JPS6230A - 悪性腫瘍性貧血治療剤 - Google Patents
悪性腫瘍性貧血治療剤Info
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- JPS6230A JPS6230A JP61022928A JP2292886A JPS6230A JP S6230 A JPS6230 A JP S6230A JP 61022928 A JP61022928 A JP 61022928A JP 2292886 A JP2292886 A JP 2292886A JP S6230 A JPS6230 A JP S6230A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
て含有する悪性腫瘍性貧血治療剤に関する。
エリスロポエチン(以下EPOと略記することもある)
は主として腎で生産される糖タンパクであり骨髄に存在
する赤芽球系幹細胞に働いて赤血球系細胞への分化を促
進する作用を有する体液性造血因子として知られている
。
は主として腎で生産される糖タンパクであり骨髄に存在
する赤芽球系幹細胞に働いて赤血球系細胞への分化を促
進する作用を有する体液性造血因子として知られている
。
ヒ)EPOに関する研究は多数報告されているが、入手
できる純粋なヒ)EPOの量に制約があることから、ヒ
トEPOの医薬としての有用性および有効性については
未だ不明である。
できる純粋なヒ)EPOの量に制約があることから、ヒ
トEPOの医薬としての有用性および有効性については
未だ不明である。
近年、担癌患者に於ける合併症として貧血症が高頻度で
認められており[例えば、MillerA等;ジャーナ
ル オブ クリニカル インベスティゲーシaン(J.
Clin.Invest.)fi旦巻 1248頁(1
956)を参照コ、特に重度の貧血は臨床的に患者の治
療上重要な問題となっている。
認められており[例えば、MillerA等;ジャーナ
ル オブ クリニカル インベスティゲーシaン(J.
Clin.Invest.)fi旦巻 1248頁(1
956)を参照コ、特に重度の貧血は臨床的に患者の治
療上重要な問題となっている。
貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄ブロック、鉄放出障害、牌の関与、エリスロポエチン
産生障害、溶血、造血幹細胞異常などが考えられている
が、悪性腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、
網内系鉄プロ・ンク、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管
障害や自己免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療
°による骨髄抑制などの他、慢性炎症等が原因とされて
いる。
鉄ブロック、鉄放出障害、牌の関与、エリスロポエチン
産生障害、溶血、造血幹細胞異常などが考えられている
が、悪性腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、
網内系鉄プロ・ンク、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管
障害や自己免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療
°による骨髄抑制などの他、慢性炎症等が原因とされて
いる。
一方担癌患者に於ける血中EPO値は正常値と同レベル
か低値であると報告されている[例えば、Zucker
S等 : ジャーナル オブ クリニカルインヘ
スティゲージ=t7 (J、Cl1n、Invest
、)1巻 1132頁 (1974)、 Dougl
as SW等;ブラッド(Blood) A旦巻
55頁(1975)、FiratD等 ; キャンサー
リサーチ(Cancer Res、)3J−巻13
55頁 (1971)、Ward HP等 ; ジャ
ーナルオブ クリニカル インベスティゲーション (
J、 CI in。
か低値であると報告されている[例えば、Zucker
S等 : ジャーナル オブ クリニカルインヘ
スティゲージ=t7 (J、Cl1n、Invest
、)1巻 1132頁 (1974)、 Dougl
as SW等;ブラッド(Blood) A旦巻
55頁(1975)、FiratD等 ; キャンサー
リサーチ(Cancer Res、)3J−巻13
55頁 (1971)、Ward HP等 ; ジャ
ーナルオブ クリニカル インベスティゲーション (
J、 CI in。
Invest、)旦立巻 332頁(1971)及び
DeGowinRL等 ; ジャーナル オブ ラボラ
トリ アンド クリニカルメディシy (J、Lab
、Cl1n、Med、)in巻 303頁(1979)
等を参照コ。
DeGowinRL等 ; ジャーナル オブ ラボラ
トリ アンド クリニカルメディシy (J、Lab
、Cl1n、Med、)in巻 303頁(1979)
等を参照コ。
しかしながら、血中EPO値の低下の度合いと貧血の程
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性ms性貧血はエ
リスロポエチン産生障害よりむしろEPOに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある[Zucker S等 ; ジ
ャーナル オブ クリニカルインヘスティゲージン(J
、Cl1n、Invest、)5i巻1132頁 (1
979)を参照]。
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性ms性貧血はエ
リスロポエチン産生障害よりむしろEPOに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある[Zucker S等 ; ジ
ャーナル オブ クリニカルインヘスティゲージン(J
、Cl1n、Invest、)5i巻1132頁 (1
979)を参照]。
従って悪性腫瘍性貧血患者にヒ)EPOを投与しても悪
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。
ヒトEPOの作用効果に関してはこれまで多数報告され
ているが悪性腫瘍性貧血の治療薬として有効であること
をヒト又は動物に実際に投与することによって実証した
ものはない。
ているが悪性腫瘍性貧血の治療薬として有効であること
をヒト又は動物に実際に投与することによって実証した
ものはない。
本発明者等は人尿中から高純度に精製したヒトEPOお
よびヒ)EPOをコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たヒトEPOを用いて担癌動物について貧
血治療効果を調べたところ、ヒ)EPOが顕著な貧血治
療効果を示したことから悪性腫瘍性貧血治療薬として有
効であることを見い出し本発明を完成した。本発明は新
規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係るものである。
よびヒ)EPOをコードする遺伝子を宿主細胞内で形質
発現させて得たヒトEPOを用いて担癌動物について貧
血治療効果を調べたところ、ヒ)EPOが顕著な貧血治
療効果を示したことから悪性腫瘍性貧血治療薬として有
効であることを見い出し本発明を完成した。本発明は新
規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係るものである。
すなわち本発明はヒトエリスロポエチンを有効成分とし
て含育する悪性腫瘍性貧血治療剤である。
て含育する悪性腫瘍性貧血治療剤である。
本発明に用いられるヒトエリスロポエチンとは、前述の
如き赤血球系細胞への増殖、分化成熟をつかさどるyk
ffi生理活性物質として規定される。
如き赤血球系細胞への増殖、分化成熟をつかさどるyk
ffi生理活性物質として規定される。
ヒトEPOは種々の手段によって得られることが知られ
ており、例えば、正常人尿や再生不良性貧血患者の尿又
は血漿(血清を含む)から抽出する方法[T、MIYA
KE等、ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ
ー(J、B、C,’)g旦2巻 6558頁(1977
);J、P、Lewin等、ジャーナル オブ ラボラ
トリ−アンドクリニカル メディシ7 (J、Lab
、C11n、Med、)且巻987頁(1985) ]
ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造する方法[特開昭5
4−557901、ヒトエリスロポエチン産生能を有す
るヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する方法[特開
昭57−40411]等の他、ヒト細胞株を細胞融合し
て得られるハイブリドーマを培養して得る方法やヒトE
POのメソセンジ+−RNA (mRNA)を採取する
ことにより、そのmRNAを利用して組換DNA体を作
成し、適当な宿主細胞(例えば、大腸菌の如き細菌類、
酵母類、植物又は動物の細胞株等)で生産させるような
、所謂、遺伝子工学的方法によっても得られる。[例え
ば、5YLVIAL、 H,等 ; プロシーディング
オブ ザナシロナル アカデミ−オブ サイエンシー
ズ オブ ザ ニーニスニー (Proc、Natl、
Acad、Sci、USA fl上巻 2708頁(
1984)を参照]。
ており、例えば、正常人尿や再生不良性貧血患者の尿又
は血漿(血清を含む)から抽出する方法[T、MIYA
KE等、ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ
ー(J、B、C,’)g旦2巻 6558頁(1977
);J、P、Lewin等、ジャーナル オブ ラボラ
トリ−アンドクリニカル メディシ7 (J、Lab
、C11n、Med、)且巻987頁(1985) ]
ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造する方法[特開昭5
4−557901、ヒトエリスロポエチン産生能を有す
るヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する方法[特開
昭57−40411]等の他、ヒト細胞株を細胞融合し
て得られるハイブリドーマを培養して得る方法やヒトE
POのメソセンジ+−RNA (mRNA)を採取する
ことにより、そのmRNAを利用して組換DNA体を作
成し、適当な宿主細胞(例えば、大腸菌の如き細菌類、
酵母類、植物又は動物の細胞株等)で生産させるような
、所謂、遺伝子工学的方法によっても得られる。[例え
ば、5YLVIAL、 H,等 ; プロシーディング
オブ ザナシロナル アカデミ−オブ サイエンシー
ズ オブ ザ ニーニスニー (Proc、Natl、
Acad、Sci、USA fl上巻 2708頁(
1984)を参照]。
前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(
CHO)細胞、マウスC−127細胞などを挙げること
ができる。
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(
CHO)細胞、マウスC−127細胞などを挙げること
ができる。
これらの方法によって得られたヒトEPOは悪性腫瘍性
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。
上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒ)EPOは、所望により通常の単離・精製法によ′
ってさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息
香酸、エタノール、アセトン。
るヒ)EPOは、所望により通常の単離・精製法によ′
ってさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息
香酸、エタノール、アセトン。
タンニン酸等の宵機溶媒による沈殿法、硫安等による塩
析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフイー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、
等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電気泳動法などが挙
げられ、これらの方法は単独でまたは適宜組合わせて用
いてもよい。
析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフイー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、
等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の電気泳動法などが挙
げられ、これらの方法は単独でまたは適宜組合わせて用
いてもよい。
得られたヒトEPOは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトEPO含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトEPOを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とができる。
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトEPO含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトEPOを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とができる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は場合によりその他の貧
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンB12製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、グルコン酸鉄、グルクロン酸鉄、オロチン
酸鉄等を挙げることができる。
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンB12製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、グルコン酸鉄、グルクロン酸鉄、オロチン
酸鉄等を挙げることができる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤に含まれるヒトEPOの
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常、成人1人当たり0.1〜50
0μg好ましくは5〜100μgのヒトエリスロポエチ
ンを含有する製剤を1週間に1〜7回投与することがで
きる。
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常、成人1人当たり0.1〜50
0μg好ましくは5〜100μgのヒトエリスロポエチ
ンを含有する製剤を1週間に1〜7回投与することがで
きる。
本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は安定化物質を含んでい
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、有
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの1つ又は2
つ以上を含有してもよい。
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、有
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの1つ又は2
つ以上を含有してもよい。
これらの安定化物質の添加量は、エリスロポエチンの1
重量部にたいして0.11〜10000重量部割合で配
合することが好ましい。なお、2つ以上の安定化物質を
混合して使用する場合においてもそれらの総量が上記範
囲以内であればよい。
重量部にたいして0.11〜10000重量部割合で配
合することが好ましい。なお、2つ以上の安定化物質を
混合して使用する場合においてもそれらの総量が上記範
囲以内であればよい。
これらの安定化物質は相応する量を適当な濃度とpHの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は0
.1〜3,0の範囲とし、より好ましくは0.8〜1.
2である。水溶液のpHは5.0〜9.0 に調整し、
特にpH6〜8に調整するのが好ましい。また本発明の
製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤を添加しても
よい。
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は0
.1〜3,0の範囲とし、より好ましくは0.8〜1.
2である。水溶液のpHは5.0〜9.0 に調整し、
特にpH6〜8に調整するのが好ましい。また本発明の
製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤を添加しても
よい。
MIYAKE、 T、 等の方法(J、 B、 C,
皿5558(1977))に従って再生不良性貧血患者
法から 1)Sephadex G50による脱塩
2)DEAEセルロースによるバッチ吸着3)エタノー
ル沈殿4)DEAEアガロースカラムクロマトクラフィ
ーを用いて部分精製されたヒ)EPOを得た。得られた
部分精製ヒ)EPOを24%プロパツール(和光純薬社
製)を含む0.1 %トリフルオロ酢酸(A I d
r i c h i社製)溶液に溶解せしめたのちHP
LCによる精製を行った。HPLCa置は日立838−
50型を用い280 nmと220nmの紫外部吸収に
より検出を行った。
皿5558(1977))に従って再生不良性貧血患者
法から 1)Sephadex G50による脱塩
2)DEAEセルロースによるバッチ吸着3)エタノー
ル沈殿4)DEAEアガロースカラムクロマトクラフィ
ーを用いて部分精製されたヒ)EPOを得た。得られた
部分精製ヒ)EPOを24%プロパツール(和光純薬社
製)を含む0.1 %トリフルオロ酢酸(A I d
r i c h i社製)溶液に溶解せしめたのちHP
LCによる精製を行った。HPLCa置は日立838−
50型を用い280 nmと220nmの紫外部吸収に
より検出を行った。
1 口マ ラフ −
24%n−プロパツールを含んだ0.1 %トリフル
オロ酢酸溶液で予め平衡化したYMC−C8カラム(8
mmX30cm山村化学社製)に上記で得られた試料を
注入し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶
出後、n−プロパツールの濃度を26%に高めて溶出さ
せた。EPOの活性画分を集めた後、Cent r 1
con −100(Amlcon社製商品名)を用いた
限外ろ適法により 0.1〜0.2mlに濃縮した。
オロ酢酸溶液で予め平衡化したYMC−C8カラム(8
mmX30cm山村化学社製)に上記で得られた試料を
注入し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶
出後、n−プロパツールの濃度を26%に高めて溶出さ
せた。EPOの活性画分を集めた後、Cent r 1
con −100(Amlcon社製商品名)を用いた
限外ろ適法により 0.1〜0.2mlに濃縮した。
゛ ロマ ラフ −
上記濃縮試料を26%n−プロパツールを含む 0.1
%TFA溶液で予め平衡化したTSK−G300SWカ
ラム(7,8mmX80cm東洋曹達社製)に注入し、
前記平衡液で溶出させた。分子量25000〜3000
0の位置にEPO活性ををするピークが得られたので、
この部分を集めて凍結乾燥した。
%TFA溶液で予め平衡化したTSK−G300SWカ
ラム(7,8mmX80cm東洋曹達社製)に注入し、
前記平衡液で溶出させた。分子量25000〜3000
0の位置にEPO活性ををするピークが得られたので、
この部分を集めて凍結乾燥した。
比活性は約9X10’u/mgであった。
各ステップに於ける比活性を表工に示す。
表l
5tep 比活性*
(u/mg)*アッセイ法 1scove N、N
等[ジャーナル オブセルラー フィジオロジ−(J、
Ce l 1.Ph1s io 1.)■巻 309頁
(1974)]の方法に従った。
(u/mg)*アッセイ法 1scove N、N
等[ジャーナル オブセルラー フィジオロジ−(J、
Ce l 1.Ph1s io 1.)■巻 309頁
(1974)]の方法に従った。
参考例2 に ヒト の1゛112月2
7日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換のた
めの補助DNAを含むベクター」(特願昭59−281
862)に開示された方法に従って、ヒトEPOをコー
ドする遺伝子を組込んだプラスミドをチャイニーズハム
スター卵巣細胞(CHO細胞)で形質発現させることに
よってヒトEPOを得た。要約すると以下の如くである
。
7日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換のた
めの補助DNAを含むベクター」(特願昭59−281
862)に開示された方法に従って、ヒトEPOをコー
ドする遺伝子を組込んだプラスミドをチャイニーズハム
スター卵巣細胞(CHO細胞)で形質発現させることに
よってヒトEPOを得た。要約すると以下の如くである
。
ヒト胎児肝細胞から得られたヒトEPoをコードする遺
伝子を組込んだラムダHEPOFL13クローンからの
DNAをEcoRlで消化させ、EPOをコードする遺
伝子を含む小さなR1フラグメントを取り出しプラスミ
ドRKI−4のEcoR1部位へ挿入した。このEPO
遺伝子を組込んだプラスミドRKI−4をDHFR−欠
損CHO細胞に組入れて形質転換させた。CHO細胞を
核酸を欠如したアルファ媒地中で培養することによって
少なくとも1つのDHFR遺伝子を育する細胞を選択し
た後、段階的にメトトレキサートの濃度を高めてゆくこ
とによってヒトEPOを産生させた。
伝子を組込んだラムダHEPOFL13クローンからの
DNAをEcoRlで消化させ、EPOをコードする遺
伝子を含む小さなR1フラグメントを取り出しプラスミ
ドRKI−4のEcoR1部位へ挿入した。このEPO
遺伝子を組込んだプラスミドRKI−4をDHFR−欠
損CHO細胞に組入れて形質転換させた。CHO細胞を
核酸を欠如したアルファ媒地中で培養することによって
少なくとも1つのDHFR遺伝子を育する細胞を選択し
た後、段階的にメトトレキサートの濃度を高めてゆくこ
とによってヒトEPOを産生させた。
最終的な培養上清中のヒ)EPOの比活性は20u/m
lであった。得られたヒ)EPOを含む培養液は0.1
%BSAを含む生理食塩水にて透析した後実験に供した
。
lであった。得られたヒ)EPOを含む培養液は0.1
%BSAを含む生理食塩水にて透析した後実験に供した
。
6週令の雄マウスの側腹部皮下に以下のマウス腫層株の
小片(1〜2mm角)を移植後、12〜16日のちに背
中足静脈から部分採血して赤血球数(RBC) 、ヘモ
グロビン量(HGB)および白血球数(WBC)をコー
ルタ−カウンター(東亜医用電子社製)にて測定した。
小片(1〜2mm角)を移植後、12〜16日のちに背
中足静脈から部分採血して赤血球数(RBC) 、ヘモ
グロビン量(HGB)および白血球数(WBC)をコー
ルタ−カウンター(東亜医用電子社製)にて測定した。
(表I)腫瘍株 マウ
ス表工 木1)<0.05 **p<O,Of 表Iに示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。
ス表工 木1)<0.05 **p<O,Of 表Iに示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。
1と同様な方法で6週令の雄性BDF i系マウス(日
本チャールスリバー社製)に腫瘍を移植し8日目に腫瘍
片の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃え
て3群(各群7匹)に分けた。
本チャールスリバー社製)に腫瘍を移植し8日目に腫瘍
片の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃え
て3群(各群7匹)に分けた。
移植後9日目より各々の群に人尿由来ヒ)EPO(10
■/マウス/日)CHO細胞由来ヒトEPO(10u/
マウス/日)及び溶媒(0,1XBSA液を含むRPM
11640培地の透析液0.5ml/マウス7日)を隔
日に、7回皮下投与した。
■/マウス/日)CHO細胞由来ヒトEPO(10u/
マウス/日)及び溶媒(0,1XBSA液を含むRPM
11640培地の透析液0.5ml/マウス7日)を隔
日に、7回皮下投与した。
移植後16日目に塩化鉄(Fe量にして1mg/マウス
)を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
)を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
対照群として同系の非担癌マウス(7匹)を用いた。
赤血球数(RBC)およびヘモグロビン量(HGB)の
変化について、それぞれ図19図2に示す。
変化について、それぞれ図19図2に示す。
° マウスモデル1と同様な
方法で6週令の雄性C3H/HeN系マウス(日本チャ
ールスリバー社製)に腫瘍を移植し28日目に腫瘍の生
着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて3群
(各群7匹)に分けた。移植後28日目より各々の群に
人尿由来ヒ)EPO(10■/マウス)、CHO細胞由
来ヒ)EPO(10■/マウス7日)及び溶媒(0,1
%BSAを含むRPM11640培地の透析液、0.5
ml/マウス7日)を隔日に7回皮下投与した。移植後
36日目に第2塩化鉄(Fe量1mg/マウス)を担癌
マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
方法で6週令の雄性C3H/HeN系マウス(日本チャ
ールスリバー社製)に腫瘍を移植し28日目に腫瘍の生
着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて3群
(各群7匹)に分けた。移植後28日目より各々の群に
人尿由来ヒ)EPO(10■/マウス)、CHO細胞由
来ヒ)EPO(10■/マウス7日)及び溶媒(0,1
%BSAを含むRPM11640培地の透析液、0.5
ml/マウス7日)を隔日に7回皮下投与した。移植後
36日目に第2塩化鉄(Fe量1mg/マウス)を担癌
マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った。
対照群として同系の非担癌マウスを用いた。
赤血球数(RBC)およびヘモグロビン量(HGB)の
変化について、それぞれ図39図4に示す。
変化について、それぞれ図39図4に示す。
図1〜4に示される如く溶媒投与担癌マウス群では、担
癌後の日数の経過と共に貧血の度合いは強まったのに対
し、ヒトEPO投与担癌マウス群では明らかに貧血が改
善された。
癌後の日数の経過と共に貧血の度合いは強まったのに対
し、ヒトEPO投与担癌マウス群では明らかに貧血が改
善された。
またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかった。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。
明はこれ等に限定されるべきものではない。
実施例1
エリスロポエチン 1重量部ヒト
血清アルブミン 100重量部注射用蒸
留水にて全量 tooooo重量部上記組
成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注し、凍
結乾燥し密封した。
血清アルブミン 100重量部注射用蒸
留水にて全量 tooooo重量部上記組
成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注し、凍
結乾燥し密封した。
実施例2
実施例1におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン40を100重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。
ラン40を100重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。
実施例3
100ml中にマンニトール5g、エリスロポエチン1
mg+ ヒト血清アルブミン100mg、アセチルトリ
プトファンナトリウム2.154 mg。
mg+ ヒト血清アルブミン100mg、アセチルトリ
プトファンナトリウム2.154 mg。
カプリル酸ナトリウム1.33mgを含む水溶液を無菌
的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。
的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。
実施例4
pH7,0の0.05Mリン酸緩衝液100m1中にエ
リスロポエチン1mgポリエチレングリコール4000
. 500mgエチレンオキサイドプロピレンオキサイ
ド共重合体30mg塩化ナトリウム800mgを含む水
溶液を無菌的に調製し、1mlずつアンプルに分注し溶
閉する。
リスロポエチン1mgポリエチレングリコール4000
. 500mgエチレンオキサイドプロピレンオキサイ
ド共重合体30mg塩化ナトリウム800mgを含む水
溶液を無菌的に調製し、1mlずつアンプルに分注し溶
閉する。
実施例5
pH7,0の0.05Mリン酸緩衝液50m1中にエリ
スロポエチン0.5mg1グリIシフ 1 gtソルビ
トール1gを含む水溶液を無菌的に調製し、0、5ml
ずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に0
.1%メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、1m
lずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。
スロポエチン0.5mg1グリIシフ 1 gtソルビ
トール1gを含む水溶液を無菌的に調製し、0、5ml
ずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に0
.1%メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、1m
lずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。
実施例6
100m1中にエリスロポエチン1 m g + ヒト
血清アルブミン50 m g + マンニトール500
mgを含む水溶液を無菌的に調製し、1mlずつバイア
ルに分注し凍結乾燥し密封する。
血清アルブミン50 m g + マンニトール500
mgを含む水溶液を無菌的に調製し、1mlずつバイア
ルに分注し凍結乾燥し密封する。
別に300m1中にグルコン酸第二鉄3g、NaCl2
.7gを含む水溶液を無菌的に調製し、31ずつアンプ
ルに分注し、溶封する。
.7gを含む水溶液を無菌的に調製し、31ずつアンプ
ルに分注し、溶封する。
上記1バイアルを1アンプルに溶解し徐々に(2〜3分
で)静注する。
で)静注する。
図1はLewls肺癌担癌マウスの抹梢血赤血球数(R
BC)に及ぼすヒトEPO投与の影響を示す。 図2はLewls肺癌担癌マウスの抹梢血ヘモグロビン
量(HGB)に及ぼすヒ)EPO投与の影響を示す。 図3はC3MC2担癌マウスの抹梢血赤血球数(RBC
)に及ぼすヒ)EPO投与の影響を示す。 図4はC3MC2担癌マウスの抹梢血ヘモグロビン量(
HGB)に及ぼすヒ)EPO投与の影響を示す。 すべての図中に於いてo−〇は非担癌マウス群△−△は
溶媒投与担癌マウス群ムームは人尿由来ヒトEPO投与
担癌マウス群、ローロはCHO細胞由来ヒ)EPO投与
担癌マウス群を示す。 又図中に表示した*印は、溶媒投与損金マウス群に対す
る有意水準を示しており、*p<0.05**p<O,
Of ***p<0.001 を意味する。 才1図 瘤炒壌役め1」欽 第2図 屑6 F? ふl Xえ の 13 4え一才3
図 烏秒慈欠fr ’3漿 十4図 ぶ諭 婦 Ak−4し−の 1コ (しく、手続補
正書(自発) 昭和61年4月25日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿1、事件の表示 昭和61年特許願第22928号 2、発明の名称 悪性am性貧血治療剤 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都北区浮間5丁目5番1号 明細書全文 特許邪 置 (03)987−71目(大代表)明 細
書 1、発明の名称 悪性腫瘍性貧血治療剤 2、特許請求の範囲 (1) ヒトエリスロボエチンを有効成分として含有す
る悪性腫瘍性貧血治療剤。 (2) ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の悪性腫瘍
性貧血治療剤。 (3) ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポを宿主
細胞内で形質発現させて得たものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第1項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 (4) 宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細
胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲
第3項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 〔5) 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞で
あることを特徴とする特許請求の範囲第3項記載の悪性
腫瘍性貧血治療剤。 (6) 宿主細胞がCOS細胞であることを特徴とする
特許請求の範囲第3項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 3、発明の詳細な説明 本発明はヒトエリスロポエチン(以下「ヒトEPOJと
いう)を有効成分として含有する悪性腫瘍性貧血治療剤
に関する。 本願明細書においてヒトEPOとは、ヒト固有のアミノ
酸配列を有するポリペブタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの(以下「ヒト尿EPOJという)、ヒトEPOのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させることにより得られるもの(以下「ヒトrEPOJ
という)、ヒト胃癌細胞の組織培養物から得られるもの
、あるいはヒ)EPO産生能を有するヒト由来の細胞株
を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られる
もの等を含む。また単にエリスロポエチン(以下rEP
OJという)という場合、それはヒトに限らず、種々の
動物において骨すいに存在する赤芽球系幹細胞に働いて
、赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を示
す微量生理活性物質をいう。 ヒト尿EPOに関する研究は多数報告されているが、ヒ
トEPOの医薬としての有効性については未だ不明であ
る。 近年、担癌患者に於ける合併症として貧血症が高頻度で
認められており[例えば% M t l l e rA
等;ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲー
ション(J、C11n、Invest、)35巻124
8頁(19513年)を参照コ、特に重度の貧血は臨床
的に患者の治療上重要な問題となっている。 貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄ブロック、鉄放出障害、牌の関与、EPO産生障害ζ
溶血、造血幹細胞の異常などが考えられているが、悪性
腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、網内系鉄
ブロック、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管障害や自己
免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療による骨髄
抑制などの他、慢性炎症等が原因とされている。一方担
癌患者に於ける血中EPO値は正常値と同レベルか低値
であると報告されている[例えば、Zucker S
等;ジャーナル オブ クリニカルインベスティゲーシ
ョン(J、Cl1n、Invest、)53巻1132
頁(1974年)、Douglas SW等;ブラッ
ド(Blood)45巻55頁(1975年)、Fir
at D等;キャンサーリサーチ(Cancer
Res、)31巻1355頁(1971年) N Wa
r d HP等;ジャーナル オブ クリニカル
インベスティゲーシaン(J、Cl1n、Invest
、)50巻332頁(1971年)及びDeGowin
RL等;ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド
クリニカル メデイシン(J、Lab、C1in、Me
d、)94巻303頁(1979年)等を参照コ。 しかしながら、血中EPO値の低下の度合いと貧血の程
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性腫瘍性貧血はエ
リスロボエチン産生障害よりむしろEPOに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある[Zucker S 等;ジ
ャーナル オブ クリニカル インベスティゲーシコン
(J。 CI in、Invest、)53巻1132頁(19
74年)を参照]。 従って悪性腫瘍性貧血患者にヒ)EPOを投与しても悪
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。 ヒト尿EPOの作用効果に関してはこれまで多数報告さ
れているがヒト尿EPOをはじめとするヒトEPOが悪
性腫瘍性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は
動物に実際に投与することによって実証したものはない
。 本発明者等は高純度に精製したヒト尿EPOおよびヒト
EPOのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内
で形質発現させて得たヒ)rEPoを用いて担癌動物に
ついて貧血治療効果を調べたところ、これらのヒトEP
Oが顕著な貧血治療効果を示したことから悪性腫瘍性貧
血治療薬として有効であることを見い出し本発明を完成
した。 本発明は新規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係るもの
である。 すなわち本発明はヒトEPOを有効成分として含有する
悪性腫瘍性貧血治療剤である。 本発明に用いられるヒトEPOは種々の手段によって得
ることができ、例えば、ヒト尿EPOは正常人尿や再生
不良性貧血患者の尿又は血漿(血清を含む)から抽出す
ることにより得ることができる[T、MIYAKE等、
ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー(J、
B、C,)、252巻5558頁(1977年);J、
P、Lewin等、ジャーナル オブ ラボラトリ−ア
ンド クリニカル メディシン(J、Lab。 Cl i、n−Me d−) 、88巻987頁(19
65年) コ 。 またヒトrEPoは例えばヒトEPOのアミノ酸配列に
対応するメツセンジャーRNA (mRNA)を採取し
、そのmRNAを利用して組換DN八へを作成し、次い
で適当な宿主細胞(例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母
類、植物又は動物の細胞株等)で生産させるような、所
謂、遺伝子工学的方法によって得られる。[例えば、5
YLVIAL、H,等;プロシーディンゲス オブ ザ
ナショナル アカデミ−オブ ザ ニー ニスy−−(
Proc、Natl、Acad、Sci。 USA)81巻2708頁(1984年)を参照]。 前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(
CHO)細胞、マウスC−127細胞などを挙げること
ができる。この他、ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造
する方法〔特開昭54−557901 、ヒトEPO産
生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する
方法[特開昭57−40411] 、ヒト細胞株を細胞
融合して得られるハイブリドーマを培養して得る方法等
によっても製造することができる。 これらの方法によって得られたヒ)EPOは悪性腫瘍性
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。 上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトEPOは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息香
酸、エタノール、アセトン、タンニン酸等の打機溶媒に
よる沈殿法、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透
析法、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティー20マドグラフイー等の
各種クロマトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気
泳動等の電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単
独でまたは適宜組合せて用いてもよい。 得られたヒトEPOは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトEPO含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトEPOを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とかできる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は場合によりその他の貧
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンB12製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、デキストラン鉄、グルコン酸鉄、グルクロ
ン酸鉄、オロチン酸鉄等を挙げることができる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤に含まれるヒトEPOの
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常9 X 10’u/mgヒトE
POとして成人1人当たり0.1〜500μg好ましく
は5〜100μgのヒトEPOを含有する製剤を1週間
に1〜7回投与することができる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は安定化物質を含んでい
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、宵
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの1つ又は2
つ以上を含有してもよい。 これらの安定化物質の添加量は、ヒトEPOの1重量部
にたいして0.11〜10000重量部の割合で配合す
ることが好ましい。なお、2つ以上の安定化物質を混合
して使用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以
内であればよい。 これらの安定化物質は相応する量を適当な1度とpHの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は0
.1〜3.0の範囲とし、より好ましくは0.8〜1.
2である。水溶液のpHは5.0〜9.0に調整し、特
にpH8〜8に調整するのが好ましい。 また本発明の製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤
を添加してもよい。 参考例1 ヒト のパ1 MIYAKE、T、等の方法[ジャーナル・オブ バイ
オロジカル ケミストリー (J、B。 C,)52巻5558頁(1977年)コに従って再生
不良性貧血患者法から 1)Sephadex G5
0による脱塩 2 ) D E A E セルo −ス
によるバッチ吸着 3)エタノール沈殿 4)DEAE
アガロースカラムクロマトグラフィーを用いて部分精製
されたヒト尿EPOを得た。 ゛ フロ7 グラフ − 得られた部分精製ヒト尿EPOを24%プロパツール(
和光純薬社製)を含む0.1%トリフルオロ酢酸(Al
drichf社製)溶液に溶解せしめたのちHPLCに
よる精製を行った。HPLC装置は日立838−50型
を用い280nmと220nmの紫外部吸収により検出
を行った。 24%n−プロパツールを含んだ0.1%トリフルオロ
酢酸溶液で予め平衡化したMMC−C8カラム(6mm
X30cm山村化学社製)に上記で得られた試料を注入
し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後
、n−プロパツールの濃度を26%に高めて溶出させた
。EPOの活性画分を集めた後、Cent r i c
on−100(Amicon社商品名)社用品名限外ろ
適法により、0.1〜0.2mlに濃縮した。 。゛ ロマトグラフ − 上記濃縮試料を26%n−プロパツールを含む0.1%
TFA溶液で予め平衡化したTSK−G3000SWカ
ラム(7,8mmX60cm東洋曹達社製)に注入し、
前記平衡液で溶出させた。 分子量25000〜30000の位置にEPO活性を有
するピークが得られたので、この部分を集めて凍結乾燥
した。比活性は約9X10”u/mgであった。
−各ステップに於ける比活性
を表Iに示す。 表I *アッセイ法 1scove N、N等[ジャーナル
オブ セルラー フィジオ ロジ−(J、Ce l 1.phyS iol、)83巻309頁(19 74年)コの方法に従った。 参考例 2 ヒト の″浩12月
27日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換の
ための補助DNAを含むベクター」(特願昭59−28
1862)に開示された方法に従って、ヒトEPOのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を組込んだプラスミドを
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)で形質
発現させることによってヒトrヒトEPOを得た。要約
すると以下の如くである。 ヒト胎児肝細胞から得られたヒトEPOのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を組込んだラムダHEOPEL13
クローンからのDNAをEcoRlで消化させ、ヒトE
POのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなR
1フラグメントを取り出しプラスミドRKI−4のEc
oR1部位へ挿入した。このヒ)EPO遺伝子を組込ん
だプラスミドRKI−4をDHFR−欠損CHO細胞に
組入れて形質転換させた。CHO細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少なくとも1つ
のDHFR遺伝子を存する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆ(ことによってヒ)
rEPoを産生させた。 最終的な培養上清中のヒ)rEPoの活性は20u/m
lであった。 CHO細胞を無血清培養液で3日間培養した後、ヒト尿
EPOで用いた精製方法に準じてヒトrEPOを精製し
た。得られたヒトrEPOはKrystal等の方法[
ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカル
メディスン(J、 Lab、CI in、Med、)9
7巻144頁(1981年)コにより6600u/ml
の活性を有していた。またこのヒトrEPoはSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドで
あることが確認された。 得られたヒトrEPoに0.1%BSAを加え、生理食
塩水にて透析した後、実験に供した。 6週令の雄マウスの側腹部皮下に以下のマウス腫瘍様の
小片(1〜2mm角)を移植後、12〜16日のちに背
中足静脈から部分採血して赤血球数(RBC) 、ヘモ
グロビン量(HGB)および白血球数(WBC)をコー
ルタ−カウンター(東亜医用電子社製)にて測定しな。 (表■)腫瘍株 マウス 表■ 表■に示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。 、 ヒ ト に ゛ −1
と同様な方法で6迎合の雄性BDFI系マウス(日本チ
ャールスリバー社製)に腫瘍を移植し8日目に腫瘍の生
着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて3群
(各群7匹)に分けた。 移植後9日目より各々の群にヒト尿EPO(10u/マ
ウス/日)、CHO細胞由来ヒトrEP。 (10u/?ウス/日)および溶媒(0,1%BSA液
を含むRPMI 1640培地の透析液0゜5ml/
マウス7日)を隔日にて、7回皮下投与した。 移植後16日目に塩化第2鉄(Fe量にして1mg/マ
ウス)を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った
。 対照群をして同系の非担癌マウス(7匹)を用いた。 赤血球数(RBC)およびヘモグロビン量(HGB)の
変化について、それぞれ図1、図2に示す。 ° 搬移 1と同様な方法で6迎合の雄性C3H/HeN系マウス
(日本チャールスリバー社製)に腫瘍を移植し28日目
に腫瘍の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを
揃えて3群(各群7匹)に分けた。移植後29日目より
各々の群にヒト尿EPO(10u/?ウス)、CHO細
胞由来ヒトrEPO(10u/?ウス/日)および溶媒
(0゜1%BSA液を含とRPMI 1840培地の
透析液、0.5ml/マウス7日)を隔日にて7回皮下
投与した。移植後36日目に塩化第2鉄(Fe量、1
m g /マウス)を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄
補給を行った。 対照群として同系の非担癌マウスを用いた。 赤血球数(RBC)およびヘモグロビン量(HGB)の
変化について、それぞれ図3、図4に示す。 図1〜4にしめされる如く溶媒投与担癌マウス群では、
担癌後の日数の経過を共に貧血の度合いは強まったのに
対し、ヒトEPo投与担癌マウス群では明らかに貧血が
改善された。 またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかった。 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。 実施例1 上記組成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥し密封した。 実施・例2 実施例1におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン40を100重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。 実施例3 100ml中にマンニトール5g1ヒト尿EP01 m
g N ヒト血清アルブミン100mg、アセチルト
リプトファンナトリウム2.154mg。 カプリル酸ナトリウム1.33mgを含む水溶液を無菌
的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。 実施例4 pH7,0の0.05Mリン酸緩衝液100m1中にヒ
ト尿EP01mg1ポリエチレングリコロール4000
500mg1工チレンオキサイドプロビレオンオキサ
イド共重合体30 m g 1塩化ナトリウム800m
gを含む水溶液を無菌的に調整し、1mlずつアンプル
に分注溶閉する。 実施例5 pH7,0の0.05Mリン酸緩衝液50m1中にCH
O細胞由来ヒトrEPOo、5mg1グリシン1g1ソ
ルビトール1gを含む水溶液を無菌的に調整し、0.5
mlずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に
0.1%メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、1
mlずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。 実施例6 100m1中にヒト尿EP01mg1ヒト血清アルブミ
ン500mg1マンニトール500mgを含む水溶液を
無菌的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥
し密封する。 別に300m1中にグリコン酸第二鉄3g、Nac12
.7gを含む水溶液を無菌的に調整し、3mlずつアン
プルに分注し、溶封する。 上記1バイアルを1アンプルに溶解し徐々に(2〜3分
で)静注する。 4、図面の簡単な説明 図1はLewis肺癌担癌マウスの末梢血赤血球数(R
BC)に及ぼすヒ)EPO投与の影響を示す。 図2はLewis肺癌担癌マウスの末梢血ヘモグロビン
量(HGB)に及ぼすヒトEPO投与の影響を示す。 図3はC3MC2担癌マウスの末梢血赤血球数(RBC
)に及ぼすヒトEPO投与の影響を示す。 図4はC3MC2担癌マウスの末梢血ヘモグロビン量(
HGB)に友ぼすヒトEPO投与の影響を示す。 すべての図中に於いてO−Oは非担癌マウス群Δ−△は
溶媒投与担癌マウス群ムームはヒト尿EPO投与担癌マ
ウス群、ローロはCHO細胞由来ヒトrEPO投与担癌
マウス群を示す。
BC)に及ぼすヒトEPO投与の影響を示す。 図2はLewls肺癌担癌マウスの抹梢血ヘモグロビン
量(HGB)に及ぼすヒ)EPO投与の影響を示す。 図3はC3MC2担癌マウスの抹梢血赤血球数(RBC
)に及ぼすヒ)EPO投与の影響を示す。 図4はC3MC2担癌マウスの抹梢血ヘモグロビン量(
HGB)に及ぼすヒ)EPO投与の影響を示す。 すべての図中に於いてo−〇は非担癌マウス群△−△は
溶媒投与担癌マウス群ムームは人尿由来ヒトEPO投与
担癌マウス群、ローロはCHO細胞由来ヒ)EPO投与
担癌マウス群を示す。 又図中に表示した*印は、溶媒投与損金マウス群に対す
る有意水準を示しており、*p<0.05**p<O,
Of ***p<0.001 を意味する。 才1図 瘤炒壌役め1」欽 第2図 屑6 F? ふl Xえ の 13 4え一才3
図 烏秒慈欠fr ’3漿 十4図 ぶ諭 婦 Ak−4し−の 1コ (しく、手続補
正書(自発) 昭和61年4月25日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿1、事件の表示 昭和61年特許願第22928号 2、発明の名称 悪性am性貧血治療剤 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 東京都北区浮間5丁目5番1号 明細書全文 特許邪 置 (03)987−71目(大代表)明 細
書 1、発明の名称 悪性腫瘍性貧血治療剤 2、特許請求の範囲 (1) ヒトエリスロボエチンを有効成分として含有す
る悪性腫瘍性貧血治療剤。 (2) ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の悪性腫瘍
性貧血治療剤。 (3) ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポを宿主
細胞内で形質発現させて得たものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第1項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 (4) 宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細
胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲
第3項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 〔5) 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞で
あることを特徴とする特許請求の範囲第3項記載の悪性
腫瘍性貧血治療剤。 (6) 宿主細胞がCOS細胞であることを特徴とする
特許請求の範囲第3項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 3、発明の詳細な説明 本発明はヒトエリスロポエチン(以下「ヒトEPOJと
いう)を有効成分として含有する悪性腫瘍性貧血治療剤
に関する。 本願明細書においてヒトEPOとは、ヒト固有のアミノ
酸配列を有するポリペブタイドであって、適宜糖鎖を有
するかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来の
もの(以下「ヒト尿EPOJという)、ヒトEPOのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させることにより得られるもの(以下「ヒトrEPOJ
という)、ヒト胃癌細胞の組織培養物から得られるもの
、あるいはヒ)EPO産生能を有するヒト由来の細胞株
を細胞融合して得たハイブリドーマを培養して得られる
もの等を含む。また単にエリスロポエチン(以下rEP
OJという)という場合、それはヒトに限らず、種々の
動物において骨すいに存在する赤芽球系幹細胞に働いて
、赤血球系細胞への分化成熟、増殖を促進する作用を示
す微量生理活性物質をいう。 ヒト尿EPOに関する研究は多数報告されているが、ヒ
トEPOの医薬としての有効性については未だ不明であ
る。 近年、担癌患者に於ける合併症として貧血症が高頻度で
認められており[例えば% M t l l e rA
等;ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲー
ション(J、C11n、Invest、)35巻124
8頁(19513年)を参照コ、特に重度の貧血は臨床
的に患者の治療上重要な問題となっている。 貧血の機序としては、鉄代謝異常による網内系に於ける
鉄ブロック、鉄放出障害、牌の関与、EPO産生障害ζ
溶血、造血幹細胞の異常などが考えられているが、悪性
腫瘍性貧血の場合腫瘍の異常増殖に伴う出血、網内系鉄
ブロック、腫瘍細胞の骨髄への浸潤、細血管障害や自己
免疫疾患による溶血、抗腫瘍剤や放射線治療による骨髄
抑制などの他、慢性炎症等が原因とされている。一方担
癌患者に於ける血中EPO値は正常値と同レベルか低値
であると報告されている[例えば、Zucker S
等;ジャーナル オブ クリニカルインベスティゲーシ
ョン(J、Cl1n、Invest、)53巻1132
頁(1974年)、Douglas SW等;ブラッ
ド(Blood)45巻55頁(1975年)、Fir
at D等;キャンサーリサーチ(Cancer
Res、)31巻1355頁(1971年) N Wa
r d HP等;ジャーナル オブ クリニカル
インベスティゲーシaン(J、Cl1n、Invest
、)50巻332頁(1971年)及びDeGowin
RL等;ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド
クリニカル メデイシン(J、Lab、C1in、Me
d、)94巻303頁(1979年)等を参照コ。 しかしながら、血中EPO値の低下の度合いと貧血の程
度との間に相関性がない事や一般に担癌患者は骨髄機能
の低下を伴うことが多いことから、悪性腫瘍性貧血はエ
リスロボエチン産生障害よりむしろEPOに対する応答
性の障害に起因する骨髄での赤血球造血能の低下が原因
であるとの考えもある[Zucker S 等;ジ
ャーナル オブ クリニカル インベスティゲーシコン
(J。 CI in、Invest、)53巻1132頁(19
74年)を参照]。 従って悪性腫瘍性貧血患者にヒ)EPOを投与しても悪
性腫瘍性貧血の治療に有効となるか否かは悪性腫瘍性貧
血の発現機序からは疑わしい限りであった。 ヒト尿EPOの作用効果に関してはこれまで多数報告さ
れているがヒト尿EPOをはじめとするヒトEPOが悪
性腫瘍性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は
動物に実際に投与することによって実証したものはない
。 本発明者等は高純度に精製したヒト尿EPOおよびヒト
EPOのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内
で形質発現させて得たヒ)rEPoを用いて担癌動物に
ついて貧血治療効果を調べたところ、これらのヒトEP
Oが顕著な貧血治療効果を示したことから悪性腫瘍性貧
血治療薬として有効であることを見い出し本発明を完成
した。 本発明は新規な悪性腫瘍性貧血治療剤の提供に係るもの
である。 すなわち本発明はヒトEPOを有効成分として含有する
悪性腫瘍性貧血治療剤である。 本発明に用いられるヒトEPOは種々の手段によって得
ることができ、例えば、ヒト尿EPOは正常人尿や再生
不良性貧血患者の尿又は血漿(血清を含む)から抽出す
ることにより得ることができる[T、MIYAKE等、
ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー(J、
B、C,)、252巻5558頁(1977年);J、
P、Lewin等、ジャーナル オブ ラボラトリ−ア
ンド クリニカル メディシン(J、Lab。 Cl i、n−Me d−) 、88巻987頁(19
65年) コ 。 またヒトrEPoは例えばヒトEPOのアミノ酸配列に
対応するメツセンジャーRNA (mRNA)を採取し
、そのmRNAを利用して組換DN八へを作成し、次い
で適当な宿主細胞(例えば、大腸菌の如き細菌類、酵母
類、植物又は動物の細胞株等)で生産させるような、所
謂、遺伝子工学的方法によって得られる。[例えば、5
YLVIAL、H,等;プロシーディンゲス オブ ザ
ナショナル アカデミ−オブ ザ ニー ニスy−−(
Proc、Natl、Acad、Sci。 USA)81巻2708頁(1984年)を参照]。 前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は噴孔動物由来の培養細胞株であり
、例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(
CHO)細胞、マウスC−127細胞などを挙げること
ができる。この他、ヒト胃癌細胞の組織培養物から製造
する方法〔特開昭54−557901 、ヒトEPO産
生能を有するヒト由来のリンパ芽球様細胞から製造する
方法[特開昭57−40411] 、ヒト細胞株を細胞
融合して得られるハイブリドーマを培養して得る方法等
によっても製造することができる。 これらの方法によって得られたヒ)EPOは悪性腫瘍性
貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機能を有
する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発明に使
用され得る。 上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトEPOは、所望により通常の単離・精製法によっ
てさらに濃縮・精製することができる。例えば、安息香
酸、エタノール、アセトン、タンニン酸等の打機溶媒に
よる沈殿法、硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透
析法、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティー20マドグラフイー等の
各種クロマトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気
泳動等の電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単
独でまたは適宜組合せて用いてもよい。 得られたヒトEPOは凍結保存とするかまたは凍結乾燥
、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存すること
ができる。さらにはヒトEPO含有水溶液に水溶性塩類
もしくは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ
、得られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。ま
た所望により、ヒトEPOを適当な緩衝液に溶解した後
、ミリポアフィルタ−等で無菌ろ過して注射剤とするこ
とかできる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は場合によりその他の貧
血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンB12製剤、男性ホル
モン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混合する
ことができ、前記鉄剤の例としては乾燥硫酸第一鉄、フ
マール酸鉄、デキストラン鉄、グルコン酸鉄、グルクロ
ン酸鉄、オロチン酸鉄等を挙げることができる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤に含まれるヒトEPOの
投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決
めることができるが通常9 X 10’u/mgヒトE
POとして成人1人当たり0.1〜500μg好ましく
は5〜100μgのヒトEPOを含有する製剤を1週間
に1〜7回投与することができる。 本発明の悪性腫瘍性貧血治療剤は安定化物質を含んでい
てもよく、該安定化物質として、例えば、ポリエチレン
グリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機塩、宵
機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの1つ又は2
つ以上を含有してもよい。 これらの安定化物質の添加量は、ヒトEPOの1重量部
にたいして0.11〜10000重量部の割合で配合す
ることが好ましい。なお、2つ以上の安定化物質を混合
して使用する場合においてもそれらの総量が上記範囲以
内であればよい。 これらの安定化物質は相応する量を適当な1度とpHの
水溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は0
.1〜3.0の範囲とし、より好ましくは0.8〜1.
2である。水溶液のpHは5.0〜9.0に調整し、特
にpH8〜8に調整するのが好ましい。 また本発明の製剤を調整するにあたっては、吸着防止剤
を添加してもよい。 参考例1 ヒト のパ1 MIYAKE、T、等の方法[ジャーナル・オブ バイ
オロジカル ケミストリー (J、B。 C,)52巻5558頁(1977年)コに従って再生
不良性貧血患者法から 1)Sephadex G5
0による脱塩 2 ) D E A E セルo −ス
によるバッチ吸着 3)エタノール沈殿 4)DEAE
アガロースカラムクロマトグラフィーを用いて部分精製
されたヒト尿EPOを得た。 ゛ フロ7 グラフ − 得られた部分精製ヒト尿EPOを24%プロパツール(
和光純薬社製)を含む0.1%トリフルオロ酢酸(Al
drichf社製)溶液に溶解せしめたのちHPLCに
よる精製を行った。HPLC装置は日立838−50型
を用い280nmと220nmの紫外部吸収により検出
を行った。 24%n−プロパツールを含んだ0.1%トリフルオロ
酢酸溶液で予め平衡化したMMC−C8カラム(6mm
X30cm山村化学社製)に上記で得られた試料を注入
し、前記平衡化溶液で溶出させた。未吸着画分が溶出後
、n−プロパツールの濃度を26%に高めて溶出させた
。EPOの活性画分を集めた後、Cent r i c
on−100(Amicon社商品名)社用品名限外ろ
適法により、0.1〜0.2mlに濃縮した。 。゛ ロマトグラフ − 上記濃縮試料を26%n−プロパツールを含む0.1%
TFA溶液で予め平衡化したTSK−G3000SWカ
ラム(7,8mmX60cm東洋曹達社製)に注入し、
前記平衡液で溶出させた。 分子量25000〜30000の位置にEPO活性を有
するピークが得られたので、この部分を集めて凍結乾燥
した。比活性は約9X10”u/mgであった。
−各ステップに於ける比活性
を表Iに示す。 表I *アッセイ法 1scove N、N等[ジャーナル
オブ セルラー フィジオ ロジ−(J、Ce l 1.phyS iol、)83巻309頁(19 74年)コの方法に従った。 参考例 2 ヒト の″浩12月
27日に出願された発明の名称「真核細胞の形質転換の
ための補助DNAを含むベクター」(特願昭59−28
1862)に開示された方法に従って、ヒトEPOのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を組込んだプラスミドを
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)で形質
発現させることによってヒトrヒトEPOを得た。要約
すると以下の如くである。 ヒト胎児肝細胞から得られたヒトEPOのアミノ酸配列
をコードする遺伝子を組込んだラムダHEOPEL13
クローンからのDNAをEcoRlで消化させ、ヒトE
POのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む小さなR
1フラグメントを取り出しプラスミドRKI−4のEc
oR1部位へ挿入した。このヒ)EPO遺伝子を組込ん
だプラスミドRKI−4をDHFR−欠損CHO細胞に
組入れて形質転換させた。CHO細胞を核酸を欠如した
アルファ媒地中で培養することによって少なくとも1つ
のDHFR遺伝子を存する細胞を選択した後、段階的に
メトトレキサートの濃度を高めてゆ(ことによってヒ)
rEPoを産生させた。 最終的な培養上清中のヒ)rEPoの活性は20u/m
lであった。 CHO細胞を無血清培養液で3日間培養した後、ヒト尿
EPOで用いた精製方法に準じてヒトrEPOを精製し
た。得られたヒトrEPOはKrystal等の方法[
ジャーナル オブ ラボラトリ−アンド クリニカル
メディスン(J、 Lab、CI in、Med、)9
7巻144頁(1981年)コにより6600u/ml
の活性を有していた。またこのヒトrEPoはSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドで
あることが確認された。 得られたヒトrEPoに0.1%BSAを加え、生理食
塩水にて透析した後、実験に供した。 6週令の雄マウスの側腹部皮下に以下のマウス腫瘍様の
小片(1〜2mm角)を移植後、12〜16日のちに背
中足静脈から部分採血して赤血球数(RBC) 、ヘモ
グロビン量(HGB)および白血球数(WBC)をコー
ルタ−カウンター(東亜医用電子社製)にて測定しな。 (表■)腫瘍株 マウス 表■ 表■に示したように担癌マウスは全て貧血状態にあるこ
とが確認された。 、 ヒ ト に ゛ −1
と同様な方法で6迎合の雄性BDFI系マウス(日本チ
ャールスリバー社製)に腫瘍を移植し8日目に腫瘍の生
着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを揃えて3群
(各群7匹)に分けた。 移植後9日目より各々の群にヒト尿EPO(10u/マ
ウス/日)、CHO細胞由来ヒトrEP。 (10u/?ウス/日)および溶媒(0,1%BSA液
を含むRPMI 1640培地の透析液0゜5ml/
マウス7日)を隔日にて、7回皮下投与した。 移植後16日目に塩化第2鉄(Fe量にして1mg/マ
ウス)を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄補給を行った
。 対照群をして同系の非担癌マウス(7匹)を用いた。 赤血球数(RBC)およびヘモグロビン量(HGB)の
変化について、それぞれ図1、図2に示す。 ° 搬移 1と同様な方法で6迎合の雄性C3H/HeN系マウス
(日本チャールスリバー社製)に腫瘍を移植し28日目
に腫瘍の生着が確認された担癌マウスを腫瘍の大きさを
揃えて3群(各群7匹)に分けた。移植後29日目より
各々の群にヒト尿EPO(10u/?ウス)、CHO細
胞由来ヒトrEPO(10u/?ウス/日)および溶媒
(0゜1%BSA液を含とRPMI 1840培地の
透析液、0.5ml/マウス7日)を隔日にて7回皮下
投与した。移植後36日目に塩化第2鉄(Fe量、1
m g /マウス)を担癌マウス群に腹腔内投与し、鉄
補給を行った。 対照群として同系の非担癌マウスを用いた。 赤血球数(RBC)およびヘモグロビン量(HGB)の
変化について、それぞれ図3、図4に示す。 図1〜4にしめされる如く溶媒投与担癌マウス群では、
担癌後の日数の経過を共に貧血の度合いは強まったのに
対し、ヒトEPo投与担癌マウス群では明らかに貧血が
改善された。 またこの実験条件下に於いて毒性は認められなかった。 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。 実施例1 上記組成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥し密封した。 実施・例2 実施例1におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン40を100重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を
作製した。 実施例3 100ml中にマンニトール5g1ヒト尿EP01 m
g N ヒト血清アルブミン100mg、アセチルト
リプトファンナトリウム2.154mg。 カプリル酸ナトリウム1.33mgを含む水溶液を無菌
的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥し密
封する。 実施例4 pH7,0の0.05Mリン酸緩衝液100m1中にヒ
ト尿EP01mg1ポリエチレングリコロール4000
500mg1工チレンオキサイドプロビレオンオキサ
イド共重合体30 m g 1塩化ナトリウム800m
gを含む水溶液を無菌的に調整し、1mlずつアンプル
に分注溶閉する。 実施例5 pH7,0の0.05Mリン酸緩衝液50m1中にCH
O細胞由来ヒトrEPOo、5mg1グリシン1g1ソ
ルビトール1gを含む水溶液を無菌的に調整し、0.5
mlずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に
0.1%メチルセルロース水溶液を無菌的に調整し、1
mlずつアンプルに分注し、溶解用溶液とする。 実施例6 100m1中にヒト尿EP01mg1ヒト血清アルブミ
ン500mg1マンニトール500mgを含む水溶液を
無菌的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥
し密封する。 別に300m1中にグリコン酸第二鉄3g、Nac12
.7gを含む水溶液を無菌的に調整し、3mlずつアン
プルに分注し、溶封する。 上記1バイアルを1アンプルに溶解し徐々に(2〜3分
で)静注する。 4、図面の簡単な説明 図1はLewis肺癌担癌マウスの末梢血赤血球数(R
BC)に及ぼすヒ)EPO投与の影響を示す。 図2はLewis肺癌担癌マウスの末梢血ヘモグロビン
量(HGB)に及ぼすヒトEPO投与の影響を示す。 図3はC3MC2担癌マウスの末梢血赤血球数(RBC
)に及ぼすヒトEPO投与の影響を示す。 図4はC3MC2担癌マウスの末梢血ヘモグロビン量(
HGB)に友ぼすヒトEPO投与の影響を示す。 すべての図中に於いてO−Oは非担癌マウス群Δ−△は
溶媒投与担癌マウス群ムームはヒト尿EPO投与担癌マ
ウス群、ローロはCHO細胞由来ヒトrEPO投与担癌
マウス群を示す。
Claims (6)
- (1)ヒトエリスロポエチンを有効成分として含有する
悪性腫瘍性貧血治療剤。 - (2)ヒトエリスロポエチンが人尿由来のものであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の悪性腫瘍性
貧血治療剤。 - (3)ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポエチンを
コードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現させて得たも
のであることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の
悪性腫瘍性貧血治療剤。 - (4)宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物の細胞
株のいずれかであることを特徴とする特許請求の範囲第
3項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。 - (5)宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第3項記載の悪性腫
瘍性貧血治療剤。 - (6)宿主細胞がCOS細胞であることを特徴とする特
許請求の範囲第3項記載の悪性腫瘍性貧血治療剤。
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