JPS61501307A - 高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法 - Google Patents
高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法発明の技術的分野
本発明は、組換え産物を高収量で産生ずるだめの改良宿主生物と方法に関する。
より詳細には、本発明は、細胞質プロテアーゼの発現が減少したために細胞の外
来性タンパクの分解能が減少するという特異的な変異をDNA配列内にもつ宿主
菌株、並びに遺伝子操作技術によって外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産
物を高収量で産生ずるためにこれらの@株を宿主細胞として使用することに関す
る。本発明に開示された方法は、外来性組換えタンパク、ポリペプチド及び他の
産物を、通常そのような産物を産生しない宿主で高収量に産生させるという利点
がある。
技術的背景
組換えDNA技、術の発達により、外来性産物をコードする外来性DNA配列で
形質転換した宿主においてそれらの産物の産生が可能になった。一般的に、所望
のアミノ酸、ポリペプチドもしくはタンパク産物をコードするDNAは、発現ビ
ークル内に組換えDNA分子を形成するように適当な部位に導入される。次いで
、その組換え分子は、適合宿主を形質転換するために用いられ、宿主は挿入D
N A配列を発現しかつそのDNA配列によってコードされる産物を産生ずるた
めに培養される。そのような組換え技術は、細菌宿主中でN核及びウィルスタン
パクを生産するために用いられている。これらには、たとえば白血球インターフ
ェロン(S、ナガタ等、「ヒト白血球インターフェロン活性を有するポリペプチ
ドの大1Ij1面(E、coli)内における合成」、2イチャー、第284巻
、第316−20頁(1980))、ヒトB型肝炎ウィルスのFuff (C,
J、バレル等、rプラスミドpBR322にクローン化されたB型肝炎ウィルス
DNA配列の大腸菌(Escherichia Co11)内における発現」、
ネイチャー、第279巻、第43−47頁(1979);M、パセフク等。
「B型肝炎ウィルス遺伝子と大腸菌内におけるそれらの発現」。
ネイチャー、第282巻、第575−79 (1979))、SV40を抗原C
T、M、ロハーツ等、「犬猫菌内におけるシミアン ウィルス40を抗原の合成
」、ブロンーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス[
JSA、第76巻、第5596−600頁(1979))、及びFMDウィルス
抗原(H,クツパー等、「口啼疫ウィルスの主要抗原のcDNAのクローニング
と、大腸菌内における発現」、ぶイチャー、第289巻、第555−59頁(1
981))などが含まれる。
組換えD N A 皮術による外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の大
規模な工業的生産は、産生宿主による組換え産物の細胞内分解のために制約され
ていた。所定の宿主細胞中では、外来性もしくは他の異常タンパクは、急速にペ
プチドやアミノ酸に分解される。さらに、高温(たとえば40°C以上)では、
これろの異常タンパクと同様に正常タンパクの分解がより速くなることが見い出
されている(S、リン及び1、ザビン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第247巻、第2205−11頁(1972);A。
セント、ジョン等、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー、第25
3巻、第3945−5.1頁(1978)〕。
これは、そのような高温では正常と外来性との両タンパクは構造的な安定性が減
少する傾向にありかつ変性してしまう(すなわち異常になる)結果、細胞内プロ
テアーゼの攻撃をうけやすくなるためである。
この異常タンパクの分解は代謝エネルギーを必要とするCJ、D、コライツト及
びA、L、ゴールドバーブ、「大腸菌における特異的異常タンパクの分解の中間
段階」、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー、第252巻。
第8350−57頁(1977);に、オルデン及びA、L。
ゴールドバーブ、「大腸菌における細胞内タンパク分解のための工皐ルギー要求
の研究」、バイオケミ−・エト・バイオフィジイーク・アクタ、第542巻、第
385−98頁(1978))、ATP依存性プロテアーゼであるプロテアーゼ
Laは、細胞内タンパク分解の初期律速段階を触媒する(C,H,チャン及びA
、L、ゴールドバーグ、rATP依存性プロテアーゼであるプロテアーゼLaに
おける大腸菌のton (capR)遺伝子の産生物」、プロシーディンゲス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス USA。
第78巻、第4931−35頁(1981);F、S、 ラ’Jモア等、「大l
1jI菌のATP依存性タンパク分解酵素であるプロテアーゼLaの研究」、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第257巻、第4187−9
5頁 ゛(1982);L、ワックスマン及びA、 L、ゴールドバーブ、「大
腸菌からのプロテアーゼLaはATPとタンパクとをある結合形式で加水分解す
る」、プロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
USA。
第79%、第4883−87頁(1982))。プロテアーゼLaはIon遺伝
子によってコードされ、またcapRやdeg遺伝子とも呼ばれている〔チャン
及びゴールドバーブ。
前出〕。fan遺伝子の変異は欠陥があるが、部分的に活性のあるプロテアーゼ
を産生し、〔チャン及びゴールドバーブ。
前出;C,H,チャン等5 「大腸菌におけるIon変異(apR9によってコ
ードされるタンパクの研究:野生型プロテアーゼを阻害するATP依存性プロテ
アーゼLaの不安定型」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー。
第258巻、第215−21頁(1983))かつ異常タンパクの分解能の減少
を示す(S、ゴフテスマン及びり、ジブサー、「大腸菌二ムユ変異のdeg表現
型」、ジャーナル・オプ・バクテリオロジー、第133巻、第844−51頁(
1978)iコライツト及びゴールドバーブ、前出〕。
L土!変異は異常タンパクの分解能の減少を示すが、まだ幾分かの分解活性を保
っている(約正常活性の173〜1/2)。
加えて、組換えDNA技術の宿主としてそれらを用いることは、Ion変異株の
いくつかの好ましくない表現形質のため、生存能力の点で原罪がある。これらの
菌は紫外線照射に対し大きな感受性を示し、さらに細胞被膜ムコ多tS類の過剰
生産のためムコイド状になる。土二二遺伝子の機能を完全に持たない変異株は、
従来得られていない。
外来性組換え産物の有用量の工業的に可能な生産における組換えDNA技術の可
能性は、現在まで外来性タンパクの分解能が減少した特性を有する生存能力のあ
る宿主がなかったので制約されている。
発明の開示
本発明は、外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物をそれらをコードするD
NA配列で形質転換された宿主生物内にて生産するための改良宿主生物と方法を
提供することによって、前述の問題を解決する。より詳細には、本発明は、細胞
内プロテアーゼの発現が減少したために細胞の外来性産物の分解能が減少するよ
うな特異的変異をDNA配列内にもつ宿主細胞菌株、並びにこれらの菌株を用い
て遺伝子操作技術により作成された外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物
の収量を増大させることに関する。
本発明によって、外来性産物の分解能が減少した特性をもつ宿主細胞内で所望の
外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物を高収量にて生産することが可能で
ある。
以下の開示からも認められるように、本発明の宿主菌株及び方法は、外来性組換
え産物の大規模生産を高収量でおこなうことを可能にする。
図面の簡単な説明
第1図は、htpR変異株から単離したプロテアーゼLaの30℃と42℃とに
おけるレベルを示す表である。
第2図は、ビューロマイシンを取り込んだ種々の不完全大腸菌ポリペプチドにつ
いての時間に対する分解パーセンテージの比較グラフである。
第3図は、アルギニンの代りにカナバニンを含む種々の大腸菌異常タンパクにつ
いての時間に対する分解パーセンテージの比較グラフである。
本発明の実施における最良方法
ここに開示する発明を十分に理解するため、以下詳細に説明する。
この説明において以下の用語を用いる:ヌクレオチド:tli部(ペントース)
、リン酸及びii?jj素環式塩基よりなるDNAあるいはRNAの単量体単位
、塩基はグリコシド炭素(ペントースの1′炭素)を介し糖と結合し、糖と塩基
との結合体はヌクレオシドとよばれる。塩基はヌクレオチドを特性化する。4つ
のDNA塩基はアデニン(rAJ)、グアニンr rGJ )、シトシン(rc
J)及びチミン(rTJ)である、4つのRNA塩基はA、 G、C。
及びウラシル(rUJ)である。
がホスホジエステル結合で互いに連結した直鎖状デオキシヌクレオチド。
コドン:鋳型もしくはmRNAを介してアミノ酸、翻訳開始シグナルもしくは翻
訳停止シグナルをコードする3つのヌクレオチド(トリブレット)のDNA配列
、たとえば、ヌクレオチド・トリブレットTTA、TTG、CTT、CTC。
CTA及びCTGはアミノ酸ロイシン(rLeuJ)をコードし、TAG、TA
A及びTGAは翻訳停止シグナルであり、かつATGは翻訳開始シグナルである
。
ポリペプチド:隣接アミノ酸のαアミノ基とカルボキシ基の間がペプチド結合で
互いに連結されたアミノ酸の線状列。
mRNAからの特異的ポリペプチドに特性的なアミノ酸配列をコードするDNA
配列。
転写:遺伝子もしくはDNA配列からm RN Aを産生ずる過程。
全「レプリコン」を含んだ非染色体2本鎖DNA配列、プラスミドをR細胞生物
内に存在させると、その生物の特性はプラスミドDNAによって変化するか、ま
たは形質転換される。
たとえば、テトラサイクリン耐性(Tet)の遺伝子をもつプラスミドは従前に
テトラサイクリン感受性であった細胞を形質転換させて耐性にする。プラスミド
で形質転換された細胞は形質転換株と呼ばれる。
ファージもしくはバクテリオファージ:バクテリアのウィルスであり、その大部
分はタンパク膜あるいは外殻(カプシド)でカプシド化されたDNA配列より成
る。
クローニング・ビークルもしくはベクター:宿主細胞内で複製可能であるプラス
ミド、ファージDNAもしくは他のDNA配列であり、1つあるいは少数のエン
ドヌクレアーゼ認識部位によって特徴化され、その部位でDNA配列は不可欠な
生物的機能、たとえば複製、コートタンパクの生産、プロモーターや結合部位な
どの損失を伴なわずに決定しうる方式で切断できる。また、それらは形質転換細
胞の同定に適当なマーカー、たとえばテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性
を含んでいる。
列に由来するような生物もしくはDNA配列を大量に得るための過程。
組換えDNAもしくはバイブリドDNA :異なったゲノム(細胞もしくはウィ
ルスの全DNA)からのDNAの部分を含み、生細胞体外で末端と末端を結合し
がっ生細胞中で維持できるようにした分子。
ときにその遺伝子もしくはDNA配列の発現を制御・調節するヌクレオチド配列
。「作用結合」という用語は、所望産物をコードする遺伝子もしくはDNA配列
の前に適当な開始シグナルをもつこと、並びに発現制御配列の制御下に挿入DN
A配列を発現させてその遺伝子もしくはDNAによってコードされる所望産物を
産生させうる正しい解読フレームを維持することを含んでいる。
本出願人は、細胞が高温度下もしくは多量の外来性ポリペプチドの存在下でタン
パク分解酵素の含有量を増やすことを見出した0本発明は、高温度下もしくは多
量の外来性ポリペプチドの存在下で特に外来性産物の分解能が減少するという特
異的な変異をDNA配列内にもつ宿主細胞菌株に関する。
この重要な特性は、細胞質プロテアーゼの発現が減少したためと思われる。従っ
て、これらの宿主細胞の利用により、遺伝子操作技術により作成された外来性タ
ンパク、ポリペプチド及び他の産物の収量を増大しうる。
本発明の好ましい一興体例においては、プロテアーゼ遺伝子の発現の特異的変異
もしくは欠損が、その遺伝子産物の産れる調節遺伝子である。高温もしくは他の
不利な条件等によって「と−ト・ショック」がかかり、高温でのある細胞タンパ
クの変性によって異常タンパクが出現したとき、細胞は「ヒート・ショック・タ
ンパク」と呼ばれる多数のポリペプチドの合成を増加させることによって応答す
るCF、C,*イドハート等、「大uJ凹の高温レギユロンを調節する遺伝子の
モレキュラー・クローニングと発現」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー」
、第153S、第597−603頁(1983);”r、ヤマモリ等、「ヒート
・ショック・オペロンの翻訳と高温における細胞生育との大腸菌遺伝子(h i
n)調節にF、C,ネイドハート、「大腸菌の高温レギユロン」。
「ヒート・ショック・フロム・バクテリア・ツー・マン」。
M、J、アッシュバーナー等線、コールド スプリング ハ四982))。ヒー
ト・ソヨフク応答のシグナルは、細胞におけるこれらの変性タンパクの出現であ
ることを突き止めた。また、異質タンパクもしくはポリペプチドのクローニング
及び発現化の結果として生した!ll胞内の外来性ポリペプチドもしくは他の産
物の蓄積は、そのヒート・ノヨフク応答を引きおこすことも突き止めた。最終的
に、ヒート・ショック・タンパクの少なくとも1種が異常もしくは外来性タンパ
クのタンパク分解において決定的な役割を果すことを確認した(S、ボッ等、プ
ロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス USA
、第81巻、第6647−51頁(1984);T、A、ベイカー等、プロシー
ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスUSA、第81
巻、第6679−83頁(1984))。
本出願人は、これらのヒート・ショック・タンパクの1種が、細胞内で異常タン
パクの選択的分解の律速段階を遂行するA T、P依存性プロテアーゼとしての
プロテアーゼLaであることを突き止めた〔S、ボッ等、前出、T、A、フィリ
ップス等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第159巻。
@283−87頁(1984))、また、プロテアーゼLaは、他のヒート・シ
ョック・タンパクと同様、低温でも細胞内で外来性タンパクの蓄積に応答して誘
導されることも見い出した6外来性DNA配列で形質転換した宿主細胞内にクロ
ーン化された外来性D N A配列の発現の際に生ずる外来性タンパクの大量の
産生は、ヒート・ショックによっても誘導されるいくつかのタンパクの低温(た
とえば30℃)での産生を誘導することも実験的に実証された。たとえば、組識
プラスミノーゲン活性因子(T P A)をコードする1)NAA配列1、捗昭
61=SO1307(4)
形質t=換した宿主内におけるその発現は、30゛Cのような低温でさえプロテ
アーゼLaをコードする上!!遺伝子の発現を増加させる。このように、ヒート
・ショック・タンパクの誘導は、高温および低温の両方での外来性もしくは他の
異常タンパクの蓄積から′4@胞を防御するという一般化された機構を示す。
蓄積した異常タンパクに応じておこるこのタンパク分解酵素の誘導は、高収量で
遺伝子操作技術によって作成された外来性タンパクの生産に対する特殊な問題で
ある。宿主生物内での所望の外来性タンパクの生産に際し、プロテアーゼLa及
び他のプロテアーゼは、高割合で細胞によって合成されかつ細胞の所望タンパク
の分解能を増加させることを見出した。
その結果、遺伝子操作技術を用いて作成されたタンパクの高収量生産に対する障
害を克服するための手段を検索した。ヒート・ショック・タンパクの誘導は、h
in変異株とも呼ばれるhtpR変異株中ではおこらないことを突き止めた。そ
のような変異株は当業者により突然変異誘発技術を用いて得られる。
細胞質タンパク分解に対するhtpR変異の影響の研究により、坦tpR遺伝子
はプロテアーゼLaをコードするJan遺伝子の転写を調節することが示された
。htpR変異株では、Ioユ遺伝子の転写が減少する結果、プロテアーゼLa
の産生が城少し、次いで異常もしくは外来性タンパクを分解するという変異株の
能力の減少をもたらす。この異常タンパクの分解能の減少は、高温及び低温の両
条件下(たとえば各々42℃と30℃)で明らかである。このように、変異株か
ら単離されたプロテアーゼLaのレベルは30℃で野生株よりも低(,42℃に
移しても増加しない(第1図)、第1図の表は、1工上R変異株から単離したプ
ロテアーゼLaのレベルを30℃と42℃について示している。この表に示され
たデータは、30℃で生育させかつ42℃に1時間移した大腸菌培養物を用いて
得た。プロテアーゼLa活性は、L、ワックスマン及びA、L、ゴールドバーブ
によってジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー(1985)(印版
中〕に記述されたように、ホスホセルロース・クロマトグラフィーによる酵素の
部分精製の後、特異的螢光測定物質であるグルタリル−アラニル−フェニルアラ
ニル−メトキシナフチルアミンを月いて測定した。さらに、宿主細胞内で遺伝子
操作技術を用いて作成されたTPAの誘4後、1on−遺伝子の発現の増加を観
察する研究により、この発現の増加はえかつ温度シフトに際し産生の増加を妨げ
ると思われる。
htpR変異株によって示される分解能の減少は、欠損したプロテアーゼLaを
コードするIon変異株に見られるものより大きいかもしくは同等である。しか
しながら、htpR変異株は、たとえば皮膜多糖類の過剰生産や蓄積(ムコイド
状とも云われる)、細胞***時の欠陥や繊維形成及び紫外線照射もしくは他のD
N A 陽傷剤への感受性の増加のようなIon変異株が示す望ましくない表
現型を示さない、従って、htpR変異株は、大規模な産業的醗酵で見られる種
々の条件下(たとえばリッチな培地など)で、Ion変異株よりも生存力が強い
。これらの条件下ではIon変異株はあまり生育しないが、htpR変異株の生
育はよく、従って発現した外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の収量を
増加させるため組換えDNA技術における宿主生物として明らかな利点を与える
。
P1形質導入を利用して、1工上R変異とIon遺伝子内の変異(たとえばIo
n△100もしくはcapR9等)との両者を含むhtpRIon変異株を作成
した。これらの二重変異株は、不安定なプロテアーゼの生産が減少し、どちらか
一方の変異のみをもつ菌株に比べて異常タンパクの分解能が劣っている。これら
の二重変異株によるタンパク分解の欠点は、既知のいずれの菌株よりも顕著であ
る。これらの二重変異株は、培養で高細胞宙度を達成する生存力のある宿主であ
る。htpR変異株と同様、それらはIon変異株が示すようなムコイド伏或い
は他の不健全な特性を示さない。
このように本発明の!LLLR上上ユ変異株は、通常では急速な細胞内分解を受
けるような遺伝子操作技術によって作成されたタンパクの大規模生産に特に有益
である0本発明によれば、外来性タンパク、ポリペプチドもしくは他の産物は、
用いて外来性タンパク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするDNA配列
を特徴とする組換えDNA分子で形質転換された宿主を培養し、この宿主はプロ
テアーゼ遺伝子の発現に欠陥があることを特徴とし、培養物から産生物を収集す
ることによって生産される。さらに、外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産
物は、htpR遺伝子産物の産生もしくは機能に欠陥があるような宿主を用い、
外来性タンパク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするDNA配列を特徴
とする組換えDNA分子で形質転換された上記宿主を培養することによっても生
産しうる。
本発明の変異株は、組換えDNA配列が任意公知の技術により導入されかつタン
パク、ポリペプチド及び池の産物として発現される宿主細胞として有利に利用し
うる。この変異株の外来性もしくは他の異常ポリペプチドの分解能の減少により
、組換えタンパク及び他の産物が高収量で生産できる。例えば、本出願人の実験
データによれば、工上工Rエユユ変異株内で生産された遺伝子操作技術を用いて
作成された組織プラスミノーゲン活性因子は、野生型宿主細胞の場合と比較して
3〜5倍に収9が増加する。
本発明の方法は大腸菌、m菌、酵母、カビ、動物もしくは植物または他の宿主生
物を含む原核及び真核宿主中での外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の
生産に適用できる。
ヒート・ショック応答は、高温という不利な吹成から細胞を防御するための普遍
的な機構であると思われる〔アシュバーナー等、前出〕、従来示唆されているよ
うに(S、ボッ等。
前出〕、ヒート・ショック応答は、異常タンパク分子の蓄積から細胞を防御する
ための一般的な機構であると思われる。
プロテアーゼLaに類似したATP依存性プロテアーゼをサルモネラ・ティフィ
メウリウム(Salmonella typhimeurium )゛ や枯草
M (Bacillus 5ubLilis )等の他の細菌でも観察した。
1o旦変異株は、サルモネラ・ティフィメウリウムで検出されている。従って、
大腸菌で見られるのと同様な異常もしくは外来性タンパクの分解機構はすべての
原核生物で見い出されうる。この機構はさらに真核生物にも存在する。プロテア
ーゼLaと同様の酵素が、哺乳動物細胞のミトコンドリア中(M、デザウテルズ
及びA、 L、ゴールドバーグ、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第257巻、第m胞の細胞質中(L、ワックスマン等、ジャーナル・オプ
・バイオロジカル・ケミストリー(1985)、段積中〕で見い出されている。
これら他の生物でのそのようなti構の存在により、大腸菌に存在するプロテア
ーゼLa遺伝子には能的に対応する遺伝子の欠損を持ちかつここで述べた変異生
物と同様に外来性産物の分解能が減少した類似変異宿主生物を作製するため、本
発明の方法を使用することができる。
さらに、各種の発現ベクターを、本発明の宿主を形質転換するのに用いうる。例
えば、有用な発現ベクターは染色体の断片、非染色体及び金成りNA配列などが
あり、例として種々の既知のSV40の派生物、colEl、pcRl、pBR
322、pMB9及びそれらの派生物を含む大腸菌のプラスミド、より広い宿主
域をもつRP4等のプラスミドなどの既知の細菌性プラスミド、NM989等の
多数のλファージの派生物1M13及び繊維状(Filamentous )−
重鎖DNAフ1−ジ等の他のDNAフプージなどのファージDNA、他の発現制
御配列、もしくは2μプラスミドやその派生物のような酵母プラスミドを用いて
修飾したプラスミドのようなプラスミドとファージDNAとの組合せに由来する
ベクター等とすることができる。特に好ましい発現ベクターは、多コピー数プラ
スミドもしくはバクテリオファージ派生物である。なぜなら、そのようなベクタ
ーは発現タンパク収量を増加させるからである。
同様に、種々の発現制御配列も、クローン化DNA配列の発現効率(転写と翻訳
)を向上させるために有用である。これらの発現制御配列には主に2つの型があ
り、1つは構成的発現制御配列であり、もう一方は制御可能な発現制御配列であ
る。β−1acのような構成的発現制御配列は、クローン化DNA配列を発現さ
せてそのDNA配列により、コードされる産物を生産するよう宿主細胞の生育中
、絶えず機能する。
trp、λPL、もしくはλP之のような制御可能な発現制御配列は、宿主細胞
の生育の間に調節しくすなわち切換え)うるので、クローン化されたDNA配列
の発現を培養の生育サイクル中の最適時に発現するようにすることができる。た
とえば、制御可能な発現制御配列は、宿主が遺伝子産物を過度に蓄積せずに繁殖
するように発現を停止させることができ、次いでこれらの発現制御配列の制御下
に多量の所望タンパク産物の発現を促進するように発現を開始させうる。正常な
無毒の遺伝子産物でさえ過剰生産すると宿主細胞に害を与えかつ特殊な宿主−ベ
クター系の安定性を(圧下させるので、制御可能な発現制御配列はしばしば宿主
細胞の生育の間発現を調節するのに好都合である。
いくつかの制御可能な発現制御配列を使用して宿主生物でタンパクやポリペプチ
ドをコードするDNA配列及び遺伝子を発現することができる。これらには、た
とえば大腸菌のラクトース・オペロンのオペレーター、プロモーター及びリポソ
ーム結合・相互作用配列〔たとえば、K、イタクラ等、「ソマトスフチンホルモ
ンの化学合成した遺伝子の大腸菌における発現」、サイエンス、第198巻、第
1056−63頁(1977);D、v、ゴーデル等8 「ヒトインシュリンの
化学合成した遺伝子の大腸菌における発現」、プロシーディンゲス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス USA、第76巻、第106−10頁
(1979))。
大腸菌のトリプトファン・オペロンの対応配列(J、 S、エムテージ等、「イ
ンフルエンザ抗原決定因子は大腸菌にクローン化したヘマグルチニン遺伝子から
発現する」、ネイチャー、第283巻、第171−74頁(1980)、 J、
A。
マーシャル等、「ヒト成長ホルモン:細菌での相補DNAのクローニング°と発
現」、サイエンス、第205巻、第602−out (1979))並びにλフ
ァージの主要オペレーター・プロモーター領域(H,パーナート等、「バクテリ
オファージλP、プロモーターから得た遺伝子発現を促進するプラスミド・クロ
ーニング・ビークルの作成」、ジーン、第5巻、第59−76頁(1979))
等が含まれる。
本発明の互上上R変異株と皿上且R1ム旦変異株とが高温で外来性タンパクの分
解能を減少するという事実は、温度誘導性の制御可能な発現制御配列と組合わせ
て使用するのに特に好都合である。バタテリオファージλのPLジブロモクー等
の熱誘導性発現配列は、既知の標準的な技術によって所望のタンパクをコードす
るDNA配列と融合させうる。得られた組換えDNA配列を次いでhtpR変異
株もしくは −拡止pRlユ」変異株宿主を形質転換するのに使用できる。
42℃で生育した場合、そのような宿主はその温度で発現を遂行する温度誘導性
発現制御配列によって、所望のタンパクもしく・は産物を高程度に発現する。さ
らに、所望のタンパクくは産物の分解能が減少したためにさらに増加する。これ
らの上上上R変異株及び五誌」−R1o工変異株中では、野生株を宿主とした場
合と異なり、高温時もしくは細胞内での外来性タンパクの生産時におけるタンパ
ク分解酵素の増加が起異株もしくはhtpRIon変異株とを組合せて使用する
ことは、遺伝子操作技術によって作成されたタンパク、ポリペプチド及び他の産
物の発現を増加させる。しかしながら、htpR変異株とhtpRIon変異株
とは低い温度(たとえば30℃)でも外来性タンパクの分解が減少しているので
、本発明は構成的発現制御配列或いは非温度誘導性発現制御配列を使用して外来
性タンパクもしく1也の産物の発現を増加させることもできることに注目すべき
である。
本発明の宿主生物及び方法は、多種のタンパク及びポリペプチドの生産に応用し
うる。加えて、本発明の方法は、収量が酵素の高いレヘルに依存する分解をうけ
やすい他の産物の生産を増加させるために用いうる。たとえば、ワクチンの活性
成分や他の医薬上活性のある産物、農業上もしくは他の産業上有用な組成物、酵
素、ホルモン、アミノ酸、工業薬品。
抗生物質1食品等の産物を本発明の方法によって有効に生産しうる。本発明の方
法によって生産されうる他の産物には、白血球インターフェロン、繊維芽細胞イ
ンターフェロン及び他のインターフェロン、免疫活性もしくは生物活性を示すポ
リペプチド、FMDVウィルス抗原もしくはB型肝炎ウィルス抗原の抗原性を有
するポリペプチド、ツマトメディンCやブロイ・ンソユリンのようなヒトもしく
は動物ホルモンの生物活性を示すポリペプチド、並びにヒト動物もしくはウィル
ス産物の免疫活性もしくは生物活性を示すポリペプチド及びタンパク等が含まれ
る。特定の産物の選択は本発明の一部ではない。むしろ、本発明は、そのような
産物をコードするDNA配列の発現を増加させること並びに本発明の変異宿主生
物中でそのような産物を生産することに一般に応用しうる。
子が除去されている宿主細胞に挿入しうろことも了解すべきである。これらの宿
主細胞を次いで、組換えD N A分子才なわち所望タンパクをコードするDN
A配列で形質転換させて、これらのタンパクを高収量で産生しうる。
また、本発明は、二重工RもしくはIony伝子またはその組合せ内に多数のお
こりうる変異のいずれかを含む宿主生物を包含することを了解すべきである。そ
のような変異株は、T、トベ等による「大腸菌におけるタンパクのヒート・ショ
ック誘導を欠損した温度感受性変異株の単離及び物理的マツピング」、モレキュ
ラー・ジェぶラル・ジェネティクス、第195巻、第10−16頁(1984)
に見られるようなヒート・ショック応答の新しい欠損株を作成するための標準的
突然変異誘発および選択技術を利用して得ることができる。
さらに、本発明の方法は、ヒート・ショック・タンパクの誘導が欠損した変異株
のような外来性タンパクの分解能の減少を示すDNA配列内の池の変異を有する
大腸菌株中で外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物を生産するのに応用し
うる(K、H,ビ・−り、「L二重A変異株における高温でのヒート・ショック
・タンパクの誘導の欠損」、「アブストラクト・オプ・ペイバーズ・プレゼンテ
フド・アット・ザ・バクテリオファージ・ミーティングj、M151頁、コール
ドスプリングハーバ−研究所版、コールド スプリング ハーバ−ニューヨーク
(1984)参照〕。
本発明をより良く理解するため、以下に実施例を示す。これらの実施例は例示の
みを目的とし、あらゆる意味で本発明の範囲を限定するものではない。
方法を例示するものである。
大vA苗の細胞(30900株、非サプレッサー、Io工′成をしないバクテリ
オファージであり、かつC■遺遺伝円内TnlOトランスポゾンを有するλNK
55を感染させた。
TnlO)ランスボゾンは、9300塩基対のトランスポゾン可能なりNA断片
であって末端に逆反復配列を有し、大腸TnlOはテトラサイクリン耐性遺伝子
をもっておりかつトランスボッ゛ン自身がバクテリオファージT6レセブタをコ
ードするし工Δ遺伝子に挿入するので、TnlOの挿入物を有する大腸菌細胞を
テトラサイクリン耐性でありかつT6フアージ耐性である。従って、λND55
感染細胞はテトラサイクリン耐性で選抜し、これらのコロニーをさらにT6フア
ージに対する耐性で選択した。大腸菌の二土旦遺伝子はtsx遺伝子の近くに位
置しているので、その結果分離株はtsx:TnlOのテトラサイクリン耐性マ
ーカーに連鎖したし」遺伝子を含んでいた。
Jonとtsx:TnlOが連鎖した遺伝子を次にP1形質導入によりIon△
100のようなIoユニー腸菌株に導入した。変異株のと!工遺伝子とP1形質
導入要素の二重Δ: Tn 10との間に交差をもつ細胞を、テトラサイクリン
耐性で選択し、上!」変異株に特有のムコイド表現型にっきスクリーニングした
。得られた分離株は、TnlOのテトラサイクリン耐性マーカーに連鎖した一L
エユ変異株であった遺伝子に変異をもつ二重変異株を作成するために、上記分離
株のIon−:tニュ′配列を大腸菌株に165もしくは株をテトラサイクリン
耐性でまず選抜し、次いで温度感受性株にl o n−遺伝子を導入して作成し
たが、逆の順序の作成、すなわちloニー株にL二zR−遺伝子を導入して作成
してもよいことは明らかである。
二重変異株であり、本発明に従って大腸菌で産生される遺伝子操作技術を用いて
作成された外来性タンパクの収量を増加させるために用いられる。同様に、1o
nR9htpR−である大腸菌株SG936及び30928を作成して本発明に
開示された方法に従い使用することもできる。
実施例2
htpR変異株中のタンパク分解の測定以下の実施例は、本発明の変異株中での
タンパク分解を測定する方法を例示したものである。
測定すべき変異株の培養を、好ましくはM9最小培地中で一晩行なう(J、H,
ミラー、「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス」、(コー
ルド スプリングハーバ−研究所(1981))、午前中、10m1の培#物を
クレット・フラスコに入れ、好ましくは菌がよく増殖したことを確認するために
少なくとも二世代生育させた。
凹が初期対数増殖期にあるとき、5■/lll1のH20ビューロマイソン(フ
ィルター滅菌) 0.2 ml”0.5 mlヲ各々のフラスコに加えた。細胞
培養物の濃度は、次の20分間が経過した後に中期対数増殖期となるようにした
。各々のフラスコのビューロマイシン最終濃度は100〜250μg/a+1で
あった。ビューロマイシンは、1lll胞の合成途中のポリペプチドに取り込ま
れるタンパク合成■害剤である。しばらくすると、この取り込み番よ、未熟なま
ま終結した異常なタンパクを形成した。そのような短いタンパクは、プロインシ
ュリン等の産業上興味のある多くのクローン化タンパクと同様に、細菌によって
通常急速に分解される(A、L、ゴールドバーグ、プロン−ディンゲス・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第69巻、第2640−44頁(
1972))。
ビューロマイシンの添加後、細胞を37℃で15分間保温した。次いで、lμC
i 3H−アミノ酸/mlを、細胞によって合成されているタンパクを標識する
ために培地に加えた。
(もし細胞をリッチなLB培地中で生育させる場合、32S−メチオニンが適当
な標識であり、4μCi ”S−メチオニン/mlを用いるべきである)、培養
物を放射活性標識とともに30℃で5分間検温した。細胞を直ちにソーパル33
−34型ローターを用いて、40m1の滅菌遠心管中で5000 rp@にて1
分間遠心分離した。上澄を迅速にデカントし、沈殿物を1■/mlの非放射性追
跡アミノ酸を含む2倍容量の培地に再息濁しかつ回動させることによって洗浄し
た。細胞を前記と同様に再遠心分離し、非放射性追跡アミノ酸を含む培地に再懸
濁し、クレット・フラスコに移した。これらのフラスコに移すとき、細胞濃度を
、次の60〜90分間の時間経過後に細胞が定常期とならないよう調節した。
操作のこの段階で、ビューロマイシン処理細胞は、ビューロマイシンを取り込ん
だ合成途中のポリペプチドを含んでおり、標識アミノ酸がそれらの配列内に取り
込まれていた。ピューロマインンによってこれらのポリペプチドはそれらが合成
されていたリポソームから解離し、その結果生じた異常ポリペプチドは細菌細胞
によって分解された。
ある特定の細胞菌株がこれらの不完全なまま終結したタンパクを分解する速度を
51定するため、サンプルを種々異なる培養時間の上澄から採取し、分解過程か
ら生じる遊離の放射性アミノ酸をσTI定した。
t=Qの時点で、2つの0.5 mlサンプルを各々の培養物から採取した。一
方は「総カウント」とし、t=Qにおける全放射性タンパク量を示すものとした
。このサンプルを、100μlの70%TCA ()リクロル酢酸)を含む水冷
しておいた試験管に移した。このサンプルに0.1 mlのH2Oを加えた。
t−Q時に採取したもう一方のサンプルは「ブランク」とし、酸可溶性カウント
、すなわち、t=Q時にサンプル中に存在する遊離の放射性アミノ酸を示してい
た。この0.5 mlサンプルも100μiの70%TCAを含む水中の試験管
に移した。
TCAの最終濃度は好ましくは10%であった。このサンプルにlOOμlのl
O%BSA (ウシ血清アルブミン)を加えた。L=15分、30分、60分及
び90分の時点で、同様の0.5 IIlサンプルを細胞培養液から採取し、1
00μlの10%BSAを含む10%TCAに加えた。
各々のサンプルをTCAi液中中で30分間水冷した。各々のサンプル中の遊離
放射性アミノ酸はTCA中で可溶化され、一方未分解のタンパクは不溶のまま残
り、TCAから沈降した。このように、タンパクの分解を、TCA中に不溶であ
る標識タンパクからTCA中に可溶である遊離放射性アミノ酸への変化を測定す
ることにより決定した。従って、経時的にTCA可溶性カウントの生産を、細胞
内でのタンパク分解速度の指標として利用した。ピエーロマイシンを取り込んだ
タンパクの分解速度は橿めて速いので、上記のTCA沈殿の操作をできるだけ迅
速におこなう必要があることに注意すべきである。
TCAi液中での培養の後、すべてのサンプル(「総カウント」を除く)を磁2
690−ターを用いて、IEC遠心分離で、3500 rpmにて10分間、4
℃で遠心分離し、各々のサンプルの0.4 ml上澄を4mlのリキシント・シ
ンチレーション液中で5分間カウント測定した。各々のサンプルのカウントを用
いて、以下の式に基づきタンパク分解の%を計算した。
式:
タンパク分解%=
平均cps (採取時)−ブランクcps(t=o)×100
総カウントCpH
第2図は、経時的なビューロマイシンを取り込んだタンパクの分解%を示したも
のであり、それぞれ大!!菌野生株細胞(lon”htpR千)対htpR変異
株(lon+ htpR)(グラフ1参照、使用菌株はグラハム・ウォーカー博
士より寄贈の5C122(htpR)及びK165(htp変異は、タンパク分
解パーセンテージをかなり減少させた。
上記の例はビューロマイシンの取り込みによって生した短族体を含む完全長さの
異常タンパクの急速な分解に従って示された。操作手順は、上記と同様であった
。中期対数増殖期に、M9培地で一晩生育させた細胞を遠心分離し、アルギニン
を含まない培地に再懸濁した。カナバニン(すなわちアルギニンのアミノ酸同族
体)を最終濃度が0.6mMになるように加えた。15分後、10−20μCi
の3H−フェニルアラニンを加えた。5分後、培養物を遠心分離し、0.6mM
のアルギニンと非放射性フェニルアラニンを0.5−1.0■/mlの濃度で含
む培地に再E濁した0次いで、その培養物を再遠心分離し、同じ培地に再で濁し
た。
ビューロマイシン決定について述べたのと同じ方法で培養物からサンプルを採取
し、カナバニン含有タンパク%を同じ式により決定した。第3図は、経時的なタ
ンパク分解%を示したものであり、大腸凹野生株(ton htpR)対用菌株
はグラハム・ウォーカー博士より寄贈のGWlooO(htpR)及びGW47
01(h仁PR−))、及び種々の変異株と一匠工p−R二ム二二重変異株での
タンパク分解(グラフ2及び3参照)を示している。野生株及びton変異株の
両者で、htpR変異は明らかにタンパク分解を減少した。さらに、二重変異株
、すなわちhtpR及びIon変異の両者を有する菌株は、htpR変異のみを
有する菌株よりも分解がさらに減少しており、この二重変異が身ンパク分解に対
し成る付加的影響を与えることを示した。
以下の実施例は、遺伝子操作技術によって作成された外来性タンパクである組織
プラスミノーゲン活性因子を産生させるよう誘導した宿主内でプロテアーゼLa
をコードするlono伝子の発現が増加したことを示すものである。しかしなが
ら、htpR変異をもつ大揚薯宿主は、このような発現の増加を示さなかった。
二重二遺伝子の発現がなされているかどうかを簡単に検出するために、Janプ
ロモーター配列をβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子である二エエZに作用結合
させてなる三重ニー1acZオペロン融合配列を作成した。lo立ジブロモクー
が作動している時、β−ガラクトシダーゼが生産され、簡単に検定されうる。こ
のIon−lac融合配列を、バクテリオファージλ中に挿入し、宿主の染色体
に組込ませた0次いで、TPA遺伝子をもつプラスミドを同じ宿主に導入し、T
PAを生産するように誘導することにより、β−ガラクトンダーゼ活性の形で示
されるto旦遺伝子の発現を測定した。
二重cZ遺伝子に作用結合させたloユプロモーターを含むDNA配列を、以下
のように、大腸菌株5C122(F−工ac (am)、trp (am)、p
ho (am)、maユゼーンバウアー等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー。
第143巻、第852−63頁(1980))とオペロン融合ベクターpMLB
1022 (T、J、シルバービー等。
「エクスペリメント・ウィズ・ジーン・フュージョン」2 コールド スプリン
グ ハーバ−研究所、コールド スプリング ハーバ−ニューヨーク(1984
)EをEcoRIとBamH1制囚エンドヌクレアーゼにューイングランドバイ
オラボ社)で切断し、これらDNAをT4DNAリガーゼの存在下で混合した。
I)MLB1022はアンピノリン酎性遺伝子と、ガラクトースの醗酵に関与す
る酵素であるβ−ガラクトシダーゼをコードする1acZ遺伝子とを含んでいる
が、このプラスミドは二土二Z構造遺伝子の転写に必要なμg/mlのアンビン
リンを添加したマツコンキー・ガラクトース・プレートで平板培養した。pML
B1022(7)l1二Z遺伝子の上流にpJMc40のJanプロモーターを
含むプラスミドで形質転換された細胞のみが、β−ガラクトシダーゼを産生ずる
ことができ、マンコンキー・ガラクトース・プレートで赤いコロニーとして出現
する。このように、プレート上で赤いコロニーを形成するアンピシリン耐性コロ
ニーを分離、シた。これらのコロニーの1つからプラスミドDNAをとり、制■
エンドヌクレア°−ゼマフビングとアガロースゲル電気泳動法とで分析し、Ja
n−1acオペロン融合配列を含むことが判明した。このプラスミドはpsG1
021と名付けた。
次いで、EcoRIで制限しておいたλNF1955 (1゜フイ等、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー、第152巻。
第1022−32頁(1982))由来のλDNAにまずこの融合配列を挿入す
ることによって、大腸菌宿主細胞の染色体にこの融合配列を組み込んだ。結合反
応を、100μg/11のλNF1955DNAと3μg/国IのプラスミドD
NAとを用いて、プラスミドDNAに対するλDNAの高濃度にて行なった。こ
の末端−末端の高濃度により、結合混合液中の組換えλDNAのコンカタマーが
形成される。この結合混合液を、次いでイン・ビトロ・パフケージング法を用い
てλ粒子内にバフケージングしたCB、ホーン等、プロシーディンゲス・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス[JSA、第71巻、第2372−
76頁(1974))。
lacの欠失をもつλ感受性大腸菌細胞にこれらの組換えファージ粒子を感染さ
せ、β−ガラクトシダーゼと反応して青いプラークを形成させる物質であるX−
Ga1(5−ブロム−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシ
ド)を50μg/mlの濃度で添加したTB(バクトドリブトン)培地に塗抹し
た。青いプラークを分離し、精製λDNAの制限酵素分析によって1on−1a
cオペロン融合配列の存在を確認した。
λNF1955は安定なf6原菌を形成しないし、サプレッサー菌株内でのみ生
育できるので、組換えファージ粒子を野生型λファージと交差させ、50μg/
mlのX−Ga1を含むTB培地にて37℃で非サプレッサー細胞を平板培養し
、濁った青いプラークをスクリーニングした。融合配列を含むファージは安定な
溶原菌を形成できるので、この方法で分離し、λシグマガンマ101と名付けた
。
大腸菌株5C122(hLpR+)とに165(htpR−)とを、λシグマガ
ンマ101で溶原化させるためにmal”で形質導入し、次いでX−Ga1を含
む培地に塗抹した。λの追いうち感染に耐性のある青いコロニーを分!した。
この方法で分離された2つの菌株を大MMilS C122由来のものにつき大
腸菌5G943 (htpR+)と名付け、大腸菌に165由来のものを大B’
A菌5G942 (htpR−)と名付けた。
たhtpR細胞とhtpR−細胞におけるIono伝子の発現
ton−lac融合体をもつ菌株5G943及び5G942を、次いで組織プラ
スミノーゲン活性因子をコードするD N A配列をもつプラスミドp TPA
1.02 (pTPA 102を含む大腸菌株は1984年8月27日にメリ
ーランド州ロフケビル在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄
託され、受託番号はATCC39810である)で形質転換した。pTPA10
2は、プラスミドpMC9に由来しくR,A、ヤング等、「抗体プローブを用い
た効果的な遺伝子の分離法J、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス USA、第80巻、第1194−98頁(1983)
)、周知の操作技術を用いて、二重二プロモーター(Lニヱからの一35領域と
LL二からの−lO領域)の制御下にTPA遺伝子を含むようにしたものである
。
pTPA102を大腸菌株5G943及び5G942の各々を形質転換するため
に用い、各菌株を培養して2つに分けた。
各々の凹株から分けた一方に、工二重プロモーターの誘4 ’f11質であるI
PTG(イソプロピルチオ−β−D−ガラクトピラノンド)を1mMの濃度にな
るように加えた。もう一方は各々未誘導のままにしておいた。細胞を30℃で1
時間保温した後、I PTGを除去するためにろ過によって洗浄した。
各々の分取分で産生されたβ−ガラクトシダーゼのレベルを、オルト−ニトロフ
ェニル−β−D−ガラクトピラノシド(ングマ社)の分解をO,D、 で検出す
ることによって渕2牛Q
定した(J、H,ミラー、「エクスベリメント・イン・モレキュラー・ジエネテ
ィクス」、第431頁、コールド スプリング ハーバ−プレス社(1972)
)、5G943株(htpR”)は、30℃で経時的にβ−ガラクトシダーゼ活
性の増加を示したのに対し、5G942株(htpR)はβ−ガラクトシダーゼ
活性の増加を示さなかった。
これらの結果により、プロテアーゼLaの発現を制御するJanプロモーターは
TPAタンパクをコードするDNA配列で形質転換した宿主内でTPA生産が誘
導されることによって作動することが示される。しかしながら、htpR変異株
は、このような発現の増加を示さない。
におけるいくつかのヒート・ショック・タンパクの:誘導およびhtpR変異株
におけるこの誘導の欠損TPA遺伝子を含むpTPA102を、前述のように大
腸菌株5G943及びSG942に形質転換させ、各々の菌株の細胞を等量で2
分画した。各々の菌株から採取した一方は、TPAを生産させるために、前述の
ように30℃で1時間I PTOを添加することによって誘導した。もう一方は
、IPTGの添加なしに、すなわち未誘導のまま30℃で1時間保温した。次い
で、細胞をろ過して洗浄した後、′S−メチオニン(>40Qci/mmol、
ニューイングランドヌクレア社)を2μci/mlの濃度で含むMOPS培地に
再1ε濁し、5分間パルス標識した。次いで、全細胞タンパクをTcA6gによ
って細胞から抽出し、先ず、10%TCAで洗浄した後、5%TCAで洗浄し、
次いでエタノール/エーテルのl:1溶液で1先浄した。タンパクを真空乾燥し
、1xsosサンプルffl?E液に再訂濁し、7〜15%リニア・グラジェン
ト・ポリアクリルアミドゲルにかけて分析した。典型的なヒート・ショック応答
を示すため、大腸菌SG943及び5G942細胞(pTPA102で形質転換
されていないもの)を上記と同様に30℃と42℃とにおいてパルス標識した。
′4胞を42℃で生育させる場合は、細胞を30℃から42℃に移して、5分間
生育させからパルス標識した。
未形質転換の二重pR細胞を30℃と42°Cとで生育させた場合のオートラジ
オグラフを比較すると、42℃では多数のヒート・ショック・タンパクの生産が
見られた(しかしながら、30℃では見られなかった)。30℃にてI PTG
で誘導したTPAを含むht工R細胞からのオートラジオグラフは、42℃に移
して生育させた(すなわち典型的なヒート・ショック応答) 垣とLR細胞のオ
ートラジオグラフで観察されるヒート・ショック・タンパクのいくつかと対応す
る4〜5 ftのタンパクを示した。これらの4〜5種のタンパクは、I PT
Gて誘導したTPAを含むhtpR!il!胞のオートラジオグラフにも現われ
てなかったし、また42℃に移して生育させたht上Rm胞のオートラジオグラ
フに現われたどのヒート・ショック・タンパクでもなかった。このデータは、h
tpR細胞内でヒート・ショックにより誘導されるタンパクの少なくとも数個が
30℃におけるTPAの産生によっても誘導されるが、これらのタンパクの誘導
は当業界で周知された技術により大MMiJの野生株MC1061゜土ユ」変異
株であるSG2041及びhtpRIon二重変異株であるSG935にプラス
ミドpTPA102を形質転換させた。m胞をLB培地中で0.D、が0.5に
なるまで生育させ、IPTGt−1mMの濃度になるように添加し、0.5〜1
時間培養した。11胞を遠心分離し、SDSサンプル緩衝液に再g3mし、10
分間g4した後、5DS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動したやゲルをニト
ロセルロース紙にプロ、トして、ゲルから紙へバンドに分れたタンパクを移した
。
次いで、紙をTPAに対するウサギ抗体(ヴオルフーディーター・シュロイニン
ク博士の寄!りで処理し、次いで、さらにヤギの抗ウサギ抗体で処理した(この
2番目の抗体は西洋ワサビのパーオキシダーゼで結合させである。バイオランド
社)、これらの抗体は、フィルター紙のTPAタンパクのバンドがある部分に結
合した。TPAバンドを検出するために、フィルター紙を、H2O2にさらし、
紙上のTPAバンドがある部分を変色させた(ウェスタン・プロット法参照)、
この手法を用いて、1二pRIon二重変異株では野生株に比べて組織プラスミ
ノーゲン活性因子の収量が3〜5倍に増加したことを示した。
実施例6
1 o n及ヒh t p R変異株におけるソマトメジンCの発現以下の実施
例は、ヒトのホルモンであるソマトメジンC(SMC)を、以下のようにSMC
をコードする遺伝子を有するプラスミドで形質転換したto旦変異株、五二iR
変異株及びIon htpR変異株の各宿主細胞において、42℃での蓄積を示
すものである。たとえば、pPLmuSMCOr’i もしくはpPLmuSM
C2(それらはSMC1i伝子を宵する)とpCIt57 とを大腸菌株HBI
OI、SC;931 (野生株)、30933 (Ion−)、30934(h
tpR−)及び5G936 (Ion−、htpR−)のそれぞれに導入した。
これらの菌株を、ヒート・ショック応答を誘導させるために42℃で2時間保温
し、各々の菌株からの大vA苗抽出物をSDSポリアクリルアミドゲルにかけク
マシープルー染色してSMCの蓄積を検出した* pPLmuSMC及びpcI
を有する5種の菌株の放射性or’i t57
免疫分析により、上記の各々のSMCの産生比率は1:1:3:15:33であ
ることが示された。従って、IonhtpR変異株は最も大量のSMCを蓄積し
、2つの変異は相乗効果があった。同様の効果が、pPLmuSMCを有する菌
でも観察された。その場合、SMCの比率は5種のそれぞれの菌株について1
:11.6 :2.3 :4.1であった。ここでも、fan 垣と、LR変異
株は最も大量のSMCを蓄積し、2つの変異は相乗効果があった。
また、ゲルのオートラジオグラフィーによって検出されるパルス追跡についても
研究した。細胞をシフティン以外のすべてのアミノ酸を添加したM9最小培地中
で28℃にて一晩培養し、次いで同じ培地中で42℃にて誘導した。培養中の細
胞を〔35S〕−システィンで30秒間標識し、次いで過剰の非標識システィン
を培地に加えて追跡巳た− pPLmu3MC2をもつH8101株はppLm
us\イC、をもっH8101株に比べてSMCに約4ffiの:3sS)−シ
スティンを取り込んだ、野生株であるHBIOIを宿主とした場合、SMCの半
減期は5分間もしくはそれ以下であり、SMCは60分後の追跡では殆んど検出
されなかった。これに対し、二重二 y±pR変異株を宿主と巳た場合、半減期
はおよそ60分間であった。
本明細書中に記載した工程によって4製された微生物はメリーランド州ロックビ
ル在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された培養物によ
って例証される。
1984年5月5日に寄託された培養物は、以下のように同定される:
培養物5G935 :ATCC39623培養物5G936 :ATCC396
241984年5月6日に寄託された培養物は以下のように同定される;
培養物5G927 :ATCC39627培養物5G928 :ATCC396
28本出願人はここまでに本発明のいくつかの実施例を示したが、本発明の基本
的な構成は、本発明の方法及び組成物を利用目的に応じて改変しうろことが明ら
かである。従って、本発明の範囲は、以上に実施例として示した特定の実施例の
みに限定されない。
タシノ()分解(X)
タシペク分科(%す
国際調丘報告
管9電1−―岬mlシ喝−^1−−^−C1喀)−−すN−喝、PCT/US8
S100!86
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.組換えDNA分子内の発現制御配列に作用結合した外来性タンパク、ポリペ プチドもしくは他の産物をコードするDNA配列を含む組換えDNA分子によっ て形質転換された宿主を培養し、上記宿主がプロテアーゼ遺伝子の発現の欠損を 有することを特徴とする外来性タンパク,ポリペプチドもしくは他の産物の生産 方法。 2.宿主がhtpR遺伝子産物の産生もしくは機能に欠損を有する請求の範囲第 1項記載の方法。 3.宿主生物を大腸菌(E.coli),サルモネラ(Salmonella) バチルス,酵母.他の菌類.動物もしくは植物細胞または他の原核もしくは真核 宿主生物より成る群から選択する請求の範囲第1項または第2項記載の方法.4 .宿主生物が大腸菌の菌株である請求の範囲第1項または第2項記載の方法。 5.宿主をhtpR変異株及びhtpR lon変異株より成る群から選択する 請求の範囲第1項または第2項記載の方法。 6.htpR lon変異株宿主をSG927,SG928,SG935,SG 936より成る群から選択する請求の範囲第5項記載の方法。 7.DNA配列を、白血球インターフェロンの免疫活性もしくは生物活性を示す ポリペプチドをコードするDNA配列,繊維芽細胞インターフェロンの免疫活性 もしくは生物活性を示すポリペプチドをコードするDNA配列、他のインターフ ェロンをコードするDNA配列,FMDVウイルス抗原の抗原性を有するポリペ プチドをコードするDNA配列,B型肝炎ウイルス抗原の抗原性を有するポリペ プチドをコードするDNA配列,プロインシュリンや他のヒトもしくは動物ホル モンの生物活性を示すポリペプチドをコードするDNA配列,並びにヒト,動物 もしくはウイルス産物の免疫活性もしくは生物活性を示す他のポリペプチド及び タンパクをコードするDNA配列より成る群から選択する請求の範囲第1項また は第2項記載の方法。 8.DNA前列がソマトメジンC.の生物活性を示すポリペプチドをコードする 請求の範囲第1項または第2項記載の方法。 9.DNA配列が組織プラスミノーゲン活性因子の生物活性を示すポリペプチド をコードする請求の範囲第1項または第2項記載の方法。 10.発現制御配列が温度誘導性発現制御配列である請求の範囲第1項または第 2項記載の方法。 11.SG927,SG928,SG935及びSG936より成る鮮から選択 される宿主。 12.ゲノム内に1on,htpR二重変異を有する大腸菌宿主生物。 13.組換えDNA分子内の発現制御配列に作用結合した外来性タンバク,ポリ ペプチドもしくは産物をコードするDNA配列を含む組換えDNA分子によって 形質転換された請求の範囲第11項または第12項記載の宿主。
Applications Claiming Priority (3)
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