GEBIET DER ERFINDUNG
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erhöhung der
Produktion biologisch aktiver rekombinanter Proteine in
Bakterien. Genauer wird ein Verfahren offenbart, bei dem ein
heterologes Protein gleichzeitig mit dem Manipulieren des zentralen
Mechanismus überexprimiert wird, welcher die
Hitzeschock-Proteinsynthese beherrscht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Bis jetzt ist von mehreren kommerziell wertvollen, in
rekombinanten Bakterien hergestellten Proteinen gefunden worden, daß
sie größtenteils vor allem in einer biologisch inaktiven
Konformation isolierbar sind. Zum Erhalten einer gewinnbringenden
Ausbeute ist es notwendig, diese Proteine in eine biologisch
aktive Konformation rückzufalten. Durch die Verwendung
rekombinanter DNA-Technologie ist es nun möglich, DNA zwischen
unterschiedlichen Organismen zum Zwecke des Exprimierens von
Fremdproteinen in eine biologisch aktive Konformation zu überführen.
Eine derartige Überführung umfaßt üblicherweise das Verbinden
geeigneter DNA-Fragmente mit einem Vektormolekül, das
anschließend in einen Empfängerorganismus transformiert wird.
Transformanten werden zum Ermitteln des klonierten Fragments durch
einen bekannten Marker auf dem Vektor oder durch ein genetisches
Muster oder biochemisches Muster selektiert. Vektoren enthalten
Sequenzen, die eine autonome Replizierung innerhalb der
Wirtszelle ermöglichen oder den Einbau in ein Wirtschromosom
erlauben.
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Falls die klonierte DNA-Sequenz für ein Protein kodiert, muß zum
Erreichen einer Synthese dieses Fremdproteins in einer
biologisch aktiven Form in der Wirtszelle eine Reihe von Vorgängen
erfolgen. Promotorsequenzen müssen zugegen sein, um die
Transkription des Gens durch RNA-Polymerase zur erlauben und eine
Ribosomenbindungsstelle und ein Startkodon muß in der
transkribierten
mRNA zur Translation durch Ribosomen zugegen sein. Diese
Transkriptions- und Translationserkennungssequenzen werden
üblicherweise für eine wirkungsvolle Bindung durch die Wirt-RNA-
Polymerase und Ribosomen optimiert und durch sorgfältige Wahl
der Vektoren ist es oft möglich, eine wirkungsvolle Exprimierung
vieler Fremdgene in einer Wirtszelle zu erhalten.
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Obschon viele Probleme einer wirkungsvollen Transkription und
Translation allgemein erkannt und zum größten Teil überwunden
sind, führt die daraus folgende Synthese eines Fremdpolypeptids
zu niedrigen oder vernachlässigbaren Ausbeuten an biologisch
aktivem Protein. Die überexprimierten Proteine bilden oft
Einschlußkörper, die sich aus zusammengeballtem inaktivem Protein
zusammensetzen. Die zusammengeballten Proteine müssen
anschließend isoliert werden und es müssen Anstrengungen zum Rückfalten
des Proteins in vitro unternommen werden. Heterologe Proteine
können in vivo löslich bleiben, können aber wegen falschem oder
unvollständigem Falten in der unüblichen Zellumgebung der
Proteolyse unterliegen (Kane et al., TIBTECH, 6, 95, (1988)). Aus
solchen Beobachtungen ist klar geworden, daß Faktoren, die das
Falten im Entstehen begriffener Polypeptidketten in vivo
beeinflussen, eine beträchtliche Wirkung auf die Ausbeute an
Fremdproteinen besitzen können, die aus Expressionsvektoren in
transformierten Zellen hergestellt wurden.
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Der Stand der Technik wird durch das US-Patent 5 158 875 an
Miller et al. veranschaulicht. Dieses Patent auf ein Verfahren
zum Herstellen insulinartigen Wachstumsfaktors (IGF-1) führt
einen auf das Ernten von IGF aus der Wirtszelle folgenden
Rückfaltungsschritt an. Dieser Schritt wird wie folgt dargestellt:
"[R]ückfalten von Met-Lys-IGF-I in seine biologisch aktive
Konformation." Eine kommerziell wichtige Einschränkung im Stand
der Technik ist eindeutig das Unvermögen, kommerzielle Ausbeuten
an einigen heterologen Proteinen in biologisch aktiver
Konformation zu erhalten.
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Eine als molekulare Chaperone bekannte Gruppe von
Hilfsproteinen,
von denen viele Hitzeschockproteine (HSP) sind, ist
ermittelt worden, die einen großen Einfluß auf das Falten,
Rückführen und die Synthese von Proteinen hat. Prokaryontische
molekulare Chaperone oder HSP schließen solche Proteine wie SecB,
DnaK (hsp70-Homologe in eukaryontischen Zellen), DnaJ, GrpE,
GroES (cpn10-Homologe in eukaryontischen Zellen) und GroEL
(cpn60 oder hsp60 in eukaryontischen Zellen) ein (Larossa et
al., Mol. Microbiol., 5 (3), 529, (1991)). Das für das
Induzieren der HSP oder Chaperone verantwortliche Hitzeschockphänomen
wurde zuerst als Antwort auf eine Temperaturverschiebung nach
oben definiert. Nachfolgende Arbeiten haben gezeigt, daß die
Einwirkung einer Reihe von Belastungen einschließlich sowohl der
Phageninfektion, Makrophagenentwicklung als auch der Anwesenheit
organischer Moleküle und Schwermetalle ebenfalls die
Hitzeschockantwort auslösen kann. Wahlweise kann die
Hitzeschockantwort durch das Erzeugen verschiedener genetischer Mutanten,
welche beständig hohe HSP-Werte exprimieren, einschließlich
molekularer Chaperone künstlich aktiviert werden, (Larossa et al.,
Mol. Microbiol., 5 (3), 529, (1991)). Die am ausführlichsten
untersuchten molekularen Chaperone sind die GroES- und GroEL-
Proteine und ihre eukaryontischen Homologen, die zusammen als
Chaperonine bekannt sind.
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Der groE-Locus wurde zuerst bei Untersuchungen von Mutationen
nachgewiesen, die den Zusammenbau der Köpfe von lambda- und T4-
Bakteriophagen und den Zusammenbau des Schwanzes des T5-
Bakteriophagen stören. Der groE-Locus enthält zwei Gene, groEL
und groES, die beide für die Lebensfähigkeit der Zelle
wesentlich sind. Das groEL- und groES-Gen kodiert für
Polypeptide mit scheinbaren relativen Molekularmassen von 65 000
beziehungsweise 15 000, die sich unter den in der Zelle am
häufigsten vorkommenden Proteinen befinden. Sowohl GroEL- als
auch GroES-Polypeptide finden sich in der Zelle als oligomere
Strukturen. Das GroEL-Protein ist eine Atpase und das GroEL- und
GroES-Protein bilden in Anwesenheit von MgATP und anderen
Nukleotiden nicht aber in ihrer Abwesenheit einen Komplex
miteinander (Ellis et al., Biochem. Soc. Symp., Kay et al. (Ed.)
Nr. 55, 145, (1989)).
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Aus In-vitro-Untersuchungen ist offensichtlich, daß ein sehr
breiter Bereich ungefalteter oder teilweise gefalteter
Polypeptide mit dem GroEL-Protein in Wechselwirkung tritt und daß diese
Wechselwirkung die nachfolgende Faltungsreaktion beeinflußt. Die
meisten Proteine kollabieren rasch zu einer nicht-nativen
Struktur, wenn sie aus einer Denaturierungslösung verdünnt
werden. Anschließend entwickelt sich in Abhängigkeit vom
jeweiligen Protein, seiner Konzentration, der Temperatur und
anderen Faktoren der nicht-native Zustand entweder weiter zu
einer aktiven gefalteten Spezies oder teilt sich in einen falsch
gefalteten oder zusammengeballten Zustand, der unwirksam ist.
Falls während des Verdünnens ungefalteter Proteine aus der
Denaturierungslösung GroEL zugegen ist, binden die nicht-nativen
Proteine an GroEL unter Bilden eines stabilen binären Komplexes.
(Goloubinoff et al., Nature, 342, 884, (1989)). Dies hat zwei
mögliche Konsequenzen. Bei Proteinen, die sich normalerweise
weiter spontan rückfalten, wird die Faltungsreaktion angehalten.
Außerdem werden Proteine, die sich unter diesen Bedingungen
falsch falten und zusammenballen, nun an GroEL gebunden und
bleiben in Lösung. An GroEL gebundene Proteine können
nachfolgend durch den Zusatz entweder von ATP oder einer Kombination
von ATP und dem Chaperonin GroES freigesetzt werden. Unter
diesen Bedingungen können Proteine, die sich ohne GroEL-Zusatz
ohnehin gefaltet hätten, dies weiter tun. Proteine, die sich
zusammengeballt hätten, werden jetzt jedoch zum produktiven
Faltungsweg hingelenkt. Übersichtsversuche zeigen, daß die meisten
E. coli-Proteine in einem komplexen Gemisch und viele einzelne
gereinigte Proteine mit GroEL in dieser Weise in Wechselwirkung
treten (Vutanen et al., Protein Sci., 1, 363, (1992); Gatenby,
Plant Mol. Biol., 19, 677, (1992)).
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In-vivo-Untersuchungen zeigen ferner, daß Chaperone das
erfolgreiche Falten von Proteinen in aktive Moleküle innerhalb von
Zellen beeinflussen. Durch Verwenden eines klonierten groE-
Operons (das für die Gene für die Proteine GroES und GroEL
kodiert) auf einem Mehrkopienplasmid ist es möglich, einen
breiten Bereich temperaturempfindlicher Mutationen mit falschem
Sinn zu unterdrücken, was anzeigt, daß das erfolgreiche Falten
thermolabiler Enzyme durch eine Überexprimierung der groES- und
groEL-Gene wiederhergestellt werden kann (Van Dyk et al.,
Nature, 342, 451, (1989)). Es ist in mehreren Berichten gezeigt
worden, daß durch Verwenden von Kombinationen verträglicher
Plasmide, wo ein Plasmid für das groE-Operon kodiert und das
zweite Plasmid für ein überproduziertes Fremdprotein kodiert,
die erhöhten Werte für molekulare Chaperone in der Zelle zu
beträchtlichen Ausbeuteverbesserungen an funktionellem
rekombinantem Protein führen (Goloubinoff et al., Nature, 337, 44 (1989);
Berry-Lowe et al., Plant Physiol., 99, 1597, (1992)).
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Der Verwendung des Doppelplasmidsystems zur erhöhten Produktion
von Fremdproteinen in Bakterien, insbesondere bei
Arbeitsvorgängen zur Maßstabsvergrößerung, wohnen jedoch mehrere Probleme
inne. Das Klonieren des groE-Operons auf einem Mehrkopienplasmid
führt zu sehr hohen Werten bei der Synthese von GroES- und
GroEL-Proteinen mit Zellen, die oft 30-50% ihres gesamten
Zellproteins als GroEL produzieren. Dies führt zu einem verringerten
biosynthetischen Fassungsvermögen in der Zelle für andere
Proteine einschließlich des gewünschten Fremdproteins und die
Gesamtausbeuten können verglichen mit dem möglichen Höchstwert
verringert sein. Diese Produktion auf einem hohen Wert
beeinflußt auch die groE-Plasmidstabilität, was zu Plasmiddeletionen
führt, die die Exprimierung der groE-Gene verringern. Diese
Deletionen sind während der Langzeitlagerung von Stämmen und
während der Zellkultur in großem Maßstab im Bereich von 10-200 1
beobachtet worden (Kalbach et al., Enzyme Microbiol. Technol.,
(im Druck) (1993)). Außerdem ist es offensichtlich, daß das
richtige Falten von Proteinen die konzertierte Aktion einer
Anzahl unterschiedlicher molekularer Chaperone erfordert und
nicht bloß auf GroES und GroEL beschränkt ist (Langer et al.,
Nature, 356, 683, (1992)). Obschon das Falten einiger Proteine
in vivo durch die groE-Überexprimierung erleichtert wird,
sprechen andere nicht auf groE an (Gatenby et al., Trends in
354, (1990)). Die Überexprimierung eines Bereiches molekularer
Chaperone kann zum Unterstützen des richtigen Faltens von
Proteinen erforderlich sein, die auf eine groE-Überexprimierung
allein nicht ansprechen. Dies kann durch Klonieren aller
Chaperongene auf kompatiblen Plasmiden erreicht werden. Dieses
Verfahren führt jedoch vermutlich erneut zu Stäminen, die große,
instabile Plasmide beherbergen. Ein bevorzugteres Verfahren kann
die allgemeine Aktivierung eines breiten Bereichs nativer
Hitzeschockproteine in Verbindung mit der Exprimierung des
Fremdproteins umfassen.
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Es scheint nun, daß die Steuerung der allgemeinen Exprimierung
von Hitzeschockproteinen durch einige, Sigmafaktoren genannte
Proteine geregelt werden kann. Sigma-32 ist der meistuntersuchte
dieser Faktoren. Grossman et al. (Cell, 38, 383, (1984))
offenbaren, daß das htpR-Gen von E. coli für einen positiven
Regulator der Hitzeschockantwort kodiert. Die Überexprimierung des
htpR-Gens und die nachfolgende Reinigung des Proteinproduktes
zeigte ein Sigma-32 genanntes Proteinprodukt mit 32 kDa.
Grossman et al. lehren, daß das Sigma-32-Protein für den
Transkriptionsstart bei Hitzeschockpromotoren verantwortlich ist.
Grossman et al. schlagen außerdem vor, das htpR-Gen in rpoH
umzubenennen und derzeit werden die beiden Ausdrücke austauschbar
verwendet.
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Indem sie die allgemeine Funktion des Sigma-32-Faktors
bestätigen, lehren Yano et al. (J. Bacteriol., 172, 2124, (1990)) eine
rpoH-Mutante, die bei oder über 34ºC nicht wachsen kann, da sie
ein verändertes Sigma-32-Protein produziert, dem weitgehend die
Transkription der Hitzeschockgene fehlt. Extragene
Suppressormutationen statteten den rpoH-Mutantenstamm mit der Fähigkeit aus,
bei 40ºC zu wachsen, und erhöhten die Sigma-32-Syntheserate und
die Induktion der Hitzeschockproteine deutlich.
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Das Koppeln der Regelung des Sigma-32-Faktors an die
Exprimierung von Fremdproteinen ist in der Technik offenbart. Debouck et
al. (EP 216 747) lehren ein Verfahren zum Exprimieren einer
Fremdpolypeptid-Kodierungssequenz in einer htpR&supmin;-E.-coli-Mutante,
die aufgrund des Abbaus durch Proteasen unter der Kontrolle des
htpR&spplus;-Gens in htpR&spplus;-E.-coli-Stämmen nicht stabil exprimiert wird.
Es wird weiter offenbart, daß die htpR&supmin;-Mutanten nicht für
Wildtyp-Sigma-32 kodieren und somit keine normale Hitzeschockantwort
eingehen können. Ähnlich lehrt Haley (WO-8503949) die
Entwicklung von htpR&supmin;-Mutanten, die keine La-Protease zur Exprimierung
von Fremdpolypeptiden aus E. coli produzieren können. Abrahamsen
et al. (EP 225 860) offenbaren ein Verfahren zur Exprimierung
und Sekretion von Proteinen in gramnegativen Bakterien durch
Einbauen eines DNA-Konstrukts in die Wirtszellen, welches für
ein Fremdprotein kodiert, bei dem die Proteinexprimierung von
der Induktion des natürlichen htpR-Gens abhängig ist. Das
Verfahren von Abrahamsen beruht auf der verallgemeinerten
Exprimierung von Hitzeschockproteinen unter Ergeben eines Lecks
der periplasmatischen Membran des transformierten Wirtes, was
die Ausscheidung des Fremdproteins in das Wachstumsmedium
gestattet.
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Easton et al. (Gene, 101, 291, (1991)) offenbart ein Verfahren
zur Herstellung von rinderinsulinähnlichem Wachstumsfaktor 2
(bIGF2) im Cytoplasma von E. coli, das eine rpoH-Mutation
enthält. Der bIGF2 wurde in Einschlußkörpern hergestellt und
stellte 20-25% des gesamten Zellproteins dar. Ähnlich lehren
Obukowicz et al. (Appl. Environ. Microbiol., 58, 1511, (1992)) neue
rpoH-Mutanten zu einer erhöhten heterologen Genexprimierung.
Expressionsuntersuchungen unter Verwenden des recA- oder araBAD-
Promotors und der Ribosomenbindungsstelle des T7-Phagengens 10L
zeigten, daß erhöhte Anreicherungswerte einer Anzahl
repräsentativer heterologer Proteine in den rpoH-Mutanten erhalten wurden.
Beispiele hergestellter heterologer Proteine schlossen die
human- und rinderinsulinähnlichen Wachstumsfaktoren 1 und 2 und
das Rinderplazentalactogen ein.
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Die vorstehend angeführten Verfahren sind zum Bewirken der
Exprimierung rekombinanter Proteine brauchbar, die für eine
Sigma-32-abhängige Proteolyse empfänglich sind oder in das
Wachstumsmedium ausgeschieden werden müssen. Mit einer Ausnahme
lehrt der gesamte vorstehend zitierte Stand der Technik, daß die
Regulierung des Sigma-32-Faktors nach unten zu einer erhöhten
Exprimierung von Fremdppolypeptiden führt. Die verbreitetste
Erklärung für dieses Phänomen ist die, daß den rpoH&supmin;-Mutanten der
Sigma-32-Faktor fehlt, was zu einer verschlechterten
Hitzeschockantwort führt. Aufgrund der Abwesenheit von Proteasen, die
sich aus der verschlechterten Hitzeschockantwort ergibt, wird
bei diesen Mutanten eine höhere Fremdproteinexprimierung
erwartet. Obschon das Verfahren von Abrahamsen (EP 225 860) die
Induktion des rpoH-Gens und die nachfolgende Zunahme der
Hitzeschockproteine lehrt, ist die hauptsächliche Motivierung, die
Ausscheidung des Proteins durch Andern der Durchlässigkeit der
periplasmatischen Membran zu gestatten, und es wird keine Angabe
zum Ausmaß der Fremdproteinexpression durch die Wirtszelle
gemacht. Es ist anzumerken, daß in dem Verfahren von Abrahamsen
ein voll funktionsfähiges Wildtyp-DnaK-Protein enthalten ist.
Außerdem ist in der Technik bekannt, daß Wildtyp-DnaK bei der
Erleichterung der natürlichen Proteinsekretion aus E. coli
wirksam ist (Wild et al., Genes Dev., 6, 1165, (1992)).
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Neuere genetische Beweise zeigen, daß es bei einem anderen
Hitzeschockprotein, DnaK, Steuerschlüsselfunktionen bei den
Werten für die Synthese, Aktivität und den Abbau von Sigma-32
gibt. DnaK (ein Mitglied der Hsp70-Proteinfamilie) ist das 70-
kDa-Produkt des dnaK-Hitzeschockgens und von ihm wird
angenommen, daß es zusammen mit anderen Hitzeschockproteinen unter
Bewirken des Rückfaltens oder der Synthese geschädigter
Zellproteine wirkt (LaRossa et al., Mol. Microbiol., 5 (3), 529,
(1991)). Von Mutationen bei dnaK, dnaH und grpE ist gezeigt
worden, daß sie eine teilweise Stabilisierung von Sigma-32 und
einen Verlust der Reprimierung der Hitzeschocktranskription
verursachen, die normalerweise bei Wildtypzellen nach einer
Temperaturänderung nach unten angetroffen wird (Straus et al.,
Genes Dev., 4, 2202, (1990), und Straus et al., Genes Dev., 3,
2003, (1989)). Von dem Mechanismus, durch den DnaK, DnaJ und
Grpe die Aktivität und Stabilität von Sigma-32 steuern, wird
angenommen, daß er auf der konzertierten Aktivität als Chaperone
beruht. Diese Aktivität umfaßt die ATP-abhängige Bindung an
Substrate von DnaK und die Stimulation der Hydrolyse von DnaK-
gebundenem ATP durch DnaJ und GrpE (Gamer et al., Cell, 69, 833
(1992)). Es ist vorgeschlagen worden, daß DnaK mit Sigma-32 in
Wechselwirkung tritt und es aus RNA-Polymerase abtrennt und
dadurch für Zellproteasen zugänglich macht.
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Im Gegensatz zu den rpoH-Mutanten sind dnaK-Mutanten bisher
nicht zur Exprimierung von Fremdpolypeptiden aus rekombinanten
Bakterien verwendet worden. Es scheint tatsächlich, daß die
Anwesenheit des DnaK-Proteins für die Exprimierung und
Ausscheidung einiger natürlicher und rekombinanter Proteine notwendig
sein kann. Wild et al. (Genes Dev., 6, 1165, (1992)) lehren, daß
die Translozierung von alkalischer Phosphatase in dnaK-Mutanten
von E. coli-Stämmen gehemmt wurde, was nahelegt, daß der Export
dieses Proteins wahrscheinlich das Dnak-Protein umfaßt. Murby et
al. (Biotechnol. Appl. Biochem., 14, 336, (1991)) offenbaren die
gemeinsame Exprimierung dreier rekombinanter Proteine (Human-
Promsulin, Ratten-Proteindisulfidisomerase und die alpha.1.2-
Kette des Human-T-Zellenrezeptors) als Fusionsproteine.
Unerwarteterweise wurde gefunden, daß die Fusionsproteine mit DnaK und
GroEL verbunden sind, was für diese HSP eine Funktion beim
Exprimieren der Fremdproteine anzeigte. Ähnlich lehren Hellebust
et al. (J. Bacteriol., 172, 5030, (1990)), daß durch eine
rekombinante E. coli exprimiertes Protein A mit dem DnaK-Protein
verbunden ist. Obschon es offensichtlich ist, daß DnaK bei der
Steuerung des Sigma-32-Faktors wirksam ist, ist es gleichermaßen
offensichtlich, daß es bei der Erleichterung der Exprimierung
verschiedener rekombinanter Proteine eine wichtige Rolle spielt.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren. zum Zweck der
Erhöhung der Exprimierung biologisch aktiver heterologer
Proteine bereit, das auf einer dnaK-Mutation beruht. Das vorliegende
Verfahren ist vom Stand der Technik eindeutig verschieden. Der
Stamm ohne dnaK produziert ein Protein ohne DnaK. Sigma-32 ist
in dieser Mutante in größeren Mengen zugegen. Die vorliegende
Erfindung zieht aus diesem Zustand innerhalb der Zelle Vorteil,
indem sie die Exprimierung biologisch aktiver heterologer
Proteine verstärkt. Der Stand der Technik lehrt eindeutig, daß die
Fremdpolypeptidexprimierung durch Erniedrigen der Sigma-32-Werte
verstärkt wird, was angeblich auf die niedrigeren Proteasewerte
zurückzuführen ist, die durch die verschlechterte
Hitzeschockantwort erreicht werden. Die Technik lehrt ferner, daß das
Wildtyp-DnaK-Protein bei der Exprimierung und Ausscheidung
heterologer Proteine notwendig und nützlich ist.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Verbesserung der
Ausbeute in Bakterien produzierter aktiver Fremdproteine bereit,
ohne die Kultur einer Temperaturänderung aussetzen zu müssen und
ohne die Notwendigkeit eines Doppelplasmidexpressionssystems. Es
wird angenommen, daß die Herstellungsausbeute kommerziell
wertvoller Proteine, wie etwa Hormone, Enzyme und anderer Proteine
verbessert werden kann, wenn die Exprimierung durch das
vorliegende Verfahren ausgeführt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung lehrt eine biologisch reine Kultur
einer transformierten dnaK-Mutante von Escherichia coli MF746,
die ein Expressionsplasmid beherbergt, das ein heterologes
Protein in biologisch aktiver Konformation produzieren kann.
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Die vorliegende Erfindung lehrt auch ein Verfahren zum
Herstellen biologisch aktiver heterologer Proteine in einer
transformierten Escherichia coli-dnaK-Mutantenwirtszelle, wobei das
Verfahren:
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a) das Exprimieren des heterologen Proteins in einer
biologisch aktiven Konformation in der Wirtszelle und
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b) das Ernten des heterologen Proteins mit einer biologisch
aktiven Konformation aus der Wirtszelle umfaßt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Figur 1 ist eine Plasmidkarte des Plasmids pANK1, das für
hexadekamere Rubisco kodiert.
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Figur 2 ist eine Plasmidkarte des Plasmids pRR2119, das für
dimere Rubisco kodiert.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die folgenden Ausdrücke können, so wie sie hierin verwendet
werden, zur Auslegung der Ansprüche und Beschreibung dienen.
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Der Ausdruck "gewünschtes Protein" bezieht sich auf jedes
Protein, das als aus genetisch veränderten Bakterien zu erhaltendes
Wertprodukt angesehen wird.
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Die Ausdrücke "heterologes Proteinu und "Fremdprötein" beziehen
sich auf jedes Protein, das in der Wirtszelle in der Natur nicht
anzutreffen ist. Diese Ausdrücke werden austauschbar verwendet.
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Der Ausdruck "biologisch aktives Protein" oder "biologisch
aktive Konformation" bezieht sich auf ein Protein in einer Form,
die die Funktion erfüllen kann, die es in der Natur hat. In der
vorliegenden Erfindung brauchbare, biologisch aktive Proteine
schließen Ribulosebisphosphat-Carboxylase, den insulinähnlichen
Faktor-1, Alfalfa-Glutaminsynthetase, Human-Mittelketten-Acyl-
CoA-Dehydrogenase, Amphibiensuperoxiddismutase, Dehydrogenase
aus Säugern für α-Ketosäuren mit verzweigter Kette und das
Brassica-S-Locusrezeptorkinase-Fusionsprotein ein, sind aber
nicht darauf beschränkt.
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Die Ausdrücke "Promotor" und "Promotorregion" beziehen sich auf
eine DNA-Sequenz, üblicherweise stromaufwärts der (5' bis zur)
Proteinkodierungssequenz eines Strukturgens, welche die
Exprimierung der Kodierungsregion durch Bereitstellen der Erkennung
für RNA-Polymerase und/oder andere Faktoren steuert, die zum
Start der Transkription an der richtigen Stelle erforderlich
sind. Promotorsequenzen sind notwendig, aber nicht immer
ausreichend,
um die Exprimierung des Gens zu lenken.
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Der Ausdruck "Fragment" oder "DNA-Fragment" bezieht sich auf
eine Fraktion der DNA-Sequenz der speziellen Region.
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Die Ausdrücke "Steuerung" und "steuern" beziehen sich auf die
Modulation der Genexprimierung, die durch DNA-Sequenzelemente
gesteuert wird, welche hauptsächlich, aber nicht ausschließlich
stromaufwärts des (5' bis zum) Transkriptionsstart eines Gens
angeordnet sind. Eine Steuerung kann zu einer vollständigen ader
überhaupt keiner Antwort auf eine Stimulation führen oder sie
kann zu Änderungen des Wertes für die Genexprimierung führen.
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Der Ausdruck "Konstruktion" oder "Konstrukt" bezieht sich auf
ein Plasmid, Virus, eine autonom replizierende Sequenz,
Phagen- oder Nukleotidsequenz, linear oder ringförmig, einer
einzeloder doppelsträngigen DNA oder RNA, die aus irgendeiner Quelle
stammt, bei der eine Anzahl Nukleotidsequenzen zu einer
einzelnen Konstruktion verbunden oder rekombiniert worden ist,
die ein Promotorfragment und eine DNA-Sequenz für ein
ausgewähltes Genprodukt zusammen mit der 3'-nicht-translatierten Sequenz
in eine Zelle einführen kann.
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Der Ausdruck "Transformation" bezieht sich auf den Erwerb neuer
Gene in einer Zelle nach dem Einbau von Nukleinsäure
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Der Ausdruck "funktionsfähig verbunden" bezieht sich auf die
Fusion zweier DNA-Fragmente in richtiger Ausrichtung und
richtigem Leserahmen, um in eine funktionsfähige RNA transkribiert
werden zu können.
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Der Ausdruck "Exprimierung" bezieht sich auf die Transkription
und Translation von einem für die Sequenz des Genproduktes
kodierenden Gen zu dem Genprodukt. Bei der Exprimierung wird
eine für die Sequenz des Genprodukts kodierende DNA-Kette zuerst
zu einer komplementären RNA transkribiert, die oft eine Boten-
RNA ist. Die transkribierte Boten-RNA wird zu dem Genprodukt
translatiert, falls das Genprodukt ein Protein ist.
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Der Ausdruck "Translationsstartsignal" bezieht sich auf eine
Einheit von drei Nukleotiden (Kodon) in einer Nukleinsäure, die
den Start der Proteinsynthese bezeichnet.
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Der hierin verwendete Ausdruck "Plasmid" bezieht sich auf ein
extrachromosomales Element, das oft Gene trägt, die nicht Teil
des zentralen Zellstoffwechsels sind, und üblicherweise in Form
ringförmiger doppelsträngiger DNA-Moleküle vorliegt. Plasmide
können sich autonom replizieren oder zum Einbau in das
Wirtsgenom befähigt sein.
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Der Ausdruck "Restriktionsendonuklease" bezieht sich auf ein
Enzym, das innerhalb einer speziellen Nukleotidsequenz innerhalb
doppelsträngiger DNA bindet und schneidet.
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Der Ausdruck "Hitzeschockprotein" bezieht sich auf jedes
Protein, das als Ergebnis einer Umweltbelastung wie etwa erhöhter
Temperatur oder durch Anwesenheit eines Angriffs aus der
Umgebung oder durch die Exprimierung der Sigma-32-Untereinheit der
RNA-Polymerase induziert wird. Typische Hitzeschockproteine
schließen die durch die Gene groEL, groES, dnaK, dnaJ, grpE,
lon, lysU, rpoD, htpG und clpD kodierten ein, sind aber nicht
auf diese beschränkt.
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Der Ausdruck "DnaK" bezieht sich auf ein Hitzeschockprotein mit
70 kDa, das an der Steuerung des Sigma-32-Faktors beteiligt ist.
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Der Ausdruck "dnaK" bezieht sich auf ein für das DnaK-Protein
kodierendes Gen.
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Der Ausdruck "dnaK-Mutante" bezieht sich auf jede Wirtszelle,
prokaryontisch oder eukaryontisch, die eine genetische Mutation
beherbergt, die zu einer veränderten Form eines DnaK-Proteins
führt und die beständig hohe Werte an Hitzeschockproteinen
produziert.
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Der Ausdruck "Sigma-32" bezieht sich auf eine
hitzeschockspezifische Untereinheit von 32 kDa einer RNA-Polymerase, welche der
Polymerase die Fähigkeit zum Transkribieren von
Hitzeschockproteinen vermittelt.
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Die Ausdrücke "Peptid", "Polypeptid" und "Protein" werden
austauschbar verwendet.
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Der Ausdruck "molekulares Chaperon" ist eine funktionelle
Definition, die sich auf eine Gruppe nicht verwandter Proteine
bezieht, die das richtige Falten anderer Polypeptide vermitteln,
selbst aber keine Bestandteile der funktionellen Endstrukturen
sind. Molekulare Chaperone können an vielen Zellvorgängen wie
etwa dem Verhindern eines vorzeitigen Faltens oder einer
Aggregation, dem Vermitteln der richtigen Proteinfaltung, dem
Erleichtern des Ausscheidens und der Membrantranslozierung,
beteiligt sein.
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Der Ausdruck "Rubisco" bezieht sich auf das Enzym D-Ribulose-
1,5-bisphosphat-Carboxylase, E. C. 4.1.1.39.
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Hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "ATCC" auf eine
Hinterlegung bei der in Rockville, Maryland, gelegenen American
Tissue Culture Collection. Die "ATCC Nr." ist die Zugangsnummer
für bei der ATCC hinterlegte Kulturen.
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Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur
verstärkten Produktion von Fremdproteinen in biologisch aktiver Form in
Bakterien. Das Verfahren umfaßt das Transformieren eines für ein
Fremdgen kodierenden Vektors in einen Escherichia coli-Stamm,
der eine Mutation enthält, so daß der Gehalt der Sigma-32-RNA-
Polymeraseuntereinheit erhöht wird, und der Gehalt an
Hitzeschockproteinen in der Zelle wird nachfolgend erhöht. Das
Kultivieren des transformierten Mutantenwirtes bei verschiedenen
Temperaturen und über unterschiedliche Zeiträume führt zur
verstärkten Exprimierung des Fremdproteins verglichen mit
Wildtyp-Transformanten.
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Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Zunahme
des Wirtszellengehaltes an Hitzeschockproteinen, die
gleichzeitig mit der Exprimierung des Fremdproteins stattfindet.
Verfahren zum Erhöhen der Zellgehalte an Hitzeschockproteinen
können in zwei Kategorien eingeteilt werden, die entweder die
direkte Induktion der Hitzeschockantwort durch Faktoren
außerhalb der Zelle oder wahlweise genetische Manipulation der
Transkriptions- oder Translationswege der Wirtszelle umfassen. Es
wird angenommen, daß beide Verfahren für die Zwecke der
Erfindung geeignet sind.
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Die direkte Induktion der Hitzeschockantwort kann durch Belasten
der Zelle mit irgendwelchen Umweltangriffen oder -giften bewirkt
werden, die zu einer Änderung des normalen Zellstoffwechsels
führen. Umweltangriffe können sowohl Chemikalien,
Umweltverunreinigungen, Temperaturänderungen, pH-Änderungen als auch Mittel
sein, die eine oxidative Schädigung, eine Schädigung der DNA,
Anaerobiose, Änderungen der Nitratverfügbarkeit oder eine
Pathogenese erzeugen. Obschon die Hitzeschockantwort typischerweise
mit Temperaturänderungen verbunden wird, ist von vielen
chemischen Substanzen einschließlich sowohl CdCl, HO, Ethanol,
Puromycin und Nalidixinsäure (VanBogelen et al., J. Bacteriol.,
169 (1), S. 26-32 (1987)) als auch Benzol, Chlorpyrivos, 2,4-
Dichloranilin, Dioctylphthalat, Hexachlorbenzol,
Pentachlorphenol, Trichlorethylen und Tetrapropylbenzolsulfonat (Blom et al.,
Appl. Environ. Microbiol., 58 (1), S. 331-334 (1992)), um nur
einige zu nennen, gezeigt worden, daß sie die Antwort
induzieren. Obschon angenommen wird, daß das Auslösen der
Hitzeschockantwort durch eine Umweltbelastung bei dem vorliegenden
Verfahren möglich ist, ist es nicht bevorzugt, da es wahrscheinlich
ist, daß eine Umweltbelastung auch den Zellstoffwechsel
nachteilig beeinflußt und deshalb zu einer schlechten Exprimierung
von Fremdproteinen führt.
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Die genetische Manipulation der Hitzeschockantwort umgeht die
Notwendigkeit, die Zelle einer Umweltbelastung auszusetzen,
während zur selben Zeit die Gehalte der Hitzeschockproteine in
der Zelle geändert werden. Typischerweise umfassen diese
Verfahren das Schaffen genetischer Mutanten, denen entweder die
Fähigkeit zum Herstellen der Sigma-32-RNA-Polymeraseuntereinheit
(z.B. rpoH&supmin;-Mutanten) fehlt, was zu niedrigeren Gehalten an
Hitzeschockproteinen in der Zelle führt, oder Mutanten, die
defekte Hitzeschockregulierungsproteine produzieren (z. B. dnaK&supmin;-
Mutanten), die weder die Synthese noch den Abbau der Sigma-32-
Untereinheit hemmen können, was zu hohen Gehalten an
Hitzeschockproteinen in der Zelle führt. Das vorliegende Verfahren
beharrt darauf, daß die Wirtszellenmutante erhöhte Zellwerte an
Hitzeschockproteinen umfaßt, wobei die dnaK-Mutanten bevorzugt
sind. Obschon die prinzipiellen Beobachtungen, welche die
Wechselwirkung des dnaK-Gens und Sigma-32 betreffen, in E. coli
durchgeführt worden sind, sind dnaK und Sigma-32-Homologe aus
einer Vielfalt prokaryontischer und eukaryontischer Spezies
isoliert worden. Es wird angenommen, daß das vorliegende
Verfahren in jeder Spezies ausführbar ist, bei der eine Regulierung
von Sigma-32 nach oben zu einer Zunahme der Hitzeschockproteine
in der Zelle führt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung
sind dnaK&supmin;-Mutationen beherbergende E. coli-Zellen bevorzugt.
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dnaK-Mutanten sind in der Technik bekannt. Wild et al. (P.N.A.S.
USA, 89, 7139, (1992)) beschreiben einen Satz von 37 E. coli-
dnaK-Mutanten, denen die Hitzeschockantwort in einigen Aspekten
fehlt. Das vorliegende Verfahren beruht auf der dnaK756
genannten dnaK&supmin;-Mutante, die in einer als MF746 bezeichneten Wirtszelle
angetroffen wird, welche durch Georgopoulos in Molec. Gen.
Genetic., 151:35 (1977), vollständig beschrieben wird. Diese
spezielle Mutante ist ferner als groPAB766, groPC766 und grpC766
beschrieben worden. dnaK756 wurde in Anwesenheit des lambdaartigen
Bakteriophagen isoliert und gestattet folglich die
lambda-Phagenvermehrung nicht. Von der Blockade, die durch die dnaK756-
Mutation auf das lambda-Phagenwachstum ausgeübt wird, ist
gezeigt worden, daß sie auf der Höhe der Phagen-DNA-Replizierung
erfolgt. Es wird angenommen, daß die dnaK756-Mutation, die von
dem MF746-Wirt beherbergt wird, für die Produktion eines
veränderten DnaK-Proteins verantwortlich ist, das den Abbau der
Sigma-32-Untereinheit hemmt, was zu erhöhten Werten der
Hitzeschockproteine und molekularen Chaperone in der Zelle führt.
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Vom Fachmann auf dem Gebiet der Bakterienmutagenese wird
erkannt, daß obschon DnaK756 vom vorliegenden Verfahren bevorzugt
wird, jede dnaK-Mutation voller Länge benützt werden kann.
Verfahren zur Selektion von DnaK-Mutationen sind bekannt und fallen
im allgemeinen unter zwei Verfahren. Bei dem ersten Verfahren
(Georgopoulos et al. in "The bacteriophage lambda" (A. D.
Hershey, Hrsg.), 553, New York Cold Spring Harbor Laboratory,
(1971)) wird eine Population von Wildtyp-E.-coli-Zellen durch
Einwirkenlassen von Nitrosoguanin mutagenisiert, in komplettem
Medium wachsen gelassen und anschließend auf LB-Platten
ausgestrichen, in die zwei verschiedene Phagen, λimmλcIhλ und
λimm&sup4;³&sup4;cIh&sup4;³&sup4; eingesät wurden. Große Kolonien, die bei 30ºC oder
37ºC wachsen, werden zur Charakterisierung isoliert. Die
Verwendung dieser beiden Phagen erfolgt zum Verringern des
Wachstums von Wildtypzellen. Der Fachmann erkennt, daß andere
Phagenkombinationen verwendet werden können und andere
Mutagenesevorschriften funktionieren könnten. Zellen, die auf den
Selektionsplatten wachsen, sind entweder mukoid, unfähig zum
Adsorbieren entweder der Phagen (und scheinen deshalb phagenresistent
zu sein) oder besitzen eine genetische Blockade, die eine
Phagenentwicklung verhindert. Kolonien der letzteren Klasse
enthalten mutmaßliche DnaK-Mutanten. Die Natur der Mutation kann auf
zwei Wegen bestätigt werden. Obschon eine Mutation in dnaK die
Phagen-DNA-Replizierung und das Wachstum unterbricht, wachsen
Phagen mit Mutationen im P-Gen (λπ) auf Zellen, denen dnaK
fehlt. Zweitens können transduzierende Phagen, die in ihrer DNA
das Wirt-wt-dnaK-Gen enthalten, auf der Mutante wachsen.
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Ein weiteres Verfahren (Itikawa et al., J. Bacteriol., 138, 339
(1979)) zum Selektieren von Mutationen in dnaK beruht auf dem
thyminlosen Tod bei nicht erlaubten Temperaturen. Zellen werden
zuerst mit Nitrosoguanidin oder einem anderen Mutagen
mutagenisiert. Da dnaK-Mutationen bei einer DNA-Synthese bei 43ºC oft
temperaturempfindlich sind, kann gegen Wildtypzellen durch
Inkubation
bei 43ºC in einem Medium ohne Thymin selektiert werden.
Überlebende Zellen werden als diejenigen angereichert, die keine
DNA-Synthese eingehen und können anschließend durch Wachstum auf
Platten bei einer erlaubten Temperatur isoliert werden. Die
mutmaßlichen dnaK-Mutanten können anschließend mittels
desselben, vorstehend beschriebenen Phagenwachstumspektrums mit λπ-
und dnaK&spplus;-transduzierendem Phagen und Wildtypphagen durchmustert
werden.
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Eine Vielfalt gewünschter Fremdproteine einschließlich Proteinen
mit industriellen, Forschungs- und pharmazeutischen Anwendungen
kann durch das vorliegende Verfahren exprimiert werden. Die am
besten auf die vorliegende Erfindung anwendbaren Proteine sind
die, von denen gezeigt worden ist, daß sie für eine richtige
Struktur auf verschiedenen Hitzeschockproteinen und moleklaren
Chaperonen basieren. Zum Beispiel haben Goloubinoff et al.
(Nature, 342, 884, (1989)) gezeigt, daß chemisch denaturierte D-
Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (Rubisco) in vitro durch
gereinigte E. coli-GroEL und -GroES renaturiert werden kann.
Ähnliche Wechselwirkungen mit Chaperonen sind für
Prä-β-lactamase, Citratsynthetase, Rhodanase und Maus-Dihydrofolatreduktase
(DHFR) (Vutanen et al., Protein Science, 1, 363, (1992))
gezeigt worden. Interessierende Proteine, die durch das Verfahren
und den Vektor dieser Erfindung exprimiert werden können,
schliesßen sowohl Enzyme wie etwa Carboxylasen, Decarboxylasen,
Nitrogenasen, Collagenasen, Aminotransferasen, Reduktasen,
Dehydrogenasen, Synthetasen, Oxidasen als auch verschiedene andere
Proteine wie etwa Hormone und Antikörperfragmente ein. Von den
vorgenannten Enzymen und Proteinen sind diejenigen bevorzugt,
von denen bekannt ist, daß sie in Anwesenheit von
Hitzeschockproteinen und Chaperonen korrekt gefaltet sind, einschließlich
Anacystis nidulans und Rhodospirillum
rubrum-Ribulosebisphosphat-Carboxylase, Klebsiella pneumoniae-Nitrogenase, Vibrio
fischeri-LuxR-Regulationsprotein, Human-Procollagenase, Gersten-
Glutamat-1-semialdehydaminotransferase, Erbsen-Ferredoxin-NADP&spplus;-
Oxidoreduktase, Decarboxylase aus Säugern für verzweigtkettige
α-Ketosäuren, menschliches Wachstumshormon,
Schweine-Citratsynthase,
Bacillus stearothermophilus-Lactatdehydrogenase, Thermus
thermophilus-Isopropylmalatdehydrogenase und
Isocitratdehydrogenase, Bacillus
stearothermophilus-Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Mitochondrienrhodanase, Hefeglucosidase, Fab-Fragment des
monoklonalen Antikörpers aus der Maus, rekombinantes
Immunotoxin, Escherichia coli-Glutaminsynthetase, Escherichia coli
Tryptophanase, Arthrobacter oxidans-6-Hydroxy-D-nicotinoxidase,
Ratten-Ornithintranscarbamoylase und Haferphytochrom. Am meisten
bevorzugt sind der Liste entnommene Proteine, welche aus dimerer
und hexadekamerer Ribulosebisphosphat-Carboxylase,
Alfalfa-Glutaminsynthetase, Human-Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenase,
Amphibien-Superoxiddismutase, Decarboxylase aus Säugern für
verzweigtkettige α-Ketosäuren und Brassica S-Locusrezeptorkinase-
Fusionsprotein bestehen.
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Das aus Pflanzen und Photosynthesebakterien und Algen isolierte
Rubiscoenzym katalysiert den Eintritt von CO in den
Photosynthesestoffwechsel und liefert Akzeptormoleküle, welche die
Produkte der Lichtreaktionen der Photosynthese verbrauchen. Zwei
Typen Rubisco mit ganz bestimmten quaternären Strukturen sind
bekannt. Die einfacheren Rubiscomoleküle stammen aus dem
purpurfarbenen schwefelfreien Photosynthesebaktenum Rhodospirillum
rubrum. Das Oligomer ist ein Dimer aus identischen, großen
Polypeptiduntereinheiten mit jeweils einer relativen Molmasse
von 50 500 Da. Die gebräuchlichere Form von Rubisco in Pflanzen
und Bakterien ist das strukturell komplexere Hexadekammer, das
acht große Untereinheiten mit jeweils einer Molmasse zwischen
50000 Da und 50500 Da und acht kleine Untereinheiten mit jeweils
einer Molmasse zwischen 12000 Da und 18000 Da (Gatenby et al.,
TIBTECH., 8, 354, (1990)) umfaßt. Es ist anzumerken, daß das
Verfahren der vorliegenden Erfindung diese beiden bedeutend
unterschiedlichen Formen des Rubiscoenzyms in biologisch aktiver
Form exprimieren kann.
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Das vorliegende Verfahren stellt ferner einen Vektor bereit, der
eine Wirtszelle transformieren kann, die ein heterologes DNA-
Fragment umfaßt, das für ein exprimierbares, gewünschtes
Fremdprotein
kodiert. Der Vektor enthält Sequenzen, welche die
Transkription und Translation des heterologen DNA-Fragments lenken,
einen selektierbaren Marker und Sequenzen, die die autonome
Replikation oder den Einbau in Chromosomen gestatten. Geeignete
Vektoren umfassen eine 5'-Region des heterologen DNA-Fragments,
die Transkriptionsstartkontrollen beherbergt, und eine 3'-Region
des DNA-Fragments, welche das Transkriptionsende steuert. Es ist
äußerst bevorzugt, daß beide Steuerregionen aus Genen stammen,
die zu E. coli homolog sind, obschon es sich versteht, daß
derartige Steuerregionen nicht aus den Genen stammen müssen, die
für die als Wirte für die Produktion gewählten speziellen
Spezies natürlich sind.
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Startkontrollregionen, die gebräuchlicher als Promotoren
bezeichnet werden, welche zum Lenken der Exprimierung homologer
DNA-Fragmente in E. coli nützlich sind, sind zahlreich und dem
Fachmann vertraut. Praktisch jeder Promotor, der die
Transkription des für das gewünschte Protein kodierenden Gens lenken
kann, ist für die vorliegende Erfindung geeignet, wobei die lac-
Promotoren bevorzugt sind.
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Regionen zur Terminierungskontrolle können auch aus
verschiedenen, gegenüber E. coli natürlichen Wirten oder gegebenenfalls
aus anderen bakteriellen oder eukaryontischen Wirten oder
Bakteriophagen oder Viren stammen. Gegebenenfalls kann eine E. coli-
Terminierungsstelle unnötig sein, sie ist jedoch am
bevorzugtesten mit inbegriffen.
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Zur intrazellulären Produktion des gewünschten Proteins wird für
das Protein kodierende DNA über ihr Startkodon mit der zur
Expressionskontrolle gewählten Region funktionsfähig verbunden, so
daß die Exprimierung zur Bildung der entsprechenden Boten-RNA
führt. Falls die Produktion eines Fusionsproteins gewünscht
wird, wird wahlweise für das gewünschte Protein kodierende DNA
an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende des für das
Fusionspartnerprotein kodierenden Gens verbunden. Wahlweise kann die umgekehrte
Ausrichtung aufgebaut werden, wo für das Fusionspartnerprotein
kodierende DNA an ihrem 5'-Ende mit dem 3'-Ende der für das
gewünschte Protein kodierenden DNA verbunden wird.
Gewünschtenfalls wird auch für ein Enzym oder einen chemisch spaltbaren
Linker kodierende DNA ohne Unterbrechung des Leserahmens
zwischen der für das gewünschte Protein kodierenden DNA und der für
den Fusionspartner kodierenden DNA eingebaut, so daß die
Exprimierung ein Fusionsprotein liefert, aus dem das gewünschte
Protein durch Enzym- oder chemische Spaltung freigesetzt werden
kann. Ein Beispiel des Weges über ein Fusionsprotein wird von
Contreras et al., Bio Technology, 9, 378, (1991), gegeben.
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Der Aufbau eines für die Exprimierung eines gewünschten Proteins
in einem Wirt der vorliegenden Erfindung geeigneten Vektors kann
mittels dem Fachmann wohlbekannte Mittel bewerkstelligt werden.
Die Quelle für das Gen, das für das gewünschte Protein kodiert,
kann entweder Chromosomen-DNA oder ein zuvor aufgebauter, das
Gen enthaltender Vektor sein.
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Das vorliegende Verfahren beruht auf zwei pANK1 (Figur 1) und
pRR2119 (Figur 2) bezeichneten Plasmiden. pANK1 umfaßt ein DNA-
Fragment, das für die großen und kleinen Untereinheiten der
hexadekameren Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Oxygenase
(Rubisco) aus Synechococcus PCC6301 kodiert, und wird bei Newman und
Gutteridge, J. Biol. Chem., 265:15154 (1990), vollständig
beschrieben. pRR2119 ist ein rekombinantes Plasmid, das ein DNA-
Fragment umfaßt, das für das dimere Rubisco aus Rhodospirillum
rubrum kodiert, und wird in Somerville, C. R. und Somerville, S.
C., Mol. Gen. Genet., 193:214 (1984), vollständig beschrieben.
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Das rekombinante Plasmid pANK1 stammte aus pUC18 mit einer
Inserierung des für die hexadekamere Form des Rubisco-Enzyms
kodierenden Gens. Sowohl die Abschnitte der großen als auch der
kleinen Untereinheiten der Rubisco-Gene stehen unter der
Kontrolle des lacZ-Promotors (Figur 1). Wie in der Technik
wohlbekannt ist, wird der lac-Promotor normalerweise in E. coli-
Wirten reprimiert und kann durch Zusatz von
Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) induziert werden, was zur Exprimierung des
Rubisco-Gens führt. Außerdem enthält pANK1 ein für die
Ampicillinresistenz kodierendes Gen, das als selektierbarer Marker
brauchbar ist.
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Das rekombinante Plasmid pRR211g ist 6,0 kb groß und wurde aus
zwei anderen Plasmiden, pRR116 und pSG21, aufgebaut und enthält
das für dimere Rubisco kodierende Gen unter der
Transkriptionskontrolle des E. coli-lac-Promotors (Figur 2). Wie pANK1 enthält
pRR2119 ein Gen für die Ampicillinresistenz und das Rubisco-Gen
ist mit IPTG induzierbar.
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Wirtszellen, die entweder vom Wildtyp sind oder die dnaK756-
Mutation enthalten, können mit den Vektoren der vorliegenden
Erfindung durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel transformiert
werden. Typischerweise wurden Zellen durch Behandlung mit CaCl
kompetent gemacht, mit dem gewünschten Vektor transformiert und
die sich daraus ergebenden Transformanten wurden durch
Standardverfahren für die Ampicillinresistenz auf Ampicillin
enthaltenden LB-Platten durchmustert. Der E. coli-Wirt MF746 wurde
entweder mit Plasmid oder Plasmid pRR2119 unter Herstellen der
Transformantenwirte MF746 (pANK1) beziehungsweise MF746 (pRR2119)
transformiert. In ähnlicher Weise wurde der E. coli-Wirt C600,
ein Wildtyp für DnaK, ebenfalls mit oder pRR2119
transformiert, was zu den Transformanten C600 (pANK1) und C600 (pRR2119)
führte.
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Zur Exprimierung des Rubisco-Proteins wurden einzelne Kolonien
auf eine Dichte von A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,3 kultiviert und mit 1 mM
Isopropylβ-D-thiogalactosid (IPTG) induziert. Proben wurden in
stündlichen Abständen entnommen und auf die Anwesenheit von Rubisco
analysiert.
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Zum Bestimmen der Gehalte an exprimiertem Rubisco-Protein wurden
induzierte Zellen aufgebrochen und auf Gesamtprotein und die
Anwesenheit des Rubisco-Enzyms analysiert. Das Aufbrechen der
Zellen wurde durch Standardverfahren mittels einer French-Presse
bewerkstelligt und der Zellextrakt wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt. Das Gesamtprotein wurde aus dem Überstand durch das
Verfahren von Biorad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) gemäß
der vom Hersteller gelieferten Vorschrift bestimmt.
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Die Anwesenheit von Rubisco kann durch eine Vielfalt Verfahren
einschließlich ELISA-Techniken (Metodiev et al., J. Exp. Bot.,
43, 155 (1992)) oder durch spektrophotometrische Verfahren (Lan
et al., Plant Physiol., 95:604 (1991)) bestimmt werden. Ein
bevorzugtes Verfahren umfaßt den Einbau von radiomarkiertem &sup4;C
wie bei (Goloubinoff et al., Nature, 342, 884 (1989))
beschrieben. Kurz gesagt wurden 100 µl Zellextraktüberstand einer Lösung
zugesetzt, die 100 mM Bicin-NaOH pH 8,0, 20 mM MgCl, 1 mM
Dithiothreit und 50 mM NaH[&sup4;C]O&sub3; (0,22 mCi/mMol) enthielt, und 10
Minuten bei 25ºC inkubiert. 1 mM Ribulosebisphosphat (RuBP)
wurde anschließend zugesetzt und das Gemisch wurde weitere 30
Minuten inkubiert; dann wurde die Reaktion mit 10% Essigsäure
beendet. Der Zusatz von Essigsäure vertreibt nicht eingebautes
&sup4;C und die Rubisco-Aktivität wird als Bildung von säurestabilem
&sup4;C in Phosphoglycerinsäure während 30 Minuten bei 25ºC gemessen.
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In den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden in
einen Vektor klonierte Fremdgensequenzen in einen E. coli-Stamm
transformiert, der die dnaK756-Mutation trägt. Der Vektor
enthält Sequenzen, die die Transkription und Translation des
Fremdgens lenken, einen selektierbaren Marker und Sequenzen, die die
autonome Replizierung oder den Chromosomeneinbau erlauben. Die
Transformierung und das Wachstum von Übernacht-Kulturen wird bei
30ºC durchgeführt, um die Selektion von Revertanten bei höheren
Temperaturen zu vermeiden. Die transformierten Wirtszellen
werden in einem geeigneten Medium kultiviert, welches das Wachstum
nur des transformierten Organismus erlaubt. Die Zellen werden
bei konstanter Temperatur innerhalb des Bereichs von 30-42ºC
über eine entsprechende Zeit nach der Induktion der Exprimierung
des Fremdgens kultiviert. Wenn die Anreicherung an biologisch
aktivem Fremdprotein ein Plateau erreicht hat, werden die Zellen
geerntet, aufgebrochen und das Fremdprotein wird isoliert.
Stämme mit der dnaK756-Mutation enthalten ein verändertes DnaK-
Protein, das die Hitzeschockantwort nicht negativ steuert.
Selbst bei 30ºC zeigten dnaK756-Zellen erhöhte Werte für die
Hitzeschock-Proteinsynthese und -Anreicherung und die Wirkung
wird ausgeprägter, wenn die Temperatur des Kulturmediums erhöht
wird. Während der Fremdproteinproduktion in dnaK756 bei 30ºC
werden verglichen mit Wildtyp-dnaK-Stämmen erhöhte Ausbeuten an
funktionellem Protein erhalten. Die Ausbeuten werden weiter
erhöht, wenn die Temperatur für das Zellwachstum erhöht wird und
die höchste Anreicherung an aktivem Fremdprotein wird im Bereich
von 37-42ºC erhalten.
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Es ist anzumerken, daß diese Erfindung nicht von einer
biologischen Erklärung der Beobachtung des Verhaltens dieses
Expressionssystems abhängt. Obschon die Erfindung nicht auf eine
bestimmte Theorie eingeschränkt ist, haben wir für die
angestellten Beobachtungen eine vernünftige Erklärung.
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Es ist bekannt, daß der dnaK756-Stamm eine veränderte Form des
DnaK-Proteins synthetisiert, was zu einem hitzeempfindlichen
Phänotyp und dem Versagen beim Unterstützen der Replikation von
Bakteriophagen-DNA führt. Das Wildtyp-DnaK-Protein steuert die
Werte für die Exprimierung der Hitzeschock- oder
stressgesteuerten Proteine in E. coli. In den gegenwärtigen Modellen wird dies
durch Binden von DnaK an die Sigma-32-Untereinheit der
RNA-Polymerase erreicht, was die Empfindlichkeit dieser Untereinheit
gegenüber der Proteolyse erhöht und auf diese Weise den Gehalt
dieser Untereinheit in der Zelle vermindert. Die Exprimierung
der Hitzeschockgene erfordert die Transkription aus speziellen
Promotoren, die nur durch RNA-Polymerase erkannt werden, die die
Sigma-32-Untereinheit enthält, deshalb wird die Exprimierung in
Abwesenheit dieser Untereinheit vermindert. Eine Eigenschaft des
DnaK756-Proteins ist, daß es nicht wirksam an die
Sigma-32-Untereinheit bindet und die Untereinheit deshalb durch Proteasen
nicht so rasch abgebaut wird. Die sich daraus ergebenden höheren
Sigma-32-Werte in der Zelle erlauben eine erhöhte Transkription
aus den Sigma-32-kontrollierten Promotoren und die
Hitzeschockproteine
einschließlich der molekularen Chaperone reichem sich
auf höhere als übliche Werte im Temperaturbereich von 30-42ºC
an. Die Produktion der in dem dnaK756-Stamm exprimierten aktiven
Fremdproteine ist verglichen mit Wildtyp-dnaK-Stämmen erhöht.
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Die folgenden Beispiele sind zum Veranschaulichen der Erfindung
bestimmt, sind aber nicht dazu gedacht, sie in irgendeiner Weise
zu beschränken. Geeignete, hierin eingesetzte gentechnische
Verfahren werden bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual - Band 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory:
Cold Spring Harbor, New York, 1989) und in den Anweisungen
beschrieben, welche die im Handel erhältlichen gentechnischen
Kits begleiten. Bakterienkulturen und Plasmide zum Durchführen
der vorliegenden Erfindung sind entweder im Handel erhältlich
oder bei der ATCC hinterlegt und sind zusammen mit ihren Quellen
im Text und den folgenden Beispielen angegeben. Solange nicht
anders angegeben, wurden in den folgenden Beispielen verwendete
Standardreagenzien und -lösungen von der Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO) geliefert.
BEISPIEL 1
Erhöhte Produktion der hexadekameren
Form von Rubisco im E. coli-Stamm MF746
-
Die E. coli-Stämme MF746 und C600 wurden mit dem
Rubisco-Expressionsplasmid pANK1 gemäß dem nachstehend ausgeführten
Verfahren transformiert. Transformanten wurden bei 37ºC in
Flüssigkultur in LB-Medium, das 0,2% Glucose und 50 µg Ampicillin je ml
enthielt, auf A&sub6;&sub0;&sub0; 0,3 gezüchtet und mit 1 mM IPTG induziert.
Proben von 15 ml wurden 1 und 2 h nach der Induktion entnommen
und die Zellen wurden wie vorstehend beschrieben aufgebrochen
und bestimmt. Die Enzymaktivität für beide Transformanten wird
in Tabelle I angegeben und wird als nMol CO, das in
säurestabiles Material eingebaut ist, je min je mg Protein ausgedrückt.
Wirtsbakterien:
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Der E. coli-Stamm MF746 (thr-1, dnaK756, tonA21, lacY1, supE44,
λ&supmin;) oder der E. coli-Stamm C600 (thr-1, toA21, lacY1, supE44,
λ&supmin;)
wurden als Transformationsempfänger verwendet. Der E. coli-
Stamm MF746 wurde von Dr. Barbara J. Bachmann, E. coli Genetic
Stock Center, Department of Biology 255 OML, Yale-Universität,
Postfach 6666, New Haven, CT 06511-7444, erhalten. Die Stock
Center-Stammnummer ist CGSC 5829. Der Stamm ist auch als CG756
und GR756 beschrieben worden. Die interessierende Mutation in
dem Stamm ist dnaK756 (Georgopoulos, C. P., Molec. Gen. Genet.
151:35 (1977)). Der E. coli-Stamm MF746 stammte von dem E. coli-
Stamm C600. Der E. coli-Stamm C600 wurde als
Wildtyp-dnaK-Kontrolle verwendet. Der E. coli-Stamm C600 wurde von Stratagene,
11099 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, erhalten.
Plasmide:
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Das rekombinante Plasmid pANK1 wurde von Dr. S. Gutteridge,
Central Research and Development, DuPont, erhalten und kodiert
für die Gene für die große und kleine Untereinheit der
hexadekammeren Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Oxygenase
(Rubisco) aus Synechococcus PCC6301.
E. coli-Transformation und Wachstum:
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Zellen des E. coli-Stammes MF746 und des E. coli-Stammes C600
wurden durch CaCl-Behandlung kompetent gemacht, mit den
Expressionsplasmiden pANK1 transformiert und auf 0,2% Glucose und 50
µg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Platten wurden bei 30ºC
Transformanten mit Ampicillinresistenz selektiert. Einzelne Kolonien
wurden in flüssiges. LB-Medium, das 0,2% Glucose und 50 µg/ml
Ampicillin enthielt, eingeimpft und über Nacht unter Schütteln
bei 30ºC kultiviert. Die Kulturen in stationärer Phase wurden in
frisches Medium 1:50 verdünnt und unter Schütteln bei der
konstanten Temperatur von 37ºC kultiviert. Als die Zelldichte eine
A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,3 erreicht hatte, wurde eine aliquote Menge von 15 ml
entnommen, die Zellen wurden durch 10 min Zentrifugieren bei
10000 x g gesammelt und die pelletierten Zellen wurden gefroren
aufbewahrt. Auf die Entnahme einer ersten aliquöten Menge
folgend wurde 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) (BRL,
Gaithersburg, MD) dem Rest der Kultur unter Induzieren der
Exprimierung des Plasmid-kodierten Fremdproteins zugesetzt. Weitere
Proben
wurden in Abständen von 1 Stunde entnommen.
Aufbrechen der Zellen und Proteinanalyse:
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Gefrorene Zellpellets wurden aufgetaut und in 3 ml 100 mM Bicin-
NaOH pH 8,0, 20 mM MgCl, 1 mM Dithiothreit, 5 µg/ml
Desoxyribenuklease I (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) erneut
suspendiert, gefolgt vom Aufbrechen durch Durchlaufen einer French-
Druckzelle (SLM Instruments Inc.) bei 20000 psi. Der Zellextrakt
wurde 30 min bei 40000 x g zentrifugiert und der Überstand
zurückbehalten. Das Gesamtprotein wurde an dem Überstand durch
das Verfahren von Biorad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)
gemäß der durch den Hersteller gelieferten Vorschrift bestimmt.
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Rubisco-Bestimmungen wurden in einem Endvolumen von 300 µl, das
100 mM Bicin-NaOH pH 8,0, 20 mM MgCl, 1 mM Dithiothreit, 50 mM
NaH[&sup4;C]O&sub3; (0,22 mCi/mMol), 1 mM Ribulosebisphosphat (RuBP) und
100 µl Zellextrakt enthielt, im wesentlichen wie bei Goloubinoff
et al., Nature, 342, 884 (1989) beschrieben, durchgeführt. Alle
Bestandteile außer RuBP wurden in einem Volumen von 288 µl
gemischt und 10 min bei 25ºC inkubiert. Ribulosebisphosphat wurde
von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten und
Na-H[&sup4;C]O&sub3; (0,22 mCi/mMol) wurde von New England Nuclear Co.
(Boston, Mass.) erhalten.
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Der Test wurde durch Zugabe von 12 µl 25 mM RuBP gestartet und
es wurde 30 min bei 25ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch
Zugabe von 700 µl 10% Essigsäure angehalten und der Inhalt der
Reaktionsröhrchen wurde bei 85ºC getrocknet. Der getrocknete
Rückstand wurde in 500 µl Wasser gelöst, mit 10 ml Ready Safe
Szintillationscocktail (Beckman Instruments) gemischt und die
eingebaute Radioaktivität wurde durch
Flüssigkeitsszintillationszählen bestimmt. Die Proteinprofile in den Zellextrakten
wurden durch Elektrophorese auf 6 oder 10% Polyacrylamidgelen in
Anwesenheit oder Abwesenheit von Natriumdodecylsulfat
untersucht, gefolgt vom Anfärben der Gele mit Coomassiebrillantblau
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).
TABELLE I
Rubisco-Aktivität in NANKL-transformierter E. coli
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Wie aus Tabelle I ersehen werden kann, wird die Expression
aktiver hexadekamerer Rubisco in dem dnaK-Mutantenstamm im
Gegensatz zum Wildtyp um das 2- bis 3fache verstärkt.
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Der E. coli-Stamm MF746 wurde am 18. März 1993 bei der ATCC
unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und
durch die ATCC-Nummer 69267 identifiziert.
BEISPIEL 2
Verstärkte Produktion der hexadekameren Form von Rubisco
im E. coli-Stamm MF746 in einem Temperaturbereich
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Die E. coli-Stämme MF746 und C600 wurden mit dem
Rubisco-Expressionsplasmid pANK1 wie zuvor beschrieben transformiert.
Transformanten wurden bei 30, 37 oder 42ºC in Flüssigkultur in
LB-Medium, das 0,2% Glucose und 50 µg je ml Ampicillin enthielt,
auf A&sub6;&sub0;&sub0; 0,3 kultiviert. Die Rubisco-Exprimierung wurde 1 h mit
1 mM IPTG induziert, wonach Proben von 15 ml entnommen wurden
und die Zellen wie zuvor beschrieben aufgebrochen und bestimmt
wurden. Die Enzymaktivität für beide Transformanten wird in
Tabelle II angegeben und wird als nMol CO, das in säurestabiles
Material eingebaut ist, je min je mg Protein ausgedrückt.
Wirtsbakterien:
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Der E. coli-Stamm MF746 (thr-1, dnaK756, tonA21, lacY1, supE44,
λ&supmin;) oder der E. coli-Stamm C600 (thr-1, Lona21, lacY1, supE44,
λ&supmin;) wurden als Transformationsempfänger verwendet.
Plasmide:
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Das rekombinante Plasmid pANK1 wurde von Dr. S. Gutteridge,
Central Research and Development, DuPont, erhalten und kodiert
für die Gene für die große und kleine Untereinheit der
hexadekameren Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Oxygenase (Rubisco) aus
Synechococcus PCC6301. Plasmid pANK1 wird bei Newman, J. und
Gutteridge, S., J. Biol. Chem. 265:15154 (1990), beschrieben.
E. coli-Transformation und Wachstum:
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Zellen des E. coli-Stammes MF746 und des E. coli-Stammes C600
wurden durch CaCl-Behandlung kompetent gemacht, mit den
Expressionsplasmiden pANK1 transformiert und auf 0,2% Glucose und 50
µg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Platten wurden bei 30ºC
Transformanten mit Ampicillinresistenz selektiert. Einzelne Kolonien
wurden in flüssiges LB-Medium, das 0,2% Glucose und 50 µg/ml
Ampicillin enthielt, eingeimpft und über Nacht unter Schütteln
bei 30ºC kultiviert. Die Kulturen in stationärer Phase wurden in
frisches Medium 1:50 verdünnt und unter Schütteln bei einer aus
30, 37 und 42ºC gewählten konstanten Temperatur in getrennten
Kulturkolben kultiviert. Als die Zelldichte eine A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,3
erreicht hatte, wurde eine aliquete Menge von 15 ml entnommen, die
Zellen wurden durch 10 min Zentrifugieren bei 10000 x g
gesammelt und die pelletierten Zellen wurden gefroren aufbewahrt. Auf
die Entnahme einer ersten aliqueten Menge folgend wurde 1 mM
Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) (BRL, Gaithersburg, MD) dem
Rest der Kultur unter Induzieren der Exprimierung des
Plasmidkodierten Fremdproteins zugesetzt. Weitere Proben wurden in
Abständen von 1 Stunde entnommen.
Aufbrechen der Zellen und Proteinanalyse:
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Gefrorene Zellpellets wurden aufgetaut und in 3 ml 100 mM Bicin-
NaOH pH 8,0, 20 mM MgCl, 1 mM Dithiothreit, 5 µg/ml
Desoxyribenuklease I erneut suspendiert. Das Aufbrechen der Zellen, die
Gesamtproteinbestimmung und die Rubisco-Bestimmung wurden wie in
Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
TABELLE II
Rubisco-Aktivität in DANKI-transformierter E. coli
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Wie aus Tabelle II ersehen werden kann, wird die Expression von
aktiver hexadekamerer Rubisco in dem dnaK-Mutantenstamm im
Gegensatz zum Wildtyp um das 3- bis 4fache verstärkt.
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Der das Rubisco-Expressionsplasmid pANK1 enthaltende E. coli-
Stamm MF746 wurde am 18. März 1993 bei der ATCC unter den
Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und durch die
ATCC-Nummer 69268 identifiziert.
BEISPIEL 3
Erhöhte Produktion der dimeren Form
von Rubisco im E. coli-Stamm MF746
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Die E. coli-Stämme MF746 und C600 wurden mit dem dimeren
Rubisco-Expressionsplasmid pRR2119 transformiert. Transformanten
wurden bei 37ºC in Flüssigkultur in LB-Medium, das 0,2% Glucose und
50 µg je ml Ampicillin enthielt, auf A&sub6;&sub0;&sub0; 0,3 kultiviert. Eine
Probe von 15 ml wurde entnommen, 1 mM IPTG wurde zur Induktion
zugesetzt und eine zweite Probe von 15 ml wurde 1 h nach der
Induktion entnommen. Die Zellen wurden wie zuvor beschrieben
aufgebrochen und bestimmt. Die Enzymaktivität für beide
Transformanten wird in Tabelle III angegeben und wird als nMol CO,
das in säurestabiles Material eingebaut ist, je min je mg
Protein ausgedrückt.
Wirtsbakterien:
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Der E. coli-Stamm MF746 (thr-1, dnaK756, toA21, lacY1, supE44,
λ&supmin;) oder der E. coli-Stamm C600 (thr-1, toA21, lacY1, sup444,
λ&supmin;) wurden als Transformationsempfänger verwendet.
Plasmide:
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Das rekombinante Plasmid pRR2119 wurde von Dr. C. R. Somerville
(DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, East
Lansing, MI 48824) erhalten und kodiert für die Gene der dimeren
Rubisco aus Rhodospirillum rubrum. Plasmid pRR2119 wird bei
Somerville, C. R. und Somerville, S. C., Mol. Gen. Genet.
193:214 (1984) beschrieben.
E. coli-Transformation und Wachstum:
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Der E. coli-Stamm MF746 (thr-1, dnaK756, toA21, lacY1, supE44,
λ&supmin;) oder C600 (thr-1, toA21, lacY1, supE44, λ&supmin;) wurden als
Transformationsempfänger verwendet. Unter Verwenden dem Fachmann
wohlbekannter Techniken wurden die Zellen durch CaCl-Behandlung
kompetent gemacht, mit dem Expressionsplasmid pRR2119
transformiert und auf 0,2% Glucose und 50 µg/ml Ampicillin enthaltenden
LB-Platten wurden bei 30ºC Transformanten mit
Ampicillinresistenz selektiert. Einzelne Kolonien wurden in flüssiges LB-
Medium, das 0,2% Glucose und 50 µg/ml Ampicillin enthielt,
eingeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 30ºC kultiviert.
Die Kulturen in stationärer Phase wurden in frisches Medium 1:50
verdünnt und unter Schütteln bei einer konstanten Temperatur von
37ºC kultiviert. Als die Zelldichte eine A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,3 erreicht
hatte, wurde eine aliquote Menge von 15 ml entnommen, die Zellen
wurden durch 10 min Zentrifugieren bei 10000 x g gesammelt und
die pelletierten Zellen wurden gefroren aufbewahrt. Auf die
Entnahme der ersten aliqueten Menge folgend wurde 1 mM
Isoprepyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) (BRL, Gaithersburg, MD) dem Rest
der Kultur unter Induzieren der Exprimierung des
Plasmid-kodierten Fremdproteins zugesetzt. Weitere Proben wurden in
Abständen von 1 Stunde entnommen.
Aufbrechen der Zellen und Proteinanalyse:
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Gefrorene Zellpellets wurden aufgetaut und in 3 ml 100 mM Bicin-
NaOH pH 8,0, 20 mM MgCl, 1 mM Dithiothreit, 5 µg/ml
Desoxyribenuklease 1 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) erneut
suspendiert. Das Aufbrechen der Zellen, die Gesamtproteinbestimmung
und die Rubisco-Bestimmung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt.
TABELLE III
Rubisco-Aktivität in pRR2119-transformierter E. coli
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Wie aus den Daten von Tabelle III ersehen werden kann, wird die
Expression von dimerer Rubisco in den dnaK756-Mutanten im
Gegensatz zum Wildtypwirt um das 1,5- bis 2,5fache verstärkt.
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Der das Rubisco-Expressionsplasmid pRR2119 enthaltende E. coli-
Stamm MF746 wurde am 18. März 1993 bei der ATCC unter den
Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und durch die
ATCC-Nummer 69266 identifiziert.