JPS6191129A - 抗腫瘍剤 - Google Patents
抗腫瘍剤Info
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- JPS6191129A JPS6191129A JP59211423A JP21142384A JPS6191129A JP S6191129 A JPS6191129 A JP S6191129A JP 59211423 A JP59211423 A JP 59211423A JP 21142384 A JP21142384 A JP 21142384A JP S6191129 A JPS6191129 A JP S6191129A
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- Japan
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- tnf
- protein
- amino acid
- antitumor agent
- tumor
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
童ス」の利用」ピ艷
この発明は、抗腫瘍剤に関し、更に詳しくは。
腫瘍壊死因子（以下ｒＴＮＦＪと記す）を含有する抗腫
瘍剤に関する。
瘍剤に関する。
貨】欽ｌ支権
ＴＮＦは動物正常細胞には壊死作用を示すことなく腫瘍
細胞のみを壊死又は死滅せしめる作用を有する。従って
、抗腫瘍剤として使用すべく研究されてきた。しかしな
がら従来、ＴＮＦ蛋白はある程度精製はされていたが、
抗腫瘍剤として使用するに耐えられる純度のＴＮＦ蛋白
は得られていなかった。ましてや、ＴＮＦを抗腫瘍剤と
して使用する際には、その物が化学的に特定できていな
ければならないが、その物を化学的に特定できる迄には
精製されていなかった。加えて、従来、腫瘍壊死作用を
有する蛋白の存在は知られていたが、その蛋白は一種類
のみか、あるいは多種の蛋白があるのかさえも知られて
いなかった。更に加えて従来知られていたウサギ由来の
ＴＮＦは、分子量４０〜５０ｋｄ （Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎ
ｃｅｒ、４０゜５３４〜５３９．１９７９）あるいは６
８〜５２ｋｄ （Ｊ、Ｉｍｍｎｏｌ、１２５．１６７１
〜１６７７．１９８０）であり、比較的分子量の大きな
ものであった。
細胞のみを壊死又は死滅せしめる作用を有する。従って
、抗腫瘍剤として使用すべく研究されてきた。しかしな
がら従来、ＴＮＦ蛋白はある程度精製はされていたが、
抗腫瘍剤として使用するに耐えられる純度のＴＮＦ蛋白
は得られていなかった。ましてや、ＴＮＦを抗腫瘍剤と
して使用する際には、その物が化学的に特定できていな
ければならないが、その物を化学的に特定できる迄には
精製されていなかった。加えて、従来、腫瘍壊死作用を
有する蛋白の存在は知られていたが、その蛋白は一種類
のみか、あるいは多種の蛋白があるのかさえも知られて
いなかった。更に加えて従来知られていたウサギ由来の
ＴＮＦは、分子量４０〜５０ｋｄ （Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎ
ｃｅｒ、４０゜５３４〜５３９．１９７９）あるいは６
８〜５２ｋｄ （Ｊ、Ｉｍｍｎｏｌ、１２５．１６７１
〜１６７７．１９８０）であり、比較的分子量の大きな
ものであった。
方朋Ｊ」騰−しようとするｌ。
従って本発明の目的は、物として特定でき、かつ抗腫瘍
剤として使用できるような高度に精製された７１’ＮＦ
蛋白を得、これによってＴＮＦを抗腫瘍剤として使用で
きるようにすることにある。
剤として使用できるような高度に精製された７１’ＮＦ
蛋白を得、これによってＴＮＦを抗腫瘍剤として使用で
きるようにすることにある。
問題点を解決するための手段
成上の問題点を解決するため、本発明者らは鋭意研究の
結果、ＴＮＦ蛋白を化学的に特定し、かつ高度に精製す
ることによって、抗腫瘍剤として使用できるＴＮＦ標品
を得ることに成功した。
結果、ＴＮＦ蛋白を化学的に特定し、かつ高度に精製す
ることによって、抗腫瘍剤として使用できるＴＮＦ標品
を得ることに成功した。
即ち、この発明は以下の内容を骨子とするものである。
マウス線維芽細胞を標的細胞とした時の細胞壊死比活性
が２Ｘ１０７単位／ｍｇ−ｍ白以上であり、かつ腫ｆｆ
５１ｙ、ＡＪ死囚子蛋白が分子中に下記のアミノ酸配列
を有し、かつ分子量が１８ｋｄである腫瘍壊死蛋白を含
有する抗腫瘍剤。
が２Ｘ１０７単位／ｍｇ−ｍ白以上であり、かつ腫ｆｆ
５１ｙ、ＡＪ死囚子蛋白が分子中に下記のアミノ酸配列
を有し、かつ分子量が１８ｋｄである腫瘍壊死蛋白を含
有する抗腫瘍剤。
Ｓｃｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｖａｌ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ−）！１
ｓ−Ｔｒｙ−Ｇｉｎ 但しＸはＣｙ ｓ Ｈ又は糖を有するアミノ酸ＴＮＦは
以下のように製造することができる。
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｖａｌ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ−）！１
ｓ−Ｔｒｙ−Ｇｉｎ 但しＸはＣｙ ｓ Ｈ又は糖を有するアミノ酸ＴＮＦは
以下のように製造することができる。
即ち、ウサギ、サル、ヒツジ、マウス、ラット、モルモ
ット、ウシ、ヤギ、イヌ等の哺乳動物の血管内、通常は
静脈内にマクロファージ賦活剤を投与する。投与方法は
、使用するマクロファージ賦活剤により異なるが、要は
血清中のＴＮＦ活性が最も高くなるように適宜予め定め
ておけばよい。
ット、ウシ、ヤギ、イヌ等の哺乳動物の血管内、通常は
静脈内にマクロファージ賦活剤を投与する。投与方法は
、使用するマクロファージ賦活剤により異なるが、要は
血清中のＴＮＦ活性が最も高くなるように適宜予め定め
ておけばよい。
マクロファージ賦活剤としては、生体内においてマクロ
ファージに作用してマクロファージの異物諏別作用又は
貧食作用等のマクロファージの作用が賦活されるような
ものをいう。このような賦活作用の有無は、マクロファ
ージ賦活剤を投与した哺乳動物よりマクロファージを分
離して、生体外にてマクロファージの活性を調べること
により知ることができる。
ファージに作用してマクロファージの異物諏別作用又は
貧食作用等のマクロファージの作用が賦活されるような
ものをいう。このような賦活作用の有無は、マクロファ
ージ賦活剤を投与した哺乳動物よりマクロファージを分
離して、生体外にてマクロファージの活性を調べること
により知ることができる。
マクロファージ賦活剤の具体例としては、リポポリサッ
カライド、ＢＣＧ、インターフェロンで、レンチナン、
ザイモザン、リピドＡ、ポリ−■。
カライド、ＢＣＧ、インターフェロンで、レンチナン、
ザイモザン、リピドＡ、ポリ−■。
Ｃ等がある。
このようにして感作された哺乳動物より、ＴＮｌ？は、
その分子量、溶屏度、電荷、特異的吸着能等を利用して
分Ｈ，精製することができる１例えば、透析、ゲルクロ
マトグラフィー、塩析、極性有機溶媒による沈澱及び電
気泳動、アフィニティークロマ！−グラフィー等を適宜
組み合せることによりｆ１７製する。より具体的には次
のような方法がある。
その分子量、溶屏度、電荷、特異的吸着能等を利用して
分Ｈ，精製することができる１例えば、透析、ゲルクロ
マトグラフィー、塩析、極性有機溶媒による沈澱及び電
気泳動、アフィニティークロマ！−グラフィー等を適宜
組み合せることによりｆ１７製する。より具体的には次
のような方法がある。
ｎ１ｌｉ乳動物から得られた血清を１００％飽和度の硫
安溶液を最終的に６０％となるように血清中に添加して
Ｔ Ｎ Ｆを沈澱させる。この沈澱をリン酸ｉυ！’７
ｔｅｉで７容解し、Ｄ ＩミＡＥセファデックスの陰
イオン交換プロマトグラフィーにかけ、低塩；負度がら
、：゛６塩濃度のり衝液でＴＮＦを溶７１−させる。こ
れ１？Ｉの１１１出液のうちＴ Ｎ ｒ−”の活性のあ
る部分をセフアリルＳ−２００のゲル濾過にかける。こ
のゲル濾過操作を２回（り返し、もう一度、陰イオン交
換クロマ１−グラフィーにかける。このようにして得ら
扛だサンプルからブルーセファロース−６３の特異的ク
ロマトグラフィーによりアルブミンをとり除き精製”１
’ Ｎ Ｆとする。
安溶液を最終的に６０％となるように血清中に添加して
Ｔ Ｎ Ｆを沈澱させる。この沈澱をリン酸ｉυ！’７
ｔｅｉで７容解し、Ｄ ＩミＡＥセファデックスの陰
イオン交換プロマトグラフィーにかけ、低塩；負度がら
、：゛６塩濃度のり衝液でＴＮＦを溶７１−させる。こ
れ１？Ｉの１１１出液のうちＴ Ｎ ｒ−”の活性のあ
る部分をセフアリルＳ−２００のゲル濾過にかける。こ
のゲル濾過操作を２回（り返し、もう一度、陰イオン交
換クロマ１−グラフィーにかける。このようにして得ら
扛だサンプルからブルーセファロース−６３の特異的ク
ロマトグラフィーによりアルブミンをとり除き精製”１
’ Ｎ Ｆとする。
得られたＴＮＦ蛋白の化学的及び生物学的性質は以下の
とおりである。
とおりである。
（，１）得られたＴＮＦ蛋白標品は、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（ｐＨ８，３）により１８ｋ
ｄであるが、「セファクリル３−２００Ｊによるゲル濾
過法では３４ｋｄである。
リルアミドゲル電気泳動法（ｐＨ８，３）により１８ｋ
ｄであるが、「セファクリル３−２００Ｊによるゲル濾
過法では３４ｋｄである。
（ｂ）Ｎ−末端部分のアミノ酸配列は以下のとおりであ
る。
る。
（Ｉｌｉｓ）−３ｅｒ”Ｈｉｓ−Ｖａｌ Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｘ−Ｖａ ｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｑｌｙ
−Ａｒｇｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒ但しＸはＣｙ ｇ
Ｈ又は糖を有するアミノ酸である。又Ｎ−末端のＨｉｓ
は確認していない。
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｘ−Ｖａ ｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｑｌｙ
−Ａｒｇｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒ但しＸはＣｙ ｇ
Ｈ又は糖を有するアミノ酸である。又Ｎ−末端のＨｉｓ
は確認していない。
（ｃ）ｉ”ＮＦはｒ−−９２９２４１１胞を特異的に壊
死せしめる。またＭ Ｈ１３４腫疫細胞を腹部皮内に移
植されたＣ ３ Ｈ／ Ｈｅマウスに対し、延命効果を
示す。
死せしめる。またＭ Ｈ１３４腫疫細胞を腹部皮内に移
植されたＣ ３ Ｈ／ Ｈｅマウスに対し、延命効果を
示す。
（ｆ）熱安定イ′ｌ ： ５６°Ｃ，３０分安定、７０
℃、２０′ｌｒ、５０％失活、１００°Ｃ，２分、１０
０％失Ｉ舌、 （ｅ、）ノ・ｒラミニダーゼ、ヒアルダーゼ及びトリプ
シンに対して安定。
℃、２０′ｌｒ、５０％失活、１００°Ｃ，２分、１０
０％失Ｉ舌、 （ｅ、）ノ・ｒラミニダーゼ、ヒアルダーゼ及びトリプ
シンに対して安定。
１’ Ｎ Ｆけ以下のように定性及び定歌分析できる。
即ち、標的細胞であるＬ−９２９ＫＭ胞（Ｐｒｏｃ。
Ｎ；＋ ｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７
２゜３６６６−３６７０）をイーグルミニマムエソセン
ンヤルｈ′ｒ地（以下Ｍ ＴＥ Ｍと記す）に５％仔牛
脂児血清を加え育成し、８ＸＩＯａ！胞が１００−１の
同上培地に含まれる様にし、９６六の平底プレートに育
種する。育種条件は３７℃、２時間５％Ｃ０２１００％
ト■２０で通常細胞培養に用いられる方法でよい。その
後アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１．−ｇ／ｍｌ
となる様に加え、培養液の液量を１５０、−１とする。
２゜３６６６−３６７０）をイーグルミニマムエソセン
ンヤルｈ′ｒ地（以下Ｍ ＴＥ Ｍと記す）に５％仔牛
脂児血清を加え育成し、８ＸＩＯａ！胞が１００−１の
同上培地に含まれる様にし、９６六の平底プレートに育
種する。育種条件は３７℃、２時間５％Ｃ０２１００％
ト■２０で通常細胞培養に用いられる方法でよい。その
後アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１．−ｇ／ｍｌ
となる様に加え、培養液の液量を１５０、−１とする。
即座にｈ−ＴＮ Ｆを含むと考えられる検体を適当にＭ
ＥＭ培地で稀釈したものを５０Ｐｌ加える。この際稀釈
率を適宜７Ｂ製し、ＥＤ５０を求める事ができる。更に
最終液量２００ 、、 ｌとなったＬ９２９剛胞を上記
条件で１８ｈｒ培養を継続する。細胞壊死活性は、まず
全培地を除去し、ここに０．２％クリスタルバイオレッ
トを含む２％メチルアルコール溶液を加え固定染色する
。クリスタルバイオレットは全有核細胞を染色するので
、ｈ −ＴＮ Ｆにより特異的に細胞壊死を生じた結果
フラスコ底面より遊歴した細胞は染色されないのでｈ−
ＴＮ Ｆ活性を直接に測定できる。この染色度を○Ｄ５
９０ｎｍの吸収でｉｌｌ！ｌ定し、対照群に対する染色
度と比１１２する事でｈ −Ｔ Ｎ Ｆを測定する。活
性の定義は次の様に行う。Ｌ９２９細胞が５０％生存で
きる検体原液の稀釈率をＸとした時、その稀釈率の逆数
に１０−３を乗じた値を原液の１ｍｌあたりの活性とす
る。即ち原液の１０００分の１稀釈でＥＤ５０を与える
検体の活性は１単位／ ｍ ｌである。
ＥＭ培地で稀釈したものを５０Ｐｌ加える。この際稀釈
率を適宜７Ｂ製し、ＥＤ５０を求める事ができる。更に
最終液量２００ 、、 ｌとなったＬ９２９剛胞を上記
条件で１８ｈｒ培養を継続する。細胞壊死活性は、まず
全培地を除去し、ここに０．２％クリスタルバイオレッ
トを含む２％メチルアルコール溶液を加え固定染色する
。クリスタルバイオレットは全有核細胞を染色するので
、ｈ −ＴＮ Ｆにより特異的に細胞壊死を生じた結果
フラスコ底面より遊歴した細胞は染色されないのでｈ−
ＴＮ Ｆ活性を直接に測定できる。この染色度を○Ｄ５
９０ｎｍの吸収でｉｌｌ！ｌ定し、対照群に対する染色
度と比１１２する事でｈ −Ｔ Ｎ Ｆを測定する。活
性の定義は次の様に行う。Ｌ９２９細胞が５０％生存で
きる検体原液の稀釈率をＸとした時、その稀釈率の逆数
に１０−３を乗じた値を原液の１ｍｌあたりの活性とす
る。即ち原液の１０００分の１稀釈でＥＤ５０を与える
検体の活性は１単位／ ｍ ｌである。
鼓盤
（］）ＴＮＦの単離、精製
日本白色家兎（体重２．５ないし３．０ｋｇ）１０羽に
１８ｍｇ／羽のＢＣＧ （日本ＢＣＧ（株）、凍結乾燥
品〕を静脈投与し、２週間後８０オ、 ｇ ７羽のＥ、
ｃｏｌｉ０１２７のりポボリサツカライド（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｂ８）を静脈投与し、２
時間後、全血を採取した。得ら第１た４００ｍ１の全血
清に６００ｍ１の硫安飽和溶液を添加し、ｐＨ７，０，
４℃にて一夜ゆっくり撹拌した。生じた沈澱を１２０
ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃｌを含む５０ｍＭリン酸ｆｔ ＦＷ
液（ｐ Ｈ７、０） ２０ ｍｌにけん濁し、４℃に
て一夜１２０ ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ１を含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液に対し透析を行った。
１８ｍｇ／羽のＢＣＧ （日本ＢＣＧ（株）、凍結乾燥
品〕を静脈投与し、２週間後８０オ、 ｇ ７羽のＥ、
ｃｏｌｉ０１２７のりポボリサツカライド（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｂ８）を静脈投与し、２
時間後、全血を採取した。得ら第１た４００ｍ１の全血
清に６００ｍ１の硫安飽和溶液を添加し、ｐＨ７，０，
４℃にて一夜ゆっくり撹拌した。生じた沈澱を１２０
ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃｌを含む５０ｍＭリン酸ｆｔ ＦＷ
液（ｐ Ｈ７、０） ２０ ｍｌにけん濁し、４℃に
て一夜１２０ ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ１を含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液に対し透析を行った。
透析内液を予め１２０ｍＭＮａＣ１を含む５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて平衡にしたｒＤＥΔ１号セ
ファデックス」に負荷して、蛋白画分を吸着せしめ、１
２０〜４００ｍＭＮａＣ１にて濃度勾配溶出を行い、２
５０〜３５０ｍＭのＮａ ＣＩにて溶出された両分を採
取した。溶出液を限外濾過膜〔東洋化学（株）、セルロ
ースフィルター、ＭＷ１万以下通過〕を用いてｌｏｍ１
程度に迄濃縮し、濃縮液を１２０ｍＭ ＮａＣ１を含
む５０ｍＭリン酸緩衝液にて平衡にした［セファクリル
Ｓ−２００Ｊ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＮＪ）カラム
に負荷し、分子量３０〜４０．ｋｄの両分を採取した。
酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて平衡にしたｒＤＥΔ１号セ
ファデックス」に負荷して、蛋白画分を吸着せしめ、１
２０〜４００ｍＭＮａＣ１にて濃度勾配溶出を行い、２
５０〜３５０ｍＭのＮａ ＣＩにて溶出された両分を採
取した。溶出液を限外濾過膜〔東洋化学（株）、セルロ
ースフィルター、ＭＷ１万以下通過〕を用いてｌｏｍ１
程度に迄濃縮し、濃縮液を１２０ｍＭ ＮａＣ１を含
む５０ｍＭリン酸緩衝液にて平衡にした［セファクリル
Ｓ−２００Ｊ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＮＪ）カラム
に負荷し、分子量３０〜４０．ｋｄの両分を採取した。
溶出液を限外濾過〔濾過膜、東洋化学（株）、セルロー
スフィルター、ＭＷ１万以下通過〕にて濃縮し、濃縮液
を「セファクリルＳ−２００」を用いて、ゲル濾過を行
った。溶出液を更にＤＥＡＥ−セファデックスカラムを
用い、２００〜３５０ｍＭＮａＣ１にて濃度勾配溶出を
行った。溶出液（２５０〜３５０ｍＭ）よりアルブミン
を除くため、゛予め１００ｍＭ ＫＣＩを含む５”
ＯｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐＨ７，０）に
て平衡化した「セファロース−６ＢＪカラムによるプロ
マトグラフィーを行い、溶出液を乾燥して、比活性２Ｘ
ＩＯ７単位／ｍｇのＴＮＦ蛋白４５０．。
スフィルター、ＭＷ１万以下通過〕にて濃縮し、濃縮液
を「セファクリルＳ−２００」を用いて、ゲル濾過を行
った。溶出液を更にＤＥＡＥ−セファデックスカラムを
用い、２００〜３５０ｍＭＮａＣ１にて濃度勾配溶出を
行った。溶出液（２５０〜３５０ｍＭ）よりアルブミン
を除くため、゛予め１００ｍＭ ＫＣＩを含む５”
ＯｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ （ｐＨ７，０）に
て平衡化した「セファロース−６ＢＪカラムによるプロ
マトグラフィーを行い、溶出液を乾燥して、比活性２Ｘ
ＩＯ７単位／ｍｇのＴＮＦ蛋白４５０．。
ｇを得た。
精製の間のＴＮＦ蛋白の比活性及び回収率を第１表に示
す。
す。
第 １ 表
＊：１０３単位／ ｍ ｇ−蛋白
（２）ＴＮＦ＄ｉ’Ｊ製蛋白の性質
得られたＴＮＦ蛋白は「セファクリルＳ−２００」によ
るゲル濾過により３４ｋｄであり、また５ＤＳ−ポリア
クリルゲル電気泳動による分子量は１８ｋｄであった。
るゲル濾過により３４ｋｄであり、また５ＤＳ−ポリア
クリルゲル電気泳動による分子量は１８ｋｄであった。
”Ｉ’ Ｎ Ｆ蛋白のアミノ酸配列を決定するために６
・−ｇのＴＮＦをプロティン・セクエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ、。
・−ｇのＴＮＦをプロティン・セクエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ、。
Ｃａ１ｆ、Ｍｏｄｅｌ ４７０Ａ）に導入した。
アミノ酸配列の決定方法は Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、
、 １９３．２６５ ２７５ （１９５１）に記載さ
れ、ている方法により行なった。
、 １９３．２６５ ２７５ （１９５１）に記載さ
れ、ている方法により行なった。
実施例２
（１）ＴＮＦの単独使用による生理作用Ｃ３Ｈ／ ｌ−
１ｅマウス腹部皮肉にＭＨ１３４１１１瘍細胞を２Ｘ１
０’細胞数移植し、移植後４日で腫瘍が一定の大きさに
生着したものを無差別に部分けし、４，７．１０日の日
程で、実施例１において得られた精製きれたＴＮＦを１
１０単位ずつ腫瘍内に投与した。２〜３日おきに腫瘍の
大きさを測定した。腫瘍の大きさは、腫瘍の最大長ｍと
最小長ｎの対数平均で表わした。又、対照群には、ＴＮ
Ｆと同様な日程で生理食塩液を投与した。
１ｅマウス腹部皮肉にＭＨ１３４１１１瘍細胞を２Ｘ１
０’細胞数移植し、移植後４日で腫瘍が一定の大きさに
生着したものを無差別に部分けし、４，７．１０日の日
程で、実施例１において得られた精製きれたＴＮＦを１
１０単位ずつ腫瘍内に投与した。２〜３日おきに腫瘍の
大きさを測定した。腫瘍の大きさは、腫瘍の最大長ｍと
最小長ｎの対数平均で表わした。又、対照群には、ＴＮ
Ｆと同様な日程で生理食塩液を投与した。
Ｍｌ１１３４腫ｆＭ細胞：Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス由来１］
Ｆ癌で腹水増殖可能にした腫瘍で、６〜８日の間隔で継
代したものを用いた。
Ｆ癌で腹水増殖可能にした腫瘍で、６〜８日の間隔で継
代したものを用いた。
Ｃ３Ｈ／ｌｌｃマウス：通交系マウスで８週令のものを
用いた。
用いた。
ＴＮＦ：部分精製して比活性が３００〜２０００倍上昇
したサンプルを用いた。
したサンプルを用いた。
その結果、対照群においては、腫瘍移植日から２２日に
至るまで腫瘍が増殖をつづけ、２２日目における腫瘍の
大きさは１８ｍｍに達し、最終的には全て死亡した。一
方、ＴＮＦ投与群においては腫瘍移植後７日から１０日
にかけて著明な腫瘍の退縮が見られ、最終的には完全治
癒マウスも出た。このことより、大量の１１０単位のＴ
ＮＦは単独でも強い抗腫瘍効果を持つことが示された。
至るまで腫瘍が増殖をつづけ、２２日目における腫瘍の
大きさは１８ｍｍに達し、最終的には全て死亡した。一
方、ＴＮＦ投与群においては腫瘍移植後７日から１０日
にかけて著明な腫瘍の退縮が見られ、最終的には完全治
癒マウスも出た。このことより、大量の１１０単位のＴ
ＮＦは単独でも強い抗腫瘍効果を持つことが示された。
ちなみにｒ、ｐｓ（リポポリサッカライド）の単独での
最大効果は、この実験系において１８日目で腫瘍径にし
て１０ｍｍ前後であった。
最大効果は、この実験系において１８日目で腫瘍径にし
て１０ｍｍ前後であった。
（２）ＴＮＦの併用効果
シイタケ由来の多糖、レンチナン（Ｌｅｎｔｉｎａｎ）
と併用制癌効果を持つが、検討を行なった。
と併用制癌効果を持つが、検討を行なった。
Ｍ Ｈ１３４ｆｌｉｆＩＩｉｌｌ胞を２Ｘ１０５細胞数
、Ｃ３１−１／ Ｈｅマウス腹部皮肉に移植後、（１）
と同様に４．７．１０日目にＴＮＦを２．５単位ずつ腫
瘍内に投与した。レンチナンは６．２５ｍｇ／ｋｇを腹
腔内に１２日、１４日目に投与した。抗腫瘍効果の判定
は（１）と同様に２２日における腫瘍径と延命日数によ
った。
、Ｃ３１−１／ Ｈｅマウス腹部皮肉に移植後、（１）
と同様に４．７．１０日目にＴＮＦを２．５単位ずつ腫
瘍内に投与した。レンチナンは６．２５ｍｇ／ｋｇを腹
腔内に１２日、１４日目に投与した。抗腫瘍効果の判定
は（１）と同様に２２日における腫瘍径と延命日数によ
った。
又、Ｍｌ（１３４と異なる腫瘍であるルイス肺癌（３Ｌ
Ｌ）に対する効果も調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス腹
部皮内に３’ＬＬを３Ｘ１０５細胞数移植して、ＴＮＦ
を５単位ずつ４，７，１０．１２゜１４１」に投与した
。レンチナンは６．２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内に６．８，
１０，１２．１４日目に投与した。抗ＩＩＩ！瘍効果は
ＭＨ１３４と同様な方法で判定した。
Ｌ）に対する効果も調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス腹
部皮内に３’ＬＬを３Ｘ１０５細胞数移植して、ＴＮＦ
を５単位ずつ４，７，１０．１２゜１４１」に投与した
。レンチナンは６．２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内に６．８，
１０，１２．１４日目に投与した。抗ＩＩＩ！瘍効果は
ＭＨ１３４と同様な方法で判定した。
ＭＨＩ３４１１１！瘍細胞＝ （１）と同様。
ルイス肺癌（３ＬＬ）：マウス肺癌で２週問おきに継代
して用いた。
して用いた。
Ｃ３Ｈ／ Ｈｅマウス： （１）と同様。
Ｃ３Ｈ／ Ｈｅマウス：通交系マウスで８週令のものを
用いた。
用いた。
レンチナン：シイタケ由来のβｌ−３結合を主鎖とする
グルカンである。味の素株式 会社より供与された。
グルカンである。味の素株式 会社より供与された。
結果は第２表に示すように、レンチナン単独投与群やＴ
ＮＦ単独投与群においては、２２日において対照群との
間に差は認められなかった。一方、ＴＮＦとレンチナン
の併用群においては、腫瘍移植後２２日１において、対
照群のみならず、ＴＮＦ甲、独群やレンチナン単独群と
の間でも、腫瘍の大きさにおいて有意な差が認められ、
ＴＮＦとレンチナンの併用が、有効な制癌効果を持つこ
とが示された。
ＮＦ単独投与群においては、２２日において対照群との
間に差は認められなかった。一方、ＴＮＦとレンチナン
の併用群においては、腫瘍移植後２２日１において、対
照群のみならず、ＴＮＦ甲、独群やレンチナン単独群と
の間でも、腫瘍の大きさにおいて有意な差が認められ、
ＴＮＦとレンチナンの併用が、有効な制癌効果を持つこ
とが示された。
第２表において、腫瘍大きさは腫瘍移植後２２日におけ
るものであり、延命日数増加率は対照群の生存日数を１
００としたときの治療群の延命日数を％で示したもので
ある。
るものであり、延命日数増加率は対照群の生存日数を１
００としたときの治療群の延命日数を％で示したもので
ある。
第 ２ 表
Claims (1)
- （１）マウス線維芽細胞を標的細胞とした時の細胞壊死
比活性が２×１０＾７単位／ｍｇ−蛋白以上であり、か
つ腫瘍壊死因子蛋白が分子中に下記のアミノ酸配列を有
し、かつ分子量が１８ｋｄである腫瘍壊死蛋白を含有す
る抗腫瘍剤。 【アミノ酸配列があります】 但しＸはＣｙｓＨ又は糖を有するアミノ酸
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59211423A JPS6191129A (ja) | 1984-10-11 | 1984-10-11 | 抗腫瘍剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59211423A JPS6191129A (ja) | 1984-10-11 | 1984-10-11 | 抗腫瘍剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6191129A true JPS6191129A (ja) | 1986-05-09 |
Family
ID=16605707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59211423A Pending JPS6191129A (ja) | 1984-10-11 | 1984-10-11 | 抗腫瘍剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6191129A (ja) |
-
1984
- 1984-10-11 JP JP59211423A patent/JPS6191129A/ja active Pending
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