JPS58150517A - Ｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子およびヒト血清アルブミン様ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 ＤＮＡ配列，組換ＤＮ▲分子およびヒト血清アルブミン
様ポリペプチドの製造方法につき開示する。本発明のＤ
ＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子はヒト血清アルブミン様
ポリペプチドを暗号化するＤＮＡ断片を含むことを特徴
とする。

これらのｉ）ＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子ならびκそ
れらによｐ形質転換される宿主を本発明の方法に使用し
て，ヒト血清アルブミン様ポリペプチドを生産する仁と
ができる。

本発明はＤＮＡ配列、組換ＤＮ人分子およびヒト血清ア
ルブミン様ポリペプチドの製造方法に関するものである
．さらに詳細には、本発明は適当′＆攬主生物κおいて
表現されるＤＮＡ配列および組換１）ＮＡ分子κ関する
吃のである。

本発明のＤＮＡ配列および組換ＤＮ▲分子は、ヒト血清
アルブミン様のポリペプチドを暗号化する断片を含むζ
とを特徴とする．シ九がって。

これらｉ）ＮＡ配列および組換Ｌ）Ｎ大分子ならびκそ
れらによ）形質転換される宿主を本発明の方法に使用し
て、ヒト血清アルブミン様ポリペプチドを製造すること
がてきる。

ヒト血清アルブミンは、ヒト血清の主要な蛋白成分であ
る．ζれは肝臓により合成され、血管内体液の浸透圧を
調節すると共κ、血液内の各種の代謝物を結合すると思
われる。天然のヒト血清アルブミンの７ξミノ配列は公
知である〔ビー●メロクン等　ＦｈＢＳ　　レタース、
第５８巻、＠１３４　〜３７１Ｆ（１９７５年１０月）
）、ｅｆｌは５８５個の７κノ鎖よ）ｆｋる蛋白質であ
る。

現在，ヒト血清アルブミンは、輸血用として最早使用し
えない血液試料から単一することＫよシ製造される。こ
れは火傷患者κ対する補血用として，ヒト循環器系の機
能を陶土させる手段として，食品添加物用のアミノ酸供
給源として，新生児κおける核黄復（ビリルビンの過剰
）の治療κおける有力な窒素固定剤としてならびκヒト
治療κ使用される多くの瘍剤およびその軸化合物κ対す
るｒｉ嬢上許袢しうるキャリアとして広く使用されてい
る。

ヒト血清アルブミンは血液試料から精製されるので，血
液と同じ汚染を受は島い●たとえばヒト血清アルブミン
は輸血によ）ヒトの関で伝染されうるＢ橿肝炎つイルス
粒子もしくはその他ウイルスおよび毒物κよって汚染さ
れることがある．要するκ，これら汚染の可能性は、ヒ
ト血清アルブミンの使用を制約している．さらκ，その
主要な供給源は捨てようとしている血液試料であるため
，ヒト血清アルブミンの供給は血液貯蔵条件が改善され
るにつれて減少するであろう．さらに、ヒト血清アルブ
ミンが医薬治療における広範な用途を有するため、ヒト
血清アルブミンの入手Ｋｉ？ける同様な減少が起ζるで
あろう。したがって、高ｇＫ精製されたヒト血清アルブ
きンの他の供給源が必要とされる。

分子生物学における最近の進歩は，細ｄＩＷ７Ｉ主にお
ける多量の成熟核蛋白質の製造を可能にしえ。これらＫ
は、たとえば白血球インタ７エロン（ニス拳ナガタ等「
イー−コリにおけるヒト白血球インタフエロン活性を有
するポリペプチドの合成」、ネイチャ誌．縞２　８　４
＠．菖６１６〜２０頁（１９８０））、　ヒト１１ｇ肝
炎ウィルスの抗原（シー●ジエー●バレル等［プラスミ
ドｐＢＲ３２２中κクローン化され九ａａｉ肝炎ウイル
スｉ）Ｎ人配列のイー拳コリにおける表現」、ネイｆ’
ｒ誌．ｊｉ２７９巻．　［４　３　〜７Ｊ［（　１　９
７９）。

およびエム●パセク等［イー−コリκおけるＢ臘肝炎遺
伝子およびそれらの表現」、ネイチャー、第２８２巻、
第５７５〜７９頁（１９７９））。

５ｖ４ｏｔ抗原　（ｆイー・エム・ロバーツ勢、「イー
・コリにおけるＪｌｌ聾ウィルス４０を抗原の合成」、
プロシーディング・ナンヨナル・アカデンー・サイエン
ス・０８人、第７６巻、第５５９６〜５６００貞（１９
７９））およびＦＭＤウィルスｔ［（エッチ拳キュツバ
ー等「７ツト争アンド−マウス病ウィルスの主要抗原の
ｃＤＮＡＯクローン化およびイー・フリにおける表丸。

ネイチャ繍、第２８９％、第５５５〜５９頁（１９８２
））が包含されろ。

一般にこｎらの方法は、表現制御配列に作用結合される
所望の生産物を暗号化するＤＮＡ配列を％黴とし九組換
ＤＮム分子の作成に依存する０次いで、適当な宿主をこ
ｎら分子によって形質転換させ、醗−法により所望の生
産物の製造ｔ−可能にする。ＤＮＡ暗号化配列について
は、化学合成によプ製造されるものの他、この種の組換
１）Ｎ人分子の作成は所望蛋白質に対するメツセンジャ
ＲＮＡ（ｍＲＮ人）−盛の単一鎖ＤＮＡコピー（ｃｉ）
ＮＡ）を生成させ、このｃＤＮＡを二重鎖ＤＮλに変換
し、仁のＤＮＡを適当なりローン化ベヒクルにおける適
当な表現制御配列へ作用結合させるという工程からなっ
ている。

次いで１組換ＤＮＡ分子を使用して適当な宿主を形質転
換させる。この形質転換は、適当な条件下で醗酵させた
場合、宿主が所望蛋白質を生産するのを可能にする。

本発明は、ヒト血清アルブミン様ポリペプチドを暗号化
する少なくとも１種の１）ＮＡ配列を提供する。さらに
詳細には、本発明によれば少なくとも１部がヒト血清ア
ルブミン様ポリペプチドを暗号化することを特徴とする
ＤＮＡ配列が提供される１本発明のこの１）ＮＡ配列は
、伽）ム（８Ａ／３５−１　、）１８Ａ／１７−５．）
ＩＳＡ／３５−１り反す一旦速几Ｉ）−Ｈ８Ａ／１７−
３（旦１ｌ−ＥｌｃｏＲＩ　）　、ｋｉ８Ａ、１５５−
１　（Ｘｂａｌ−Ｅｃ。

凡１）−に４ＳＡ／１７−５（Ｘ吠ニー担凡工）。

わ）前記ＤＮＡ配列のいずれかにヒブリド化しかつヒト
血清アルブミン様ポリペプチドを暗号化する１）ＮＡ配
列、（）供＃源の種類を問わず、天然１合成もしくは生
合成の供給源、突然変異に関連する賜のを包含し、さら
に前記ＤＮＡ配＾のいずれかに関し、単一もしくは多重
の塩基置換、ｓｔｎ、挿入および逆転を包含するＤＮム
配タＵ、および傾前記ＯＮム配列のいずれかのコドンに
より暗号化されるものと同様表アミノ酸配列を含有する
ポリペプチドを暗号化しかつヒト血清アルブミン様ポリ
ペプチドをａＳ化するコ５トンの配列からなるＤＮＡ配
列よ）なる群から選択される。

したがって１本発明によれば、ヒト血液および血漿から
単１１１ｍされる天然のヒト血清アルブインに従来固有
のＢａ１ｔ肝炎ウィルス粒子もしくはその他不純物によ
ｐ汚粂されないような形態でかつ相当量でヒト血清アル
ブミン様ポリペプチドを得ることができる。本発明にお
けるＤＮＡ配列１組換ＤＮム分子、宿主およびそれらの
使用方法ならびにそれらによ）生産されるヒト血清アル
ブミン様ポリペプチドは、ヒト血清アルブ建ン製造のそ
の他公知の方法を悩ませていえ問ｉｉ［を回避する。し
たがって、医薬上およびその他工業用に各種の用途とし
て多量の高１ｌＩＩＩ＆ヒト血清アルブミン様ポリペプ
チドおよびその誘導体を利用することが可能となる。

本明細書中に記載する本発明を一層充分理解しうるよう
以下詳細に説明する。

本明細書において１次の用語を使用する：ヌクレオチド
二纏部分（ペントース）と燐′一部分と含窒素複素環式
塩基とよりなるＤＮ＾もしくはＲＮＡのモノ！一単位、
塩基はグリコシド炭素（ペントースの１　炭素）　を介
して糖部分に結合されており、塩基と纏とのむの結合を
ヌクレオチドと呼ぶ、塩基はヌクレオチドを特性付ｄる
。４種のＤＮＡ塩基はアデニン（陶）。

グアニン（ｒＧＪ　）、シトシン（ｒＣＪ　）およびチ
イン（ｒＴＪ　）である・。４種のＲＮム塩基はＡ。

Ｇ、ＣおよびウラシルＣ「υ」）である。

工状μノ」１烈−：隣接するペントースの５炭素と５炭
素　との間のホスホジエステル結合によｐ互いに結合さ
れえヌクレオチドの線状列。

−２」ニド＃　３４８のヌクレオチドのＤＮＡ配列Ｃト
リブレッド）であって１ｍ＆ＮＡを介しアイノ績、ｌｌ
訳開始信号まえは翻訳停止信号を暗号化する。たとえば
、ヌクレオテドトリプレッ）　　ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴ
Ｔ、ｃＴＣ，ＣＴＡＴｈＪびＣＴＧはアンノ駿ロイシン
（「Ｌ＠ｕＪ　）を４１化し、ＴＡＧ、ＴＡムおよびＴ
ＧＡは翻訳停止信号であり、ムＴＧは一訳關始信号でｂ
る。

ｆｊＮ＊　：　ｍ　ＲＮムをア（）鹸配列へ翻訳する際
のコドンのグループ、Ｉｆ訳の―は、適性な貌枠を錨持
せねばならな一１九とえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧ’ｒ
ＡＡＧ　１３っｏ絖枠、すなわち相において翻訳するこ
とができ、そのそれぞれは異なるア櫂ノ鐵配列、すなわ
ち ＧＯＴ　ＧＧＴ　ＴＧＴムムＧ　−− Ａｊ　ａ−ＧＪ　ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＡＧ　−−Ｌａｕ−Ｖａ
ｌ−ＶａｊＧＣｉ諒」没ＴＡＡ　Ｇ−Ｔｒｐ−Ｌｔｕ−
（ｌ！＃゛を与える・ ）基とカルボ中シ基との間のペプチド結合によ）互いに
結合されたアミノ酸の線状列。

ゲノム：細胞１１九紘ウイルスの全ＤＮＡ、これ＃ｉ、
　Ｉｌ＃Ｋｍ！１８％　Ｌ＜はウィルスのポリペプチド
を暗号化する構造遺伝子ならびにそのオペレータ、プロ
モータを含み、さらにリボソーム結合性および反応性配
列を含み、九とえばシャインーダルガルノ配列のような
配列を包含する・構造遺伝子ニー瀝もしくはメツセンジ
ャ８Ｎム（ｒｍＲＮＡＪ　）を介し、轡定のポリペプチ
ドに特性的次アきノ酸の配列耐暗号化するＤＮＡ配列。

転写：構造遺伝子からｍＲＮムを生産する過龜・ 翻訳：ｍＲＮ人からポリペプチドを生産する過揚働 表現：ポリペプチドを生産する九め構造遺伝子により受
ける過程、これは転写と翻訳との組合せであ本。

プラスミド：プラスミドを宿主細胞中に複劇するような
完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎮ＤＮＡ配列
−プラスミドを単細胞生物中に入れると、その生物の特
性はプ９ｑドのＤＮＡの結果として変化し、まえは形質
転換される。たと゛えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｅ
ｔ　）に対する遺伝子含有するプラスミドは、テトラサ
イクリンに対し感受性であった細胞をテトラサイクリν
に対し耐性である細胞に形質転換させる。プラスｊ）″
によｐ形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。

７ア゛−ジ筐九はバクテリオファージ：ｍｍ性ウィルス
であって、その多くは蛋白エンベロブもしくはコニト中
にカプセル化され九ＤＮＡ配りＩｆ（ｒカプシド蛋白質
」）よシなっている。

クローン化ベヒクル：プラスミド、７アージ１）ＮＡ普
えはその値のＤＮＡ配列であって、これはこの種の１Ｊ
Ｎ人配列を決定可能に切断しうる１箇もしくは少数の５
工ンドヌクレアーゼ織別位置を有し、しかもＤＮＡの本
質的な生物学的機能、たとえば複製Ｊ゛コート蛋白質の
生産またはプロモータもしくは結合位置の喪失を伴わな
いことを特徴とし、かつ形質転換細胞の同定に使用する
のに適する標識、たとえばテトラサイクリン耐性管たは
アンピシリン耐性を有する。

クローン化ベヒクル社、シばしばベクタと呼ばれる。

クローン化：無性繁殖によプこの種の１種の生物まえは
配列から誘導される生物またはＤＮＡ配列の集団を得る
過程。

組換ＤＮＡ分子またはヒブリドＤＮＡ：生細胞の外部で
末端結合されておりかつ成る種の宿主細胞に感染する能
力を有して、そζに維持されるような異なるゲノムから
の１）ＮＡ断片よりなる分子。

表構制御配列：構造遺伝子に作用結合され九― 場合、これら構造遺伝子の表現を制御かつ調節するヌク
レオチドの配列。これらはｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴｉＣ
系、β−１ａｃ系、ファージニの主要オペレータおよび
プロモータ領域、　ｆｄコート蛋白の制御領域および原
始核細胞もしくは成熟核細胞重比はそれらのウィルスの
遺伝子の表塊を制御することが知られたその他の配列お
よびそれらの各種の組合せを包含する。

ヒト血清アルプ建ν機ポリペプチド：天然のヒト血清ア
ルブミン（ｒｋｌｓ人」）の生物学的もしくは免疫学的
活性を示すポリペプチド、このポリペプチドは、天然Ｈ
８Ａｔ）　１部でないア建ノ績を含有しうるか、ま走は
天然）１８Ａのア建ノ虐の１部だけを含有することがで
きる。さらに、このペプチドは天然のに′１８ムと同一
でなくと４良い・何故なら、これを生産する宿主は宿主
生産されたポリペプチドを天然）（８ムの構造および置
換物に形質転換させるのに必要とされるような逼！１な
酵素を欠如することもあるからである。

第１＃ｔＪについて説明すれば、とこＫは本発明のＤＮ
Ａ配列および組換ＤＮＡ分子の製造方法における一具体
例の略図が示されている。

実施例 ヒト胎児の肝ｐｃＤＮＡ保存物の調製 ヒト胎児の肝−ｃＤＮＡ保存物をバーバード・メジカル
・スクールのダビット拳クルニットが調製した。ポリＡ
　ＲＮＡを周知の方法によりヒト胎児の肝臓から単離し
丸。次いで、このポリＡ　ＲＮＡを雛型として使用して
、単一鎖の補完ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した〔たとえ
ばニー・エフストラチアジス等、「グロビンおよびコリ
オン５ｎｌｔＮＡの全長さおよび個々の部分逆転写」、
セル誌、１１４８、第３６７〜７８貞（１９７５）およ
びそこに引用され九文献〕。次いで、このｃＤＮＡを慣
用の方法によｐ二ＩｊＬ鎖となし、ｄＣ残留物で切断し
て、これｔｐＫｉ［’２１８（ｐＢＲ６２２の霞導体）
のｄＧ−切断Ｐｓｔ１部位へ挿入した〔たとえばエル働
ビラーコマロフ等「プロインシュリンを合成する細１性
クローン」。

プロシーデイング・ナショナル・アカデ＜−−サイエン
ス・ＬＪ１９Ａ、ｊ１ｇ７５巻、第３７２７−５１１（
（１９７８）；ケーータルマツシ等「イー・コ９にイン
シュリン抗原を持込む成ａｍ信号配列」、グロシーデイ
ンダーナシ叢ナル・アカデミ−・ｔ（工ｙｘ−Ｕ８Ａ、
１１１１７７％、に５５ｂ９〜７５頁（１９８０））、
得られ九ヒト胎児の肝臓保存物からなる組換ＤＮム分子
を次いで使用して。

標準法によ珈虜合性のイー・コリ１（Ｂ１０１　を形質
転換させた。タルニット博士によシこの保存物が我々に
提供されえ。

Ｚ！ 上記のヒト胎児の肝１１ｃＤＮＡ保存物をネズＺ（ｍｏ
ｕｓｅ）血清アルブ々ンｃ　Ｊ）ＮＡでスクリーニング
することを決定した〔ディー・キオウシス等、「α−フ
ェト蛋自およびアルプンンの発生」、ジャーナル・オプ
・バイオロジカル・ケ々ストリー。

ＪＩｇ２５６＠、菖１９６０〜６７］［（１９８１年２
月２５日］〕０本発明者等による方法の１鑵は、子牛お
よびねずみ（ｒａｔ）の血清アルプ擢ンがヒト血清アル
ブ（ンに対し幾つかのアミノ績配列類似性を有すること
である〔テイー−ピータース・ジュニア、「血清アルブ
ミン」、ザ・プラーＫｆｆ・プロティン（エフ・ダブリ
ュ・プットナムー集）、ｌｌ１１巻、第１３３〜１８１
貞（ｉ９７５））。し九がって、本発明者等は、ネズイ
血清アルブきンｃＤＮＡがヒト血清アルブミンｃＤＮＡ
Ｋ充分な程度クロスヒプリド化して、特定のヒト血清ア
ルプンン関連ｃＤＮムを、Ｈ８ムに＠連しない多くのｃ
ＤＮＡを含有するｃＤＮＤＮＡ物から選択しうろことを
推定した。

上記のｃＤＮＡ保存物をスクリーニングするため、本発
明者等は保存物から約１（１，０００個の集落を集め、
これら集落の培養物をテトラサイクＩＪ／（２０βｌン
ー）を補充しえ２ＹＴ培地にシいて３７℃で増殖させた
（１０ｄ、ＯＤ５．。＝１８）〔ジエー・エッチ・イラ
ー、「分子遺伝学における実験」コールド・スプリング
Ｑバー１４、・５ｉ４５トリー、コールド４スプリング
−ハーバ−・ニューヨーク（１９７’２））＊プラスイ
ドｐＫＴ２１８はテトラティクリン耐性を暗号化する遺
伝子を含むので、９ＫＴ２１８によシ形質転換されえイ
ーーコ！Ｊｆ−ＩＢ１０１（この完全遺伝子を有する）
は、このように形質転換されなかつ九イー・コリをのぞ
いてこの抗生物質を含有する培地中で増殖するであろう
、したがって、テトラサイクリン含有検地における増殖
は、ｐＫＴ２１８を含む宿主の選択を可能にする。

培養物を遠心分離しｌｆＯ分間、５０００　ｒｐｍ）、
１ｄのα５トリス−Ｈｃｌ　（ｐｋｉ　８　）およびリ
ゾｆ　−４（１６１１／ＩＩＪ）中に再Ｊｌｉ？ＩＪセ
、そして氷中ＶＣｌ５分間静置し九・次いで、この冷混
合物をＥＤＴ人と混合しく８きリモルまで）、氷中に残
留させた１次いで、これを２０憾のトリトンＸ−１００
（α１５ｓＪ）、α５モルの１ｉＤＴＡ（ｐＨ８）（＆
７５ｓｅＪ）、　１モルのトリス−ｆ（ｃｌ（ｐｋｉ７
．９）（ｔ５ａ＃）、ｎ２０（４，６ａＪ）の混合物と
温合し、氷中に１５分間靜静置え、溶−し九細胞をエツ
ペンドルフ達心分離器で遠心分離しく５分間、１２００
Ｏｒｐｍ、４℃）、挿入ヒト胎児肝ｄｃＤＮＡを含有す
る溶−され九ｐＫＴ２１８に基づく組換プラスミド（上
置液）から細胞残骸を除去した。

仁の上置液を低融点のアガロースゲル（αν優）Ｋ施し
、アガロースを６５℃で溶融させることによ妙「スーパ
ーコイル」のパン）”（５０００〜７０００個のヌクレ
オチド寸法）の上部をゲルから除去した。このバンドは
約７５０個の塩基対よりも大きいヒト胎児肝臓保存物か
らのｃＤＮＡ挿入物を有する全てのｐＫＴ２１８プラス
ミドを含有すると推定される０次いで、分離されたアガ
ロース−含有のｐＫＴ２１Ｂに基づく組換プラスミドを
使用して、慣用方法により氷中でイー・コＩＪＨＢ１０
１の競合性細胞を形質転換させ九（ゲル２０声ｔ／細胞
１００μｍ）　（たとえば、ニス・アール・クシナー、
シエネチツクーエンジニアリング（エッチ−ｆブリュ・
ボイヤー纏集）第１７頁（１９７８））。

これら細胞を氷中に４５分間保ち、次いで５７℃まで５
分間加熱し九。この時点で２ＹＴブロス（２１１１）を
加え、そして細胞を振とうしながら６７℃にて４５分間
培養した。次いで、細胞ｔ−２ＹＴ含有のアガロース板
（２０μＰ／１ｍｌのテトラサイクリンを含有する）上
に＠嫁して、６７℃にで１晩増殖させ九。

次いで、このアガロース板のニトロセルロースフィルタ
複属物を３つ作成し、そしてこれらを３７℃にて５時間
増養した。２つのフィルタからの集落を２ＹＴ會有のア
ガａ−ス（１００μＰ／Ｍのクロラムフェニコールを補
充＞へ移シ、そして５７℃にて１５時間培養し九。クロ
ラムフェニコールを使用して宿主細胞中におけるｃＤＮ
人含有プツス建ドのコピー数を増加させえ６次いで、こ
れら細胞をアール・イー・タイヤ−１「イー拳コリのプ
ラス擢ドにおける外来ＤＮＡの改嵐検出方法」、アナリ
テイカル・バイオケ建ストリー、嬉９８巻、第６０〜６
３頁（１９７９）に記載されえ方法によ）湊１させ。

タタシこの場合ニトロセルロースフィルタを１分間でな
く２分間ワットマンム１フイルメ円盤の積層物に載置し
、そして２回ではなく１回のみ吸収および教権り過ａｔ
反復した０次いで、作成されたフィルタを乾燥し、８０
℃にて２時間加熱した。かくして、仁の手順により１０
０〜２００クローン／フイルタをそれぞれ含有する４０
枚のフィルタを得た。

これらフィルタを厳格でない条件下に、ネズ建血清アル
プζンｃＤＮ人試料にヒプリド化させた。何故なら、ヒ
ト血清アルブ電ンｃＤＮ人とネズ建血清アルプ建ンｃＤ
ＮＡとの間では同質性が低いと思われるからである。こ
のスクリーニングのためネズ電血清アルブ（ｙｃＤＮＡ
試料を作成したが、この際ネズき血清アルブ々ンｃＤＮ
ＡＩ含有する宿主を検量しくデー・キオククス、上記）
、かつアルブ（ン挿入物をＨ４ｎ４厘制限酵素によりプ
ラスミドから切除することによ９行なり九、この断片を
８１６ポリアクリールアイドゲル上で精製し、４種のα
−Ｐ１ζ−標識ヌクレオチドおよび比活性ｔ２Ｘ１０”
ｃｐｍ／μｐｔでのポリメラーゼ■の全ての存在下に二
ｙクー訳（ｎ１ｃｋ−１ｒａｎｓｌａｔｅ　）　（、ｆ
ｌ　ｔｓ次いで、これらをヒブリド化緩衝液（４０１１
ホルムアイド、α６４ルＮ暑Ｃｔ、α１２モルトリｘ　
−ＨＣｊ　（ｐｋｉ　８　）、４ｉル七ル１ＤＴＡ　（
以下、５　Ｘ　８１ＡＴと呼ぶ）および１０憾デキスト
ランサルフエート、α１慢８Ｄ８　）中において４２℃
にて１２時間場養することによ〕ヒブリド化用のフィル
タを作成しえ。

ヒブリド化の丸め２枚のフィルタを２−の新鮮なヒゲリ
ド化用緩衝液および緩衝液１ｏｏ＠ｌ蟲Ｄ　１００　Ｊ
Ｆ　ＯｐＢＲ３２２ノＨｉｎｆ　Ｉ断片とが存在するポ
リエチレン装甲に入れ、そしてＩＸｌｏｃｐｍの上記で
単離されたｃＤＮＡ試料を加ええ、ヒブリド化を４２℃
にて１８時間継続し丸０次いで、これらフィルタｔ＊温
にてａｉｉｆｌａ洗浄Ｌ（ＩＬＸ、ＪｉＪＩ／ｒ、　（
Ｌ５優８Ｄ８　）ｑｉ次いで４２℃に？　２０１Ｊｌ洗
浄り九（１１Ｘ　Ｊｉｌｔ）Ｉ。

次いで、フィルタを発色させて、標識試料に対しヒブリ
ド化した強い証明を示す位置をさらに検査する丸め選択
した・ 最も強いヒブリド化陽性の位置に対応する２０個の集落
を使用して、２ＹＴブロス中で３７℃にて１晩培養物を
調製し丸。次いで、これら培養物を２ＹＴ−アガロース
板（２５μＰ／−のテトラサイクリンを含有する］上へ
塗抹し、＃ｉ記と同様にヒプリド化の丸めの複製物を作
成し九、２０個のクローンの内１８備が再び本ヒプリド
化分析において標識ネズミ血清アルブ建ｙｃＤＮ人試料
に対し強い陽性を示し九・ヒト血清アルプイン関連ｃＤ
Ｎムの単一上記陽性の１８個の集落の培養物各１−を調
製し、これらをエツペンドル７チューブにおいて遠心分
離し九（５分間、１２０００ｒｌ）Ｉｎ）＊培養物を７
０μｔの８ＴＩＴ緩衝液（８憾の蔗糖、５０イリモルの
トリス−ＨＣｊ　（ｐＨ８）、５ミリモルのＥＤＴＡ％
５憾゛のトリトン、Ｈ２０）と５μＬのリゾチーム（１
０１１／１１１１ｇ）とに再懸濁させ、そして室温にて
５分間静置し丸。１分間煮沸し九後、溶麿細胞をエッペ
ンドル７チューブで遠心分離しＣ５分間、１２０００ｒ
ｐｍ　）。

上皺液を同量のインプロパノールと混合し良。

このインプロパツール混合物を−２０ｔｌ：ｆｉで１時
間冷却し、再び適心分離し九（４℃、５分間。

１２０００ｒｐｌＥ１）＊次いで、このペレットを制限
分析のため４０声Ｌ　ｏ　ｋ１２０中に再懸濁させた・ 上記で調製した１８種の温金物のそれぞれはネＸｉｌア
ルフィンｃＤＮ人試料に強力にヒブリド化するｐＫＴ２
１８−ヒト胎児の肝臓ｃＤＮＡ組換体を含有する。この
組換体はｄＣ／ｄＧ切断によ〕作成し、かつｐＫＴ２１
８の１１夏部位に挿入し九ので、この６ＤＮＡ挿入物は
Ｐｓｔｔ制限＄制限上１各組換体から切除することがで
きる。したがって、これら１８種の混合物を標４に条件
下で！す〕ｋよ〕制限化し、１８個の陽性培養物によｐ
生産された断片をｔＳ＊アガロースゲルで寸法決定し九
、１０個の大鳳断片（約１２００〜２２５０塩基対）を
含有するクローンを選択しえ。

最大挿入物を含有する１０種のクローνにおいて挿入物
の配向性を決定する丸め、サウザン（８ｏｕｔｈ＠ｒｎ
　）ヒブリド化を用’Ａ　ｆｔ　＊　ｔ　９９　ｙヒプ
リド化については、上記と同様に作成され九ヒト胎児の
肝臓ｃＤＮＡ保存物から、はぼ上記と同様にして従前に
単離された３００−ヌクレオチドｃＤＮム配列を使用し
、えだしこれは短かいｃＤＮ人断片を特徴とした。部分
的なヌクレオチド配列決定にょシ、この配列はヒト血清
アルプンンの７建ノ酸３１９〜４１６を暗号化すること
が示されえ。したがって、このＨ８に関連ｃＤＮＡ配列
を使用して、ヱリｊでの制限化によＪ））１８Ａの５末
端に対する試″料を作成し九（ｉ（８人は７２〕＠５６
５にヱリｊ部位を有する）、仁の制限化によ〕、Ｈ８ム
のア擢ノ酸３１９〜３６５０幅を有する試料が得られ良
０次いで、仁の試料をニス・ワイ・ツサイ等によ〕痰質
的に記載され九と同機にニック−訳し九〔「ひなの卵管
における遺伝子表！ＩＫ対するエストロゲンの作用、オ
ホパムコイド遺伝子の調整」。

バイオケｉｘトリー、　ｍ１ｌｌ　７巻、ＪＩＩ５５７
５〜８０員（１９７８））。

上記８８人関連試料に対するヒブリド化用のクローンを
含有する１０種のネズξ血清アルブｉンｃＤＮ人のヒブ
リド化陽性かつ大飄断片をｌＩＨするため、ｓｉ々の制
＠酵素：　Ｐｖｕ　ｌ　、　Ｈｉｎｄｌ　、　Ｐｓｔ　
Ｉおよびヱｓｔ　Ｉ　／Ｈ４ｎｄ　Ｉによってクローン
を処思し九。これら酵素分解によシ生成された特定の断
片ならびに５１９〜５６５ｋ１８人Ｅ１４に対するそれ
らのヒブリド化は、挿入物の配向性と各挿入物の５末端
の位置との決定を可能４ＣＬ九、１０種のクローンのう
ち２種、すなわちＦｉｔ上の位置によって示された。１
）ＫＴ２１８（）１８人／１３−１）およびｐＫＴ　２
１８　（Ｈ８Ａ／　１７−５）は、ｐＫＴ２１８中に断
片が挿入されているペニシリナーゼを暗号化する遺伝子
の転写方向に関し、正確な配向で５末端を有した。これ
ら２種のクローンの構造を第２図に示す。

１１Ｌ２ｍかｂ判；ｂように％ｐＫＴ２１８（Ｈ８８ム
／３−１）（以下、ｐｃＨ８人／３３−１と呼ぶ）の挿
入物は、後記するようなヒトプロ血清アルブンンの予備
配列を暗号化するヌクレオチド配列の少なくとも１部と
、いわゆるヒトプロ血清アルブ電ンに対する全暗号化配
列とから構成されている。　ｐＫＴ２１８　（Ｈ８Ａ／
１７−５　）　（以下、ｐｃＨ８人／１７−３と呼ぶ）
の挿入物は。

Ｒ８人の３非暗号化末端からの約２５０個のヌクレオチ
ドと、Ｈ８ＡＫ対する暗号化配列の最初の約１６００〜
１７００ヌクレオチドとから構成されている（すなわち
、最初の約５０〜６５個のアミノ酸に対する暗号化配列
を欠如する）。

したがって、２種の挿入物（ｉ（８Ａ／３３−１および
８８ム／１７−３）の組合せは、非暗号化Ｓ末端の実質
的部分と、予備配列の少なくとも１部とを暗号化するＤ
ＮＡ配列ならびにヒトプロ血清アルブミンの全暗号化配
列を与える。

１１８人１５５−１とｋｌｓム／１７−３との組合せ物
を作成するため、各クローンを旦１−璽およびｌ復ＲＩ
Ｋよって制限化し、９ＫＴ２１８（ｎｓ人１５３−１）
のよ〕短かい８ｇ１厘一旦凡■断片をＩ）ＫＴ２１８（
）ｉｓム／１７−３）のよ〕長い月１ノー！狸ＢＩｗＲ
片へ結鍮させ九。この新九に作成され九ｐＫＴ２１８（
ＭＪ紬Ｙ０４１（工耐表１【Ｊ、麗−エ二邑５とｏａｌ
）−８８ム／１７−５　（」−」璽−１四ＲＩ　）（ｒ
ｐｃ＆１８ム扉」）をも第２図に示す、その後のＤＮム
配列決定は、ｐＫＴ２１８ｋｌ＆Ａ１５５−１　（工≧
色ＩＬ１１−１！ｃｏ　Ｒ１）　−３（８ム／１７−５
　（」１」−四ＲＩ）のこの作成が成熟Ｒ８ムを暗号化
するＤＮＡ配列から６６ヌクレオチド１厘−Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ断片を除青させたことを示した。しかしながら、下記
に示すように、この削除は特定の削除を有する仁のよう
な作成物がこれらによシ形質転換され九宿主においてｋ
ｉｄＡ様ポリペプチドを生産することをさまたげない。

ヒト血清アルブき７機ポリペプチドの表現上記の組＠Ｄ
Ｎ人分子、すなわち：　ｐＫ’ｒ２１８（１−１８ム／
１５−１　）、ｐＫＴ２１８（Ｈ８ム／１７−３）およ
びＰＫＴ２１８（ｉ（８ム１５３−１（星ｌ　−却ＲＩ
　）−１１８ム／１７−３（工！菖−１遠ルＩ））　を
使用して前記の形質転換法によシイーＯコリ）ＩＢｌｏ
ｌを形質転換させ良。

次いで、これら形質転換され喪生物の培養物を作成し、
ブルー五−ギルパート法を用いてヒト血清アルブンン様
ポリペプチドの表現Ｋ”）き試験した〔ニス・ブルーム
およびダブリュ・ギルバート、「特定翻訳生産物を検出
するための免疫学的スクリーニング方法」、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデ建−・サイエンス・Ｕ８Ａ
、第７４４１１１２７４６〜４９頁（１９７８））。

抗ｄ８ＡＩｇＧ（マイルス・ラバラドリース社から入手
）を１（８Ａｉｌ和性カラムを使用して精製し、かつ標
準技術により　ｘ　１２１ｉ　Ｋよって標識した０次い
で、ポリビニル円錐にＫＨ８ＡＩｇＧを被覆し、そして
こ０固相をニス・ブルー＾およびダブリュ・ギルバート
（上記）によ）実質的に記載されたように板上で溶菌さ
れた各細菌抽出物および放射能標識された抗１（８Ａに
よ〕順次に処理した。次いで、ニス・プルームおよびｆ
プリュ・ギルバート（上記）によ〕記載されたように洗
浄を行なった。次いで、固相の放射能を監視し、免疫反
応を決定し良。

仁の分析法において放射簡標織された抗体は、細−抽出
物からのＨＢｌの免疫学的性質を示すポリペプチドが固
相の抗体に結合されている固体支持体上の位置にの重結
合するであろう。したがって、標識され九同相は、抽出
物におけるＨ８Ａ様ポリペプチドの存在を示す・ 放射線免疫分析の結果を以下に示す： イー・コリ　ＨＢｌ　０１（ｐＫＴ２１８（Ｈ８Ａ／１
７−３））　　　　　　　＋ イー−コリ　ＨＢｌ　０１　（ｐＫＴ２１Ｂ（Ｈ８ム／
ｌ速＆Ｉ　）　）　） イー−コリ　）ＩＢｌｏｌ（ＰＫＴ２１８）　　　　　
　　　　−（負の制御） ８８人　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋（正
の制御） の使用 本発明により作成されたＨ　８　Ａ　＠ａ　ａ　Ｄ　Ｎ
ムをりｑ−ン化するに線、広範なｍ−の宿主／り■−ン
化ベヒクル組合せを使用しうるむとｔ臘解すべきである
。たとえに、有用なりローン化ベヒクル扛染色体、非染
色体および合成ＯＤＮム配列の断片、たとえは各種の公
知のＢＶ４！−００誘導体および公知の細１性プラスミ
ド、たとえはａｏｌＫ／　、　ｐＣＲ／　、　ｐＢＲＪ
ＪＪ　、　ｐＭＢＦ　ｆ含むイー−コリからのものおよ
びその誘導体、広範な宿主範囲のプラスミド、たとえば
ＢＰ＃およびファージＤＮＡ、たとえばファージλの多
くの誘導体（たとえｌｄＮＭｆｌ？）およびその他のＤ
Ｎムファージ（九とえばＭ／Ｊ）および繊維状単鎖ＤＮ
ム７アージおよびグフスミドとファージＤＮＡとの組合
せから得られるベクタｉまたとえば７アージＤＮムもし
くはその他の表決制御配列を使用するよう改変されたグ
ラス建ド、壕九は酵母プラミドド（たとえ＃ｉλμグシ
スイド）ま九はその８１４体よ〕なることができる、有
用な徊主嬬たとえばイー・コリ（たとえ／ｄイー＠ｓす
１１ｍ／４７／、　イー１１：２９Ｘ／　７７４．４−
＠コリＸλ−ｌλ、イー・コリＭｊｉＣＩ　）の菌株、
およびシュウトモナス、枯単−、Ｊ６熱曹の菌株のよう
な＃ｌｌＩ性徊主ならびにその他のイー拳コリ、−１゜
酵母およびその伽臭■−１動物もしくは植物宿主。

たとえば培ＩＦＫおける動物（ヒトを含む）もしくは植
物細胞を友はその他の宿主を包含する。勿論、全ての宿
主／ベクター組合せ物が同等に有効であるとは限らない
、宿主／クローン化ベヒクル組倉せの特定ｏＢ択は、本
ａｒｓｏ＠−から逸脱せずにζこに示し象原履、を考慮
した後、機業看によって行なうむとができる。たとえば
、逼娼な宿主の選択は、轟東界でｌａ！織された多くの
７アクタによって管層される。これらの７７クタは、た
とえｄ選択ベクターとＯ適音性、ヒラリドグラスイドに
より暗号化された蛋白質０壽性、所望蛋白質の回収の容
易さ、ベクターおよび宿主の表視物性、生物安全性カら
びにコストを包含する。これらファクターのバランスは
、必らずしも全ての宿主がｑｐｉ芝ｏ組換ＤＮム分子の
表椀につき同１４’Ｃ有効ではないという板層に基づか
ねはならない。

さらに、それぞれの特定クローン化ベヒクルの範囲内で
、種々の部位を選択して１ｉａＡ胸連ＤＮムの挿入を行
たりことかで自る。これらの部位性、一般にこれら部位
を切断する制限エンドヌクレアーゼにより命名される。

たとえ＃ｉ。

ｐＢＲＪＪＪにおいて力組１部位は、β−ラクタマーゼ
に対する遺伝子においてこの蛋白質のアさノ酸ｉｔｉお
よび／Ｉコを暗号化するヌクレオチドトリプレットの間
に位置する。この部位ｔＬ白白血球インタフレーン免疫
学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドの合成に
おいてニス・ナガタ勢（上記）によって使用された。−
個の旦堕旦履エンドヌクレアーゼ識別部位の１つけアミ
ノ酸１０／および１０−を暗号化するトリブレットの間
に存在し、幾つかのシ１部位の／’）蝶ｐＢＲＪＪＪに
おけるβ−ツクタ！−ゼの７建ノ１ｌｌｌｊｔ暗号化す
るトリプレットに存在する＠　ｌ”ｌ１１に、ＰＢＲＪ
−λにおけるＩｃｅｓ　ＲＩ部位およびＰｖｓｉ　ｌ部
位は任意の暗号化領域の九個に存在し、たとえばｊ１Ｂ
１部位はそれぞれテトラサイクリンおよびアンピシリン
に対すゐ耐性を暗号化する遺伝子の関に存在する。これ
らＯｓ位は、轟東看によｐ充分認識されている。勿論１
本発明において有用なタ霞−ン化ベヒクルは１選択ＤＮ
ム断片の挿入に対し制限エンドヌクレアー−ｖｓ位を有
する必簀がないことｔｍ解すべきである。むしろ、ベヒ
クルは他の手段によって切断および断片に結合させるこ
とができる。

特定のベクター、すなわちクローン化ベヒクル。

および組換ＤＮム分子を生成させる九めに選択ＤＮＡ断
片を細金させるよう七〇に選択した部位も、当業界１’
ｃｌｌ織され九種々のファクタ、たとえば特定の制＠＃
掌に感受性の部位の個数。

懺現すべ＠＊白白質０法法、宿主細胞靜嵩よる蛋白質加
水分解に対する所望蛋白質の感受性。

積属の一除去するのが１鋤な細土細胞蛋白質による表現
すべ電量白質の汚染１表組特性、たとえはベクター配列
に対する開始コドンおよび停止コドンの位置、ならびに
当巣者によ＊ｉｉｇ＊され九七の伽のファクタによｐ決
定される。ベクターおよびこのベクターにおける特定遺
伝子の挿入部位Ｋｌｌする選択性、これら７アクタのバ
ランスによシ決定され、必らずしも全てＯ選択が所定の
場合に同等に有効であるとは限らない。

外来ＤＮＡをりｐ−ン化ベヒクルすなわちベクター中に
挿入して組換ＤＮム分子を生成させる幾つかの方法が当
業界で知られているが、本発明において好適な初期のク
ローン化方法をｐＫＴＪ／ｒにつき上記し良、勿論、Ｄ
ＮＡ配列をクレーン化ベヒクル中へ挿入して組換ＤＮム
分子を生成させるその他公知の方法を本発明に同勢に使
用することができる。これらに紘、たとえばｄムーｄＴ
切断、直Ｉ！や結１合成りン力、エキソヌクレアーゼお
よびボリメ２−ゼ納金され次修復反応とそれに続く結紮
、またはＤＮムポリメラー−ｖ＊よび造画な単一鎖Ｉ！
朧によるＤＮＡ＠ｅ）Ｗ＆長とそれに続＜ｍ素を包含す
る。

ＤＮＡｌｌＩＦｒ片の地図化およびヌクレオチド配列の
決定 Ｈ８ム橡ポリペプチドを展遺すゐために使用する他１本
尭明のＤＮＡ配列および組換ＤＮム分子はＭ８ムのゲノ
ムの金てま九ａ／ＩＩを含有する特定ヌクレオチド記動
の複製においても１用である。この方法で開脚され九１
ＩｊｉＡ　　ＤＮムｔＩＩ！用してゲノムの部分、％に
Ｈａムの活性部分を暗号化するような部分のヌクレオチ
ド配列を決定すゐことがで龜る。これらの配列からポリ
ペプチド自身の構造を決定することができる。

さらに、これら配列の知識は、本発明の組換ＤＮム分子
において改変を行なって生産されるポリペプチドの収率
を向上させ、生産されるポリペプチドの活性を増大させ
、かつＨ８ムＯ誘導体を。製造する仁とを可能にする。

組換ＤＮＡ分子ｐＫＴＪ／Ｊｒ（ＨａＡ／ｊＪ−／（Ｂ
ｇ−見　　厘゛　−桓　ＲＩ）−Ｈａ　　ム／／７−Ｊ
（３色些二色　厘−ｊｃａｏＲＩ））　　は、非暗号化
３′配列の実質的部分ならびにいわゆるヒトプロ血清ア
ルプンンの完全暗号化配列（Ｊ４ヌクレオチドシ已膳−
１４ｇｋｌの削除Ｓを除く）および予備配列の少なくと
もｌｓを含有するので％弧長され九Ｈ８ムゲノムのヌク
レオチド配列を決定するのに使用することができる。

前記と同様にグラス建ドＤＮＡｔ単一し、このＤＮＡを
各糧の制＠＃素Ｃニューイングランド・ビオフ１社壕九
はＢＲＬ）を用いて周知方法によシ推奨緩ａｔ中で分解
させる仁とによシＨ８ム／ＪＪ−／（１−邑β、１：鳳
−担ＲＩ）−Ｈ８ム／／７−Ｊ（シリ璽−μ堕ＲＩ）配
列の物理的地図を作成した。分解生成物を７％アガロー
スゲルで電気泳動にかけ良。臭化エチジウムで染色する
ことによシ内限化させ良後、ｐＢＲＪコ一の許細な物理
的地図と比較してこれらを分析し良〔レアー・ジー・サ
ットクリス［イー・コリプラス建ドｐｉｌＲＪ−一の完
全ヌクレオチド配列」。

コールド・スプリング拳ハーバ−・シンホシクム、＠４
１−Ｊ＠、ＪＩ１号、ｊＩ７７〜り０頁（／９７１）〕
。

これらの分屏パターンに基＝）いて、Ｈ８ム配列の部分
子＃＠地図を作成した。この地図を第Ｊ−に示す０次い
で、エイ・エム・マキｆＡおよびダ１リエ・ギルバー）
　ｒＤＮＡＯｋ！、判決定の九めの新規な方法」、プル
シーディング噂ナシ冒ナル・アカデミ−・サイエンス・
Ｕ−８ム、ｊＩ７＃ＩＩｋ、第７４Ｑ〜１１参買（ｌり
７７）により実質的に記載され九ように、ＤＮム挿入物
の配列決定によ）前記地図を改棗した。第１図は、種々
の制限化断片（円はレベルを示し、矢印社配列の方向を
示す）およびｐＫＴλ／ｒ（［８ム／ＪＪ−）（シロ量
−桓Ｒ１）−３１８ム／／７−Ｊ（町已璽−Δｌｌ０Ｉ
ＬＩ））のヌクレオチド配列の部分を決定するのに使用
した配列決定方法を示している。ｐＫＴＪ／Ｉ（Ｈａム
／ＪＪ−／　（Ｂｇｌ　ｌ−二≧！し９−凰１）−Ｈａ
ム／／７−Ｊ（上！」厘−！！ヱ８１））の挿入のため
に得たヌクレオチドの配列の過切な部分ｔ−第第一図示
す、この配列線、配列に対する改＊、たとえは突然変異
、単一もしくは多重の塩基置換、削除％神人もしくは逆
転が既に起こっていないか、或いはその後七の我′ｍも
しくは活性を改変させる丸め使用しえないという可能性
もあ夛うる。さらに、ヌクレオチド配ターＨ８ム／ＪＪ
−／　（Ｂｇｌ　１−ＥａｏＲＩ　）−Ｈ８ム／／７−
Ｊ（町（ｌ　１−ＪｉＣｓ＋＋ｏＲＩ　）の残存する部
分も同様な技術により決定しうろことが了解されるべき
である。

決定され九Ｈ８ム／ＪＪ−／（Ｂｇｌ鳳−和ＲＩ）−Ｈ
ａム／／７−Ｊ（、すｌ【」：鳳−１ｉｏｏ１１１）ヌ
クレオチド配列の種々の領域により暗号化されたポリペ
プチドを天然のＨ８ムにつき決定された２１０個のア々
ノ駿とを比較することによシ〔ビー・メロラン、上記〕
、この挿入智のＤＮム配列扛、疎水性のためヒト血清ア
ルブンンの推定予備配列におりる少なくと４７部として
割当てた配列の７１個のア建ノ験←第参図にア建ノ＠−
７〜−−コとして示す）およびｊＰｌ伽の７建ノ酸を有
するポリペプチドの全アミノ酸配列を暗号化すると思わ
れる。天然Ｈ８ムの報告され良アイノ酸配ター〔メロラ
ン、上記〕に基づいて、このよシ大龜なＩＩｉ日質をヒ
トプロ血清アルツ電ンと命名し九〔これ鉱予備配列と天
然ヒト血清アルプｉンにつき報告され九ア建）酸配列と
の間に４個のア々ノｗｉｔ＜ｗｇ参図に７ンノ験−７〜
−６として示す）を有する〕。

さらに、決定されたヌクレオチド配列０１６分から解か
るように、１１８ム／１３−／（ｌ１ｇ１．鳳−！叩Ｒ
Ｉ）、Ｈ８ム／　／　７−Ｊ　（Ｂｇｌ　ｌ・−α型８
りの暗号化配列はｈ　　Ｐ”翼Ｊ−−中へ挿入したべ二
シリナーゼ耐性を暗号化する遺伝子のｌｌｒ号・化配列
と此験して、単一のヌクレオチドだけ相がずれている。

しかしながら、何らかの内部的開始の結果、ｐＫＴＪ／
ｆ　Ｋお轄るヒプリド遺伝子（相がずれていても）によ
り形質転換された宿主線まだＨ８ム橡の生産物を生成す
る。

勿論、本発明によ〕単一されかっこζに記載され九ヒト
グー血清アルッ建ンのＩＩ号化配列を他の作成に使用し
て、暗号化配゛列がベニシリナーゼ遺伝子と相を一款さ
せたグラスミドをｔ１４にすることかで＊、或いはその
他のグラス電ドを１１１して本発明によるＨ８ム橡ポリ
ペプチドの収率および活性を向上させることもできる。

宿主における蛋白質生産のレベルはλつの生簀な７アク
タ、すなわち細胞内にお轄る遺伝子のコピー数およびこ
れら遺伝子コピーが転与および翻訳する効率によって支
配される。転写および翻訳（これらは−緒になって表現
を構成する）の効率は２通常、所望の暗号化配列の前方
に位置するヌクレオチド配列に依存する。これらのヌク
レオチド配列または表視制御配列は。

籍にＲＮムボリメラーゼが転写を開始するよう反応する
位置（プロモータ配列）およびリボソームがｍＲＮム（
転写の生産物）と結合して反応し、翻訳を開始する位置
を規定する。必らずしも全てのこの樵の表現制御配列が
同等な効率を持って機能するとは限らない。したがって
、所望の蛋白ｊ［に対する特定Ｏ１＃号化配列をそれら
のｉｌＩ級するヌクレオチド配夕１ｊから分−して。

これらをその代ｊｌＫ伽の公知０＊＊駒御配判に―合さ
せ、それによル一層高い表現レベルオ九は恐らく一層＾
い１１主細胞からの分泌および成熟レベルを連成するの
が有利である。これＦｉ既に連成されているが、新九に
作成され喪ＤＮＡ断片を多徴写グツスンドオ比はバクテ
リオファージ誘導体中に挿入して細胞内に遺伝子コピー
の個数を増大させ、かつそれによｐさらに１ＩＩｌｌ蛋
白質の収率を向上させゐことかで１１ゐ。

幾つかＯ衆機制御配列を前記のように使用することがで
きる。これらはオペレータ、プ胃モータおよびイー・コ
リの乳糖オペロン（Ｆｌａ。

系」）のリポソーム紬舎性かつ反応性配列（九とえにシ
ャインーダルガルイ記動などの配列を包含する）、イー
・＝りのトリブトファンシンセターゼ系の対応する配列
Ｃｒｔｒｐ皐」）、β−１Ｉ系、７アージλの土豪オペ
レータおよびプルモータ領域（０ＬＰＬ　ｋよび０ａＰ
＝　）　、　フィラメント状単−鎖ＤＮムファージＯ制
御４１領域、ま九は鳳細被もしく鉱成熟被細胞の遺伝子
の表現を制御するその他の配夕ＩＪおよびそれらのウィ
ルスならびにこれら配列の穏々の組合せ、たとえば工Δ
旦系もしくは１旦９糸を包含する。し九がって、ｊ１烏
な伽主において特定のポリペプチドの生産を向上させる
には、このポリペプチドを暗号化する遺伝子を前記のよ
うに選択し、かつこれを含有する組換ＤＮム分子から除
去し。

遺伝子を他のクローン化ベヒクルすなわちＩｉ！！現ベ
クター中へよ６３１１１！ＦＫ再押入し、或いは前省の
ＩＲｊｉ１１制御配列に対しよｐｊ１切な関係で、或い
は上記の改嵐され九表現制御配列の７つを制御しながら
再挿入すゐことができる。この槍の方法は癲東界で公知
である。

申　こむで使用する「関係」という用飴は、多くのファ
クタ、良とえｉ組換ＤＮＡ分子、および挿入ＤＮム配列
の表徳向上および促進領域を分離する間隔、ベクター自
身における挿入ＤＮＡ配列もしくはその他配列の転′４
および翻訳特性、ベクターの挿入ＤＮム配夕Ｕおよびそ
０　＊に、＋ｔｔの特定ヌクレオチド配列、およびベク
ターの貴楓向上および促進領域の特定の性質を包含する
。

この１１の作成の前壜良は＠、Ｈ８ム橡ポリペプチドを
論量化するＤＮム配タｔ＋ｔａＬｍ核もしくは成熟核の
両者の各撫信号配列またはその組合せ物と混合して、Ｈ
ｉｍム橡ポリペプチドを宿主細胞から分泌させると共に
、ｔ＆壇しくに分泌の際信号配列を＃ａ訣させることが
できる。この種の方法は、たとえばと２−コマロア勢（
上記）およびタルマッシ等（上記）に記載されている。

所望生置物の細胞収率におけゐ増大は、さらに＃Ｉ胞中
に利用しうる遺伝子の個数における増加に依存する０例
示の目的であるか、これは前記のように作Ｍ１．され九
組換ＤＮム分子をａｉｍバクテリオファージλ（ＮＭｆ
ｔり）中へ押入することによ〕、％に簡単にはグラス電
ドを制＠酵素で分解させて一状分子を生成させ１次−で
これを１ｌｌｊ　ｉｉファージλクローン化ベヒクル〔
喪トえばエヌ・イー・ムレー勢、［試験管中で組換体の
１収を簡単化するλファージＪ、Ｍｏｌ・６゜ｇ＠口、
　Ｇｅｍ・も０、第ｉｚｏ巻、第１３〜４１貢（／り７
７）およびエヌ・イー・ムレー勢、ｒバクテリオファー
ジＴ４ＩからＯＤＮムリガーゼ遺伝子の分子クローン化
Ｊ　、　ＪｌＭｏｌ、　Ｂｊｏｌ　、第１ＪＪ＠、籐参
り３〜１０１買（／Ｐ７Ｆ）に記載され九種拳のもの〕
と混合し、この組換ＤＮム分子をＤＮムリガーゼとの培
１１によシ再積化させることによプ達成することができ
る。次いで。

所望の組換体７アージを前記の様に選択し、これを使用
してイー・；りの宿主菌株を溶菌させゐことができる。

特に有用なλクローン化ベヒクルはレプレツを遺伝子（
ＩＩＫおける感温性突然変異と遺伝予見におけ石抑圧性
突然変異とを含み、その生産物は宿主細胞の溶菌にとっ
て必蚤であシ、さらに遺伝子！における抑圧性突然変異
を含みその生産物はウィルスの主要なカシシト蛋白質で
ある。この系を用いて＊＊性細胞を３２℃で増殖させ１
次いで＄ｊ’Ｃオで加熱してプロ７アージの切断を誘発
させ為、７７℃における長時間の増殖は、Ｓｔ胞内に保
持される蛋白質の高レベルの主意をもたらす、何故なら
、これらは通常の方法ではファージ量伝子生腫物によｐ
１１曹されないからである。ま九、７７−ジ遺伝子神入
物はカブ七ル化されないので後の転写に利用され続ける
０次いでＳａｔ亀の人工的漫画は所望の生産物を高収率
で遊離する。

その他の例として５本ｌｉ―の１１８ム様ポリベグチド
を暗号化する遺伝子の暗号化配列は、エッチ・キュツバ
−等、「７ツト・アンド−マウス病つィルスＯ主ＩＩ抗
原の魯ＤＮムのクローン化およびイー・コリにおける表
現」、ネイチャ誌、第一１６．籐１！１〜！！り頁（ｉ
ｙｔ／）にＦＭＤＶの抗原性を示すポリペプチドを暗号
化する遺伝子につき実質的に記載されえように。

ＰＬ劃側下で衆構ベクター中に挿入することができる。

さらに、゛本発明によｐ作成され九１１８ム橡ポリペグ
チドの収率は、現在ＯＤＮム配列のコドンの幾つかまた
Ｆｉ全てを異なるコドンで置換することにより教養しう
ろことが了解堪れよう。

これらの置換コドンは、交換されたコドンによｐＷ＃号
化されるものと同様または同一のアンノ識を暗号化する
であろうが、より好ｔｔ、、＜ＵＨ８ム生童生産し選択
され九特定Ｏｖｓ主においてＩ！現されるであろう。

最螢に１本発明の組換ＤＮム分子によｐ生産されるポリ
ペプチドの活性は１本発明の範ａｔ逸脱することなく周
知手段により１本発明のＤＮム配列もしくはポリペプチ
ドを断片化し、改変し、ｔたは誘導体化させることによ
り改豐することができる。

本発明によりＤＮム配列を単一し、かつこれを表現制御
配列に結合する１つの例として上記のベクターからＨ８
ム／ＪＪ−／（１１鳳−：μ孔（＋（ＩＲＩ）−Ｈａム
／／７−Ｊ（！ｆｉ４厘−４遼ＲＩ）を単一し。

これを他の表現ベクターにおけるＴＡＣグロプロタの下
流に結合させえ。

この作成を行なうため、前記のように単一されたｐＫＴ
コ／ｆ（１１８ム／ＪＪ−／（、！Ｌ！思−狗ｏＢＩ）
−１１ｇ１ム／／７−Ｊ（軽量−μｓｏ　ＲＩ　））を
篇！図に示したようｆＣＩＣ５ｏ　ＲＩおよびＨｉｎｄ
鳳によって制限化しえ０次いで、触８！末端にＨ８ム暗
号化配り樋を有するα阻ＲＩ−Ｈ４ｎｄ鳳断片をＴＡＣ
表１Ａ−一配列を有するｐＫＩｃ／／弘−／／　　＜：
Ｌルゲン・１０シウスによｐ、、嵜ｍ−ａｒｔ。

たもの）から（ＤＩＳ＠凰ｌ−１１ｉａｄｌ　　断片と
混食し九。得られた断片（これは２つの現μＩ末端を有
ｆ　ｂ　）　を次イテｐ　ＫＫ／　０−Ｊ　（ｐ　Ｂ　
ＢＪＪＪのｓｓ体であり、エルゲンのプルシラスの寄贈
にかかる）のＨ１ｍｄ■断片と組合せることによ！０１
１４ｍ！化させ友。この組換ＤＮム分子を　ｐｘｔコ／
１−ＴＡＣ（ｊｉｉｉム／Ｊ　Ｊ　−／　（Ｂｇｌ　ト
Ｅ＜υＲＩ）−Ｈ８ム／／７−Ｊ（シ已ト４ぴＲ１））
また拡ｐｏＨ８ム／Ｊ　と命名し良。　この組換ＤＮム
分子でイー・コリ　ＨＩＡ１０／を形゛賀転換させると
、２０〜３０倍７４いＨ８ム様ポリペグチト０の生産が
観察された。ｐＫＴコ／ｒ−ＴＡＣ（Ｈ８ム／３３−７
（１年り匹−１鳳−魚ＲＩ　）−［８ム／ｌクーＪ（！
ｌ！　Ｉ−α阻ｊｉＩ））で形質転換された宿主におい
て生態されるＨ８ム様ポリペプチドの位置を決定する九
め、硫黄を含有しない培地〔アール・ビー・ｐパーツ等
、［イー・コリにおける生金或の研究］、キルビー・リ
トグラフインク・カンパニー１イ゛ンコーボレイテツド
＊　１ｉｕ員（／ｆＪ７））１０−において、イー嗜フ
リＨＢｔｏｉｃｐＫＴコ／ｆ−ＴＡＣ（１１８１／１ｌ
−１（！Ｌ！思−初ＲＩ）−Ｈ８ム／／７−Ｊ（）竺ｇ
ｌｌ−ＫｏｏＲＩ）））（）培養物２ｄｆＯＤ＝０．２
１で培養した０次いで、この培養物をｊｉｕのＩＰＴＧ
で１１発させ、そして培養をｏＤＱｏ、ｚまで続は九。

次いで、培養物を８−Ｈｌ５ｏ４で＠１１！シ（ｊｆｆ
ｌ＠、％　３０分間、７７℃）、−ｔしてＩＥ心分離し
た（７分間、ｌコ０００　ｒｐｍ　）　、ベレットをト
リス−ｋｌｃｌ（ｌｉｔ）、２１％Ｊ１−１Ｊｊμｌリ
ゾチーム（１０Ｎ／ＷＬＩ）および水中にｌｊ分間再懸
濁し、そして豊び違心分−しく７分間、／２０００　ｒ
ｐｍ　）　、上澄ａ（形質転＊細胞の外負量自７ラクシ
ｌンを含有する）を除去シ良、ベレット（スヘログラス
ト）をλコＩμノのトリス−１１ｃｊ（ｐＨｊ）中に再
懸濁させ、ＪＪＩＩｉｉｌ−とｔａｚｓｚのトリトン−
湊曹混會物〔ｏ、ｉｊモルのトリス−ＨＣｊ、（ＰＨｆ
）、００２モル０ＥＤＴＡ、コチのトリトンｘｉｏｏ〕
を加えた。混合物を水中でｌＩ分間靜装し１次いで遠心
分離（１分間、／２０００　ｒｐａ＋、　４”Ｃ）　し
て。

細胞残骸を除去した（上澄液は形質転換宿主細胞の細胞
内ｊｌ自７ラクシ冒ンを含有する）。

次いで、外質フラクシ曹ンを含有する上澄液および細胞
内フラクシ曹ンを含有する上置値をＨ８ム橡ポリペプチ
ドの存在につ亀分析した。

１ｏｏｏ倍過−Ｏ抗Ｈ８ムを両フラクシ１ンに加え、こ
れらを３７℃にて１時間静置し良。次いで、３ｏｏｓｌ
のセファロース蛋白Ａ　（Ｊ　０１１９／ＩＩＩＪ）を
加え、この混合物を室温にて１時間静置し、そして遣る
分離した（１分間、ｌコ０００ｆ　ｐ醜）　、　ペレッ
トを／−のＮＩＣＴ−Ｎｌ叡１１ｉＱ〔０，４１モルの
ＮａＣｌ　、　ｊ　ｉリモルのＥＤＴＡ％ｊｏミリモル
のトリス−ＨＣｊ（ｐ）１７．ｊ）、ｌ−のトリトンＸ
１００〕中に再懸濁させ、遠心分離しく１分間、ｌコ０
００　ｒｐｍ　）　、ｒｒＩＪじｓｎａ中ＫＮｊｌ濁し
、遠心分離しく１分間、ｌコｏｏ。

ｒＰ−）ｍそして同じｉｉ＊淑中に再懸濁させたが。

九だしこの場合ｌｌｌ鈎液は０．４１モルのＮｍ　ＣＩ
でなく０，１１モルのＮａＣ４とした。再懸濁および遠
心外−のむの過程を一回反復し１次いで最終ペレットを
ＪＯμノのラメレ＆衡箪中に烏濁させ良、ゲルを分析す
ると、外質クラクションにおける形質転換宿主で生産さ
れたＨ８ム橡ボリペグチドの約１０％の存在と、＃１ｌ
ＩｌＪＩＩｌ内７ラクシｌンにおけるｋＸＳＡ様ポリベ
グチドの約１０％の存在とが示された。

この宿主で生産されたＨ８ム様ポリペプチドは、天然の
ＨＳムより４小淑であると思われ九。

このようにＩｌ察され良家るｆＩＩＡ度の寸法の差社。

ＩＮＳム暗号化配列における３４個のヌクレオチドの喪
失によって説明することができる。しかしながら、この
寸法の差ｄ、３４個のヌクレオチドＯ喪失にｌａＳ号化
される／Ｊ伽のアミノ酸で説明しうるものよりも大であ
る。したがって、さらに寸法の葺＃′ｉ、内ｓｇａ細か
らの蛋白質の生型、蛋白質の分解を良は不正確な地層に
よって説−することができる。いずれにせよ、ポリペプ
チドは、天然Ｒ８ムと一歇する免疫学的ｆｒｌ性を示し
た。

さらに上記の構造は単一ヌクレオチドによシペニシリナ
ーゼを暗号化する遺伝子とは相がずれ７（Ｈ１ｉム暗号
化配列を有するので、これを使用してペニシリナーゼを
暗号化する遺伝子とＨ８ム関連ＤＮＡｌｌＦｒ片との間
に正確な読枠を有する構造物を調製し良。菖６図に示す
ように、この構造物を見り−Ｅ鳳によって制限化し、こ
の断片の重複末端にクレノー断片な諷め九。次いで、Ｄ
Ｎムをさらに旦すＲ１で制限化し、そしてよシ大きなシ
ｔｉｌｌ−μ勘ＲＩ断片を単離し友、この断片を予めＥ
ｅｏＲｌおよびシ土ｌによって制限化され、かつ漁めら
れた（クレノー断片、ｄｃＴＰの＋）プラスミドｐＴＫ
ＪＪＦ（ケ一・タルマツチ勢、上記）とから単一された
断片と組合せ九。得られた作成物は、ペニシリナーゼを
暗号化する遺伝子の部分とＨ８Ａ＠連晰号化配列との間
に１個のヌクレオチドが少ないものであった。このヒブ
リド分子をｐ＠Ｈ８Ａ／Ｊと命名した。こ（ＤＦＩＩ：
、Ｒヒブリド遺伝子により形質転換されたイーＩコリ１
１ｍ１ｏｔによって生産され７’ｊ−Ｈ８Ａ様ポリペグ
チドＯ分析は、ｐＫＴコ／＃−ＴＡＣ（Ｈ８ム／　Ｊ　
Ｊ　−／　（シ已思−桓ＲＩ）−Ｈ８ム／／７−Ｊ　（
Ｂｇｌ　１−ＥｅｏＲｌ　）　）で形質転換された宿主
におけると＃１は同量のル８ム様ポリベグチドが細胞／
ｌ１１ｍりに生産され九ことを示した。表現のレベルは
約ダ、１ｘ１０　　分子／細胞である。さらに、この生
ｉｉｗは天然Ｒ８ムとほば同じ８Ｄ８／アクリルアｉド
ゲル上の寸法を有した。この仁とは予想外である。何故
なら、この生産物は上記の３６個のヌクレオチドが削除
されたＤＮム配列から誘導されたからである。

さらにＨａＡ様ポリペグチドを暗号化するＤＮＡｋ、判
を特徴とする他の懺楓畢を調製し九。

これらの作成は、Ｊ４１／Ａ（ＤヌクレオチドＢｇｌ鳳
−シリ鳳の一除を伴なわずに、■８ム様ポリペプチドｔ
ｅ号化するＤＮム配列を生魚すぺ（設計しえ、さらに、
　＊ｉａ制御配列と傷号配り植との各種の組合せをＨ区
ムｗＩＩ号化配列の前に使用するよう設計し九。

第７ｅＡにつ自説明すれば、こζに祉Ｘｂａｌ／ｉｓｏ
　ＲＩでの分解および再結集によるｐＫＴＪ／ｒ（Ｈａ
ム／Ｊ　Ｊ　−／　）とｐＫＴＪ／ｆ（１１８ム／／７
−３）とからのｐ＠ＨｌムＪＯの作成が図示されている
。この過＄Ｆｉ、１８ム暗号化配列のＢｇｌｌの１ＩＩ
Ｊ＠によってもたらされる。７４備のヌクレオチドの削
除を回避している。この場合。

Ｐ＠ＨａムＪ０を使用してｐ　＠ＨＢムＪ／およびＰ・
Ｈ８ムＪＪを生産させえ、これらの組換ＤＮム分子はｐ
ＧＦＹコｉｔ＜エルゲン・プ四シウスの寄贈にがかる）
から靜導され九ＴＡＣＩＩ塊制御配列を有する。イー・
プリＷ！ｌ１０ＩＱをｐｃＨ８ＡＪＪＫよって形質転換
させた。イー・＝す’ｉｌＪ／１０ＩＱは、ＴＡＣ懺楓
制御配列（たとえＩｆ　Ｐ＠　１ｉａＡＪ−２Ｃ）ＨＢ
　ｋ暗号４Ｆ、に、ｌＵ　）　Ｏｌｕ制御下にＤＮム配
列の表楓をＩＰＴＧによる誘発ｔで抑制するＬ遺伝子に
失熱Ｉｃａを有する１株である。ＩＰＴＧによシＩ１１
発させると、形質転換され九−株は約１０００分子／＃
１胞の１１８ム橡ボリベグチドを生産した。このポリペ
１チドは天然Ｈ８ムとほは同じ寸法（８０８／アクリル
ア建トグル）を有し九。

さらに、ｐｏＨ８ムＪ／とｐ＠Ｈ８ＡＪＪとｔ使用して
組換ＤＮム分子（ｐ＠１ｉ１８ムＪ４）を作成し、この
場合Ｈ８ム暗号化配列はＴＲＣ表鴇制御配列の制御下に
おいえ、Ｔｉｃ配列（エルゲン・プ四シウムのを贈にか
かる）紘、前記ＴｉＣ系の誘導体である。Ｐ（ｌＨ８ム
Ｊ４の作成につき第１図に示す。

Ｐ　＠　ＨＢ　Ａ　Ｊ≦を使用してイー・コリＷＪ／１
ｏＩＱを形質転換さぜた。前記のように誘発させ友後。

形質転換され九菌株は天然）１８ムとほぼ同じ寸法（８
Ｄ８／アクリルアｉドゲル）の蛋白ｊ［を多量に生産し
良。さらに、この蛋白質は抗体沈澱の後に主として目に
見える単一バンドとして軟われる。したがって、仁の作
成物すなわち本発明の最も好適な作成物は多量のＨ８ム
橡ボリベグチドを生産すると信じられる。しかしながら
、形質転換され良智主は誘発ＩＬ俵に死滅する。

これは、横主によ夕生成畜れた多量のＨ８Ａ橡ポリペグ
チドＯ毒性作用による−のと償しられる。他の１株およ
びその増矯もしくはｌＩ発条件社、ｐ＠１１８ムＪ４に
より形質転換された１株の雑持および所ｉｌ修童物の多
量の生産を可能にする。

微生物、ＤＮム記動およびζこに記載した方法によｐ作
成される組換ＤＮム分子は、ｌりｔｉ＄ｉコ月ｌ＃日付
でメリー２ンド州、ロックビル在のアメリカン・タイプ
・カルチャ・＝レクシ冒ンの墳養物コレクシ曹ンに寄託
し九培養物によシ例示され、Ｈ８ムームとして同定され
かつムＴＣＣ受ト書号ＪりＯＪｊ号が付与された。

ム寞イーψコリＨＩＩ１０／（ｐＫＴＪ／Ｉ（Ｈａム／
ＪＪ−／（シ已ト１駐ＲＩ）−Ｈ８ム／／７−Ｊ（！Ｌ
！ｌ−Ｅｔ四Ｒ１）　）　） 本発明のその他の徽生物、ＤＮム配列および組換ＤＮム
分子は、１１１２年１１月　６　日付轄でメリーランド
州、ロックビル在のアメリカン−タイプ噛カルチャ１１
コレクシ田ンＯ培襲物＝レクＶＮンに寄託され、Ｈ８ム
ーＢとして一定されかつムＴＣＣ受託番号−０９１７号
が付与された。

ＢＳイー拳コリＷＪ／１０Ｉｑ（ｐａ１ｍム７４）以上
１本発明の多くの具体例につ龜配叡したが１本発明の基
本的構成を変化させて１本発明の方法および組成物を利
用する他の具体例を提供しうることが明らかである。し
たがって本発明の範囲は実施例として上記し次特定具体
例のみに限定されないことが了解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のヒト血清アルプ建ン様ポリベグチドの
製造方法の一具体例を示す略ａ明図でＴｏｎ。 ｍ２図は重置−のＪＩＩのＤＮム配列および組換ＤＮム
分子ｓ　ｐＫＴコ／１（ｋＩＢム／ＪＪ−／）。 ｐＫＴ２／Ｉ（Ｈａム／／７−１）またはｐＫＴコ／１
（ａＳム／ＪＪ−／（！！ｌ！鳳−４鳳凰４）−ｍｉｘ
ム／／　７−Ｊ　（ジ已履−！駐卑Ｉ））Ｏ藝分制限地
園であって、最初０Ｊ）４り配列を組合せて纂ＪＯもの
Ｖｔ製造することを示し。 ＠Ｊ＠ハＤ　ＮＡ配ｑｌｉ＃Ａ／７７−／　（Ｂｇｌ　
ｌ−！！！凰１）−菖８ム／／７−Ｊ（、！Ｉｇｌ鳳−
ＮａｏＲＩ）の部分−＠ＳＳおよびそのヌクレオチド配
列の部分を決定する九め使用する方法を示す園であｊＩ
（示し九距離は概略であって、ヌクレオチドの配列決定
によｅｉｉｉｉｉする仁とができる）。 第参図は１１８ｈ／７７−／　（Ｉ１ｇｌ鳳−！ρμ―
ｏＲＩ）−１１８ム／／７−Ｊ（！Ｌ！鳳−１≦ト１９
凰■）のヌクレオチド配列の部分およびこれら部分の暗
号化領域の７ｔノ駿配列を示す園であ〕。 纂１５４社本弛明Ｏ他Ｏ組換ＤＮム分子の製造方法を示
す略図であり、 １１／４４図は本発明Ｏ他Ｏ組換ＤＮム分子の製造方法
を示す１１図であり。 第７図は本発明の他の組換ＤＮム分子の製造方法を示す
略図であり。 ＠Ｉ脂は本発明のさらに他の組換ＤＮム分子の製造方法
を示す略図である。 図面の浄書（内容に変更なしλ セト物先のべｃｏＮＡ４＄６鞠 Ｆ／、θ、１ Ｆｌｏ、２ ｐｃｒ　ｌ／Ｉ（ＷＳＡ／／７−Ｊ）　　　　　　　１
第１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番−Ｃ１
２Ｐ　２１１００　　　　　　　　　　　７２３５−４
８８ Ｂ ８ ８ Ｂ ８ Ｂ ４Ｂ ４Ｂ ４Ｂ 号　０発　明　者　バーバラ・ウオルナー・フィリップ アメリカ合衆国マサチューセラ ツ州０２１６１ニュートン・ロック レッジ・ロード３２番 手続補正書（方力 昭和５８年４月（３Ｌ１ 特許庁長官　若　杉　和犬　殿 １、事件の表示 ＠０５７年特許願第　２１’＋９１８　号２、発明の名
称 Ｄ　Ｎ　Ａ配列、組換ＤＮＡ分子およびヒト血清アルブ
ミン様ポリペプチドの製造方法 ：３．績＋Ｅをする者 事件との関係　　　特許出願人 ４、代　理　人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）少なくとも１部分がヒト血清アルブ建ンの免疫学
   的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを暗号化し
   かつ（ａ）Ｈ８Ａ／３３−１　。 １（８Ａ／１７−５．１−１８人／３３−１（１〔菖−
   ｇｃｏＲＩ）−８８ム／１７−！Ｓ（８ｇ１厘−ＩＡｃ
   。 凡Ｉ）、ｔｉ８１８ム／３３　（堕■−且要Ｒ，Ｉ）−
   Ｈ８人／１７−　Ｓ　（ＸｂａＩ−１ｉｌｃｏＲＩ　）
   、　　（ｂ）前配置）Ｎ人配列のいずれかにヒ“ブリド
   化するＤＮＡ配列、（Ｃ）供給源の種類を問わず、天然
   １合成もしくは半合成の供給源、突然変異ＫＩＩＩ遜す
   るものを包含し、さらに前記ＤＮＡ配列のいずれかに関
   し、単一もしくは多重の塩基置換ｄｅｌ＋除、挿入およ
   び逆転を包含する１）Ｎ人配列および（ｄ）前記ＤＮＡ
   配列のいずれかのコドンにより暗号化されるものと同機
   なア建ノ酸配列を含有するポリペプチドを暗号化するコ
   ドンの配列からなるＤＮＡ配列よりなる群から選択され
   、前記ＤＮＡ配列配列−赫）はヒ、ト血清アルプ建ンＯ
   免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを暗
   号化することを特徴とするＤＮＡ配列。 ■　特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列からなる組
   換８８人分子。 （５）ＤＮＡ配列が表現制御配列に作用結合されている
   特許請求の範１１ｊ１２項記載の組換８８人分子。 鱒）　表現制御配列をイー・コ、す（Ｊｃｏｌｉ）ＩＡ
   ｃ系、イー・コリｔｒｐ系、イー・コリβ−１暑Ｃ系％
   ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、７アージλの主要オペレータおよ
   びプロモータｌｋｔ　フィラメント状の単一鎖ＤＮ人７
   アージの制御領域、原始値もしくは成熟核細胞およびそ
   れらのフィルスの遺伝子の表現を制御するその他の配列
   ならびにそれらの組合せよりなる評から選択される特許
   請求の範ＷＡ＠５項記載の組換１）Ｎム分子。 （５）　　ｐＫＴ２１８（Ｈ８人１５３−１　）、ｐＫ
   Ｔ２１８（ＦＡ、８Ａ／１７−３）ｌＫＴ２１８（ｉ（
   ８ム／！、３−１　（ＢｇｌＩ−Ｊｉｃｏ＆Ｉ）−Ｈ８
   Ａ／１７−５（Ｈｇｌ７−５（Ｈ凡Ｉ））、ｐＫＴ２１
   ８−ＴＡＣ（ｋｉｓ人／３３−１　　（Ｂｇｌｉ−Ｅｃ
   ｏＲＩ）−ｋｌＢｋ／１７−３　（Ｂｇｌｌ−１ｉ１ｃ
   ｏＲＩ））５、ｐｃｋｉ８ム３２およびｐｃｋｌＢム３
   ６　よ〕なる群から選択される特許請求のｌｉｓ第４項
   記載の組換ＤＮＡ分子。 藝）　特許請求の範ａｍ１４項または嬉５項記載の少な
   くとも１種の組換ＤＮＡ分子によｐ形質転換されえ宿主
   。 σ）　形質転換宿主をイー・コリ、シュードモナｘ　（
   Ｐｓ＠ｕｄｏｍｏａａｓ　）　、枯草ｔｌｉ　（Ｂａｃ
   ｉＨｇｇ＠ｕｂｔ目ｉ）、高熱１ｇ（Ｂａｃｔｌｌｕｓ
   　ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈ口ｕｓ）ｓその他の
   ＋１ｉａｓｒ、　＊母、真ｍ類の一株、動物および植物
   宿主ならびにヒト組繊細胞よルなる群から選択する特許
   請求の範囲＃Ｉ６項記載の形質転換宿主。 （８）４−”：）１７Ｈ８１０１（９ＫＴ２１８（Ｈ８
   Ａ／３３−１　））　、イー−コリ）ｉＢｌｏｌ（１）
   ＫＴ２１Ｂ（ｋｉａ人／１７−３　）　）　、イー拳コ
   リｄＢ１０１　（ｐＫＴ２１８（ｉ（８人／３５−１３
   ５−１（Ｂノ）ジ！８１＞−ｋｌｓ人／１７−３（且１
   ↓墓−２厚蝉３ミ！≧−几１）））、イー・コリＷ５１
   １０ＩＱ　（ｐｃＨｓム５２）およびイーリリＶＬ５１
   １０ＩＱ（ｐｃＨ８Ａ６６）よｐなる群から選択される
   特許請求の範囲第６項または縞７項記載の形質転換宿主
   。 （９ヒト血清アルブきンの免疫学的もしくは生物学的活
   性を示しかつ特許請求の範Ｈｕｂ項乃至摸８項のいずれ
   かく記載の形質転換宿主により生産されるポリペプチド
   普九はその断片もしくは誘導体。 （１０）少なくとも１部が特許請求の範！ｊ！Ａ第１項
   記載のＤＮＡ配列によプ暗号イヒされ九本のであるポリ
   ペプチド・ （１１）　４１１１’Ｆ−請求の範Ｓ篇１項記載のＤＮ
   Ａ配列をクローン化ベヒクル中へ導入することを特徴と
   する組換ＤＮム分子の製造方法。 （１２）クローン化ベヒクル中に’ｌＲ現制御配列を導
   入する工１ｉをさもに含み、前記表′ｉＡ制御配列ヲ前
   記クローン化ベヒクル中に導入して前記ＤＮＡ配列の表
   属を制御および調節する特許請求の爲Ｓ第１１項記載の
   方法。 （１５）特許請求の８８８４項または第５項記載の組換
   ＤＮＡ分子を宿主中に導入する工程を含む宿主の形質転
   換方法。 （１４）適当な宿主を特許請求の範囲第４項ま九は第５
   璃記載の組換１）ＮＡ分子によ）形質転換させ、前記宿
   主を培養しかつポリペプチドを回収する工程からなるヒ
   ト血清アルブミンの免疫学的もしくは生物学的活性を示
   すポリペプチドの生産方法。 （１５）形質転換宿主をイー・コリ、シュード七ナス、
   枯草菌、高４１１１．その他の５ｔａｒ、酵母。 真−の−株、動物もしくは植物宿主およびヒト組繊細胞
   よ＾る群から選択する特許請求の範囲＄１Ｅ１４項記載
   の方法。 （１６）％許請求の範囲第４項または第５項記載の組換
   ＤＮＡ分子によｐ形質転換され喪宿主を培養し、かつポ
   リペプチドを回収する工程からなる。ヒト血清アルブミ
   ンの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
   の生産方法。 （１７）ヒト血清アルブミンの免疫学的もしくは生物学
   的活性を示すポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列ｔｉ
   ｎＯＤＮＡ配列から選択するＫＩＩＬ、前記群の１）Ｎ
   Ａ配列をスクリーニングして特許請求の範１８第１項記
   載のＤＮＡ配列の少なくとも１種にヒブリド化するもの
   を決定することを特徴とするＤＮＡ配列の選択方法。 （１８）スクリーニングされる１）ＮＡ配列を天然供給
   源からの１）ＮＡ配列、合成りＮＡ配列、組換１）ＮＡ
   分子からのＤＮｈ７列および前記ＤＮＡ配列のいずれか
   の組合せであるＤＮＡ配列よりなる群から選択する特許
   請求の範囲館１７項記載の方法。 （１９）特許請求の範Ｓ篇９項ｔたは１１１１１０項記
   載のポリペプチドおよび特許請求の範１１Ｊ１１４項乃
   至ｌ１１６項のいずれかの方法で生産されるポリペプチ
   ドよ〕援る騨から選択されるポリペプチドからなること
   を特徴とする特許許容しうる組成物● （２０）％杵饋求の１１４１３１１１９項記載の組成物
   にょり医薬上許容しうる方法でヒトを処置することを畳
   黴とするヒトの処置方法。