ＩｇＧを単離する方法であって、 （ａ）ＩｇＧを含有する試料を、固相支持体にシステイ
ン残基を介して固定化された少なくとも１個のシステイ
ン残基を含有するプロテインＧ変異体と接触させ； （ｂ）工程（ａ）で得た固相支持体をｐＨ５〜８の緩衝
液で洗浄して結合しなかった溶質を溶出させ； （ｃ）工程（ｂ）で得た固相支持体をｐＨ３．５〜２０
４の緩衝液で溶出させて溶出液中にＩｇＧ得ることから
なる方法。 ２４、該固定化プロテインＧ変異体が請求項８、９また
は１０のいずれかに記載の固定化プロテインＧ変異体で
ある請求項２３記載の方法。 ２５、天然にＩｇＧに付随する不純物をＩｇＧから分離
する方法であって、 （ａ）ＩｇＧを含有する試料を固相支持体に固定化され
たプロテインＧ変異体と接触させ； （ｂ）工程（ａ）で得た固相支持体をｐＨ５〜８の緩衝
液で洗浄して不純物を溶出させると共に、ＩｇＧが結合
したを固相支持体を得、 （ｃ）工程（ｂ）で得た固相支持体をｐＨ３．５〜２．
４の緩衝液で溶出させて溶出液中に天然にＩｇＧに付随
する不純物を伴わないＩｇＧを得ることからなる方法。
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