JPS58150517A - Dna配列、組換dna分子およびヒト血清アルブミン様ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
Dna配列、組換dna分子およびヒト血清アルブミン様ポリペプチドの製造方法Info
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- JPS58150517A JPS58150517A JP57217918A JP21791882A JPS58150517A JP S58150517 A JPS58150517 A JP S58150517A JP 57217918 A JP57217918 A JP 57217918A JP 21791882 A JP21791882 A JP 21791882A JP S58150517 A JPS58150517 A JP S58150517A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の要約
DNA配列,組換DN▲分子およびヒト血清アルブミン
様ポリペプチドの製造方法につき開示する。本発明のD
NA配列および組換DNA分子はヒト血清アルブミン様
ポリペプチドを暗号化するDNA断片を含むことを特徴
とする。
様ポリペプチドの製造方法につき開示する。本発明のD
NA配列および組換DNA分子はヒト血清アルブミン様
ポリペプチドを暗号化するDNA断片を含むことを特徴
とする。
これらのi)NA配列および組換DNA分子ならびκそ
れらによp形質転換される宿主を本発明の方法に使用し
て,ヒト血清アルブミン様ポリペプチドを生産する仁と
ができる。
れらによp形質転換される宿主を本発明の方法に使用し
て,ヒト血清アルブミン様ポリペプチドを生産する仁と
ができる。
本発明はDNA配列、組換DN人分子およびヒト血清ア
ルブミン様ポリペプチドの製造方法に関するものである
.さらに詳細には、本発明は適当′&攬主生物κおいて
表現されるDNA配列および組換1)NA分子κ関する
吃のである。
ルブミン様ポリペプチドの製造方法に関するものである
.さらに詳細には、本発明は適当′&攬主生物κおいて
表現されるDNA配列および組換1)NA分子κ関する
吃のである。
本発明のDNA配列および組換DN▲分子は、ヒト血清
アルブミン様のポリペプチドを暗号化する断片を含むζ
とを特徴とする.シ九がって。
アルブミン様のポリペプチドを暗号化する断片を含むζ
とを特徴とする.シ九がって。
これらi)NA配列および組換L)N大分子ならびκそ
れらによ)形質転換される宿主を本発明の方法に使用し
て、ヒト血清アルブミン様ポリペプチドを製造すること
がてきる。
れらによ)形質転換される宿主を本発明の方法に使用し
て、ヒト血清アルブミン様ポリペプチドを製造すること
がてきる。
ヒト血清アルブミンは、ヒト血清の主要な蛋白成分であ
る.ζれは肝臓により合成され、血管内体液の浸透圧を
調節すると共κ、血液内の各種の代謝物を結合すると思
われる。天然のヒト血清アルブミンの7ξミノ配列は公
知である〔ビー●メロクン等 FhBS レタース、
第58巻、@134 〜371F(1975年10月)
)、eflは585個の7κノ鎖よ)fkる蛋白質であ
る。
る.ζれは肝臓により合成され、血管内体液の浸透圧を
調節すると共κ、血液内の各種の代謝物を結合すると思
われる。天然のヒト血清アルブミンの7ξミノ配列は公
知である〔ビー●メロクン等 FhBS レタース、
第58巻、@134 〜371F(1975年10月)
)、eflは585個の7κノ鎖よ)fkる蛋白質であ
る。
現在,ヒト血清アルブミンは、輸血用として最早使用し
えない血液試料から単一することKよシ製造される。こ
れは火傷患者κ対する補血用として,ヒト循環器系の機
能を陶土させる手段として,食品添加物用のアミノ酸供
給源として,新生児κおける核黄復(ビリルビンの過剰
)の治療κおける有力な窒素固定剤としてならびκヒト
治療κ使用される多くの瘍剤およびその軸化合物κ対す
るri嬢上許袢しうるキャリアとして広く使用されてい
る。
えない血液試料から単一することKよシ製造される。こ
れは火傷患者κ対する補血用として,ヒト循環器系の機
能を陶土させる手段として,食品添加物用のアミノ酸供
給源として,新生児κおける核黄復(ビリルビンの過剰
)の治療κおける有力な窒素固定剤としてならびκヒト
治療κ使用される多くの瘍剤およびその軸化合物κ対す
るri嬢上許袢しうるキャリアとして広く使用されてい
る。
ヒト血清アルブミンは血液試料から精製されるので,血
液と同じ汚染を受は島い●たとえばヒト血清アルブミン
は輸血によ)ヒトの関で伝染されうるB橿肝炎つイルス
粒子もしくはその他ウイルスおよび毒物κよって汚染さ
れることがある.要するκ,これら汚染の可能性は、ヒ
ト血清アルブミンの使用を制約している.さらκ,その
主要な供給源は捨てようとしている血液試料であるため
,ヒト血清アルブミンの供給は血液貯蔵条件が改善され
るにつれて減少するであろう.さらに、ヒト血清アルブ
ミンが医薬治療における広範な用途を有するため、ヒト
血清アルブミンの入手Ki?ける同様な減少が起ζるで
あろう。したがって、高gK精製されたヒト血清アルブ
きンの他の供給源が必要とされる。
液と同じ汚染を受は島い●たとえばヒト血清アルブミン
は輸血によ)ヒトの関で伝染されうるB橿肝炎つイルス
粒子もしくはその他ウイルスおよび毒物κよって汚染さ
れることがある.要するκ,これら汚染の可能性は、ヒ
ト血清アルブミンの使用を制約している.さらκ,その
主要な供給源は捨てようとしている血液試料であるため
,ヒト血清アルブミンの供給は血液貯蔵条件が改善され
るにつれて減少するであろう.さらに、ヒト血清アルブ
ミンが医薬治療における広範な用途を有するため、ヒト
血清アルブミンの入手Ki?ける同様な減少が起ζるで
あろう。したがって、高gK精製されたヒト血清アルブ
きンの他の供給源が必要とされる。
分子生物学における最近の進歩は,細dIW7I主にお
ける多量の成熟核蛋白質の製造を可能にしえ。これらK
は、たとえば白血球インタ7エロン(ニス拳ナガタ等「
イー−コリにおけるヒト白血球インタフエロン活性を有
するポリペプチドの合成」、ネイチャ誌.縞2 8 4
@.菖616〜20頁(1980))、 ヒト11g肝
炎ウィルスの抗原(シー●ジエー●バレル等[プラスミ
ドpBR322中κクローン化され九aai肝炎ウイル
スi)N人配列のイー拳コリにおける表現」、ネイf’
r誌.ji279巻. [4 3 〜7J[( 1 9
79)。
ける多量の成熟核蛋白質の製造を可能にしえ。これらK
は、たとえば白血球インタ7エロン(ニス拳ナガタ等「
イー−コリにおけるヒト白血球インタフエロン活性を有
するポリペプチドの合成」、ネイチャ誌.縞2 8 4
@.菖616〜20頁(1980))、 ヒト11g肝
炎ウィルスの抗原(シー●ジエー●バレル等[プラスミ
ドpBR322中κクローン化され九aai肝炎ウイル
スi)N人配列のイー拳コリにおける表現」、ネイf’
r誌.ji279巻. [4 3 〜7J[( 1 9
79)。
およびエム●パセク等[イー−コリκおけるB臘肝炎遺
伝子およびそれらの表現」、ネイチャー、第282巻、
第575〜79頁(1979))。
伝子およびそれらの表現」、ネイチャー、第282巻、
第575〜79頁(1979))。
5v4ot抗原 (fイー・エム・ロバーツ勢、「イー
・コリにおけるJll聾ウィルス40を抗原の合成」、
プロシーディング・ナンヨナル・アカデンー・サイエン
ス・08人、第76巻、第5596〜5600貞(19
79))およびFMDウィルスt[(エッチ拳キュツバ
ー等「7ツト争アンド−マウス病ウィルスの主要抗原の
cDNAOクローン化およびイー・フリにおける表丸。
・コリにおけるJll聾ウィルス40を抗原の合成」、
プロシーディング・ナンヨナル・アカデンー・サイエン
ス・08人、第76巻、第5596〜5600貞(19
79))およびFMDウィルスt[(エッチ拳キュツバ
ー等「7ツト争アンド−マウス病ウィルスの主要抗原の
cDNAOクローン化およびイー・フリにおける表丸。
ネイチャ繍、第289%、第555〜59頁(1982
))が包含されろ。
))が包含されろ。
一般にこnらの方法は、表現制御配列に作用結合される
所望の生産物を暗号化するDNA配列を%黴とし九組換
DNム分子の作成に依存する0次いで、適当な宿主をこ
nら分子によって形質転換させ、醗−法により所望の生
産物の製造t−可能にする。DNA暗号化配列について
は、化学合成によプ製造されるものの他、この種の組換
1)N人分子の作成は所望蛋白質に対するメツセンジャ
RNA(mRN人)−盛の単一鎖DNAコピー(ci)
NA)を生成させ、このcDNAを二重鎖DNλに変換
し、仁のDNAを適当なりローン化ベヒクルにおける適
当な表現制御配列へ作用結合させるという工程からなっ
ている。
所望の生産物を暗号化するDNA配列を%黴とし九組換
DNム分子の作成に依存する0次いで、適当な宿主をこ
nら分子によって形質転換させ、醗−法により所望の生
産物の製造t−可能にする。DNA暗号化配列について
は、化学合成によプ製造されるものの他、この種の組換
1)N人分子の作成は所望蛋白質に対するメツセンジャ
RNA(mRN人)−盛の単一鎖DNAコピー(ci)
NA)を生成させ、このcDNAを二重鎖DNλに変換
し、仁のDNAを適当なりローン化ベヒクルにおける適
当な表現制御配列へ作用結合させるという工程からなっ
ている。
次いで1組換DNA分子を使用して適当な宿主を形質転
換させる。この形質転換は、適当な条件下で醗酵させた
場合、宿主が所望蛋白質を生産するのを可能にする。
換させる。この形質転換は、適当な条件下で醗酵させた
場合、宿主が所望蛋白質を生産するのを可能にする。
本発明は、ヒト血清アルブミン様ポリペプチドを暗号化
する少なくとも1種の1)NA配列を提供する。さらに
詳細には、本発明によれば少なくとも1部がヒト血清ア
ルブミン様ポリペプチドを暗号化することを特徴とする
DNA配列が提供される1本発明のこの1)NA配列は
、伽)ム(8A/35−1 、)18A/17−5.)
ISA/35−1り反す一旦速几I)−H8A/17−
3(旦1l−ElcoRI ) 、ki8A、155−
1 (Xbal−Ec。
する少なくとも1種の1)NA配列を提供する。さらに
詳細には、本発明によれば少なくとも1部がヒト血清ア
ルブミン様ポリペプチドを暗号化することを特徴とする
DNA配列が提供される1本発明のこの1)NA配列は
、伽)ム(8A/35−1 、)18A/17−5.)
ISA/35−1り反す一旦速几I)−H8A/17−
3(旦1l−ElcoRI ) 、ki8A、155−
1 (Xbal−Ec。
凡1)−に4SA/17−5(X吠ニー担凡工)。
わ)前記DNA配列のいずれかにヒブリド化しかつヒト
血清アルブミン様ポリペプチドを暗号化する1)NA配
列、()供#源の種類を問わず、天然1合成もしくは生
合成の供給源、突然変異に関連する賜のを包含し、さら
に前記DNA配^のいずれかに関し、単一もしくは多重
の塩基置換、stn、挿入および逆転を包含するDNム
配タU、および傾前記ONム配列のいずれかのコドンに
より暗号化されるものと同様表アミノ酸配列を含有する
ポリペプチドを暗号化しかつヒト血清アルブミン様ポリ
ペプチドをaS化するコ5トンの配列からなるDNA配
列よ)なる群から選択される。
血清アルブミン様ポリペプチドを暗号化する1)NA配
列、()供#源の種類を問わず、天然1合成もしくは生
合成の供給源、突然変異に関連する賜のを包含し、さら
に前記DNA配^のいずれかに関し、単一もしくは多重
の塩基置換、stn、挿入および逆転を包含するDNム
配タU、および傾前記ONム配列のいずれかのコドンに
より暗号化されるものと同様表アミノ酸配列を含有する
ポリペプチドを暗号化しかつヒト血清アルブミン様ポリ
ペプチドをaS化するコ5トンの配列からなるDNA配
列よ)なる群から選択される。
したがって1本発明によれば、ヒト血液および血漿から
単111mされる天然のヒト血清アルブインに従来固有
のBa1t肝炎ウィルス粒子もしくはその他不純物によ
p汚粂されないような形態でかつ相当量でヒト血清アル
ブミン様ポリペプチドを得ることができる。本発明にお
けるDNA配列1組換DNム分子、宿主およびそれらの
使用方法ならびにそれらによ)生産されるヒト血清アル
ブミン様ポリペプチドは、ヒト血清アルブ建ン製造のそ
の他公知の方法を悩ませていえ問ii[を回避する。し
たがって、医薬上およびその他工業用に各種の用途とし
て多量の高1lIII&ヒト血清アルブミン様ポリペプ
チドおよびその誘導体を利用することが可能となる。
単111mされる天然のヒト血清アルブインに従来固有
のBa1t肝炎ウィルス粒子もしくはその他不純物によ
p汚粂されないような形態でかつ相当量でヒト血清アル
ブミン様ポリペプチドを得ることができる。本発明にお
けるDNA配列1組換DNム分子、宿主およびそれらの
使用方法ならびにそれらによ)生産されるヒト血清アル
ブミン様ポリペプチドは、ヒト血清アルブ建ン製造のそ
の他公知の方法を悩ませていえ問ii[を回避する。し
たがって、医薬上およびその他工業用に各種の用途とし
て多量の高1lIII&ヒト血清アルブミン様ポリペプ
チドおよびその誘導体を利用することが可能となる。
本明細書中に記載する本発明を一層充分理解しうるよう
以下詳細に説明する。
以下詳細に説明する。
本明細書において1次の用語を使用する:ヌクレオチド
二纏部分(ペントース)と燐′一部分と含窒素複素環式
塩基とよりなるDN^もしくはRNAのモノ!一単位、
塩基はグリコシド炭素(ペントースの1 炭素) を介
して糖部分に結合されており、塩基と纏とのむの結合を
ヌクレオチドと呼ぶ、塩基はヌクレオチドを特性付dる
。4種のDNA塩基はアデニン(陶)。
二纏部分(ペントース)と燐′一部分と含窒素複素環式
塩基とよりなるDN^もしくはRNAのモノ!一単位、
塩基はグリコシド炭素(ペントースの1 炭素) を介
して糖部分に結合されており、塩基と纏とのむの結合を
ヌクレオチドと呼ぶ、塩基はヌクレオチドを特性付dる
。4種のDNA塩基はアデニン(陶)。
グアニン(rGJ )、シトシン(rCJ )およびチ
イン(rTJ )である・。4種のRNム塩基はA。
イン(rTJ )である・。4種のRNム塩基はA。
G、CおよびウラシルC「υ」)である。
工状μノ」1烈−:隣接するペントースの5炭素と5炭
素 との間のホスホジエステル結合によp互いに結合さ
れえヌクレオチドの線状列。
素 との間のホスホジエステル結合によp互いに結合さ
れえヌクレオチドの線状列。
−2」ニド# 348のヌクレオチドのDNA配列Cト
リブレッド)であって1m&NAを介しアイノ績、ll
訳開始信号まえは翻訳停止信号を暗号化する。たとえば
、ヌクレオテドトリプレッ) TTA、TTG、CT
T、cTC,CTAThJびCTGはアンノ駿ロイシン
(「L@uJ )を41化し、TAG、TAムおよびT
GAは翻訳停止信号であり、ムTGは一訳關始信号でb
る。
リブレッド)であって1m&NAを介しアイノ績、ll
訳開始信号まえは翻訳停止信号を暗号化する。たとえば
、ヌクレオテドトリプレッ) TTA、TTG、CT
T、cTC,CTAThJびCTGはアンノ駿ロイシン
(「L@uJ )を41化し、TAG、TAムおよびT
GAは翻訳停止信号であり、ムTGは一訳關始信号でb
る。
fjN* : m RNムをア()鹸配列へ翻訳する際
のコドンのグループ、If訳の―は、適性な貌枠を錨持
せねばならな一1九とえば、配列GCTGGTTG’r
AAG 13っo絖枠、すなわち相において翻訳するこ
とができ、そのそれぞれは異なるア櫂ノ鐵配列、すなわ
ち GOT GGT TGTムムG −− Aj a−GJ y−Cys−Lys G CTG GTT GTA AG −−Lau−Va
l−VajGCi諒」没TAA G−Trp−Ltu−
(l!#゛を与える・ )基とカルボ中シ基との間のペプチド結合によ)互いに
結合されたアミノ酸の線状列。
のコドンのグループ、If訳の―は、適性な貌枠を錨持
せねばならな一1九とえば、配列GCTGGTTG’r
AAG 13っo絖枠、すなわち相において翻訳するこ
とができ、そのそれぞれは異なるア櫂ノ鐵配列、すなわ
ち GOT GGT TGTムムG −− Aj a−GJ y−Cys−Lys G CTG GTT GTA AG −−Lau−Va
l−VajGCi諒」没TAA G−Trp−Ltu−
(l!#゛を与える・ )基とカルボ中シ基との間のペプチド結合によ)互いに
結合されたアミノ酸の線状列。
ゲノム:細胞11九紘ウイルスの全DNA、これ#i、
Il#Km!18% L<はウィルスのポリペプチド
を暗号化する構造遺伝子ならびにそのオペレータ、プロ
モータを含み、さらにリボソーム結合性および反応性配
列を含み、九とえばシャインーダルガルノ配列のような
配列を包含する・構造遺伝子ニー瀝もしくはメツセンジ
ャ8Nム(rmRNAJ )を介し、轡定のポリペプチ
ドに特性的次アきノ酸の配列耐暗号化するDNA配列。
Il#Km!18% L<はウィルスのポリペプチド
を暗号化する構造遺伝子ならびにそのオペレータ、プロ
モータを含み、さらにリボソーム結合性および反応性配
列を含み、九とえばシャインーダルガルノ配列のような
配列を包含する・構造遺伝子ニー瀝もしくはメツセンジ
ャ8Nム(rmRNAJ )を介し、轡定のポリペプチ
ドに特性的次アきノ酸の配列耐暗号化するDNA配列。
転写:構造遺伝子からmRNムを生産する過龜・
翻訳:mRN人からポリペプチドを生産する過揚働
表現:ポリペプチドを生産する九め構造遺伝子により受
ける過程、これは転写と翻訳との組合せであ本。
ける過程、これは転写と翻訳との組合せであ本。
プラスミド:プラスミドを宿主細胞中に複劇するような
完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎮DNA配列
−プラスミドを単細胞生物中に入れると、その生物の特
性はプ9qドのDNAの結果として変化し、まえは形質
転換される。たと゛えば、テトラサイクリン耐性(Te
t )に対する遺伝子含有するプラスミドは、テトラサ
イクリンに対し感受性であった細胞をテトラサイクリν
に対し耐性である細胞に形質転換させる。プラスj)″
によp形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎮DNA配列
−プラスミドを単細胞生物中に入れると、その生物の特
性はプ9qドのDNAの結果として変化し、まえは形質
転換される。たと゛えば、テトラサイクリン耐性(Te
t )に対する遺伝子含有するプラスミドは、テトラサ
イクリンに対し感受性であった細胞をテトラサイクリν
に対し耐性である細胞に形質転換させる。プラスj)″
によp形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
7ア゛−ジ筐九はバクテリオファージ:mm性ウィルス
であって、その多くは蛋白エンベロブもしくはコニト中
にカプセル化され九DNA配りIf(rカプシド蛋白質
」)よシなっている。
であって、その多くは蛋白エンベロブもしくはコニト中
にカプセル化され九DNA配りIf(rカプシド蛋白質
」)よシなっている。
クローン化ベヒクル:プラスミド、7アージ1)NA普
えはその値のDNA配列であって、これはこの種の1J
N人配列を決定可能に切断しうる1箇もしくは少数の5
工ンドヌクレアーゼ織別位置を有し、しかもDNAの本
質的な生物学的機能、たとえば複製J゛コート蛋白質の
生産またはプロモータもしくは結合位置の喪失を伴わな
いことを特徴とし、かつ形質転換細胞の同定に使用する
のに適する標識、たとえばテトラサイクリン耐性管たは
アンピシリン耐性を有する。
えはその値のDNA配列であって、これはこの種の1J
N人配列を決定可能に切断しうる1箇もしくは少数の5
工ンドヌクレアーゼ織別位置を有し、しかもDNAの本
質的な生物学的機能、たとえば複製J゛コート蛋白質の
生産またはプロモータもしくは結合位置の喪失を伴わな
いことを特徴とし、かつ形質転換細胞の同定に使用する
のに適する標識、たとえばテトラサイクリン耐性管たは
アンピシリン耐性を有する。
クローン化ベヒクル社、シばしばベクタと呼ばれる。
クローン化:無性繁殖によプこの種の1種の生物まえは
配列から誘導される生物またはDNA配列の集団を得る
過程。
配列から誘導される生物またはDNA配列の集団を得る
過程。
組換DNA分子またはヒブリドDNA:生細胞の外部で
末端結合されておりかつ成る種の宿主細胞に感染する能
力を有して、そζに維持されるような異なるゲノムから
の1)NA断片よりなる分子。
末端結合されておりかつ成る種の宿主細胞に感染する能
力を有して、そζに維持されるような異なるゲノムから
の1)NA断片よりなる分子。
表構制御配列:構造遺伝子に作用結合され九―
場合、これら構造遺伝子の表現を制御かつ調節するヌク
レオチドの配列。これらはlac系、trp系、TiC
系、β−1ac系、ファージニの主要オペレータおよび
プロモータ領域、 fdコート蛋白の制御領域および原
始核細胞もしくは成熟核細胞重比はそれらのウィルスの
遺伝子の表塊を制御することが知られたその他の配列お
よびそれらの各種の組合せを包含する。
レオチドの配列。これらはlac系、trp系、TiC
系、β−1ac系、ファージニの主要オペレータおよび
プロモータ領域、 fdコート蛋白の制御領域および原
始核細胞もしくは成熟核細胞重比はそれらのウィルスの
遺伝子の表塊を制御することが知られたその他の配列お
よびそれらの各種の組合せを包含する。
ヒト血清アルプ建ν機ポリペプチド:天然のヒト血清ア
ルブミン(rkls人」)の生物学的もしくは免疫学的
活性を示すポリペプチド、このポリペプチドは、天然H
8At) 1部でないア建ノ績を含有しうるか、ま走は
天然)18Aのア建ノ虐の1部だけを含有することがで
きる。さらに、このペプチドは天然のに′18ムと同一
でなくと4良い・何故なら、これを生産する宿主は宿主
生産されたポリペプチドを天然)(8ムの構造および置
換物に形質転換させるのに必要とされるような逼!1な
酵素を欠如することもあるからである。
ルブミン(rkls人」)の生物学的もしくは免疫学的
活性を示すポリペプチド、このポリペプチドは、天然H
8At) 1部でないア建ノ績を含有しうるか、ま走は
天然)18Aのア建ノ虐の1部だけを含有することがで
きる。さらに、このペプチドは天然のに′18ムと同一
でなくと4良い・何故なら、これを生産する宿主は宿主
生産されたポリペプチドを天然)(8ムの構造および置
換物に形質転換させるのに必要とされるような逼!1な
酵素を欠如することもあるからである。
第1#tJについて説明すれば、とこKは本発明のDN
A配列および組換DNA分子の製造方法における一具体
例の略図が示されている。
A配列および組換DNA分子の製造方法における一具体
例の略図が示されている。
実施例
ヒト胎児の肝pcDNA保存物の調製
ヒト胎児の肝−cDNA保存物をバーバード・メジカル
・スクールのダビット拳クルニットが調製した。ポリA
RNAを周知の方法によりヒト胎児の肝臓から単離し
丸。次いで、このポリA RNAを雛型として使用して
、単一鎖の補完DNA(cDNA)を調製した〔たとえ
ばニー・エフストラチアジス等、「グロビンおよびコリ
オン5nltNAの全長さおよび個々の部分逆転写」、
セル誌、1148、第367〜78貞(1975)およ
びそこに引用され九文献〕。次いで、このcDNAを慣
用の方法によp二IjL鎖となし、dC残留物で切断し
て、これtpKi[’218(pBR622の霞導体)
のdG−切断Pst1部位へ挿入した〔たとえばエル働
ビラーコマロフ等「プロインシュリンを合成する細1性
クローン」。
・スクールのダビット拳クルニットが調製した。ポリA
RNAを周知の方法によりヒト胎児の肝臓から単離し
丸。次いで、このポリA RNAを雛型として使用して
、単一鎖の補完DNA(cDNA)を調製した〔たとえ
ばニー・エフストラチアジス等、「グロビンおよびコリ
オン5nltNAの全長さおよび個々の部分逆転写」、
セル誌、1148、第367〜78貞(1975)およ
びそこに引用され九文献〕。次いで、このcDNAを慣
用の方法によp二IjL鎖となし、dC残留物で切断し
て、これtpKi[’218(pBR622の霞導体)
のdG−切断Pst1部位へ挿入した〔たとえばエル働
ビラーコマロフ等「プロインシュリンを合成する細1性
クローン」。
プロシーデイング・ナショナル・アカデ<−−サイエン
ス・LJ19A、j1g75巻、第3727−511(
(1978);ケーータルマツシ等「イー・コ9にイン
シュリン抗原を持込む成am信号配列」、グロシーデイ
ンダーナシ叢ナル・アカデミ−・t(工yx−U8A、
111177%、に55b9〜75頁(1980))、
得られ九ヒト胎児の肝臓保存物からなる組換DNム分子
を次いで使用して。
ス・LJ19A、j1g75巻、第3727−511(
(1978);ケーータルマツシ等「イー・コ9にイン
シュリン抗原を持込む成am信号配列」、グロシーデイ
ンダーナシ叢ナル・アカデミ−・t(工yx−U8A、
111177%、に55b9〜75頁(1980))、
得られ九ヒト胎児の肝臓保存物からなる組換DNム分子
を次いで使用して。
標準法によ珈虜合性のイー・コリ1(B101 を形質
転換させた。タルニット博士によシこの保存物が我々に
提供されえ。
転換させた。タルニット博士によシこの保存物が我々に
提供されえ。
Z!
上記のヒト胎児の肝11cDNA保存物をネズZ(mo
use)血清アルブ々ンc J)NAでスクリーニング
することを決定した〔ディー・キオウシス等、「α−フ
ェト蛋自およびアルプンンの発生」、ジャーナル・オプ
・バイオロジカル・ケ々ストリー。
use)血清アルブ々ンc J)NAでスクリーニング
することを決定した〔ディー・キオウシス等、「α−フ
ェト蛋自およびアルプンンの発生」、ジャーナル・オプ
・バイオロジカル・ケ々ストリー。
JIg256@、菖1960〜67][(1981年2
月25日]〕0本発明者等による方法の1鑵は、子牛お
よびねずみ(rat)の血清アルプ擢ンがヒト血清アル
ブ(ンに対し幾つかのアミノ績配列類似性を有すること
である〔テイー−ピータース・ジュニア、「血清アルブ
ミン」、ザ・プラーKff・プロティン(エフ・ダブリ
ュ・プットナムー集)、ll11巻、第133〜181
貞(i975))。し九がって、本発明者等は、ネズイ
血清アルブきンcDNAがヒト血清アルブミンcDNA
K充分な程度クロスヒプリド化して、特定のヒト血清ア
ルプンン関連cDNムを、H8ムに@連しない多くのc
DNAを含有するcDNDNA物から選択しうろことを
推定した。
月25日]〕0本発明者等による方法の1鑵は、子牛お
よびねずみ(rat)の血清アルプ擢ンがヒト血清アル
ブ(ンに対し幾つかのアミノ績配列類似性を有すること
である〔テイー−ピータース・ジュニア、「血清アルブ
ミン」、ザ・プラーKff・プロティン(エフ・ダブリ
ュ・プットナムー集)、ll11巻、第133〜181
貞(i975))。し九がって、本発明者等は、ネズイ
血清アルブきンcDNAがヒト血清アルブミンcDNA
K充分な程度クロスヒプリド化して、特定のヒト血清ア
ルプンン関連cDNムを、H8ムに@連しない多くのc
DNAを含有するcDNDNA物から選択しうろことを
推定した。
上記のcDNA保存物をスクリーニングするため、本発
明者等は保存物から約1(1,000個の集落を集め、
これら集落の培養物をテトラサイクIJ/(20βlン
ー)を補充しえ2YT培地にシいて37℃で増殖させた
(10d、OD5.。=18)〔ジエー・エッチ・イラ
ー、「分子遺伝学における実験」コールド・スプリング
Qバー14、・5i45トリー、コールド4スプリング
−ハーバ−・ニューヨーク(197’2))*プラスイ
ドpKT218はテトラティクリン耐性を暗号化する遺
伝子を含むので、9KT218によシ形質転換されえイ
ーーコ!Jf−IB101(この完全遺伝子を有する)
は、このように形質転換されなかつ九イー・コリをのぞ
いてこの抗生物質を含有する培地中で増殖するであろう
、したがって、テトラサイクリン含有検地における増殖
は、pKT218を含む宿主の選択を可能にする。
明者等は保存物から約1(1,000個の集落を集め、
これら集落の培養物をテトラサイクIJ/(20βlン
ー)を補充しえ2YT培地にシいて37℃で増殖させた
(10d、OD5.。=18)〔ジエー・エッチ・イラ
ー、「分子遺伝学における実験」コールド・スプリング
Qバー14、・5i45トリー、コールド4スプリング
−ハーバ−・ニューヨーク(197’2))*プラスイ
ドpKT218はテトラティクリン耐性を暗号化する遺
伝子を含むので、9KT218によシ形質転換されえイ
ーーコ!Jf−IB101(この完全遺伝子を有する)
は、このように形質転換されなかつ九イー・コリをのぞ
いてこの抗生物質を含有する培地中で増殖するであろう
、したがって、テトラサイクリン含有検地における増殖
は、pKT218を含む宿主の選択を可能にする。
培養物を遠心分離しlfO分間、5000 rpm)、
1dのα5トリス−Hcl (pki 8 )およびリ
ゾf −4(1611/IIJ)中に再Jli?IJセ
、そして氷中VCl5分間静置し九・次いで、この冷混
合物をEDT人と混合しく8きリモルまで)、氷中に残
留させた1次いで、これを20憾のトリトンX−100
(α15sJ)、α5モルの1iDTA(pH8)(&
75seJ)、 1モルのトリス−f(cl(pki7
.9)(t5a#)、n20(4,6aJ)の混合物と
温合し、氷中に15分間靜静置え、溶−し九細胞をエツ
ペンドルフ達心分離器で遠心分離しく5分間、1200
Orpm、4℃)、挿入ヒト胎児肝dcDNAを含有す
る溶−され九pKT218に基づく組換プラスミド(上
置液)から細胞残骸を除去した。
1dのα5トリス−Hcl (pki 8 )およびリ
ゾf −4(1611/IIJ)中に再Jli?IJセ
、そして氷中VCl5分間静置し九・次いで、この冷混
合物をEDT人と混合しく8きリモルまで)、氷中に残
留させた1次いで、これを20憾のトリトンX−100
(α15sJ)、α5モルの1iDTA(pH8)(&
75seJ)、 1モルのトリス−f(cl(pki7
.9)(t5a#)、n20(4,6aJ)の混合物と
温合し、氷中に15分間靜静置え、溶−し九細胞をエツ
ペンドルフ達心分離器で遠心分離しく5分間、1200
Orpm、4℃)、挿入ヒト胎児肝dcDNAを含有す
る溶−され九pKT218に基づく組換プラスミド(上
置液)から細胞残骸を除去した。
仁の上置液を低融点のアガロースゲル(αν優)K施し
、アガロースを65℃で溶融させることによ妙「スーパ
ーコイル」のパン)”(5000〜7000個のヌクレ
オチド寸法)の上部をゲルから除去した。このバンドは
約750個の塩基対よりも大きいヒト胎児肝臓保存物か
らのcDNA挿入物を有する全てのpKT218プラス
ミドを含有すると推定される0次いで、分離されたアガ
ロース−含有のpKT21Bに基づく組換プラスミドを
使用して、慣用方法により氷中でイー・コIJHB10
1の競合性細胞を形質転換させ九(ゲル20声t/細胞
100μm) (たとえば、ニス・アール・クシナー、
シエネチツクーエンジニアリング(エッチ−fブリュ・
ボイヤー纏集)第17頁(1978))。
、アガロースを65℃で溶融させることによ妙「スーパ
ーコイル」のパン)”(5000〜7000個のヌクレ
オチド寸法)の上部をゲルから除去した。このバンドは
約750個の塩基対よりも大きいヒト胎児肝臓保存物か
らのcDNA挿入物を有する全てのpKT218プラス
ミドを含有すると推定される0次いで、分離されたアガ
ロース−含有のpKT21Bに基づく組換プラスミドを
使用して、慣用方法により氷中でイー・コIJHB10
1の競合性細胞を形質転換させ九(ゲル20声t/細胞
100μm) (たとえば、ニス・アール・クシナー、
シエネチツクーエンジニアリング(エッチ−fブリュ・
ボイヤー纏集)第17頁(1978))。
これら細胞を氷中に45分間保ち、次いで57℃まで5
分間加熱し九。この時点で2YTブロス(2111)を
加え、そして細胞を振とうしながら67℃にて45分間
培養した。次いで、細胞t−2YT含有のアガロース板
(20μP/1mlのテトラサイクリンを含有する)上
に@嫁して、67℃にで1晩増殖させ九。
分間加熱し九。この時点で2YTブロス(2111)を
加え、そして細胞を振とうしながら67℃にて45分間
培養した。次いで、細胞t−2YT含有のアガロース板
(20μP/1mlのテトラサイクリンを含有する)上
に@嫁して、67℃にで1晩増殖させ九。
次いで、このアガロース板のニトロセルロースフィルタ
複属物を3つ作成し、そしてこれらを37℃にて5時間
増養した。2つのフィルタからの集落を2YT會有のア
ガa−ス(100μP/Mのクロラムフェニコールを補
充>へ移シ、そして57℃にて15時間培養し九。クロ
ラムフェニコールを使用して宿主細胞中におけるcDN
人含有プツス建ドのコピー数を増加させえ6次いで、こ
れら細胞をアール・イー・タイヤ−1「イー拳コリのプ
ラス擢ドにおける外来DNAの改嵐検出方法」、アナリ
テイカル・バイオケ建ストリー、嬉98巻、第60〜6
3頁(1979)に記載されえ方法によ)湊1させ。
複属物を3つ作成し、そしてこれらを37℃にて5時間
増養した。2つのフィルタからの集落を2YT會有のア
ガa−ス(100μP/Mのクロラムフェニコールを補
充>へ移シ、そして57℃にて15時間培養し九。クロ
ラムフェニコールを使用して宿主細胞中におけるcDN
人含有プツス建ドのコピー数を増加させえ6次いで、こ
れら細胞をアール・イー・タイヤ−1「イー拳コリのプ
ラス擢ドにおける外来DNAの改嵐検出方法」、アナリ
テイカル・バイオケ建ストリー、嬉98巻、第60〜6
3頁(1979)に記載されえ方法によ)湊1させ。
タタシこの場合ニトロセルロースフィルタを1分間でな
く2分間ワットマンム1フイルメ円盤の積層物に載置し
、そして2回ではなく1回のみ吸収および教権り過at
反復した0次いで、作成されたフィルタを乾燥し、80
℃にて2時間加熱した。かくして、仁の手順により10
0〜200クローン/フイルタをそれぞれ含有する40
枚のフィルタを得た。
く2分間ワットマンム1フイルメ円盤の積層物に載置し
、そして2回ではなく1回のみ吸収および教権り過at
反復した0次いで、作成されたフィルタを乾燥し、80
℃にて2時間加熱した。かくして、仁の手順により10
0〜200クローン/フイルタをそれぞれ含有する40
枚のフィルタを得た。
これらフィルタを厳格でない条件下に、ネズ建血清アル
プζンcDN人試料にヒプリド化させた。何故なら、ヒ
ト血清アルブ電ンcDN人とネズ建血清アルプ建ンcD
NAとの間では同質性が低いと思われるからである。こ
のスクリーニングのためネズ電血清アルブ(ycDNA
試料を作成したが、この際ネズき血清アルブ々ンcDN
AI含有する宿主を検量しくデー・キオククス、上記)
、かつアルブ(ン挿入物をH4n4厘制限酵素によりプ
ラスミドから切除することによ9行なり九、この断片を
816ポリアクリールアイドゲル上で精製し、4種のα
−P1ζ−標識ヌクレオチドおよび比活性t2X10”
cpm/μptでのポリメラーゼ■の全ての存在下に二
yクー訳(n1ck−1ranslate ) (、f
l ts次いで、これらをヒブリド化緩衝液(4011
ホルムアイド、α64ルN暑Ct、α12モルトリx
−HCj (pki 8 )、4iル七ル1DTA (
以下、5 X 81ATと呼ぶ)および10憾デキスト
ランサルフエート、α1慢8D8 )中において42℃
にて12時間場養することによ〕ヒブリド化用のフィル
タを作成しえ。
プζンcDN人試料にヒプリド化させた。何故なら、ヒ
ト血清アルブ電ンcDN人とネズ建血清アルプ建ンcD
NAとの間では同質性が低いと思われるからである。こ
のスクリーニングのためネズ電血清アルブ(ycDNA
試料を作成したが、この際ネズき血清アルブ々ンcDN
AI含有する宿主を検量しくデー・キオククス、上記)
、かつアルブ(ン挿入物をH4n4厘制限酵素によりプ
ラスミドから切除することによ9行なり九、この断片を
816ポリアクリールアイドゲル上で精製し、4種のα
−P1ζ−標識ヌクレオチドおよび比活性t2X10”
cpm/μptでのポリメラーゼ■の全ての存在下に二
yクー訳(n1ck−1ranslate ) (、f
l ts次いで、これらをヒブリド化緩衝液(4011
ホルムアイド、α64ルN暑Ct、α12モルトリx
−HCj (pki 8 )、4iル七ル1DTA (
以下、5 X 81ATと呼ぶ)および10憾デキスト
ランサルフエート、α1慢8D8 )中において42℃
にて12時間場養することによ〕ヒブリド化用のフィル
タを作成しえ。
ヒブリド化の丸め2枚のフィルタを2−の新鮮なヒゲリ
ド化用緩衝液および緩衝液1oo@l蟲D 100 J
F OpBR322ノHinf I断片とが存在するポ
リエチレン装甲に入れ、そしてIXlocpmの上記で
単離されたcDNA試料を加ええ、ヒブリド化を42℃
にて18時間継続し丸0次いで、これらフィルタt*温
にてaiifla洗浄L(ILX、JiJI/r、 (
L5優8D8 )qi次いで42℃に? 201Jl洗
浄り九(11X Jilt)I。
ド化用緩衝液および緩衝液1oo@l蟲D 100 J
F OpBR322ノHinf I断片とが存在するポ
リエチレン装甲に入れ、そしてIXlocpmの上記で
単離されたcDNA試料を加ええ、ヒブリド化を42℃
にて18時間継続し丸0次いで、これらフィルタt*温
にてaiifla洗浄L(ILX、JiJI/r、 (
L5優8D8 )qi次いで42℃に? 201Jl洗
浄り九(11X Jilt)I。
次いで、フィルタを発色させて、標識試料に対しヒブリ
ド化した強い証明を示す位置をさらに検査する丸め選択
した・ 最も強いヒブリド化陽性の位置に対応する20個の集落
を使用して、2YTブロス中で37℃にて1晩培養物を
調製し丸。次いで、これら培養物を2YT−アガロース
板(25μP/−のテトラサイクリンを含有する]上へ
塗抹し、#i記と同様にヒプリド化の丸めの複製物を作
成し九、20個のクローンの内18備が再び本ヒプリド
化分析において標識ネズミ血清アルブ建ycDN人試料
に対し強い陽性を示し九・ヒト血清アルプイン関連cD
Nムの単一上記陽性の18個の集落の培養物各1−を調
製し、これらをエツペンドル7チューブにおいて遠心分
離し九(5分間、12000rl)In)*培養物を7
0μtの8TIT緩衝液(8憾の蔗糖、50イリモルの
トリス−HCj (pH8)、5ミリモルのEDTA%
5憾゛のトリトン、H20)と5μLのリゾチーム(1
011/1111g)とに再懸濁させ、そして室温にて
5分間静置し丸。1分間煮沸し九後、溶麿細胞をエッペ
ンドル7チューブで遠心分離しC5分間、12000r
pm )。
ド化した強い証明を示す位置をさらに検査する丸め選択
した・ 最も強いヒブリド化陽性の位置に対応する20個の集落
を使用して、2YTブロス中で37℃にて1晩培養物を
調製し丸。次いで、これら培養物を2YT−アガロース
板(25μP/−のテトラサイクリンを含有する]上へ
塗抹し、#i記と同様にヒプリド化の丸めの複製物を作
成し九、20個のクローンの内18備が再び本ヒプリド
化分析において標識ネズミ血清アルブ建ycDN人試料
に対し強い陽性を示し九・ヒト血清アルプイン関連cD
Nムの単一上記陽性の18個の集落の培養物各1−を調
製し、これらをエツペンドル7チューブにおいて遠心分
離し九(5分間、12000rl)In)*培養物を7
0μtの8TIT緩衝液(8憾の蔗糖、50イリモルの
トリス−HCj (pH8)、5ミリモルのEDTA%
5憾゛のトリトン、H20)と5μLのリゾチーム(1
011/1111g)とに再懸濁させ、そして室温にて
5分間静置し丸。1分間煮沸し九後、溶麿細胞をエッペ
ンドル7チューブで遠心分離しC5分間、12000r
pm )。
上皺液を同量のインプロパノールと混合し良。
このインプロパツール混合物を−20tl:fiで1時
間冷却し、再び適心分離し九(4℃、5分間。
間冷却し、再び適心分離し九(4℃、5分間。
12000rplE1)*次いで、このペレットを制限
分析のため40声L o k120中に再懸濁させた・ 上記で調製した18種の温金物のそれぞれはネXilア
ルフィンcDN人試料に強力にヒブリド化するpKT2
18−ヒト胎児の肝臓cDNA組換体を含有する。この
組換体はdC/dG切断によ〕作成し、かつpKT21
8の11夏部位に挿入し九ので、この6DNA挿入物は
Pstt制限$制限上1各組換体から切除することがで
きる。したがって、これら18種の混合物を標4に条件
下で!す〕kよ〕制限化し、18個の陽性培養物によp
生産された断片をtS*アガロースゲルで寸法決定し九
、10個の大鳳断片(約1200〜2250塩基対)を
含有するクローンを選択しえ。
分析のため40声L o k120中に再懸濁させた・ 上記で調製した18種の温金物のそれぞれはネXilア
ルフィンcDN人試料に強力にヒブリド化するpKT2
18−ヒト胎児の肝臓cDNA組換体を含有する。この
組換体はdC/dG切断によ〕作成し、かつpKT21
8の11夏部位に挿入し九ので、この6DNA挿入物は
Pstt制限$制限上1各組換体から切除することがで
きる。したがって、これら18種の混合物を標4に条件
下で!す〕kよ〕制限化し、18個の陽性培養物によp
生産された断片をtS*アガロースゲルで寸法決定し九
、10個の大鳳断片(約1200〜2250塩基対)を
含有するクローンを選択しえ。
最大挿入物を含有する10種のクローνにおいて挿入物
の配向性を決定する丸め、サウザン(8outh@rn
)ヒブリド化を用’A ft * t 99 yヒプ
リド化については、上記と同様に作成され九ヒト胎児の
肝臓cDNA保存物から、はぼ上記と同様にして従前に
単離された300−ヌクレオチドcDNム配列を使用し
、えだしこれは短かいcDN人断片を特徴とした。部分
的なヌクレオチド配列決定にょシ、この配列はヒト血清
アルプンンの7建ノ酸319〜416を暗号化すること
が示されえ。したがって、このH8に関連cDNA配列
を使用して、ヱリjでの制限化によJ))18Aの5末
端に対する試″料を作成し九(i(8人は72〕@56
5にヱリj部位を有する)、仁の制限化によ〕、H8ム
のア擢ノ酸319〜3650幅を有する試料が得られ良
0次いで、仁の試料をニス・ワイ・ツサイ等によ〕痰質
的に記載され九と同機にニック−訳し九〔「ひなの卵管
における遺伝子表!IK対するエストロゲンの作用、オ
ホパムコイド遺伝子の調整」。
の配向性を決定する丸め、サウザン(8outh@rn
)ヒブリド化を用’A ft * t 99 yヒプ
リド化については、上記と同様に作成され九ヒト胎児の
肝臓cDNA保存物から、はぼ上記と同様にして従前に
単離された300−ヌクレオチドcDNム配列を使用し
、えだしこれは短かいcDN人断片を特徴とした。部分
的なヌクレオチド配列決定にょシ、この配列はヒト血清
アルプンンの7建ノ酸319〜416を暗号化すること
が示されえ。したがって、このH8に関連cDNA配列
を使用して、ヱリjでの制限化によJ))18Aの5末
端に対する試″料を作成し九(i(8人は72〕@56
5にヱリj部位を有する)、仁の制限化によ〕、H8ム
のア擢ノ酸319〜3650幅を有する試料が得られ良
0次いで、仁の試料をニス・ワイ・ツサイ等によ〕痰質
的に記載され九と同機にニック−訳し九〔「ひなの卵管
における遺伝子表!IK対するエストロゲンの作用、オ
ホパムコイド遺伝子の調整」。
バイオケixトリー、 m1ll 7巻、JII557
5〜80員(1978))。
5〜80員(1978))。
上記88人関連試料に対するヒブリド化用のクローンを
含有する10種のネズξ血清アルブiンcDN人のヒブ
リド化陽性かつ大飄断片をlIHするため、si々の制
@酵素: Pvu l 、 Hindl 、 Pst
Iおよびヱst I /H4nd Iによってクローン
を処思し九。これら酵素分解によシ生成された特定の断
片ならびに519〜565k18人E14に対するそれ
らのヒブリド化は、挿入物の配向性と各挿入物の5末端
の位置との決定を可能4CL九、10種のクローンのう
ち2種、すなわちFit上の位置によって示された。1
)KT218()18人/13−1)およびpKT 2
18 (H8A/ 17−5)は、pKT218中に断
片が挿入されているペニシリナーゼを暗号化する遺伝子
の転写方向に関し、正確な配向で5末端を有した。これ
ら2種のクローンの構造を第2図に示す。
含有する10種のネズξ血清アルブiンcDN人のヒブ
リド化陽性かつ大飄断片をlIHするため、si々の制
@酵素: Pvu l 、 Hindl 、 Pst
Iおよびヱst I /H4nd Iによってクローン
を処思し九。これら酵素分解によシ生成された特定の断
片ならびに519〜565k18人E14に対するそれ
らのヒブリド化は、挿入物の配向性と各挿入物の5末端
の位置との決定を可能4CL九、10種のクローンのう
ち2種、すなわちFit上の位置によって示された。1
)KT218()18人/13−1)およびpKT 2
18 (H8A/ 17−5)は、pKT218中に断
片が挿入されているペニシリナーゼを暗号化する遺伝子
の転写方向に関し、正確な配向で5末端を有した。これ
ら2種のクローンの構造を第2図に示す。
11L2mかb判;bように%pKT218(H88ム
/3−1)(以下、pcH8人/33−1と呼ぶ)の挿
入物は、後記するようなヒトプロ血清アルブンンの予備
配列を暗号化するヌクレオチド配列の少なくとも1部と
、いわゆるヒトプロ血清アルブ電ンに対する全暗号化配
列とから構成されている。 pKT218 (H8A/
17−5 ) (以下、pcH8人/17−3と呼ぶ)
の挿入物は。
/3−1)(以下、pcH8人/33−1と呼ぶ)の挿
入物は、後記するようなヒトプロ血清アルブンンの予備
配列を暗号化するヌクレオチド配列の少なくとも1部と
、いわゆるヒトプロ血清アルブ電ンに対する全暗号化配
列とから構成されている。 pKT218 (H8A/
17−5 ) (以下、pcH8人/17−3と呼ぶ)
の挿入物は。
R8人の3非暗号化末端からの約250個のヌクレオチ
ドと、H8AK対する暗号化配列の最初の約1600〜
1700ヌクレオチドとから構成されている(すなわち
、最初の約50〜65個のアミノ酸に対する暗号化配列
を欠如する)。
ドと、H8AK対する暗号化配列の最初の約1600〜
1700ヌクレオチドとから構成されている(すなわち
、最初の約50〜65個のアミノ酸に対する暗号化配列
を欠如する)。
したがって、2種の挿入物(i(8A/33−1および
88ム/17−3)の組合せは、非暗号化S末端の実質
的部分と、予備配列の少なくとも1部とを暗号化するD
NA配列ならびにヒトプロ血清アルブミンの全暗号化配
列を与える。
88ム/17−3)の組合せは、非暗号化S末端の実質
的部分と、予備配列の少なくとも1部とを暗号化するD
NA配列ならびにヒトプロ血清アルブミンの全暗号化配
列を与える。
118人155−1とklsム/17−3との組合せ物
を作成するため、各クローンを旦1−璽およびl復RI
Kよって制限化し、9KT218(ns人153−1)
のよ〕短かい8g1厘一旦凡■断片をI)KT218(
)isム/17−3)のよ〕長い月1ノー!狸BIwR
片へ結鍮させ九。この新九に作成され九pKT218(
MJ紬Y041(工耐表1【J、麗−エ二邑5とoal
)−88ム/17−5 (」−」璽−1四RI )(r
pc&18ム扉」)をも第2図に示す、その後のDNム
配列決定は、pKT218kl&A155−1 (工≧
色IL11−1!co R1) −3(8ム/17−5
(」1」−四RI)のこの作成が成熟R8ムを暗号化
するDNA配列から66ヌクレオチド1厘−Bgl I
I断片を除青させたことを示した。しかしながら、下記
に示すように、この削除は特定の削除を有する仁のよう
な作成物がこれらによシ形質転換され九宿主においてk
idA様ポリペプチドを生産することをさまたげない。
を作成するため、各クローンを旦1−璽およびl復RI
Kよって制限化し、9KT218(ns人153−1)
のよ〕短かい8g1厘一旦凡■断片をI)KT218(
)isム/17−3)のよ〕長い月1ノー!狸BIwR
片へ結鍮させ九。この新九に作成され九pKT218(
MJ紬Y041(工耐表1【J、麗−エ二邑5とoal
)−88ム/17−5 (」−」璽−1四RI )(r
pc&18ム扉」)をも第2図に示す、その後のDNム
配列決定は、pKT218kl&A155−1 (工≧
色IL11−1!co R1) −3(8ム/17−5
(」1」−四RI)のこの作成が成熟R8ムを暗号化
するDNA配列から66ヌクレオチド1厘−Bgl I
I断片を除青させたことを示した。しかしながら、下記
に示すように、この削除は特定の削除を有する仁のよう
な作成物がこれらによシ形質転換され九宿主においてk
idA様ポリペプチドを生産することをさまたげない。
ヒト血清アルブき7機ポリペプチドの表現上記の組@D
N人分子、すなわち: pK’r218(1−18ム/
15−1 )、pKT218(H8ム/17−3)およ
びPKT218(i(8ム153−1(星l −却RI
)−118ム/17−3(工!菖−1遠ルI)) を
使用して前記の形質転換法によシイーOコリ)IBlo
lを形質転換させ良。
N人分子、すなわち: pK’r218(1−18ム/
15−1 )、pKT218(H8ム/17−3)およ
びPKT218(i(8ム153−1(星l −却RI
)−118ム/17−3(工!菖−1遠ルI)) を
使用して前記の形質転換法によシイーOコリ)IBlo
lを形質転換させ良。
次いで、これら形質転換され喪生物の培養物を作成し、
ブルー五−ギルパート法を用いてヒト血清アルブンン様
ポリペプチドの表現K”)き試験した〔ニス・ブルーム
およびダブリュ・ギルバート、「特定翻訳生産物を検出
するための免疫学的スクリーニング方法」、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデ建−・サイエンス・U8A
、第7441112746〜49頁(1978))。
ブルー五−ギルパート法を用いてヒト血清アルブンン様
ポリペプチドの表現K”)き試験した〔ニス・ブルーム
およびダブリュ・ギルバート、「特定翻訳生産物を検出
するための免疫学的スクリーニング方法」、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデ建−・サイエンス・U8A
、第7441112746〜49頁(1978))。
抗d8AIgG(マイルス・ラバラドリース社から入手
)を1(8Ail和性カラムを使用して精製し、かつ標
準技術により x 121i Kよって標識した0次い
で、ポリビニル円錐にKH8AIgGを被覆し、そして
こ0固相をニス・ブルー^およびダブリュ・ギルバート
(上記)によ)実質的に記載されたように板上で溶菌さ
れた各細菌抽出物および放射能標識された抗1(8Aに
よ〕順次に処理した。次いで、ニス・プルームおよびf
プリュ・ギルバート(上記)によ〕記載されたように洗
浄を行なった。次いで、固相の放射能を監視し、免疫反
応を決定し良。
)を1(8Ail和性カラムを使用して精製し、かつ標
準技術により x 121i Kよって標識した0次い
で、ポリビニル円錐にKH8AIgGを被覆し、そして
こ0固相をニス・ブルー^およびダブリュ・ギルバート
(上記)によ)実質的に記載されたように板上で溶菌さ
れた各細菌抽出物および放射能標識された抗1(8Aに
よ〕順次に処理した。次いで、ニス・プルームおよびf
プリュ・ギルバート(上記)によ〕記載されたように洗
浄を行なった。次いで、固相の放射能を監視し、免疫反
応を決定し良。
仁の分析法において放射簡標織された抗体は、細−抽出
物からのHBlの免疫学的性質を示すポリペプチドが固
相の抗体に結合されている固体支持体上の位置にの重結
合するであろう。したがって、標識され九同相は、抽出
物におけるH8A様ポリペプチドの存在を示す・ 放射線免疫分析の結果を以下に示す: イー・コリ HBl 01(pKT218(H8A/1
7−3)) + イー−コリ HBl 01 (pKT21B(H8ム/
l速&I ) ) ) イー−コリ )IBlol(PKT218)
−(負の制御) 88人 +(正
の制御) の使用 本発明により作成されたH 8 A @a a D N
ムをりq−ン化するに線、広範なm−の宿主/り■−ン
化ベヒクル組合せを使用しうるむとt臘解すべきである
。たとえに、有用なりローン化ベヒクル扛染色体、非染
色体および合成ODNム配列の断片、たとえは各種の公
知のBV4!−00誘導体および公知の細1性プラスミ
ド、たとえはaolK/ 、 pCR/ 、 pBRJ
JJ 、 pMBF f含むイー−コリからのものおよ
びその誘導体、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえば
BP#およびファージDNA、たとえばファージλの多
くの誘導体(たとえldNMfl?)およびその他のD
Nムファージ(九とえばM/J)および繊維状単鎖DN
ム7アージおよびグフスミドとファージDNAとの組合
せから得られるベクタiまたとえば7アージDNムもし
くはその他の表決制御配列を使用するよう改変されたグ
ラス建ド、壕九は酵母プラミドド(たとえ#iλμグシ
スイド)ま九はその814体よ〕なることができる、有
用な徊主嬬たとえばイー・コリ(たとえ/dイー@sす
11m/47/、 イー11:29X/ 774.4−
@コリXλ−lλ、イー・コリMjiCI )の菌株、
およびシュウトモナス、枯単−、J6熱曹の菌株のよう
な#llI性徊主ならびにその他のイー拳コリ、−1゜
酵母およびその伽臭■−1動物もしくは植物宿主。
物からのHBlの免疫学的性質を示すポリペプチドが固
相の抗体に結合されている固体支持体上の位置にの重結
合するであろう。したがって、標識され九同相は、抽出
物におけるH8A様ポリペプチドの存在を示す・ 放射線免疫分析の結果を以下に示す: イー・コリ HBl 01(pKT218(H8A/1
7−3)) + イー−コリ HBl 01 (pKT21B(H8ム/
l速&I ) ) ) イー−コリ )IBlol(PKT218)
−(負の制御) 88人 +(正
の制御) の使用 本発明により作成されたH 8 A @a a D N
ムをりq−ン化するに線、広範なm−の宿主/り■−ン
化ベヒクル組合せを使用しうるむとt臘解すべきである
。たとえに、有用なりローン化ベヒクル扛染色体、非染
色体および合成ODNム配列の断片、たとえは各種の公
知のBV4!−00誘導体および公知の細1性プラスミ
ド、たとえはaolK/ 、 pCR/ 、 pBRJ
JJ 、 pMBF f含むイー−コリからのものおよ
びその誘導体、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえば
BP#およびファージDNA、たとえばファージλの多
くの誘導体(たとえldNMfl?)およびその他のD
Nムファージ(九とえばM/J)および繊維状単鎖DN
ム7アージおよびグフスミドとファージDNAとの組合
せから得られるベクタiまたとえば7アージDNムもし
くはその他の表決制御配列を使用するよう改変されたグ
ラス建ド、壕九は酵母プラミドド(たとえ#iλμグシ
スイド)ま九はその814体よ〕なることができる、有
用な徊主嬬たとえばイー・コリ(たとえ/dイー@sす
11m/47/、 イー11:29X/ 774.4−
@コリXλ−lλ、イー・コリMjiCI )の菌株、
およびシュウトモナス、枯単−、J6熱曹の菌株のよう
な#llI性徊主ならびにその他のイー拳コリ、−1゜
酵母およびその伽臭■−1動物もしくは植物宿主。
たとえば培IFKおける動物(ヒトを含む)もしくは植
物細胞を友はその他の宿主を包含する。勿論、全ての宿
主/ベクター組合せ物が同等に有効であるとは限らない
、宿主/クローン化ベヒクル組倉せの特定oB択は、本
arso@−から逸脱せずにζこに示し象原履、を考慮
した後、機業看によって行なうむとができる。たとえば
、逼娼な宿主の選択は、轟東界でla!織された多くの
7アクタによって管層される。これらの77クタは、た
とえd選択ベクターとO適音性、ヒラリドグラスイドに
より暗号化された蛋白質0壽性、所望蛋白質の回収の容
易さ、ベクターおよび宿主の表視物性、生物安全性カら
びにコストを包含する。これらファクターのバランスは
、必らずしも全ての宿主がqpi芝o組換DNム分子の
表椀につき同14’C有効ではないという板層に基づか
ねはならない。
物細胞を友はその他の宿主を包含する。勿論、全ての宿
主/ベクター組合せ物が同等に有効であるとは限らない
、宿主/クローン化ベヒクル組倉せの特定oB択は、本
arso@−から逸脱せずにζこに示し象原履、を考慮
した後、機業看によって行なうむとができる。たとえば
、逼娼な宿主の選択は、轟東界でla!織された多くの
7アクタによって管層される。これらの77クタは、た
とえd選択ベクターとO適音性、ヒラリドグラスイドに
より暗号化された蛋白質0壽性、所望蛋白質の回収の容
易さ、ベクターおよび宿主の表視物性、生物安全性カら
びにコストを包含する。これらファクターのバランスは
、必らずしも全ての宿主がqpi芝o組換DNム分子の
表椀につき同14’C有効ではないという板層に基づか
ねはならない。
さらに、それぞれの特定クローン化ベヒクルの範囲内で
、種々の部位を選択して1iaA胸連DNムの挿入を行
たりことかで自る。これらの部位性、一般にこれら部位
を切断する制限エンドヌクレアーゼにより命名される。
、種々の部位を選択して1iaA胸連DNムの挿入を行
たりことかで自る。これらの部位性、一般にこれら部位
を切断する制限エンドヌクレアーゼにより命名される。
たとえ#i。
pBRJJJにおいて力組1部位は、β−ラクタマーゼ
に対する遺伝子においてこの蛋白質のアさノ酸itiお
よび/Iコを暗号化するヌクレオチドトリプレットの間
に位置する。この部位tL白白血球インタフレーン免疫
学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドの合成に
おいてニス・ナガタ勢(上記)によって使用された。−
個の旦堕旦履エンドヌクレアーゼ識別部位の1つけアミ
ノ酸10/および10−を暗号化するトリブレットの間
に存在し、幾つかのシ1部位の/’)蝶pBRJJJに
おけるβ−ツクタ!−ゼの7建ノ1llljt暗号化す
るトリプレットに存在する@ l”l11に、PBRJ
−λにおけるIces RI部位およびPvsi l部
位は任意の暗号化領域の九個に存在し、たとえばj1B
1部位はそれぞれテトラサイクリンおよびアンピシリン
に対すゐ耐性を暗号化する遺伝子の関に存在する。これ
らOs位は、轟東看によp充分認識されている。勿論1
本発明において有用なタ霞−ン化ベヒクルは1選択DN
ム断片の挿入に対し制限エンドヌクレアー−vs位を有
する必簀がないことtm解すべきである。むしろ、ベヒ
クルは他の手段によって切断および断片に結合させるこ
とができる。
に対する遺伝子においてこの蛋白質のアさノ酸itiお
よび/Iコを暗号化するヌクレオチドトリプレットの間
に位置する。この部位tL白白血球インタフレーン免疫
学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドの合成に
おいてニス・ナガタ勢(上記)によって使用された。−
個の旦堕旦履エンドヌクレアーゼ識別部位の1つけアミ
ノ酸10/および10−を暗号化するトリブレットの間
に存在し、幾つかのシ1部位の/’)蝶pBRJJJに
おけるβ−ツクタ!−ゼの7建ノ1llljt暗号化す
るトリプレットに存在する@ l”l11に、PBRJ
−λにおけるIces RI部位およびPvsi l部
位は任意の暗号化領域の九個に存在し、たとえばj1B
1部位はそれぞれテトラサイクリンおよびアンピシリン
に対すゐ耐性を暗号化する遺伝子の関に存在する。これ
らOs位は、轟東看によp充分認識されている。勿論1
本発明において有用なタ霞−ン化ベヒクルは1選択DN
ム断片の挿入に対し制限エンドヌクレアー−vs位を有
する必簀がないことtm解すべきである。むしろ、ベヒ
クルは他の手段によって切断および断片に結合させるこ
とができる。
特定のベクター、すなわちクローン化ベヒクル。
および組換DNム分子を生成させる九めに選択DNA断
片を細金させるよう七〇に選択した部位も、当業界1’
cll織され九種々のファクタ、たとえば特定の制@#
掌に感受性の部位の個数。
片を細金させるよう七〇に選択した部位も、当業界1’
cll織され九種々のファクタ、たとえば特定の制@#
掌に感受性の部位の個数。
懺現すべ@*白白質0法法、宿主細胞靜嵩よる蛋白質加
水分解に対する所望蛋白質の感受性。
水分解に対する所望蛋白質の感受性。
積属の一除去するのが1鋤な細土細胞蛋白質による表現
すべ電量白質の汚染1表組特性、たとえはベクター配列
に対する開始コドンおよび停止コドンの位置、ならびに
当巣者によ*iig*され九七の伽のファクタによp決
定される。ベクターおよびこのベクターにおける特定遺
伝子の挿入部位Kllする選択性、これら7アクタのバ
ランスによシ決定され、必らずしも全てO選択が所定の
場合に同等に有効であるとは限らない。
すべ電量白質の汚染1表組特性、たとえはベクター配列
に対する開始コドンおよび停止コドンの位置、ならびに
当巣者によ*iig*され九七の伽のファクタによp決
定される。ベクターおよびこのベクターにおける特定遺
伝子の挿入部位Kllする選択性、これら7アクタのバ
ランスによシ決定され、必らずしも全てO選択が所定の
場合に同等に有効であるとは限らない。
外来DNAをりp−ン化ベヒクルすなわちベクター中に
挿入して組換DNム分子を生成させる幾つかの方法が当
業界で知られているが、本発明において好適な初期のク
ローン化方法をpKTJ/rにつき上記し良、勿論、D
NA配列をクレーン化ベヒクル中へ挿入して組換DNム
分子を生成させるその他公知の方法を本発明に同勢に使
用することができる。これらに紘、たとえばdムーdT
切断、直I!や結1合成りン力、エキソヌクレアーゼお
よびボリメ2−ゼ納金され次修復反応とそれに続く結紮
、またはDNムポリメラー−v*よび造画な単一鎖I!
朧によるDNA@e)W&長とそれに続<m素を包含す
る。
挿入して組換DNム分子を生成させる幾つかの方法が当
業界で知られているが、本発明において好適な初期のク
ローン化方法をpKTJ/rにつき上記し良、勿論、D
NA配列をクレーン化ベヒクル中へ挿入して組換DNム
分子を生成させるその他公知の方法を本発明に同勢に使
用することができる。これらに紘、たとえばdムーdT
切断、直I!や結1合成りン力、エキソヌクレアーゼお
よびボリメ2−ゼ納金され次修復反応とそれに続く結紮
、またはDNムポリメラー−v*よび造画な単一鎖I!
朧によるDNA@e)W&長とそれに続<m素を包含す
る。
DNAllIFr片の地図化およびヌクレオチド配列の
決定 H8ム橡ポリペプチドを展遺すゐために使用する他1本
尭明のDNA配列および組換DNム分子はM8ムのゲノ
ムの金てま九a/IIを含有する特定ヌクレオチド記動
の複製においても1用である。この方法で開脚され九1
IjiA DNムtII!用してゲノムの部分、%に
Haムの活性部分を暗号化するような部分のヌクレオチ
ド配列を決定すゐことがで龜る。これらの配列からポリ
ペプチド自身の構造を決定することができる。
決定 H8ム橡ポリペプチドを展遺すゐために使用する他1本
尭明のDNA配列および組換DNム分子はM8ムのゲノ
ムの金てま九a/IIを含有する特定ヌクレオチド記動
の複製においても1用である。この方法で開脚され九1
IjiA DNムtII!用してゲノムの部分、%に
Haムの活性部分を暗号化するような部分のヌクレオチ
ド配列を決定すゐことがで龜る。これらの配列からポリ
ペプチド自身の構造を決定することができる。
さらに、これら配列の知識は、本発明の組換DNム分子
において改変を行なって生産されるポリペプチドの収率
を向上させ、生産されるポリペプチドの活性を増大させ
、かつH8ムO誘導体を。製造する仁とを可能にする。
において改変を行なって生産されるポリペプチドの収率
を向上させ、生産されるポリペプチドの活性を増大させ
、かつH8ムO誘導体を。製造する仁とを可能にする。
組換DNA分子pKTJ/Jr(HaA/jJ−/(B
g−見 厘゛ −桓 RI)−Ha ム//7−J
(3色些二色 厘−jcaoRI)) は、非暗号化
3′配列の実質的部分ならびにいわゆるヒトプロ血清ア
ルプンンの完全暗号化配列(J4ヌクレオチドシ已膳−
14gklの削除Sを除く)および予備配列の少なくと
もlsを含有するので%弧長され九H8ムゲノムのヌク
レオチド配列を決定するのに使用することができる。
g−見 厘゛ −桓 RI)−Ha ム//7−J
(3色些二色 厘−jcaoRI)) は、非暗号化
3′配列の実質的部分ならびにいわゆるヒトプロ血清ア
ルプンンの完全暗号化配列(J4ヌクレオチドシ已膳−
14gklの削除Sを除く)および予備配列の少なくと
もlsを含有するので%弧長され九H8ムゲノムのヌク
レオチド配列を決定するのに使用することができる。
前記と同様にグラス建ドDNAt単一し、このDNAを
各糧の制@#素Cニューイングランド・ビオフ1社壕九
はBRL)を用いて周知方法によシ推奨緩at中で分解
させる仁とによシH8ム/JJ−/(1−邑β、1:鳳
−担RI)−H8ム//7−J(シリ璽−μ堕RI)配
列の物理的地図を作成した。分解生成物を7%アガロー
スゲルで電気泳動にかけ良。臭化エチジウムで染色する
ことによシ内限化させ良後、pBRJコ一の許細な物理
的地図と比較してこれらを分析し良〔レアー・ジー・サ
ットクリス[イー・コリプラス建ドpilRJ−一の完
全ヌクレオチド配列」。
各糧の制@#素Cニューイングランド・ビオフ1社壕九
はBRL)を用いて周知方法によシ推奨緩at中で分解
させる仁とによシH8ム/JJ−/(1−邑β、1:鳳
−担RI)−H8ム//7−J(シリ璽−μ堕RI)配
列の物理的地図を作成した。分解生成物を7%アガロー
スゲルで電気泳動にかけ良。臭化エチジウムで染色する
ことによシ内限化させ良後、pBRJコ一の許細な物理
的地図と比較してこれらを分析し良〔レアー・ジー・サ
ットクリス[イー・コリプラス建ドpilRJ−一の完
全ヌクレオチド配列」。
コールド・スプリング拳ハーバ−・シンホシクム、@4
1−J@、JI1号、jI77〜り0頁(/971)〕
。
1−J@、JI1号、jI77〜り0頁(/971)〕
。
これらの分屏パターンに基=)いて、H8ム配列の部分
子#@地図を作成した。この地図を第J−に示す0次い
で、エイ・エム・マキfAおよびダ1リエ・ギルバー)
rDNAOk!、判決定の九めの新規な方法」、プル
シーディング噂ナシ冒ナル・アカデミ−・サイエンス・
U−8ム、jI7#IIk、第74Q〜11参買(lり
77)により実質的に記載され九ように、DNム挿入物
の配列決定によ)前記地図を改棗した。第1図は、種々
の制限化断片(円はレベルを示し、矢印社配列の方向を
示す)およびpKTλ/r([8ム/JJ−)(シロ量
−桓R1)−318ム//7−J(町已璽−Δll0I
LI))のヌクレオチド配列の部分を決定するのに使用
した配列決定方法を示している。pKTJ/I(Haム
/JJ−/ (Bgl l−二≧!し9−凰1)−Ha
ム//7−J(上!」厘−!!ヱ81))の挿入のため
に得たヌクレオチドの配列の過切な部分t−第第一図示
す、この配列線、配列に対する改*、たとえは突然変異
、単一もしくは多重の塩基置換、削除%神人もしくは逆
転が既に起こっていないか、或いはその後七の我′mも
しくは活性を改変させる丸め使用しえないという可能性
もあ夛うる。さらに、ヌクレオチド配ターH8ム/JJ
−/ (Bgl 1−EaoRI )−H8ム//7−
J(町(l 1−JiCs++oRI )の残存する部
分も同様な技術により決定しうろことが了解されるべき
である。
子#@地図を作成した。この地図を第J−に示す0次い
で、エイ・エム・マキfAおよびダ1リエ・ギルバー)
rDNAOk!、判決定の九めの新規な方法」、プル
シーディング噂ナシ冒ナル・アカデミ−・サイエンス・
U−8ム、jI7#IIk、第74Q〜11参買(lり
77)により実質的に記載され九ように、DNム挿入物
の配列決定によ)前記地図を改棗した。第1図は、種々
の制限化断片(円はレベルを示し、矢印社配列の方向を
示す)およびpKTλ/r([8ム/JJ−)(シロ量
−桓R1)−318ム//7−J(町已璽−Δll0I
LI))のヌクレオチド配列の部分を決定するのに使用
した配列決定方法を示している。pKTJ/I(Haム
/JJ−/ (Bgl l−二≧!し9−凰1)−Ha
ム//7−J(上!」厘−!!ヱ81))の挿入のため
に得たヌクレオチドの配列の過切な部分t−第第一図示
す、この配列線、配列に対する改*、たとえは突然変異
、単一もしくは多重の塩基置換、削除%神人もしくは逆
転が既に起こっていないか、或いはその後七の我′mも
しくは活性を改変させる丸め使用しえないという可能性
もあ夛うる。さらに、ヌクレオチド配ターH8ム/JJ
−/ (Bgl 1−EaoRI )−H8ム//7−
J(町(l 1−JiCs++oRI )の残存する部
分も同様な技術により決定しうろことが了解されるべき
である。
決定され九H8ム/JJ−/(Bgl鳳−和RI)−H
aム//7−J(、すl【」:鳳−1ioo111)ヌ
クレオチド配列の種々の領域により暗号化されたポリペ
プチドを天然のH8ムにつき決定された210個のア々
ノ駿とを比較することによシ〔ビー・メロラン、上記〕
、この挿入智のDNム配列扛、疎水性のためヒト血清ア
ルブンンの推定予備配列におりる少なくと47部として
割当てた配列の71個のア建ノ験←第参図にア建ノ@−
7〜−−コとして示す)およびjPl伽の7建ノ酸を有
するポリペプチドの全アミノ酸配列を暗号化すると思わ
れる。天然H8ムの報告され良アイノ酸配ター〔メロラ
ン、上記〕に基づいて、このよシ大龜なIIi日質をヒ
トプロ血清アルツ電ンと命名し九〔これ鉱予備配列と天
然ヒト血清アルプiンにつき報告され九ア建)酸配列と
の間に4個のア々ノwit<wg参図に7ンノ験−7〜
−6として示す)を有する〕。
aム//7−J(、すl【」:鳳−1ioo111)ヌ
クレオチド配列の種々の領域により暗号化されたポリペ
プチドを天然のH8ムにつき決定された210個のア々
ノ駿とを比較することによシ〔ビー・メロラン、上記〕
、この挿入智のDNム配列扛、疎水性のためヒト血清ア
ルブンンの推定予備配列におりる少なくと47部として
割当てた配列の71個のア建ノ験←第参図にア建ノ@−
7〜−−コとして示す)およびjPl伽の7建ノ酸を有
するポリペプチドの全アミノ酸配列を暗号化すると思わ
れる。天然H8ムの報告され良アイノ酸配ター〔メロラ
ン、上記〕に基づいて、このよシ大龜なIIi日質をヒ
トプロ血清アルツ電ンと命名し九〔これ鉱予備配列と天
然ヒト血清アルプiンにつき報告され九ア建)酸配列と
の間に4個のア々ノwit<wg参図に7ンノ験−7〜
−6として示す)を有する〕。
さらに、決定されたヌクレオチド配列016分から解か
るように、118ム/13−/(l1g1.鳳−!叩R
I)、H8ム/ / 7−J (Bgl l・−α型8
りの暗号化配列はh P”翼J−−中へ挿入したべ二
シリナーゼ耐性を暗号化する遺伝子のllr号・化配列
と此験して、単一のヌクレオチドだけ相がずれている。
るように、118ム/13−/(l1g1.鳳−!叩R
I)、H8ム/ / 7−J (Bgl l・−α型8
りの暗号化配列はh P”翼J−−中へ挿入したべ二
シリナーゼ耐性を暗号化する遺伝子のllr号・化配列
と此験して、単一のヌクレオチドだけ相がずれている。
しかしながら、何らかの内部的開始の結果、pKTJ/
f Kお轄るヒプリド遺伝子(相がずれていても)によ
り形質転換された宿主線まだH8ム橡の生産物を生成す
る。
f Kお轄るヒプリド遺伝子(相がずれていても)によ
り形質転換された宿主線まだH8ム橡の生産物を生成す
る。
勿論、本発明によ〕単一されかっこζに記載され九ヒト
グー血清アルッ建ンのII号化配列を他の作成に使用し
て、暗号化配゛列がベニシリナーゼ遺伝子と相を一款さ
せたグラスミドをt14にすることかで*、或いはその
他のグラス電ドを111して本発明によるH8ム橡ポリ
ペプチドの収率および活性を向上させることもできる。
グー血清アルッ建ンのII号化配列を他の作成に使用し
て、暗号化配゛列がベニシリナーゼ遺伝子と相を一款さ
せたグラスミドをt14にすることかで*、或いはその
他のグラス電ドを111して本発明によるH8ム橡ポリ
ペプチドの収率および活性を向上させることもできる。
宿主における蛋白質生産のレベルはλつの生簀な7アク
タ、すなわち細胞内にお轄る遺伝子のコピー数およびこ
れら遺伝子コピーが転与および翻訳する効率によって支
配される。転写および翻訳(これらは−緒になって表現
を構成する)の効率は2通常、所望の暗号化配列の前方
に位置するヌクレオチド配列に依存する。これらのヌク
レオチド配列または表視制御配列は。
タ、すなわち細胞内にお轄る遺伝子のコピー数およびこ
れら遺伝子コピーが転与および翻訳する効率によって支
配される。転写および翻訳(これらは−緒になって表現
を構成する)の効率は2通常、所望の暗号化配列の前方
に位置するヌクレオチド配列に依存する。これらのヌク
レオチド配列または表視制御配列は。
籍にRNムボリメラーゼが転写を開始するよう反応する
位置(プロモータ配列)およびリボソームがmRNム(
転写の生産物)と結合して反応し、翻訳を開始する位置
を規定する。必らずしも全てのこの樵の表現制御配列が
同等な効率を持って機能するとは限らない。したがって
、所望の蛋白j[に対する特定O1#号化配列をそれら
のilI級するヌクレオチド配夕1jから分−して。
位置(プロモータ配列)およびリボソームがmRNム(
転写の生産物)と結合して反応し、翻訳を開始する位置
を規定する。必らずしも全てのこの樵の表現制御配列が
同等な効率を持って機能するとは限らない。したがって
、所望の蛋白j[に対する特定O1#号化配列をそれら
のilI級するヌクレオチド配夕1jから分−して。
これらをその代jlK伽の公知0**駒御配判に―合さ
せ、それによル一層高い表現レベルオ九は恐らく一層^
い11主細胞からの分泌および成熟レベルを連成するの
が有利である。これFi既に連成されているが、新九に
作成され喪DNA断片を多徴写グツスンドオ比はバクテ
リオファージ誘導体中に挿入して細胞内に遺伝子コピー
の個数を増大させ、かつそれによpさらに1IIll蛋
白質の収率を向上させゐことかで11ゐ。
せ、それによル一層高い表現レベルオ九は恐らく一層^
い11主細胞からの分泌および成熟レベルを連成するの
が有利である。これFi既に連成されているが、新九に
作成され喪DNA断片を多徴写グツスンドオ比はバクテ
リオファージ誘導体中に挿入して細胞内に遺伝子コピー
の個数を増大させ、かつそれによpさらに1IIll蛋
白質の収率を向上させゐことかで11ゐ。
幾つかO衆機制御配列を前記のように使用することがで
きる。これらはオペレータ、プ胃モータおよびイー・コ
リの乳糖オペロン(Fla。
きる。これらはオペレータ、プ胃モータおよびイー・コ
リの乳糖オペロン(Fla。
系」)のリポソーム紬舎性かつ反応性配列(九とえにシ
ャインーダルガルイ記動などの配列を包含する)、イー
・=りのトリブトファンシンセターゼ系の対応する配列
Crtrp皐」)、β−1I系、7アージλの土豪オペ
レータおよびプルモータ領域(0LPL kよび0aP
= ) 、 フィラメント状単−鎖DNムファージO制
御41領域、ま九は鳳細被もしく鉱成熟被細胞の遺伝子
の表現を制御するその他の配夕IJおよびそれらのウィ
ルスならびにこれら配列の穏々の組合せ、たとえば工Δ
旦系もしくは1旦9糸を包含する。し九がって、j1烏
な伽主において特定のポリペプチドの生産を向上させる
には、このポリペプチドを暗号化する遺伝子を前記のよ
うに選択し、かつこれを含有する組換DNム分子から除
去し。
ャインーダルガルイ記動などの配列を包含する)、イー
・=りのトリブトファンシンセターゼ系の対応する配列
Crtrp皐」)、β−1I系、7アージλの土豪オペ
レータおよびプルモータ領域(0LPL kよび0aP
= ) 、 フィラメント状単−鎖DNムファージO制
御41領域、ま九は鳳細被もしく鉱成熟被細胞の遺伝子
の表現を制御するその他の配夕IJおよびそれらのウィ
ルスならびにこれら配列の穏々の組合せ、たとえば工Δ
旦系もしくは1旦9糸を包含する。し九がって、j1烏
な伽主において特定のポリペプチドの生産を向上させる
には、このポリペプチドを暗号化する遺伝子を前記のよ
うに選択し、かつこれを含有する組換DNム分子から除
去し。
遺伝子を他のクローン化ベヒクルすなわちIi!!現ベ
クター中へよ63111!FK再押入し、或いは前省の
IRji11制御配列に対しよpj1切な関係で、或い
は上記の改嵐され九表現制御配列の7つを制御しながら
再挿入すゐことができる。この槍の方法は癲東界で公知
である。
クター中へよ63111!FK再押入し、或いは前省の
IRji11制御配列に対しよpj1切な関係で、或い
は上記の改嵐され九表現制御配列の7つを制御しながら
再挿入すゐことができる。この槍の方法は癲東界で公知
である。
申 こむで使用する「関係」という用飴は、多くのファ
クタ、良とえi組換DNA分子、および挿入DNム配列
の表徳向上および促進領域を分離する間隔、ベクター自
身における挿入DNA配列もしくはその他配列の転′4
および翻訳特性、ベクターの挿入DNム配夕Uおよびそ
0 *に、+ttの特定ヌクレオチド配列、およびベク
ターの貴楓向上および促進領域の特定の性質を包含する
。
クタ、良とえi組換DNA分子、および挿入DNム配列
の表徳向上および促進領域を分離する間隔、ベクター自
身における挿入DNA配列もしくはその他配列の転′4
および翻訳特性、ベクターの挿入DNム配夕Uおよびそ
0 *に、+ttの特定ヌクレオチド配列、およびベク
ターの貴楓向上および促進領域の特定の性質を包含する
。
この11の作成の前壜良は@、H8ム橡ポリペプチドを
論量化するDNム配タt+taLm核もしくは成熟核の
両者の各撫信号配列またはその組合せ物と混合して、H
imム橡ポリペプチドを宿主細胞から分泌させると共に
、t&壇しくに分泌の際信号配列を#a訣させることが
できる。この種の方法は、たとえばと2−コマロア勢(
上記)およびタルマッシ等(上記)に記載されている。
論量化するDNム配タt+taLm核もしくは成熟核の
両者の各撫信号配列またはその組合せ物と混合して、H
imム橡ポリペプチドを宿主細胞から分泌させると共に
、t&壇しくに分泌の際信号配列を#a訣させることが
できる。この種の方法は、たとえばと2−コマロア勢(
上記)およびタルマッシ等(上記)に記載されている。
所望生置物の細胞収率におけゐ増大は、さらに#I胞中
に利用しうる遺伝子の個数における増加に依存する0例
示の目的であるか、これは前記のように作M1.され九
組換DNム分子をaimバクテリオファージλ(NMf
tり)中へ押入することによ〕、%に簡単にはグラス電
ドを制@酵素で分解させて一状分子を生成させ1次−で
これを1llj iiファージλクローン化ベヒクル〔
喪トえばエヌ・イー・ムレー勢、[試験管中で組換体の
1収を簡単化するλファージJ、Mol・6゜g@口、
Gem・も0、第izo巻、第13〜41貢(/り7
7)およびエヌ・イー・ムレー勢、rバクテリオファー
ジT4IからODNムリガーゼ遺伝子の分子クローン化
J 、 JlMol、 Bjol 、第1JJ@、籐参
り3〜101買(/P7F)に記載され九種拳のもの〕
と混合し、この組換DNム分子をDNムリガーゼとの培
11によシ再積化させることによプ達成することができ
る。次いで。
に利用しうる遺伝子の個数における増加に依存する0例
示の目的であるか、これは前記のように作M1.され九
組換DNム分子をaimバクテリオファージλ(NMf
tり)中へ押入することによ〕、%に簡単にはグラス電
ドを制@酵素で分解させて一状分子を生成させ1次−で
これを1llj iiファージλクローン化ベヒクル〔
喪トえばエヌ・イー・ムレー勢、[試験管中で組換体の
1収を簡単化するλファージJ、Mol・6゜g@口、
Gem・も0、第izo巻、第13〜41貢(/り7
7)およびエヌ・イー・ムレー勢、rバクテリオファー
ジT4IからODNムリガーゼ遺伝子の分子クローン化
J 、 JlMol、 Bjol 、第1JJ@、籐参
り3〜101買(/P7F)に記載され九種拳のもの〕
と混合し、この組換DNム分子をDNムリガーゼとの培
11によシ再積化させることによプ達成することができ
る。次いで。
所望の組換体7アージを前記の様に選択し、これを使用
してイー・;りの宿主菌株を溶菌させゐことができる。
してイー・;りの宿主菌株を溶菌させゐことができる。
特に有用なλクローン化ベヒクルはレプレツを遺伝子(
IIKおける感温性突然変異と遺伝予見におけ石抑圧性
突然変異とを含み、その生産物は宿主細胞の溶菌にとっ
て必蚤であシ、さらに遺伝子!における抑圧性突然変異
を含みその生産物はウィルスの主要なカシシト蛋白質で
ある。この系を用いて**性細胞を32℃で増殖させ1
次いで$j’Cオで加熱してプロ7アージの切断を誘発
させ為、77℃における長時間の増殖は、St胞内に保
持される蛋白質の高レベルの主意をもたらす、何故なら
、これらは通常の方法ではファージ量伝子生腫物によp
11曹されないからである。ま九、77−ジ遺伝子神入
物はカブ七ル化されないので後の転写に利用され続ける
0次いでSat亀の人工的漫画は所望の生産物を高収率
で遊離する。
IIKおける感温性突然変異と遺伝予見におけ石抑圧性
突然変異とを含み、その生産物は宿主細胞の溶菌にとっ
て必蚤であシ、さらに遺伝子!における抑圧性突然変異
を含みその生産物はウィルスの主要なカシシト蛋白質で
ある。この系を用いて**性細胞を32℃で増殖させ1
次いで$j’Cオで加熱してプロ7アージの切断を誘発
させ為、77℃における長時間の増殖は、St胞内に保
持される蛋白質の高レベルの主意をもたらす、何故なら
、これらは通常の方法ではファージ量伝子生腫物によp
11曹されないからである。ま九、77−ジ遺伝子神入
物はカブ七ル化されないので後の転写に利用され続ける
0次いでSat亀の人工的漫画は所望の生産物を高収率
で遊離する。
その他の例として5本li―の118ム様ポリベグチド
を暗号化する遺伝子の暗号化配列は、エッチ・キュツバ
−等、「7ツト・アンド−マウス病つィルスO主II抗
原の魯DNムのクローン化およびイー・コリにおける表
現」、ネイチャ誌、第一16.籐1!1〜!!り頁(i
yt/)にFMDVの抗原性を示すポリペプチドを暗号
化する遺伝子につき実質的に記載されえように。
を暗号化する遺伝子の暗号化配列は、エッチ・キュツバ
−等、「7ツト・アンド−マウス病つィルスO主II抗
原の魯DNムのクローン化およびイー・コリにおける表
現」、ネイチャ誌、第一16.籐1!1〜!!り頁(i
yt/)にFMDVの抗原性を示すポリペプチドを暗号
化する遺伝子につき実質的に記載されえように。
PL劃側下で衆構ベクター中に挿入することができる。
さらに、゛本発明によp作成され九118ム橡ポリペグ
チドの収率は、現在ODNム配列のコドンの幾つかまた
Fi全てを異なるコドンで置換することにより教養しう
ろことが了解堪れよう。
チドの収率は、現在ODNム配列のコドンの幾つかまた
Fi全てを異なるコドンで置換することにより教養しう
ろことが了解堪れよう。
これらの置換コドンは、交換されたコドンによpW#号
化されるものと同様または同一のアンノ識を暗号化する
であろうが、より好tt、、<UH8ム生童生産し選択
され九特定Ovs主においてI!現されるであろう。
化されるものと同様または同一のアンノ識を暗号化する
であろうが、より好tt、、<UH8ム生童生産し選択
され九特定Ovs主においてI!現されるであろう。
最螢に1本発明の組換DNム分子によp生産されるポリ
ペプチドの活性は1本発明の範at逸脱することなく周
知手段により1本発明のDNム配列もしくはポリペプチ
ドを断片化し、改変し、tたは誘導体化させることによ
り改豐することができる。
ペプチドの活性は1本発明の範at逸脱することなく周
知手段により1本発明のDNム配列もしくはポリペプチ
ドを断片化し、改変し、tたは誘導体化させることによ
り改豐することができる。
本発明によりDNム配列を単一し、かつこれを表現制御
配列に結合する1つの例として上記のベクターからH8
ム/JJ−/(11鳳−:μ孔(+(IRI)−Haム
//7−J(!fi4厘−4遼RI)を単一し。
配列に結合する1つの例として上記のベクターからH8
ム/JJ−/(11鳳−:μ孔(+(IRI)−Haム
//7−J(!fi4厘−4遼RI)を単一し。
これを他の表現ベクターにおけるTACグロプロタの下
流に結合させえ。
流に結合させえ。
この作成を行なうため、前記のように単一されたpKT
コ/f(118ム/JJ−/(、!L!思−狗oBI)
−11g1ム//7−J(軽量−μso RI ))を
篇!図に示したようfCIC5o RIおよびHind
鳳によって制限化しえ0次いで、触8!末端にH8ム暗
号化配り樋を有するα阻RI−H4nd鳳断片をTAC
表1A−一配列を有するpKIc//弘−// <:
Lルゲン・10シウスによp、、嵜m−art。
コ/f(118ム/JJ−/(、!L!思−狗oBI)
−11g1ム//7−J(軽量−μso RI ))を
篇!図に示したようfCIC5o RIおよびHind
鳳によって制限化しえ0次いで、触8!末端にH8ム暗
号化配り樋を有するα阻RI−H4nd鳳断片をTAC
表1A−一配列を有するpKIc//弘−// <:
Lルゲン・10シウスによp、、嵜m−art。
たもの)から(DIS@凰l−11iadl 断片と
混食し九。得られた断片(これは2つの現μI末端を有
f b ) を次イテp KK/ 0−J (p B
BJJJのss体であり、エルゲンのプルシラスの寄贈
にかかる)のH1md■断片と組合せることによ!01
14m!化させ友。この組換DNム分子を pxtコ/
1−TAC(jiiiム/J J −/ (Bgl ト
E<υRI)−H8ム//7−J(シ已ト4ぴR1))
また拡poH8ム/J と命名し良。 この組換DNム
分子でイー・コリ HIA10/を形゛賀転換させると
、20〜30倍74いH8ム様ポリペグチト0の生産が
観察された。pKTコ/r−TAC(H8ム/33−7
(1年り匹−1鳳−魚RI )−[8ム/lクーJ(!
l! I−α阻jiI))で形質転換された宿主におい
て生態されるH8ム様ポリペプチドの位置を決定する九
め、硫黄を含有しない培地〔アール・ビー・pパーツ等
、[イー・コリにおける生金或の研究]、キルビー・リ
トグラフインク・カンパニー1イ゛ンコーボレイテツド
* 1iu員(/fJ7))10−において、イー嗜フ
リHBtoicpKTコ/f−TAC(1181/1l
−1(!L!思−初RI)−H8ム//7−J()竺g
ll−KooRI)))()培養物2dfOD=0.2
1で培養した0次いで、この培養物をjiuのIPTG
で11発させ、そして培養をoDQo、zまで続は九。
混食し九。得られた断片(これは2つの現μI末端を有
f b ) を次イテp KK/ 0−J (p B
BJJJのss体であり、エルゲンのプルシラスの寄贈
にかかる)のH1md■断片と組合せることによ!01
14m!化させ友。この組換DNム分子を pxtコ/
1−TAC(jiiiム/J J −/ (Bgl ト
E<υRI)−H8ム//7−J(シ已ト4ぴR1))
また拡poH8ム/J と命名し良。 この組換DNム
分子でイー・コリ HIA10/を形゛賀転換させると
、20〜30倍74いH8ム様ポリペグチト0の生産が
観察された。pKTコ/r−TAC(H8ム/33−7
(1年り匹−1鳳−魚RI )−[8ム/lクーJ(!
l! I−α阻jiI))で形質転換された宿主におい
て生態されるH8ム様ポリペプチドの位置を決定する九
め、硫黄を含有しない培地〔アール・ビー・pパーツ等
、[イー・コリにおける生金或の研究]、キルビー・リ
トグラフインク・カンパニー1イ゛ンコーボレイテツド
* 1iu員(/fJ7))10−において、イー嗜フ
リHBtoicpKTコ/f−TAC(1181/1l
−1(!L!思−初RI)−H8ム//7−J()竺g
ll−KooRI)))()培養物2dfOD=0.2
1で培養した0次いで、この培養物をjiuのIPTG
で11発させ、そして培養をoDQo、zまで続は九。
次いで、培養物を8−Hl5o4で@11!シ(jff
l@、% 30分間、77℃)、−tしてIE心分離し
た(7分間、lコ000 rpm ) 、ベレットをト
リス−klcl(lit)、21%J1−1Jjμlリ
ゾチーム(10N/WLI)および水中にlj分間再懸
濁し、そして豊び違心分−しく7分間、/2000 r
pm ) 、上澄a(形質転*細胞の外負量自7ラクシ
lンを含有する)を除去シ良、ベレット(スヘログラス
ト)をλコIμノのトリス−11cj(pHj)中に再
懸濁させ、JJIIiil−とtazszのトリトン−
湊曹混會物〔o、ijモルのトリス−HCj、(PHf
)、002モル0EDTA、コチのトリトンxioo〕
を加えた。混合物を水中でlI分間靜装し1次いで遠心
分離(1分間、/2000 rpa+、 4”C) し
て。
l@、% 30分間、77℃)、−tしてIE心分離し
た(7分間、lコ000 rpm ) 、ベレットをト
リス−klcl(lit)、21%J1−1Jjμlリ
ゾチーム(10N/WLI)および水中にlj分間再懸
濁し、そして豊び違心分−しく7分間、/2000 r
pm ) 、上澄a(形質転*細胞の外負量自7ラクシ
lンを含有する)を除去シ良、ベレット(スヘログラス
ト)をλコIμノのトリス−11cj(pHj)中に再
懸濁させ、JJIIiil−とtazszのトリトン−
湊曹混會物〔o、ijモルのトリス−HCj、(PHf
)、002モル0EDTA、コチのトリトンxioo〕
を加えた。混合物を水中でlI分間靜装し1次いで遠心
分離(1分間、/2000 rpa+、 4”C) し
て。
細胞残骸を除去した(上澄液は形質転換宿主細胞の細胞
内jl自7ラクシ冒ンを含有する)。
内jl自7ラクシ冒ンを含有する)。
次いで、外質フラクシ曹ンを含有する上澄液および細胞
内フラクシ曹ンを含有する上置値をH8ム橡ポリペプチ
ドの存在につ亀分析した。
内フラクシ曹ンを含有する上置値をH8ム橡ポリペプチ
ドの存在につ亀分析した。
1ooo倍過−O抗H8ムを両フラクシ1ンに加え、こ
れらを37℃にて1時間静置し良。次いで、3oosl
のセファロース蛋白A (J 0119/IIIJ)を
加え、この混合物を室温にて1時間静置し、そして遣る
分離した(1分間、lコ000f p醜) 、 ペレッ
トを/−のNICT−Nl叡11iQ〔0,41モルの
NaCl 、 j iリモルのEDTA%joミリモル
のトリス−HCj(p)17.j)、l−のトリトンX
100〕中に再懸濁させ、遠心分離しく1分間、lコ0
00 rpm ) 、rrIJじsna中KNjl濁し
、遠心分離しく1分間、lコoo。
れらを37℃にて1時間静置し良。次いで、3oosl
のセファロース蛋白A (J 0119/IIIJ)を
加え、この混合物を室温にて1時間静置し、そして遣る
分離した(1分間、lコ000f p醜) 、 ペレッ
トを/−のNICT−Nl叡11iQ〔0,41モルの
NaCl 、 j iリモルのEDTA%joミリモル
のトリス−HCj(p)17.j)、l−のトリトンX
100〕中に再懸濁させ、遠心分離しく1分間、lコ0
00 rpm ) 、rrIJじsna中KNjl濁し
、遠心分離しく1分間、lコoo。
rP−)mそして同じii*淑中に再懸濁させたが。
九だしこの場合lll鈎液は0.41モルのNm CI
でなく0,11モルのNaC4とした。再懸濁および遠
心外−のむの過程を一回反復し1次いで最終ペレットを
JOμノのラメレ&衡箪中に烏濁させ良、ゲルを分析す
ると、外質クラクションにおける形質転換宿主で生産さ
れたH8ム橡ボリペグチドの約10%の存在と、#1l
IlJIIl内7ラクシlンにおけるkXSA様ポリベ
グチドの約10%の存在とが示された。
でなく0,11モルのNaC4とした。再懸濁および遠
心外−のむの過程を一回反復し1次いで最終ペレットを
JOμノのラメレ&衡箪中に烏濁させ良、ゲルを分析す
ると、外質クラクションにおける形質転換宿主で生産さ
れたH8ム橡ボリペグチドの約10%の存在と、#1l
IlJIIl内7ラクシlンにおけるkXSA様ポリベ
グチドの約10%の存在とが示された。
この宿主で生産されたH8ム様ポリペプチドは、天然の
HSムより4小淑であると思われ九。
HSムより4小淑であると思われ九。
このようにIl察され良家るfIIA度の寸法の差社。
INSム暗号化配列における34個のヌクレオチドの喪
失によって説明することができる。しかしながら、この
寸法の差d、34個のヌクレオチドO喪失にlaS号化
される/J伽のアミノ酸で説明しうるものよりも大であ
る。したがって、さらに寸法の葺#′i、内sga細か
らの蛋白質の生型、蛋白質の分解を良は不正確な地層に
よって説−することができる。いずれにせよ、ポリペプ
チドは、天然R8ムと一歇する免疫学的frl性を示し
た。
失によって説明することができる。しかしながら、この
寸法の差d、34個のヌクレオチドO喪失にlaS号化
される/J伽のアミノ酸で説明しうるものよりも大であ
る。したがって、さらに寸法の葺#′i、内sga細か
らの蛋白質の生型、蛋白質の分解を良は不正確な地層に
よって説−することができる。いずれにせよ、ポリペプ
チドは、天然R8ムと一歇する免疫学的frl性を示し
た。
さらに上記の構造は単一ヌクレオチドによシペニシリナ
ーゼを暗号化する遺伝子とは相がずれ7(H1iム暗号
化配列を有するので、これを使用してペニシリナーゼを
暗号化する遺伝子とH8ム関連DNAllFr片との間
に正確な読枠を有する構造物を調製し良。菖6図に示す
ように、この構造物を見り−E鳳によって制限化し、こ
の断片の重複末端にクレノー断片な諷め九。次いで、D
Nムをさらに旦すR1で制限化し、そしてよシ大きなシ
till−μ勘RI断片を単離し友、この断片を予めE
eoRlおよびシ土lによって制限化され、かつ漁めら
れた(クレノー断片、dcTPの+)プラスミドpTK
JJF(ケ一・タルマツチ勢、上記)とから単一された
断片と組合せ九。得られた作成物は、ペニシリナーゼを
暗号化する遺伝子の部分とH8A@連晰号化配列との間
に1個のヌクレオチドが少ないものであった。このヒブ
リド分子をp@H8A/Jと命名した。こ(DFII:
、Rヒブリド遺伝子により形質転換されたイーIコリ1
1m1otによって生産され7’j−H8A様ポリペグ
チドO分析は、pKTコ/#−TAC(H8ム/ J
J −/ (シ已思−桓RI)−H8ム//7−J (
Bgl 1−EeoRl ) )で形質転換された宿主
におけると#1は同量のル8ム様ポリベグチドが細胞/
l11mりに生産され九ことを示した。表現のレベルは
約ダ、1x10 分子/細胞である。さらに、この生
iiwは天然R8ムとほば同じ8D8/アクリルアiド
ゲル上の寸法を有した。この仁とは予想外である。何故
なら、この生産物は上記の36個のヌクレオチドが削除
されたDNム配列から誘導されたからである。
ーゼを暗号化する遺伝子とは相がずれ7(H1iム暗号
化配列を有するので、これを使用してペニシリナーゼを
暗号化する遺伝子とH8ム関連DNAllFr片との間
に正確な読枠を有する構造物を調製し良。菖6図に示す
ように、この構造物を見り−E鳳によって制限化し、こ
の断片の重複末端にクレノー断片な諷め九。次いで、D
Nムをさらに旦すR1で制限化し、そしてよシ大きなシ
till−μ勘RI断片を単離し友、この断片を予めE
eoRlおよびシ土lによって制限化され、かつ漁めら
れた(クレノー断片、dcTPの+)プラスミドpTK
JJF(ケ一・タルマツチ勢、上記)とから単一された
断片と組合せ九。得られた作成物は、ペニシリナーゼを
暗号化する遺伝子の部分とH8A@連晰号化配列との間
に1個のヌクレオチドが少ないものであった。このヒブ
リド分子をp@H8A/Jと命名した。こ(DFII:
、Rヒブリド遺伝子により形質転換されたイーIコリ1
1m1otによって生産され7’j−H8A様ポリペグ
チドO分析は、pKTコ/#−TAC(H8ム/ J
J −/ (シ已思−桓RI)−H8ム//7−J (
Bgl 1−EeoRl ) )で形質転換された宿主
におけると#1は同量のル8ム様ポリベグチドが細胞/
l11mりに生産され九ことを示した。表現のレベルは
約ダ、1x10 分子/細胞である。さらに、この生
iiwは天然R8ムとほば同じ8D8/アクリルアiド
ゲル上の寸法を有した。この仁とは予想外である。何故
なら、この生産物は上記の36個のヌクレオチドが削除
されたDNム配列から誘導されたからである。
さらにHaA様ポリペグチドを暗号化するDNAk、判
を特徴とする他の懺楓畢を調製し九。
を特徴とする他の懺楓畢を調製し九。
これらの作成は、J41/A(DヌクレオチドBgl鳳
−シリ鳳の一除を伴なわずに、■8ム様ポリペプチドt
e号化するDNム配列を生魚すぺ(設計しえ、さらに、
*ia制御配列と傷号配り植との各種の組合せをH区
ムwII号化配列の前に使用するよう設計し九。
−シリ鳳の一除を伴なわずに、■8ム様ポリペプチドt
e号化するDNム配列を生魚すぺ(設計しえ、さらに、
*ia制御配列と傷号配り植との各種の組合せをH区
ムwII号化配列の前に使用するよう設計し九。
第7eAにつ自説明すれば、こζに祉Xbal/iso
RIでの分解および再結集によるpKTJ/r(Ha
ム/J J −/ )とpKTJ/f(118ム//7
−3)とからのp@HlムJOの作成が図示されている
。この過$Fi、18ム暗号化配列のBgllの1II
J@によってもたらされる。74備のヌクレオチドの削
除を回避している。この場合。
RIでの分解および再結集によるpKTJ/r(Ha
ム/J J −/ )とpKTJ/f(118ム//7
−3)とからのp@HlムJOの作成が図示されている
。この過$Fi、18ム暗号化配列のBgllの1II
J@によってもたらされる。74備のヌクレオチドの削
除を回避している。この場合。
P@HaムJ0を使用してp @HBムJ/およびP・
H8ムJJを生産させえ、これらの組換DNム分子はp
GFYコit<エルゲン・プ四シウスの寄贈にがかる)
から靜導され九TACII塊制御配列を有する。イー・
プリW!l10IQをpcH8AJJKよって形質転換
させた。イー・=す’ilJ/10IQは、TAC懺楓
制御配列(たとえIf P@ 1iaAJ−2C)HB
k暗号4F、に、lU ) Olu制御下にDNム配
列の表楓をIPTGによる誘発tで抑制するL遺伝子に
失熱Icaを有する1株である。IPTGによシI11
発させると、形質転換され九−株は約1000分子/#
1胞の118ム橡ボリベグチドを生産した。このポリペ
1チドは天然H8ムとほは同じ寸法(808/アクリル
ア建トグル)を有し九。
H8ムJJを生産させえ、これらの組換DNム分子はp
GFYコit<エルゲン・プ四シウスの寄贈にがかる)
から靜導され九TACII塊制御配列を有する。イー・
プリW!l10IQをpcH8AJJKよって形質転換
させた。イー・=す’ilJ/10IQは、TAC懺楓
制御配列(たとえIf P@ 1iaAJ−2C)HB
k暗号4F、に、lU ) Olu制御下にDNム配
列の表楓をIPTGによる誘発tで抑制するL遺伝子に
失熱Icaを有する1株である。IPTGによシI11
発させると、形質転換され九−株は約1000分子/#
1胞の118ム橡ボリベグチドを生産した。このポリペ
1チドは天然H8ムとほは同じ寸法(808/アクリル
ア建トグル)を有し九。
さらに、poH8ムJ/とp@H8AJJとt使用して
組換DNム分子(p@1i18ムJ4)を作成し、この
場合H8ム暗号化配列はTRC表鴇制御配列の制御下に
おいえ、Tic配列(エルゲン・プ四シウムのを贈にか
かる)紘、前記TiC系の誘導体である。P(lH8ム
J4の作成につき第1図に示す。
組換DNム分子(p@1i18ムJ4)を作成し、この
場合H8ム暗号化配列はTRC表鴇制御配列の制御下に
おいえ、Tic配列(エルゲン・プ四シウムのを贈にか
かる)紘、前記TiC系の誘導体である。P(lH8ム
J4の作成につき第1図に示す。
P @ HB A J≦を使用してイー・コリWJ/1
oIQを形質転換さぜた。前記のように誘発させ友後。
oIQを形質転換さぜた。前記のように誘発させ友後。
形質転換され九菌株は天然)18ムとほぼ同じ寸法(8
D8/アクリルアiドゲル)の蛋白j[を多量に生産し
良。さらに、この蛋白質は抗体沈澱の後に主として目に
見える単一バンドとして軟われる。したがって、仁の作
成物すなわち本発明の最も好適な作成物は多量のH8ム
橡ボリベグチドを生産すると信じられる。しかしながら
、形質転換され良智主は誘発IL俵に死滅する。
D8/アクリルアiドゲル)の蛋白j[を多量に生産し
良。さらに、この蛋白質は抗体沈澱の後に主として目に
見える単一バンドとして軟われる。したがって、仁の作
成物すなわち本発明の最も好適な作成物は多量のH8ム
橡ボリベグチドを生産すると信じられる。しかしながら
、形質転換され良智主は誘発IL俵に死滅する。
これは、横主によ夕生成畜れた多量のH8A橡ポリペグ
チドO毒性作用による−のと償しられる。他の1株およ
びその増矯もしくはlI発条件社、p@118ムJ4に
より形質転換された1株の雑持および所il修童物の多
量の生産を可能にする。
チドO毒性作用による−のと償しられる。他の1株およ
びその増矯もしくはlI発条件社、p@118ムJ4に
より形質転換された1株の雑持および所il修童物の多
量の生産を可能にする。
微生物、DNム記動およびζこに記載した方法によp作
成される組換DNム分子は、lりti$iコ月l#日付
でメリー2ンド州、ロックビル在のアメリカン・タイプ
・カルチャ・=レクシ冒ンの墳養物コレクシ曹ンに寄託
し九培養物によシ例示され、H8ムームとして同定され
かつムTCC受ト書号JりOJj号が付与された。
成される組換DNム分子は、lりti$iコ月l#日付
でメリー2ンド州、ロックビル在のアメリカン・タイプ
・カルチャ・=レクシ冒ンの墳養物コレクシ曹ンに寄託
し九培養物によシ例示され、H8ムームとして同定され
かつムTCC受ト書号JりOJj号が付与された。
ム寞イーψコリHII10/(pKTJ/I(Haム/
JJ−/(シ已ト1駐RI)−H8ム//7−J(!L
!l−Et四R1) ) ) 本発明のその他の徽生物、DNム配列および組換DNム
分子は、1112年11月 6 日付轄でメリーランド
州、ロックビル在のアメリカン−タイプ噛カルチャ11
コレクシ田ンO培襲物=レクVNンに寄託され、H8ム
ーBとして一定されかつムTCC受託番号−0917号
が付与された。
JJ−/(シ已ト1駐RI)−H8ム//7−J(!L
!l−Et四R1) ) ) 本発明のその他の徽生物、DNム配列および組換DNム
分子は、1112年11月 6 日付轄でメリーランド
州、ロックビル在のアメリカン−タイプ噛カルチャ11
コレクシ田ンO培襲物=レクVNンに寄託され、H8ム
ーBとして一定されかつムTCC受託番号−0917号
が付与された。
BSイー拳コリWJ/10Iq(pa1mム74)以上
1本発明の多くの具体例につ龜配叡したが1本発明の基
本的構成を変化させて1本発明の方法および組成物を利
用する他の具体例を提供しうることが明らかである。し
たがって本発明の範囲は実施例として上記し次特定具体
例のみに限定されないことが了解されよう。
1本発明の多くの具体例につ龜配叡したが1本発明の基
本的構成を変化させて1本発明の方法および組成物を利
用する他の具体例を提供しうることが明らかである。し
たがって本発明の範囲は実施例として上記し次特定具体
例のみに限定されないことが了解されよう。
第1図は本発明のヒト血清アルプ建ン様ポリベグチドの
製造方法の一具体例を示す略a明図でTon。 m2図は重置−のJIIのDNム配列および組換DNム
分子s pKTコ/1(kIBム/JJ−/)。 pKT2/I(Haム//7−1)またはpKTコ/1
(aSム/JJ−/(!!l!鳳−4鳳凰4)−mix
ム// 7−J (ジ已履−!駐卑I))O藝分制限地
園であって、最初0J)4り配列を組合せて纂JOもの
Vt製造することを示し。 @J@ハD NA配qli#A/77−/ (Bgl
l−!!!凰1)−菖8ム//7−J(、!Igl鳳−
NaoRI)の部分−@SSおよびそのヌクレオチド配
列の部分を決定する九め使用する方法を示す園であjI
(示し九距離は概略であって、ヌクレオチドの配列決定
によeiiiiiする仁とができる)。 第参図は118h/77−/ (I1gl鳳−!ρμ―
oRI)−118ム//7−J(!L!鳳−1≦ト19
凰■)のヌクレオチド配列の部分およびこれら部分の暗
号化領域の7tノ駿配列を示す園であ〕。 纂154社本弛明O他O組換DNム分子の製造方法を示
す略図であり、 11/44図は本発明O他O組換DNム分子の製造方法
を示す11図であり。 第7図は本発明の他の組換DNム分子の製造方法を示す
略図であり。 @I脂は本発明のさらに他の組換DNム分子の製造方法
を示す略図である。 図面の浄書(内容に変更なしλ セト物先のべcoNA4$6鞠 F/、θ、1 Flo、2 pcr l/I(WSA//7−J) 1
第1頁の続き ■Int、 C1,3識別記号 庁内整理番−C1
2P 21100 7235−4
88 B 8 8 B 8 B 4B 4B 4B 号 0発 明 者 バーバラ・ウオルナー・フィリップ アメリカ合衆国マサチューセラ ツ州02161ニュートン・ロック レッジ・ロード32番 手続補正書(方力 昭和58年4月(3L1 特許庁長官 若 杉 和犬 殿 1、事件の表示 @057年特許願第 21’+918 号2、発明の名
称 D N A配列、組換DNA分子およびヒト血清アルブ
ミン様ポリペプチドの製造方法 :3.績+Eをする者 事件との関係 特許出願人 4、代 理 人
製造方法の一具体例を示す略a明図でTon。 m2図は重置−のJIIのDNム配列および組換DNム
分子s pKTコ/1(kIBム/JJ−/)。 pKT2/I(Haム//7−1)またはpKTコ/1
(aSム/JJ−/(!!l!鳳−4鳳凰4)−mix
ム// 7−J (ジ已履−!駐卑I))O藝分制限地
園であって、最初0J)4り配列を組合せて纂JOもの
Vt製造することを示し。 @J@ハD NA配qli#A/77−/ (Bgl
l−!!!凰1)−菖8ム//7−J(、!Igl鳳−
NaoRI)の部分−@SSおよびそのヌクレオチド配
列の部分を決定する九め使用する方法を示す園であjI
(示し九距離は概略であって、ヌクレオチドの配列決定
によeiiiiiする仁とができる)。 第参図は118h/77−/ (I1gl鳳−!ρμ―
oRI)−118ム//7−J(!L!鳳−1≦ト19
凰■)のヌクレオチド配列の部分およびこれら部分の暗
号化領域の7tノ駿配列を示す園であ〕。 纂154社本弛明O他O組換DNム分子の製造方法を示
す略図であり、 11/44図は本発明O他O組換DNム分子の製造方法
を示す11図であり。 第7図は本発明の他の組換DNム分子の製造方法を示す
略図であり。 @I脂は本発明のさらに他の組換DNム分子の製造方法
を示す略図である。 図面の浄書(内容に変更なしλ セト物先のべcoNA4$6鞠 F/、θ、1 Flo、2 pcr l/I(WSA//7−J) 1
第1頁の続き ■Int、 C1,3識別記号 庁内整理番−C1
2P 21100 7235−4
88 B 8 8 B 8 B 4B 4B 4B 号 0発 明 者 バーバラ・ウオルナー・フィリップ アメリカ合衆国マサチューセラ ツ州02161ニュートン・ロック レッジ・ロード32番 手続補正書(方力 昭和58年4月(3L1 特許庁長官 若 杉 和犬 殿 1、事件の表示 @057年特許願第 21’+918 号2、発明の名
称 D N A配列、組換DNA分子およびヒト血清アルブ
ミン様ポリペプチドの製造方法 :3.績+Eをする者 事件との関係 特許出願人 4、代 理 人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)少なくとも1部分がヒト血清アルブ建ンの免疫学
的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを暗号化し
かつ(a)H8A/33−1 。 1(8A/17−5.1−18人/33−1(1〔菖−
gcoRI)−88ム/17−!S(8g1厘−IAc
。 凡I)、ti818ム/33 (堕■−且要R,I)−
H8人/17− S (XbaI−1ilcoRI )
、 (b)前配置)N人配列のいずれかにヒ“ブリド
化するDNA配列、(C)供給源の種類を問わず、天然
1合成もしくは半合成の供給源、突然変異KIII遜す
るものを包含し、さらに前記DNA配列のいずれかに関
し、単一もしくは多重の塩基置換del+除、挿入およ
び逆転を包含する1)N人配列および(d)前記DNA
配列のいずれかのコドンにより暗号化されるものと同機
なア建ノ酸配列を含有するポリペプチドを暗号化するコ
ドンの配列からなるDNA配列よりなる群から選択され
、前記DNA配列配列−赫)はヒ、ト血清アルプ建ンO
免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを暗
号化することを特徴とするDNA配列。 ■ 特許請求の範囲第1項記載のDNA配列からなる組
換88人分子。 (5)DNA配列が表現制御配列に作用結合されている
特許請求の範11j12項記載の組換88人分子。 鱒) 表現制御配列をイー・コ、す(Jcoli)IA
c系、イー・コリtrp系、イー・コリβ−1暑C系%
TAC系、TRC系、7アージλの主要オペレータおよ
びプロモータlkt フィラメント状の単一鎖DN人7
アージの制御領域、原始値もしくは成熟核細胞およびそ
れらのフィルスの遺伝子の表現を制御するその他の配列
ならびにそれらの組合せよりなる評から選択される特許
請求の範WA@5項記載の組換1)Nム分子。 (5) pKT218(H8人153−1 )、pK
T218(FA、8A/17−3)lKT218(i(
8ム/!、3−1 (BglI−Jico&I)−H8
A/17−5(Hgl7−5(H凡I))、pKT21
8−TAC(kis人/33−1 (Bgli−Ec
oRI)−klBk/17−3 (Bgll−1i1c
oRI))5、pcki8ム32およびpcklBム3
6 よ〕なる群から選択される特許請求のlis第4項
記載の組換DNA分子。 藝) 特許請求の範am14項または嬉5項記載の少な
くとも1種の組換DNA分子によp形質転換されえ宿主
。 σ) 形質転換宿主をイー・コリ、シュードモナx (
Ps@udomoaas ) 、枯草tli (Bac
iHgg@ubt目i)、高熱1g(Bactllus
stearo−thermoph口us)sその他の
+1iasr、 *母、真m類の一株、動物および植物
宿主ならびにヒト組繊細胞よルなる群から選択する特許
請求の範囲#I6項記載の形質転換宿主。 (8)4−”:)17H8101(9KT218(H8
A/33−1 )) 、イー−コリ)iBlol(1)
KT21B(kia人/17−3 ) ) 、イー拳コ
リdB101 (pKT218(i(8人/35−13
5−1(Bノ)ジ!81>−kls人/17−3(且1
↓墓−2厚蝉3ミ!≧−几1)))、イー・コリW51
10IQ (pcHsム52)およびイーリリVL51
10IQ(pcH8A66)よpなる群から選択される
特許請求の範囲第6項または縞7項記載の形質転換宿主
。 (9ヒト血清アルブきンの免疫学的もしくは生物学的活
性を示しかつ特許請求の範Hub項乃至摸8項のいずれ
かく記載の形質転換宿主により生産されるポリペプチド
普九はその断片もしくは誘導体。 (10)少なくとも1部が特許請求の範!j!A第1項
記載のDNA配列によプ暗号イヒされ九本のであるポリ
ペプチド・ (11) 4111’F−請求の範S篇1項記載のDN
A配列をクローン化ベヒクル中へ導入することを特徴と
する組換DNム分子の製造方法。 (12)クローン化ベヒクル中に’lR現制御配列を導
入する工1iをさもに含み、前記表′iA制御配列ヲ前
記クローン化ベヒクル中に導入して前記DNA配列の表
属を制御および調節する特許請求の爲S第11項記載の
方法。 (15)特許請求の8884項または第5項記載の組換
DNA分子を宿主中に導入する工程を含む宿主の形質転
換方法。 (14)適当な宿主を特許請求の範囲第4項ま九は第5
璃記載の組換1)NA分子によ)形質転換させ、前記宿
主を培養しかつポリペプチドを回収する工程からなるヒ
ト血清アルブミンの免疫学的もしくは生物学的活性を示
すポリペプチドの生産方法。 (15)形質転換宿主をイー・コリ、シュード七ナス、
枯草菌、高4111.その他の5tar、酵母。 真−の−株、動物もしくは植物宿主およびヒト組繊細胞
よ^る群から選択する特許請求の範囲$1E14項記載
の方法。 (16)%許請求の範囲第4項または第5項記載の組換
DNA分子によp形質転換され喪宿主を培養し、かつポ
リペプチドを回収する工程からなる。ヒト血清アルブミ
ンの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
の生産方法。 (17)ヒト血清アルブミンの免疫学的もしくは生物学
的活性を示すポリペプチドを暗号化するDNA配列ti
nODNA配列から選択するKIIL、前記群の1)N
A配列をスクリーニングして特許請求の範18第1項記
載のDNA配列の少なくとも1種にヒブリド化するもの
を決定することを特徴とするDNA配列の選択方法。 (18)スクリーニングされる1)NA配列を天然供給
源からの1)NA配列、合成りNA配列、組換1)NA
分子からのDNh7列および前記DNA配列のいずれか
の組合せであるDNA配列よりなる群から選択する特許
請求の範囲館17項記載の方法。 (19)特許請求の範S篇9項tたは111110項記
載のポリペプチドおよび特許請求の範11J114項乃
至l116項のいずれかの方法で生産されるポリペプチ
ドよ〕援る騨から選択されるポリペプチドからなること
を特徴とする特許許容しうる組成物● (20)%杵饋求の114131119項記載の組成物
にょり医薬上許容しうる方法でヒトを処置することを畳
黴とするヒトの処置方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33091281A | 1981-12-14 | 1981-12-14 | |
US330912 | 1981-12-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58150517A true JPS58150517A (ja) | 1983-09-07 |
Family
ID=23291841
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57217918A Pending JPS58150517A (ja) | 1981-12-14 | 1982-12-14 | Dna配列、組換dna分子およびヒト血清アルブミン様ポリペプチドの製造方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0091527A3 (ja) |
JP (1) | JPS58150517A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0683233A2 (en) | 1994-05-18 | 1995-11-22 | The Green Cross Corporation | Process for producing recombinant human serum albumin |
WO2005004902A1 (ja) * | 2003-07-10 | 2005-01-20 | Nipro Corporation | プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤 |
WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび/または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
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IL66614A (en) * | 1981-08-28 | 1985-09-29 | Genentech Inc | Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it |
EP0079739A3 (en) * | 1981-11-12 | 1984-08-08 | The Upjohn Company | Albumin-based nucleotides, their replication and use, and plasmids for use therein |
US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
FR2579224B1 (fr) * | 1985-03-25 | 1987-05-22 | Genetica | Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine |
FR2579223B1 (fr) * | 1985-03-25 | 1988-12-09 | Genetica | Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine |
EP0206733A1 (en) * | 1985-06-17 | 1986-12-30 | Genex Corporation | Cloned human serum albumin gene |
GB8725529D0 (en) * | 1987-10-30 | 1987-12-02 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
NL8901932A (nl) * | 1989-07-26 | 1991-02-18 | Mogen Int | Produktie van heterologe eiwitten in planten of plantecellen. |
FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
EP1276756A4 (en) | 2000-04-12 | 2004-06-09 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
US7507413B2 (en) | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
ES2545090T3 (es) | 2001-12-21 | 2015-09-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina y GCSF |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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IL66614A (en) * | 1981-08-28 | 1985-09-29 | Genentech Inc | Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it |
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-
1982
- 1982-12-13 EP EP82306643A patent/EP0091527A3/en not_active Withdrawn
- 1982-12-14 JP JP57217918A patent/JPS58150517A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2005004902A1 (ja) * | 2003-07-10 | 2005-01-20 | Nipro Corporation | プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤 |
WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび/または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0091527A2 (en) | 1983-10-19 |
EP0091527A3 (en) | 1984-07-25 |
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