JPS63102684A - 遺伝子およびその利用方法 - Google Patents

遺伝子およびその利用方法

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JPS63102684A
JPS63102684A JP61266160A JP26616086A JPS63102684A JP S63102684 A JPS63102684 A JP S63102684A JP 61266160 A JP61266160 A JP 61266160A JP 26616086 A JP26616086 A JP 26616086A JP S63102684 A JPS63102684 A JP S63102684A
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serrapeptase
dna
amino acid
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中浜　一雄
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医薬品等として有用なセラペプターゼ（Ｓ　
ｅｒｒａｐｅｐｔａｓｅ、国際一般的名称）またはセラ
ペプターゼ様抗炎症作用を有用するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡおよびその利用方法に関する。
従来の技術 抗炎症剤などの医薬として有用なセラペプターゼ′の製
造法としては、たとえばセラチア属菌の培養による方法
が挙げられる（特公昭４１−１０１９３号公報、米国特
許第３，６９１．０１４号公報参照）。しかしセラペプ
ターゼ遺伝子のクローニングは未だなされていないため
、遺伝子工学技術によるセラペプターゼの生産は、実施
されていな発明が解決しようとする問題点 セラチア属菌の培養によりセラペプターゼを生産する場
合、遺伝子槽ｒＩＩｌこよって、セラペプターゼの産生
量をより増大させることが期待される。
また、セラチア属菌によってセラペプターゼと同時に産
生されるＤ　Ｎ　ａｓｅなどの蛋白質の産生を減少させ
ることにより、セラペプターゼの精製が簡略化され得る
ことが予想される。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、セラペプターゼを産生ずるセラチア属菌
の染色体ＤＮＡからセラペプターゼ遺伝子を含むＤＮＡ
領域をクローニングし、このクローン化したＤＮＡを含
むプラスミドで形質転換体を製造すると、該形質転換体
は、著量のセラペプターゼを産生ずること、さらにセラ
ペプターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドを産生ず
ることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究した
結果本発明を完成した。
本発明は、セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプ
ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれたプラスミド、該プラス
ミドで形質転換された形質転換体。
そのＮ末端にＭｅｔを有していてもよい第３図の第（１
）番目から第（４７０）番目のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、その部分ポリペプチドまたはそれらの一部
のアミノ酸残基が置換、挿入、付加もしくは除去された
セラペプターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチド、お
よび これらの製造法ならびに用途を提供するものである。
さらに本発明は、プロテアーゼなど遺伝子組換え技術に
よる蛋白質の製造などに有用な式％式％ ］ で表わされる塩基配列またはその部分配列であるＤＮＡ
、式 ％式％ ［］ で表わされるポリペプチド、その部分ポリペプチド、ま
たはそれらの一部のアミノ酸残基が置換。
挿入、付加もしくは除去されたポリペプチド、およびこ
れらの製造法、使用法をも提供するものである。
上記セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプターゼ
様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
に関し、例えば一般式 ％式％ ［１］ ［式中、ＸｌはＴまたはＧを、ＸｔはＴまたはＧをそれ
ぞれ示す。］の塩基配列で表わされるＤ　Ｎ　Ａとハイ
ブリダイズする特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡや一
般式 ％式％［ ［式中、Ｙ、はＴまたはＣを、Ｙ、はＡ、Ｇ、Ｔまたは
Ｃを、Ｙ３はＴまたはＣをそれぞれ示す。］の塩基配列
で表わされるＤＮＡとハイブリダイズするＤ　Ｎ　Ａが
挙げられる。
またその５′末端にＡＴＧを、３′末端にＴＡＡ。
ＴＡＧおよびＴＧＡのコドンのうちの−っまたはこれら
の二つの連続したものを有する第３図の第７３１番目か
ら第２２３６番目で表わされる塩基配列［ＩＩＩ］、そ
の部分配列またはそれらの一部の塩基が置換、挿入、付
加もしくは除去された塩基配列を含有するＤＮＡ。
その５′末端にＡＴＧもしくは水素原子を、３′末端に
ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡのコドンのうちの一つまた
はこれらの二つの連続したものを有する第３図の第８２
７番目から第２２３６番目で表わされる塩基配列［ＩＶ
’］であるＤＮＡ、および第３図の第１番目から第２５
７０番目で表わされる塩基配列、その部分配列またはそ
れらの一部の塩基が置換、挿入、付加もしくは除去され
た塩基配列を含有するＤＮＡなどが挙げられる。
さらに式 ％式％ ３５個から４５個のアミノ酸残基−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ　−７０個から
８０個のアミノ酸残基−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌａ−Ｌｙ
ｓ　−Ｓｅｒ　−Ｐｈｅ　−Ｓｅｒ　−Ａｓｐ　−Ｖａ
ｌ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙて表わされるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡやその 該アミノ酸配列の一部のアミノ酸残基の置換。
挿入、付加もしくは除去されたアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡなどが挙げられる。
なお、上記アミノ酸配列の一部のアミノ酸残基が置換、
挿入、付加もしくは除去に関し、例えばＩｌｅがＬｅｕ
またはＭｅｔで置換されたもの。
Ｉｌｅ　−Ｇ　ｌｙ　−ＨｉｓがＩ　ｌｅ　−Ｔ　ｈｒ
　−Ｈｉｓで置換されたもの。
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　がＨｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、
Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＶａｌまたはＨｉｓ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｖ　ａｌて置換されたもの。
Ｇ　ｌｙ　−Ｈｉｓ　−Ｔｙｒ　が　Ｇ　ｌｙ　−Ｖａ
ｌ　−Ｈｉｓ　−Ｔｙｒて置換されたもの。
Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｈｅがＧ　
ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｈｅまたはＧ　Ｉｕ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ｉｌｅで置換されたものなどが例示される。
上記ＤＮＡがコードするポリペプチドとして、例えば第
３図の第（１７６）番目から第（３１５）番目のアミノ
酸配列を含有するポリペプチド。
第３図の第（１４６）番目から第（３６５）番目のアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチドなどが挙げられ、さら
に第３図の第（−３３）番目から第（ＡＴＧ）番目のア
ミノ酸配列［ＶＩ］で表わされるポリペプチド、その部
分ポリペプチドまたはそれらの一部のアミノ酸残基が置
換、挿入、付加もしくは除去されたポリペプチドや、 そのＮ末端にＭｅｔを有していてもよい第３図の第（１
）番目から第（４７０）番目のアミノ酸配列［■コを有
するポリペプチドなども例示される。
上記式［ｍ　＝および［Ｖ］で表わされる塩基配列また
はその部分配列は、置換、挿入、付加および除去を組み
合わせて得ることもできる。
上記式［■］および［ＩＸ］で表わされるポリペプチド
またはその部分ポリペプチドは、置換、挿入、付加およ
び除去を組み合わせて得ることもできる。
なお、本明細書においては、セラペプターゼポリペプチ
ドまたはセラペプターゼ様抗炎症作用を有するポリペプ
チドを「セラペプターゼ類」と称することもある。
また、セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプター
ゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを「セラペプターゼ類遺伝子」と称することもある。
本発明のセラペプターゼポリペプチドまたはセラペプタ
ーゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡは、たとえばプロテアーゼを産生ずるセラチア（Ｓ
　ｅｒｒａｔ　ｉａ）属菌の染色体ＤＮＡから得ること
ができる。
上記セラチア属菌としては、たとえばセラチア・ミルセ
ッセンス（Ｓ　ｅｒｒａｔ　ｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓ）が挙げられる。具体的には、たとえば、セラチア
・ミルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４，セラチア・ミル
セッセンスＩＦ０３０４６．セラチア・ミルセッセンス
ｌＰＯ３７３５などが挙げられる。
上記ＡＴＣ０２１０７４味は、昭和４２年（１９６７年
）５月１５日にジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（Ｔ　ｈｅ　　Ａ　ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　ＣｏＩｌｅｃｔｉｏｎ、　　
ＡＴＣＣ）に寄託され、該ＡＴＣＣ発行のアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション・カタログ・イン・
バクテリア・ファージズ・アンド・アールディーエヌエ
イ・ベクターズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　ＴｙｐｅＣｕＨ
ｕｒｅ　　ＣｏＩｌｅｃｔｉｏｎ　　Ｃａｔａｌｏｇｕ
ｅ　　ｏｆＢ　ａｃｔｅｒｉａ、　　Ｐｈａｇｅｓ　　
ａｎｄ　　ｒＤ　Ｎ　Ａ　　Ｖ　ｅｃｔｏｒｓ）第１６
版、１９８５年に掲載されている。
上記ｌＰＯ３０４６株およびｌＰＯ３７３５株は財団法
人発酵研究所（ＩＦＯ）発行のインスティテユート・フ
ォー・ファーメンテ−ジョン・リスト・イン・カルヂャ
ーズ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　　Ｆｏｒｉ’；’ｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ　　０ｓａｋａ　　Ｌｉ５ｔ　　ｏｆ　
　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）１９８４年第７版に掲載されてい
る。
セラチア属菌の菌体からの染色体ＤＮＡの調製法はそれ
自体公知であり、たとえば、ｔ、ｏｖｅｔｔらの方法し
メソッズ・イン・エンジ−モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　６８　、３４
２（１９７９）］などに従って行われる。
このようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素で切断
する。染色体ＤＮＡは、制限酵素による部分分解物も利
用できる。
次に、このようにして得られた染色体ＤＮＡ断片をベク
ターＤＮＡにＤＮＡリガーゼを用いて連結する。
上記ベクターとしては、たとえば、Ｃｏ１ＥＩ由来のプ
ラスミドｐＢＲ３２２［ジーン（Ｇ　ｅｎｅ）、　２　
。
９５（１９７７）参照］、１）ＢＲ３２５［ジーン、±
。
１２１（１９７８）参照］、ｐＵ　Ｃ１２［Ｖ　１ｅｉ
ｒａ、　Ｊ　。
およびＭｅｓｓｉｎｇ　　Ｊ　、　、ジーン、１９．２
５９（１９８２）参照１．ｐＵＣ１３［ジーン、上記、
２５９（１９８２）参照コなどが最もよく利用されるが
、その他のプラスミドであっても、宿主内で複製保持さ
れるしのであれば、いずれをも用いることができる。
上記連結は、まず、ベクターＤＮＡを制限酵素で切断す
る。なお、一般的には、ベクターＤＮＡは、それを−個
所切断する制限酵素で切断するのが便利である。該切断
は、自体公知の方法に従って行われる。
上記ベクターＤＮＡに、該染色体ＤＮＡ断片をＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結するには、自体公知の方法に従って
行われる。
このようにして得られた組み換えＤ　Ｎ　Ａの中から、
目的とする組み換えＤＮＡを選択する。すなわち用いら
れる宿主−ベクター系としては、染色体ＤＮＡ断片をベ
クターに連結したのち、形質転換することによって、そ
の断片上にセラペプターゼ類遺伝子の存在が確認できる
ものであればいかなるものであってもよく、具体的には
大腸菌宿主−ベクター系が挙げられる。さらに具体的に
は、上記で得られたベクターに染色体ＤＮＡ断片を連結
した組み換えＤＮＡを用いて、自体公知の方法、たとえ
ばブロン−ディゲス・イン・ザ・ナショナル・アカデミ
−・イン・サイエンシズ・イン・ザ・ユナイテッド・ス
テイン・イン・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　
ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍ
ｙｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｕ
ｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓｏｆ　　Ａｍｅｒｉｃａ　
（以下、Ｐｒｏｃ、　　　Ｎａｔ、　　　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＩＪ、Ｓ、Ａ、と略称することもある。）。
６９．２１１０（１９７２）に記載の方法に従って大腸
菌を形質転換させる。形質転換体の選択は、用いたプラ
スミドの薬剤耐性を指標として行うことができる。たと
えばベクターとしてｐＢＲ３２２を使用すれば、まず、
アンピシリン耐性あるいはテトラサイクリン耐性で選択
できる。
さらにすでにアミノ酸配列の明らかになったセラペプタ
ーゼ類のアミノ酸配列に対応すると考えられる塩基配列
をもったオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これ
を３２Ｐでラベルしてプローブとなし、たとえばそれ自
体公知のコロニーハイブリダイゼーション法［Ｇ　ｒｕ
ｎｓｔｅｉｎ　　Ｈｏｇｎｅｓｓの方法：Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。
７２．３９６１（１９７５）］によって、すでに得た薬
剤耐性の形質転換体の中から求めるクローンを二次スク
リーニングすることができる。
プローブとしては、たとえばＬｅｅ、１．Ｓ、らの報告
［フェデレーション・ブロシーデインダス（Ｆ　ｅｄｅ
ｒａｔｉｏｎ　　Ｐ　ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）、土工、
Ｍａｒｃｈ　　ｐ。
１０５７（１９８５）］に記載されたセラチア・プロテ
アーゼのアミノ酸配列中の第４２〜５１１Ｈ１のアミノ
酸配列（Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｈ
ｒ　−Ｔ　ｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ　−
Ｖａｔ）から推測される塩基配列の連鎖である一般式 ％式％ ［１ ［式中、ｘｌはＴまたはＧを、Ｘ、はＴまたはＧをそれ
ぞれ示す。］の塩基配列で表わされるＤＮＡ。
または、上記セラチア・プロテアーゼのアミノ酸配列中
の第１４３〜１４７番目のアミノ酸配列（Ｔｒｐ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｉｎ　−Ａｓｐ）から推測
される塩基配列の連鎖である一般式 ％式％［］ ［式中、ＹｌはＴまたはＣを、Ｙ、はＡ、Ｇ、Ｔまたは
Ｃを、Ｙ３はＴまたはＣをそれぞれ示す。コの塩基配列
で表わされるＤＮＡが挙げられる。
前記式［１］で表わされるＤＮＡと式［１１］で表わさ
れるＤＮＡとの両者を用いてもよい。　　″これらプロ
ーブを使ったコロニーハイブリダイゼーションによって
陽性を示したクローンの塩基配列を、たとえばマキサム
・ギルバード（ＭａχＢ＠−Ｇ　１ｌｂｅｒｔ）法［Ｍ
ａｘａｍ、Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　　Ｇ１１ｂｅｒｔ。
Ｗ、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ、７４　。
５６０（１９７７）］あるいはジデオキシ法［Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ、　Ｊ　、ら、ニュークレイツク・アシツズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ）、　９　。
３０９（１９８１）］によって決定し、既知のアミノ酸
配列との比較からセラペプターゼ類遺伝子の存在を確認
する。その結果、セラペプターゼ類遺伝子をコードする
全領域がカバーされていない場合には、陽性を示したク
ローンから得られたプラスミドの挿入部を新たにプロー
ブとして再スクリーニングし、セラペプターゼ類遺伝子
全領域を含むＤＮＡ断片を調製する。
このようにして得られた形質転換体から、たとえばヌー
クレイック・アシッズ・リサーチ、Ｌ。
１５１３（１９７９）に記載の方法に従って、プラスミ
ドを抽出し、目的とするセラペプターゼまたはセラペプ
ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡが組み込まれたプラスミドが得られる。
なかでも、式［Ｖ］で表わされる塩基配列を有するＤＮ
Ａを製造するには、後述の実施例で示したようにプラス
ミド例えば、ｐＴ　Ｓ　Ｐ　２５を制限酵素Ｐｓｔｌで
部分分解することにより得ることが出来る。
同様にして式［１１１］、［ｌ’Ｖ］および［■コで表
わされる塩基配列を有するＤＮＡは上記プラスミドを材
料に、それ自体公知の方法、すなわち制限酵素によるフ
ラグメントの切り出しとライゲースを用いたフラグメン
トの連結および必要であれば化学合成したＤＮＡフラグ
メントの利用等を組み合せて製造することが出来る。ま
た全配列を化学合成することも出来る。
塩基配列において、それらの一部の塩基を置換。
挿入、付加もしくは除去する方法としては、５ｉｔｅ−
ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓの方法［
メソツズ・イン争エンジーモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙＩＩｌｏｌｏｇｙ）Ｖｏｌ、　　
ｌ　ＯＯ，ｐ、　４６　Ｂ（１９８３）、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ　　Ｎ、　Ｙ、　］がよく利用される。
上記方法により、式［ＶＩ］で表わされるポリペプチド
、その部分ポリペプチドまたはそれらの一部のアミノ酸
残基が置換、挿入、付加もしくは除去されたポリペプチ
ドをコードするＤＮＡをも製造することができる。
このようにして得られたセラペプターゼまたはセラペプ
ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
Ｄ　Ｎ　Ａは、セラペプターゼまたはセラペプターゼ様
抗炎症作用を有するポリペプチドの産生のための構造遺
伝子として用いることができる。
また、このようにして得られた式［ＶＩ］で表わされる
ポリペプチド、その部分ポリペプチドまたはそれらの一
部のアミノ酸残基が置換、挿入、付加もしくは除去され
たポリペプチドをコードするＤＮＡは、該ポリペプチド
の産生のための構造遺伝子として用いることができる。
次に、上記で得られたセラペプターゼまたはセラペプタ
ーゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡが組み込まれたプラスミドを用いて、形質転換体を
製造する。
形質転換体を製造する際に用いられる宿主としては、た
とえばエシェリヒア（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌
。
セラチア属菌、バチルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ）属菌、
酵母などの微生物、動物細胞などの真核生物細胞などが
挙げられる。
上記宿主としてのエシェリヒア属菌としては、たとえば
エシェリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）が挙げられ、具体的にはたとえばエシェリヒア・コ
リＤＨ１株［ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２１７　
。
１１１０（１９６８）参照］、エシェリヒア・コリ３Ｍ
１０３株［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ。
９．３０９（１９８１）参照］、エシェリヒア・コリＪ
Ａ２２１株［ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ）１２０．５１７（１９７８）参照
］、エシェリヒア・コリＲＲＩ株［メソッズ・イン・エ
ンジ−モロジー、６８．２６２（１９７９）コなどが挙
げられる。
上記セラチア属菌としては、たとえばセラチア・ミルセ
ッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
）が挙げられ、具体的にはたとえばセラチア・ミルセッ
センスＩＦＯ３７５９，セラチア・ミルセッセンスＡＴ
ＣＣ２１０７４，セラチア・ミルセッセンスＩＦ０３０
４６．セラチア・ミルセッセンスＩＦＯ３７３５，セラ
チア争マルセッセンスＮｏ。
８７、セラチア・ミルセヅセンスＮＧ−４などが挙げら
れる。
上記セラチア・ミルセッセンスｌＰＯ３７５９株は、昭
和３３年（１９５８年）９月２３日に財団法人発酵研究
所（ＩＦＯ）に寄託され、該ＩＦＯ発行のインスティテ
ユート・フォー・ファーメンテ−ジョン・リスト・オン
・カルチャーズ１９８４年第７版に掲載されている。セ
ラチア・ミルセッセンスＩＦ０３７５９株の菌学的性質
は、ジャーナル・オン・バクテリオロジー（Ｊ　ｏｕｒ
ｎａｌ　　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１１．７６
−７７　（１９２６）に記載のそれと同じである。
上記セラチア・ミルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４の菌
学的性質は、特公昭４１−１０１９３号公報、米国特許
第３，６９１，０１４号公報に記載されている。
上記セラチア・ミルセッセンスＮｏ、８７株およびセラ
チア・ミルセッセンスＮＣ−４株は、それぞれ昭和６０
年（１９８５年）７月５日および昭和６１年（１９８６
年）４月１７日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託
番号ＩＦＯ１４４５４および１ＦＯＩ４５０４として寄
託され、またこれら微生物は、それぞれ昭和６０年（１
９８５年）１１月７日および昭和６１年５月２９日に通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（、Ｆ　ＲＩ
　）に寄託され、ブタペスト条約に基づき番号ＦＥＲＭ
Ｂｐ−１１８１およびＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１８２とし
て保管されている。
上記セラチア・ミルセッセンスＮｏ、８７およびセラチ
ア・ミルセッセンスＮＣ−４の菌学的性状は、バーシー
ズ・マニュアル・オン・デターミネイティブ・バクテリ
オロジ−（Ｂ　ｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌ　　ｏｒＤ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）第８版に記載のセラチア・ミルセツセンスのそれ
と同じである。
上記宿主としてのバチルス属菌としては、たとえばバチ
ルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ａｂｔｉｌｉ
ｓ）が挙げられ、具体的にはたとえばバチルス・サチル
スＭｌ　　１１４［ジーン（Ｇｅｎｅ）、２４．２５５
（１９８３）］などが挙げられる。
上記宿主としての酵母としては、たとえばサツカロマイ
セス・セレビシェ（Ｓ　ａｃｃｈａｒＯｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａ　Ｈ２２Ｒ″″　［Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０，１（１９８３）］などが挙げら
れる。
上記動物細胞としては、たとえばマウスＬ細胞。
チャイニーズ・ハムスター・オバリー（Ｃ）（０）細胞
、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。
上記エシェリヒア属菌またはセラチア属菌を形質転換す
るには、自体公知の方法に従えばよく、たとえば、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。
東９．２１１０（１９７２）、ジーン、１７，１０７（
１９８２）などに記載の方法に従って行われる。
上記バチルス属菌を形質転換するには、自体公知の方法
に従えばよく、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジエネテイツクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　＆　
　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　１６８゜１
１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なわれる
。
また酵母、動物細胞などの真核生物細胞の形質転換の方
法もそれら自体公知であり、たとえば米国特許　４，３
９９，２１６号に記載の方法に従って行われる。
さらにセラペプターゼ類の発現を高めるためには、得ら
れたクローンからセラペプターゼ類遺伝子の全部あるい
は一部をきり出し、適当なプロモーター゛配列の下流に
つないでこれを宿主に導入することができる。さらに、
必要な場合は、プロモーターの下流にＳＤ（シャインア
ンドダルガーノ）配列を挿入することもできる。
宿主として大腸菌やセラチア属菌を用いた場合には、プ
ロモーターとしては、たとえばトリプトファン（ｔ　ｒ
ｐ）プロモーター、バクテリオファージ由来のλＰＬプ
ロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、蛋白
質鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター、ｒｅｃＡ
プロモーターなどが挙げられる。
宿主としてバチルス属菌を用いた場合には、プロモータ
ーとしてはたとえばＳＰＯ１プロモーター、ｖｅｇプロ
モーター、Ｐｌプロモーター（特開昭６０−１３７２９
１号公報参照）などが挙げられる。
宿主として酵母を用いた場合には、プロモーターとして
、たとえば、ＰＨ０５プロモーター、ＧＬＤプロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨ０
８１プロモーターなどが利用できる。
同様に宿主として動物細胞などの真核生物細胞を用いた
場合にも、その生物種に適応したプロモーターを適時選
択して利用することができる。
このようにしてセラペプターゼ類をコードするＤＮＡが
組み込まれたプラスミドで形質転換された形質転換体が
得られる。
このようにして得られた形質転換体が細菌（エンエリヒ
ア属菌、セラチア園菌、バチルス属菌）、酵母である場
合、該形質転換体を培地に培養することにより、培養物
中にセラペプターゼ類を生成蓄積せしめ、これを採取す
ることにより、セラペプターゼ類を製造することができ
る。
宿主が細菌である形質転換体を培養する際、培養に使用
される培地としては、液体培地が適当であり、その中に
は該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物
その他が含有せしめられる。
炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または何機物質。
無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素
ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また
酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。とりわけ塩化カルンウム、２水和物を約０，１
％およびリン酸二水素ナトリウム・２水和物を約２％含
有する培地がプロテアーゼの生産に有利である。また、
培養するための温度、ｐＨ、時間などの条件は、セラペ
プターゼ類の生産およびその活性が最高となるように適
宜に定められるが、一般に培養温度はセラチア属細菌で
は約２５〜３５℃付近、エシェリヒア属菌またはバチル
ス属菌では約２０〜４０℃付近、培養ｐＨは微酸性から
微アルカリ性で特に中性付近が望ましく、培養時間は２
日間程度が好ましい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、Ｋ　、　Ｌ　、ら。
Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳ　
Ａ、７７．４５０５（１９８０）］が挙られる。培養は
通常的１５°Ｃ〜４０℃、好ましくは約２４°Ｃ〜３７
℃で約１０〜９６時間、好ましくは約２４〜７２時間行
い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
動物細胞などの真核生物細胞を宿主として得られた形質
転換体は、公知の方法と同様に培養して、セラペプター
ゼ類を産生せしめる。
たとえば、培養の際に用いられる培地としては、たとえ
ばＥａｇｌｅのＭ　Ｅ　Ｍ　［Ｈ、Ｅ　ａｇ　Ｉｅ　：
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１３０．４３２（１９５
９）］、Ｄｕｌｂｅｃｏ。
のｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ［
ｏｒｇａｄ　Ｌａｕｂ＆　　Ｗ　ｉｌｌｉａｍ　　Ｊ　
、　Ｒｕｔｔｅｒ：ジャーナル・オン・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢ　ｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２５８　、６０
４３（１９８３）］、ＨＡＴ培地［Ｌ　１ｔｔｌｅｆｉ
ｅｌｄ、　Ｊ　、　Ｗ　。
サイエンス１４５．７０９（１９６４）］が挙げられる
。
培養は通常的３０６Ｃ〜４２℃、好ましくは約３５℃〜
３７℃で、約１−１０日間行う。
培養物中に蓄積されたセラペプターゼ類は、当分野にお
ける通常の方法、たとえば超音波破砕法。
フレンチプレスを利用した破砕法、摩砕などの機械的破
砕法、リゾチームなどの酵素による破砕法。
塩酸グアニジンなどの薬剤による方法で抽出する。
次にこのようにして得られた抽出液や培養上清からそれ
自体公知の分離精製手段、たとえば沈殿剤による沈殿法
９等電点沈殿法、塩析法、透析法、イオン交換樹脂など
の吸着剤を利用する方法、ゲルろ適法、高速液体クロマ
トグラフィー等によっても分離精製される。
すなわち、たとえば本発明の方法で得られるセラペプタ
ーゼ類含有液をたとえば硫酸ナトリウム。
硫酸アンモニウム、食塩等で塩析し・、あるいは適宜の
親水性有機溶媒、たとえばアルコール類、アセトン等を
添加してセラペプターゼ類を分画沈殿させることもでき
る。そして本発明の方法で得られるセラペプターゼ類は
安定なので、たとえば培養液のような希薄な含有液を減
圧下に濃縮しうる。
また、たとえばリン酸カルシウム、アルミナ、ベントナ
イト、イオン交換樹脂等による吸着および脱着、クロマ
トグラフ法、蛋白沈殿剤たとえば核酸。
タンニン酸、リン・タングステン酸による沈殿法または
重金属塩による不純物の分離除去９等電点における沈殿
法、電気透析法等の精製手段を適用することも可能であ
る。
本発明で得られたベクターに、セラペプターゼ類を菌体
外に分泌するシグナルペプチドをコードするＤＮＡ領域
が挿入されている場合には、該ベクターの形質転換体を
培養すると、目的とするセラペプターゼ類が菌体外に蓄
積されるので、産生されたセラペプターゼ類を採取する
のに好都合である。なお分泌を目的とする場合には、使
用宿主に適合したシグナル配列コード領域を用いればよ
い。
さらに、本発明のセラチア属菌以外の形質転換体を使用
すれば、形質転換体の培養の際、培地中にＤＮａｓｅな
どの蛋白質が産生されないので、２目的とするセラペプ
ターゼ類を培養物から採取する際に、好都合である。
従来、セラペプターゼを生産することが知られているセ
ラチア属菌を上記形質転換体の宿主として用いた場合に
ついては、本発明を用いることにより、セラペプターゼ
の生産力価を向上させることができる。
このように、本発明の形質転換体を用いることにより、
抗炎症剤などとして有用なセラペプターゼ類を工業的に
有用に生産することができる。
本発明方法で製造されたセラペプターゼおよびセラペプ
ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドは、たとえば
抗炎症剤として、特公昭４１−１０１９３号公報、米国
特許第３．６９１．０１４号公報に記載の方法と同様に
用いることができる。
本発明の式［ＶＩ］で表わされるポリペプチド、その部
分ポリペプチド、またはそれらの一部のアミノ酸残基が
置換、挿入、付加もしくは除去されたポリペプチドは前
記のセラペプターゼ類の製造法と同様の方法で製造する
ことができる。またその製造法も、セラペプターゼ類の
製造法と同様の有利な点を有している。
本発明の式［ＶＩ］で表わされるポリペプチド、その部
分ポリペプチド、またはそれらの一部のアミノ酸残基が
置換、挿入、付加もしくは除去されたポリペプチドは、
セラペプターゼと同様の抗炎症作用を有するので、セラ
ペプターゼと同様の方法で抗炎症剤として用いろことが
できる。
本発明の式［■］で表わされる塩基配列またはその部分
配列であるＤ　Ｎ　Ａは、遺伝子工学の手法におけるシ
グナルペプチドをコードする遺伝子としての用途が予想
されろ。したがって、該ＤＮＡの下流に異種遺伝子を連
結することにより、その異種遺伝子産物を菌体外へ分泌
させることができる。
本発明の式［ＩＸ］で表わされるポリペプチド、または
その部分ポリペプチド、またはそれらの一部のアミノ酸
残基が置換、挿入、付加もしくは除去されたポリペプチ
ドは、遺伝子工学の手法に１おけるシグナルペプチドと
しての用途が予想される。
なお、本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で
表示する場合、Ｉ　ＵＰＡＣ−Ｉ　ＵＢＣｏｍｍｉｓｓ
ｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｎｏｍ
ｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野におけ
る慣用略号に基づくしのであり、その例を次に挙げろ。
また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特
に明示しなければＬ一体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　デオキシリポ核酸 Ａ　　　　アデニン Ｃシトシン Ｇ　　　　グアニン Ｔ　　　チミン Ａｌａ　　　　アラニン Ａｒｇ　　　　アルギニン Ａｓｎ　　　　アスパラギン Ａｓｐ　　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　　システィン Ｇｉｎ　　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　グリシン Ｈｉｓ　　　　ヒスチジン Ｉｌｅ　　　　イソロイシン Ｌｅｕ　　　　ロイシン １、ｙｓ　　　　リジン Ｍｅｔ　　　　メチオニン Ｐｈｅ　　　　フェニルアラニン Ｐｒｏ　　　　プロリン Ｓｅｒ　　　セリン Ｔｈｒ　　　　スレオニン Ｔｒｐ　　　　）リプトファン Ｔｙｒ　　　　チロシン Ｖａｌ　　　バリン 実施例 以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明
する。
実施例１ セラチア・ミルセッセンスの染色体ＤＮＡの単離 セラチア・ミルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４を１％ト
リプトン（ディフコ社製、米国）、０．５％酵母エキス
（ディフコ社製）、０．５％ＮａＣ１および０．１％ブ
ドウ糖、ｐＨ７，３からなる４０Ｔｎ１のＬ培地を含む
２００戒容三角フラスコで２８℃。
１６時時間域う培養した。得られた培養液の１鑓を４０
蔵のし培地を含む２００１Ｒ１容三角フラスコに接種し
、３７℃で２時間域とうして培養を行った。
得られた培養液（１０ｄ）を遠心して菌体を集め、４０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ８，５−２５ｍＭＥＤ
ＴＡで２回洗浄した。洗浄菌体をｌｄの４０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８，５−２５ｍＭ　　ＥＤＴＡに懸
澗し、これに０．１ｄの１０ｍｇ／ｄリゾチーム溶液を
加え、３７℃で２０分間保温した。次に１ｇの０．７５
％ザルコシルー４０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　　ｐＨ
８，５−２５ｍＭ　　ＥＤＴＡを加え、６５℃で８分間
処理したのちＯ，ｌｄの５　ｍｇ／　ｘｉ！リボヌクレ
アーゼ溶液を加え、３７℃で３０分間保温した。さらに
０．１−の１０ｍｇ／Ｊプロナーゼ溶液を加え、３７℃
で１時間保温じた。これをフェノール抽出したのち、エ
タノールでＤＮＡを沈でんさせた。沈てんを０．５滅の
１０ｉ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　　　　ｐＨ８，０−１ｍ
Ｍ　　　　ＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝液）に溶解し、同じ緩衝
液に対して４℃で２日間透析して、ＤＮＡ溶液を得た。
実施例２ セラペプターゼをコードする遺伝子のクローニング。
（Ａ）　　シーンライブラリーの調製ニブラスミド（ｐ
ＵＣｌ　２）１．０μｇを１０ユニツトの制限酵素Ｉ３
ａｍＨＩで３７℃、２時間分解し、これに０．１ユニツ
トのアルカリホスファターゼ（ワシントン社製、米国）
を加えて６５℃で３０分間処理したのち、フェノール抽
出、エーテル抽出後、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈
殿させた。
一方、実施例１で得られたセラチア・ミルセッセンスＡ
ＴＣＣ２１０７４の染色体ＤＮＡ３μｇをＩＯユニット
の制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、１時間消化したのち、
６５℃で１５分間処理し、エタノール沈殿を行った。
このようにして得たＢａｍＨＩで分解したｐＵＣｌ　２
ＸＩ　Ｏｎｇ）とＢａｍＨＩで分解した染色体ＤＮＡ（
４０ｎｇ）とをそれぞれ水に溶解して混合し、これらを
それぞれ１０ｒ＋ｍｏｌのＡＴＰ、２０ユニツトのＴ　
４　Ｄ　Ｎ　、Ａリガーゼにューイングランド・バイオ
ラプス社製、米国）およびリガーゼ綬衡液を含む反応液
（１０μＱ）中で１５℃で１６時間反応させ、この反応
液でエシェリヒア・コリＤ　Ｌ（＋またはエシェリヒア
・コリＪＭ１０３を、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６９．２１
１０（１９７２）に記載の方法に従って形質転換さけろ
とアンピシリン耐性株が多数得られた。
（Ｂ）　　プローブの調製ニ プローブとして、前述のＬｅｅ、Ｉ−ｓ、らの報告［フ
ェデレーション・プロシーディンゲス４４゜Ｍａｒｃｈ
　　ｐ、　　ｌ　０５７（１９８５）］のセラデア・プ
ロテアーゼのアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸Ｎｏ、
　４２〜Ｎｏ、　　５１（Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ）から推測される塩基配列の連鎖である一般Ｋ　［Ｉ
　］で表わされるＤＮＡ（４とおりの化合物の混合物）
およびアミノ酸Ｎｏ、　　１４３〜Ｎｏ、　１４７　（
Ｔｒｐ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａｓｐ
）から推測されろ塩基配列の連鎖である一般式［ｎ］で
表わされるＤＮＡ（１６とおりの化合物の混合物）をＣ
ｒｅａ、　Ｒ、らの報告［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７５゜５７６５（１９７８
）］に従ってそれぞれ化学合成した。
このオリゴヌクレオヂドに対して、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドカイネースを用いて５０μＱの反応液［オリゴヌクレ
オヂド２ｚｚｇ、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ　（ｐ
Ｈ７、’　６）、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｔ、１０ＩＩＩ
Ｍメルカプトエタ／−ル、４０μＣ４７−”ＰＡＴＰ。
１２ユニツトＴ４ポリヌクレオチドカイネースコ中で３
７℃で１０分間保温し、さらに０．１ｍＭＡＴＰ２μｇ
加えて３７℃で２０分間反応させ、５′末端を３２ｐで
標識した。
（Ｃ）　コロニーハイブリダイゼーションにょるスクリ
ーニング： 実施例２（Ａ）で得た約７００個のアンピシリン耐性テ
トラサイクリン感受性株のＤＮＡをＧ　ｒｕｎｓｔｅｉ
ｎ　−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７２，３９６１　（１
９７５）］でニトロセルロースフィルター上に固定した
。
次に、Ｌａｗｎらの方法［ヌークレイック・アシッズ・
リサーチ　９．６１０３（１９８１）］＋：従ッテ、固
定したＤＮＡに実施例２（Ｂ）で調製したプローブを会
合させ、オートラジオグラフィーによって上記二種類の
プローブの両方に反応するクローンを１個単離した。こ
れらのクローンからプラスミドＤ　Ｎ　ＡをＢ　ｉｒｎ
ｂｏｉｍ　−Ｄ　ｏｌｙの方法［ヌークレイック・アシ
ッズ・リサーチェ、１５１３（１９７９）コによって単
離した。得られたＤＮＡをＢａｍＨＩで処理して挿入部
を切り出し、ＢａｍＨＩで切り出せるプラスミドをｐＴ
ｓＰ２０と命名した。これらプラスミドの制限酵素切断
地図を第１図に示す。
第１図において、ロ：コ　はプラスミドｐＵＣ１２由来
のＤＮＡ断片を、−１■゛はセラチア・ミルセッセンス
ＡＴＣＣ２１０７４染色体由来のＤＮＡ断片をそれぞれ
示す。
実施例３ 塩基配列の決定： ｐＴｓＰ２０より単離した０　、　４２ｋｂ　　Ｈｉｎ
ｄｌ［［−Ｐｓｔｌ断片をＭｅｓｓｉｎｇらの方法［ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ、９，３０９（１９８
１）］に従って大腸菌ファージＭ１３ｍｐ８およびＭ１
３ｍｐ９に挿入し、ジデオキシ法［Ｓ　ａｎｇｅｒら、
Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４，５４６
３（１９７７）］によって塩基配列を決定した。
次の第１表にセラペプターゼの１番目から２０番目をコ
ードする領域の塩基配列を示す。
第１表 本塩基配列より推測したアミノ酸配列は、Ｌｅｅら［フ
ェデレーション・プロシーディゲス４４゜Ｍａｒｃｈ　
　ｐ、　　１０５７（１９８５）コによって報告された
セラチア・プロテアーゼの１番目から２０番目までのア
ミノ酸配列と完全に一致した。したがって１）ＴＳＰ２
０はセラペプターゼをコードする遺伝子を有することが
わかった。
実施例４ セラペプターゼをコードする遺伝子の再クローニング： 実施例２でクローニングされたセラペプターゼをコード
する遺伝子にはＣ末端部分をコードする領域が欠損して
いた。そこで本領域を得る目的でセラペプターゼ遺伝子
の再クローニングを行った。
プラスミドｐＢＲ３２２（１μｇ）を５ユニツトの制限
酵素ＨｉｎｄＩＩ［を用いて３７℃で１時間分解し、こ
れに０．１ユニツトのアルカリ性フォスファターゼ（ワ
シントン社製、米国）を加えて６５℃で３０分間処理し
たのち、フェノール抽出、エーテル抽出後、冷エタノー
ルを加えてＤＮＡ゛を沈でんさせた。
一方、実施例１で得られたセラチア・ミルセッセンスＡ
ＴεＣ２１０７４の染色体ＤＮＡ３μｇを１０ユニツト
の制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉを用いて３７℃で１時間分解
したのち６５℃で１５分間処理しエタノール沈でんを行
った。
このようにして得たＨｉｎｄＩｎで分解したｐＢＲ３２
２（ｌｏｎｇ）とＨ４ｎｄＩＩＩで分解した染色体ＤＮ
Ａ（５０ｎｇ）とをそれぞれ水に溶解して混合し、これ
らをそれぞれ１０　ｎｍｏｌｅのＡＴＰ、２０ユニツト
のＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランド・バイオラプ
ス社製、米国）およびリガーゼ緩衝液を含む反応液（１
０μｅ）を１５℃で１６時間保温し、これを用いてエン
エリキア・コリＤＨＩをＰｒｏｃ。
Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６９．２１
１０（１９７２）に記載の方法に従って形質転換させる
と、アンピシリン（１００μｇ／ｄ）を含む寒天プレー
トに合計６０００株の形質転換体が得られた。
上５己のプレートにニトロセルロースフィルタ−（シュ
ライヒャー・ジュール社製，米国）を接触させてコロニ
ーをフィルター上に移し、さらにフィルターをコロニー
面を上にして寒天プレート上で３７°Ｃ．４時間保温し
て、コロニーを生育させた。
コロニーが生育したフィルターを寒天プレートからはぎ
取り、これを０．５Ｎ　　ＮａＯＨをしみ込ませたろ紙
の上にのせて１０分間放置し、さらにＩＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　　ｐＨ７．５−１．５ＭＮａＣ１をしみ込ま
せたろ紙の上にのせて５分間放置したのち３０〜６０分
間風乾し、７８℃で３時間加熱してＤＮＡをフィルター
上に固定させた。
りＴ　Ｓ　Ｐ　２　０の挿入断片中の０．　９ｋｂ　　
Ｐｓｔｌ−ＢａｍＨＩ断片上にはセラペプターゼの９３
番目から３９１９１番目ミノ酸をコードする領域が存在
する。そこでＭａｎｉａｔｉｓ　　らの方法［モレキュ
ラー・クローニング、ア・ラバラトリー・マニュアル（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ　ｔｏｎｉｎｇ，Ａ　　Ｌ　
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＸＣｏｌｄ　　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８
２年）］に従って本断片をニックトランスレーションで
ラベル化し、これをプローブとしてコロニーハイブリダ
イゼーションによるセラペプターゼをコードする遺伝子
のクローニングを行った。
その結果、４株の候補味が得られ、その１株から得たプ
ラス、ミドをｐＴｓＰ２１と命名した。本プラスミドの
制限酵素地図を第２図に示す。第２図において、ニコ　
はプラスミドｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片を、腸■　
　はセラチア・ミルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４染色
体由来のＤＮＡ断片をそれぞれ示す。
実施例５ セラペプターゼ遺伝子の塩基配列の決定：実施例２で得
たプラスミドｐＴｓＰ２０のセラチア・ミルセッセンス
ＡＴＣＣ２１０７４染色体由来のＤＮＡ断片のうちの２
ｋｂ　　Ｐｓｔｌ　−ＢａｍＨ１断片および実施例４で
得たプラスミドｐＴＳＰ２１のセラチア・ミルセッセン
スＡＴＣＣ２１０７４染色体由来のＤＮＡ断片のうちの
１　、８５ｋｂ　　ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片を各
種の制限酵素で切断した。このようにして得られた小断
片をＭｅｓｓｉｎｇ　　らの方法［ヌクレイク・アシッ
ズ・リサ−で９，３０９（１９８１）］に従って各種の
大腸菌ファージＭ１３に挿入し、ジデオキシ法［Ｓ　ａ
ｎｇｅｒ　　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、
　　Ｕ、Ｓ、Ａ、。
旦、５４６３（１９７７）］によって塩基配列を決定し
た。次に第３図にセラペプターゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡの塩基配列およびその塩基配列から推定した
アミノ酸配列を示す。第３図より明らかな揉に、本セラ
ペプターゼの成熟たんばくのアミノ酸配列はＬｅｅ　　
ら［フエデレーション・プロシーディゲス、４４　、Ｍ
ａｒｃｈ　　ｐ、　１０５７（１９８５）］によってエ
ドマン分解法を用いて明らかされたセラチア・プロテア
ーゼのアミノ酸配列と一致した。
実施例６ セラペプターゼ遺伝子全領域を含むプラスミドの構築・ プラスミドｐＴｓＰ２０にはセラペプターゼのＣ末端部
分をコードする領域が欠損しており、ｐＴＳＰ２１には
セラペプターゼをコードする遺伝子のプロモータ一部分
が一部欠損している。そこで両プラスミドからセラペプ
ターゼ発現プラスミドを次の様にして構築した。
（１）：１）ＴＳＰ２１より単離した６、　８ｋｂ　　
ＢａｍＨｌ断片をアルカリ性フ十スファターゼで処理し
、ｐＴｓＰ２０より単離した２、３ｋ　　ＢａｍＨＩ断
片とＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼで連結させたのち、エ
シェリキア・コリＤＨＩおよびエシェリキア・コリＪＭ
　１０３の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転
換体を得た。本形質転換体からプラスミドを単離し、こ
れをｐＴＳＰ２５と命名した。本プラスミドの制限酵素
地図を第４図に示す。第４図において、ニコはプラスミ
ドｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片を、−−はセラチア・
ミルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４染色体由来のＤ　Ｎ
　Ａ断片をそれぞれ示す。
（２）４）ＴＳＰ２１を制限酵素ＥｃｏＲＶで切断した
のちアルカリ性フォスファターゼで処理し、これにｐＴ
ｓＰ２０より単離した１、Ｏｋｂ　　ＥｃｏＲＶ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、エシェリキア・コリＤ
ＨＩおよびエシェリキア・コリＪＭ１０３の形質転換を
行った。アンピシリン耐性の形質転換体からプラスミド
を単離し、これをｐＴＳＰ２６と命名した。本プラスミ
ドの制限酵素地図を第５図に示す。第５図において、ニ
コはプラスミドｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片を、■■
　はセラチア・ミルセッセンス　ＡＴＣＣ２１０７４染
色体由来のＤＮＡ断片をそれぞれ示す。
実施例７ セラチア属菌株の形質転換体の製造法：実施例４で得ら
れたプラスミドｐＴｓＰ２１．実施例６で得られたプラ
スミドｐＴＳＰ２５またはｐ’ｒ　Ｓ　Ｐ　２６を用い
て、ジーン、１７，１０７（１９８２）に記載の方法に
従って、セラチア・ミルセッセンスＩＦＯ３７５９，セ
ラチア・ミルセッセンスＮｏ、８７（ＩＰＯ１４４５４
，ＦＥＲＭＰ−８５１０）およびセラチア・ミルセッセ
ンスＡＴＣＣ２１０７４を形質転換し、形質転換体セラ
チア・ミルセッセンスＩＦＯ３７５９／ｐＴｓＰ２＋、
セラチア・ミルセッセンスＩＦＯ３７５９／ｐＴＳＰ２
５．セラチア・ミルセッセンスＩＦＯ３７５９／ｐＴＳ
Ｐ２６．セラチア・ミルセッセンスＮｏ、　８７　／ｐ
Ｔ　Ｓ　Ｐ　２１　、セラチア−？ルセッ、センスＮｏ
、８７／ｐＴＳＰ２５．セラチア・ミルセッセンスＮｏ
、８７／１）ＴＳＰ２６゜セラチア・ミルセッセンスＡ
ＴＣＣ２１０７４／ｐＴｓＰ２１．セラデア・ミルセッ
センスＡＴＣＣ２１０７４／Ｉ）ＴＳＰ２５．セラチア
・ミルセッセンスＡＴＣＣ２１０７４／ｐＴＳＰ２６．
セラチア・ミルセッセンスＮＣ−４／ｐＴＳＰ２１．セ
ラデア・ミルセッセンスＮＣ−４／ｐＴＳＰ２５および
セラチア・ミルセッセンスＮ　Ｏ−４／ｐＴ　Ｓ　Ｐ２
Ｏをそれぞれ得た。
実施例８ セラペプターゼ発現プラスミドの構築：セラペプターゼ
の成熟たんばくの１番目のアミノ酸（アラニン）をコー
ドする配列付近には制限酵素ＸｍａｌＩＩの切断部位が
存在する。そこでｐ’ｒｓｐ２１より単離した４、　　
０ｋｂ　　’Ｈｉｎｄｎ［フラグメントを制限酵素Ｘｍ
ａｎＩで部分切断し、成熟たんばくの１番目のアミノ酸
（アラニン）より５′末端側を除去した３、　２ｋｂＸ
ｍａｌｎ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片を得た。
次に本断片をＳｔヌクレアーゼを用いてその両端をｆｌ
ｕｓｈ　ｅｎｄに改変した。これに５′末端をリン酸化
した合成ヌクレオチドＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣおよびＧ
ＧＣＣＡＴＧをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結したの
ちＥｃｏＲＩで処理し、両端をＥｃ。
Ｒ１部位に改変した。一方ｔｒｐプロモーターを有する
発現プラスミドｐＴＲＰ７８１（特開昭６１−５０９６
号公報参照）をＥｃｏＲＩで切断し、これに上記のＥｃ
ｏＲＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、セラペプタ
ーゼの遺伝子がｔｒｐプロモーターに対して正方向であ
るプラスミドｐ’ｒ　Ｓ　Ｐ３１を得た。本プラスミド
の制限酵素地図を第６図に示す。第６図においてロ：コ
はプラスミドｐＴｓＰ７８１由来のＤＮＡ断片を、−―
　はセラチア・ミルセヅセンスＡＴＣＣ２１０７４染色
体由来のＤＮＡ断片をそれぞれ示す。
実施例９ エシェリキア・コリの形質転換体の製造法：実施例４で
得られたプラスミド［）ＴＳＰ２１．実施例６で得られ
たプラスミドｐＴＳＰ２５．ｐＴＳＰ２６．実施例７で
得られたプラスミドｐ’ｒｓｐ３１を用いて、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、６艶
、２１１０（１９７２）またはモレキュラー・クローニ
ング・ア・ラボラトリ−・マニュアル［（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　　Ｌ　ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、　　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら
、　Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｌ　９８２］に記載の方法に従っ
てエシェリキア・コリＤＨＩまたはエシェリキア・コリ
Ｊ　Ｍ　Ｉ　０３を形質転換し、形質転換体エシェリキ
ア・コリＤＨＩ／ｐＴＳＰ２１．エシェリキア・コリＤ
Ｈ！／りＴＳＰ２５．エシェリキア・コリＤＨｉ／ｐ’
ｒｓｐ　２６．エシェリキア・コリＤＨＩ／Ｉ）ＴＳＰ
３１．エシェリキア・コリＪＭ１０３／ｐＴ　Ｓ　Ｐ　
２１　、エシェリキア・コリＪＭ１０３／ｐＴＳＰ２５
．エシェリキア・コリＪＭ１０３／Ｉ）ＴＳＰ２６．エ
シェリキア・コリＪＭ１０３／ｐＴｓＰ３１をそれぞれ
得た。
実施例１Ｏ セラペプターゼ遺伝子の発現： 実施例９で得られた形質転換体エシェリキア・コリＪＭ
Ｉ　０３／ｐＴＳＰ３１をアンピシリン（１００μｇ／
ｄ）添加のプレインハート・インヒュジョン培地（ＢＨ
Ｉ培地、Ｄｉｆｃｏ社）５戒を含む試験管に接種し、３
７℃で６時間振とう培養し、その培養液０．５１ｎｌを
２０ｄのＢ　Ｉ−１１培地を含む２００蔵容三角フラス
コに移し、２８℃で１８振とう培養した。得られた培養
液を遠心分離して集めた菌体を５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　
　ＨＣＩ　　ｐＨ８，０５０ｍＭ　　ＮａＣ１で２回洗
浄し、ドライアイス−エタノールで凍結した。この凍結
菌体を２寸の５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ８
，０−５０ｍＭ０−５Ｏに懸濁し、菌体を超音波破砕機
で１９．５ＫＨｚ、２分間破砕したのち遠心分離し、抽
出液を調製した。
得られた抽出液の０．２ｄに０．３ｇの冷アセビンを加
え遠心分離した。その沈でんを１２０μＱの１２５ｍＭ
　　Ｔｒｉｓｉ（ＣＩ　　ｐＨ６，８−２％５ＤＳ−２
０％グリセロール−０，００２％ブロムフェノールブル
ー１０％２−メルカプトエタノールを加えたのち１００
℃で１０分間加熱し、遠心分離した。その上清の３０μ
Ｑを１０％アクリルアミドゲル、電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）にかけた。
電気泳動式トランスプロット装置（バイオーラッド社製
）を用いてアクリルアミドからニトロセルロースフィル
ターにたんばくを移し、通常の方法で調製したウサギの
抗セラペターゼ特異抗体（生物化学実験法１５．免疫学
実験入門、松橋直、成内秀雄、臼井美津子著、学会出版
センターを参照）およびパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウ
サギＩｇＧ（バイオ・ラッド社′！Ａ）を用いたイムユ
ン・プロットアッセイシステム（バイオ・ラッド社製）
でセラペプターゼの定量を行ったところ、培養液１ｊ当
り２５０μｇのセラペプターゼが生成していることが認
められた。ここで得られた産物は、抗セラペプターゼ抗
体と反応することおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥでセラペプタ
ーゼの標準品と全く同じ挙動をすることから免疫学的に
も、分子層的にもセラペプターゼと判断された。
実施例１１ セラチア・ミルセッセンスでのセラチアプロテアーゼ遺
伝子の発現 実施例６で得たプラスミドｐＴＳＰ２６を用いて塩化カ
ルシウム法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ。
ｔ’ｓＡ、６９，２１１０（１９７２）］てセラチア・
ミルセッセンスＮＣ−４を形質転換し、アンピシリン耐
性の形質転換株を得た。
セラチア・ミルセッセンスＮＣ−４および形質転換株セ
ラチア・ミルセッセンスＮ　Ｃ−４７ｐ’ｒ　５Ｐ２６
をそれぞれ２０威のプレインハート・インヒユージョン
培地を含む２ＯＬｄ容三角フラスコで３０’Ｃ，４８時
間振とう培養した。その培養液を遠心分離して得られた
培養上清を酵素液としてプロテアーゼ活性［Ａｒｇｒｉ
ｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。
２８．７７０（１９６４）コを測定した。その結果を表
１に示す。また生産されたプロテアーゼはＳＤＳ電気泳
動後、抗セラペプターゼ抗体を反応した。
表　　１ プロテアーゼ セラチア・ミルセッセンス　　　　　７０Ｇ　　　　　
７．５ＮＣ−４／Ｉ）ＴＳＰ２６ １′２回の実験の平均値 以上の結果、本形質転換株は４．５ｍｇ／！２のセラチ
アプロテアーゼを培地中に生産して０ることか明らかに
なった。
発明の効果 本発明のセラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎症
作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが組み込
まれたプラスミドで形質転換された形質転換体は、高力
価にセラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎症作用
を有するポリペプチドを産生ずるので、該形質転換体を
用いることにより、セラペプターゼまたはセラペプター
ゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドを工業的に効率良
く生産することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例２で得られたプラスミドｐ’ｒｓｐ２０
の制限酵素切断地図を、第２図は実施例４で得られたプ
ラスミドｐＴｓＰ２１の制限酵素切断地図を、第３図は
実施例５で得られたセラペプターゼをコードする遺伝子
の塩基配列および該塩基配列から推定したアミノ酸配列
を、第４図は実施例６で得られたプラスミドｐＴＳＰ２
５の制限酵素制限酵素地図を、第５図は実施例６で得ら
れたプラスミドｐＴＳＰ２６の制限酵素切断地図を、第
６図は実施例８で得られたｐＴｓＰ３１の制限酵素切断
地図をそれぞれ示す。 第３図 ＴＧＴ、ＧＧＧ、ΔＧＣ，ＣＧＧ、ＴＡＴ、ｌ３ＡＡ、
Δ［ｉＧ、ＴＡＣ，ＴＴＴ、ＡＡＣ，ＯＣＧ。 【 ：ＣＣ，ＧＧＣ，ＧＣＡ、ＧＴＣ，ＴＣＧ、ＧＣＣ，Ｇ
ＧＧ、ＣＧＴ、ＧＡｌ、１　Ｅ　Ｔ Ｊｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Δｌａ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙｋｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
−Ｃｙｓ停４閃 茅　５　圀 環６図

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）、セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプタ
    ーゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするＤ
    ＮＡ。
  2. （２）、一般式 【遺伝子配列があります】［ I ］ ［式中、Ｘ＿１はＴまたはＧを、Ｘ＿２はＴまたはＧを
    それぞれ示す。］の塩基配列で表わされるＤＮＡとハイ
    ブリダイズする特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
  3. （３）、一般式 ５′ＴＣＹ＿１ＴＧＹ＿２ＣＣＹ＿３ＴＧＣＣＡ＾３′
    ［II］ ［式中、Ｙ＿１はＴまたはＣを、Ｙ＿２はＡ、Ｇ、Ｔま
    たはＣを、Ｙ＿３はＴまたはＣをそれぞれ示す。］の塩
    基配列で表わされるＤＮＡとハイブリダイズする特許請
    求の範囲第１項記載または第２項記載のＤＮＡ。
  4. （４）、その５′末端にＡＴＧを、３′末端にＴＡＡ、
    ＴＡＧおよびＴＧＡのコドンのうちの一つまたはこれら
    の二つの連続したものを有する第３図の第７３１番目か
    ら第２２３６番目で表わされる塩基配列［III］、その
    部分配列またはそれらの一部の塩基が置換、挿入、付加
    もしくは除去された塩基配列を含有する特許請求の範囲
    第１項記載のＤＮＡ。
  5. （５）、その５′末端にＡＴＧもしくは水素原子を、３
    ′末端にＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡのコドンのうちの
    一つまたはこれらの二つの連続したものを有する第３図
    の第８２７番目から第２２３６番目で表わされる塩基配
    列［IV］である特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
  6. （６）、第３図の第１番目から第２５７０番目で表わさ
    れる塩基配列、その部分配列またはそれらの一部の塩基
    が置換、挿入、付加もしくは除去された塩基配列を含有
    する特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
  7. （７）、式 Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌ
    ｅｕ−３５個から４５個のアミノ酸残基−Ｇｌｙ−Ａｓ
    ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−７０個
    から８０個のアミノ酸残基−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−
    Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇ
    ｌｙ−Ｇｌｙで表わされるアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドをコードする特許請求の範囲第１項記載のＤＮ
    Ａ。
  8. （８）、ポリペプチドが該アミノ酸配列の一部のアミノ
    酸残基の置換、挿入、付加もしくは除去されたアミノ酸
    配列を含有する特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ。
  9. （９）、ＩｌｅがＬｅｕまたはＭｅｔで置換されたアミ
    ノ酸配列である特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ。
  10. （１０）、Ｉｌｅ−ＧｌＹ−ＨｉｓがＩｌｅ−Ｔｈｒ−
    Ｈｉｓで置換されたアミノ酸配列である特許請求の範囲
    第７項記載のＤＮＡ。
  11. （１１）、Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＬｅｕがＨｉｓ−ＧＩｙ−
    Ｌｅｕ、Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＶａｌまたはＨｉｓ−Ｇｌｙ
    −Ｖａｌで置換されたアミノ酸配列である特許請求の範
    囲第７項記載のＤＮＡ。
  12. （１２）、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−ＴｙｒがＧｌｙ−Ｖａｌ−
    Ｈｉｓ−Ｔｙｒで置換されたアミノ酸配列である特許請
    求の範囲第７項記載のＤＮＡ。
  13. （１３）、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＰｈｅがＧｌｕ−
    Ｓｅｒ−ＰｈｅまたはＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅで置換さ
    れたアミノ酸配列である特許請求の範囲第７項記載のＤ
    ＮＡ。
  14. （１４）、ポリペプチドが第３図の第（１７６）番目か
    ら第（３１５）番目のアミノ酸配列を含有する特許請求
    の範囲第７項記載のＤＮＡ。
  15. （１５）、ポリペプチドが第３図の第（１４６）番目か
    ら第（３６５）番目のアミノ酸配列を含有する特許請求
    の範囲第７項記載のＤＮＡ。
  16. （１６）、第３図の第（−３３）番目から第（４７０）
    番目のアミノ酸配列［VI］で表わされるポリペプチド、
    その部分ポリペプチドまたはそれらの一部のアミノ酸残
    基が置換、挿入、付加もしくは除去されたポリペプチド
    をコードする特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
  17. （１７）、そのＮ末端にＭｅｔを有していてもよい第３
    図の第（１）番目から第（４７０）番目のアミノ酸配列
    ［VII］を有するポリペプチドをコードする特許請求の
    範囲第１項記載のＤＮＡ。
  18. （１８）、式 【遺伝子配列があります】［VIII］ で表わされる塩基配列またはその部分配列であるＤＮＡ
    。
  19. （１９）、セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプ
    ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
    ＤＮＡが組み込まれたプラスミド。
  20. （２０）、セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプ
    ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
    ＤＮＡが組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
    転換体。
  21. （２１）、そのＮ末端にＭｅｔを有していてもよい第３
    図の第（１）番目から第（４７０）番目のアミノ酸配列
    を有するポリペプチド、その部分ポリペプチド、または
    それらの一部のアミノ酸残基が置換、挿入、付加もしく
    は除去されたセラペプターゼ様抗炎症作用を有するポリ
    ペプチド。
  22. （２２）、式 【遺伝子配列があります】［IX］ で表わされるポリペプチド、その部分ポリペプチド、ま
    たはそれらの一部のアミノ酸残基が置換、挿入、付加も
    しくは除去されたポリペプチド。
  23. （２３）、セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプ
    ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
    ＤＮＡが組み込まれたプラスミドで形質置換された形質
    転換体を培地に培養し、培養物中にセラペプターゼポリ
    ペプチドまたはセラペプターゼ様抗炎症作用を有するポ
    リペプチドを生成蓄積せしめこれを採取することを特徴
    とするセラペプターゼポリペプチドまたはセラペプター
    ゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドの製造法。
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