JPS5889183A - Ｎａｄ（ｐ）依存性コレステロ−ル脱水素酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）依存性コレステロール脱水素酵
素（Ｃｂｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ
ｓｅ　：以下［ＮＡＤ■−ＣＤＨＪと略す）に関する。

さらに詳しく説明すると。微生物を好気的条件下で培養
し、その菌体もしくは培養液からＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ
を採取する方法に関する。

本発明方法により得られたＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨは、　
。

コレステロールの定量法およびコレステロールの定量用
試薬として有用である、ここでいうＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤ
Ｈとは、補酵素としてＮＡＤにコチンアミドアデニン、
ジヌクレオチド、）、ＮＡＤＰにコチンアミドアデニン
、ジヌクレオチドリンン酸）を要求し、電子供与体（コ
レステロール）から水素をうばい、電子受容体（ＮＡＤ
又はＮＡＤＰ）に付加する反応を触媒する酵素をいう。

従来好気性微生物が、コレステロールオキシダーゼ、コ
レステロールデヒドラターゼを生産することは既に知ら
れている。また、ノカルジア・エリスロポリスがコレス
テロールの酸化を触媒する酵合は、ＮＡＤ（Ｐ）への依
存性は認められない。また、クテリウムーステロリカム
（特公昭４８−１１９０７についても同様のことがいえ
る。さらには、絶対嫌気性微生物である、オイバクテリ
ウムＳｐ。

ＡＴＣＣ２１４０８がＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを生産する
との報告（特開昭５３−５６０９０）もあるが、酵素学
的性質等の記載はほとんどなされていないばかりか、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）依存性の記載があるにもかかわらず、ＮＡＤ
（Ｐ）の存在なしにも反応が進行する例が記載されてい
る。しＪコがってこの酵素は、本発明でいうところのＮ
ＡＤ（Ｐ）依存性脱水素酵素とはいえない。

を 従来酵素にするコレステロールの定量は、コレステロー
ルオキシダーゼを使用する方法が広く用いられているが
、発色系に導（ためにパーオキシダーゼ等が必要であり
、操作が繁雑である。しかも血中のどクルビン、アスコ
ルビン酸等により影響をうけ、これにより誤差が牛じゃ
ずいという欠点を有している。

コレステロールの定量において、ＮＡＤ（Ｐ）の存在な
しには反応が進行しないＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを用い、
下記反応式に示される反応により生ずるＮＡ　Ｄ（Ｐ）
Ｈを直接光度計で測定できれば、操作が簡単であり、前
記のコレステロールオキシダーゼを用いる方法の種々の
問題も解決される。

コレステロール＋ＮＡＤ（Ｐ）、：：コレステノン＋Ｎ
ＡＤ■Ｈ 本発明者等は、上記反応に適した酵素すなわち、コレス
テロールに特異性が高く、ＮＡＤ（Ｐ）依存性である脱
水素酵素を広く自然界に求めたところ、意外にも好気的
条件下に生育する微生物が、著量のＮ　Ａ　Ｄ（Ｐ）　
−ＣＤ　Ｈを生産することを見い出した。

その中で、特に優れた菌株として、ノカルジア鷺ｓｐ、
　Ｎｉｌ　Ｃｈ２−１（Ｎｏｃａｒｄｉａ　５ｐ−Ｎｃ
ｈＣｈ２−１　）、アルカリゲネスｓｐ、　Ｎａ　４　
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　Ｎ［Ｌ４　）、お
よびプロテウス・ブルガリスＩＡＭ１０２５Ｐｒｏｔｅ
ｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＩＡＭ１０２５が例示される
。

次にノカルジアｓｐ、Ｎｌ１ｃｈ２−１およびアルカリ
ゲネス５ｐ−Ｎａ４　　の菌学的性質を以下に述べる。

（１）ノカルジアｓｐ、　ＮａＣｈ２　１（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ　ｓｐ。

嵐Ｃｈ２−１）の菌学的性質 ■　形態的性質 １）細胞の形および大きさ：培養初期菌糸状に生育し分
岐を生じる。その後、不規 則な分断が生じ細胞は桿菌状となる。

大きさは０．８〜１．０μ×１．５〜４．０μ位である
。気菌糸を形成せず胞子のう 胞子も形成しない。

２）ダラム染色性：ＶｖＪ性 ３）抗酸性：陽性 ４）運動性：無し く口）化学的組成分析 細胞壁中にｍｅｓｏ−ジアノピメリン酸、アラビ、−＼
、カラ２．−フカ１含まれ−Ｐ。

アミノピメリン酸、グリシンは含まない。

Ｏ各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培地：３０°Ｃで４日培養後、直径０
．５〜１．　Ｑ　ｍｍの円形コロニーを形成する。周辺
は金縁もしくは波状で ある。表面は平滑で半球状であり、中 心部が凸状に***する場合もある。色 調は薄いクリーム色で不透明である。

培地中に色素は出さない。

２）シーークロース硝酸塩寒天培地 生背中程度で集落の色は白色ないし薄クリーム色である
。水溶性色素は出さない。

３）クルコース、アスパラギン寒天ｓ地生育中程度で集
落の色はクリーム色である。水溶性色素は出さない。

４）グリセリン、アスパラギン寒天培地生育中程度で集
落の色は白色ないし褥クリーム色である。水溶性色素は
出さない。

５）スターチ無機塩寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリーム色である
。水溶性色素は出さない。

６）チロシン寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリーム色である
。水溶性色素は出さない。

７）栄養寒天培地 生育良好で集落の色はクリーム色である。

水溶性色素は出さない。

８）イースト麦芽寒天培地 生育良好で集落の色はクリーム色である。

水溶性色素は出さない。

９）オートミール寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリーム色である
。水溶性色素は出さない。

０　生理的性質 １）生育温度：１５°Ｃ〜４３°Ｃで生育する。

１０°Ｃ１４５°Ｃで生付しない。

最適温度は３０〜３５°Ｃであ る。

２）硝酸塩還元性：陽性 ３）カタラーゼ二陽性 ４）オキシダーゼ：陰性 ５）ウレアーゼ：陽性 ６）デンプン加水分解：陰性 ７）ゼラチン液化：陰性 ８）チロシン加水分解：陰性 ９）カゼイン加水分解：陰性 １０）　　キサンチン加水分解：陰性 １１）ＤＮＡの分解：陰性 １２）リドマスミルク：アルカリ性、ペプトン化、凝固
共にしない。

１３）メラニン様色素の生成：無し １４）エスクリン加水分解：陽性 １５）　　Ｔｗｅｅｎ　２０．４０．６０．８０加水分
解：すべて陽性 −１６）ペニシリン耐性試験：耐性 １７）酸素に対する態度：好気性 １８）無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩共に
利用する。

１９）　　Ｎａ＆ｊ生育範囲：０〜６％で生育する。

７％で生育しない。

２０）各種炭素源の同化性（プリドハム、ゴドリーブ寒
天培地） Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、 マンノース、グリセリン、トレハロー スを同化する。襲−アラビノース、Ｄ −キシロース、サッカロース、イノシ し ット、セーラムノース、ラフィノース、Ｄ−ガラクトー
ス、Ｄ−マンニット、 マルトース、ソルビットを同化しない。

２１）各種菌から酸の生成 り−グルコース、マンノース、Ｄ−フ ラクトース、トレハロース、グリセリ ンから酸を生成する。賢−アラビノ− ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトー ス、マルトース、サッカロース、ラク トース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニ ット、イノジット、デンプンから酸を 生成しない。

以、１−の菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａ
ｌ　ｏｆ襲 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ第８版を参考に検ン酸、アラビノース、ガラクトース
を含み寮廖＋−ジアミノピメリン酸、グリシンが含まれ
ないこと、好気性で菌糸状によく生育し、後に分断して
閉状となること、抗酸性であること、胞子のう胞子およ
び気菌糸を着生しないこと等から本菌はＮｏｃａｒｄｉ
ａに属する菌である。

よって本菌は、本発明者らがノカルジアｓ　ｐ　−Ｎｏ
。

Ｃｈ２　１（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、Ｎｏ、Ｃｈ２　
１）と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に菌寄
第６２１７号（ＦＥＲＭ−ＰＰ！ｌＬ６２１７　）足−
寄託されている。

■　アルカリゲネスｓｐ、Ｎ１１４　（Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ　ｓｐ。

Ｎ１１４）の菌学的性質 （ハ）形　態 １）細胞の形および大きさ：０．４〜０．６μ×對　　
０．８〜１．２μの　菌である。

２）細胞の多形性の有無：多形性は認められない。

３）連動性の有無：周鞭毛を有し運動する。

４）胞子の有無：胞子は形成しない。

５）ダラム染色性：陰性 ６）抗酸性：陰性 ０　各培地における生育状態 １）肉汁寒天平勧養 円形ローニーで表面は平滑、半レンズ 状の***、全縁状で薄クリーム色、半 透明、光沢あり ２）肉汁寒天斜面培養 生育中程度、糸状に生育、薄クリーム色へて半透明 ３）肉汁液体培養 菌膜をつくらない、やや濁り沈　も少 しある。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンは液化しない。

５）リドマスミルク培養：アルカリ性になるがペプトン
化しない、凝゛固しない。

０　生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽性 ２）脱窒反応：陰性 ３）ＭＲテスト：陰性 ４）ＶＲテスト：陰性 ５）インドールの生成：陰性 ６）硫化水素の生成：開隔性 ７）デンプン加水分解：陰性 ８）クエン酸塩の利用：　Ｋｏｓｅｒの培地とＣｈｒｉ
ｓｔｅｎｓｅｎの培地で共に利用する。

９）無機窒素源の利用：硝酸塩およびアンモニウム塩を
利用する。

１０）　　色素の生成：水溶性色素を生成しない。

１１）ウレアーゼ：陽性 １２）オキシダーゼ：＠性 １３）カタラーゼ：陽性 １４）生育範囲ＰＨ：　ＰＨ５，０〜１０．０で生育す
る。温度：５°Ｃ〜３７°Ｃで生育する。

４２°Ｃで生育しない。。

１５）酸素に対する態度：好気性 １６）　　ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ　−Ｌｅｉｆｓｏｎ法
）：フラクトースから好気的に酸を生成する。

１７）糖類から酸およびガスの生成の有無Ａｙｅｒｓ、
　Ｒｕｐｐ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｇｏｎ培地でフラクトー
スとグリセリンから酸を生成す るかガスは生成しない。

アラビノース、キシロース、グルコー ス、マンノース、ガラクトース、麦芽 糖、シ・糖、乳糖、トレハロース、ソ ルビット、マンニット、イノジット、 デンプンからは酸もガスも生成しない。

１８）独立栄養的生育：水素ガス、炭酸ガス、酸素ガス
を含有する気体中で生育しな い。

１９）　　Ｔｗｅｅｎ　８０の分解性：陽性２０）　　
資化性：　Ｄ−フラクトース、ｋ−フェニルアラニン、
レブリン酸カルシウム、 ζ−スレオニンを資化する。マンノー ス、マルトース、マンニット、ベタイ ンを資化しない。

以−Ｌの菌学的諸性質からＢｅｒｇｅｙ’ｓ　ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ　　（第８版）の記載に照合して検討する
と短桿菌で周ペン毛により運動すること、ダラム陰性、
好気性であること、栄養要求性はなく、アンモニウム塩
、硝酸塩を利用すること、カゼインおよびゼラチンを分
解しないこと、オキシダーゼ陽性であること等からＡｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ属に分類される。

育、Ｄ−７ラクトースの資化性で、Ａ、、ａｇｖａｍａ
ｒ　１ｎｕｓとは、主にデンプンの分解性、マルトース
の資化性で、Ａ、ｐａｃｉｆ　１ｃｕｓとは、主にスレ
オニン、−べタインの資化性で、Ａ、ｃｕｐｉｄｕｓと
は、主にオキシダーゼおよびマンニット、マンノースの
資化性で、Ａ、ｖｅｎｕｓｔｕｓとは、主にレブリン酸
塩、スレオニン、ベタインの資化性で、Ａ、ａｅｓｔｕ
ｓとは、主にマンニット、スレオニン、フェニルアラニ
ンの資化性で異なる。よって本菌をアルカリゲネスｓｐ
。

％　４　（Ａｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　Ｎ［Ｌ
４　）と命名し工業技術院微生物工業技術研究所に菌寄
第６２１６号（ＦＥＲＭ−ＰＮ［１６２１６）として寄
託されている。

次にこれらの菌を用いてＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを製造す
る方法について詳述する。これらの菌はいづれも構成的
にＮＡＤＱ））−ＣＤＨを生産する能力を有し、通常の
ペプトン、酵母エキス、又は硫酸アンモニウム等のチッ
ソ源及びグルコース、グリセロール等の炭素源、その他
無機塩等を含有する培地でもＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを生
産するが、コレステロールを培地に添加することにより
さらに多量にＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを生産する。この際
コレステロールの添加は、培養開始時あるいは途中から
のいずれでもよい。−また、その他培養条件に関しては
、通常イＩなわれる範囲で実施できる。これらの菌によ
り生産されたＮＡＤ（Ｐ）−ｃＤｍは、菌体のみならず
、培養液中にも蓄積され、その何れからでも酵素を回収
することができる。これらの培養濾液又は菌体抽出液を
硫酸アンモニウム等による塩析又ｉよ、アセトン、エタ
ノール等の溶剤沈澱して得た粗酵素は、そのまま、コレ
ステロールの定量に使用するか、あるいは更に精製して
使用することもテキる。例えば精製については、イオン
交換クロストグラフィー、分子篩クロストグラフィー等
公知の方法により可能である。

ここで得られるＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨは、コレステロー
ル含有物質中のコレステロール定量等に有利に使用でき
る。

本発明に使用するＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの活性測定法を
以下に示す。

ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの酵素活性は、うレスチロールと
ＮＡＤ（Ｐ）を基質として反応した場合のＮＡＤｏＨの
生成量を、３４０ｎｍにおける吸光度の増加として、分
光光度計で測定し算出する。すなわち、０．１Ｍ）！Ｊ
スス−酸緩衝液（ＰＨ８，６）　２．６５ｍ１゜２８ｍ
ＭＮＡＤ溶液０．１ｍＪ、（８％トリトンＸ−１００溶
液０．１５１１）、１％コレステロール溶液０．０５ｍ
ｊ及びＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ水溶液０．０５ｍ／を混合
し、３０°Ｃで反応させ、反応開始後１分間の３４００
ｍにおける吸光度の増加を測定する。

対照として上記組成でコレステロールの代りに水を用い
同様の操作を行ない、対照液の３４０ｎｍにおける吸光
度の増加を試験液のそれから差し引く。得られた値から
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量を求め、これより試料中のＮＡ
Ｄ（Ｐ）−ＣＤＨ活性を算出する。

酵素活性の表示は、ＰＨ８，６，３０°Ｃの条件下で１
分間に１μｍｏｌｅのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する酵素を
１単位とした。

次に本発明に使用するＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＨの作用を示
す。

コレステロール＋ＮＡＤ（Ｐ＋、＝＝？コレステノン＋
ＮＡＤ（ＰＪＨ 本発明におけるＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨは全てこの反応を
触媒する。

以下に本発明に使用するＮＡＤ［Ｆ］＼ＣＤＨの一般的
性質をノヵルジア８１）−ＮｃｉＣｈ２　１（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａｓｐ、Ｎ［ｌＣｈ２−１）ＦＥＲＭ−Ｐ６２１
７およびアルカリゲネスｓｐ、　％　４　（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ　ＳＴＹ、　Ｎ［１４）　ＦＥＲＭ−Ｐ６
２１６の生産するものについて示す。

０）ノカルジアｓｐ、　ｌ’ＩｋＬｃｈ２−１　（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ　ｓｐ。

Ｉｌ！ｌＣｈ２−１）ＦＥＲＭ−Ｐ６２１７の生産する
ＮＡＤ（Ｐｌ−ＣＤＨ １）至適ＰＨ 第１図に３０°ＣにおけるＰＨと活性の関係を示した。

２）ＰＨ安定性 第２図に３７°ＣにおＨるＰＨと安定性の関係を示した
。

３）至適温度 第３図にＰＨ８，６における温度と活性の関係を示した
。

４）熱安定性 第４図にＰＨ７，０における温度と安定性の関係を示し
た。

５）基質特異性 本　素は、３β位に水酸基をもつステロイドに反応し、
コレステロールを１ｏｏとするとスティグマスチロール
３５、β−シトステロール２５、その他デヒドロエビア
ントロステロン、エル−ゴスチロール等にわずかに作用
する。

６）補素 ＮＡＤを要求する。

（２）アルカリゲネスｓｐ、　Ｎ＋１４　（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ。

陥４　）ＦＥＲＭ−Ｐ６２１６（７）生産−ｉるＮＡＤ
（Ｐｉ−ＣＤＨ １）至適ＰＨ 第５図に３０°ＣにおけるＰＨと活性の関係を示した。

２）ＰＨ安定性 第６図に３７°ＣにおけるＰＨと安定性の関係を示した
。

３）至適温度 第７図にＰ　Ｈ８，５における温度と活性の関係を示し
た。

４）熱安定性 第８図にＰ　Ｈ７，Ｑにおける温度と安定性の関係を示
した。

５）基質特異性 本　素は３β位に水酸基をもつステロイドに反応し、コ
レステロールを１００とするとβ−シトステロール３６
、スチグマステロール２０、その他、デヒドロエピアン
ドロステロン、エルゴステロール等にわずかに作用する
。

６）補素 ＮＡＤを要求する。

次に本発明のＮＡＤ■−ＣＤＩを使用したコレステロー
ルの定量について詳述する。

コレステロールを定量する場合、実際には緩衝液、ＮＡ
Ｄ■、基質（血清、コレステロール等）及び、ＮＡＤ（
Ｐｉ−ＣＤＨを混合し、一定時間反応し、生成するＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの増加を吸先度３４０ｎｍで測定する。また
必要に応じて、生成したＮＡＤ［Ｆ］Ｈの水素をフェナ
ジンメソサルフェート（ＰＭＳ）、ジアフォラーゼ等に
より、ホルマザン色素等の発色系に導くことも回加であ
る。さらには、反応系にコレステロールエステラーゼ、
界面活性剤及び、安定化剤等の添加も可能である。反応
時のｐ４〜１０の範囲で実施できるが、優れているＰ）
ｆ範囲は７〜９である。

次にＮＡＤ（Ｐｉ−ＣＤＨによるコレステロール定量用
試薬の量的組成についての１例を述べれば、反応系３ｍ
／当り、ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨｏ、１〜１０単位、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）−１０〜１００ｍＭ１　トリトンＸ−１００１
，０％以下、コレステロールエステラーゼ（ベーリンガ
ー社製）０１〜１０単位が有利である。しかし本発明は
これらの量的組成に限定されるものではない。本発明の
測定法における特別な利点は生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
直接測定できることであり、また完全に定量できること
である。

次に試験例及び実施例につき述べる。

試験例 本発明における菌株３柚につき、コレステロール５ｇ／
１１肉エキス５ｇ乙−酵母エキス９．２　ｇ／ｌ　。

少輩の消泡剤の組成よりなる培地（ＰＨ７Ｔ２）ｘｏ６
ｍｌを入れた５００ｍ１客坂ロフラスコに植菌し、３０
°Ｃで４０時間振盪培養した。培養液５０ｍ／を遠心分
離（８０００ｒｐｍ　１０分間）により集菌し、０．１
Ｍリン酸緩衝液ＰＨ７，Ｑ、５Ｑｍ／、で洗浄した。

茨に同じ緩衝液５９ｍ／に菌体を懸濁し、超音波にて菌
体を破砕した。この破砕液を遠心分離（１１００００ｒ
ｐ、１０分間）し、清澄液を得た。得られた清澄液のＮ
ＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ活性を測定し次の結果を得た。

実施例Ｉ Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、　Ｃｈ２　１　ＦＥＲＭ−Ｐ
Ｎｎ６２１７をグルコース５ｇ／７、肉エキス５ｇ／／
１酵母エキススコに植菌し、３０°Ｃで２４時間振盪培
養する。

こ 陶の種培養液をコレステロール５　ｇ／ｌ　、　Ｍｇ　
ＳＯ４７Ｈ２００，２ｇ／ｌ　、消泡剤０−５　ｇ／ｚ
の組成よりなる培地（ＰＨ７，２）２０１を入れた３０
／容ジャーフ１−メンタ−に植菌し、３０°Ｃで通気、
攪拌（０，５ｖ／ｖ／ｍｉｎ、　２０Ｏｒｐｍ　）　Ｌ
／ながら４０時間培養した。

培養液を遠心分離し、得られた菌体を０．１ＭＩＪン酸
緩衝ＰＨ７９に懸濁し、ガラスゼーズにより菌体を破砕
した。この菌体破砕液を遠心分離（１１０００ｒｐ、　
１０分間）し、清澄な菌体抽出液を得た。得られた清澄
液に硫酸アンモニウムを３５％飽和になるように加え酵
素を沈澱せしめた。

沈澱を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）で集め２
０ｍＭリン酸緩衝液ＰＨ７，０，１００ｍ１に溶かし、
セロファンチューブで、２０ｍＭリン酸緩ｉ液Ｐ　Ｈ７
，９に対して２４時間透析した。

次に得られた透析液を２０ｍＭＩＪン酸緩衝液ＰＨ７，
０で平衡化した。ＤＥＡＥ・セルロース２０　Ｑｍｌを
充填したカラムに通し、酵素を吸着せしめた。

同様の緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液濃度を０．１Ｍ
に一ヒげてＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを溶出した。

ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを含む両分を集め、これを濃縮後
２０ｍＭＩＪン酸緩衝液Ｐ　Ｈ７，Ｑに対して透析した
。

こ 淘れを同様の緩衝液で平衡化したヘキシルセファ０−ス
２０　ｍ　ｌを充填したカラムに通し、吸着せしめた。

このカラムを２０ｍＭリン酸緩衝液ＰＨ７，９で洗浄し
た。次に９．５　ＭＮａＣｌを含む同様の緩衝液でＮＡ
Ｄ■−ＣＤＩを溶出し、活性画分を集め、濃縮し、５０
単位／ｍ　ｌのＮＡＤ（Ｐｉ　−ＣＤＨ溶液５．Ｑｍｌ
を得た。全体の活性収率は３０％であった。

実施例２ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　Ｎ１１４　ＦＥＲＭ
−ＰＮ［１６２１６をコレステロール１０　ｇ／ｌ　、
グリセロール２　ｇ／ｌ　１コーンスチープリカ−５ｇ
／ｌ　１ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／ｌ　、　Ｍ遁５０７Ｈ２０
０−２ｇ／１１消泡剤０５ｇ／ｌの組成よりなる培地に
培養し、実施例１と同様の操作を行ない、４０単位／ｍ
ｌのＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ溶液を５．Ｑｍｌ得た。全体
の活性収率は４０％であった。

実施例３ Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＩＡＭ１０２５を
用い、実施例１に準する操作を行ない、３７単４ｖｍｔ
のＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＩ溶液溶液４全／た。全体の活性
収率は５２％であった。

実施例４ Ｎｏｃａｒｄｉａ　１１１）、　Ｎ［ｌ　Ｃｈ２１　Ｆ
ＥＲＭ−ＰＮ［１６２１７をグルコース５　ｇ／ｌ　、
肉エキス、酵母エキスＱ、２ｍ１１少量の消泡剤の組成
よりなる培地（ＰＨ７，２）２００ｍｒを入れた５００
ｍｚ′８坂ロフラスコに植菌し、３０°Ｃで２４時間振
盪培養する。この種培養液をコレステロール５　ｇ／　
ｌ　ｓ　グルコース２ｇ／１１肉ｘ’４　ス５　ｇ／ｌ
　、ｌＫＨ２ＰＯ４・５　ｇ／ｌ　、　ＭｇＳＯ４・７
　Ｈ２Ｏ０，２ｇ／ｌ　、消泡剤０．５　ｇ／ｌの組成
よりなる培地（ＰＨ７，２）２０１を入れた３０１容ジ
ャーファーメンタ−に植菌し、３０°Ｃで通気、攪拌（
０，５ｖ７ｖ／ｍｉｎ　、　２０Ｏｒｐｍ　）　Ｌ／な
がら、７２時間培養した。この培養液を遠心分離（８０
００ｒｐｍ、　１０分間）除菌した。得られた培養ろ液
に、硫酸アンモニウムを４０％飽和になるように加え酵
素を沈澱せしめた。

沈澱を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）で集め、
２０ｍＭリン酸緩衝液ＰＨ７，０・１００ｍ１に溶かし
、セロファンチューブで、２０ｍＭリン酸緩衝液ＰＨ７
，０に対して２４時間透析した。

次に曇施例１〜実施例３に準する方法で精製を行ない、
３０単位／ｍ　ｌのＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ溶液を：３２
ｍ１得た。全体の活性収率は３２％であった。

実施例５ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　Ｎａ３　ＦＥＲＭ　
ＰＮ１１６２１６を用い、実施４に準する操作を行ない
、２５単位／ｍｌのＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ溶液を４．２
ｍｌを得た。全体の活性収率は３８％であった。

実施例６ Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＩＡＭ１０２５を
用い、実施例４に準する操作を行ない、１８単位／ｍ　
ｌのＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ溶液を３．５ｍ４得た。全体
の活性収率は４９％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はノカルジアｓｐ、　Ｎ１１Ｃｈ２−Ｉ　ＦＥＲ
Ｍ−ＰＮＱ６２１７の生産するＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの
３０’Ｃにおける至適ＰＨを示す図で声り、第２図は本
ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの３７°ＣにおけるＰＨ安定性を
示す図であり、第３図は本ＮＡＤ（Ｆ）−ＣＤＨの至適
温度を示す図であり、第４図は本ＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＨ
の熱安定性を示す図である。 第５図はアルカリゲネスｓｐ、Ｎｃｈ４　ＦＥＲＭ−Ｐ
傘６２１６の生産するＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＨの３０°Ｃ
における至適ＰＨを示す図であり、第６図は本ＮＡＤ［
Ｆ］−ＣＤＨの３７°ＣにおけるＰＨ安定性を示す図−
であり、第７図は本ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの至適温度を
示す図であり、第８図は本ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの熱安
定性を示す図である。 第１ｒｊ４ Ｈ 第２図 ５ｔｉ７　　　　ＩＩＩ　　　υ　　　１υ　　１１Ｈ 第８図 温度 第４図 温度 第５図 第７図 °　温度 第８図 温度

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、好気的条件下で生育する微生物を培養し培養物から
   ＮＡＤ　（Ｐ）依存性コレステロール脱水素酵素を採取
   することを特徴とするＮＡＤ［Ｆ］依存性コレステロー
   ル脱水素酵素の製造法。 ２、好気的条件下で生育する微生物がノカルジア属、ア
   ルカリ土類金属、プロテウス属の、うちのいずれかに属
   する菌株である特許請求の範囲第１項記載のＮＡＤ（Ｆ
   Ｍ依存性コレステロール脱水素酵素の製造法。 ３、　ノカルジア属に属する菌株がノカルジアｓｐ、Ｎ
   Ｑｃｈ　２−１　（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、ＰＪｎＣ
   ｈ２−１）　ＦＥＲＭ−Ｐｔ’に６２１７である特許請
   求の範囲第２項記載のＮＡＤ（ＦＭ依存性コレステロー
   ル脱水素酵素の製造法。 ４、　アルカリ土類金属に属する菌株がアルカリゲネス
   ｓｐ、　嵐４　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　Ｎ
   Ｌ１４　）　ＦＥＲＭ−ＰＮｔ１６２１　’６である特
   許、ｉ／ｊ求の範囲第２項記載のＮＡＤ（Ｐ）依存性コ
   レステロール脱水素酵素の製造法。 ５、プロテウス属に属する菌株がプロテウス・ブルガリ
   スＩＡＭＩＱ２５（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌ　ｇａｒｉ
   ｓ　ＩＡＭ１０２５）である特許請求の範囲第２項記載
   のＮＡＤ（Ｐ）依存性コレステロール脱水素酵素の製造
   法。