JP3344618B2 - シャペロン発現プラスミド - Google Patents
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Description
ラスミドに関する。さらに詳しくは、DnaK、Dna
JおよびGrpEのシャペロンをコードするオペロン、
該オペロンを有する発現プラスミド、該プラスミドを外
来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる
共形質転換菌および該共形質転換菌を用いる外来蛋白質
の製造方法に関する。
宿主ベクター系の研究が最も進んでおり、多くの高発現
ベクターが開発されるなど、異種蛋白質を安価にかつ収
率よく生産するための宿主として最適であることから、
大腸菌の宿主ベクター系は異種遺伝子の発現系として最
も広く利用されている。
蛋白質は大腸菌内で高発現させると、細胞質内で会合し
生物学的に不活性な不溶性の封入体と呼ばれるアグリゲ
ートを形成する。封入体の形成は、発現蛋白質を宿主菌
体内の蛋白質分解酵素による分解から保護し、また遠心
分離により菌体から容易に分離することを可能ならしめ
るという利点を持つが、目的である生物学的に活性な蛋
白質を得るためには、封入体を変性可溶化した後、再生
(リフォールディング)する必要がある。この可溶化・
再生の操作は、個々の蛋白質ごとに試行錯誤を繰り返し
経験的に行われているが、満足な回収率が得られないこ
とが多いばかりか、必ずしも再生できるとは限らない。
また、大腸菌でプロテアーゼにより分解を受けて、高い
発現量に達しない異種蛋白質も少なくない。このような
発現産物の不溶化や分解に対する解決手段はまだ十分に
確立されたとは言い難く、大腸菌で生物学的に活性な蛋
白質を大量に生産することには必ずしも成功していない
のが現状である。この問題を解決するために、シャペロ
ン等を共発現させることが試みられており、いくつかの
報告がなされている。
白質の折り畳み(フォールディング)に協調して働くシ
ャペロンである。まず、DnaJが、基質である折り畳
まれていない蛋白質に結合すると、DnaK上のATP
が加水分解され、折り畳まれていない蛋白質−DnaJ
−DnaK(ADP結合型)複合体を形成し、次に、G
rpEによって、ADP/ATP交換が起こり、基質蛋
白質が複合体から遊離すると考えられている[Szabo, A.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10345-1034
9(1994)]。
aJ遺伝子は同一オペロン上にあるが、grpE遺伝子
は離れて存在する。これまで、DnaK単独またはDn
aKおよびDnaJを目的蛋白質と共発現させた例[Blu
m, P. et al., BioTechnol.10, 301-304(1992); Perez-
Perez, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.210,
524-529(1995)]、DnaJ単独を目的蛋白質と共発現さ
せた例(特開平8−308564号公報)、DnaKお
よびDnaJとGrpEとをそれぞれ別のプラスミドか
ら発現させた例[Caspers, P. et al., Cell. Mol. Bio
l. 40,635-644(1994)] ならびに同一プラスミドからD
naKおよびDnaJとGrpEとを同じプロモーター
を用いて独立に発現させる例[Stieger, M. & Caspers,
P., Immunology Methods Manual, 39-44(1997)] が知ら
れてるが、これらの方法にはそれぞれ次のような問題点
がある。
DnaJおよびGrpEは、同時に共発現させた方が効
果が大きいと考えられ、DnaK単独またはDnaKお
よびDnaJだけを発現させても本来もっているシャペ
ロン機能を十分に発揮させていない可能性が高い。ま
た、DnaKおよびDnaJとGrpEとを別のプラス
ミドから発現させる方法では、目的蛋白質の発現プラス
ミドとあわせて計3つのプラスミドを大腸菌内に共存さ
せることが難しいことから、GrpEと目的蛋白質の遺
伝子を1つのプラスミドにのせており、個々の目的蛋白
質に応じて、発現プラスミドを構築しなければならな
い。しかも、GrpEと目的蛋白質の発現に同じプロモ
ーターを利用していることから、目的蛋白質の発現量を
十分に高められないという欠点もある。さらに、同一プ
ラスミドからDnaKおよびDnaJとGrpEとを同
じプロモーターを用いて独立に発現させる方法は、同じ
プロモーターが2個重複して存在していることから、プ
ラスミドの安定性にも問題がある。
ために、プロテアーゼ変異株を宿主大腸菌として用いる
ことが知られており、例えば、Lonプロテアーゼの欠
失変異株等が好んで用いられる。さらに、Lonおよび
Clpプロテアーゼの発現誘導は、rpoH遺伝子がコ
ードするσ32により制御されていることから、かかるプ
ロテアーゼ活性を抑制するため、rpoH変異株を用い
る発現方法が知られている(特表昭61−501307
号公報、国際公開第85/03949号パンフレッ
ト)。また、clpPX遺伝子およびlon遺伝子の二
重変異株を用いる外来蛋白質の安定発現方法も知られて
いる(特開平8−140671号公報)。
rpE、GroELおよびGroES等のシャペロンの
発現誘導も制御している。GroELおよびGroES
が大腸菌の生育に必須で、rpoH欠失変異株は20℃
を越える温度では増殖できないことから、従来、rpo
H変異株(htpR変異株)としては、ミスセンス変異
が用いられてきた。しかし、より完全にLonおよびC
lp等の種々のプロテアーゼの発現誘導を抑えるために
は、rpoH欠失変異株を用いることが望まれる。
するために、外来蛋白質をGroELおよびGroES
と共発現させることにより、可溶化することに成功した
例が多く知られている。例えば、チロシンキナーゼ[Cas
pers, P. et al., Cell Mol.Biol. 40,635-644(1994);A
mrein, K. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA92,
1048-1052(1995)] 、グルタミン酸ラセマーゼ[Ashiuch
i, M. et al., J. Biochem. 117,495-498(1995)]、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素[Dale, G. E. et al., Protein. Eng.
7,925-931(1994)] 等が挙げられる。さらに、DnaK
の共発現でヒト成長ホルモンの溶解性が向上した例[Blu
m, P. et al., Biotechnol. 10,301-304(1992)] やDn
aJの共発現でトランスグルタミナーゼが可溶化した例
[ 特開平8−308654号公報] 、DnaK、Dna
JおよびGrpEの共発現によりチロシンキナーゼが可
溶化した例[Caspers, P. et al., Cell Mol. Biol. 40,
635-644(1994)]が知られている。しかし、どの外来蛋白
質に対してどのシャペロンをどの程度共発現させればよ
いかということを予測することはできない。
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、大腸
菌の菌体内で外来蛋白質を安定化かつ可溶化させて発現
するために用いられるシャペロンをコードするオペロン
を提供することにある。本発明の他の目的は、かかるオ
ペロンを有する発現プラスミドを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、かかるプラスミドを外来蛋
白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる共形
質転換菌を提供することにある。本発明のさらに他の目
的は、かかる共形質転換菌を用いる外来蛋白質の製造方
法を提供することにある。
技術に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、dnaKdnaJ
遺伝子とgrpE遺伝子とを連結し、1つのオペロンと
して1つのプロモーターの制御下に発現させるプラスミ
ドを構築した。そして、かかるプラスミドを用いて、大
腸菌においてDnaK、DnaJおよびGrpEを発現
させることにより、DnaK/DnaJ/GrpEシャ
ペロンシステムによる蛋白質のフォールディングをより
効率化することに成功した。さらに、groESgro
EL遺伝子を別のプロモーターの制御下に前記と同一の
プラスミド中に挿入し、プロテアーゼ変異株やrpoH
変異株を含む大腸菌において発現させることにより、大
腸菌における主要なシャペロンシステムであるDnaK
/DnaJ/GrpEシステムとGroEL/ESシス
テムの両方を強化し、目的蛋白質のフォールディングを
いっそう効率化することに成功した。特に、rpoH変
異株の増殖にも必要なGroELおよびGroESを補
い、適切な量のDnaK、DnaJおよびGrpEを共
発現させることが可能となり、その結果、目的蛋白質を
安定化させかつ可溶化させることに成功した。
ンをコードし、かつ該シャペロンが、1つのプロモータ
ーの制御下に支配されたものである、人工オペロン、 (2) 該プロモーターが、誘導可能なプロモーターで
ある、前記(1)記載の人工オペロン、 (3) 誘導可能なプロモーターが、lac、trp、
araBおよびPzt−1からなる群より選ばれた前記
(2)記載の人工オペロン、 (4) 前記(1)〜(3)いずれか記載の人工オペロ
ンを有し、DnaK、DnaJおよびGrpEを発現す
るプラスミド、 (5) 誘導可能なプロモーターに接続したgroEオ
ペロンをさらに含んでなり、DnaK、DnaJ、Gr
pE、GroELおよびGroESを発現する前記
(4)記載のプラスミド、 (6) groEオペロンに接続している誘導可能なプ
ロモーターが、lac、trp、araBおよびPzt
−1からなる群より選ばれた前記(5)記載のプラスミ
ド、 (7) 前記(4)〜(6)いずれか記載のプラスミド
を、外来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得
られる共形質転換菌、 (8) 大腸菌が、プロテアーゼ変異株である前記
(7)記載の共形質転換菌、 (9) プロテアーゼ変異株が、lonおよびclpP
X二重変異株またはlon、clpPXおよびhslV
/U三重変異株である前記(8)記載の共形質転換菌、 (10) 大腸菌が、plsX変異株である前記(7)
記載の共形質転換菌、 (11) 大腸菌が、rpoH変異株である前記(7)
記載の共形質転換菌、 (12) rpoH変異株が、rpoH欠失変異株であ
る前記(11)記載の共形質転換菌、 (13) 外来蛋白質が、インターフェロン、インター
ロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン
受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー
刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血
病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホル
モン、プロインスリン、インスリン様成長因子、繊維芽
細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミ
ング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長
因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリ
ア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、プロウ
ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血
液凝固因子、プロテインC、グルコセレブロシダーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチー
ム、P450、プロキモシン、トリプシンインヒビタ
ー、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチ
ン、免疫グロブリン、1本鎖抗体、補体成分、血清アル
ブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレス蛋白質、
プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転写調
節因子およびウイルス構成蛋白質からなる群より選ばれ
た前記(7)〜(12)いずれか記載の共形質転換菌、 (14) 前記(7)〜(13)いずれか記載の共形質
転換菌を用いることを特徴とする、外来蛋白質の製造方
法、 (15) DnaK、DnaJおよびGrpEの発現量
とGroELおよびGroESの発現量が外来蛋白質の
安定化および/または可溶化に適したシャペロンの誘導
条件下で、共形質転換菌の培養を行う前記(14)記載
の製造方法、に関する。
は、蛋白質のフォールディングに関与する蛋白質であれ
ばいかなる蛋白質でも構わない。本発明においては、大
腸菌由来のシャペロンが好ましく、例えば、DnaK、
DnaJ、GrpE、GroEL、GroES、Hsc
A/Hsc66、CbpA、HtpG等が挙げられる。
大腸菌において外来蛋白質を安定化かつ可溶化させて発
現させるという観点から、DnaK、DnaJ、Grp
E、GroEL、GroESがさらに好ましく、かかる
シャペロンが協調して作用するという観点から、Dna
K/DnaJ/GrpEシャペロンシステムおよびGr
oEL/GroESシャペロンシステムを組み合わせて
用いることが特に好ましい。
ぺロンを提供する。本発明でオぺロンとは、前記シャペ
ロンをコードする遺伝子が、1つのプロモーターの制御
下に支配されている転写単位を形成している遺伝子群を
いい、天然のオペロンのみならず、人工オぺロンも含ま
れる。本発明においては、大腸菌由来のDnaK、Dn
aJおよびGrpEをコードする人工オペロン(dna
K/dnaJ/grpEオぺロンと称する)が好まし
く、また、大腸菌の増殖にも必要なGroELおよびG
roESをコードするオぺロン(groEオペロンと称
する)と組み合わせて用いることがさらに好ましい。
ぺロンは、公知のdnaK/dnaJオぺロンよりも発
現するシャペロン機能をより効果的に発揮させることが
可能である。外来蛋白質としてプロウロキナーゼを用い
た具体例が、後述されている。
ーは、本発明のシャペロンの発現量を調節するという観
点から、誘導可能なプロモーターであることが好まし
い。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、la
c、tac、trc、trp、araB、Pzt−1、
λPL が挙げられる。lac、tacおよびtrcは、
いずれもイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトピラノ
シド(IPTG)を用いて、trp、araBおよびP
zt−1は、それぞれ、3−インドールアクリル酸(I
AA)、L−アラビノース、テトラサイクリンを用い
て、λPL は高温(42℃)で誘導することができる。
また、T7RNAポリメラーゼによって特異的にかつ強
力に転写されるT7プロモーターも使用できる。この場
合、lacプロモーター下流に連結したT7RNAポリ
メラーゼ遺伝子をもつλファージを溶原化した大腸菌を
用いることにより、IPTGで誘導が可能である。
まれており、制限酵素等を用いてベクターから適宜切り
出して用いることができる。
有し、かつ大腸菌に導入された後前記シャペロンを発現
するものである。すなわち、dnaK/dnaJ/gr
pEオぺロンを有するプラスミドが好ましく、さらに好
ましくは、dnaK/dnaJ/grpEオぺロンおよ
びgroEオペロンを同時に有するプラスミドが望まし
い。
可能なプロモーターにより本発明のシャペロン、すなわ
ち、DnaK、DnaJおよびGrpEを発現すること
が好ましく、さらに好ましくは、DnaK、DnaJ、
GrpE、GroELおよびGroESを発現すること
が望ましい。
記シャペロンの発現量や発現時期を最適化するために、
シャペロンの発現と目的蛋白質の発現は独立して制御で
きる方が有利であり、シャペロンの発現に用いる誘導可
能なプロモーターとしては、目的蛋白質の発現に用いら
れるプロモーターと異なるものが好ましい。dnaK/
dnaJ/grpEオぺロン発現のためのプロモーター
とgroEオペロン発現のためのプロモーターに同じプ
ロモーターを使用しても構わないが、それぞれ別のプロ
モーターを用いることにより、DnaK、DnaJおよ
びGrpEとGroELおよびGroESの発現量や発
現時期を別々に調節することができる。例えば、ara
Bプロモーター−dnaK/dnaJ/grpEオぺロ
ンおよびPzt−1プロモーター−groEオペロンか
らなるプラスミドpG−KJE6(図1)が好適に使用
される。
hang, A. C. Y. and Cohen, S. N.,J. Bacteriol. 134,
1141-1156(1978)]を基に構築されたプラスミドであり、
図1に記載のように、pACYCベクター由来ori、
Cm耐性遺伝子、araBプロモーター−dnaK/d
naJ/grpEオぺロン、およびPzt−1プロモー
ター−groEオペロンからなる構造を有している。D
naK、DnaJおよびGrpEをL−アラビノースに
より、GroELおよびGroESをテトラサイクリン
により発現誘導させる。L−アラビノースおよびテトラ
サイクリンを同時に添加したり、別々に時間差をつけて
添加したり、濃度を変えて添加することにより、これら
2つのグループのシャペロンを同時に発現させたり、別
々に時間差発現させたり、発現させるシャペロンの量を
必要に応じて変えることが可能である。
は安定に共存できない。この現象を不和合性という。本
発明のプラスミドは、大腸菌内で目的蛋白質の発現ベク
ターと不和合性を示さないレプリコンを有するものであ
れば使用可能である。例えば、目的蛋白質の発現ベクタ
ーとしてpBR322等ColE1レプリコンをもつも
のを用いる場合、本発明のプラスミドには、pACYC
ベクターに存在するp15Aレプリコンを使用すること
ができる。
択が容易に行われるように、必要に応じて選択マーカー
遺伝子をさらに含んでもよい。かかる選択マーカー遺伝
子としては、アンピシリン耐性(Ampr )遺伝子、カ
ナマイシン耐性(Kmr )遺伝子、クロラムフェニコー
ル耐性(Cmr )遺伝子等が挙げられるが、外来蛋白質
発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とは異なる
ことが望ましい。
ambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,New York, 1989年発行に記載の方法により行うこと
ができる。前記pG−KJE6の具体的な構築方法は、
後述の実施例に記載されている。
モーターによる本発明のシャペロンを発現させる方法お
よび本発明のシャペロンの発現量を調節する方法は、後
述されている。
プラスミドを外来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導
入することにより得られるものである。
外来蛋白質を大腸菌内で発現させるベクターで、かつ、
前記プラスミドと不和合性を示さなければいかなるもの
でも構わないが、誘導可能なプロモーターにより、目的
の外来蛋白質の発現が誘導されるベクターが好ましい。
同様のプロモーターが挙げられるが、本発明のシャペロ
ンの誘導発現に用いるプロモーター以外のプロモーター
を選ぶことにより、本発明のシャペロンと目的の外来蛋
白質とを別々に発現誘導することができる。
応じて選択マーカー遺伝子を含んでもよい。かかる選択
マーカー遺伝子としては、前記と同様のものが挙げられ
るが、本発明のプラスミドに含まれる選択マーカー遺伝
子以外のものを用いることにより、共形質転換菌の二重
選別が可能となる。
101、JM109、MC4100MG1655、W3
110等の野生株、ならびにlon変異株、clpPX
変異株、hslV/U変異株、lonおよびclpPX
二重変異株、lon、clpPXおよびhslV/U三
重変異株等のプロテアーゼ変異株、plsX変異株、r
poH欠失変異株、rpoHミスセンス変異株等の変異
株が挙げられる。
に発現させるため、lon変異株、clpPX変異株、
hslV/U変異株、lonおよびclpPX二重変異
株またはlon、clpPXおよびhslV/U三重変
異株のプロテアーゼ変異株、plsX変異株ならびにr
poH欠失変異株等のrpoH変異株を用いることがで
きる。
株としては、lon遺伝子およびclpPX遺伝子に二
重欠失変異を導入したMC4100株由来のKY226
3株(FERM P−16087)が好適に用いられ
る。
/U三重変異株とは、前記lonおよびclpPX二重
変異株において、さらにHslV/Uプロテアーゼをコ
ードするhslV/U遺伝子に変異を導入した変異株で
あり、lon遺伝子、clpPX遺伝子およびhslV
/U遺伝子に三重欠失変異を導入したMC4100株由
来のKY2266株(FERM P−16088)が好
適に用いられる。
plsXがコードするポリペプチドのN末端領域に対応
する位置へのテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入変異を
有するplsX変異株(特開平8−140671号公
報)が挙げられる。
ば、MC4100ΔrpoH[Zhou,Y. N. et al., J. B
acteriol. 170,3640-3649(1988)] 、MG1655Δr
poH等が挙げられる。rpoH欠失変異株では、σ32
により制御されるあらゆる熱ショック蛋白質(シャペロ
ン、プロテアーゼを含む)の発現量が抑制されている。
rpoH欠失変異株を、例えば、pG−KJE6で形質
転換することによって発現抑制されたシャペロンを十分
補うことにより、プロテアーゼの量が少なく、シャペロ
ンの量の多い系が提供され、不安定な外来蛋白質を安定
発現させるためのよい効果が奏されるものと期待され
る。また、rpoH欠失変異株は、温度感受性であり、
通常20℃を越える温度で生育できないが、前記したよ
うにGroELおよびGroESを補うことによって、
20℃を越える温度でも生育できるようになるので、取
り扱いが容易になる。従って、rpoH欠失変異株を用
いることが特に好ましい。
しては、大腸菌内で不安定化および/または不溶化する
外来蛋白質であれば、いかなる蛋白質でも構わない。か
かる外来蛋白質としては、インターフェロン、インター
ロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン
受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー
刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血
病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホル
モン、プロインスリン、インスリン様成長因子、繊維芽
細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミ
ング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長
因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリ
ア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、プロウ
ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血
液凝固因子、プロテインC、グルコセレブロシダーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチー
ム、P450、プロキモシン、トリプシンインヒビタ
ー、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチ
ン、免疫グロブリン、1本鎖抗体、補体成分、血清アル
ブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレス蛋白質、
プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転写調
節因子およびウイルス構成蛋白質が挙げられる。
ターと共に大腸菌に導入する方法としては、塩化カルシ
ウム法、塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法
等の通常の方法が用いられる。共形質転換菌のスクリー
ニング法としては、選択マーカー遺伝子に応じた薬剤に
より行なうことができる。外来蛋白質の発現は、例え
ば、ウエスタンブロッティング等により確認することが
できる。
いる外来蛋白質の製造方法を提供する。かかる製造方法
は、(1)発現対象の外来蛋白質の安定化および/また
は可溶化に適したシャペロンの誘導条件を調べる工程、
(2)共形質転換菌を培養し、(1)で調べた誘導条件
下でシャペロンおよび外来蛋白質を誘導発現させた後、
菌体を集める工程、ならびに、(3)集めた菌体を破砕
し、外来蛋白質に応じた精製方法に従って、該外来蛋白
質を単離・精製する工程という3つの工程よりなる。
の発現を例に、本発明のdnaK/dnaJ/grpE
オぺロンを用いて互いに協調的に働くDnaK、Dna
JおよびGrpEを同時に共発現させることにより、公
知のdnaK/dnaJオぺロンを用いてDnaKおよ
びDnaJだけを発現させた場合に比べて、シャペロン
機能をより効果的に発揮させることが可能であることを
具体的に確認することができる。
伝子、araC、araBプロモーター/オペレーター
遺伝子を有するプラスミドpAR3(ATCC8702
6)のaraBプロモーター下流を制限酵素PstIで
切断し、平滑末端にした後、PCRで調製した大腸菌の
dnaK/dnaJオペロンのコーディング領域約3k
bと、grpE遺伝子のコーディング領域約0.6kb
を挿入して、araBプロモーターの支配下に1つのオ
ペロンからDnaK、DnaJおよびGrpEを発現す
るプラスミドpKJE7を作製する。
よびKpnIで切断して、GrpE遺伝子のコーディン
グ領域をほぼすべて取り除き、平滑末端にした後、セル
フライゲーションさせる。araBプロモーターからD
naKおよびDnaJのみを発現するプラスミドを単離
し、pKJ1とする。
発現誘導できるプラスミドpUK−02pm0[Kanemor
i, M. et al., J. Bacteriol. 176, 5648-5653(1994)]
とpKJE7またはpKJ1とを用いて、塩化ルビジウ
ム法によりMG1655(CGSC6300;E. coli
Genetic Stock Center, Yale University)を形質転換す
る。得られたpUK−02pm0とpKJE7との共形
質転換菌およびpUK−02pm0とpKJ1との共形
質転換菌を単離し、それぞれNK284およびNK28
7とする。
g/mlのL−アラビノースを添加したL培地中、37
℃で培養し、Klett Unit約40のときに1m
MのIPTGを前記培地に添加し、1時間後に培養液の
一部を取り、トリクロロ酢酸を加え、菌体を沈殿させ
る。沈殿物を遠心分離により集め、アセトンで洗浄後、
SDS−PAGE用サンプルバッファーに溶解し、SD
S−PAGEにより蛋白質を分離した後、CBB染色に
より誘導されたシャペロンを検出する(図2)。
収したNK284およびNK287の各菌体を超音波処
理により破砕した後、可溶性画分と不溶性画分に分画し
て、抗ウロキナーゼ抗体を用いたウエスタンブロッティ
ングにより両画分のプロウロキナーゼを検出する(図
2)。
pEを共発現させたとき、ほぼすべてのプロウロキナー
ゼが可溶性で発現するのに対して、DnaKおよびDn
aJのみを共発現させたときはプロウロキナーゼが一部
可溶化せず、不溶性で発現することがわかる。
原CryjII発現ベクターによる共形質転換菌(NK2
41)を用いた外来蛋白質の製造方法を具体的に説明す
る。CryjIIは、大腸菌内で発現させると、不安定な
蛋白質であり、その半減期は、スペクチノマイシンを添
加して蛋白質合成を停止させた菌体のウエスタンブロッ
ティングによれば約10分である。
可溶化に適するシャペロンの誘導条件の検討 まず、pG−KJE6単独でJM109を形質転換さ
せ、形質転換菌をクロラムフェニコールを用いてスクリ
ーニングする。得られた形質転換菌を、0〜3mg/m
lのL−アラビノースおよび0〜150ng/mlのテ
トラサイクリンを添加したL培地中、30℃で培養し、
Klett Unit約40のときに菌体を集める。各
菌体の蛋白質をSDS−PAGEにより分離した後、ク
マジーブリリアントブルー(CBB)染色により、誘導
されたシャペロンを検出する(図3)。図3に示すよう
に、前記薬剤の濃度に依存して各シャペロンが誘導され
る。
より誘導可能なCryjII発現ベクターによるMG16
55共形質転換菌(NK241)を、0〜8mg/ml
のL−アラビノースおよび0〜10ng/mlのテトラ
サイクリンを添加した以外は前記と同様の方法で培養
し、Klett Unit約40のときに、1mMのI
PTGを培地に添加し、2時間後に菌体を回収する。各
菌体の全蛋白質をSDS−PAGEにより分離した後、
CBB染色により、誘導されたシャペロンを検出し、ま
たは、ウエスタンブロッティングによりCryjIIを検
出する(図4)。図4に示すように、DnaK、Dna
JおよびGrpE、GroELおよびGroESまたは
前記5つとも共発現させると、CryjIIが高発現する
ことがわかる。
音波処理により破砕した後、遠心分離により可溶性画分
と不溶性画分とに分画して、両画分のウエスタンブロッ
ティングによりCryjIIの可溶性を調べる(図5)。
図5に示すように、DnaK、DnaJおよびGrpE
の3つだけを共発現させると、CryjIIが不溶化する
ことが示される(レーン2〜5)が、DnaK、Dna
JおよびGrpEの誘導発現量が比較的少なく、Gro
ELおよびGroESを同時に発現誘導させた場合は、
CryjIIが可溶なまま安定化することがわかる(レー
ン6〜9)。しかし、DnaK、DnaJおよびGrp
Eを大過剰に発現させた場合は、GroELおよびGr
oESを同時に発現誘導させてもCryjIIが不溶化す
る(レーン10)。従って、GroELおよびGroE
Sを同時に発現誘導させた場合は、DnaK、DnaJ
およびGrpEの過剰発現によるCryjIIの不溶化を
ある程度抑制することがわかる。
ンを添加して蛋白質合成を停止させた菌体中のCryj
IIの残量をウエスタンブロッティングにより定量するこ
とにより、半減期として表される。前記条件下では、そ
の半減期は40分以上となる(図6)。
響をさらに明らかにするために、DnaK、DnaJ、
GrpE、GroELおよびGroES各変異株(MC
4100由来)に、前記CryjII発現ベクターを導入
し、前記と同様にCryjIIの発現と可溶性を調べる
(図7)。図7に示すように、DnaK変異株およびD
naJ変異株中では、CryjIIは不溶化するが、Gr
pE変異株中では、あまり影響が見られない。GroE
L変異株およびGroES変異株中では、CryjIIは
可溶性であるが、発現量が減っており、CryjIIがさ
らに不安定になっていると推測される。
aJおよびGrpEの発現量は、多すぎても少なすぎて
もCryjIIの不溶化が起こるということが示唆され、
DnaK、DnaJおよびGrpEは、CryjIIのフ
ォールディングに何らかの重要な影響を与えていると考
えられる。
(NK196)を用いて、前記と同様にしてCryjII
のフォールディングに係わるシャペロンをさらに詳細に
検討する(図8、9)。図8、9に示すように、rpo
H欠失変異株では、一連のシャペロンやプロテアーゼの
量が減少しているため、発現したCryjIIは非常に安
定であるが著しく不溶化する(図8および9、レーン
a)。また、CryjIIの可溶化については、Dna
K、DnaJおよびGrpEの3つだけ、またはGro
ELおよびGroESの2つだけを共発現させた場合
は、CryjIIは可溶化せず(図9、レーンb、c)、
DnaK、DnaJ、GrpE、GroELおよびGr
oESの5つを共発現させた場合に初めてCryjIIが
可溶化する(図9、レーンd)。さらに、前記5つを共
発現させる条件下で、DnaK、DnaJおよびGrp
Eの発現量をさらに増やすと、CryjIIの再不溶化が
起こり(図9、レーンe)、NK241での実験結果と
一致する。
仮説をたてることができる。即ち、GroELおよびG
roESは、CryjIIと結合してプロテアーゼによる
分解を阻害するが、CryjIIのフォールディングには
あまり関与しない。一方、DnaK、DnaJおよびG
rpEは、CryjIIのフォールディングにも深く係わ
っており、特にDnaJが重要な役割を担っていると考
えられる。しかし、過剰にDnaK、DnaJおよびG
rpEが発現しても不溶化してしまう。そこで、Cry
jIIのフォールディングを効率的に行なうためには、D
naK、DnaJおよびGrpEならびにGroELお
よびGroESの両シャペロングループが適度に存在す
る方がよい。この仮説は、これまでに示されてきたシャ
ペロンが互いに協調的に働くという諸説ともよく一致す
るものである。
LおよびGroESの5つのシャペロンを同時にまたは
グループ別に共発現させて外来蛋白質発現への影響およ
び効果的な発現を調べることは、新規である。Cryj
IIのような共発現させるシャペロンの種類や量によって
挙動の変わる蛋白質を研究することは、シャペロンの働
きを知る上でも興味深いと思われる。また、rpoH欠
失変異株中でシャペロンのみを過剰発現させる系は、他
の外来蛋白質のより効率的な発現にも適用できると思わ
れる。
び外来蛋白質の誘導発現ならびに菌体の回収 このようにして得られたCryjIIを安定および可溶化
発現させるために好適なシャペロン誘導条件下(10n
g/mlのテトラサイクリンおよび1mg/mlのL−
アラビノース)で、NK241を(1)と同様に培養
し、KlettUnit約40のときに、1mMのIP
TGを培地に添加し、2時間後に菌体を集める。
し、ゲル濾過、各種のカラムクロマトグラフィー等、蛋
白質の精製に使用されている通常の方法によりCryj
IIを精製する。
蛋白質ORP150発現ベクターpORP4(IPTG
により誘導)およびpG−KJE6をJM109に導入
して得られた共形質転換菌(NK269)を用いるヒト
ORP150の製造方法について述べる。大腸菌内でp
ORP4単独でヒトORP150を発現させると、発現
したORP150の多くが不溶化する。NK269は、
培養開始時から培地にL−アラビノースを添加すると、
理由は不明であるが生育できないので、L−アラビノー
スおよびテトラサイクリンをKlett Unit約4
0のときに加えること以外は前記と同様にして、NK2
69を培養し、発現誘導させる(図10)。図10に示
すように、ヒトORP150は、GroELおよびGr
oESだけを共発現させた場合は、半分以上が可溶性画
分にきており(パネル右、レーンb)、DnaK、Dn
aJおよびGrpEの3つだけまたは前記5つを同時に
発現させた場合には、ほとんど可溶化することがわかる
(パネル右、レーンc、d、e)。
には、例えば、L培地中でNK269を培養し、Kle
tt Unit約40のときに、10ng/mlのテト
ラサイクリン、10mg/mlのL−アラビノースおよ
び1mMのIPTGを前記培地に添加して発現誘導させ
る。2時間培養後、前記と同様に菌体を集め、ORP1
50を単離・精製する。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例
は、 Sambrook, J. ら著、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, New York, 1989年発行、Current Protocols
in Protein Science(ed. Coligan, J. E. et al.), Joh
n Wiley and Sons,Inc.等に記載の方法で行った。
araBプロモーター/オペレーター遺伝子を有するプ
ラスミドpAR3(ATCC87026)のaraBプ
ロモーター下流を制限酵素PstIで切断し、平滑末端
にした後、PCRで調製した大腸菌のdnaK/dna
Jオペロンのコーディング領域約3kbと、grpE遺
伝子のコーディング領域約0.6kbを挿入して、ar
aBプロモーターの支配下に1つのオペロンからDna
K、DnaJおよびGrpEを発現するプラスミドpK
JE7を作製した。
よびKpnIで切断して、GrpE遺伝子のコーディン
グ領域をほぼすべて取り除き、平滑末端にした後、セル
フライゲーションさせた。araBプロモーターからD
naKおよびDnaJのみを発現するプラスミドを単離
し、pKJ1とした。
スミドpUK−02pm0[Kanemori, M. et al., J. B
acteriol. 176, 5648-5653(1994)] 10ngと、実施例
1で得られたpKJE7を10ng用いて、塩化ルビジ
ウム法によりMG1655(CGSC6300;E. col
i Genetic Stock Center, Yale University)を形質転換
した。クロラムフェニコールおよびアンピシリンにより
スクリーニングし、pUK−02pm0とpKJE7と
の共形質転換菌を単離し、NK284とした。
られたpKJ1を用いること以外は実施例2と同様にし
て、pUK−02pm0とpKJ1との共形質転換菌を
単離し、NK287とした。
の発現 実施例2で得られたNK284および比較例2で得られ
たNK287を、1mg/mlのL−アラビノース(和
光純薬工業株式会社製)を添加したL培地中、37℃で
培養し、Klett Unit約40のときに1mMの
IPTG(和光純薬工業株式会社製)を培地に添加し、
1時間後に培養液の一部を取り、トリクロロ酢酸を終濃
度5%になるように加え、菌体を沈殿させた。沈殿物を
遠心分離により集め、アセトンで洗浄後、SDS−PA
GE用サンプルバッファーに溶解し、SDS−PAGE
により蛋白質を分離した後、CBB染色により誘導され
たシャペロンを検出した(図2、パネル左)。
収したNK284およびNK287の各菌体を超音波処
理により破砕した後、遠心分離により可溶性画分と不溶
性画分に分画して、抗ウロキナーゼ抗体(SANBIO BV 社
製) を用いたウエスタンブロッティングにより両画分の
プロウロキナーゼを検出した(図2、パネル右)。
Pzt−1(ドイツハイデルベルク大学 H. Bujard博士
より入手)のPzt−1プロモーター下流に存在するル
シフェラーゼ遺伝子を、制限酵素KpnIおよびXba
Iで切り出し、そこにpKV1561[Kanemori, M. et
al., J. Bacteriol. 176,4235-4242(1994)]を制限酵素
XhoIで消化して得たプロモーター領域を含まない大
腸菌groEオペロンを連結して、Pzt−1プロモー
ターの支配下にGroELおよびGroESを発現する
プラスミドpGro8を作製した。次いで、トランスポ
ゾンTn10を有する大腸菌からPCRにより約800
bpのテトラサイクリンリプレッサー(tetR)遺伝
子を調製し、pGro8のPzt−1プロモーター上流
に存在するAatI部位に挿入し、pGro10Rを得
た。
およびAvrIIで切断して、tetR−Pzt−1−g
roESgroELを含む断片を調製し、末端平滑化処
理をした後、これを実施例1で得られたpKJE7のX
mnI部位に挿入して、araBプロモーターからDn
aK、DnaJおよびGrpEを、Pzt−1からGr
oELおよびGroESを発現するプラスミドpG−K
JE6を作製した。
誘導発現 実施例3で得られたpG−KJE6を10ng用いて、
塩化ルビジウム法によりJM109(TaKaRaコン
ピテントセル、宝酒造株式会社製)を形質転換した。ク
ロラムフェニコールによりスクリーニングして得られた
形質転換菌を、0〜3mg/mlのL−アラビノース
(和光純薬工業株式会社製)および0〜150ng/m
lのテトラサイクリン(ナカライテスク株式会社製)を
添加したL培地中、37℃で培養し、Klett Un
it約40のときに培養液にトリクロロ酢酸を終濃度5
%となるように加え、菌体を沈殿させた。各沈殿物を遠
心分離により集め、アセトンで洗浄後、SDS−PAG
E用サンプルバッファーに溶解し、SDS−PAGEに
より蛋白質を分離した後、CBB染色により、誘導され
たシャペロンを検出した(図3)。
BS Lett. 353,124-128(1994)] の成熟型CryjII蛋白
質(Arg46〜Ser433 )をコードする領域を、IP
TGで誘導可能な大腸菌用発現プラスミドpKK223
−3(Pharmacia Biotech 社製) のEcoRI−Pst
I部位に挿入して、pKCJ2を作製した。次いで、p
KCJ2のBamHI部位に、pMJR1560(Amer
sham社製) から調製したlacIq 遺伝子を挿入してp
KCJ2Iとした。
E6と10ngの前記CryjII発現ベクターpKCJ
2Iとを用いて、塩化ルビジウム法によりMG1655
(CGSC6300)(E. coli Genetic Stock Center,
Yale University) を形質転換した。クロラムフェニコ
ールおよびアンピシリンによりスクリーニングして共形
質転換菌を単離し、NK241を得た。
L−アラビノースおよび0〜10ng/mlのテトラサ
イクリンを添加した以外は実施例4と同様の方法で培養
し、Klett Unit約40のときに、1mMのI
PTGを培地に添加し、2時間後に培養液の一部を取
り、トリクロロ酢酸を終濃度5%になるように加え、菌
体を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により集め、アセト
ンで洗浄後、SDS−PAGE用サンプルバッファーに
溶解し、SDS−PAGEにより蛋白質を分離した後、
CBB染色により、誘導されたシャペロンを検出した。
さらに、抗CryjIIモノクローナル抗体N−26[ 澤
谷ら、アレルギー 43,467-473(1994)]を用いるウエスタ
ンブロッティングによりCryjIIを検出した(図
4)。
収したNK241菌体を超音波処理により破砕した後、
遠心分離により可溶性画分と不溶性画分とに分画して、
前記と同様にウエスタンブロッティングにより両画分の
CryjIIを検出した(図5)。
トラサイクリン、8mg/mlのL−アラビノースまた
は20ng/mlのテトラサイクリンと8mg/mlの
L−アラビノースを添加した以外は実施例4と同様の方
法で培養し、Klett Unit約40のときに、1
mMのIPTGを培地に添加し、2時間CryjIIを発
現誘導した。次に、500μg/mlとなるようにスペ
クチノマイシン(シグマ社製)を加えて蛋白質合成を止
め、経時的にサンプリングして菌体を集めた。各菌体の
全蛋白質をSDS−PAGEにより分離した後、抗Cr
yjIIモノクローナル抗体N−26を用いてウエスタン
ブロッティングを行なった。ウエスタンブロッティング
像をスキャナーで取り込み、解析ソフトIntelligent Qu
antfier(日本バイオイメージ社製) で、バンド強度を定
量した(図6)。
oES各変異株(MC4100株由来)として、それぞ
れ、MC4100ΔdnaK52[Nagai, H. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10280-10284(1994)]、
MC4100dnaJ259[Ishiai, M. et al., J. B
acteriol. 174, 5597-5603(1992)] 、MC4100gr
pE280[Ishiai, M. et al., J. Bacteriol. 174, 5
597-5603(1992)] 、MC4100EL44[Tilly, K. &
Georgopoulos, C., J. Bacteriol. 149, 1082-1088(19
82)]、MC4100ES72[Tilly, K. & Georgopoulo
s,C., J. Bacteriol. 149, 1082-1088(1982)]を用い
た。実施例5に記載の方法に従って、10ngのCry
jII発現ベクターを前記変異株に導入し、実施例6と同
様にしてCryjIIの発現と可溶性を調べた(図7)。
eriol. 170,3640-3649(1988)] のΔrpoH::kan
遺伝子を、T4ファージを用いたトランスダクションに
よりMG1655に移した。カナマイシン耐性を指標に
ΔrpoH::kanの移った菌株を選択し、20℃で
は増殖するが30℃、37℃および42℃で増殖できな
いことを確認してMG1655ΔrpoH株NK161
を得た。
ΔrpoH株NK161を用いること以外は、実施例5
と同様にして、rpoH欠失変異株共形質転換菌NK1
96を得た。NK196を用いて、実施例6と同様にし
てCryjIIの発現と可溶性を調べた(図8、9)。
m. Biophys. Res. Comm. 230, 94-99(1997)] の成熟型
ORP150蛋白質(Leu33〜Leu999 )をコード
する領域を、IPTGで誘導可能な大腸菌用発現プラス
ミドpTrc99A(Pharmacia Biotech 社製) のNc
oI部位に挿入して、pORP4を作製した。10ng
のpORP4および10ngの実施例3で得られたpG
−KJE6を、実施例4に記載の方法に従って、JM1
09を形質転換し、共形質転換菌NK269を得た。
地にL−アラビノースを添加すると生育できないので、
L−アラビノースおよびテトラサイクリンをKlett
Unit約40のときに加えること以外は実施例6と
同様にして、NK269を培養し、ヒトORP150を
発現誘導させた(図10)。
白質を安定化かつ可溶化させて発現するために用いられ
るシャペロンをコードするオペロン、かかるオペロンを
有する発現プラスミド、かかるプラスミドを外来蛋白質
発現ベクターと共に大腸菌に導入して得られる共形質転
換菌およびかかる共形質転換菌を用いる外来蛋白質の製
造方法が提供される。本発明によれば、大腸菌における
外来蛋白質の効率的な遺伝子工学的生産が可能となる。
示す。
て、1mg/mlのL−アラビノース(Ara)による
シャペロンの発現誘導(パネル左)ならびにプロウロキ
ナーゼ(proUK)の可溶性(パネル右)を示す電気
泳動の写真である。図中、Sは可溶性画分を示し、Iは
不溶性画分を示す。
からのシャペロンの発現誘導を示す電気泳動の写真であ
る。各レーンの上の数字は、L−アラビノース(Ar
a)およびテトラサイクリン(Tc)の濃度を示す。
raおよびTcによるシャペロンの発現誘導(パネル
左)ならびにCryjIIの発現(パネル右)を示す電気
泳動の写真である。
性画分と不溶性画分とに分画することによるCryjII
の挙動(可溶性)を示す電気泳動の写真である。図中、
Sは可溶性画分を示し、Iは不溶性画分を示す。
ンと共発現させたCryjIIの安定性を示すグラフであ
る。図中、0分の時のCryjII量の値を1として示
し、CryjII残量が0.5の値を示す時間をCryj
II量の半減期とする。
jIIの発現を示す電気泳動の写真である。図中、MCは
親株MC4100を示し、K- はMC4100Δdna
K52を示し、J- はMC4100dnaJ259を示
し、E- はMC4100grpE280を示し、L- は
MC4100EL44を示し、S- はMC4100ES
72を示す。図中、Sは可溶性画分を示し、Iは不溶性
画分を示す。
のAraおよびTcによるシャペロンの発現誘導(パネ
ル上)ならびにCryjIIの発現(パネル下)を示す電
気泳動の写真である。
性画分と不溶性画分とに分画することによるCryjII
の可溶性を示す電気泳動の写真である。図中、Sは可溶
性画分を示し、Iは不溶性画分を示す。
のAraおよびTcによるシャペロンの発現誘導(パネ
ル左)ならびにORP150の発現(パネル右)を示す
電気泳動の写真である。各パネルの両端のレーンは、分
子量マーカーを示す。パネル右の各レーンのSは可溶性
画分を示し、Iは不溶性画分を示す。
Claims (15)
- 【請求項1】 DnaK、DnaJおよびGrpEのシ
ャペロンをコードし、かつ該シャペロンが、1つのプロ
モーターの制御下に支配されたものである、人工オペロ
ン。 - 【請求項2】 該プロモーターが、誘導可能なプロモー
ターである、請求項1記載の人工オペロン。 - 【請求項3】 誘導可能なプロモーターが、lac、t
rp、araBおよびPzt−1からなる群より選ばれ
た請求項2記載の人工オペロン。 - 【請求項4】 請求項1〜3いずれか記載の人工オペロ
ンを有し、DnaK、DnaJおよびGrpEを発現す
るプラスミド。 - 【請求項5】 誘導可能なプロモーターに接続したgr
oEオペロンをさらに含んでなり、DnaK、Dna
J、GrpE、GroELおよびGroESを発現する
請求項4記載のプラスミド。 - 【請求項6】 groEオペロンに接続している誘導可
能なプロモーターが、lac、trp、araBおよび
Pzt−1からなる群より選ばれた請求項5記載のプラ
スミド。 - 【請求項7】 請求項4〜6いずれか記載のプラスミド
を、外来蛋白質発現ベクターと共に大腸菌に導入して得
られる共形質転換菌。 - 【請求項8】 大腸菌が、プロテアーゼ変異株である請
求項7記載の共形質転換菌。 - 【請求項9】 プロテアーゼ変異株が、lonおよびc
lpPX二重変異株またはlon、clpPXおよびh
slV/U三重変異株である請求項8記載の共形質転換
菌。 - 【請求項10】 大腸菌が、plsX変異株である請求
項7記載の共形質転換菌。 - 【請求項11】 大腸菌が、rpoH変異株である請求
項7記載の共形質転換菌。 - 【請求項12】 rpoH変異株が、rpoH欠失変異
株である請求項11記載の共形質転換菌。 - 【請求項13】 外来蛋白質が、インターフェロン、イ
ンターロイキン、インターロイキン受容体、インターロ
イキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコ
ロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチ
ン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、
成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因
子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トラン
スフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因
子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄
養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフ
ィン、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター、血液凝固因子、プロテインC、グルコセレブ
ロシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レニ
ン、リゾチーム、P450、プロキモシン、トリプシン
インヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチ
ン、レプチン、免疫グロブリン、1本鎖抗体、補体成
分、血清アルブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性スト
レス蛋白質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン
産物、転写調節因子およびウイルス構成蛋白質からなる
群より選ばれた請求項7〜12いずれか記載の共形質転
換菌。 - 【請求項14】 請求項7〜13いずれか記載の共形質
転換菌を用いることを特徴とする、外来蛋白質の製造方
法。 - 【請求項15】 DnaK、DnaJおよびGrpEの
発現量とGroELおよびGroESの発現量が外来蛋
白質の安定化および/または可溶化に適したシャペロン
の誘導条件下で、共形質転換菌の培養を行う請求項14
記載の製造方法。
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