JPH06107693A - 蛋白質とその蛋白質をコードするｄｎａ並びにその蛋白質の製造方法 - Google Patents
蛋白質とその蛋白質をコードするｄｎａ並びにその蛋白質の製造方法Info
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- JPH06107693A JPH06107693A JP4281136A JP28113692A JPH06107693A JP H06107693 A JPH06107693 A JP H06107693A JP 4281136 A JP4281136 A JP 4281136A JP 28113692 A JP28113692 A JP 28113692A JP H06107693 A JPH06107693 A JP H06107693A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 癌転移抑制剤として有用な新規蛋白質とその
蛋白質をコードするＤＮＡ、さらには、その蛋白質の製
造方法を提供することを目的とする。 【構成】 癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、その蛋
白質をコードするＤＮＡ、並びに、その蛋白質の産生能
を有する細胞を培養し、その培養上清から蛋白質を採取
してなる当該蛋白質の製造方法を構成とする。
蛋白質をコードするＤＮＡ、さらには、その蛋白質の製
造方法を提供することを目的とする。 【構成】 癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、その蛋
白質をコードするＤＮＡ、並びに、その蛋白質の産生能
を有する細胞を培養し、その培養上清から蛋白質を採取
してなる当該蛋白質の製造方法を構成とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、癌転移抑制活性を有す
る新規蛋白質とその蛋白質をコードするＤＮＡ、さらに
は、その蛋白質の製造方法に関するものである。
る新規蛋白質とその蛋白質をコードするＤＮＡ、さらに
は、その蛋白質の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】現在、癌の治療は、主として外科的手
術、化学療法、放射線療法により行われている。多くの
癌はこれらの方法により治療できるが、万一、癌細胞の
一部が治療後も生き残るようなことがあると、その生き
残った一部の癌細胞が撒き散らされて一層重篤な癌転移
を促進し、患者の寿命を却って縮めてしまうことにな
る。癌転移が抑制できれば、癌患者の苦痛を和らげ、余
命を大幅に延ばすことが可能になると考えられ、現在、
有効な癌転移抑制剤の開発が強く望まれている。しかし
ながら、癌転移は一般に複雑な過程を経て成立すると考
えられており、それ故に、未だ有効な癌転移抑制剤を開
発できないでいるというのが実状である。
術、化学療法、放射線療法により行われている。多くの
癌はこれらの方法により治療できるが、万一、癌細胞の
一部が治療後も生き残るようなことがあると、その生き
残った一部の癌細胞が撒き散らされて一層重篤な癌転移
を促進し、患者の寿命を却って縮めてしまうことにな
る。癌転移が抑制できれば、癌患者の苦痛を和らげ、余
命を大幅に延ばすことが可能になると考えられ、現在、
有効な癌転移抑制剤の開発が強く望まれている。しかし
ながら、癌転移は一般に複雑な過程を経て成立すると考
えられており、それ故に、未だ有効な癌転移抑制剤を開
発できないでいるというのが実状である。
【０００３】なお、これまでにも、癌転移抑制活性を有
する様々な蛋白質が報告されているけれども、何れも本
発明の蛋白質とは相違するものである。例えば、インタ
ーフェロン、インターロイキン−２及び腫瘍壊死因子が
癌転移抑制活性を有するとの報告があるが、これらは何
れも分子量及びアミノ酸配列において本発明の蛋白質と
は明らかに異なり、且つ、何れも未だ有効な癌転移抑制
剤とはなり得ていない。一方、特開平２−３０８７９９
号公報には、ヒト造血器由来の細胞が産生する癌転移抑
制因子が開示されているけれども、例えば、分子量一つ
とってみても１０，０００乃至４５０，０００と極めて
曖昧であり、物質としての構造や性質・性状が明らかに
されているとは言い難い。
する様々な蛋白質が報告されているけれども、何れも本
発明の蛋白質とは相違するものである。例えば、インタ
ーフェロン、インターロイキン−２及び腫瘍壊死因子が
癌転移抑制活性を有するとの報告があるが、これらは何
れも分子量及びアミノ酸配列において本発明の蛋白質と
は明らかに異なり、且つ、何れも未だ有効な癌転移抑制
剤とはなり得ていない。一方、特開平２−３０８７９９
号公報には、ヒト造血器由来の細胞が産生する癌転移抑
制因子が開示されているけれども、例えば、分子量一つ
とってみても１０，０００乃至４５０，０００と極めて
曖昧であり、物質としての構造や性質・性状が明らかに
されているとは言い難い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このような状況に鑑
み、本発明の目的とするところは、癌転移を効果的に抑
制する新規な蛋白質を提供することにある。
み、本発明の目的とするところは、癌転移を効果的に抑
制する新規な蛋白質を提供することにある。
【０００５】本発明の別の目的は、その蛋白質をコード
するＤＮＡを提供することにある。
するＤＮＡを提供することにある。
【０００６】本発明のさらなる目的は、その蛋白質の製
造方法を提供することにある。
造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等が癌転移抑制
活性を有する新規物質を見出すべく鋭意研究したとこ
ろ、ヒトＴ細胞白血病由来の株化細胞であるＨＰＢ−Ｍ
ＬＴ細胞（微工研条寄第２４３０号）をカルメット・ゲ
ランウシ型結核菌（以下、「ＢＣＧ」と略記する。）及
びリポ多糖（以下、「ＬＰＳ」と略記する。）で刺激す
ると、その培養上清中に癌転移抑制活性が出現すること
を見出した。そして、その本体を解明すべく鋭意研究を
続けたところ、癌転移抑制活性の本体は蛋白質であり、
次のような理化学的性質を有するものであることが判明
した。
活性を有する新規物質を見出すべく鋭意研究したとこ
ろ、ヒトＴ細胞白血病由来の株化細胞であるＨＰＢ−Ｍ
ＬＴ細胞（微工研条寄第２４３０号）をカルメット・ゲ
ランウシ型結核菌（以下、「ＢＣＧ」と略記する。）及
びリポ多糖（以下、「ＬＰＳ」と略記する。）で刺激す
ると、その培養上清中に癌転移抑制活性が出現すること
を見出した。そして、その本体を解明すべく鋭意研究を
続けたところ、癌転移抑制活性の本体は蛋白質であり、
次のような理化学的性質を有するものであることが判明
した。
【０００８】（１）分子量 ４５，０００±５，０００
【０００９】（２）等電点 ｐＩ＝５．７±０．５
【００１０】（３）部分アミノ酸配列 Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ又はＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕを有す
る。
ｙｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ又はＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕを有す
る。
【００１１】（４）溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶。
【００１２】（５）生物活性 ヒト大腸癌由来の株化培養細胞であるＲＰＭＩ４７８８
細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を抑制する活性
を有する。
細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を抑制する活性
を有する。
【００１３】（６）安定性 水溶液中、ｐＨ７．２において１００℃で３０分間放置
すると失活する。水溶液中、ｐＨ７．２において４℃で
一ヶ月間放置しても安定。
すると失活する。水溶液中、ｐＨ７．２において４℃で
一ヶ月間放置しても安定。
【００１４】本発明者等が当該蛋白質を単離し、そのア
ミノ酸配列を分析したところ、化１に示すようなアミノ
酸配列を有することが判明した。なお、本発明で言う
「実質的に化１で表わされるアミノ酸配列を含有する」
とは、本発明の蛋白質は化１に示すアミノ酸配列を有す
るもののみに限定されず、その相同変異体をも包含する
ということを意味する。言い換えれば、前記理化学的性
質を有する限り、化１に示すアミノ酸配列の一部のみを
有する蛋白質も本発明に包含される。
ミノ酸配列を分析したところ、化１に示すようなアミノ
酸配列を有することが判明した。なお、本発明で言う
「実質的に化１で表わされるアミノ酸配列を含有する」
とは、本発明の蛋白質は化１に示すアミノ酸配列を有す
るもののみに限定されず、その相同変異体をも包含する
ということを意味する。言い換えれば、前記理化学的性
質を有する限り、化１に示すアミノ酸配列の一部のみを
有する蛋白質も本発明に包含される。
【００１５】
【化１】
【００１６】このアミノ酸配列に基づき、ＨＰＢ−ＭＬ
Ｔ細胞から本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを検索し
たところ、化２に示す塩基配列を含むことが判明した。
本発明のＤＮＡも化２に示す塩基配列のもののみに限定
されず、本発明で言う「実質的に化２で表わされる塩基
配列を有する」とは、化２に示す塩基配列全体を含むも
のは言うに及ばず、その一部を含むものをも包含し得る
ことを意味する。例えば、遺伝コードの縮重に基づき、
化２に示す塩基配列における一以上の塩基が他の塩基に
置換されたもの、前記のような相同変異体を暗号指定す
る塩基配列、さらには、化２に示す塩基配列と相補的な
塩基配列も本発明に包含される。なお、相補的な塩基配
列の場合、化２に示す塩基配列全体に相補的な配列であ
っても良いし、その一部と相補的な配列であっても良
い。
Ｔ細胞から本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを検索し
たところ、化２に示す塩基配列を含むことが判明した。
本発明のＤＮＡも化２に示す塩基配列のもののみに限定
されず、本発明で言う「実質的に化２で表わされる塩基
配列を有する」とは、化２に示す塩基配列全体を含むも
のは言うに及ばず、その一部を含むものをも包含し得る
ことを意味する。例えば、遺伝コードの縮重に基づき、
化２に示す塩基配列における一以上の塩基が他の塩基に
置換されたもの、前記のような相同変異体を暗号指定す
る塩基配列、さらには、化２に示す塩基配列と相補的な
塩基配列も本発明に包含される。なお、相補的な塩基配
列の場合、化２に示す塩基配列全体に相補的な配列であ
っても良いし、その一部と相補的な配列であっても良
い。
【００１７】
【化２】
【００１８】さらに、本発明は当該蛋白質の製造方法を
も提供するものであり、本発明の蛋白質は、その蛋白質
の産生能を有する細胞を培養し、その培養物から蛋白質
を採取することにより製造することができる。本製造方
法で使用する細胞としては、例えば、ＨＰＢ−ＭＬＴ細
胞やＭＯＬＴ−４細胞などのヒトＴ細胞白血病由来の株
化細胞などが挙げられるが、本発明はこれらヒト細胞を
用いる態様に限定されない。動物由来の細胞や微生物で
あっても、その細胞乃至微生物が本来的に当該蛋白質の
産生能を有するものであるか、或は、例えば、細胞融合
法や遺伝子組換法によって当該蛋白質をコードする本発
明のＤＮＡを導入したものであって、培養後、その培養
物中から本発明の蛋白質を採取することができる限り、
前記ヒト細胞と同様、本発明において有利に使用するこ
とができる。
も提供するものであり、本発明の蛋白質は、その蛋白質
の産生能を有する細胞を培養し、その培養物から蛋白質
を採取することにより製造することができる。本製造方
法で使用する細胞としては、例えば、ＨＰＢ−ＭＬＴ細
胞やＭＯＬＴ−４細胞などのヒトＴ細胞白血病由来の株
化細胞などが挙げられるが、本発明はこれらヒト細胞を
用いる態様に限定されない。動物由来の細胞や微生物で
あっても、その細胞乃至微生物が本来的に当該蛋白質の
産生能を有するものであるか、或は、例えば、細胞融合
法や遺伝子組換法によって当該蛋白質をコードする本発
明のＤＮＡを導入したものであって、培養後、その培養
物中から本発明の蛋白質を採取することができる限り、
前記ヒト細胞と同様、本発明において有利に使用するこ
とができる。
【００１９】このように、本発明の製造方法で使用する
細胞は本明細書に具体的に開示した細胞のみに限定され
ず、本発明の蛋白質は、必要に応じて、これら細胞の何
れかをＢＣＧ及びＬＰＳなどの適当な刺激剤で刺激しな
がら培養し、その細胞若しくは培養上清から生成した癌
転移抑制活性を有する蛋白質を採取することにより製造
することができる。そして、その培養は動物細胞若しく
は微生物一般の培養に準じればよく、ビタミン、ミネラ
ル、炭水化物などを含んでなる公知の培養培地を使用す
ることができる。採取方法も蛋白性生理活性物質一般の
精製に用いられる一種若しくは二種以上の方法が採用で
き、例えば、塩析、透析、遠心分離、ゲル瀘過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳
動、等電点分画などの方法を適宜組合わせればよい。
細胞は本明細書に具体的に開示した細胞のみに限定され
ず、本発明の蛋白質は、必要に応じて、これら細胞の何
れかをＢＣＧ及びＬＰＳなどの適当な刺激剤で刺激しな
がら培養し、その細胞若しくは培養上清から生成した癌
転移抑制活性を有する蛋白質を採取することにより製造
することができる。そして、その培養は動物細胞若しく
は微生物一般の培養に準じればよく、ビタミン、ミネラ
ル、炭水化物などを含んでなる公知の培養培地を使用す
ることができる。採取方法も蛋白性生理活性物質一般の
精製に用いられる一種若しくは二種以上の方法が採用で
き、例えば、塩析、透析、遠心分離、ゲル瀘過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳
動、等電点分画などの方法を適宜組合わせればよい。
【００２０】このように、本発明は前記目的を達成する
ものであって、癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、そ
の蛋白質をコードするＤＮＡ、さらには、その蛋白質の
製造方法を包括するものである。
ものであって、癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、そ
の蛋白質をコードするＤＮＡ、さらには、その蛋白質の
製造方法を包括するものである。
【００２１】次に、実験により本発明を説明する。
【００２２】
【実験１】 癌転移抑制活性の測定 癌転移抑制活性は、猶本等、『ジャーナル・オブ・キャ
ンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）』、第１１３巻、
第５４４〜５４９頁（１９８７年）に記載された方法に
準じ、ヌードマウスにＲＰＭＩ４７８８細胞（微工研条
寄第２４２９号）を移植して肺転移を起こさせるモデル
を用いて測定した。
ンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）』、第１１３巻、
第５４４〜５４９頁（１９８７年）に記載された方法に
準じ、ヌードマウスにＲＰＭＩ４７８８細胞（微工研条
寄第２４２９号）を移植して肺転移を起こさせるモデル
を用いて測定した。
【００２３】すなわち、被験群においては、細胞を移植
する２日前、１日前及び３時間前に、先ず、ＢＡＬＢ／
ｃヌードマウス（５匹以上）の尾静脈に被験標品を含む
燐酸緩衝液０．２ｍｌを計３回注射した。ヌードマウス
の尾静脈にＲＰＭＩ４７８８細胞２×１０6 個を注射し
て移植した翌日から、被験標品を１日１回、７日間連続
して前記と同様に注射した。対照群に対しては、被験標
品を含まない燐酸緩衝液を用いた以外、試験群と同様に
処置した。細胞を移植してから２１日目にヌードマウス
を屠殺し、その肺表面の転移巣を肉眼で計数した。対照
群において５０個以上の平均転移巣数が認められ、且
つ、被験群においてこの平均転移巣数が半分以下に減少
し、その減少が統計学的に有意と判定されたときに、癌
転移抑制活性があると判断した。
する２日前、１日前及び３時間前に、先ず、ＢＡＬＢ／
ｃヌードマウス（５匹以上）の尾静脈に被験標品を含む
燐酸緩衝液０．２ｍｌを計３回注射した。ヌードマウス
の尾静脈にＲＰＭＩ４７８８細胞２×１０6 個を注射し
て移植した翌日から、被験標品を１日１回、７日間連続
して前記と同様に注射した。対照群に対しては、被験標
品を含まない燐酸緩衝液を用いた以外、試験群と同様に
処置した。細胞を移植してから２１日目にヌードマウス
を屠殺し、その肺表面の転移巣を肉眼で計数した。対照
群において５０個以上の平均転移巣数が認められ、且
つ、被験群においてこの平均転移巣数が半分以下に減少
し、その減少が統計学的に有意と判定されたときに、癌
転移抑制活性があると判断した。
【００２４】
【実験２】 ＢＣＧ／ＬＰＳ刺激ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞培
養上清の調製 新生仔ハムスターに予めウサギから公知の方法で調製し
た抗ハムスター胸腺血清を注射して免疫を弱めた後、そ
の皮下にＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を移植し、通常の方法で４
週間飼育した。皮下に生じた約２０ｇの腫瘍を摘出し、
細切して分散させた細胞を血清無添加のＲＰＭＩ１６４
０培地で洗浄した後、同じ培地に５×１０6 個／ｍｌの
濃度になるように再懸濁し、得られた懸濁液にＢＣＧを
１０μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で１日培養した。次い
で、培養物にＬＰＳを１μｇ／ｍｌ添加し、さらに１日
培養した後、遠心分離して培養上清を採取した。
養上清の調製 新生仔ハムスターに予めウサギから公知の方法で調製し
た抗ハムスター胸腺血清を注射して免疫を弱めた後、そ
の皮下にＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を移植し、通常の方法で４
週間飼育した。皮下に生じた約２０ｇの腫瘍を摘出し、
細切して分散させた細胞を血清無添加のＲＰＭＩ１６４
０培地で洗浄した後、同じ培地に５×１０6 個／ｍｌの
濃度になるように再懸濁し、得られた懸濁液にＢＣＧを
１０μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で１日培養した。次い
で、培養物にＬＰＳを１μｇ／ｍｌ添加し、さらに１日
培養した後、遠心分離して培養上清を採取した。
【００２５】
【実験３】 本発明の蛋白質の精製と理化学的性質 実験２で得た培養上清をメンブランモジュール『ＡＩＬ
３０１３（旭化成工業製造）』により約２０倍濃縮し、
２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対
して透析した後、２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で平衡化させたＰＢＥ−９４カラム（フ
ァルマシア・エル・ケー・ビー製造）に負荷した。次い
で、カラムにｐＨ４．０のポリバッファー７４（ファル
マシア・エル・ケー・ビー製造）を通液して培養上清を
溶出させ、各溶出画分をＰＢＳに対して透析した後、癌
転移抑制活性の有無を試験した。その結果、ｐＨ５．０
乃至６．５の間に溶出した画分に癌転移抑制活性のある
ことが判明した。活性画分を集め、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−２００カラム（ファルマシア・エル・ケー・ビー
製造）により再分画した後、各溶出画分の癌転移抑制活
性を試験したところ、溶出液体積／充填ゲル体積が０．
５乃至０．６５の間に溶出した画分に癌転移抑制活性が
認められた。その活性画分を１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．４）に対して透析した後、１０ｍＭ燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム（東ソー製造）に負荷し、次いで、１０ｍＭ
から５００ｍＭまでの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
４）による直線濃度勾配下で溶出させたところ、癌転移
抑制活性は、燐酸カリウム緩衝液の濃度が７０ｍＭ付近
に溶出された。このようにして得られた活性画分を１０
ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析
した後、１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
で平衡化させたヒドロキシアパタイトカラム（東亜燃料
工業製造）に負荷し、カラムに１０ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．８）を通液したところ、癌転移抑制活
性は非吸着画分に認められた。この非吸着画分を２５ｍ
Ｍビス・トリスーイミノ二酢酸緩衝液（ｐＨ７．１）で
平衡化させたＭｏｎｏ−Ｐカラム（ファルマシア・エル
・ケー・ビー製造）に負荷し、次いで、ポリバッファー
７４（ｐＨ４．０）で溶出させることにより、癌転移抑
制活性を有する本発明の蛋白質を単離した。
３０１３（旭化成工業製造）』により約２０倍濃縮し、
２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対
して透析した後、２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で平衡化させたＰＢＥ−９４カラム（フ
ァルマシア・エル・ケー・ビー製造）に負荷した。次い
で、カラムにｐＨ４．０のポリバッファー７４（ファル
マシア・エル・ケー・ビー製造）を通液して培養上清を
溶出させ、各溶出画分をＰＢＳに対して透析した後、癌
転移抑制活性の有無を試験した。その結果、ｐＨ５．０
乃至６．５の間に溶出した画分に癌転移抑制活性のある
ことが判明した。活性画分を集め、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−２００カラム（ファルマシア・エル・ケー・ビー
製造）により再分画した後、各溶出画分の癌転移抑制活
性を試験したところ、溶出液体積／充填ゲル体積が０．
５乃至０．６５の間に溶出した画分に癌転移抑制活性が
認められた。その活性画分を１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．４）に対して透析した後、１０ｍＭ燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム（東ソー製造）に負荷し、次いで、１０ｍＭ
から５００ｍＭまでの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
４）による直線濃度勾配下で溶出させたところ、癌転移
抑制活性は、燐酸カリウム緩衝液の濃度が７０ｍＭ付近
に溶出された。このようにして得られた活性画分を１０
ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析
した後、１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
で平衡化させたヒドロキシアパタイトカラム（東亜燃料
工業製造）に負荷し、カラムに１０ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．８）を通液したところ、癌転移抑制活
性は非吸着画分に認められた。この非吸着画分を２５ｍ
Ｍビス・トリスーイミノ二酢酸緩衝液（ｐＨ７．１）で
平衡化させたＭｏｎｏ−Ｐカラム（ファルマシア・エル
・ケー・ビー製造）に負荷し、次いで、ポリバッファー
７４（ｐＨ４．０）で溶出させることにより、癌転移抑
制活性を有する本発明の蛋白質を単離した。
【００２６】このようにして、ＢＣＧ及びＬＰＳで刺激
したＨＰＢ−ＭＬＴ細胞の培養上清５０リットルから本
発明の蛋白質約７０μｇを単離した。本品を用いて理化
学的性質を調べた。
したＨＰＢ−ＭＬＴ細胞の培養上清５０リットルから本
発明の蛋白質約７０μｇを単離した。本品を用いて理化
学的性質を調べた。
【００２７】（１）分子量 本品をレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、『ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９
７０年）に記載された方法に準じてドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ」と略記する。）し、分子量マーカとの相対
易動度より分子量を測定したところ、４５，０００±
５，０００であった。
ｔｕｒｅ）』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９
７０年）に記載された方法に準じてドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ」と略記する。）し、分子量マーカとの相対
易動度より分子量を測定したところ、４５，０００±
５，０００であった。
【００２８】（２）等電点 Ｍｏｎｏ−Ｐカラムからの溶出ｐＨより、本品の等電点
は５．７±０．５と推定された。
は５．７±０．５と推定された。
【００２９】（３）部分アミノ酸配列 本品をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルから分子量約４
５，０００に相当するバンドを切出した。切出したゲル
切片を０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む１００ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液中、３７℃で
１時間処理した後、リジルエンドペプチダーゼ（和光純
薬製造）を５μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で一晩消化し
た。消化物の上清をＤＥＡＥプレカラム付きのＣ１８カ
ラム（バイダック製造）による逆相クロマトグラフィー
で分画し、ペプチド断片を分取した。得られたペプチド
断片の部分アミノ酸配列をアミノ酸シーケンサ『４７０
Ａ型（アプライッドバイオシステム社製造）』により分
析した結果を化３、化４、化５及び化６に示す。
５，０００に相当するバンドを切出した。切出したゲル
切片を０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む１００ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液中、３７℃で
１時間処理した後、リジルエンドペプチダーゼ（和光純
薬製造）を５μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で一晩消化し
た。消化物の上清をＤＥＡＥプレカラム付きのＣ１８カ
ラム（バイダック製造）による逆相クロマトグラフィー
で分画し、ペプチド断片を分取した。得られたペプチド
断片の部分アミノ酸配列をアミノ酸シーケンサ『４７０
Ａ型（アプライッドバイオシステム社製造）』により分
析した結果を化３、化４、化５及び化６に示す。
【００３０】
【化３】
【００３１】
【化４】
【００３２】
【化５】
【００３３】
【化６】
【００３４】（４）溶剤に対する溶解性 本品は水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶であった。
【００３５】（５）生物活性 本品の癌転移抑制活性を実験１の方法で試験した。その
結果、対照群（ヌードマウス５匹使用）における転移巣
数が３１４±１６９個であったのに対して、本品を２５
０μｇ／ｍｌ含む溶液を投与した群（ヌードマウス５匹
使用）の転移巣数は１００±４３個であり、本品が顕著
な癌転移抑制活性を有することが明らかとなった。
結果、対照群（ヌードマウス５匹使用）における転移巣
数が３１４±１６９個であったのに対して、本品を２５
０μｇ／ｍｌ含む溶液を投与した群（ヌードマウス５匹
使用）の転移巣数は１００±４３個であり、本品が顕著
な癌転移抑制活性を有することが明らかとなった。
【００３６】（６）安定性 本品をｐＨ７．２の燐酸緩衝液に溶解し、溶液を１００
℃で３０分間放置した後、実験１の方法で癌転移抑制活
性を試験したところ、活性は認められず、本発明の蛋白
質はこの条件下で失活することが判明した。一方、本品
をｐＨ７．２の燐酸緩衝液に溶解し、溶液を４℃で一ヶ
月間放置した後、同様に活性を試験したところ、活性の
低下は認められず、本発明の蛋白質はこの条件下で安定
であることが判明した。
℃で３０分間放置した後、実験１の方法で癌転移抑制活
性を試験したところ、活性は認められず、本発明の蛋白
質はこの条件下で失活することが判明した。一方、本品
をｐＨ７．２の燐酸緩衝液に溶解し、溶液を４℃で一ヶ
月間放置した後、同様に活性を試験したところ、活性の
低下は認められず、本発明の蛋白質はこの条件下で安定
であることが判明した。
【００３７】
【実験４】 急性毒性試験 ７週齢のマウスを使用して、本品の急性毒性を試験した
ところ、静脈内に投与した場合、本品のＬＤ５０は５０
ｍｇ／ｋｇ以上と、極めて毒性の低いことが判明した。
ところ、静脈内に投与した場合、本品のＬＤ５０は５０
ｍｇ／ｋｇ以上と、極めて毒性の低いことが判明した。
【００３８】
【実験５】 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の塩基
配列 本実験では、ティー・マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）等、『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』、
第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載されている
一般的な方法を採用し、本発明の蛋白質をコードする遺
伝子の塩基配列を決定した。
配列 本実験では、ティー・マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）等、『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』、
第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載されている
一般的な方法を採用し、本発明の蛋白質をコードする遺
伝子の塩基配列を決定した。
【００３９】
【実験５−１】 ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞のｃＤＮＡライブ
ラリーの作製 実験２の方法で得たＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を血清無添加の
ＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０6 個／ｍｌの濃度にな
るように懸濁した。次いで、懸濁液にＢＣＧを１０μｇ
／ｍｌ添加し、３７℃で１日培養した後、ＬＰＳを１μ
ｇ／ｍｌ添加してさらに４．５時間培養した。培養物を
遠心分離して回収した細胞を４Ｍグアニジウム・イソチ
オシアネートで可溶化し、ホモゲナイズした後、５．７
Ｍ塩化セシウム上に重層させ、２５，０００ｒｐｍでさ
らに１７時間遠心分離することによりトータルＲＮＡを
得た。次いで、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ精製用ビーズ『オリ
ゴテックス−ｄＴ３０・スーパ（第一化学薬品製造）』
を用いてポリ（Ａ）+ ＲＮＡを精製し、そのポリ（Ａ）
+ ＲＮＡにｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャム
製造）をそこに添加されている指示書にしたがって適用
することによりｃＤＮＡを合成した。次いで、ｃＤＮＡ
クローニングシステムλｇｔ１０（アマシャム製造）を
用いてその合成したｃＤＮＡとλｇｔ１０ファージＤＮ
Ａとをライゲーションさせ、ライゲーションにより得ら
れた組換ファージＤＮＡをラムダ・インビトロ・パッケ
ージング・キット（アマシャム製造）を使用してパッケ
ージングすることにより、組換ファージによるＨＰＢ−
ＭＬＴ細胞のｃＤＮＡライブラリーを作製した。
ラリーの作製 実験２の方法で得たＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を血清無添加の
ＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０6 個／ｍｌの濃度にな
るように懸濁した。次いで、懸濁液にＢＣＧを１０μｇ
／ｍｌ添加し、３７℃で１日培養した後、ＬＰＳを１μ
ｇ／ｍｌ添加してさらに４．５時間培養した。培養物を
遠心分離して回収した細胞を４Ｍグアニジウム・イソチ
オシアネートで可溶化し、ホモゲナイズした後、５．７
Ｍ塩化セシウム上に重層させ、２５，０００ｒｐｍでさ
らに１７時間遠心分離することによりトータルＲＮＡを
得た。次いで、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ精製用ビーズ『オリ
ゴテックス−ｄＴ３０・スーパ（第一化学薬品製造）』
を用いてポリ（Ａ）+ ＲＮＡを精製し、そのポリ（Ａ）
+ ＲＮＡにｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャム
製造）をそこに添加されている指示書にしたがって適用
することによりｃＤＮＡを合成した。次いで、ｃＤＮＡ
クローニングシステムλｇｔ１０（アマシャム製造）を
用いてその合成したｃＤＮＡとλｇｔ１０ファージＤＮ
Ａとをライゲーションさせ、ライゲーションにより得ら
れた組換ファージＤＮＡをラムダ・インビトロ・パッケ
ージング・キット（アマシャム製造）を使用してパッケ
ージングすることにより、組換ファージによるＨＰＢ−
ＭＬＴ細胞のｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００４０】
【実験５−２】 標識ＤＮＡプローブの作製 実験３で得られた化３に示す部分アミノ酸配列に基づ
き、その部分アミノ酸配列における配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａから予想される塩基
配列をＤＮＡシンセサイザー（アプライッドバイオシス
テム製造）で合成した。合成した塩基１７個からなる９
６種類の配列を表１に示す。
き、その部分アミノ酸配列における配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａから予想される塩基
配列をＤＮＡシンセサイザー（アプライッドバイオシス
テム製造）で合成した。合成した塩基１７個からなる９
６種類の配列を表１に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】化５に示す部分アミノ酸配列については、
その配列Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓから
予想される塩基配列の相補鎖を上記と同様にして合成し
た。合成した塩基１４個からなる９６種類の配列を表２
に示す。なお、ＤＮＡは［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを使い、常法にしたがって標識
した。
その配列Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓから
予想される塩基配列の相補鎖を上記と同様にして合成し
た。合成した塩基１４個からなる９６種類の配列を表２
に示す。なお、ＤＮＡは［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを使い、常法にしたがって標識
した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【実験５−３】 標識ＤＮＡプローブを用いたスクリー
ニング 実験５−１で調製したＨＰＢ−ＭＬＴ細胞のｃＤＮＡラ
イブラリーである組換λｇｔ１０ファージ液と大腸菌Ｎ
Ｍ５１４Ｔ株をＬ培地で一晩培養して得られた培養液と
を混合し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートし
た後、ソフトアガーを混合し、ハードアガー上に重層
し、固化させた。次いで、重層したアガー上の大腸菌を
３７℃で８時間培養し、冷却した後、アガー上にメンブ
ランフィルタ『Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ フィルタ（アマシャ
ム製造）』を重ねてメンブランフィルタ上にファージを
移取り、ファージＤＮＡを固定した。次に、標識ＤＮＡ
プローブと目的とする相補ＤＮＡ以外のＤＮＡとの非特
異的結合を防止するために、メンブランフィルタをサケ
***ＤＮＡ（シグマ製造）溶液に浸漬することによりプ
レハイブリダイゼーションさせた後、実験５−２で調製
した標識ＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼ
ーション法によるスクリーニングを行った。表１に示す
プローブ１による一次スクリーニングと表２に示すプロ
ーブ２による二次スクリーニングを行った結果、約６０
万個のクローンから３個の陽性クローンが得られた。こ
れら陽性クローンから取出したファージＤＮＡを制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化してベクターＤＮＡから切離し、挿
入断片の長さをアガロース電気泳動で確認した後、最も
長い約１．５ｋｂｐの挿入断片を持つクローンについて
さらなる解析を行った。
ニング 実験５−１で調製したＨＰＢ−ＭＬＴ細胞のｃＤＮＡラ
イブラリーである組換λｇｔ１０ファージ液と大腸菌Ｎ
Ｍ５１４Ｔ株をＬ培地で一晩培養して得られた培養液と
を混合し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートし
た後、ソフトアガーを混合し、ハードアガー上に重層
し、固化させた。次いで、重層したアガー上の大腸菌を
３７℃で８時間培養し、冷却した後、アガー上にメンブ
ランフィルタ『Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ フィルタ（アマシャ
ム製造）』を重ねてメンブランフィルタ上にファージを
移取り、ファージＤＮＡを固定した。次に、標識ＤＮＡ
プローブと目的とする相補ＤＮＡ以外のＤＮＡとの非特
異的結合を防止するために、メンブランフィルタをサケ
***ＤＮＡ（シグマ製造）溶液に浸漬することによりプ
レハイブリダイゼーションさせた後、実験５−２で調製
した標識ＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼ
ーション法によるスクリーニングを行った。表１に示す
プローブ１による一次スクリーニングと表２に示すプロ
ーブ２による二次スクリーニングを行った結果、約６０
万個のクローンから３個の陽性クローンが得られた。こ
れら陽性クローンから取出したファージＤＮＡを制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化してベクターＤＮＡから切離し、挿
入断片の長さをアガロース電気泳動で確認した後、最も
長い約１．５ｋｂｐの挿入断片を持つクローンについて
さらなる解析を行った。
【００４５】
【実験５−４】 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の
塩基配列 実験５−３で得た陽性クローンからファージＤＮＡを取
り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、アクリルア
ミドゲル電気泳動で分離して約１．５ｋｂｐの挿入ＤＮ
Ａ断片を得た。このＤＮＡ断片をライゲーションキット
（アマシャム製造）を用いてｐＵＣ１８プラスミドにラ
イゲーションすることにより、組換プラスミドを得た。
この組換プラスミドを常法により大腸菌に導入して得ら
れた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、次い
で、そのプラスミドＤＮＡにジデオキシ法を適用するこ
とにより本発明の塩基配列を決定し、その塩基配列から
本発明による蛋白質のアミノ酸配列を推定した。その結
果、本発明のＤＮＡは１，２２４塩基からなり、アミノ
酸４０８個からなる蛋白質をコードしていることが判明
した。そして、ここで推定したアミノ酸配列は、実験３
で決定したアミノ酸配列化３、化４、化５及び化６を全
て包括していた。
塩基配列 実験５−３で得た陽性クローンからファージＤＮＡを取
り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、アクリルア
ミドゲル電気泳動で分離して約１．５ｋｂｐの挿入ＤＮ
Ａ断片を得た。このＤＮＡ断片をライゲーションキット
（アマシャム製造）を用いてｐＵＣ１８プラスミドにラ
イゲーションすることにより、組換プラスミドを得た。
この組換プラスミドを常法により大腸菌に導入して得ら
れた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、次い
で、そのプラスミドＤＮＡにジデオキシ法を適用するこ
とにより本発明の塩基配列を決定し、その塩基配列から
本発明による蛋白質のアミノ酸配列を推定した。その結
果、本発明のＤＮＡは１，２２４塩基からなり、アミノ
酸４０８個からなる蛋白質をコードしていることが判明
した。そして、ここで推定したアミノ酸配列は、実験３
で決定したアミノ酸配列化３、化４、化５及び化６を全
て包括していた。
【００４６】次に、本発明による蛋白質の製造方法の実
施例を示す。
施例を示す。
【００４７】
【実施例】実験２と同様にしてヒトＴ細胞白血病由来の
株化細胞であるＭＯＬＴ−４細胞（大日本製薬販売）を
ＢＣＧ及びＬＰＳで刺激しながら培養し、次いで、その
培養上清を実験３と同様に処理して癌転移抑制活性を有
する本発明の蛋白質を採取した。収量は、培養上清５０
リットル当たり約４０μｇであった。本品は、実験３で
調製した蛋白質と同一の理化学的性質を有していた。
株化細胞であるＭＯＬＴ−４細胞（大日本製薬販売）を
ＢＣＧ及びＬＰＳで刺激しながら培養し、次いで、その
培養上清を実験３と同様に処理して癌転移抑制活性を有
する本発明の蛋白質を採取した。収量は、培養上清５０
リットル当たり約４０μｇであった。本品は、実験３で
調製した蛋白質と同一の理化学的性質を有していた。
【００４８】
【発明の効果】本発明の蛋白質は癌転移を効果的に抑制
するので、癌転移の予防剤、治療剤、診断剤として有用
である。本発明の蛋白質は毒性が低いことから、注射剤
や舌下剤などの適宜剤形にして全身投与することができ
る。
するので、癌転移の予防剤、治療剤、診断剤として有用
である。本発明の蛋白質は毒性が低いことから、注射剤
や舌下剤などの適宜剤形にして全身投与することができ
る。
【００４９】斯くも有用な当該蛋白質は、本発明の製造
方法により、大量に製造することができる。
方法により、大量に製造することができる。
【００５０】また、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ
は、遺伝子組換法により本発明の蛋白質を製造する上で
有用である。
は、遺伝子組換法により本発明の蛋白質を製造する上で
有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/06 5/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 理化学的性質が （１）分子量 ４５，０００±５，０００ （２）等電点 ｐＩ＝５．７±０．５ （３）部分アミノ酸配列 Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ又はＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕを有する （４）溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶 （５）生物活性 ヒト大腸癌由来の株化培養細胞であるＲＰＭＩ４７８８
細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を抑制する活性
を有する （６）安定性 水溶液中、ｐＨ７．２にて１００℃で３０分間放置する
と失活する 水溶液中、ｐＨ７．２にて４℃で一ヶ月間放置しても安
定 である蛋白質。 - 【請求項２】 実質的に下記の化１で表わされるアミノ
酸配列を含有する請求項１に記載の蛋白質。 【化１】 - 【請求項３】 理化学的性質が （１）分子量 ４５，０００±５，０００ （２）等電点 ｐＩ＝５．７±０．５ （３）部分アミノ酸配列 Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ又はＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕを有する （４）溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶 （５）生物活性 ヒト大腸癌由来の株化培養細胞であるＲＰＭＩ４７８８
細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を抑制する活性
を有する （６）安定性 水溶液中、ｐＨ７．２にて１００℃で３０分間放置する
と失活する 水溶液中、ｐＨ７．２にて４℃で一ヶ月間放置しても安
定 である蛋白質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 実質的に下記の化２で表わされる塩基配
列を有する請求項３に記載のＤＮＡ。 【化２】 - 【請求項５】 理化学的性質が （１）分子量 ４５，０００±５，０００ （２）等電点 ｐＩ＝５．７±０．５ （３）部分アミノ酸配列 Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ又はＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕを有する （４）溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶 （５）生物活性 ヒト大腸癌由来の株化培養細胞であるＲＰＭＩ４７８８
細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を抑制する活性
を有する （６）安定性 水溶液中、ｐＨ７．２にて１００℃で３０分間放置する
と失活する 水溶液中、ｐＨ７．２にて４℃で一ヶ月間放置しても安
定 である蛋白質の産生能を有する細胞を培養し、得られる
培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質
の製造方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28113692A JP3439490B2 (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 蛋白質とその蛋白質をコードするｄｎａ並びにその蛋白質の製造方法 |
| TW082107913A TW241268B (ja) | 1992-09-28 | 1993-09-25 | |
| KR1019930019832A KR100294977B1 (ko) | 1992-09-28 | 1993-09-27 | 단백질과이단백질을코우드하는dna및이단백질의제조방법 |
| US08/127,278 US5498697A (en) | 1992-09-28 | 1993-09-27 | Protein possessing metastasis-inhibitory activity |
| EP93307668A EP0594311B1 (en) | 1992-09-28 | 1993-09-28 | Process for preparing a metastasis-inhibiting protein and uses thereof. |
| DE69331368T DE69331368T2 (de) | 1992-09-28 | 1993-09-28 | Herstellung und Benützung eines Metastasehemmendes Proteines. |
| US08/555,860 US5585474A (en) | 1992-09-28 | 1995-11-13 | DNA encoding protein possessing metastasis-inhibitory activity |
| US08/827,864 US5827691A (en) | 1992-09-28 | 1997-04-09 | Process for preparing a protein which inhibits metastasis of cancer |
Applications Claiming Priority (1)
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