JP3040228B2 - Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ、その製造方法及びｌ−フコースの定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特にＬ−フコースの定
量に有用なＬ−フコースデヒドロゲナーゼ、その製造方
法及びＬ−フコースの酵素的定量方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】これまでに見い出されているＬ−フコー
スデヒドロゲナーゼとしては、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２４４巻、４７８５頁（１９６９年）に記載の
ブダ肝臓由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ、アーカ
イブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフ
ィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．）、１８６巻、１８４頁（１９７８年）に記載の羊
肝臓由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ、ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）、８６巻、１５５９頁（１９７９年）に記載のウ
サギ肝臓由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ、特開昭
６２−１５５０８５号公報に記載のコリネバクテリウム
属細菌由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ、さらに特
開平２−８４１７７号公報に記載のシュードモナス属の
細菌由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼが知られてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来から知られている
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼはＬ−フコースの定量分
析用の酵素として使用する際、次に示す欠点を有してい
た。すなわち、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、２４４巻、４７８５頁（１９６９年）に記
載のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ、アーカイブス・オ
ブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス、
１８６巻、１８４頁（１９７８年）に記載のＬ−フコー
スデヒドロゲナーゼ、及びジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー、８６巻、１５５９頁（１９７９年）に記載
のＬ−フコースデヒドロゲナーゼのいずれも動物由来の
酵素であるため、工業的に該酵素を供することは困難で
あった。また、特開昭６２−１５５０８５号公報に記載
のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ、及び特開平２−８４
１７７号公報に記載のＬ−フコースデヒドロゲナーゼの
生産菌は、これらの酵素を工業的に供給する生産性を有
しているが、これらの酵素を作用せしめて生成する還元
型ニコチアンアミド補酵素を定量分析する際、Ｌ−フコ
ースに対するミカエリス定数（以下Ｋｍ値という）が大
きいため、測定感度に問題があった。さらに、これらの
酵素は、温度に対する安定性が低く、実用上も問題があ
った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、ストレプトミ
セス属に属する放線菌が、Ｌ−フコースに作用して、Ｌ
−フコノラクトンにすると共に酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ⁺という）を還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨ
という）に還元するＬ−フコースデヒドロゲナーゼを生
産することを見い出し、また、この微生物の培養物から
得られるＬ−フコースデヒドロゲナーゼはＬ−フコース
に対するＫｍ値が小さく、かつ温度に対する安定性が高
いという性質を有し、Ｌ−フコースの測定に有効に利用
できることを見い出し、本発明を完成に至った。

【０００５】すなわち、本発明は、Ｌ−フコースに対す
るＫｍ値が小さく、かつ温度に対する安定性が高い新規
なＬ−フコースデヒドロゲナーゼであり、また他の発明
は、ストレプトミセス属に属しＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物からＬ−
フコースデヒドロゲナーゼを採取することからなるＬ−
フコースデヒドロゲナーゼの製造方法である。更に、他
の発明は、Ｌ−フコースを含有する試料にＮＡＤ⁺ の存
在下でストレプトミセス属に属する微生物由来のＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼを作用させ、生成するＮＡＤＨ
を測定するＬ−フコースの定量方法である。

【０００６】従来、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ生産
株としては前記のコリネバクテリウム属、シュードモナ
ス属等の細菌が報告されているだけで、放線菌が本酵素
を生産したという事実は本発明者らが初めて得た知見で
ある。

【０００７】以下、本発明を具体的に説明する。

【０００８】本発明により得られたＬ−フコースデヒド
ロゲナーゼは、次の理化学的性質を有する。

【０００９】（１）作用 本酵素は次式に示す通り、Ｌ−フコースを酸化してＬ−
フコノラクトンにすると共にＮＡＤ⁺ をＮＡＤＨに還元
する。

【００１０】Ｌ−フコース ＋ ＮＡＤ⁺ → Ｌ−フ
コノラクトン ＋ ＮＡＤＨ ＋ Ｈ⁺ （２）基質特異性 本酵素はＬ−フコースに最も特異性が高いが、Ｌ−ガラ
クトース、Ｄ−アラビノースなどにも作用する。１０ｍ
Ｍの濃度における各糖類に対する本酵素の相対活性は、
Ｌ−フコースに対する活性を１００として表示すると第
１表のようになる。

【００１１】

【表１】

【００１２】また、本酵素は補酵素としてＮＡＤ⁺ を要
求し、ＮＡＤＰ⁺ には全く作用を示さない。

【００１３】（３）至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは７．５〜１０．０にある。（図１に
示す） （４）ｐＨ安定性 本酵素を３０℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理
したときはｐＨ６．０〜１０．５まで安定である。（図
２に示す） （５）分子量 ６５，０００±５，０００［Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＴＳＫ−
２５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によるゲル濾過法によ
り］ （６）サブユニットの分子量 ３７，０００±５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により） （７）サブユニットの数：２個 本発明における分子量の値は、特に断わらない限りゲル
濾過法により、サブユニットの分子量の値は、ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より、それぞれ測定したものをいう。

【００１４】また、本発明のＬ−フコースデヒドロゲナ
ーゼが有するその他の理化学的性質は以下の通りであ
る。

【００１５】（１）Ｋｍ値 ラインウイバー−バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕ
ｒｋ）プロットにより、本酵素のＬ−フコースに対する
Ｋｍ値を求めたところ、０．２４ｍＭである。 （２）至適温度 ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）において５
０℃である。（図３に示す） （３）温度安定性 ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）において、
それぞれの温度で１０分間処理したとき、５０℃まで安
定であり、６５℃では完全に失活する。（図４に示す） （４）金属イオンの影響及び安定化 種々の金属イオン及び試薬の濃度１ｍＭでの本発明の酵
素に対する影響を第２表に示す。Ａｇ⁺、 Ｈｇ²⁺及びＣ
ｄ²⁺により強く阻害を受ける。

【００１６】

【表２】

【００１７】（５）等電点 セルバライト（ｐＨ３．０−１０．０ セルバ社製）を
用いた等電点電気泳動法により求めた本酵素の等電点は
４．０〜４．４である。

【００１８】上記理化学的性質を有する本発明のＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼと、従来から知られているコリ
ネバクテリウム属、シュードモナス属由来のＬ−フコー
スデヒドロゲナーゼの理化学的諸性質を比較した結果、
本発明の酵素は従来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼと
は性質を異にする酵素であることが明らかになった。第
３表に本発明によるＬ−フコースデヒドロゲナーゼと従
来から知られているＬ−フコースデヒドロゲナーゼの酵
素の諸性質の比較を示す。

【００１９】

【表３】

【００２０】第３表における従来のＬ−フコースデヒド
ロゲナーゼとは、特開昭６２−１５５０８５号公報に記
載のコリネバクテリウム属由来のＬ−フコースデヒドロ
ゲナーゼ及び特開平２−８４１７７号公報に記載のシュ
ードモナス属由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼであ
る。

【００２１】第３表から本発明のＬ−フコースデヒドロ
ゲナーゼと従来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼとは、
基質特異性、Ｌ−フコースに対するＫｍ値、安定温度、
分子量及びサブユニットの分子量において明らかな相違
があることがわかる。特に、本酵素のＬ−フコースに対
するＫｍ値が０．２４ｍＭであり、安定温度が５０℃ま
でであることが特徴としてあげられる。

【００２２】本発明におけるＬ−フコースデヒドロゲナ
ーゼの酵素活性測定方法及び酵素活性値の表示方法は以
下の通りである。

【００２３】０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を
０．５ｍｌ、５０ｍＭ Ｌ−フコース溶液を０．２ｍ
ｌ、１ｍＭＮＡＤ⁺ 溶液を０．２ｍｌ、それぞれ光路長
１ｃｍの標準キュベットに設置し、５分間保った後に適
当に希釈した酵素液０．１ｍｌを加えて混合し、反応を
始める。３４０ｎｍの波長で２分または必要であれば、
それ以上の時間にわたって吸光度を測定する。吸光度の
一分間当りの増加量（Ａ）から、生成するＮＡＤＨの量
を下記換算式に基づいて求めた。酵素活性値は、１分間
に１μｍｏｌｅのＮＡＤＨを生成する酵素量を１ユニッ
トとする。

【００２４】

【数１】

【００２５】次に、本発明によるＬ−フコースデヒドロ
ゲナーゼの製造法について説明する。 本発明に使用さ
れる微生物は、ストレプトミセス属に属し、Ｌ−フコー
スデヒドロゲナーゼの生産能を有するものであればいか
なる菌株でもよく、またこれらの菌株の変異株でもよ
い。そして、ストレプトミセス属に属し、Ｌ−フコース
デヒドロゲナーゼの生産能を有する菌株の具体例として
は、例えばストレプトミセス・オリーバクロムゲネス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏ
ｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ ３１７８、ストレプトミセス・ネ
ヤガワエンジス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｅｙａ
ｇａｗａｅｎｓｉｓ）Ｒ−１９菌があげられる。特に本
発明者らが土壌中より分離したストレプトミセス・ネヤ
ガワエンジス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｅｙａｇ
ａｗａｅｎｓｉｓ）Ｒ−１９菌が好ましく用いられる。

【００２６】このストレプトミセス・ネヤガワエンジス
Ｒ−１９菌の菌学的性質は以下に示す通りである。

【００２７】（Ａ）形態 本菌株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸より気菌糸を伸長
し、その先端はらせん状を呈す。輪生分枝を示さず、菌
核などの特殊器官の形成は認められない。成熟した胞子
鎖は１０個以上の胞子の連鎖を認め、胞子の大きさは
０．８×１．１ミクロン位の円筒形状で、胞子の表面は
平滑である。

【００２８】（Ｂ）各種培地における生育状態及び生理
的性質 培養は特に記載のないものは２８℃で行った。また、特
に記載のないものは、培地中への溶解性色素の生産は認
められなかった。

【００２９】（１）シュクロース・硝酸塩寒天 発育は無色、気菌糸は明るい灰色を呈す。

【００３０】（２）グルコース・アスパラギン寒天 発育はたいしゃ色、気菌糸は白〜灰白色 （３）グリセリン・アスパラギン寒天 発育はカーキー色、気菌糸は白〜明るい灰色 （４）スターチ・無機塩寒天 発育は金茶色で、気菌糸は明るい灰色を呈する。培養後
２日目ごろより、スターチの水解が認められる。

【００３１】（５）チロシン寒天 発育は焦茶色、気菌糸は白〜明るい灰色を呈する。黒色
の溶解性色素の生産は認められる。

【００３２】（６）栄養寒天 黄土色に発育し、気菌糸の着生は認められない。

【００３３】（７）イースト・麦芽寒天 発育はカーキー色、灰色の気菌糸を着生する。

【００３４】（８）オートミール寒天 発育はカーキー色、気菌糸は明るい灰色。

【００３５】（９）ペプトン・イースト・鉄寒天 焦茶色に発育し、気菌糸の着生は認められない。黒色の
可溶性色素の生産は認められる。

【００３６】（１０）グルコース・ペプトン・ゼラチン
穿刺培養 発育は金茶色、気菌糸の着生は認められない。培養後２
１日まで、ゼラチンの液化は認められない。

【００３７】（１１）脱脂粉乳（３７℃培養） 気菌糸の着生は認められない。培養後１２日目ごろより
茶色に変化し、さらに培養後２１日目カーキー色に変化
するとともに脱脂粉乳の部分的凝固を示す。

【００３８】（１２）メラニン様色素の生成 チロシン寒天及びペプトン・イースト・鉄寒天の両培地
とも、メラニン様色素の生成が認められる。

【００３９】（１３）Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノー
ス、ラフィノース、イノシトール、Ｄ−マンニトール、
Ｄ−ガラクトース、Ｌ−フコースをよく利用し、シュク
ロースも利用する。

【００４０】（１４）硝酸塩の還元 １０％硝酸塩カリウム含有ペプトン水を用いて試験した
結果、硝酸塩の還元がみられる。

【００４１】（１５）耐塩性試験 ４％まで耐塩性がある。

【００４２】（１６）最適生育温度 マルトース・イースト寒天（ｐＨ７．０）を用いて１０
℃、２２℃、２５℃、２８℃、３０℃、３７℃、５０℃
の各温度での試験の結果、２２℃〜３７℃で生育可能で
あるが、２８℃付近が最適温度と思われる。

【００４３】以上の結果を総括すると、本菌株はストレ
プトミセス属に属し、菌糸の先端はらせん状を示し、胞
子の表面は平滑である。種々の培地で薄黄〜焦茶色の発
育上に白〜灰白色〜明るい灰色の気菌糸を着生し、メラ
ニン様色素は認められるが、その他の溶解性色素は認め
られない。スターチの水解性は強い。蛋白分解力は弱
く、脱脂牛乳の凝固は少々認められるが、ゼラチンの液
化は認められない。炭素源としてはＤ−グルコース、Ｌ
−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、
Ｌ−ラムノース、ラフィノース、イノシトール、Ｄ−マ
ンニトール、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−フコースをよく利
用し、シュクロースも利用する。

【００４４】これらの性状より、類似する既知菌種をＩ
ＳＰ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）により検索すると、近縁菌と
してストレプトミセス・ネヤガワエンジス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｎｅｙａｇａｗａｅｎｓｉｓ）とスト
レプトミセス・レジストミシフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ）があ
げられる。さらに、バージエイの記載（Ｂｅｒｇｅｙｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄ．）と対比す
ると、本菌株の耐塩性は４％までであるため、ストレプ
トミセス・レジストミシフィカスとは異なり、ストレプ
トミセス・ネヤガワエンジスに最も近縁と思われる。

【００４５】次に，本菌株と、既知のＩＳＰ菌株５５８
８（ストレプトミセス・ネヤガワエンジス）とを同じ条
件下に培養して得た菌学的性質の比較結果を要約して第
４表に示す。

【００４６】

【表４】

【００４７】このように、牛乳の凝固及び硝酸塩の還元
反応において若干の差異が認められるが、その他の点で
は、本菌株はストレプトミセス・ネヤガワエンジスの特
徴をすべて満たしている。従って本菌株をストレプトミ
セス・ネヤガワエンジスに属する菌株と同定し、ストレ
プトミセス・ネヤガワエンジス・Ｒ−１９（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｎｅｙａｇａｗａｅｎｓｉｓ Ｒ−１
９）と命名した。なおこの菌株は工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第１２６２０号（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２６２０）として寄託されている。Ｌ−フコースデ
ヒドロゲナーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地と
しては、炭素源、窒素源、無機塩その他の栄養源を加え
た合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であ
る。炭素源としてはグルコース、シュクロース、フルク
トース、グリセロール、スターチなどの一般的に使用さ
れるものでもよい。窒素源としては硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物あるいはペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、アスパラギン等の有機窒素
化合物を用いる。無機塩としてはリン酸第一カリウム、
リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム等を使用し、他に消泡剤としてアデカノールＬＧ−２
９４等の界面活性剤を必要に応じて添加する。なお、本
発明のＬ−フコースデヒドロゲナーゼは誘導酵素である
故、Ｌ−フコースを培地に添加すれば著しく酵素生産量
が増大する。Ｌ−フコースの添加量は０．０５％以上で
酵素生産誘導効果を示すが、好ましくは０．１〜０．３
％である。培養はｐＨ６〜８の範囲で可能であるが、ｐ
Ｈ７付近で行うのがより望ましい。ジャーファーメンタ
ーによる培養を行う際には、初期ｐＨを７．０にする。
また培養温度は２２〜３７℃の範囲で可能であるが、望
ましくは２８℃付近である。培養には酸素の供給が必要
で、通気攪拌を行う必要がある。ジャーファーメンター
での培養時間は通常４８〜７２時間であるが、高活性な
菌株を得るには菌体増殖が静止期（Ｓｔａｔｉｏｎａｒ
ｙ ｐｈａｓｅ）に達していることが望ましい。

【００４８】Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培
養した後、酵素を回収するに際し、ストレプトミセス・
ネヤガワエンンジスＲ−１９の場合には酵素は主に菌体
内にあるので、まず培養物を遠心分離、あるいは濾過な
どの方法で、菌体だけを分離するのが好ましい。

【００４９】本発明のＬ−フコースデヒドロゲナーゼの
分離精製は、次のようにして行うことができる。菌体内
に蓄積された該酵素を菌体から抽出する方法としては、
従来から行われている超音波による菌体破砕、あるいは
ガラス・ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機によ
る菌体破砕または、リゾチーム等の酵素やトルエン等の
有機溶媒による細胞膜の破砕などの方法があげられる。
これらの中から適当な方法を選択して菌体から酵素の抽
出を行うことにより、酵素の採取ができる。

【００５０】これらの方法で抽出された粗酵素液からＬ
−フコースデヒドロゲナーゼをさらに精製する必要があ
る場合は、通常実施されている一般的な酵素の精製手段
である硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換カラムクロ
マトグラフィー法、ゲル濾過法、疎水結合カラムクロマ
トグラフィー法などの方法を適宜組み合わせるか、ある
いは繰り返すことによって精製を行うことができる。

【００５１】本発明によるＬ−フコースデヒドロゲナー
ゼの完全に純化された酵素の比活性値は、約１３０ユニ
ット／ｍｇ−タンパクを示す。また、ドデシル硫酸ナト
リウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法
において単一のタンパクバンドが観察される。

【００５２】次に本発明によるＬ−フコースの定量法に
ついて具体的に説明する。

【００５３】本発明の測定原理は下記に示す通りであ
る。

【００５４】Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼＬ−フコー
ス ＋ ＮＡＤ⁺ → Ｌ−フコノラクトン ＋ ＮＡ
ＤＨ ＋ Ｈ⁺ 試料中のＬ−フコースはＮＡＤ⁺ の存在下、Ｌ−フコー
スデヒドロゲナーゼの作用により、Ｌ−フコノラクトン
とＮＡＤＨを生成する。生成したＮＡＤＨの定量には公
知の方法を用いることができる。例えば、ＮＡＤＨその
ものを３４０ｎｍの吸光度を測定する方法などによって
測定することができる。

【００５５】反応に用いられる緩衝液は、特に限定され
ず、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液など
が好適であり、ｐＨ６〜１０．５、好ましくはｐＨ７．
５〜１０の緩衝液が用いられる。本発明のＬ−フコース
デヒドロゲナーゼのＬ−フコースに対するＫｍ値が小さ
いため、反応液中のＬ−フコースデヒドロゲナーゼは通
常０．０５〜２０ユニットで使用されるが、特に０．１
〜５ユニットが好適である。ＮＡＤ⁺ の濃度は反応条件
などにより異なるが、通常は０．５ｍＭ〜５ｍＭが用い
られる。反応温度は３０〜５０℃、反応時間は２〜２０
分間が望ましい。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、Ｌ−フコースの定量に有
用なＬ−フコースデヒドロゲナーゼ、その工業的生産に
適した製造方法及び操作が簡単で感度の高いＬ−フコー
スの定量法が提供される。

【００５７】

【実施例】以下、本発明を実施例によってさらに具体的
に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるもので
はない。

【００５８】実施例１ Ｌ−フコース０．３％、ペプトン０．４％、酵母エキス
０．２％、肉エキス０．２％及び消泡剤（アデカノール
ＬＧ２９４）０．０２％、ｐＨ７．０からなる培地１
００ｍｌを分注して滅菌（１２０℃、２０分間）した５
００ｍｌの坂口フラスコにストレプトミセス・ネヤガワ
エンジスＲ−１９を接種し、２８℃で７２時間振とう培
養した。この培養物中のＬ−フコースデヒトロデナーゼ
活性は０．５８ユニット／ｍｌであった。 実施例２ Ｌ−フコース０．３％、ペプトン０．４％、酵母エキス
０．２％、肉エキス０．２％及び消泡剤（アデカノール
ＬＧ２９４）０．０２％、ｐＨ７．０からなる培地
１，５００ｍｌを５ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃
２０分間滅菌した後、２８℃下でこの培地にストレプト
ミセス・ネヤガワエンジスＲ−１９を植菌する。２８℃
で７２時間振とう培養を行った後この培養液を、あらか
じめ上記と同様の組成を有する培地２０ｌを仕込み滅菌
しておいたジャー・ファーメンターに加えて本培養を行
った。培養条件は２８℃、攪拌回数１５０ｒｐｍ、通気
２０ｌ ／ｍｉｎ で、７０時間培養の後、培養液を遠心
分離にかけて菌体を採取した。得られた菌体の７０ｇ
（湿菌体重量）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１．５ｌに懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機により菌
体破砕を行った。その破砕液を遠心分離機を使用して遠
心分離し、上清液を得た。この上清液中のＬ−フコース
デヒドロゲナーゼの総活性は２，４７０ユニット、比活
性は０．０９ユニット／ｍｇ−タンパクであった。

【００５９】この上清液をあらかじめ２０ｍＭのリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
ス（商品名：ワットマン社製）を充填したカラム（φ９
×４０ｃｍ）に通した。１０ｌの０．１Ｍの食塩を含む
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄後、食塩濃
度が０．１Ｍから０．４Ｍである直線濃度勾配（総容
量：１０ｌ）にて吸着されたタンパク質を溶出させ、Ｌ
−フコースデヒドロゲナーゼ活性画分を回収した。本活
性画分中のＬ−フコースデヒドロゲナーゼの総活性は
１，８４０ユニット、比活性は１．５３ユニット／ｍｇ
−タンパクであった。

【００６０】この活性画分を限外濾過装置を用いて、脱
塩及び濃縮した後、硫酸アンモニウムを２５％となるよ
うに添加し、生じた沈殿を遠心分離して除いた。得られ
た上清液中のＬ−フコースデヒドロゲナーゼの総活性は
１，４３０ユニット、比活性は２．５２ユニット／ｍｇ
−タンパクであった。

【００６１】この上清液をあらかじめ２５％の硫酸アン
モニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
平衡化したブチルトヨパール６５０Ｍ（商品名：東ソー
社製）を充填したカラム（φ３．５×２２．５ｃｍ）に
通した。カラムを同様の緩衝液で洗浄した後、硫酸アン
モニウム濃度が２５％（約０．８Ｍ）から０％である直
線濃度勾配（総容量：２ｌ）にて吸着されたＬ−フコー
スデヒドロゲナーゼを溶出させた。この溶液中のＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼの総活性は１，２５０ユニッ
ト、比活性は２２．７３ユニット／ｍｇ−タンパクであ
った。

【００６２】この溶出液を限外濾過により脱塩及び濃縮
した後、あらかじめ０．０５Ｍの硫酸ナトリウムを含む
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したバイ
オシル ＴＳＫ−２５０（商品名：バイオラット社製）
カラム（φ２．１５×６０ｃｍ）に通し、ゲル濾過を行
い活性画分を集めた。この活性画分中のＬ−フコースデ
ヒドロゲナーゼの総活性は８４０ユニット、比活性は１
００ユニット／ｍｇ−タンパクであった。

【００６３】この溶液に硫酸アンモニウムを２５％とな
るように添加し、次いであらかじめ２５％の硫酸アンモ
ニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化したブチルトヨパール ６５０Ｍ（商品名：東ソー
社製）を充填したカラム（φ１．６×５．２ｃｍ）に通
した。カラムを同様の緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモ
ニウム濃度が２５％（約０．８Ｍ）から０％である直線
濃度勾配（総容量：１００ｍｌ）にて吸着されたＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼを溶出させた。Ｌ−フコースデ
ヒドロゲナーゼ活性画分を透析にて脱塩することによっ
て精製酵素溶液を得た。この精製酵素溶液中のＬ−フコ
ースデヒドロゲナーゼの総活性は、５６０ユニット、比
活性は１３０ユニット／ｍｇ−タンパクであった。

【００６４】こうして得られた酵素の純度はドデシル硫
酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって調べた結果、一本のバンドのみが観察さ
れ、純粋なＬ−フコースデヒドロゲナーゼであることが
確認された。

【００６５】実施例３ 得られた精製酵素を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）により適当に希釈して調整した酵素標品を用いて本
酵素の基質特異性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、
温度安定性を調べた。

【００６６】［基質特異性］０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）０．５ｍｌ、各種糖の５０ｍＭ溶液０．２ｍ
ｌ、１ｍＭＮＡＤ⁺ 溶液０．２ｍｌからなる反応液に、
酵素標品０．１ｍｌ（０．０１ユニット）を添加し、３
７℃で２分間反応させ、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの
吸収の増加に基づいて、酵素活性を求めた。これらの糖
に対する作用の強さを、それぞれＬ−フコースに対する
作用を１００とした相対活性値を第１表に示す。

【００６７】［至適ｐＨ］０．２Ｍ各種緩衝液（ｐＨ
５．０〜６．５：クエン酸緩衝液；ｐＨ６．０〜８．
０：リン酸緩衝液；ｐＨ７．５〜８．５：トリス−塩酸
緩衝液；ｐＨ８．５〜１１．５：グリシン−苛性ソーダ
緩衝液）０．５ｍｌ、５０ｍＭＬ−フコース溶液０．２
ｍｌ、１ｍＭＮＡＤ⁺ 溶液０．２ｍｌからなる反応液に
酵素標品０．１ｍｌ（０．０１ユニット）を添加し、３
７℃で２分間反応させ、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの
吸収の増加に基づいて、酵素活性を求めた。以上の操作
の後、最高の酵素活性を１００％とした相対活性（Ｒｅ
ｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を算出し、グラフ化
して図１を得た。図１より、本酵素の至適ｐＨは７．５
〜１０．０の範囲にあることがわかる。

【００６８】［ｐＨ安定性］０．１Ｍトリス−イミダゾ
ール−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５，５．０，
５．５，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，
８．５，９．０，９．５，１０．０，１０．５，１０．
７，１１．２，１１．７，１２．２）０．９５ｍｌに
０．０５ｍｌの酵素標品（０．４ユニット）を混合し、
３０℃で６０分間放置した後、各溶液０．０２５ｍｌを
０．２Ｍトリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９．５）０．５ｍｌ、５０ｍＭＬ−フコース溶液
０．２ｍｌ、１ｍＭＮＡＤ⁺ 溶液０．２ｍｌ、イオン交
換水０．０７５ｍｌと混合し、３７℃で２分間反応さ
せ、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの吸収の増加に基づい
て、酵素活性を求めた。以上の操作の後、最高の酵素活
性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化して
図２を得た。図２から明らかなように、本酵素はｐＨ
６．０〜１０．５の範囲で安定である。

【００６９】［至適温度］０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）０．５ｍｌ、５０ｍＭＬ−フコース溶液
０．２ｍｌ、１ｍＭＮＡＤ⁺ 溶液０．２ｍｌからなる反
応液に酵素標品０．１ｍｌ（０．０１ユニット）を添加
し、２５，３０，３５，３７，４０，４５，５０，５
５，６０，６５，７０℃の各温度下において、２分間反
応させ、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの吸収の増加に基
づいて、酵素活性を求めた。以上の操作の後、最高の酵
素活性値を１００％とした相対活性を算出し、グラフ化
して図３を得た。図３より、本酵素の至適温度は５０℃
であることがわかる。

【００７０】［温度安定性］１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で希釈した酵素標品０．２ｍｌ（０．０４ユ
ニット）を２５，３０，３５，４０，４５，５０，５
５，６０℃の各温度で１０分間処理した。この酵素溶液
０．０５ｍｌを０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．
０）０．５ｍｌ、５０ｍＭ Ｌ−フコース溶液０．２ｍ
ｌ、１ｍＭＮＡＤ⁺ 溶液０．２ｍｌ、イオン交換水０．
０５ｍｌと混合し、３７℃で２分間反応させ、３４０ｎ
ｍにおけるＮＡＤＨの吸収の増加に基づいて、酵素活性
を求めた。以上の操作の後、最高の酵素活性値を１００
％とした相対活性値を算出し、グラフ化して図４を得
た。図４から明らかなように、本酵素は５０℃までの温
度において安定である。

【００７１】実施例４ 試料溶液中のＬ−フコースの濃度を下記組成の試薬を用
い、下記方法により定量した。

【００７２】 ａ）試薬 ０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．６ｍｌ ５ｍＭ ＮＡＤ⁺ ０．２ｍｌ ０．７ユニット／ｍｌ Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ ０．１ｍｌ ｂ）測定法 上記試薬の混合液０．９ｍｌに試料溶液を０．１ｍｌ添
加し、３７℃で５分間反応させ、３４０ｎｍの吸光度を
測定した。同様にして試料溶液の代わりに水を同量加え
て反応させて吸光度を測定した。試料溶液を添加したと
きの吸光度から水を添加したときの吸光度を差し引い
て、試料溶液の吸光度を算出した。

【００７３】別に、試料溶液の代わりに既知濃度のＬ−
フコース溶液を上記試薬の混合液に添加し、同様に反応
させて、検量線を作成した（図５に示す）。この検量線
を用いて上記試料溶液中のＬ−フコースの濃度を求めた
ところ、正確に定量できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＬ−フコースデヒドロゲナーゼのｐＨ
活性曲線を示す図である。

【図２】同酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図３】同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図４】同酵素の温度安定性を示す図である。

【図５】Ｌ−フコースの濃度を測定する際に使用した検
量線を示す図である。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するＬ−フコー
   スデヒドロゲナーゼ。 作用：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ドの存在下でＬ−フコースに作用し、Ｌ−フコノラクト
   ンと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生
   成する。 基質特異性：Ｌ−フコース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ
   −アラビノースに対して作用し、Ｄ−アラビノースに最
   も特異性が低い。 至適ｐＨ：ｐＨ７．５〜１０．０ ｐＨ安定性：３０℃においてそれぞれのｐＨで６０
   分間処理したときは、ｐＨ６．０〜１０．５まで安定で
   ある。 分子量：６５，０００±５，０００ サブユニットの分子量及びその数：分子量３７，０
   ００±５，０００のサブユニット、２個からなる。
2. 【請求項２】ストレプトミセス属に属し、Ｌ−フコース
   デヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物を培養し、培養
   物からＬ−フコースデヒドロゲナーゼを採取することを
   特徴とする請求項１のＬ−フコースデヒドロゲナーゼの
   製造方法。
3. 【請求項３】Ｌ−フコースを含有する試料に、酸化型ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で請求項
   １のストレプトミセス属に属する微生物由来のＬ−フコ
   ースデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチドを定量することを特
   徴とするＬ−フコースの定量方法。