JPS61501307A

JPS61501307A - 高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法

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Publication number: JPS61501307A
Application number: JP60501145A
Authority: JP
Inventors: ゴールドバーグ，アルフレツド　エル; ゴフ，ステイーブン　エイ; カツソン，ローレンス　ピー
Original assignee: プレジデント　アンド　フエロ−ズ　オブ　ハ−バ−ド　カレツジ
Priority date: 1984-03-06
Filing date: 1985-03-06
Publication date: 1986-07-03
Anticipated expiration: 2010-08-16
Also published as: AU4067985A; EP0174367A1; DE3586189T2; JPH0775550B2; EP0174367B1; ATE77104T1; DE3586189D1; JPH06261746A; AU594015B2; WO1985003949A1; US4758512A; EP0174367A4; JPH0771483B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法発明の技術的分野本発明は、組換え産物を高収量で産生ずるだめの改良宿主生物と方法に関する。

より詳細には、本発明は、細胞質プロテアーゼの発現が減少したために細胞の外来性タンパクの分解能が減少するという特異的な変異をＤＮＡ配列内にもつ宿主菌株、並びに遺伝子操作技術によって外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物を高収量で産生ずるためにこれらの＠株を宿主細胞として使用することに関する。本発明に開示された方法は、外来性組換えタンパク、ポリペプチド及び他の産物を、通常そのような産物を産生しない宿主で高収量に産生させるという利点がある。

技術的背景組換えＤＮＡ技、術の発達により、外来性産物をコードする外来性ＤＮＡ配列で形質転換した宿主においてそれらの産物の産生が可能になった。一般的に、所望のアミノ酸、ポリペプチドもしくはタンパク産物をコードするＤＮＡは、発現ビークル内に組換えＤＮＡ分子を形成するように適当な部位に導入される。次いで、その組換え分子は、適合宿主を形質転換するために用いられ、宿主は挿入Ｄ　Ｎ　Ａ配列を発現しかつそのＤＮＡ配列によってコードされる産物を産生ずるために培養される。そのような組換え技術は、細菌宿主中でＮ核及びウィルスタンパクを生産するために用いられている。これらには、たとえば白血球インターフェロン（Ｓ、ナガタ等、「ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチドの大１Ｉｊ１面（Ｅ、ｃｏｌｉ）内における合成」、２イチャー、第２８４巻、第３１６−２０頁（１９８０））、ヒトＢ型肝炎ウィルスのＦｕｆｆ　（Ｃ，Ｊ、バレル等、ｒプラスミドｐＢＲ３２２にクローン化されたＢ型肝炎ウィルスＤＮＡ配列の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１）内における発現」、ネイチャー、第２７９巻、第４３−４７頁（１９７９）；Ｍ、パセフク等。

「Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子と大腸菌内におけるそれらの発現」。

ネイチャー、第２８２巻、第５７５−７９　（１９７９））、ＳＶ４０を抗原ＣＴ、Ｍ、ロハーツ等、「犬猫菌内におけるシミアン　ウィルス４０を抗原の合成」、ブロンーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス［ＪＳＡ、第７６巻、第５５９６−６００頁（１９７９））、及びＦＭＤウィルス抗原（Ｈ，クツパー等、「口啼疫ウィルスの主要抗原のｃＤＮＡのクローニングと、大腸菌内における発現」、ぶイチャー、第２８９巻、第５５５−５９頁（１９８１））などが含まれる。

組換えＤ　Ｎ　Ａ　皮術による外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の大規模な工業的生産は、産生宿主による組換え産物の細胞内分解のために制約されていた。所定の宿主細胞中では、外来性もしくは他の異常タンパクは、急速にペプチドやアミノ酸に分解される。さらに、高温（たとえば４０°Ｃ以上）では、これろの異常タンパクと同様に正常タンパクの分解がより速くなることが見い出されている（Ｓ、リン及び１、ザビン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４７巻、第２２０５−１１頁（１９７２）；Ａ。

セント、ジョン等、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５３巻、第３９４５−５．１頁（１９７８）〕。

これは、そのような高温では正常と外来性との両タンパクは構造的な安定性が減少する傾向にありかつ変性してしまう（すなわち異常になる）結果、細胞内プロテアーゼの攻撃をうけやすくなるためである。

この異常タンパクの分解は代謝エネルギーを必要とするＣＪ、Ｄ、コライツト及びＡ、Ｌ、ゴールドバーブ、「大腸菌における特異的異常タンパクの分解の中間段階」、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５２巻。

第８３５０−５７頁（１９７７）；に、オルデン及びＡ、Ｌ。

ゴールドバーブ、「大腸菌における細胞内タンパク分解のための工皐ルギー要求の研究」、バイオケミ−・エト・バイオフィジイーク・アクタ、第５４２巻、第３８５−９８頁（１９７８））、ＡＴＰ依存性プロテアーゼであるプロテアーゼＬａは、細胞内タンパク分解の初期律速段階を触媒する（Ｃ，Ｈ，チャン及びＡ、Ｌ、ゴールドバーグ、ｒＡＴＰ依存性プロテアーゼであるプロテアーゼＬａにおける大腸菌のｔｏｎ　（ｃａｐＲ）遺伝子の産生物」、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ。

第７８巻、第４９３１−３５頁（１９８１）；Ｆ、Ｓ、　ラ’Ｊモア等、「大ｌ１ｊＩ菌のＡＴＰ依存性タンパク分解酵素であるプロテアーゼＬａの研究」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第４１８７−９５頁　゛（１９８２）；Ｌ、ワックスマン及びＡ、　Ｌ、ゴールドバーブ、「大腸菌からのプロテアーゼＬａはＡＴＰとタンパクとをある結合形式で加水分解する」、プロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ。

第７９％、第４８８３−８７頁（１９８２））。プロテアーゼＬａはＩｏｎ遺伝子によってコードされ、またｃａｐＲやｄｅｇ遺伝子とも呼ばれている〔チャン及びゴールドバーブ。

前出〕。ｆａｎ遺伝子の変異は欠陥があるが、部分的に活性のあるプロテアーゼを産生し、〔チャン及びゴールドバーブ。

前出；Ｃ，Ｈ，チャン等５　「大腸菌におけるＩｏｎ変異（ａｐＲ９によってコードされるタンパクの研究：野生型プロテアーゼを阻害するＡＴＰ依存性プロテアーゼＬａの不安定型」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー。

第２５８巻、第２１５−２１頁（１９８３））かつ異常タンパクの分解能の減少を示す（Ｓ、ゴフテスマン及びり、ジブサー、「大腸菌二ムユ変異のｄｅｇ表現型」、ジャーナル・オプ・バクテリオロジー、第１３３巻、第８４４−５１頁（１９７８）ｉコライツト及びゴールドバーブ、前出〕。

Ｌ土！変異は異常タンパクの分解能の減少を示すが、まだ幾分かの分解活性を保っている（約正常活性の１７３〜１／２）。

加えて、組換えＤＮＡ技術の宿主としてそれらを用いることは、Ｉｏｎ変異株のいくつかの好ましくない表現形質のため、生存能力の点で原罪がある。これらの菌は紫外線照射に対し大きな感受性を示し、さらに細胞被膜ムコ多ｔＳ類の過剰生産のためムコイド状になる。土二二遺伝子の機能を完全に持たない変異株は、従来得られていない。

外来性組換え産物の有用量の工業的に可能な生産における組換えＤＮＡ技術の可能性は、現在まで外来性タンパクの分解能が減少した特性を有する生存能力のある宿主がなかったので制約されている。

発明の開示本発明は、外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物をそれらをコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物内にて生産するための改良宿主生物と方法を提供することによって、前述の問題を解決する。より詳細には、本発明は、細胞内プロテアーゼの発現が減少したために細胞の外来性産物の分解能が減少するような特異的変異をＤＮＡ配列内にもつ宿主細胞菌株、並びにこれらの菌株を用いて遺伝子操作技術により作成された外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の収量を増大させることに関する。

本発明によって、外来性産物の分解能が減少した特性をもつ宿主細胞内で所望の外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物を高収量にて生産することが可能である。

以下の開示からも認められるように、本発明の宿主菌株及び方法は、外来性組換え産物の大規模生産を高収量でおこなうことを可能にする。

図面の簡単な説明第１図は、ｈｔｐＲ変異株から単離したプロテアーゼＬａの３０℃と４２℃とにおけるレベルを示す表である。

第２図は、ビューロマイシンを取り込んだ種々の不完全大腸菌ポリペプチドについての時間に対する分解パーセンテージの比較グラフである。

第３図は、アルギニンの代りにカナバニンを含む種々の大腸菌異常タンパクについての時間に対する分解パーセンテージの比較グラフである。

本発明の実施における最良方法ここに開示する発明を十分に理解するため、以下詳細に説明する。

この説明において以下の用語を用いる：ヌクレオチド：ｔｌｉ部（ペントース）、リン酸及びｉｉ？ｊｊ素環式塩基よりなるＤＮＡあるいはＲＮＡの単量体単位、塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介し糖と結合し、糖と塩基との結合体はヌクレオシドとよばれる。塩基はヌクレオチドを特性化する。４つのＤＮＡ塩基はアデニン（ｒＡＪ）、グアニンｒ　ｒＧＪ　）、シトシン（ｒｃＪ）及びチミン（ｒＴＪ）である、４つのＲＮＡ塩基はＡ、　Ｇ、Ｃ。

及びウラシル（ｒＵＪ）である。

がホスホジエステル結合で互いに連結した直鎖状デオキシヌクレオチド。

コドン：鋳型もしくはｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳開始シグナルもしくは翻訳停止シグナルをコードする３つのヌクレオチド（トリブレット）のＤＮＡ配列、たとえば、ヌクレオチド・トリブレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ。

ＣＴＡ及びＣＴＧはアミノ酸ロイシン（ｒＬｅｕＪ）をコードし、ＴＡＧ、ＴＡＡ及びＴＧＡは翻訳停止シグナルであり、かつＡＴＧは翻訳開始シグナルである。

ポリペプチド：隣接アミノ酸のαアミノ基とカルボキシ基の間がペプチド結合で互いに連結されたアミノ酸の線状列。

ｍＲＮＡからの特異的ポリペプチドに特性的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。

転写：遺伝子もしくはＤＮＡ配列からｍ　ＲＮ　Ａを産生ずる過程。

全「レプリコン」を含んだ非染色体２本鎖ＤＮＡ配列、プラスミドをＲ細胞生物内に存在させると、その生物の特性はプラスミドＤＮＡによって変化するか、または形質転換される。

たとえば、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ）の遺伝子をもつプラスミドは従前にテトラサイクリン感受性であった細胞を形質転換させて耐性にする。プラスミドで形質転換された細胞は形質転換株と呼ばれる。

ファージもしくはバクテリオファージ：バクテリアのウィルスであり、その大部分はタンパク膜あるいは外殻（カプシド）でカプシド化されたＤＮＡ配列より成る。

クローニング・ビークルもしくはベクター：宿主細胞内で複製可能であるプラスミド、ファージＤＮＡもしくは他のＤＮＡ配列であり、１つあるいは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴化され、その部位でＤＮＡ配列は不可欠な生物的機能、たとえば複製、コートタンパクの生産、プロモーターや結合部位などの損失を伴なわずに決定しうる方式で切断できる。また、それらは形質転換細胞の同定に適当なマーカー、たとえばテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性を含んでいる。

列に由来するような生物もしくはＤＮＡ配列を大量に得るための過程。

組換えＤＮＡもしくはバイブリドＤＮＡ　：異なったゲノム（細胞もしくはウィルスの全ＤＮＡ）からのＤＮＡの部分を含み、生細胞体外で末端と末端を結合しがっ生細胞中で維持できるようにした分子。

ときにその遺伝子もしくはＤＮＡ配列の発現を制御・調節するヌクレオチド配列。「作用結合」という用語は、所望産物をコードする遺伝子もしくはＤＮＡ配列の前に適当な開始シグナルをもつこと、並びに発現制御配列の制御下に挿入ＤＮＡ配列を発現させてその遺伝子もしくはＤＮＡによってコードされる所望産物を産生させうる正しい解読フレームを維持することを含んでいる。

本出願人は、細胞が高温度下もしくは多量の外来性ポリペプチドの存在下でタンパク分解酵素の含有量を増やすことを見出した０本発明は、高温度下もしくは多量の外来性ポリペプチドの存在下で特に外来性産物の分解能が減少するという特異的な変異をＤＮＡ配列内にもつ宿主細胞菌株に関する。

この重要な特性は、細胞質プロテアーゼの発現が減少したためと思われる。従って、これらの宿主細胞の利用により、遺伝子操作技術により作成された外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の収量を増大しうる。

本発明の好ましい一興体例においては、プロテアーゼ遺伝子の発現の特異的変異もしくは欠損が、その遺伝子産物の産れる調節遺伝子である。高温もしくは他の不利な条件等によって「と−ト・ショック」がかかり、高温でのある細胞タンパクの変性によって異常タンパクが出現したとき、細胞は「ヒート・ショック・タンパク」と呼ばれる多数のポリペプチドの合成を増加させることによって応答するＣＦ、Ｃ，＊イドハート等、「大ｕＪ凹の高温レギユロンを調節する遺伝子のモレキュラー・クローニングと発現」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー」、第１５３Ｓ、第５９７−６０３頁（１９８３）；”ｒ、ヤマモリ等、「ヒート・ショック・オペロンの翻訳と高温における細胞生育との大腸菌遺伝子（ｈ　ｉ　ｎ）調節にＦ、Ｃ，ネイドハート、「大腸菌の高温レギユロン」。

「ヒート・ショック・フロム・バクテリア・ツー・マン」。

Ｍ、Ｊ、アッシュバーナー等線、コールド　スプリング　ハ四９８２））。ヒート・ソヨフク応答のシグナルは、細胞におけるこれらの変性タンパクの出現であることを突き止めた。また、異質タンパクもしくはポリペプチドのクローニング及び発現化の結果として生した！ｌｌ胞内の外来性ポリペプチドもしくは他の産物の蓄積は、そのヒート・ノヨフク応答を引きおこすことも突き止めた。最終的に、ヒート・ショック・タンパクの少なくとも１種が異常もしくは外来性タンパクのタンパク分解において決定的な役割を果すことを確認した（Ｓ、ボッ等、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、第８１巻、第６６４７−５１頁（１９８４）；Ｔ、Ａ、ベイカー等、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻、第６６７９−８３頁（１９８４））。

本出願人は、これらのヒート・ショック・タンパクの１種が、細胞内で異常タンパクの選択的分解の律速段階を遂行するＡ　Ｔ、Ｐ依存性プロテアーゼとしてのプロテアーゼＬａであることを突き止めた〔Ｓ、ボッ等、前出、Ｔ、Ａ、フィリップス等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１５９巻。

＠２８３−８７頁（１９８４））、また、プロテアーゼＬａは、他のヒート・ショック・タンパクと同様、低温でも細胞内で外来性タンパクの蓄積に応答して誘導されることも見い出した６外来性ＤＮＡ配列で形質転換した宿主細胞内にクローン化された外来性Ｄ　Ｎ　Ａ配列の発現の際に生ずる外来性タンパクの大量の産生は、ヒート・ショックによっても誘導されるいくつかのタンパクの低温（たとえば３０℃）での産生を誘導することも実験的に実証された。たとえば、組識プラスミノーゲン活性因子（Ｔ　Ｐ　Ａ）をコードする１）ＮＡＡ配列１、捗昭６１＝ＳＯ１３０７（４）形質ｔ＝換した宿主内におけるその発現は、３０゛Ｃのような低温でさえプロテアーゼＬａをコードする上！！遺伝子の発現を増加させる。このように、ヒート・ショック・タンパクの誘導は、高温および低温の両方での外来性もしくは他の異常タンパクの蓄積から′４＠胞を防御するという一般化された機構を示す。

蓄積した異常タンパクに応じておこるこのタンパク分解酵素の誘導は、高収量で遺伝子操作技術によって作成された外来性タンパクの生産に対する特殊な問題である。宿主生物内での所望の外来性タンパクの生産に際し、プロテアーゼＬａ及び他のプロテアーゼは、高割合で細胞によって合成されかつ細胞の所望タンパクの分解能を増加させることを見出した。

その結果、遺伝子操作技術を用いて作成されたタンパクの高収量生産に対する障害を克服するための手段を検索した。ヒート・ショック・タンパクの誘導は、ｈｉｎ変異株とも呼ばれるｈｔｐＲ変異株中ではおこらないことを突き止めた。そのような変異株は当業者により突然変異誘発技術を用いて得られる。

細胞質タンパク分解に対するｈｔｐＲ変異の影響の研究により、坦ｔｐＲ遺伝子はプロテアーゼＬａをコードするＪａｎ遺伝子の転写を調節することが示された。ｈｔｐＲ変異株では、Ｉｏユ遺伝子の転写が減少する結果、プロテアーゼＬａの産生が城少し、次いで異常もしくは外来性タンパクを分解するという変異株の能力の減少をもたらす。この異常タンパクの分解能の減少は、高温及び低温の両条件下（たとえば各々４２℃と３０℃）で明らかである。このように、変異株から単離されたプロテアーゼＬａのレベルは３０℃で野生株よりも低（，４２℃に移しても増加しない（第１図）、第１図の表は、１工上Ｒ変異株から単離したプロテアーゼＬａのレベルを３０℃と４２℃について示している。この表に示されたデータは、３０℃で生育させかつ４２℃に１時間移した大腸菌培養物を用いて得た。プロテアーゼＬａ活性は、Ｌ、ワックスマン及びＡ、Ｌ、ゴールドバーブによってジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（１９８５）（印版中〕に記述されたように、ホスホセルロース・クロマトグラフィーによる酵素の部分精製の後、特異的螢光測定物質であるグルタリル−アラニル−フェニルアラニル−メトキシナフチルアミンを月いて測定した。さらに、宿主細胞内で遺伝子操作技術を用いて作成されたＴＰＡの誘４後、１ｏｎ−遺伝子の発現の増加を観察する研究により、この発現の増加はえかつ温度シフトに際し産生の増加を妨げると思われる。

ｈｔｐＲ変異株によって示される分解能の減少は、欠損したプロテアーゼＬａをコードするＩｏｎ変異株に見られるものより大きいかもしくは同等である。しかしながら、ｈｔｐＲ変異株は、たとえば皮膜多糖類の過剰生産や蓄積（ムコイド状とも云われる）、細胞***時の欠陥や繊維形成及び紫外線照射もしくは他のＤ　Ｎ　Ａ　陽傷剤への感受性の増加のようなＩｏｎ変異株が示す望ましくない表現型を示さない、従って、ｈｔｐＲ変異株は、大規模な産業的醗酵で見られる種々の条件下（たとえばリッチな培地など）で、Ｉｏｎ変異株よりも生存力が強い。これらの条件下ではＩｏｎ変異株はあまり生育しないが、ｈｔｐＲ変異株の生育はよく、従って発現した外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の収量を増加させるため組換えＤＮＡ技術における宿主生物として明らかな利点を与える。

Ｐ１形質導入を利用して、１工上Ｒ変異とＩｏｎ遺伝子内の変異（たとえばＩｏｎ△１００もしくはｃａｐＲ９等）との両者を含むｈｔｐＲＩｏｎ変異株を作成した。これらの二重変異株は、不安定なプロテアーゼの生産が減少し、どちらか一方の変異のみをもつ菌株に比べて異常タンパクの分解能が劣っている。これらの二重変異株によるタンパク分解の欠点は、既知のいずれの菌株よりも顕著である。これらの二重変異株は、培養で高細胞宙度を達成する生存力のある宿主である。ｈｔｐＲ変異株と同様、それらはＩｏｎ変異株が示すようなムコイド伏或いは他の不健全な特性を示さない。

このように本発明の！ＬＬＬＲ上上ユ変異株は、通常では急速な細胞内分解を受けるような遺伝子操作技術によって作成されたタンパクの大規模生産に特に有益である０本発明によれば、外来性タンパク、ポリペプチドもしくは他の産物は、用いて外来性タンパク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするＤＮＡ配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主を培養し、この宿主はプロテアーゼ遺伝子の発現に欠陥があることを特徴とし、培養物から産生物を収集することによって生産される。さらに、外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物は、ｈｔｐＲ遺伝子産物の産生もしくは機能に欠陥があるような宿主を用い、外来性タンパク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするＤＮＡ配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子で形質転換された上記宿主を培養することによっても生産しうる。

本発明の変異株は、組換えＤＮＡ配列が任意公知の技術により導入されかつタンパク、ポリペプチド及び池の産物として発現される宿主細胞として有利に利用しうる。この変異株の外来性もしくは他の異常ポリペプチドの分解能の減少により、組換えタンパク及び他の産物が高収量で生産できる。例えば、本出願人の実験データによれば、工上工Ｒエユユ変異株内で生産された遺伝子操作技術を用いて作成された組織プラスミノーゲン活性因子は、野生型宿主細胞の場合と比較して３〜５倍に収９が増加する。

本発明の方法は大腸菌、ｍ菌、酵母、カビ、動物もしくは植物または他の宿主生物を含む原核及び真核宿主中での外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の生産に適用できる。

ヒート・ショック応答は、高温という不利な吹成から細胞を防御するための普遍的な機構であると思われる〔アシュバーナー等、前出〕、従来示唆されているように（Ｓ、ボッ等。

前出〕、ヒート・ショック応答は、異常タンパク分子の蓄積から細胞を防御するための一般的な機構であると思われる。

プロテアーゼＬａに類似したＡＴＰ依存性プロテアーゼをサルモネラ・ティフィメウリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｅｕｒｉｕｍ　）゛　や枯草Ｍ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂＬｉｌｉｓ　）等の他の細菌でも観察した。

１ｏ旦変異株は、サルモネラ・ティフィメウリウムで検出されている。従って、大腸菌で見られるのと同様な異常もしくは外来性タンパクの分解機構はすべての原核生物で見い出されうる。この機構はさらに真核生物にも存在する。プロテアーゼＬａと同様の酵素が、哺乳動物細胞のミトコンドリア中（Ｍ、デザウテルズ及びＡ、　Ｌ、ゴールドバーグ、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第ｍ胞の細胞質中（Ｌ、ワックスマン等、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（１９８５）、段積中〕で見い出されている。

これら他の生物でのそのようなｔｉ構の存在により、大腸菌に存在するプロテアーゼＬａ遺伝子には能的に対応する遺伝子の欠損を持ちかつここで述べた変異生物と同様に外来性産物の分解能が減少した類似変異宿主生物を作製するため、本発明の方法を使用することができる。

さらに、各種の発現ベクターを、本発明の宿主を形質転換するのに用いうる。例えば、有用な発現ベクターは染色体の断片、非染色体及び金成りＮＡ配列などがあり、例として種々の既知のＳＶ４０の派生物、ｃｏｌＥｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの派生物を含む大腸菌のプラスミド、より広い宿主域をもつＲＰ４等のプラスミドなどの既知の細菌性プラスミド、ＮＭ９８９等の多数のλファージの派生物１Ｍ１３及び繊維状（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　）− 重鎖ＤＮＡフ１−ジ等の他のＤＮＡフプージなどのファージＤＮＡ、他の発現制御配列、もしくは２μプラスミドやその派生物のような酵母プラスミドを用いて修飾したプラスミドのようなプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター等とすることができる。特に好ましい発現ベクターは、多コピー数プラスミドもしくはバクテリオファージ派生物である。なぜなら、そのようなベクターは発現タンパク収量を増加させるからである。

同様に、種々の発現制御配列も、クローン化ＤＮＡ配列の発現効率（転写と翻訳）を向上させるために有用である。これらの発現制御配列には主に２つの型があり、１つは構成的発現制御配列であり、もう一方は制御可能な発現制御配列である。β−１ａｃのような構成的発現制御配列は、クローン化ＤＮＡ配列を発現させてそのＤＮＡ配列により、コードされる産物を生産するよう宿主細胞の生育中、絶えず機能する。

ｔｒｐ、λＰＬ、もしくはλＰ之のような制御可能な発現制御配列は、宿主細胞の生育の間に調節しくすなわち切換え）うるので、クローン化されたＤＮＡ配列の発現を培養の生育サイクル中の最適時に発現するようにすることができる。たとえば、制御可能な発現制御配列は、宿主が遺伝子産物を過度に蓄積せずに繁殖するように発現を停止させることができ、次いでこれらの発現制御配列の制御下に多量の所望タンパク産物の発現を促進するように発現を開始させうる。正常な無毒の遺伝子産物でさえ過剰生産すると宿主細胞に害を与えかつ特殊な宿主−ベクター系の安定性を（圧下させるので、制御可能な発現制御配列はしばしば宿主細胞の生育の間発現を調節するのに好都合である。

いくつかの制御可能な発現制御配列を使用して宿主生物でタンパクやポリペプチドをコードするＤＮＡ配列及び遺伝子を発現することができる。これらには、たとえば大腸菌のラクトース・オペロンのオペレーター、プロモーター及びリポソーム結合・相互作用配列〔たとえば、Ｋ、イタクラ等、「ソマトスフチンホルモンの化学合成した遺伝子の大腸菌における発現」、サイエンス、第１９８巻、第１０５６−６３頁（１９７７）；Ｄ、ｖ、ゴーデル等８　「ヒトインシュリンの化学合成した遺伝子の大腸菌における発現」、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、第７６巻、第１０６−１０頁（１９７９））。

大腸菌のトリプトファン・オペロンの対応配列（Ｊ、　Ｓ、エムテージ等、「インフルエンザ抗原決定因子は大腸菌にクローン化したヘマグルチニン遺伝子から発現する」、ネイチャー、第２８３巻、第１７１−７４頁（１９８０）、　Ｊ、　Ａ。

マーシャル等、「ヒト成長ホルモン：細菌での相補ＤＮＡのクローニング°と発現」、サイエンス、第２０５巻、第６０２−ｏｕｔ　（１９７９））並びにλファージの主要オペレーター・プロモーター領域（Ｈ，パーナート等、「バクテリオファージλＰ、プロモーターから得た遺伝子発現を促進するプラスミド・クローニング・ビークルの作成」、ジーン、第５巻、第５９−７６頁（１９７９））等が含まれる。

本発明の互上上Ｒ変異株と皿上且Ｒ１ム旦変異株とが高温で外来性タンパクの分解能を減少するという事実は、温度誘導性の制御可能な発現制御配列と組合わせて使用するのに特に好都合である。バタテリオファージλのＰＬジブロモクー等の熱誘導性発現配列は、既知の標準的な技術によって所望のタンパクをコードするＤＮＡ配列と融合させうる。得られた組換えＤＮＡ配列を次いでｈｔｐＲ変異株もしくは　−拡止ｐＲｌユ」変異株宿主を形質転換するのに使用できる。

４２℃で生育した場合、そのような宿主はその温度で発現を遂行する温度誘導性発現制御配列によって、所望のタンパクもしく・は産物を高程度に発現する。さらに、所望のタンパクくは産物の分解能が減少したためにさらに増加する。これらの上上上Ｒ変異株及び五誌」−Ｒ１ｏ工変異株中では、野生株を宿主とした場合と異なり、高温時もしくは細胞内での外来性タンパクの生産時におけるタンパク分解酵素の増加が起異株もしくはｈｔｐＲＩｏｎ変異株とを組合せて使用することは、遺伝子操作技術によって作成されたタンパク、ポリペプチド及び他の産物の発現を増加させる。しかしながら、ｈｔｐＲ変異株とｈｔｐＲＩｏｎ変異株とは低い温度（たとえば３０℃）でも外来性タンパクの分解が減少しているので、本発明は構成的発現制御配列或いは非温度誘導性発現制御配列を使用して外来性タンパクもしく１也の産物の発現を増加させることもできることに注目すべきである。

本発明の宿主生物及び方法は、多種のタンパク及びポリペプチドの生産に応用しうる。加えて、本発明の方法は、収量が酵素の高いレヘルに依存する分解をうけやすい他の産物の生産を増加させるために用いうる。たとえば、ワクチンの活性成分や他の医薬上活性のある産物、農業上もしくは他の産業上有用な組成物、酵素、ホルモン、アミノ酸、工業薬品。

抗生物質１食品等の産物を本発明の方法によって有効に生産しうる。本発明の方法によって生産されうる他の産物には、白血球インターフェロン、繊維芽細胞インターフェロン及び他のインターフェロン、免疫活性もしくは生物活性を示すポリペプチド、ＦＭＤＶウィルス抗原もしくはＢ型肝炎ウィルス抗原の抗原性を有するポリペプチド、ツマトメディンＣやブロイ・ンソユリンのようなヒトもしくは動物ホルモンの生物活性を示すポリペプチド、並びにヒト動物もしくはウィルス産物の免疫活性もしくは生物活性を示すポリペプチド及びタンパク等が含まれる。特定の産物の選択は本発明の一部ではない。むしろ、本発明は、そのような産物をコードするＤＮＡ配列の発現を増加させること並びに本発明の変異宿主生物中でそのような産物を生産することに一般に応用しうる。

子が除去されている宿主細胞に挿入しうろことも了解すべきである。これらの宿主細胞を次いで、組換えＤ　Ｎ　Ａ分子才なわち所望タンパクをコードするＤＮＡ配列で形質転換させて、これらのタンパクを高収量で産生しうる。

また、本発明は、二重工ＲもしくはＩｏｎｙ伝子またはその組合せ内に多数のおこりうる変異のいずれかを含む宿主生物を包含することを了解すべきである。そのような変異株は、Ｔ、トベ等による「大腸菌におけるタンパクのヒート・ショック誘導を欠損した温度感受性変異株の単離及び物理的マツピング」、モレキュラー・ジェぶラル・ジェネティクス、第１９５巻、第１０−１６頁（１９８４）に見られるようなヒート・ショック応答の新しい欠損株を作成するための標準的突然変異誘発および選択技術を利用して得ることができる。

さらに、本発明の方法は、ヒート・ショック・タンパクの誘導が欠損した変異株のような外来性タンパクの分解能の減少を示すＤＮＡ配列内の池の変異を有する大腸菌株中で外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物を生産するのに応用しうる（Ｋ、Ｈ，ビ・−り、「Ｌ二重Ａ変異株における高温でのヒート・ショック・タンパクの誘導の欠損」、「アブストラクト・オプ・ペイバーズ・プレゼンテフド・アット・ザ・バクテリオファージ・ミーティングｊ、Ｍ１５１頁、コールドスプリングハーバ−研究所版、コールド　スプリング　ハーバ−ニューヨーク（１９８４）参照〕。

本発明をより良く理解するため、以下に実施例を示す。これらの実施例は例示のみを目的とし、あらゆる意味で本発明の範囲を限定するものではない。

方法を例示するものである。

大ｖＡ苗の細胞（３０９００株、非サプレッサー、Ｉｏ工′成をしないバクテリオファージであり、かつＣ■遺遺伝円内ＴｎｌＯトランスポゾンを有するλＮＫ５５を感染させた。

ＴｎｌＯ）ランスボゾンは、９３００塩基対のトランスポゾン可能なりＮＡ断片であって末端に逆反復配列を有し、大腸ＴｎｌＯはテトラサイクリン耐性遺伝子をもっておりかつトランスボッ゛ン自身がバクテリオファージＴ６レセブタをコードするし工Δ遺伝子に挿入するので、ＴｎｌＯの挿入物を有する大腸菌細胞をテトラサイクリン耐性でありかつＴ６フアージ耐性である。従って、λＮＤ５５感染細胞はテトラサイクリン耐性で選抜し、これらのコロニーをさらにＴ６フアージに対する耐性で選択した。大腸菌の二土旦遺伝子はｔｓｘ遺伝子の近くに位置しているので、その結果分離株はｔｓｘ：ＴｎｌＯのテトラサイクリン耐性マーカーに連鎖したし」遺伝子を含んでいた。

Ｊｏｎとｔｓｘ：ＴｎｌＯが連鎖した遺伝子を次にＰ１形質導入によりＩｏｎ△ １００のようなＩｏユニー腸菌株に導入した。変異株のと！工遺伝子とＰ１形質導入要素の二重Δ：　Ｔｎ　１０との間に交差をもつ細胞を、テトラサイクリン耐性で選択し、上！」変異株に特有のムコイド表現型にっきスクリーニングした。得られた分離株は、ＴｎｌＯのテトラサイクリン耐性マーカーに連鎖した一Ｌエユ変異株であった遺伝子に変異をもつ二重変異株を作成するために、上記分離株のＩｏｎ−：ｔニュ′配列を大腸菌株に１６５もしくは株をテトラサイクリン耐性でまず選抜し、次いで温度感受性株にｌ　ｏ　ｎ−遺伝子を導入して作成したが、逆の順序の作成、すなわちｌｏニー株にＬ二ｚＲ−遺伝子を導入して作成してもよいことは明らかである。

二重変異株であり、本発明に従って大腸菌で産生される遺伝子操作技術を用いて作成された外来性タンパクの収量を増加させるために用いられる。同様に、１ｏｎＲ９ｈｔｐＲ−である大腸菌株ＳＧ９３６及び３０９２８を作成して本発明に開示された方法に従い使用することもできる。

実施例２ｈｔｐＲ変異株中のタンパク分解の測定以下の実施例は、本発明の変異株中でのタンパク分解を測定する方法を例示したものである。

測定すべき変異株の培養を、好ましくはＭ９最小培地中で一晩行なう（Ｊ、Ｈ，ミラー、「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス」、（コールド　スプリングハーバ−研究所（１９８１））、午前中、１０ｍ１の培＃物をクレット・フラスコに入れ、好ましくは菌がよく増殖したことを確認するために少なくとも二世代生育させた。

凹が初期対数増殖期にあるとき、５■／ｌｌｌ１のＨ２０ビューロマイソン（フィルター滅菌）　０．２　ｍｌ”０．５　ｍｌヲ各々のフラスコに加えた。細胞培養物の濃度は、次の２０分間が経過した後に中期対数増殖期となるようにした。各々のフラスコのビューロマイシン最終濃度は１００〜２５０μｇ／ａ＋１であった。ビューロマイシンは、１ｌｌｌ胞の合成途中のポリペプチドに取り込まれるタンパク合成■害剤である。しばらくすると、この取り込み番よ、未熟なまま終結した異常なタンパクを形成した。そのような短いタンパクは、プロインシュリン等の産業上興味のある多くのクローン化タンパクと同様に、細菌によって通常急速に分解される（Ａ、Ｌ、ゴールドバーグ、プロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第６９巻、第２６４０−４４頁（１９７２））。

ビューロマイシンの添加後、細胞を３７℃で１５分間保温した。次いで、ｌμＣｉ　３Ｈ−アミノ酸／ｍｌを、細胞によって合成されているタンパクを標識するために培地に加えた。

（もし細胞をリッチなＬＢ培地中で生育させる場合、３２Ｓ−メチオニンが適当な標識であり、４μＣｉ　”Ｓ−メチオニン／ｍｌを用いるべきである）、培養物を放射活性標識とともに３０℃で５分間検温した。細胞を直ちにソーパル３３ −３４型ローターを用いて、４０ｍ１の滅菌遠心管中で５０００　ｒｐ＠にて１分間遠心分離した。上澄を迅速にデカントし、沈殿物を１■／ｍｌの非放射性追跡アミノ酸を含む２倍容量の培地に再息濁しかつ回動させることによって洗浄した。細胞を前記と同様に再遠心分離し、非放射性追跡アミノ酸を含む培地に再懸濁し、クレット・フラスコに移した。これらのフラスコに移すとき、細胞濃度を、次の６０〜９０分間の時間経過後に細胞が定常期とならないよう調節した。

操作のこの段階で、ビューロマイシン処理細胞は、ビューロマイシンを取り込んだ合成途中のポリペプチドを含んでおり、標識アミノ酸がそれらの配列内に取り込まれていた。ピューロマインンによってこれらのポリペプチドはそれらが合成されていたリポソームから解離し、その結果生じた異常ポリペプチドは細菌細胞によって分解された。

ある特定の細胞菌株がこれらの不完全なまま終結したタンパクを分解する速度を５１定するため、サンプルを種々異なる培養時間の上澄から採取し、分解過程から生じる遊離の放射性アミノ酸をσＴＩ定した。

ｔ＝Ｑの時点で、２つの０．５　ｍｌサンプルを各々の培養物から採取した。一方は「総カウント」とし、ｔ＝Ｑにおける全放射性タンパク量を示すものとした。このサンプルを、１００μｌの７０％ＴＣＡ　（）リクロル酢酸）を含む水冷しておいた試験管に移した。このサンプルに０．１　ｍｌのＨ２Ｏを加えた。

ｔ−Ｑ時に採取したもう一方のサンプルは「ブランク」とし、酸可溶性カウント、すなわち、ｔ＝Ｑ時にサンプル中に存在する遊離の放射性アミノ酸を示していた。この０．５　ｍｌサンプルも１００μｉの７０％ＴＣＡを含む水中の試験管に移した。

ＴＣＡの最終濃度は好ましくは１０％であった。このサンプルにｌＯＯμｌのｌＯ％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）を加えた。Ｌ＝１５分、３０分、６０分及び９０分の時点で、同様の０．５　ＩＩｌサンプルを細胞培養液から採取し、１００μｌの１０％ＢＳＡを含む１０％ＴＣＡに加えた。

各々のサンプルをＴＣＡｉ液中中で３０分間水冷した。各々のサンプル中の遊離放射性アミノ酸はＴＣＡ中で可溶化され、一方未分解のタンパクは不溶のまま残り、ＴＣＡから沈降した。このように、タンパクの分解を、ＴＣＡ中に不溶である標識タンパクからＴＣＡ中に可溶である遊離放射性アミノ酸への変化を測定することにより決定した。従って、経時的にＴＣＡ可溶性カウントの生産を、細胞内でのタンパク分解速度の指標として利用した。ピエーロマイシンを取り込んだタンパクの分解速度は橿めて速いので、上記のＴＣＡ沈殿の操作をできるだけ迅速におこなう必要があることに注意すべきである。

ＴＣＡｉ液中での培養の後、すべてのサンプル（「総カウント」を除く）を磁２６９０−ターを用いて、ＩＥＣ遠心分離で、３５００　ｒｐｍにて１０分間、４ ℃で遠心分離し、各々のサンプルの０．４　ｍｌ上澄を４ｍｌのリキシント・シンチレーション液中で５分間カウント測定した。各々のサンプルのカウントを用いて、以下の式に基づきタンパク分解の％を計算した。

式：タンパク分解％＝平均ｃｐｓ　（採取時）−ブランクｃｐｓ（ｔ＝ｏ）×１００総カウントＣｐＨ第２図は、経時的なビューロマイシンを取り込んだタンパクの分解％を示したものであり、それぞれ大！！菌野生株細胞（ｌｏｎ”ｈｔｐＲ千）対ｈｔｐＲ変異株（ｌｏｎ＋　ｈｔｐＲ）（グラフ１参照、使用菌株はグラハム・ウォーカー博士より寄贈の５Ｃ１２２（ｈｔｐＲ）及びＫ１６５（ｈｔｐ変異は、タンパク分解パーセンテージをかなり減少させた。

上記の例はビューロマイシンの取り込みによって生した短族体を含む完全長さの異常タンパクの急速な分解に従って示された。操作手順は、上記と同様であった。中期対数増殖期に、Ｍ９培地で一晩生育させた細胞を遠心分離し、アルギニンを含まない培地に再懸濁した。カナバニン（すなわちアルギニンのアミノ酸同族体）を最終濃度が０．６ｍＭになるように加えた。１５分後、１０−２０μＣｉの３Ｈ−フェニルアラニンを加えた。５分後、培養物を遠心分離し、０．６ｍＭのアルギニンと非放射性フェニルアラニンを０．５−１．０■／ｍｌの濃度で含む培地に再Ｅ濁した０次いで、その培養物を再遠心分離し、同じ培地に再で濁した。

ビューロマイシン決定について述べたのと同じ方法で培養物からサンプルを採取し、カナバニン含有タンパク％を同じ式により決定した。第３図は、経時的なタンパク分解％を示したものであり、大腸凹野生株（ｔｏｎ　ｈｔｐＲ）対用菌株はグラハム・ウォーカー博士より寄贈のＧＷｌｏｏＯ（ｈｔｐＲ）及びＧＷ４７０１（ｈ仁ＰＲ−））、及び種々の変異株と一匠工ｐ−Ｒ二ム二二重変異株でのタンパク分解（グラフ２及び３参照）を示している。野生株及びｔｏｎ変異株の両者で、ｈｔｐＲ変異は明らかにタンパク分解を減少した。さらに、二重変異株、すなわちｈｔｐＲ及びＩｏｎ変異の両者を有する菌株は、ｈｔｐＲ変異のみを有する菌株よりも分解がさらに減少しており、この二重変異が身ンパク分解に対し成る付加的影響を与えることを示した。

以下の実施例は、遺伝子操作技術によって作成された外来性タンパクである組織プラスミノーゲン活性因子を産生させるよう誘導した宿主内でプロテアーゼＬａをコードするｌｏｎｏ伝子の発現が増加したことを示すものである。しかしながら、ｈｔｐＲ変異をもつ大揚薯宿主は、このような発現の増加を示さなかった。

二重二遺伝子の発現がなされているかどうかを簡単に検出するために、Ｊａｎプロモーター配列をβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子である二エエＺに作用結合させてなる三重ニー１ａｃＺオペロン融合配列を作成した。ｌｏ立ジブロモクーが作動している時、β−ガラクトシダーゼが生産され、簡単に検定されうる。このＩｏｎ−ｌａｃ融合配列を、バクテリオファージλ中に挿入し、宿主の染色体に組込ませた０次いで、ＴＰＡ遺伝子をもつプラスミドを同じ宿主に導入し、ＴＰＡを生産するように誘導することにより、β−ガラクトンダーゼ活性の形で示されるｔｏ旦遺伝子の発現を測定した。

二重ｃＺ遺伝子に作用結合させたｌｏユプロモーターを含むＤＮＡ配列を、以下のように、大腸菌株５Ｃ１２２（Ｆ−工ａｃ　（ａｍ）、ｔｒｐ　（ａｍ）、ｐｈｏ　（ａｍ）、ｍａユゼーンバウアー等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー。

第１４３巻、第８５２−６３頁（１９８０））とオペロン融合ベクターｐＭＬＢ　１０２２　（Ｔ、Ｊ、シルバービー等。

「エクスペリメント・ウィズ・ジーン・フュージョン」２　コールド　スプリング　ハーバ−研究所、コールド　スプリング　ハーバ−ニューヨーク（１９８４）ＥをＥｃｏＲＩとＢａｍＨ１制囚エンドヌクレアーゼにューイングランドバイオラボ社）で切断し、これらＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で混合した。

Ｉ）ＭＬＢ１０２２はアンピノリン酎性遺伝子と、ガラクトースの醗酵に関与する酵素であるβ−ガラクトシダーゼをコードする１ａｃＺ遺伝子とを含んでいるが、このプラスミドは二土二Ｚ構造遺伝子の転写に必要なμｇ／ｍｌのアンビンリンを添加したマツコンキー・ガラクトース・プレートで平板培養した。ｐＭＬＢ１０２２（７）ｌ１二Ｚ遺伝子の上流にｐＪＭｃ４０のＪａｎプロモーターを含むプラスミドで形質転換された細胞のみが、β−ガラクトシダーゼを産生ずることができ、マンコンキー・ガラクトース・プレートで赤いコロニーとして出現する。このように、プレート上で赤いコロニーを形成するアンピシリン耐性コロニーを分離、シた。これらのコロニーの１つからプラスミドＤＮＡをとり、制■ エンドヌクレア°−ゼマフビングとアガロースゲル電気泳動法とで分析し、Ｊａｎ−１ａｃオペロン融合配列を含むことが判明した。このプラスミドはｐｓＧ１０２１と名付けた。

次いで、ＥｃｏＲＩで制限しておいたλＮＦ１９５５　（１゜フイ等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１５２巻。

第１０２２−３２頁（１９８２））由来のλＤＮＡにまずこの融合配列を挿入することによって、大腸菌宿主細胞の染色体にこの融合配列を組み込んだ。結合反応を、１００μｇ／１１のλＮＦ１９５５ＤＮＡと３μｇ／国ＩのプラスミドＤＮＡとを用いて、プラスミドＤＮＡに対するλＤＮＡの高濃度にて行なった。この末端−末端の高濃度により、結合混合液中の組換えλＤＮＡのコンカタマーが形成される。この結合混合液を、次いでイン・ビトロ・パフケージング法を用いてλ粒子内にバフケージングしたＣＢ、ホーン等、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス［ＪＳＡ、第７１巻、第２３７２− ７６頁（１９７４））。

ｌａｃの欠失をもつλ感受性大腸菌細胞にこれらの組換えファージ粒子を感染させ、β−ガラクトシダーゼと反応して青いプラークを形成させる物質であるＸ− Ｇａ１（５−ブロム−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加したＴＢ（バクトドリブトン）培地に塗抹した。青いプラークを分離し、精製λＤＮＡの制限酵素分析によって１ｏｎ−１ａｃオペロン融合配列の存在を確認した。

λＮＦ１９５５は安定なｆ６原菌を形成しないし、サプレッサー菌株内でのみ生育できるので、組換えファージ粒子を野生型λファージと交差させ、５０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａ１を含むＴＢ培地にて３７℃で非サプレッサー細胞を平板培養し、濁った青いプラークをスクリーニングした。融合配列を含むファージは安定な溶原菌を形成できるので、この方法で分離し、λシグマガンマ１０１と名付けた。

大腸菌株５Ｃ１２２（ｈＬｐＲ＋）とに１６５（ｈｔｐＲ−）とを、λシグマガンマ１０１で溶原化させるためにｍａｌ”で形質導入し、次いでＸ−Ｇａ１を含む培地に塗抹した。λの追いうち感染に耐性のある青いコロニーを分！した。

この方法で分離された２つの菌株を大ＭＭｉｌＳ　Ｃ１２２由来のものにつき大腸菌５Ｇ９４３　（ｈｔｐＲ＋）と名付け、大腸菌に１６５由来のものを大Ｂ’ Ａ菌５Ｇ９４２　（ｈｔｐＲ−）と名付けた。

たｈｔｐＲ細胞とｈｔｐＲ−細胞におけるＩｏｎｏ伝子の発現ｔｏｎ−ｌａｃ融合体をもつ菌株５Ｇ９４３及び５Ｇ９４２を、次いで組織プラスミノーゲン活性因子をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列をもつプラスミドｐ　ＴＰＡ　１．０２　（ｐＴＰＡ　１０２を含む大腸菌株は１９８４年８月２７日にメリーランド州ロフケビル在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号はＡＴＣＣ３９８１０である）で形質転換した。ｐＴＰＡ１０２は、プラスミドｐＭＣ９に由来しくＲ，Ａ、ヤング等、「抗体プローブを用いた効果的な遺伝子の分離法Ｊ、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、第８０巻、第１１９４−９８頁（１９８３））、周知の操作技術を用いて、二重二プロモーター（Ｌニヱからの一３５領域とＬＬ二からの−ｌＯ領域）の制御下にＴＰＡ遺伝子を含むようにしたものである。

ｐＴＰＡ１０２を大腸菌株５Ｇ９４３及び５Ｇ９４２の各々を形質転換するために用い、各菌株を培養して２つに分けた。

各々の凹株から分けた一方に、工二重プロモーターの誘４　’ｆ１１質であるＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノンド）を１ｍＭの濃度になるように加えた。もう一方は各々未誘導のままにしておいた。細胞を３０℃で１時間保温した後、Ｉ　ＰＴＧを除去するためにろ過によって洗浄した。

各々の分取分で産生されたβ−ガラクトシダーゼのレベルを、オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ングマ社）の分解をＯ，Ｄ、　で検出することによって渕２牛Ｑ定した（Ｊ、Ｈ，ミラー、「エクスベリメント・イン・モレキュラー・ジエネティクス」、第４３１頁、コールド　スプリング　ハーバ−プレス社（１９７２））、５Ｇ９４３株（ｈｔｐＲ”）は、３０℃で経時的にβ−ガラクトシダーゼ活性の増加を示したのに対し、５Ｇ９４２株（ｈｔｐＲ）はβ−ガラクトシダーゼ活性の増加を示さなかった。

これらの結果により、プロテアーゼＬａの発現を制御するＪａｎプロモーターはＴＰＡタンパクをコードするＤＮＡ配列で形質転換した宿主内でＴＰＡ生産が誘導されることによって作動することが示される。しかしながら、ｈｔｐＲ変異株は、このような発現の増加を示さない。

におけるいくつかのヒート・ショック・タンパクの：誘導およびｈｔｐＲ変異株におけるこの誘導の欠損ＴＰＡ遺伝子を含むｐＴＰＡ１０２を、前述のように大腸菌株５Ｇ９４３及びＳＧ９４２に形質転換させ、各々の菌株の細胞を等量で２分画した。各々の菌株から採取した一方は、ＴＰＡを生産させるために、前述のように３０℃で１時間Ｉ　ＰＴＯを添加することによって誘導した。もう一方は、ＩＰＴＧの添加なしに、すなわち未誘導のまま３０℃で１時間保温した。次いで、細胞をろ過して洗浄した後、′Ｓ−メチオニン（＞４０Ｑｃｉ／ｍｍｏｌ、ニューイングランドヌクレア社）を２μｃｉ／ｍｌの濃度で含むＭＯＰＳ培地に再１ε濁し、５分間パルス標識した。次いで、全細胞タンパクをＴｃＡ６ｇによって細胞から抽出し、先ず、１０％ＴＣＡで洗浄した後、５％ＴＣＡで洗浄し、次いでエタノール／エーテルのｌ：１溶液で１先浄した。タンパクを真空乾燥し、１ｘｓｏｓサンプルｆｆｌ？Ｅ液に再訂濁し、７〜１５％リニア・グラジェント・ポリアクリルアミドゲルにかけて分析した。典型的なヒート・ショック応答を示すため、大腸菌ＳＧ９４３及び５Ｇ９４２細胞（ｐＴＰＡ１０２で形質転換されていないもの）を上記と同様に３０℃と４２℃とにおいてパルス標識した。

′４胞を４２℃で生育させる場合は、細胞を３０℃から４２℃に移して、５分間生育させからパルス標識した。

未形質転換の二重ｐＲ細胞を３０℃と４２°Ｃとで生育させた場合のオートラジオグラフを比較すると、４２℃では多数のヒート・ショック・タンパクの生産が見られた（しかしながら、３０℃では見られなかった）。３０℃にてＩ　ＰＴＧで誘導したＴＰＡを含むｈｔ工Ｒ細胞からのオートラジオグラフは、４２℃に移して生育させた（すなわち典型的なヒート・ショック応答）　垣とＬＲ細胞のオートラジオグラフで観察されるヒート・ショック・タンパクのいくつかと対応する４〜５　ｆｔのタンパクを示した。これらの４〜５種のタンパクは、Ｉ　ＰＴＧて誘導したＴＰＡを含むｈｔｐＲ！ｉｌ！胞のオートラジオグラフにも現われてなかったし、また４２℃に移して生育させたｈｔ上Ｒｍ胞のオートラジオグラフに現われたどのヒート・ショック・タンパクでもなかった。このデータは、ｈｔｐＲ細胞内でヒート・ショックにより誘導されるタンパクの少なくとも数個が３０℃におけるＴＰＡの産生によっても誘導されるが、これらのタンパクの誘導は当業界で周知された技術により大ＭＭｉＪの野生株ＭＣ１０６１゜土ユ」変異株であるＳＧ２０４１及びｈｔｐＲＩｏｎ二重変異株であるＳＧ９３５にプラスミドｐＴＰＡ１０２を形質転換させた。ｍ胞をＬＢ培地中で０．Ｄ、が０．５になるまで生育させ、ＩＰＴＧｔ−１ｍＭの濃度になるように添加し、０．５〜１時間培養した。１１胞を遠心分離し、ＳＤＳサンプル緩衝液に再ｇ３ｍし、１０分間ｇ４した後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動したやゲルをニトロセルロース紙にプロ、トして、ゲルから紙へバンドに分れたタンパクを移した。

次いで、紙をＴＰＡに対するウサギ抗体（ヴオルフーディーター・シュロイニンク博士の寄！りで処理し、次いで、さらにヤギの抗ウサギ抗体で処理した（この２番目の抗体は西洋ワサビのパーオキシダーゼで結合させである。バイオランド社）、これらの抗体は、フィルター紙のＴＰＡタンパクのバンドがある部分に結合した。ＴＰＡバンドを検出するために、フィルター紙を、Ｈ２Ｏ２にさらし、紙上のＴＰＡバンドがある部分を変色させた（ウェスタン・プロット法参照）、この手法を用いて、１二ｐＲＩｏｎ二重変異株では野生株に比べて組織プラスミノーゲン活性因子の収量が３〜５倍に増加したことを示した。

実施例６１　ｏ　ｎ及ヒｈ　ｔ　ｐ　Ｒ変異株におけるソマトメジンＣの発現以下の実施例は、ヒトのホルモンであるソマトメジンＣ（ＳＭＣ）を、以下のようにＳＭＣをコードする遺伝子を有するプラスミドで形質転換したｔｏ旦変異株、五二ｉＲ変異株及びＩｏｎ　ｈｔｐＲ変異株の各宿主細胞において、４２℃での蓄積を示すものである。たとえば、ｐＰＬｍｕＳＭＣＯｒ’ｉ　もしくはｐＰＬｍｕＳＭＣ２（それらはＳＭＣ１ｉ伝子を宵する）とｐＣＩｔ５７　とを大腸菌株ＨＢＩＯＩ、ＳＣ；９３１　（野生株）、３０９３３　（Ｉｏｎ−）、３０９３４（ｈｔｐＲ−）及び５Ｇ９３６　（Ｉｏｎ−、ｈｔｐＲ−）のそれぞれに導入した。

これらの菌株を、ヒート・ショック応答を誘導させるために４２℃で２時間保温し、各々の菌株からの大ｖＡ苗抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけクマシープルー染色してＳＭＣの蓄積を検出した＊　ｐＰＬｍｕＳＭＣ及びｐｃＩ　を有する５種の菌株の放射性ｏｒ’ｉ　ｔ５７免疫分析により、上記の各々のＳＭＣの産生比率は１：１：３：１５：３３であることが示された。従って、ＩｏｎｈｔｐＲ変異株は最も大量のＳＭＣを蓄積し、２つの変異は相乗効果があった。同様の効果が、ｐＰＬｍｕＳＭＣを有する菌でも観察された。その場合、ＳＭＣの比率は５種のそれぞれの菌株について１　：１１．６　：２．３　：４．１であった。ここでも、ｆａｎ　垣と、ＬＲ変異株は最も大量のＳＭＣを蓄積し、２つの変異は相乗効果があった。

また、ゲルのオートラジオグラフィーによって検出されるパルス追跡についても研究した。細胞をシフティン以外のすべてのアミノ酸を添加したＭ９最小培地中で２８℃にて一晩培養し、次いで同じ培地中で４２℃にて誘導した。培養中の細胞を〔３５Ｓ〕−システィンで３０秒間標識し、次いで過剰の非標識システィンを培地に加えて追跡巳た−　ｐＰＬｍｕ３ＭＣ２をもつＨ８１０１株はｐｐＬｍｕｓ＼イＣ、をもっＨ８１０１株に比べてＳＭＣに約４ｆｆｉの：３ｓＳ）−システィンを取り込んだ、野生株であるＨＢＩＯＩを宿主とした場合、ＳＭＣの半減期は５分間もしくはそれ以下であり、ＳＭＣは６０分後の追跡では殆んど検出されなかった。これに対し、二重二　ｙ±ｐＲ変異株を宿主と巳た場合、半減期はおよそ６０分間であった。

本明細書中に記載した工程によって４製された微生物はメリーランド州ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された培養物によって例証される。

１９８４年５月５日に寄託された培養物は、以下のように同定される：培養物５Ｇ９３５　：ＡＴＣＣ３９６２３培養物５Ｇ９３６　：ＡＴＣＣ３９６２４１９８４年５月６日に寄託された培養物は以下のように同定される；培養物５Ｇ９２７　：ＡＴＣＣ３９６２７培養物５Ｇ９２８　：ＡＴＣＣ３９６２８本出願人はここまでに本発明のいくつかの実施例を示したが、本発明の基本的な構成は、本発明の方法及び組成物を利用目的に応じて改変しうろことが明らかである。従って、本発明の範囲は、以上に実施例として示した特定の実施例のみに限定されない。

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Claims

【特許請求の範囲】１．組換えＤＮＡ分子内の発現制御配列に作用結合した外来性タンパク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子によって形質転換された宿主を培養し、上記宿主がプロテアーゼ遺伝子の発現の欠損を有することを特徴とする外来性タンパク，ポリペプチドもしくは他の産物の生産方法。２．宿主がｈｔｐＲ遺伝子産物の産生もしくは機能に欠損を有する請求の範囲第１項記載の方法。３．宿主生物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）バチルス，酵母．他の菌類．動物もしくは植物細胞または他の原核もしくは真核宿主生物より成る群から選択する請求の範囲第１項または第２項記載の方法．４．宿主生物が大腸菌の菌株である請求の範囲第１項または第２項記載の方法。５．宿主をｈｔｐＲ変異株及びｈｔｐＲ　ｌｏｎ変異株より成る群から選択する請求の範囲第１項または第２項記載の方法。６．ｈｔｐＲ　ｌｏｎ変異株宿主をＳＧ９２７，ＳＧ９２８，ＳＧ９３５，ＳＧ９３６より成る群から選択する請求の範囲第５項記載の方法。７．ＤＮＡ配列を、白血球インターフェロンの免疫活性もしくは生物活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列，繊維芽細胞インターフェロンの免疫活性もしくは生物活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、他のインターフェロンをコードするＤＮＡ配列，ＦＭＤＶウイルス抗原の抗原性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列，Ｂ型肝炎ウイルス抗原の抗原性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列，プロインシュリンや他のヒトもしくは動物ホルモンの生物活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列，並びにヒト，動物もしくはウイルス産物の免疫活性もしくは生物活性を示す他のポリペプチド及びタンパクをコードするＤＮＡ配列より成る群から選択する請求の範囲第１項または第２項記載の方法。８．ＤＮＡ前列がソマトメジンＣ．の生物活性を示すポリペプチドをコードする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。９．ＤＮＡ配列が組織プラスミノーゲン活性因子の生物活性を示すポリペプチドをコードする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。１０．発現制御配列が温度誘導性発現制御配列である請求の範囲第１項または第２項記載の方法。１１．ＳＧ９２７，ＳＧ９２８，ＳＧ９３５及びＳＧ９３６より成る鮮から選択される宿主。１２．ゲノム内に１ｏｎ，ｈｔｐＲ二重変異を有する大腸菌宿主生物。１３．組換えＤＮＡ分子内の発現制御配列に作用結合した外来性タンバク，ポリペプチドもしくは産物をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子によって形質転換された請求の範囲第１１項または第１２項記載の宿主。