JPH06107693A - 蛋白質とその蛋白質をコードするdna並びにその蛋白質の製造方法 - Google Patents
蛋白質とその蛋白質をコードするdna並びにその蛋白質の製造方法Info
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- JPH06107693A JPH06107693A JP4281136A JP28113692A JPH06107693A JP H06107693 A JPH06107693 A JP H06107693A JP 4281136 A JP4281136 A JP 4281136A JP 28113692 A JP28113692 A JP 28113692A JP H06107693 A JPH06107693 A JP H06107693A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 癌転移抑制剤として有用な新規蛋白質とその
蛋白質をコードするDNA、さらには、その蛋白質の製
造方法を提供することを目的とする。 【構成】 癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、その蛋
白質をコードするDNA、並びに、その蛋白質の産生能
を有する細胞を培養し、その培養上清から蛋白質を採取
してなる当該蛋白質の製造方法を構成とする。
蛋白質をコードするDNA、さらには、その蛋白質の製
造方法を提供することを目的とする。 【構成】 癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、その蛋
白質をコードするDNA、並びに、その蛋白質の産生能
を有する細胞を培養し、その培養上清から蛋白質を採取
してなる当該蛋白質の製造方法を構成とする。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、癌転移抑制活性を有す
る新規蛋白質とその蛋白質をコードするDNA、さらに
は、その蛋白質の製造方法に関するものである。
る新規蛋白質とその蛋白質をコードするDNA、さらに
は、その蛋白質の製造方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】現在、癌の治療は、主として外科的手
術、化学療法、放射線療法により行われている。多くの
癌はこれらの方法により治療できるが、万一、癌細胞の
一部が治療後も生き残るようなことがあると、その生き
残った一部の癌細胞が撒き散らされて一層重篤な癌転移
を促進し、患者の寿命を却って縮めてしまうことにな
る。癌転移が抑制できれば、癌患者の苦痛を和らげ、余
命を大幅に延ばすことが可能になると考えられ、現在、
有効な癌転移抑制剤の開発が強く望まれている。しかし
ながら、癌転移は一般に複雑な過程を経て成立すると考
えられており、それ故に、未だ有効な癌転移抑制剤を開
発できないでいるというのが実状である。
術、化学療法、放射線療法により行われている。多くの
癌はこれらの方法により治療できるが、万一、癌細胞の
一部が治療後も生き残るようなことがあると、その生き
残った一部の癌細胞が撒き散らされて一層重篤な癌転移
を促進し、患者の寿命を却って縮めてしまうことにな
る。癌転移が抑制できれば、癌患者の苦痛を和らげ、余
命を大幅に延ばすことが可能になると考えられ、現在、
有効な癌転移抑制剤の開発が強く望まれている。しかし
ながら、癌転移は一般に複雑な過程を経て成立すると考
えられており、それ故に、未だ有効な癌転移抑制剤を開
発できないでいるというのが実状である。
【0003】なお、これまでにも、癌転移抑制活性を有
する様々な蛋白質が報告されているけれども、何れも本
発明の蛋白質とは相違するものである。例えば、インタ
ーフェロン、インターロイキン−2及び腫瘍壊死因子が
癌転移抑制活性を有するとの報告があるが、これらは何
れも分子量及びアミノ酸配列において本発明の蛋白質と
は明らかに異なり、且つ、何れも未だ有効な癌転移抑制
剤とはなり得ていない。一方、特開平2−308799
号公報には、ヒト造血器由来の細胞が産生する癌転移抑
制因子が開示されているけれども、例えば、分子量一つ
とってみても10,000乃至450,000と極めて
曖昧であり、物質としての構造や性質・性状が明らかに
されているとは言い難い。
する様々な蛋白質が報告されているけれども、何れも本
発明の蛋白質とは相違するものである。例えば、インタ
ーフェロン、インターロイキン−2及び腫瘍壊死因子が
癌転移抑制活性を有するとの報告があるが、これらは何
れも分子量及びアミノ酸配列において本発明の蛋白質と
は明らかに異なり、且つ、何れも未だ有効な癌転移抑制
剤とはなり得ていない。一方、特開平2−308799
号公報には、ヒト造血器由来の細胞が産生する癌転移抑
制因子が開示されているけれども、例えば、分子量一つ
とってみても10,000乃至450,000と極めて
曖昧であり、物質としての構造や性質・性状が明らかに
されているとは言い難い。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】このような状況に鑑
み、本発明の目的とするところは、癌転移を効果的に抑
制する新規な蛋白質を提供することにある。
み、本発明の目的とするところは、癌転移を効果的に抑
制する新規な蛋白質を提供することにある。
【0005】本発明の別の目的は、その蛋白質をコード
するDNAを提供することにある。
するDNAを提供することにある。
【0006】本発明のさらなる目的は、その蛋白質の製
造方法を提供することにある。
造方法を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者等が癌転移抑制
活性を有する新規物質を見出すべく鋭意研究したとこ
ろ、ヒトT細胞白血病由来の株化細胞であるHPB−M
LT細胞(微工研条寄第2430号)をカルメット・ゲ
ランウシ型結核菌(以下、「BCG」と略記する。)及
びリポ多糖(以下、「LPS」と略記する。)で刺激す
ると、その培養上清中に癌転移抑制活性が出現すること
を見出した。そして、その本体を解明すべく鋭意研究を
続けたところ、癌転移抑制活性の本体は蛋白質であり、
次のような理化学的性質を有するものであることが判明
した。
活性を有する新規物質を見出すべく鋭意研究したとこ
ろ、ヒトT細胞白血病由来の株化細胞であるHPB−M
LT細胞(微工研条寄第2430号)をカルメット・ゲ
ランウシ型結核菌(以下、「BCG」と略記する。)及
びリポ多糖(以下、「LPS」と略記する。)で刺激す
ると、その培養上清中に癌転移抑制活性が出現すること
を見出した。そして、その本体を解明すべく鋭意研究を
続けたところ、癌転移抑制活性の本体は蛋白質であり、
次のような理化学的性質を有するものであることが判明
した。
【0008】(1)分子量 45,000±5,000
【0009】(2)等電点 pI=5.7±0.5
【0010】(3)部分アミノ酸配列 Asp−Ser−Glu−Gly−Tyr−Ile−T
yr−Ala−Arg−Gly−Ala−Gln−As
p−Met−Lys又はGlu−His−Trp−Se
r−His−Asp−Pro−Phe−Gluを有す
る。
yr−Ala−Arg−Gly−Ala−Gln−As
p−Met−Lys又はGlu−His−Trp−Se
r−His−Asp−Pro−Phe−Gluを有す
る。
【0011】(4)溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶。
【0012】(5)生物活性 ヒト大腸癌由来の株化培養細胞であるRPMI4788
細胞(微工研条寄第2429号)の転移を抑制する活性
を有する。
細胞(微工研条寄第2429号)の転移を抑制する活性
を有する。
【0013】(6)安定性 水溶液中、pH7.2において100℃で30分間放置
すると失活する。水溶液中、pH7.2において4℃で
一ヶ月間放置しても安定。
すると失活する。水溶液中、pH7.2において4℃で
一ヶ月間放置しても安定。
【0014】本発明者等が当該蛋白質を単離し、そのア
ミノ酸配列を分析したところ、化1に示すようなアミノ
酸配列を有することが判明した。なお、本発明で言う
「実質的に化1で表わされるアミノ酸配列を含有する」
とは、本発明の蛋白質は化1に示すアミノ酸配列を有す
るもののみに限定されず、その相同変異体をも包含する
ということを意味する。言い換えれば、前記理化学的性
質を有する限り、化1に示すアミノ酸配列の一部のみを
有する蛋白質も本発明に包含される。
ミノ酸配列を分析したところ、化1に示すようなアミノ
酸配列を有することが判明した。なお、本発明で言う
「実質的に化1で表わされるアミノ酸配列を含有する」
とは、本発明の蛋白質は化1に示すアミノ酸配列を有す
るもののみに限定されず、その相同変異体をも包含する
ということを意味する。言い換えれば、前記理化学的性
質を有する限り、化1に示すアミノ酸配列の一部のみを
有する蛋白質も本発明に包含される。
【0015】
【化1】
【0016】このアミノ酸配列に基づき、HPB−ML
T細胞から本発明の蛋白質をコードするDNAを検索し
たところ、化2に示す塩基配列を含むことが判明した。
本発明のDNAも化2に示す塩基配列のもののみに限定
されず、本発明で言う「実質的に化2で表わされる塩基
配列を有する」とは、化2に示す塩基配列全体を含むも
のは言うに及ばず、その一部を含むものをも包含し得る
ことを意味する。例えば、遺伝コードの縮重に基づき、
化2に示す塩基配列における一以上の塩基が他の塩基に
置換されたもの、前記のような相同変異体を暗号指定す
る塩基配列、さらには、化2に示す塩基配列と相補的な
塩基配列も本発明に包含される。なお、相補的な塩基配
列の場合、化2に示す塩基配列全体に相補的な配列であ
っても良いし、その一部と相補的な配列であっても良
い。
T細胞から本発明の蛋白質をコードするDNAを検索し
たところ、化2に示す塩基配列を含むことが判明した。
本発明のDNAも化2に示す塩基配列のもののみに限定
されず、本発明で言う「実質的に化2で表わされる塩基
配列を有する」とは、化2に示す塩基配列全体を含むも
のは言うに及ばず、その一部を含むものをも包含し得る
ことを意味する。例えば、遺伝コードの縮重に基づき、
化2に示す塩基配列における一以上の塩基が他の塩基に
置換されたもの、前記のような相同変異体を暗号指定す
る塩基配列、さらには、化2に示す塩基配列と相補的な
塩基配列も本発明に包含される。なお、相補的な塩基配
列の場合、化2に示す塩基配列全体に相補的な配列であ
っても良いし、その一部と相補的な配列であっても良
い。
【0017】
【化2】
【0018】さらに、本発明は当該蛋白質の製造方法を
も提供するものであり、本発明の蛋白質は、その蛋白質
の産生能を有する細胞を培養し、その培養物から蛋白質
を採取することにより製造することができる。本製造方
法で使用する細胞としては、例えば、HPB−MLT細
胞やMOLT−4細胞などのヒトT細胞白血病由来の株
化細胞などが挙げられるが、本発明はこれらヒト細胞を
用いる態様に限定されない。動物由来の細胞や微生物で
あっても、その細胞乃至微生物が本来的に当該蛋白質の
産生能を有するものであるか、或は、例えば、細胞融合
法や遺伝子組換法によって当該蛋白質をコードする本発
明のDNAを導入したものであって、培養後、その培養
物中から本発明の蛋白質を採取することができる限り、
前記ヒト細胞と同様、本発明において有利に使用するこ
とができる。
も提供するものであり、本発明の蛋白質は、その蛋白質
の産生能を有する細胞を培養し、その培養物から蛋白質
を採取することにより製造することができる。本製造方
法で使用する細胞としては、例えば、HPB−MLT細
胞やMOLT−4細胞などのヒトT細胞白血病由来の株
化細胞などが挙げられるが、本発明はこれらヒト細胞を
用いる態様に限定されない。動物由来の細胞や微生物で
あっても、その細胞乃至微生物が本来的に当該蛋白質の
産生能を有するものであるか、或は、例えば、細胞融合
法や遺伝子組換法によって当該蛋白質をコードする本発
明のDNAを導入したものであって、培養後、その培養
物中から本発明の蛋白質を採取することができる限り、
前記ヒト細胞と同様、本発明において有利に使用するこ
とができる。
【0019】このように、本発明の製造方法で使用する
細胞は本明細書に具体的に開示した細胞のみに限定され
ず、本発明の蛋白質は、必要に応じて、これら細胞の何
れかをBCG及びLPSなどの適当な刺激剤で刺激しな
がら培養し、その細胞若しくは培養上清から生成した癌
転移抑制活性を有する蛋白質を採取することにより製造
することができる。そして、その培養は動物細胞若しく
は微生物一般の培養に準じればよく、ビタミン、ミネラ
ル、炭水化物などを含んでなる公知の培養培地を使用す
ることができる。採取方法も蛋白性生理活性物質一般の
精製に用いられる一種若しくは二種以上の方法が採用で
き、例えば、塩析、透析、遠心分離、ゲル瀘過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳
動、等電点分画などの方法を適宜組合わせればよい。
細胞は本明細書に具体的に開示した細胞のみに限定され
ず、本発明の蛋白質は、必要に応じて、これら細胞の何
れかをBCG及びLPSなどの適当な刺激剤で刺激しな
がら培養し、その細胞若しくは培養上清から生成した癌
転移抑制活性を有する蛋白質を採取することにより製造
することができる。そして、その培養は動物細胞若しく
は微生物一般の培養に準じればよく、ビタミン、ミネラ
ル、炭水化物などを含んでなる公知の培養培地を使用す
ることができる。採取方法も蛋白性生理活性物質一般の
精製に用いられる一種若しくは二種以上の方法が採用で
き、例えば、塩析、透析、遠心分離、ゲル瀘過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳
動、等電点分画などの方法を適宜組合わせればよい。
【0020】このように、本発明は前記目的を達成する
ものであって、癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、そ
の蛋白質をコードするDNA、さらには、その蛋白質の
製造方法を包括するものである。
ものであって、癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、そ
の蛋白質をコードするDNA、さらには、その蛋白質の
製造方法を包括するものである。
【0021】次に、実験により本発明を説明する。
【0022】
【実験1】 癌転移抑制活性の測定 癌転移抑制活性は、猶本等、『ジャーナル・オブ・キャ
ンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー(Jou
rnal of Cancer Research C
linical Oncology)』、第113巻、
第544〜549頁(1987年)に記載された方法に
準じ、ヌードマウスにRPMI4788細胞(微工研条
寄第2429号)を移植して肺転移を起こさせるモデル
を用いて測定した。
ンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー(Jou
rnal of Cancer Research C
linical Oncology)』、第113巻、
第544〜549頁(1987年)に記載された方法に
準じ、ヌードマウスにRPMI4788細胞(微工研条
寄第2429号)を移植して肺転移を起こさせるモデル
を用いて測定した。
【0023】すなわち、被験群においては、細胞を移植
する2日前、1日前及び3時間前に、先ず、BALB/
cヌードマウス(5匹以上)の尾静脈に被験標品を含む
燐酸緩衝液0.2mlを計3回注射した。ヌードマウス
の尾静脈にRPMI4788細胞2×106 個を注射し
て移植した翌日から、被験標品を1日1回、7日間連続
して前記と同様に注射した。対照群に対しては、被験標
品を含まない燐酸緩衝液を用いた以外、試験群と同様に
処置した。細胞を移植してから21日目にヌードマウス
を屠殺し、その肺表面の転移巣を肉眼で計数した。対照
群において50個以上の平均転移巣数が認められ、且
つ、被験群においてこの平均転移巣数が半分以下に減少
し、その減少が統計学的に有意と判定されたときに、癌
転移抑制活性があると判断した。
する2日前、1日前及び3時間前に、先ず、BALB/
cヌードマウス(5匹以上)の尾静脈に被験標品を含む
燐酸緩衝液0.2mlを計3回注射した。ヌードマウス
の尾静脈にRPMI4788細胞2×106 個を注射し
て移植した翌日から、被験標品を1日1回、7日間連続
して前記と同様に注射した。対照群に対しては、被験標
品を含まない燐酸緩衝液を用いた以外、試験群と同様に
処置した。細胞を移植してから21日目にヌードマウス
を屠殺し、その肺表面の転移巣を肉眼で計数した。対照
群において50個以上の平均転移巣数が認められ、且
つ、被験群においてこの平均転移巣数が半分以下に減少
し、その減少が統計学的に有意と判定されたときに、癌
転移抑制活性があると判断した。
【0024】
【実験2】 BCG/LPS刺激HPB−MLT細胞培
養上清の調製 新生仔ハムスターに予めウサギから公知の方法で調製し
た抗ハムスター胸腺血清を注射して免疫を弱めた後、そ
の皮下にHPB−MLT細胞を移植し、通常の方法で4
週間飼育した。皮下に生じた約20gの腫瘍を摘出し、
細切して分散させた細胞を血清無添加のRPMI164
0培地で洗浄した後、同じ培地に5×106 個/mlの
濃度になるように再懸濁し、得られた懸濁液にBCGを
10μg/ml添加し、37℃で1日培養した。次い
で、培養物にLPSを1μg/ml添加し、さらに1日
培養した後、遠心分離して培養上清を採取した。
養上清の調製 新生仔ハムスターに予めウサギから公知の方法で調製し
た抗ハムスター胸腺血清を注射して免疫を弱めた後、そ
の皮下にHPB−MLT細胞を移植し、通常の方法で4
週間飼育した。皮下に生じた約20gの腫瘍を摘出し、
細切して分散させた細胞を血清無添加のRPMI164
0培地で洗浄した後、同じ培地に5×106 個/mlの
濃度になるように再懸濁し、得られた懸濁液にBCGを
10μg/ml添加し、37℃で1日培養した。次い
で、培養物にLPSを1μg/ml添加し、さらに1日
培養した後、遠心分離して培養上清を採取した。
【0025】
【実験3】 本発明の蛋白質の精製と理化学的性質 実験2で得た培養上清をメンブランモジュール『AIL
3013(旭化成工業製造)』により約20倍濃縮し、
25mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.4)に対
して透析した後、25mMイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH7.4)で平衡化させたPBE−94カラム(フ
ァルマシア・エル・ケー・ビー製造)に負荷した。次い
で、カラムにpH4.0のポリバッファー74(ファル
マシア・エル・ケー・ビー製造)を通液して培養上清を
溶出させ、各溶出画分をPBSに対して透析した後、癌
転移抑制活性の有無を試験した。その結果、pH5.0
乃至6.5の間に溶出した画分に癌転移抑制活性のある
ことが判明した。活性画分を集め、Sephacryl
S−200カラム(ファルマシア・エル・ケー・ビー
製造)により再分画した後、各溶出画分の癌転移抑制活
性を試験したところ、溶出液体積/充填ゲル体積が0.
5乃至0.65の間に溶出した画分に癌転移抑制活性が
認められた。その活性画分を10mM燐酸カリウム緩衝
液(pH7.4)に対して透析した後、10mM燐酸カ
リウム緩衝液(pH7.4)で平衡化したDEAE−5
PWカラム(東ソー製造)に負荷し、次いで、10mM
から500mMまでの燐酸カリウム緩衝液(pH7.
4)による直線濃度勾配下で溶出させたところ、癌転移
抑制活性は、燐酸カリウム緩衝液の濃度が70mM付近
に溶出された。このようにして得られた活性画分を10
mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)に対して透析
した後、10mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)
で平衡化させたヒドロキシアパタイトカラム(東亜燃料
工業製造)に負荷し、カラムに10mM燐酸ナトリウム
緩衝液(pH6.8)を通液したところ、癌転移抑制活
性は非吸着画分に認められた。この非吸着画分を25m
Mビス・トリスーイミノ二酢酸緩衝液(pH7.1)で
平衡化させたMono−Pカラム(ファルマシア・エル
・ケー・ビー製造)に負荷し、次いで、ポリバッファー
74(pH4.0)で溶出させることにより、癌転移抑
制活性を有する本発明の蛋白質を単離した。
3013(旭化成工業製造)』により約20倍濃縮し、
25mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.4)に対
して透析した後、25mMイミダゾール−塩酸緩衝液
(pH7.4)で平衡化させたPBE−94カラム(フ
ァルマシア・エル・ケー・ビー製造)に負荷した。次い
で、カラムにpH4.0のポリバッファー74(ファル
マシア・エル・ケー・ビー製造)を通液して培養上清を
溶出させ、各溶出画分をPBSに対して透析した後、癌
転移抑制活性の有無を試験した。その結果、pH5.0
乃至6.5の間に溶出した画分に癌転移抑制活性のある
ことが判明した。活性画分を集め、Sephacryl
S−200カラム(ファルマシア・エル・ケー・ビー
製造)により再分画した後、各溶出画分の癌転移抑制活
性を試験したところ、溶出液体積/充填ゲル体積が0.
5乃至0.65の間に溶出した画分に癌転移抑制活性が
認められた。その活性画分を10mM燐酸カリウム緩衝
液(pH7.4)に対して透析した後、10mM燐酸カ
リウム緩衝液(pH7.4)で平衡化したDEAE−5
PWカラム(東ソー製造)に負荷し、次いで、10mM
から500mMまでの燐酸カリウム緩衝液(pH7.
4)による直線濃度勾配下で溶出させたところ、癌転移
抑制活性は、燐酸カリウム緩衝液の濃度が70mM付近
に溶出された。このようにして得られた活性画分を10
mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)に対して透析
した後、10mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)
で平衡化させたヒドロキシアパタイトカラム(東亜燃料
工業製造)に負荷し、カラムに10mM燐酸ナトリウム
緩衝液(pH6.8)を通液したところ、癌転移抑制活
性は非吸着画分に認められた。この非吸着画分を25m
Mビス・トリスーイミノ二酢酸緩衝液(pH7.1)で
平衡化させたMono−Pカラム(ファルマシア・エル
・ケー・ビー製造)に負荷し、次いで、ポリバッファー
74(pH4.0)で溶出させることにより、癌転移抑
制活性を有する本発明の蛋白質を単離した。
【0026】このようにして、BCG及びLPSで刺激
したHPB−MLT細胞の培養上清50リットルから本
発明の蛋白質約70μgを単離した。本品を用いて理化
学的性質を調べた。
したHPB−MLT細胞の培養上清50リットルから本
発明の蛋白質約70μgを単離した。本品を用いて理化
学的性質を調べた。
【0027】(1)分子量 本品をレムリ(Laemmli)、『ネーチャー(Na
ture)』、第227巻、第680〜685頁(19
70年)に記載された方法に準じてドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下、「SDS
−PAGE」と略記する。)し、分子量マーカとの相対
易動度より分子量を測定したところ、45,000±
5,000であった。
ture)』、第227巻、第680〜685頁(19
70年)に記載された方法に準じてドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下、「SDS
−PAGE」と略記する。)し、分子量マーカとの相対
易動度より分子量を測定したところ、45,000±
5,000であった。
【0028】(2)等電点 Mono−Pカラムからの溶出pHより、本品の等電点
は5.7±0.5と推定された。
は5.7±0.5と推定された。
【0029】(3)部分アミノ酸配列 本品をSDS−PAGEにかけ、ゲルから分子量約4
5,000に相当するバンドを切出した。切出したゲル
切片を0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む100m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)溶液中、37℃で
1時間処理した後、リジルエンドペプチダーゼ(和光純
薬製造)を5μg/ml添加し、37℃で一晩消化し
た。消化物の上清をDEAEプレカラム付きのC18カ
ラム(バイダック製造)による逆相クロマトグラフィー
で分画し、ペプチド断片を分取した。得られたペプチド
断片の部分アミノ酸配列をアミノ酸シーケンサ『470
A型(アプライッドバイオシステム社製造)』により分
析した結果を化3、化4、化5及び化6に示す。
5,000に相当するバンドを切出した。切出したゲル
切片を0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む100m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)溶液中、37℃で
1時間処理した後、リジルエンドペプチダーゼ(和光純
薬製造)を5μg/ml添加し、37℃で一晩消化し
た。消化物の上清をDEAEプレカラム付きのC18カ
ラム(バイダック製造)による逆相クロマトグラフィー
で分画し、ペプチド断片を分取した。得られたペプチド
断片の部分アミノ酸配列をアミノ酸シーケンサ『470
A型(アプライッドバイオシステム社製造)』により分
析した結果を化3、化4、化5及び化6に示す。
【0030】
【化3】
【0031】
【化4】
【0032】
【化5】
【0033】
【化6】
【0034】(4)溶剤に対する溶解性 本品は水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶であった。
【0035】(5)生物活性 本品の癌転移抑制活性を実験1の方法で試験した。その
結果、対照群(ヌードマウス5匹使用)における転移巣
数が314±169個であったのに対して、本品を25
0μg/ml含む溶液を投与した群(ヌードマウス5匹
使用)の転移巣数は100±43個であり、本品が顕著
な癌転移抑制活性を有することが明らかとなった。
結果、対照群(ヌードマウス5匹使用)における転移巣
数が314±169個であったのに対して、本品を25
0μg/ml含む溶液を投与した群(ヌードマウス5匹
使用)の転移巣数は100±43個であり、本品が顕著
な癌転移抑制活性を有することが明らかとなった。
【0036】(6)安定性 本品をpH7.2の燐酸緩衝液に溶解し、溶液を100
℃で30分間放置した後、実験1の方法で癌転移抑制活
性を試験したところ、活性は認められず、本発明の蛋白
質はこの条件下で失活することが判明した。一方、本品
をpH7.2の燐酸緩衝液に溶解し、溶液を4℃で一ヶ
月間放置した後、同様に活性を試験したところ、活性の
低下は認められず、本発明の蛋白質はこの条件下で安定
であることが判明した。
℃で30分間放置した後、実験1の方法で癌転移抑制活
性を試験したところ、活性は認められず、本発明の蛋白
質はこの条件下で失活することが判明した。一方、本品
をpH7.2の燐酸緩衝液に溶解し、溶液を4℃で一ヶ
月間放置した後、同様に活性を試験したところ、活性の
低下は認められず、本発明の蛋白質はこの条件下で安定
であることが判明した。
【0037】
【実験4】 急性毒性試験 7週齢のマウスを使用して、本品の急性毒性を試験した
ところ、静脈内に投与した場合、本品のLD50は50
mg/kg以上と、極めて毒性の低いことが判明した。
ところ、静脈内に投与した場合、本品のLD50は50
mg/kg以上と、極めて毒性の低いことが判明した。
【0038】
【実験5】 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の塩基
配列 本実験では、ティー・マニアティス(T.Maniat
is)等、『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル(Molecular Cloni
ng A Laboratory Manual)』、
第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー(Cold Spring Harbor Labo
ratory)発行、1989年などに記載されている
一般的な方法を採用し、本発明の蛋白質をコードする遺
伝子の塩基配列を決定した。
配列 本実験では、ティー・マニアティス(T.Maniat
is)等、『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル(Molecular Cloni
ng A Laboratory Manual)』、
第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー(Cold Spring Harbor Labo
ratory)発行、1989年などに記載されている
一般的な方法を採用し、本発明の蛋白質をコードする遺
伝子の塩基配列を決定した。
【0039】
【実験5−1】 HPB−MLT細胞のcDNAライブ
ラリーの作製 実験2の方法で得たHPB−MLT細胞を血清無添加の
RPMI1640培地に5×106 個/mlの濃度にな
るように懸濁した。次いで、懸濁液にBCGを10μg
/ml添加し、37℃で1日培養した後、LPSを1μ
g/ml添加してさらに4.5時間培養した。培養物を
遠心分離して回収した細胞を4Mグアニジウム・イソチ
オシアネートで可溶化し、ホモゲナイズした後、5.7
M塩化セシウム上に重層させ、25,000rpmでさ
らに17時間遠心分離することによりトータルRNAを
得た。次いで、ポリ(A)+ RNA精製用ビーズ『オリ
ゴテックス−dT30・スーパ(第一化学薬品製造)』
を用いてポリ(A)+ RNAを精製し、そのポリ(A)
+ RNAにcDNA合成システム・プラス(アマシャム
製造)をそこに添加されている指示書にしたがって適用
することによりcDNAを合成した。次いで、cDNA
クローニングシステムλgt10(アマシャム製造)を
用いてその合成したcDNAとλgt10ファージDN
Aとをライゲーションさせ、ライゲーションにより得ら
れた組換ファージDNAをラムダ・インビトロ・パッケ
ージング・キット(アマシャム製造)を使用してパッケ
ージングすることにより、組換ファージによるHPB−
MLT細胞のcDNAライブラリーを作製した。
ラリーの作製 実験2の方法で得たHPB−MLT細胞を血清無添加の
RPMI1640培地に5×106 個/mlの濃度にな
るように懸濁した。次いで、懸濁液にBCGを10μg
/ml添加し、37℃で1日培養した後、LPSを1μ
g/ml添加してさらに4.5時間培養した。培養物を
遠心分離して回収した細胞を4Mグアニジウム・イソチ
オシアネートで可溶化し、ホモゲナイズした後、5.7
M塩化セシウム上に重層させ、25,000rpmでさ
らに17時間遠心分離することによりトータルRNAを
得た。次いで、ポリ(A)+ RNA精製用ビーズ『オリ
ゴテックス−dT30・スーパ(第一化学薬品製造)』
を用いてポリ(A)+ RNAを精製し、そのポリ(A)
+ RNAにcDNA合成システム・プラス(アマシャム
製造)をそこに添加されている指示書にしたがって適用
することによりcDNAを合成した。次いで、cDNA
クローニングシステムλgt10(アマシャム製造)を
用いてその合成したcDNAとλgt10ファージDN
Aとをライゲーションさせ、ライゲーションにより得ら
れた組換ファージDNAをラムダ・インビトロ・パッケ
ージング・キット(アマシャム製造)を使用してパッケ
ージングすることにより、組換ファージによるHPB−
MLT細胞のcDNAライブラリーを作製した。
【0040】
【実験5−2】 標識DNAプローブの作製 実験3で得られた化3に示す部分アミノ酸配列に基づ
き、その部分アミノ酸配列における配列Glu−Gly
−Tyr−Ile−Tyr−Alaから予想される塩基
配列をDNAシンセサイザー(アプライッドバイオシス
テム製造)で合成した。合成した塩基17個からなる9
6種類の配列を表1に示す。
き、その部分アミノ酸配列における配列Glu−Gly
−Tyr−Ile−Tyr−Alaから予想される塩基
配列をDNAシンセサイザー(アプライッドバイオシス
テム製造)で合成した。合成した塩基17個からなる9
6種類の配列を表1に示す。
【0041】
【表1】
【0042】化5に示す部分アミノ酸配列については、
その配列Asn−Pro−His−Leu−Lysから
予想される塩基配列の相補鎖を上記と同様にして合成し
た。合成した塩基14個からなる96種類の配列を表2
に示す。なお、DNAは[γ−32P]ATPとT4ポ
リヌクレオチドキナーゼを使い、常法にしたがって標識
した。
その配列Asn−Pro−His−Leu−Lysから
予想される塩基配列の相補鎖を上記と同様にして合成し
た。合成した塩基14個からなる96種類の配列を表2
に示す。なお、DNAは[γ−32P]ATPとT4ポ
リヌクレオチドキナーゼを使い、常法にしたがって標識
した。
【0043】
【表2】
【0044】
【実験5−3】 標識DNAプローブを用いたスクリー
ニング 実験5−1で調製したHPB−MLT細胞のcDNAラ
イブラリーである組換λgt10ファージ液と大腸菌N
M514T株をL培地で一晩培養して得られた培養液と
を混合し、混合物を37℃で15分間インキュベートし
た後、ソフトアガーを混合し、ハードアガー上に重層
し、固化させた。次いで、重層したアガー上の大腸菌を
37℃で8時間培養し、冷却した後、アガー上にメンブ
ランフィルタ『Hybond N フィルタ(アマシャ
ム製造)』を重ねてメンブランフィルタ上にファージを
移取り、ファージDNAを固定した。次に、標識DNA
プローブと目的とする相補DNA以外のDNAとの非特
異的結合を防止するために、メンブランフィルタをサケ
***DNA(シグマ製造)溶液に浸漬することによりプ
レハイブリダイゼーションさせた後、実験5−2で調製
した標識DNAプローブを用いてサザンハイブリダイゼ
ーション法によるスクリーニングを行った。表1に示す
プローブ1による一次スクリーニングと表2に示すプロ
ーブ2による二次スクリーニングを行った結果、約60
万個のクローンから3個の陽性クローンが得られた。こ
れら陽性クローンから取出したファージDNAを制限酵
素EcoRIで消化してベクターDNAから切離し、挿
入断片の長さをアガロース電気泳動で確認した後、最も
長い約1.5kbpの挿入断片を持つクローンについて
さらなる解析を行った。
ニング 実験5−1で調製したHPB−MLT細胞のcDNAラ
イブラリーである組換λgt10ファージ液と大腸菌N
M514T株をL培地で一晩培養して得られた培養液と
を混合し、混合物を37℃で15分間インキュベートし
た後、ソフトアガーを混合し、ハードアガー上に重層
し、固化させた。次いで、重層したアガー上の大腸菌を
37℃で8時間培養し、冷却した後、アガー上にメンブ
ランフィルタ『Hybond N フィルタ(アマシャ
ム製造)』を重ねてメンブランフィルタ上にファージを
移取り、ファージDNAを固定した。次に、標識DNA
プローブと目的とする相補DNA以外のDNAとの非特
異的結合を防止するために、メンブランフィルタをサケ
***DNA(シグマ製造)溶液に浸漬することによりプ
レハイブリダイゼーションさせた後、実験5−2で調製
した標識DNAプローブを用いてサザンハイブリダイゼ
ーション法によるスクリーニングを行った。表1に示す
プローブ1による一次スクリーニングと表2に示すプロ
ーブ2による二次スクリーニングを行った結果、約60
万個のクローンから3個の陽性クローンが得られた。こ
れら陽性クローンから取出したファージDNAを制限酵
素EcoRIで消化してベクターDNAから切離し、挿
入断片の長さをアガロース電気泳動で確認した後、最も
長い約1.5kbpの挿入断片を持つクローンについて
さらなる解析を行った。
【0045】
【実験5−4】 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の
塩基配列 実験5−3で得た陽性クローンからファージDNAを取
り出し、制限酵素EcoRIで切断した後、アクリルア
ミドゲル電気泳動で分離して約1.5kbpの挿入DN
A断片を得た。このDNA断片をライゲーションキット
(アマシャム製造)を用いてpUC18プラスミドにラ
イゲーションすることにより、組換プラスミドを得た。
この組換プラスミドを常法により大腸菌に導入して得ら
れた形質転換体からプラスミドDNAを調製し、次い
で、そのプラスミドDNAにジデオキシ法を適用するこ
とにより本発明の塩基配列を決定し、その塩基配列から
本発明による蛋白質のアミノ酸配列を推定した。その結
果、本発明のDNAは1,224塩基からなり、アミノ
酸408個からなる蛋白質をコードしていることが判明
した。そして、ここで推定したアミノ酸配列は、実験3
で決定したアミノ酸配列化3、化4、化5及び化6を全
て包括していた。
塩基配列 実験5−3で得た陽性クローンからファージDNAを取
り出し、制限酵素EcoRIで切断した後、アクリルア
ミドゲル電気泳動で分離して約1.5kbpの挿入DN
A断片を得た。このDNA断片をライゲーションキット
(アマシャム製造)を用いてpUC18プラスミドにラ
イゲーションすることにより、組換プラスミドを得た。
この組換プラスミドを常法により大腸菌に導入して得ら
れた形質転換体からプラスミドDNAを調製し、次い
で、そのプラスミドDNAにジデオキシ法を適用するこ
とにより本発明の塩基配列を決定し、その塩基配列から
本発明による蛋白質のアミノ酸配列を推定した。その結
果、本発明のDNAは1,224塩基からなり、アミノ
酸408個からなる蛋白質をコードしていることが判明
した。そして、ここで推定したアミノ酸配列は、実験3
で決定したアミノ酸配列化3、化4、化5及び化6を全
て包括していた。
【0046】次に、本発明による蛋白質の製造方法の実
施例を示す。
施例を示す。
【0047】
【実施例】実験2と同様にしてヒトT細胞白血病由来の
株化細胞であるMOLT−4細胞(大日本製薬販売)を
BCG及びLPSで刺激しながら培養し、次いで、その
培養上清を実験3と同様に処理して癌転移抑制活性を有
する本発明の蛋白質を採取した。収量は、培養上清50
リットル当たり約40μgであった。本品は、実験3で
調製した蛋白質と同一の理化学的性質を有していた。
株化細胞であるMOLT−4細胞(大日本製薬販売)を
BCG及びLPSで刺激しながら培養し、次いで、その
培養上清を実験3と同様に処理して癌転移抑制活性を有
する本発明の蛋白質を採取した。収量は、培養上清50
リットル当たり約40μgであった。本品は、実験3で
調製した蛋白質と同一の理化学的性質を有していた。
【0048】
【発明の効果】本発明の蛋白質は癌転移を効果的に抑制
するので、癌転移の予防剤、治療剤、診断剤として有用
である。本発明の蛋白質は毒性が低いことから、注射剤
や舌下剤などの適宜剤形にして全身投与することができ
る。
するので、癌転移の予防剤、治療剤、診断剤として有用
である。本発明の蛋白質は毒性が低いことから、注射剤
や舌下剤などの適宜剤形にして全身投与することができ
る。
【0049】斯くも有用な当該蛋白質は、本発明の製造
方法により、大量に製造することができる。
方法により、大量に製造することができる。
【0050】また、本発明の蛋白質をコードするDNA
は、遺伝子組換法により本発明の蛋白質を製造する上で
有用である。
は、遺伝子組換法により本発明の蛋白質を製造する上で
有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // A61K 37/02 ADU 8314−4C C12N 5/06 5/08 (C12P 21/02 C12R 1:91)
Claims (5)
- 【請求項1】 理化学的性質が (1)分子量 45,000±5,000 (2)等電点 pI=5.7±0.5 (3)部分アミノ酸配列 Asp−Ser−Glu−Gly−Tyr−Ile−T
yr−Ala−Arg−Gly−Ala−Gln−As
p−Met−Lys又はGlu−His−Trp−Se
r−His−Asp−Pro−Phe−Gluを有する (4)溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶 (5)生物活性 ヒト大腸癌由来の株化培養細胞であるRPMI4788
細胞(微工研条寄第2429号)の転移を抑制する活性
を有する (6)安定性 水溶液中、pH7.2にて100℃で30分間放置する
と失活する 水溶液中、pH7.2にて4℃で一ヶ月間放置しても安
定 である蛋白質。 - 【請求項2】 実質的に下記の化1で表わされるアミノ
酸配列を含有する請求項1に記載の蛋白質。 【化1】 - 【請求項3】 理化学的性質が (1)分子量 45,000±5,000 (2)等電点 pI=5.7±0.5 (3)部分アミノ酸配列 Asp−Ser−Glu−Gly−Tyr−Ile−T
yr−Ala−Arg−Gly−Ala−Gln−As
p−Met−Lys又はGlu−His−Trp−Se
r−His−Asp−Pro−Phe−Gluを有する (4)溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶 (5)生物活性 ヒト大腸癌由来の株化培養細胞であるRPMI4788
細胞(微工研条寄第2429号)の転移を抑制する活性
を有する (6)安定性 水溶液中、pH7.2にて100℃で30分間放置する
と失活する 水溶液中、pH7.2にて4℃で一ヶ月間放置しても安
定 である蛋白質をコードするDNA。 - 【請求項4】 実質的に下記の化2で表わされる塩基配
列を有する請求項3に記載のDNA。 【化2】 - 【請求項5】 理化学的性質が (1)分子量 45,000±5,000 (2)等電点 pI=5.7±0.5 (3)部分アミノ酸配列 Asp−Ser−Glu−Gly−Tyr−Ile−T
yr−Ala−Arg−Gly−Ala−Gln−As
p−Met−Lys又はGlu−His−Trp−Se
r−His−Asp−Pro−Phe−Gluを有する (4)溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶 (5)生物活性 ヒト大腸癌由来の株化培養細胞であるRPMI4788
細胞(微工研条寄第2429号)の転移を抑制する活性
を有する (6)安定性 水溶液中、pH7.2にて100℃で30分間放置する
と失活する 水溶液中、pH7.2にて4℃で一ヶ月間放置しても安
定 である蛋白質の産生能を有する細胞を培養し、得られる
培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質
の製造方法。
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28113692A JP3439490B2 (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 蛋白質とその蛋白質をコードするdna並びにその蛋白質の製造方法 |
TW082107913A TW241268B (ja) | 1992-09-28 | 1993-09-25 | |
KR1019930019832A KR100294977B1 (ko) | 1992-09-28 | 1993-09-27 | 단백질과이단백질을코우드하는dna및이단백질의제조방법 |
US08/127,278 US5498697A (en) | 1992-09-28 | 1993-09-27 | Protein possessing metastasis-inhibitory activity |
EP93307668A EP0594311B1 (en) | 1992-09-28 | 1993-09-28 | Process for preparing a metastasis-inhibiting protein and uses thereof. |
DE69331368T DE69331368T2 (de) | 1992-09-28 | 1993-09-28 | Herstellung und Benützung eines Metastasehemmendes Proteines. |
US08/555,860 US5585474A (en) | 1992-09-28 | 1995-11-13 | DNA encoding protein possessing metastasis-inhibitory activity |
US08/827,864 US5827691A (en) | 1992-09-28 | 1997-04-09 | Process for preparing a protein which inhibits metastasis of cancer |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28113692A JP3439490B2 (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 蛋白質とその蛋白質をコードするdna並びにその蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06107693A true JPH06107693A (ja) | 1994-04-19 |
JP3439490B2 JP3439490B2 (ja) | 2003-08-25 |
Family
ID=17634871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP28113692A Expired - Fee Related JP3439490B2 (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 蛋白質とその蛋白質をコードするdna並びにその蛋白質の製造方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US5498697A (ja) |
EP (1) | EP0594311B1 (ja) |
JP (1) | JP3439490B2 (ja) |
KR (1) | KR100294977B1 (ja) |
DE (1) | DE69331368T2 (ja) |
TW (1) | TW241268B (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ500748A (en) * | 1997-05-12 | 2001-06-29 | Aphton Corp | Methods for the treatment of gastrin-dependent tumours comprising active or passive immunisation with an anti-CCK-B/gastrin receptor immunogen or anti-CCK-B/gastrin receptor antibodies |
US20040001842A1 (en) * | 1997-05-12 | 2004-01-01 | Dov Michaeli | Immunogenic compositions to the CCK-B/gastrin receptor and methods for the treatment of tumors |
JP2005508838A (ja) | 2001-03-23 | 2005-04-07 | アフトン コーポレーション | 膵癌の組合せ治療 |
US6387661B1 (en) * | 2001-03-23 | 2002-05-14 | Pe Corporation (Ny) | Nucleic acid molecules encoding human aminoacylase proteins |
US20090191232A1 (en) | 2001-05-04 | 2009-07-30 | Gevas Philip C | Combination therapy for the treatment of tumors |
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