DE3586189T2

DE3586189T2 - Menge und verfahren zur herstellung rekombinierter erzeugnisse in grosser ausbeute.

Info

Publication number: DE3586189T2
Application number: DE8585901721T
Authority: DE
Inventors: Lawrence P Casson; Stephen A Goff; L Goldberg
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1984-03-06
Filing date: 1985-03-06
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2005-03-07
Also published as: AU4067985A; EP0174367A1; JPH0775550B2; EP0174367B1; ATE77104T1; DE3586189D1; JPH06261746A; AU594015B2; WO1985003949A1; US4758512A; EP0174367A4; JPS61501307A; JPH0771483B2

Description

Die hierin beschriebene Erfindung wurde während einer durch ein Stipendium der National Institutes of Health, U.S.Department of Health and Human Services, unterstützten Arbeit gemacht.

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft verbesserte Wirtsorganismen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Produkte in hohen Ausbeuten. Insbesondere betrifft diese Erfindung Wirtsstämme, die innerhalb ihrer DNA-Sequenzen spezifische Mutationen tragen, die eine reduzierte Fähigkeit der Zellen zum Abbau fremder Produkte auf Grund der reduzierten Expression zellulärer Proteasen verursachen, und die Verwendung dieser Stämme als Wirtszellen zur Herstellung erhöhter Ausbeuten an genetisch manipulierten fremden Proteinen, Polypeptiden und anderen Produkten. Die erfindungsgemäß offenbarten Verfahren erlauben vorteilhafterweise die Herstellung in hohen Ausbeuten von fremden rekombinanten Proteinen, Polypeptiden oder Produkten in Wirten, die gewöhnlich solche Produkte nicht erzeugen.

STAND DER TECHNIK

Die Entwicklung der DNA-Rekombinationstechnik ermöglicht die Herstellung fremder Produkte in Wirtszellen, die mit fremden, diese Produkte codierenden DNA-Sequenzen transformiert wurden. Im allgemeinen wird zur Bildung eines rekombinanten DNA-Moleküls die die gewünschte Aminosäure, ein Polypeptid oder Protein codierende DNA an einer geeigneten Stelle in ein Expressionsvehikel eingefügt. Dieses Molekül wird dann zur Transformation eines kompatiblen Wirts verwendet und anschließend wird der Wirt gezüchtet, um die insertierte DNA-Sequenz zu exprimieren und um das von dieser DNA-Sequenz codierte Produkt zu erzeugen. Diese Rekombinationstechniken wurden zur Produktion eukaryontischer und viraler Proteine in bakteriellen Wirten verwendet. Dazu gehören zum Beispiel das Leukozyten-Interferon [S. Nagata et al., "Synthesis In E. coli Of A Polypeptide With Human Leukocyte Interferon Activity", Nature 284, S.316 - 320 (1980)], Antigene des humanen Hepatitis B Virus [C. J. Burrell et al., "Expression in Escherichia coli of Hepatitis B Virus DNA Sequences Cloned In Plasmid pBR322", Nature 279, S. 43 - 47 (1979), M. Pasek et al., "Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. coli", Nature 282, S. 575 - 579 (1979)], SV40t Antigen [T. M. Roberts et al., "Synthesis Of Simian Virus 40t Antigen In Escherichia coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, S. 5596 - 5600 (1979)], und FMD virale Antigene [H. Kupper et al., "Cloning Of cDNA Of Major Antigen Of Foot And Mouth Disease Virus And Expression In E. coli", Nature 289, S. 555 - 559 (1981)].
Die kommerzielle Herstellung von fremden Proteinen, Polypeptiden und anderen Produkten durch DNA-Rekombinationstechniken in großtechnischem Maßstab wurde oft durch den intrazellulären Abbau des rekombinanten Produkts durch die Wirtszelle, in der dieses erzeugt wurde, eingeschränkt. In einer gegebenen Wirtszelle werden fremde oder andere abnormale Proteine schnell zu Peptiden oder Aminosäuren abgebaut. Weiterhin fand man, daß bei hohen Temperaturen (z.B. über 40ºC) der Abbau sowohl dieser abnormalen Proteine als auch der normalen Zellproteine noch schneller erfolgte [S. Lin und I. Zabin, J. Biol. Chem. 247, S. 2205 - 2211 (1972); A. St. John et al., J. Biol. Chem. 253, S. 3945 - 3951 (1978)]. Dies beruht auf der Tatsache, daß bei solch hohen Temperaturen sowohl normale als auch fremde Proteine dazu neigen, strukturell weniger stabil zu sein und denaturiert, d.h. abnormal zu werden, was zu einer Erhöhung ihrer Zugänglichkeit für intrazelluläre Proteasen führt.
Dieser Abbau abnormaler Proteine erfordert Stoffwechselenergie [J. D. Kowit und A. L. Goldberg, "Intermediate Steps In The Degradation Of A Specific Abnormal Protein In Escherichia Coli", J. Biol. Chem. 252, S.8350 - 8357 (1977); H. Olden und A. L. Goldberg, "Studies Of The Energy Requirement For Intracellular Protein Degradation in Escherichia coli", Biochim. et Biophys. Acta. 542, S. 385 - 398 (1978)]. Eine ATP- abhängige Protease, Protease La, katalysiert den einleitenden, geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt des intrazellulären Proteinabbaus [C. H. Chung und A. L. Goldberg, "The Product Of The lon (capR) Gene In Escherichia coli In The ATP-Dependent Protease, Protease La", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, S. 4931- 4935 (1981); F. S. Larimore et al., "Studies Of The ATP-Dependent Proteolytic Enzyme Protease La In E. coli", J. Biol. Chem. 257, S. 4187 - 4195 (1982); L. Waxman und A. L. Goldberg, "Protease La From E. coli Hydrolyzes ATP And Proteins In A Linked Fashion", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, S. 4883 - 4887 (1982)]. Protease La wird von dem lon-Gen codiert, das auch als capR- oder deg-Gen bezeichnet wird [Chung und Goldberg, siehe oben]. lon-Gen Mutanten erzeugen eine defekte, aber noch teilweise aktive Protease [Chung und Goldberg, siehe oben; C. H. Chung et al., "Studies Of The Protein Encoded By The lon Mutation capR9 In Escherichia coli: A Labile Form Of The ATP-Dependent Protease La That Inhibits The Wild-Type Protease", J. Biol. Chem. 258, S. 215 - 221 (1983)] und zeigen eine reduzierte Fähigkeit zum Abbau abnormaler Proteine [S. Gottesman und D. Zipser, "deg Phenotype Of E. coli lon Mutants", J. Bacteriol. 133, S. 844 - 851 (1978); Kowit und Goldberg, siehe oben). Obwohl lon Mutanten eine reduzierte Fähigkeit zum Proteinabbau aufweisen, zeigen sie doch noch eine deutliche Abbaufähigkeit (ungefähr 1/3 bis 1/2 der normalen Aktivität). Zusätzlich ist ihre Verwendung als Wirte bei DNA-Rekombinationstechniken aufgrund verschiedener unerwünschter charakteristischer Phänotypen dieser lon-Mutanten im Hinblick auf ihre Lebensfähigkeit eingeschränkt. Dazu gehören größere Empfindlichkeit gegenüber ultravioletter Strahlung und die Überproduktion zellulärer Mucopolysaccharid-Schleimkapseln. Bisher waren Mutanten, die die Funktion des lon-Gens vollständig eliminiert haben, nicht verfügbar.
Bis heute war das Potential der DNA-Rekombinationstechnik zur kommerziell durchführbaren Herstellung von brauchbaren Mengen fremder rekombinanter Produkte in Ermangelung lebensfähiger Wirte, die durch eine reduzierte Fähigkeit zum Abbau fremder Produkte gekennzeichnet sind, eingeschränkt.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung löst die oben beschriebenen Probleme durch die Bereitstellung verbesserter Wirtsorganismen und Verfahren zur Herstellung fremder Proteine, Polypeptide oder anderer Produkte in solchen, mit diese Produkte codierenden DNA-Sequenzen transformierten Wirtsorganismen. Insbesondere betrifft diese Erfindung Wirtszell-Stämme, die innerhalb ihrer DNA-Sequenzen spezifische Mutationen tragen, die eine reduzierte Fähigkeit der Zellen zum Abbau fremder Produkte aufgrund der reduzierten Expression zellulärer Proteasen verursachen und die Verwendung dieser Stämme zur Herstellung erhöhter Ausbeuten an genetisch manipulierten fremden Proteinen, Polypeptiden und anderen Produkten.
Aufgrund dieser Erfindung ist es möglich, hohe Ausbeuten des gewünschten Proteine, Polypeptids oder anderer Produkte in Wirtszellen, die durch eine reduzierte Fähigkeit zum Abbau fremder Produkte gekennzeichnet sind, zu erhalten.
Wie aus der folgenden Beschreibung abgeleitet werden kann, erlauben die erfindungsgemäßen Wirtsstämme und Verfahren die Herstellung fremder rekombinanter Produkte in großtechnischem Maßstab mit hohen Ausbeuten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt in einer Tabelle den Gehalt an aus htpR Mutanten bei 30º und 42ºC isolierter Protease La.
Figur 2 zeigt in einer vergleichenden graphischen Darstellung den Abbau (in Prozent) verschiedener unvollständiger E. coli Polypeptide, die Puromycin eingebaut haben, in Abhängigkeit von der Zeit.
Figur 3 zeigt in einer vergleichenden graphischen Darstellung den Abbau (in Prozent) verschiedener unvollständiger E. coli Proteine, die Canavanin anstelle von Arginin enthalten, in Abhängigkeit von der Zeit.

DIE BESTE ART ZUR DURCHFÜHRUNG DIESER ERFINDUNG

Zum besseren Verständnis der hierin aufgeführten Erfindung folgt eine ausführliche Beschreibung.
In der Beschreibung werden folgende Begriffe verwendet:
Nucleotid - Eine monomere DNA- oder RNA-Einheit, die aus einem Zuckeranteil (Pentose), einem Phosphat und einer heterozyclischen Stickstoffbase besteht. Die Base ist mit dem Zuckeranteil über einen Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) glykosidisch verknüpft und diese Kombination von Base und Zucker wird als Nucleosid bezeichnet. Durch die Base wird das Nucleotid charakterisiert. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").
DNA-Sequenz - Eine lineare Aufeinanderfolge von Nucleotiden, die miteinander über Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'- und 5'-Kohlenstoffatomen benachbarter Pentosen verbunden sind.
Codon - Eine DNA-Sequenz aus drei Nucleotiden (ein Triplett), die über ihre Matritze oder ihre messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäure, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsstopsignal codiert. Zum Beispiel codieren die Nucleotid-Tripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsstopsignale und ATG ist ein Translationsstartsignal.
Polypeptid - Eine lineare Aufeinanderfolge von Aminosäuren, die miteinander über Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und den Carboxylgruppen benachbarter Aminosäuren verknüpft sind.
Gen - Eine DNA-Sequenz, die über ihre mRNA eine für ein spezifisches Polypeptid charakteristische Aminosäuresequenz codiert.
Transkription - Der Prozess der Herstellung einer mRNA von einem Gen oder einer DNA-Sequenz.
Translation - Der Prozess der Herstellung eines Polypeptids von einer mRNA.
Expression - Der Prozess der Herstellung eines Polypeptids von einer DNA-Sequenz oder einem Gen. Er beinhaltet Transkription und Translation.
Plasmid - Eine nichtchromosomale, doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replikon" umfaßt, das die Replikation des Plasmids in einer Wirtszelle erlaubt. Falls das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingebracht wird, können durch die DNA des Plasmids Eigenschaften dieses Organismus verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transformiert ein das Gen für Tetracyclinresistenz (TetR) tragendes Plasmid eine zuvor gegenüber Tetracyclin empfindliche Zelle in eine dagegen resistente Zelle. Eine mit einem Plasmid oder einem Vektor transformierte Wirtszelle wird als "Transformante" bezeichnet.
Phase oder Bakteriophage - Bakterielle Viren, von denen viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in einer Proteinhülle oder Umhüllung eingekapselt sind ("Capsid").
Clonierungsvehikel oder Vektor - Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die zur Replikation in einer Wirtszelle in der Lage ist und die durch eine oder eine kleine Anzahl von Erkennungs- oder Restriktionsstellen für Endonucleasen gekennzeichnet ist, an denen die DNA-Sequenzen auf eine bestimmbare Art und Weise ohne einen damit einhergehenden Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA, wie z.B. Replikation, Erzeugung von Hüllproteinen oder der Verlust von Promotor- oder Bindungsstellen, gespalten werden kann, und die einen zur Verwendung für die Identifizierung der transformierten Zellen geeigneten Marker enthält, z.B. Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz.
Clonierung - Das Verfahren zum Erhalt einer Population von Organismen oder von DNA-Sequenzen, die von einem solchen Organismus oder einer solchen Sequenz abstammen, durch asexuelle Vermehrung.
Rekombinantes DNA-Molekül oder Hybrid-DNA - Ein aus DNA-Segmenten verschiedener Genome (die Gesamt-DNA einer Zelle oder eines Virus) bestehendes Molekül, dessen Enden außerhalb lebender Zellen miteinander verknüpft wurden und das die Fähigkeit besitzt, einige Wirtszellen zu infizieren und in diesen zu verbleiben.
Expressions-Kontrollsequenzen - Eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Genen oder DNA-Sequenzen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit diesen Genen oder DNA-Sequenzen funktional verknüpft ist. Der Begriff "funktional verknüpft" umfaßt ein geeignetes Startsignal vor dem Gen oder der DNA-Sequenz, die das gewünschte Produkt codiert, die Beibehaltung des korrekten Leserahmens, um die Expression der eingefügten DNA-Sequenz unter der Kontrolle der Expressionskontrollsequenz zu erlauben, und die Erzeugung des gewünschten, von diesem Gen oder dieser DNA-Sequenz codierten Produkte.
Wir stellten fest, daß bei hohen Temperaturen oder in Gegenwart großer Mengen fremder Polypeptide Zellen ihren Gehalt an proteolytischen Enzymen erhöhen. Diese Erfindung betrifft Wirtszell-Stämme, die innerhalb ihrer DNA-Sequenzen spezifische Mutationen tragen, die dazu führen, daß die Zellen unter anderem bei hoher Temperatur oder in Gegenwart hoher Mengen von Fremdproteinen eine reduzierte Fähigkeit zum Abbau fremder Produkte zeigen. Wir glauben, daß diese wichtige Eigenschaft auf einer reduzierten Expression zellulärer Proteasen beruht. Folglich erlaubt die Verwendung dieser Wirtszellen die Herstellung erhöhter Ausbeuten an genetisch manipulierten fremden Proteinen, Polypeptiden und anderen Produkten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die spezifische Mutation oder der Defekt in der Expression von Proteasegenen im htpR-Gen lokalisiert, wobei die Erzeugung oder die Funktion dieses Genprodukts beeinflußt wird. Das htpR-Gen von E. coli is ein regulatorisches Gen, das an der Hitzeschockantwort der Zelle beteiligt ist. Bei "Hitzeschock" durch hohe Temperatur oder anderen ungünstigen Bedingungen, z.B. dem durch die Denaturierung einiger zellulärer Proteine bei hoher Temperatur bedingten Auftreten abnormaler Proteine, antwortet die Zelle mit einer Erhöhung der Synthese einer Reihe von Polypeptiden, die als "Hitzeschockproteine" bezeichnet werden [F. C. Neidhardt et al., Molecular Cloning And Expression Of A Gene That Controls The High-Temperature Regulon Of Escherichia coli", J. Bacteriol. 153, S. 597 - 603 (1983); T. Yamamori et al., "Escherichia coli Gene (hin) Control Of Transcription Of Heat Shock Operons And Cell Growth At High Temperatures"; F. C. Neidhardt, "The High Temperature Regulon Of Escherichia coli", in Heat Shock From Bacteria To Man, H. J. Ashburner et al. (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, S. 131 - 138; 139 - 145 (1982)]. Wir stellten fest, daß das Auftreten solcher denaturierter Proteine in der Zelle ein Signal für die Hitzeschockantwort ist. Außerdem fanden wir, daß die durch Clonierung und Expression heterologer Proteine oder Polypeptide bedingte Anreicherung fremder Polypeptide oder anderer Produkte in der Zelle ebenfalls diese Hitzeschockantwort auslöst. Schließlich fanden wir, daß mindestens eines der Hitzeschockproteine eine kritische Rolle beim proteolytischen Abbau abnormaler oder fremder Proteine spielt [S. Goff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, S. 6647 - 6651 (1984); T. A. Baker et al., Proc. Nato. Acad. Sci. USA 81, S. 6779 - 6783 (1984)].
Wir fanden, daß eines dieser Hitzeschockproteine Protease La ist, eine ATP-abhängige Protease, die beim selektiven Abbau abnormaler Proteine innerhalb der Zelle den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt ausführt [S. Goff et al., siehe oben; T. A. Phillips et al., J. Bacteriol. 159, S. 283 - 287 (1984)]. Wir fanden außerdem, daß sowohl Protease La als auch andere Hitzeschockproteine als Antwort auf die Anreicherung von Fremdproteinen innerhalb der Zelle auch bei niedrigen Temperaturen induziert werden. Unser experimenteller Beweis zeigt, daß die Herstellung großer Mengen fremder Proteine, wie dies bei der Expression von fremden DNA-Sequenzen, die in die mit diesen Sequenzen transformierten Wirtszellen cloniert wurden, geschieht, bei niedrigen Temperaturen (z.B. 30ºC) die Erzeugung von verschiedenen Proteinen induziert, die auch durch Hitzeschock induziert werden. Zum Beispiel bewirkt die Expression von den Gewebe-Plasminogenaktivator (TPA) codierenden DNA-Sequenzen in mit diesen Sequenzen transformierten Zellen sogar bei niedrigen Temperaturen wie z.B. 30ºC eine erhöhte Expression des Protease La codierenden lon- Gens. Die Induktion der Hitzeschockproteine stellt somit einen allgemeinen Mechanismus zum Schutz der Zelle vor der Anreicherung fremder oder anderer abnormaler Proteine sowohl bei hohen als auch niedrigen Temperaturen dar.
Diese Induktion proteolytischer Enzyme als Antwort auf angereicherte abnormale Proteine ist insbesondere bei der Herstellung großer Mengen an genetisch manipulierten Fremdproteinen problematisch. Wir fanden, daß nach der Herstellung eines gewünschten Fremdproteins in einem Wirtsorganismus Protease La und andere Proteasen von der Zelle in erhöhten Mengen synthetisiert werden und die Fähigkeit der Zellen zum Abbau des gewünschten Proteine erhöhen. Es wurde daher nach Möglichkeiten gesucht, dieses Hindernis bei der Herstellung von genetisch manipulierten Proteinen in hohen Ausbeuten zu überwinden. Wir fanden, daß in htpR-Mutanten, die auch als hin-Mutanten bezeichnet werden, die Induktion von Hitzeschockproteinen nicht eintritt. Solche Mutanten können vom Fachmann mit Standard-Mutagenisierungstechniken erhalten werden.
Unsere Untersuchungen zur Auswirkung der htpR-Mutation auf den zellulären Proteinabbau zeigen, daß das htpR-Gen die Transkription des die Protease La codierenden lon-Gens kontrolliert. In htpR-Mutanten ist die Transkription des lon-Gens reduziert, was die reduzierte Erzeugung der Protease La zur Folge hat. Dies führt wiederum zu einer Abnahme der Fähigkeit der Mutante zum Abbau abnormaler oder fremder Proteine. Diese reduzierte Fähigkeit zum Abbau aberranter Proteine ist sowohl unter hohen als auch niedrigen Temperaturbedingungen (z.B. 42ºC bzw. 30ºC) ersichtlich. Daher ist der Gehalt an aus Mutantenzellen isolierter Protease La bei 30ºC geringer als in Wildtypzellen und steigt beim Übergang auf 42ºC nicht an (Figur 1). Die Tabelle in Figur 1 zeigt den Gehalt an Protease La, die aus htpR-Mutanten bei 30ºC und 42ºC isoliert wurde. Die in der Tabelle dargestellten Daten wurden mit E. coli Kulturen erhalten, die bei 30ºC gezüchtet und dann eine Stunde auf 42ºC gehalten wurden. Die Protease La - Aktivität wurde mit dem von L. Waxmann und A. L. Goldberg in J. Biol. Chem. 260, S.12022 - 12028, 1985 beschriebenen spezifischen Fluoreszenzsubstrat Glutaryl-Alanyl-Phenylalanyl-Methoxynaphthylamin nach partieller Reinigung des Enzyms mittels Phosphocellulosechromatographie gemessen. Weiterhin zeigten unsere Untersuchungen, die eine erhöhte Expression des lon-Gene nach Induktion von genetisch manipuliertem TPA in Wirtszellen nachwiesen, daß diese erhöhte Expression in htpR-Mutanten nicht vorhanden war. Die htpR-Mutationen scheinen daher das Grundniveau an Protease La zu beeinflußen und deren erhöhte Erzeugung nach einer Temperaturverschiebung zu verhindern.
Die von den htpR-Mutanten gezeigte reduzierte Abbaufähigkeit ist größer als oder entspricht derjenigen von lon-Mutanten, die eine defekte Protease La codieren. Die u-Mutanten zeigen jedoch nicht die von lon- Mutanten gezeigten unerwünschten Phänotypen wie z.B. die Überproduktion und Anreicherung von Kapsel-Polysacchariden (auch als Mukoidie ("Mucoidy") bezeichnet), gestörte Zellteilung und Filamentbildung und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ultravioletter Strahlung oder anderen DNA-schädigenden Mitteln. Die htpR-Mutanten sind deshalb bei einer Reihe von Bedingungen, die bei der industriellen, großtechnischen Fermentation vorliegen (z.B. Vollmedium), lebensfähiger als lon-Mutanten. Während lon-Mutanten unter diesen Bedingungen nur schwach wachsen, wachsen htpR- Mutanten gut und bieten damit als Wirtsorganismen bei DNA-Rekombinationstechniken zur Erhöhung der Ausbeute an rekombinanten fremden Proteinen, Polypeptiden oder anderen Produkten einen deutlichen Vorteil.
Unter Anwendung der P1-vermittelten Transduktion konstruierten wir htpR-lon-Mutanten, die sowohl eine htpR-Mutation als auch eine Mutation im lon-Gen, z.B. lonΔ100 oder capR9, enthalten. Diese Doppelmutanten erzeugen eine labile Protease in reduzierten Mengen und zeigen eine geringere Abbaufähigkeit für abnormale Proteine als die die jeweilige Einzelmutation tragenden Stämme. Bei diesen Doppelmutanten ist der Defekt hinsichtlich der Proteolyse größer als der bei allen bekannten Stämmen gefundene. Diese Doppelmutanten sind lebensfähige Wirte, die in Kultur hohe Zelldichten erreichen. Wie die htpR-Mutanten leiden sie nicht an Mukoidie oder anderen beeinträchtigenden Eigenschaften, wie sie lon-Mutanten zeigen.
Daher sind die erfindungsgemäßen htpR lon-Mutanten besonders nützlich für die großtechnische Herstellung genetisch manipulierter Proteine, die normalerweise einem schnellen intrazellulären Abbau unterliegen. Erfindungsgemäß kann ein fremdes Protein, Polypeptid oder Produkt mit htpR-Mutanten, mehr bevorzugt mit htpR lon-Mutanten, durch die Züchtung eines Wirts, der mit einem durch eine das fremde Protein, Polypeptid oder Produkt codierende DNA-Sequenz gekennzeichneten rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, wobei der Wirt durch einen Defekt in der Expression von Protease-Genen gekennzeichnet ist, und die Gewinnung der Produkte aus der Kultur hergestellt werden. Fremde Proteine, Polypeptide oder Produkte können auch durch Züchtung eines Wirts, der mit einem rekombinanten, durch eine das fremde Protein, Polypeptid oder Produkt codierende DNA-Sequenz gekennzeich-neten DNA-Molekül transformiert wurde, hergestellt werden, wobei dieser Wirt einen Defekt bei der Erzeugung oder Funktion des htpR-Genprodukte aufweist.
Die erfindungsgemäßen Mutantenstämme können vorteilhafterweise als Wirtszellen verwendet werden, in die mittels einer auf dem Fachgebiet bekannten Methode rekombinante DNA-Sequenzen eingeführt und in Form von Proteinen, Polypeptiden und anderen Produkten exprimiert werden. Die reduzierte Fähigkeit dieser Mutantenstämme zum Abbau fremder oder anderer aberranter Polypeptide erlaubt die Herstellung rekombinanter Proteine oder anderer Produkte in hohen Ausbeuten. So zeigen z.B. unsere experimentellen Daten eine drei- bis fünffache Steigerung der Ausbeute an genetisch manipuliertem, in htpR lon-Mutanten erzeugtem Gewebe-Plasminogenaktivator im Vergleich zu der in Wildtypwirtezellen erhaltenen Ausbeute.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind für die Herstellung fremder Proteine, Polypeptide und Produkte in prokaryontischen und eukaryontischen Wirten einschließlich E. coli, Bazillen, Hefen, Pilze, tierische- oder Pflanzenzellen oder andere Wirtsorganismen, anwendbar. Die Hitzeschockantwort scheint ein universeller Mechanismus für den Schutz der Zelle gegen die ungünstigen Bedingungen einer hohen Temperatur zu sein [Ashburner et al., siehe oben]. Wie bereits früher vermutet [S. Goff et al., siehe oben], scheint die Hitzeschockantwort ein genereller Mechanismus zum Schutz der Zelle vor der Anreicherung abnormaler Proteinmoleküle zu sein. Wir haben in anderen Bakterien wie z.B. Salmonella typhimeurium und Bacillus subtilis ATP-abhängige, der Protease La analoge Proteasen beobachtet. Lon-Mutanten wurden auch in Salmonella Typhimeurium gefunden. Es ist daher wahrscheinlich, daß in allen Prokaryonten ein Mechanismus zum Abbau abnormaler oder fremder Proteine gefunden werden kann, der jenem in E. coli gefundenen ähnlich ist. Dieser Mechanismus könnte auch in eukaryontischen Organismen vorhanden sein. Ein der Protease La ähnliches Enzym wurde in Mitochondrien von Säugetierzellen [M. Desautels und A. L. Goldberg, J. Biol. Chem. 257, S. 11673 (1982)] und im Cytosol gezüchteter Maus-Erythroleukämiezellen [L. Waxman et al., J. Biol. Chem. 260, S. 11994 - 12000 (1985)] gefunden.
Die Existenz eines solchen Mechanismus in diesen anderen Organismen erlaubt die Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Konstruktion analoger Mutanten-Wirtsstämme, die im Gen, das funktionell dem in E. coli vorhandenen Protease La-Gen entspricht, defekt sind und die, ähnlich der hier beschriebenen Mutanten-Organismen, eine reduzierte Abbaufähigkeit für Fremdprodukte zeigen.
Zusätzlich können eine Reihe von Expressionsvektoren zur Transformation der erfindungsgemäßen Wirtszellen verwendet werden. Brauchbare Expressionsvektoren können z.B. aus Teilen von chromosomalen, nichtchromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, wie z.B. verschiedene bekannte Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, z.B. Plasmide aus E. coli, einschließlich col E1, pCR1, pBR322, pMB9 und deren Abkömmlinge, Plasmide mit breiterem Wirtsspektrum, z.B. RP4, Phagen- DNAs, z.B. zahlreiche Derivate des Phagen λ, z.B. NM 989, und andere DNA-Phagen, z.B. M13, und filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen und Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs stammen, wie Plasmide, die zur Verwendung von Phagen-DNA oder anderen Expressionskontrollsequenzen modifiziert wurden, oder Hefeplasmide wie das 2µ Plasmid oder Derivate davon. Ein besonders bevorzugter Expressionsvektor ist ein Plasmid mit hoher Kopienzahl oder ein Abkömmling von einem Bakteriophagen, da diese Vektoren eine verbesserte Ausbeute an exprimierten Proteinen bereitstellen.
Entsprechend sind eine Reihe von Expressionskontrollsequenzen zur Verbesserung der Expressionseffizienz (Transkription und Translation) der clonierten DNA-Sequenzen erhältlich. Es gibt zwei Haupttypen dieser Expressionskontrollsequenzen: konstitutive und regulierbare Expressionskontrollsequenzen. Konstitutive Expressionskontrollsequenzen wie ß-lac führen zur kontinuierlichen Expression der clonierten DNA-Sequenz und der Produktion des durch diese DNA-Sequenz codierten Produkte während der Aufzucht der Wirtezellen. Regulierbare Expressionskontrollsequenzen wie trp, λPL oder λPR können während der Aufzucht der Wirtszellen reguliert, d.h. an- oder abgeschaltet werden, sodaß die Expression der clonierten DNA-Sequenz zu der während eines Wachstumszyklus der Kultur günstigsten Zeit "angeschaltet" werden kann. Regulierbare Expressionskontrollsequenzen können z.B. abgeschaltet werden, um es den Wirtszellen zu ermöglichen sich ohne die übermäßige Anreicherung von Genprodukten zu vermehren und anschließend zur Förderung der Expression großer Mengen der gewünschten Proteinprodukte, die unter der Kontrolle dieser Expreseionssequenzen sind, angeschaltet werden. Da die Überproduktion von selbst normalerweise nichttoxischen Genprodukten für die Wirtszellen schädlich sein kann und zu einer verringerten Stabilität bestimmter Wirts/Vektor-Systeme führen kann, wird oft eine regulierbare Expressionskontrollsequenz zur Modulation der Expression während der Aufzucht der Wirtszellen vorgezogen.
Verschiedene regulierbare Expressionskontrollsequenzen können zur Expression von DNA-Sequenzen und von Genen, die für Proteine und Polypeptide codieren, in Wirtsorganismen Verwendung finden. Zu diesen gehören z.B. Operator-, Promotor-, Ribosomenbindungs- und in Wechselwirkung stehende Sequenzen des Lactose-Operons von E. coli [z.B. H. Itakura et al., "Expression In Escherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin", Science 198, S. 1056 - 1063 (1977); D. V. Goeddel et al., "Expression In Escherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, S. 106 - 110 (1979)], die entsprechenden Sequenzen des Tryptophansynthetase-Systems von E. coli [J. S. Emtage et al., "Influenza Antigenic Determinants Are Expressed From Haemagglutinin Genes Cloned In Escherichia coli", Nature 283, S. 171 - 174 (1980); J. A. Martial et al., "Human Growth Hormone: Complementary DNA Cloning And Expression in Bacteria", Science 205, S. 602 - 606 (1979)] und wichtige Operator- und Promotorregionen des Phagen λ [H. Bernard et al., "Construction Of Plasmid Cloning Vehicles That Promote Gene Expression From The Bacteriophage Lambda PL Promotor", Gene 5, S. 59 - 76 (1979)].
Die Tatsache, daß die erfindungsgemäßen htpR- und lon-Mutanten eine reduzierte Abbaufähigkeit für Fremdproteine bei hohen Temperaturen zeigen, macht sie für eine Anwendung in Verbindung mit durch Temperaturinduktion regulierbaren Expressionskontrollsequenzen besonders geeignet. Eine hitzeinduzierbare Expressionssequenz, z.B. der PL-Promotor des Bakteriophagen Lambda, kann mit einer DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein codiert, mittels bekannter Standardtechniken fusioniert werden. Die resultierende rekombinante DNA-Sequenz kann dann zur Transformation eines htpR- oder htpR lon-Mutanten-Wirtsorganismus benutzt werden. Durch die Aufzucht bei 42ºC exprimieren diese Wirte aufgrund der bei dieser Temperatur angeschalteten, temperaturinduzierten Expressionskontrollsequenz das gewünschte Protein oder Produkt in erhöhtem Ausmaß. Zusätzlich wird aufgrund der reduzierten Abbaufähigkeit dieser Wirte für fremde Proteine oder Produkte die Expression des gewünschten Proteine oder Produkte weiter erhöht. Anders als bei Wildtypwirten kommt es bei diesen htpR- und htpR lon-Mutanten nicht zu einer Zunahme an proteolytischen Enzymen bei hoher Temperatur oder der Produktion von Fremdproteinen in den Zellen.
Somit erlaubt die Verwendung der erfindungsgemäßen htpR- und htpR lon-Mutanten in Verbindung mit hitzeinduzierbaren Expressionskontrollsequenzen eine gesteigerte Expression genetisch manipulierter Proteine, Polypeptide und anderer Produkte. Es versteht sich jedoch von selbst, daß diese Erfindung auch die erhöhte Expression von Fremdproteinen oder anderen Produkten unter Verwendung nicht-temperaturinduzierbarer oder auch konstitutiver Expressionskontrollsequenzen erlaubt, da die htpR- und htpR lon-Mutanten einen reduzierten Abbau von Fremdproteinen bei niedrigen Temperaturen (z.B. 30ºC) zeigen.
Die erfindungsgemäßen Wirtsorganismen und Verfahren sind für die Produktion einer großen Anzahl von Proteinen und Polypeptiden anwendbar. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verfahren zur Steigerung der Produktion von solchen Produkten angewendet werden, deren Ausbeuten wiederum von einem hohen Niveau an Enzymen abhängen, die ansonsten einem Abbau unterliegen würden. Zum Beispiel können Produkte wie wirksame Bestandteile von Impfstoffen oder andere pharmazeutische Wirkstoffe, landwirtschaftlich oder in anderer Weise kommerziell brauchbare Mittel, Enzyme, Hormone, Aminosäuren, industrielle Chemikalien, Antibiotika, Lebensmittel usw. durch die erfindungsgemäßen Verfahren zweckdienlich hergestellt werden. Weitere Produkte, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden können, umfassen Polypeptide, die eine immunologische oder biologische Wirksamkeit von Leukozyteninterferon, Fibroblasteninterferon oder anderen Interferonen zeigen, Polypeptide, die die antigenen Eigenschaften von FMDV-Virusantigenen oder Hepatitis B-Virusantigenen aufweisen, Polypeptide, die die biologische Wirksamkeit von menschlichen oder tierischen Hormonen wie Somatomedin C und Proinsulin zeigen, und Polypeptide, die eine immunologische oder biologische Aktivität von menschlichen, tierischen oder viralen Produkten zeigen. Die Auswahl eines bestimmten Produkte ist nicht Gegenstand dieser Erfindung. Vielmehr ist die Erfindung generell für die gesteigerte Expression von DNA-Sequenzen, die solche Produkte codieren, und für die Herstellung solcher Produkte in den erfindungsgemäßen Mutanten-Wirtsorganismen anwendbar.
Es sollte besonders erwähnt werden, daß, obwohl die Erfindung die Verwendung von htpR und htpR lon-Mutanten als Wirtezellen für DNA-Rekombinationstechniken beschreibt, die htpR-Mutation als solche in Wirtszellen, bei denen das entsprechende Gen elimiert wurde, eingeführt werden kann. Diese Wirtszellen können dann mit rekombinanten DNA-Sequenzen, d.h. solchen, die die gewünschten Proteine codieren, transformiert werden, und werden dann diese Proteine mit hohen Ausbeuten erzeugen.
Selbstverständlich umfaßt diese Erfindung auch Wirtsorganismen, die irgendeine aus einer Zahl von innerhalb der htpR- oder lon-Gene möglichen Mutationen oder Kombinationen davon enthalten. Solche Mutanten können mittels Standard-Mutagenisierungs- und Selektionstechniken zur Erzeugung neuer, in der Hitzeschockantwort defizienter Stämme erhalten werden, wie z.B. die von T. Tobe et al., "Isolation And Physical Mapping 0f Temperature-Sensitive Mutante Defective In Heat-Shock Induction Of Proteine In Escherichia coli", Molec. Gen. Genet. 195, S. 10 - 16 (1984) beschriebenen. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Verfahren für die Herstellung von fremden Proteinen, Polypeptiden und Produkten in E. coli-Stämmen anwendbar, die innerhalb ihrer DNA-Sequenzen andere Mutationen tragen, die das Auftreten einer reduzierten Abbaufähigkeit der Zellen für Fremdproteine verursachen können, wie z.B. Mutanten, die in der Induktion von Hitzeschockproteinen defekt sind [siehe K. H. Paek, "A Defect In Induction Of Heat-Shock-Proteins At High Temperature In xthA Mutants", in Abstracts Of Papers Presented At The Bacteriophage Meeting, August 21 - 26, S. 151, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1984)].
Die folgenden Beispiele sollen dem besseren Verständnis der Erfindung dienen. Diese Beispiele bezwecken lediglich eine Veranschaulichung und können nicht als Einschränkung des Schutzbereiche der Erfindung in irgendeiner Art und Weise ausgelegt werden.

Beispiel 1

Das folgende Beispiel erläutert die Verfahren zur Konstruktion der erfindungsgemäßen htpR lon-Mutanten.

Konstruktion der htpR-lon-Mutanten

E. coli-Zellen (Stamm SG900, Nicht-Suppressor, lon&spplus;, tsx&spplus;, htpR&spplus;) wurden mit λNK55 infiziert, einem Bakteriophagen, der in Nicht-Suppressor-Wirten in der DNA-Synthese defekt ist und in seinem CIII-Gen das Transposon Tn10 trägt. Das Tranposon Tn10, ein 9300 Basenpaare langes, transponierbares DNA-Stück mit terminalen "inverted-repeat"-Sequenzen, inseriert sich in das tsx-Gen, das auf dem E. coli Chromosom bei ungefähr 10 min auf der genetischen Karte liegt. Die resultierende Region auf dem Chromosom wird mit tsx:Tn10 bezeichnet.
Da Tn10 ein Gen für Tetracyclinresistenz trägt und sich in das den Bakteriophagenrezeptor T6 codierende Gen inseriert, sind E. coli-Zellen, die das Tn10-Insert tragen, resistent gegenüber Tetracyclin und gegenüber Infektion mit T6. Daher wurden die infizierten λND55-Zellen auf Tetracyclinresistenz und diese Kolonien dann weiter auf Resistenz gegenüber T6-Phagen selektiert. Da das lon-Gen von E. coli nahe dem tsx-Gen lokalisiert ist, enthielten die resultierenden Isolate das mit dem Tetrazyclinresistenzmarker von tsx:Tn10 verknüpfte lon-Gen.
Die verknüpften lon- und tsx:Tn10-Gene wurden anschließend mittels P1-vermittelter Transduktion in einen E. coli-Stamm wie z.B. lonΔ100 eingeschleust. Zellen, die Crossover zwischen dem lon-Gen des Mutantenstamms und dem tsx-Tn10-Gen des transduzierenden P1-Elements enthielten, wurden auf Tetracyclinresistenz selektiert und auf den für lon-Mutanten typischen "Mucoid"-Phänotyp überprüft. Bei den resultierenden Isolaten handelte es sich um die mit dem Tetracyclinresistenzmarker von Tn10 verknüpften lon-Mutanten (lon&supmin;, tetr).
Zur Konstruktion von Doppelmutantenstämmen, die Mutationen im lon- Gen und im die Hitzeschockantwort kontrollierenden htpR-Gen enthalten, wurde die lon&supmin;:tetr-Sequenz der oben beschriebenen Isolate in eine htpR- Mutante eines E.coli-Stamms wie z.B. E. coli-Stamm K165 oder GW4701, lon&spplus;, htpR&supmin; mittels P1-vermittelter Transduktion eingeführt. Die Doppelmutanten wurden auf Tetracyclinresistenz selektiert und anschließend auf Temperaturempfindlichkeit überprüft. Es versteht sich von selbst, daß, obwohl die hier beschriebenen Doppelmutanten durch die Einführung des lon&supmin;-Gens in einen htpR&supmin;-Stamm konstruiert wurden, die umgekehrte schrittweise Konstruktion, d.h. die Einführung des htoR&supmin;-Gens in einen lon&supmin;-Stamm, ebenfalls angewendet werden kann.
Die resultierenden Isolate, htpR&supmin; lon&supmin;-Doppelmutanten wie z.B. die E. coli-Stämme SG935 und SG927, lonΔ100, htpR&supmin;, können erfindungsgemäß zur Steigerung der Ausbeute von genetisch manipulierten, in E. coli erzeugten Proteinen verwendet werden. Auf ähnliche Weise können die E. coli-Stämme SG936 und SG928, lonR9, htpR&supmin;, hergestellt und gemäß den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden.

Beispiel 2

Bestimmung des Proteinabbaus in htpR-Mutanten

Das folgende Beispiel erläutert die Verfahren zur Bestimmung des Proteinabbaus in den erfindungsgemäßen Mutantenstämmen.
Eine Kultur des zu untersuchenden Mutantenstamms wurde über Nacht gezüchtet, vorzugsweise in M9-Minimalmedium (J. H. Miller, Experiments In Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, 1981)). Am nächsten Morgen wurden 10 ml Kulturen in Klett-Kolben angesetzt und die Zellen vorzugsweise für wenigstens zwei Generationen wachsen gelassen, um ein gutes Wachstum zu gewährleisten.
Sobald die Zellen in der frühen Log-Phase waren, wurden zu jedem Kolben 0,2 ml - 0,5 ml 5 mg/ml H&sub2;O Puromycin (sterilfiltriert) zugegeben. Die Dichte der Zellkulturen war so, daß nach Beendigung der nächsten 20 Minuten-Periode die Zellen in der mittleren Log-Phase waren. Die Endkonzentration an Puromycin betrug in jedem Kolben 100 - 200 µg/ml. Puromycin ist ein Inhibitor der Proteinsynthese, der in die wachsenden Polypeptide der Zelle eingebaut wird. Dieser Einbau führt nach einiger Zeit zur Bildung von abnormalen, vorzeitig terminierten Proteinen. Solche kurzen Proteine werden wie viele clonierten Proteine von kommerziellem Interesse, wie z.B. Proinsulin, normalerweise schnell in den Bakterien abgebaut. (A. L. Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, S. 2640 - 2644 (1972)).
Nach Zugabe von Puromycin wurden die Zellen 15 min bei 37ºC inkubiert. 1 µCi ³H-Aminosäure/ml wurde dann zur Markierung der in den Zellen synthetisierten Proteine zu den Kulturen gegeben. (Falls die Zellen in LB-Vollmedium gezüchtet werden, ist ³&sup5;S-Methionin die bevorzugte Markierung und 4 µCi ³&sup5;S-Methionin/ml sollten verwendet werden.) Die Kulturen wurden 5 min bei 37ºC mit dem radioaktiven Marker inkubiert. Unmittelbar danach wurden die Zellen in sterilen 40 ml Zentrifugenröhrchen in einem Sorvall SS-34 Rotor 1 min bei 5000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde schnell dekantiert und die Niederschläge durch Resuspendieren und Vortexen in 2 Volumina 1 mg/ml kalte "chase"-Aminosäure enthaltendem Medium gewaschen. Die Zellen wurden erneut wie zuvor zentrifugiert, in kalte "chase"-Aminosäure enthaltendem Medium resuspendiert und in Klett-Kolben überführt. Beim Überführen in diese Kolben wurde die Zelldichte so eingestellt, daß nach Ablauf einer Zeitspanne von 60 oder 90 Minuten die Zellen nicht in der stationären Phase waren.
Während dieser Verfahrensstufe enthielten die Puromycin-behandelten Zellen wachsende Polypeptide, die innerhalb ihrer Sequenzen Puromycin und markierte Aminosäuren eingebaut hatten. Puromycin führte zur Ablösung der Polypeptide von den Ribosomen, an denen sie synthetisiert wurden, und die resultierenden abnormalen Polypeptide wurden durch die bakterielle Zelle abgebaut.
Zur Bestimmung der Rate, mit der ein bestimmter Stamm diese vorzeitig terminierten Proteine abbaute, wurden zu verschiedenen Zeiten Proben aus den Kulturüberständen genommen und die durch den Abbauprozess entstehenden freien radioaktiven Aminosäuren gemessen.
Zwei 0,5 ml Proben wurden bei t = 0 von jeder Kultur entnommen. Eine wurde mit "Gesamt-Zerfälle" bezeichnet und entsprach der Gesamtmenge an radioaktivem Protein bei t = 0. Diese Probe wurde dann in ein im Eis stehendes Röhrchen, das 100 µl TCA (Trichloressigsäure) enthielt, überführt. Zu dieser Probe wurden 0,1 ml H&sub2;O zugegeben. Die zweite bei t = 0 entnommene Probe wurde mit "Leerwert" bezeichnet und entsprach den bei t = 0 in der Probe vorhandenen säurelöslichen radioaktiven Zerfällen, d.h. freien radioaktiven Aminosäuren. Diese 0,5 ml Probe wurde ebenfalls in ein im Eis stehendes, 100 µl 70% TCA enthaltendes Röhrchen überführt. Die Endkonzentration an TCA betrug vorzugsweise 10%. Zu dieser Probe wurden 100 µl 10% RSA (Rinderserumalbumin) gegeben. Bei t = 15, 30, 60 und 90 Minuten wurden ebenfalls 0,5 ml Proben aus der Zellkultur entnommen und zu 10% TCA mit 100 µl 10% RSA gegeben.
Jede Probe wurde 30 min auf Eis in der TCA-Lösung inkubiert. Freie radioaktive Aminosäuren in jeder Probe wurden in TCA gelöst, während nicht-abgebaute Proteine unlöslich blieben und aus der TCA präzipitierten. Somit wurde der Proteinabbau durch die Messung der Umwandlung markierter, in TCA unlöslicher Proteine in freie, in TCA lösliche radioaktive Aminosäuren bestimmt. Die zeitabhängige Bildung TCA-löslicher radioaktiver Zerfälle wurde somit als ein Hinweis auf die Proteinabbaurate innerhalb der Zellen verwendet. Es sollte beachtet werden, daß die Abbaurate der Puromycyl-Proteinen sehr hoch ist und daher eine möglichst schnelle Durchführung der oben beschriebenen TCA-Präzipitationsschritte erfordert.
Nach Inkubation in der TCA-Lösung wurden alle Proben (außer denen für die "Gesamt-Zerfälle") 10 min bei 4ºC in einer IEC-Zentrifuge, Rotor #269, bei 3500 Upm zentrifugiert; 0,4 ml des Überstands jeder Probe wurden dann in 4 ml Liquiscint Szintillationsflüssigkeit gezählt. Die Zerfälle jeder Probe dienten zur Berechnung des Proteinabbaus in % nach der Formel:
% Proteinabbau = Durchschnitts-cpm (Zeitpunkt) - Leerwert-cpm (t = 0) Gesamt-Zerfälle cpm X 100
Figur 2 zeigt den Prozentsatz des Puromycylproteinabbaus in Abhängigkeit von der Zeit in einer Wildtyp E. coli-Zelle (lon&spplus;, htpR&spplus;) gegenüber einer htpR-Mutante (lon&spplus;, htpR&supmin;) ( siehe Diagramm 1, mit dem Stamm SC122 (htpR&spplus;) und K165 (htpR&supmin;), Geschenke von Dr. Graham Walker) und den Abbau in verschiedenen lon-Mutanten und htpR lon-Doppelmutanten (siehe die Diagramme 2 und 3). Wie aus der Abbildung hervorgeht, reduzierte die htpR-Mutation sowohl in Wildtyp- als auch in lon-Mutantenzellen den Prozentsatz des Proteinzerfalls innerhalb der Zelle signifikant.
Während das oben beschriebene Beispiel den Abbau kurzer, durch den Einbau von Puromycin entstandener Polypeptide betrifft, konnten ähnliche Auswirkungen der htpR-Mutation durch die Verfolgung des schnellen Abbaus von abnormalen Proteinen mit voller Länge, die Aminosäureanaloga wie Canavanin enthielten, gezeigt werden. Das Verfahren war ähnlich dem oben beschriebenen. Zellen, die über Nacht in M9-Medium gezüchtet wurden, wurden in der mittleren Log-Phase zentrifugiert und in Arginin-freiem Medium resuspendiert. Canavanin, ein Aminosäureanalogon für Arginin, wurde bis zur Endkonzentration von 0,6 mM zugegeben. Nach 15 min wurden 10 - 20 µCi ³H-Phenylalanin zugegeben. Nach 5 min wurde die Kultur zentrifugiert und in einem 0,6 mM Arginin und 0,5 - 1,0 mg/ml kaltes Phenylalanin enthaltenden Medium resuspendiert. Die Kulturen wurden anschließend erneut zentrifugiert und im gleichen Medium resuspendiert.
Von den Kulturen wurden, genau wie oben bereits für die Puromycinbestimmung beschrieben, Proben entnommen und der Prozentsatz an Canavanin-enthaltenden Proteinen wurde nach der gleichen Formel bestimmt. Figur 3 zeigt den Prozentsatz des Proteinabbaus in Abhängigkeit von der Zeit für Wildtyp E. coli-Zellen (lon&spplus;, htpR&spplus;) im Vergleich zu einer htpR-Mutante (lon&spplus;, htpR&supmin;) (siehe Diagramm 1, unter Verwendung des Stamme GW1000 (htpR&spplus;) und GW4701 (htpR&supmin;), Geschenke von Dr. Graham Walker) und den Proteinabbau in verschiedenen Mutanten und den htpR lon- Doppelmutanten (siehe die Diagramme 2 und 3). Die htpR-Mutation reduzierte deutlich den Proteinzerfall sowohl in Wildtyp- als auch in lon- Mutantenzellen. Außerdem zeigten die Doppelmutanten, d.h. jene, die die htpR- und die lon-Mutationen trugen, eine stärkere Abnahme des Abbaus als Zellen, die nur die htpR-Mutation allein trugen, was darauf hinweist, daß die Doppelmutation eine zusätzliche Wirkung auf den Proteinabbau bereitstellt.

Beispiel 3

Erhöhte Expression des lon-Gene in htpR&spplus;-Wirtszellen, die Gewebe-Plasminogenaktivator erzeugen, und das Fehlen einer solchen Expression in einer htpR&supmin;-Mutante.

Das folgende Beispiel zeigt die gesteigerte Expression des Protease La codierenden lon-Gens in Wirtszellen, die zur Herstellung eines genetisch manipulierten Fremdproteine, Gewebe-Plasminogenactivator, induziert wurden. Eine htpR-Mutation tragende E. coli-Wirtszellen zeigten jedoch nicht diese gesteigerte Expression.
Um das Einschalten des lon-Gens leichter nachweisen zu können, wurde eine lon-lacZ-Operon Fusionssequenz konstruiert, die aus der lon- Promotorsequenz bestand, die funktional mit dem Strukturgen für β-Galactosidase, lacZ, verknüpft war. Bei Einschalten des lon-Promotors wird β- Galactosidase erzeugt, was leicht nachgewiesen werden kann. Diese lon- lac-Fusionssequenz wurde in einen λ-Bakteriophagen inseriert und in das Wirtschromosom integriert. Ein das TPA-Gen enthaltende Plasmid wurde anschließend in den selben Wirt eingeschleust, zur Herstellung von TPA induziert, und die Expression des lon-Gens in Form der β-Galactosidaseaktivität bestimmt.

A. Konstruktion einer lon-lac-Operon Fusionssequenz.

Eine den lon-Promotor funktional verknüpft mit dem lacZ-Gen enthaltende DNA-Sequenz wurde in die E. coli-Stämme SC122 (F&supmin; lac (am), trp (am), pho (am), mal (am), rpsL, supC (ts)) und den davon abgeleiteten Stamm K165 (htpR (am)) wie nachfolgend beschrieben eingeschleust:
Das die lon-Gen Sequenz enthaltende Plasmid pJMC40 (B. A. Zehnbauer et al., J. Bacteriol. 143, S. 852 - 863 (1980) und ein Operon-Fusionsvektor, pMLB1022 (T. J. Silhavy et al., Experiments With Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1984)) wurden mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI (New England Biolabs) geschnitten und die DNAs in Gegenwart von T4 DNA-Ligase zusammengemischt. pMLB1022 enthält das Gen für Ampicillinresistenz und ein ß- Galactosidase codierendes lacZ-Gen, ein Enzym, das an der Fermentation von Galactose beteiligt ist. Dem Plasmid fehlt jedoch der lac-Promotor zur Transkription des lacZ-Strukturgens.
E. coli-Zellen, die lac&supmin; waren, wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf 25 µg/ml Ampicillin enthaltenden MacConkey-Galactoseplatten ausplattiert. Nur die Zellen, die mit einem den lon-Promotor von pJMC40 oberhalb des lacZ-Gens von pMBL1022 enthaltenden Plasmid transformiert wurden, sind in der Lage, β-Galactosidase zu erzeugen und erscheinen als rote Kolonien auf MacConkey-Galactoseplatten. Ampicillin- resistente Kolonien, die auf den Platten rot waren, wurden isoliert. Die Plasmid-DNA einer dieser Kolonien wurde mittels Reetriktionskartierung und Agarosegel-Elektrophorese analysiert, wobei sich zeigte, daß sie die lon-lac Operon Fusionssequenz enthielt. Dieses Plasmid wurde mit pSG1201 bezeichnet.
Im nächsten Schritt wurde diese Fusionssequenz in das Chromosom von E. coli-Wirtszellen integriert, wobei zuerst die Fusionssequenz in eine ebenfalls mit EcoRI geschnittene λDNA von λNF1955 (I. Hui et al., J. Bacteriol. 152, S. 1022 - 1032 (1982)) inseriert wurde. Die Ligationsreaktion wurde bei einer hohen Konzentration an Lambda-DNA gegenüber Plasmid-DNA mit 100 µg/ml λNF1955 DNA und 3 µg/ml Plasmid-DNA durchgeführt. Diese hohe Konzentration der Enden zueinander führte im Ligationsgemisch zur Bildung von Konkatameren aus rekombinanter λDNA. Das Ligationsgemisch wurde dann mit einem in-vitro-Verpackungssystems (B. Hohn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, S. 2372 - 2376 (1974)) in λPartikel verpackt.
λsensitive E. coli-Zellen mit lac-Deletionen wurden mit diesen rekombinanten Phagenpartikeln infiziert und auf TB (Bactotrypton)-Medium mit 50 µg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) ausplattiert, ein Substrat für β-Galactosidase, dessen Reaktion mit dem Enzym zur Bildung blauer Plaques führt. Blaue Plaques wurden isoliert und das Vorhandensein der lon-lac Operon-Fusionssequenz durch Restriktionsanalyse der gereinigten λDNA bestätigt.
Da λNF1955 keine stabilen Lysogene bildet und nur in Suppressorstämmen wachsen kann, wurden die rekombinanten Phagenpartikel mit Wildtyp λPhagen gekreuzt, auf 50 µg/ml X-Gal enthaltendes TB Medium mit Nicht-Suppressorzellen bei 37ºC plattiert und nach trüben, blauen Plaques abgesucht. Auf diese Weise wurde ein die Fusionssequenz enthaltender Phage, der in der Lage war stabile Lysogene zu bilden, isoliert und mit λ sigmagamma 101 bezeichnet.
E. coli-Stämme SC122 (htpR&spplus;) und K165 (htpR&supmin;) wurden zu mal&spplus; transduziert, um sie mit λ sigmagamma lysogen zu machen, und anschließend auf X-Gal enthaltendee Medium plattiert. Kolonien, die blau und resistent gegen Überinfektion mit λ waren, wurden isoliert.
Zwei auf diese Art isolierte Stämme wurden mit E. coli SG943 (htpR&spplus;), abgeleitet von E. coli SC122, und E. coli SG942 (htpR&supmin;), abgeleitet von E. coli K165, bezeichnet.

B. Expression von lon-Genen in htpR&spplus;- gegenüber htpR&supmin;-Zellen, die zur Herstellung von Gewebe-Plasminogenaktivator induziert wurden.

Die die lon-lac Fusion enthaltenden Stämme SG943 und SG942 wurden anschließend mit dem Plasmid pTPA102 transformiert, das die Gewebe-Plasminogenaktivator codierenden DNA-Sequenzen enthielt (ein pTPA102 enthaltender E. coli-Stamm wurde bei der American Type Culture Collection, Rockeville, Maryland, am 27. August 1984 unter ATCC # 39810 hinterlegt). pTPA102 wurde von Plasmid pMC9 (R. A. Young et al., "Efficient Isolation 0f Genes By Using Antibody Probes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, S. 1194 - 1198 (1983)) mittels bekannter Standardtechniken abgeleitet und enthält das TPA-Gen unter der Kontrolle des trc-Promotors (-35 von trp, -10 von lac). pTPA102 wurde zur Transformation der E. coli-Stämme SG943 bzw. SG942 verwendet und jeder Stamm wurde gezüchtet und in zwei Aliquots aufgeteilt. Zu einem Aliquot jedes Stammes wurde IPTG (Isopropylthio-β-D-galactopyranosid), ein Induktor des trc-Promotors, in einer Konzentration von 1 mM gegeben. Das andere Aliquot jedes Stammes blieb nicht-induziert. Die Zellen wurden 1 h bei 30ºC inkubiert und dann zur Entfernung von IPTG durch Filtration gewaschen. Die Mengen an β-Galactosidase, die von jedem dieser Aliquots erzeugt wurden, wurden durch die bei O.D.&sub2;&sub4;&sub0; überwachte Spaltung von ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (Sigma) bestimmt [J. H. Miller, Exneriments in Molecular Genetics, S. 431, Cold Spring Harbor Press (1972)]. Stamm SG943 (htpR&spplus;) zeigte bei 30ºC einen zeitabhängigen Anstieg der β-Galactosidaseaktivität, während Stamm SG942 (htpR&supmin;) keinen Anstieg der β-Galactosidaseaktivität zeigte.
Diese Ergebnisse zeigen, daß der lon-Promotor, der die Expression von Protease La kontrolliert, durch die Induktion der TPA-Herstellung in mit dieses Protein codierenden DNA-Sequenzen transformierten Wirtezellen angeschaltet wird. htpR-Mutanten zeigen jedoch diese gesteigerte Expression nicht.

Beispiel 4

Induktion einiger Hitzeschockproteine in Wirtszellen, die Gewebe-Plasminogenaktivator bei 30ºC produzieren, und das Fehlen dieser Induktion in einer htpR-Mutante.

Das TPA-Gen enthaltende pTPA102 wurde, wie oben beschrieben, in die E. coli-Stämme SG943 und SG942 transformiert und die Zellen jedes Stammes wurden in zwei Aliquots aufgeteilt. Ein Aliquot jedes Stammes wurde wie oben beschrieben 1 h bei 30ºC durch die Zugabe von IPTG zur Herstellung von TPA induziert. Das zweite Aliquot wurde 1 h bei 30ºC ohne die Zugabe von IPTG induziert, d.h. es war nicht-induziert. Die Zellen wurden anschließend durch Filtration gewaschen, in 2 µCi/ml ³&sup5;S- Methionin (> 400 Ci/mmol, New England Nuclear) enthaltendem MOPS-Medium resuspendiert und 5 min Puls-markiert. Das Gesamt-Zellprotein wurde im Anschluß daran durch TCA-Präzipitation aus den Zellen extrahiert und zuerst mit 10% TCA, dann 5% TCA und dann mit einer Ethanol/Ether-Lösung (1:1) gewaschen. Das Protein wurde im Vakuum getrocknet, in 1x SDS-Auftragspuffer resuspendiert und auf einem 7-15% linearen Gradienten-Polyacrylamidgel elektrophoretisiert. Zum Nachweis der klassischen Hitzeschockantwort wurden E. coli SG943- und SG942-Zellen, die nicht mit pTPA102 transformiert worden waren, bei 30ºC und 42ºC wie oben beschrieben Puls-markiert. Im Fall der Zellaufzucht bei 42ºC wurden die Zellen von 30ºC auf 42ºC gebracht, 5 min wachsen gelassen und anschließend Puls-markiert.
Ein Vergleich der Autoradiogramme der untransformierten, bei 30ºC und 42ºC gewachsenen htpR&spplus;-Zellen zeigte die Herstellung zahlreicher Hitzeschockproteine bei 42ºC (d.h. nicht vorhanden bei 30ºC). Das Autoradiogramm der TPA-enthaltenden htpR&spplus;-Zellen, die mit ITPG bei 30ºC induziert wurden, zeigt 4 - 5 Proteine, die einigen jener Hitzeschockproteine entsprechen, die auf dem Autoradiogramm der htpR&spplus;-Zellen entdeckt wurden, die zum Wachsen auf 42ºC gebracht wurden (d.h. die klassische Hitzeschockantwort). Diese 4 - 5 Proteine waren auf den Autoradiogrammen der TPA-enthaltenden, mit ITPG induzierten htpR&supmin;-Zellen nicht vorhanden und auch auf dem Autoradiogramm der htpR&supmin;-Zellen, die zum Wachsen auf 42ºC gebracht wurden, waren keine Hitzeschockproteine vorhanden. Diese Daten zeigen, daß zumindest einige der durch Hitzeschock induzierten Proteine in htpR+-Zellen auch durch die Herstellung von TPA bei 30ºC induziert werden, während die Induktion dieser Proteine in htpR-Mutanten fehlt.

Beispiel 5

Gesteigerte Ausbeuten an in htpR-Mutanten cloniertem Gewebe-Plasminogenaktivator

Ein Wildtyp E. coli-Stamm MC1061, eine lon 100 Mutante, SG2041, und eine htpR-lon-Doppelmutante, SG935, wurden mittels bekannter Techniken mit dem Plasmid pTPA102 transformiert. Die Zellen wurden bis zu einer O.D. von 0,5 in LB-Medium gezüchtet und ITPG bis zu einer Konzentration von 1 mM für 0,5 - 1 h zugegeben. Die Zellen wurden abzentrifugiert, in SDS-Auftragspuffer resuspendiert, 10 min aufgekocht und auf einem SDS- Polyacrylamidgel elektrophoretisiert. Das Gel wurde auf Nitrocellulosepapier als Blot aufgebracht, wodurch ein Transfer der Proteinbande aus dem Gel auf das Papier erhalten wurde. Das Papier wurde anschließend mit Antikörpern gegen TPA aus Kaninchen (ein Geschenk von Dr. Wolf-Dieter Schleunig) und anschließend mit Anti-Kaninchen Antikörpern aus Ziegen behandelt, wobei der zweite Antikörper mit Meerrettichperoxidase (Biorad) konjugiert war. Die Antikörper banden an die Bereiche des Filterpapiers wo das TPA-Protein lokalisiert war. Zum Nachweis der TPA-Bande wurde das Filterpapier mit H&sub2;O&sub2; behandelt, das dort wo das TPA-Protein lokalisiert war, eine Farbänderung auf dem Papier bewirkte (siehe das Zitat für Western Blot). Mit diesem Verfahren konnten wir nachweisen, daß die htpR-lon-Doppelmutante eine gegenüber dem Wildtypstamm 3- bis 5fache Steigerung der Ausbeute an Gewebe-Plasminogenaktivator zeigte.

Beispiel 6

Expression von Somatomedin C in lon- und htpR-Mutanten

Das folgende Beispiel zeigt die Anreicherung des menschlichen Hormons Somatomedin C (SMC) in lon-, htpR- und lon-htpR-Doppelmutanten Wirtszellen nach der Transformation dieser Mutanten mit einem das SMC codierende Gen enthaltenden Plasmid und der Aufzucht des transformierten Wirts bei 42ºC. Wir führten zum Beispiel Plasmid pPLmuSMCori oder pPLmuSMC2 (die das Gen für SMC tragen) und pcI&sub8;&sub5;&sub7; in die E. coli-Stämme HB101, SG931 (Wildtyp), SG933 (lon&supmin;), SG934 (htpR&supmin;) bzw. SG936 (lon&supmin; htpR&supmin;) ein. Zur Induktion der Hitzeschockantwort inkubierten wir diese Stämme 2 h bei 42ºC und konnten so die Anreicherung von SMC auf Coomassieblau-gefärbten SDS-Polyacrylamidgelen mit E.coli-Extrakten aus den entsprechenden Stämmen nachweisen. Die Analyse der fünf Stämme, von denen jeder pPLmusMCori und pcI&sub8;&sub5;&sub7; trug, mit Radioimmuntest zeigte für die entsprechenden oben aufgelisteten Stämme SMC-Verhältnisee von 1:1:3:15:33. Somit reicherten die lon-htpR-Mutanten am meisten SMC an, wobei die zwei Mutationen in ihren Wirkungen ein additives Verhalten zeigten. Ähnliche Wirkungen konnten in Stämmen, die pPLmuSMC2 trugen, beobachtet werden. In diesem Fall betrugen die SMC-Verhältnisse für die entsprechenden fünf Stämme 1:1:2,6:2,3:4,1. Auch hier reicherten die lon-htpR-Mutanten das meiste SMC an und die zwei Mutationen zeigten additive Auswirkungen.
Wir führten außerdem eine Puls-"chase"-Untersuchung durch, die mittels Gelautoradiographie ausgewertet wurde. Wir züchteten Zellen über Nacht bei 28ºC in M9-Minimalmedium mit allen Aminosäuren außer Cystein, gefolgt von einer Induktion im selben Medium bei 42ºC. Die wachsenden Kulturen wurden 30 Sekunden mit [³&sup5;S]-Cystein markiert und dann durch die Zugabe eines Überschusses an unmarkiertem Cystein zur Kultur ein "chase" durchgeführt. pPLmuSMC2 tragender HB101 baute etwa viermal mehr [³&sup5;S]-Cystein in SMC ein als pPLmuSMCori tragender HB101. Die Halbwertszeit von SMC schien im Wildytp HB101-Wirt 5 min oder weniger zu betragen und nach einem 60 min "chase" war SMC fast nicht mehr nachweisbat. Im Gegensatz dazu hatte das SMC im lon-htpR-Mutantenwirt eine Halbwertszeit von ungefähr 60 min.
Die mit den hier beschriebenen Verfahren hergestellten Mikroorganismen sind durch bei der American Typs Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegte Kulturen veranschaulicht. Die am 5. März 1984 hinterlegten Kulturen sind folgendermaßen gekennzeichnet:
Kultur SG935: ATCC 39623
Kultur SG936: ATCC 39624
Die Kulturen, die am 6. März 1984 hinterlegt wurden, sind folgendermaßen gekennzeichnet:
Kultur SG927: ATCC 39627
Kultur SG928; ATCC 39628
Wir haben hier eine Reihe von erfindungsgemäßen Ausführungsformen gezeigt, wobei es offensichtlich ist, daß unsere zugrunde liegende Konstruktion zur Bereitstellung anderer Ausführungsformen, die die erfindungsgemäßen Verfahren und Bestandteile dieser Erfindung verwenden, abgeändert werden kann. Es sollte daher berücksichtigt werden, daß der Schutzbereich der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen, die durch Beispiele dargestellt worden sind, bestimmt wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides in einem bakteriellen Wirtsorganismus, umfassend den Schritt der Züchtung eines bakteriellen Wirtes, der mit einem rekombinanten, durch eine das Polypeptid codierende nicht- htpR DNA-Seguenz gekennzeichneten DNA-Molekül transformiert ist, wobei der Wirt eine Mutation in einem Hitzeschock-Regulatorgen trägt, die eine reduzierte proteolytische Abbaufähigkeit für das Polypeptid zur Folge hat.

2. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides in einem bakteriellen Wirtsorganismus, umfassend die Schritte

a. der Insertion einer das Polypeptid codierenden nicht-htpR DNA-Sequenz in ein Clonierungsvehikel, so daß die DNA-Sequenz von einer funktionalen Expressionskontrollsequenz reguliert wird;

b. der Transformation eines bakteriellen Wirtes mit dem Clonierungsvehikel, das die insertierte DNA-Sequenz enthält, wobei der Wirt eine Mutation in einem Hitzeschock-Regulatorgen trägt, die eine reduzierte proteolytische Abbaufähigkeit für das Polypeptid zur Folge hat; und

c. der Züchtung des transformierten Wirtes.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirtsorganismus ein Bacillus-Stamm ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirtsorganismus ein Salmonella-Stamm ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirtsorganismus ein E. coli-Stamm ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Hitzeschock-Regulatorgen das htpR-Gen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Wirt eine lon-Mutante ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirt aus der Gruppe E.coli Stamm SG 927, ATCC Hinterlegungsnummer 39,627; E.coli Stamm SG 928 , ATCC Hinterlegungsnummer 39,628; E.coli Stamm SG 935, ATCC Hinterlegungsnummer 39,623 und E.coli Stamm SG 936, ATCC Hinterlegungsnummer 39,624 ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz aus der Gruppe von DNA-Sequenzen ausgewählt ist, die Polypeptide mit einer immunologischen oder biologischen Aktivität von Leukozyteninterferon, Fibroblasteninterferon, Immuninterferon, FMDV-Virusantigene, Heptatitis B- Virusantigene oder Proinsulin codieren.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz Polypeptide mit der biologischen Aktivität von Somatomedin C codiert.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz Polypeptide mit der biologischen Aktivität des Gewebe- Plasminogenaktivators codiert.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionskontrollsequenz eine Temperatur-induzierbare Expressionskontrollsequenz ist.

13. Wirt, ausgewählt aus der Gruppe E.coli Stamm SG 927, ATCC Hinterlegungsnummer 39,627; E.coli Stamm SG 928, ATCC Hinterlegungsnummer 39,628; E.coli Stamm SG 935, ATCC Hinterlegungsnummer 39,623 und E.coli Stamm SG 936, ATCC Hinterlegungsnummer 39,624.

14. E.coli-Wirtsorganismus, der Mutationen sowohl im htpR- Gen als auch im lon-Gen aufweist, die eine reduzierte proteolytische Abbaufähigkeit aufgrund der Anwesenheit eines nicht-htpR-Proteins, -Polypeptids oder -Produktes zur Folge haben.

15. Wirt nach Anspruch 13 oder 14, transformiert mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das eine ein nicht-htpR- Protein, -Polypeptid oder -Produkt codierende DNA- Sequenz umfaßt, die funktional mit der Expressionskontrollsequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül verknüpft ist.