JPS6053599B2 - コリンオキシダ−ゼを含有する分析用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なコリンオキシダーゼを用いてなるコ
リンまたはベタインアルデヒドを含有する液体の分析に
関する。

従来、コリンを酸化してベタインアルデヒドと１する
公知の酸素としては、酸素番号１．１．９９．１コリン
、（アクセプター）オキシドレダクターゼ〔ＣｈＯｌｌ
ｎｅ： （ＡｃｃｅｐｔＯｒ）０ｘｉｄ０ｒｅｄｕｃｔ
ａｓｅ〕、常用名コリンデヒドロゲナーゼ（ＣｈＯｌｌ
ｎｅｄｅｈｙｄｒＯｇｅｎａｓｅ）〔酵素名・酵素反応
記号一覧第７５頁（１９６１）国際酵素委員会報告、共
立出版〕が挙られ、この酵素は次式で示す反応を触媒す
る。

〔式中、Ａはフラピンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ
）、チトクロームＣなどの呼吸鎖成分、フエナジンメト
サルフエート、フエリサイアナイド２●６ージクロルフ
ェノールインドフェノール、メチレンブルーなどの酸化
還元色素を示す。〕〔メソウズ●イン●エンチモロジー
（ＭｅｔｈＯｄｓｉｎＥｍｙｍＯｌＯｇｙ）■、５６２
−５７０（１９６２）アカデミツク●ブレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。上記反応において、Ａが呼吸
鎖成分であるＦ，ＡＤの場合には、コリンの酸化反応は
次式に示す通り進行すると推定されている。

即ちコリンによつて還元されたＦＡＤ（ＦＡＤＨ２）は
電気をチトクローム系に伝達し、伝達された電子は最終
的に酸素に渡されて水を生成する（これはコリンオキシ
ダーゼ系とも呼ばれる）〔メソウズ●イン エンチモロ
ジ―（ＭｅｔｈＯｄｓｉｎＥｍ押０１０舒）１１６７４
−６７８（１９５５）アカデミツク●ブレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。

以上の如く、公知の、コリンのベタインアルデヒドへの
酵素的酸化反応は、種々の電子受容体を伴つて進行する
ものであつて、動物ではミトコンドリアの呼吸鎖、微生
物、例えばシュードモナス●エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄ
ＯｍＯｎａｓａｅｒｕｇｉｎＯｓａ）Ａ−１６菌株では
、その細胞膜に結合している電子伝達系の成分が関与し
て行なわれると報告されている〔アグリカルチユラル・
アンド・バイオロジカル ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌａｎｄＢｌＯｌＯｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ
ｔｒ３／）？［、１５１３−１５１４（１９７５）、日
本農芸化学会講演要旨集５１、１００（１９７６）日本
農芸化学会〕。

また、上記コリンデヒドロゲナーゼによつてコリンから
生成したベタインアルデヒドは、酵素番号１．２．１．
８．ベタインアルデヒドニＮＡＤオキシドレダクターゼ
（Ｂａｔａｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ：ＮＡＤＯｘｉｄＯｒ
ｅｄｕｃｔａｓｅ）常用名ベタインアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ（Ｂｅｔａｉｒｌｅａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙ
ｄｒＯｇｅｎａｓｅ）〔酵素名・酵素反応記号一覧第７
６（１９６１）国際酵素委員会報告、共立出版〕によつ
て、次式に示す通りの反応によりベタインまで酸化され
る。

（なお、ＮＡＤはニコチナミドアデニンジヌクレオチド
、ＮＡＤＰはニコチナミドアデニンジヌクレオチドホス
フエートおよびＮＡＤ鴇、ＮＡＤＰＨ２は各々の還元体
を略称したものである。）〔酵素研究法第２巻第４２５
−４２６（１９５６）朝倉書店、メソウＪズ●イン エ
ンチモロジー（ＭｅｔｈＯｄｓｉｎＥ部押０１０舒）１
１６７４−６７８（１９６２）アカデミツク●ブレス（
．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）．日本農芸化学会講演
要旨集５１、１００（１９７６）日本農芸化学会〕この
ベタインアルデヒデヒドロゲナーゼは、シ２ユードモナ
ス・エルギノーサＡ−１６菌株より単離、精製され、そ
の分子量は約１４５０００（ゲルろ過法）、等電点は５
．１、至適ＰＨは８．０〜９．へ安定ＰＨは７．附近で
あることが確認されている。本発明者らは、鹿児島県川
辺郡川辺町高田のさ５つまいも畑より分離したアースロ
バクター（，ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒ）属に属する細
菌Ｂ−０５７７菌株が、その菌体内に、コリンのベタイ
ンへの酸化反応を触媒する酵素を生産することを見い出
し、該酵素を単一にまで精製した。

この酵素は、等電点４．６（キャリア・アンホライトを
用いる電気泳動法）、分子量約８４０００±２１００（
セフアデツクスＧ−１５０ゲルｐ過法）の物理的性状を
有し、コリンおよびベタインアルデヒドに基質特異性を
示し、その酵素反応において補酵素の添加を必要とせず
、基質を直接酵素と反応せしめ、１モルのコリンをベタ
インアルデヒドを経由してベタインまで酸化して２モル
の過酸化水素を生成せしめ、また１モルのベタインアル
デヒドをベタインまで酸化して１モルの過酸化水素を生
成せしめる反応を触媒するものであつて、その基質特異
性および酵素反応からコリンオキシダーゼと命名し、新
規なコリンオキシダーゼであることを見い出した。

上記の細菌Ｂ−０５７糟株の肉眼的および顕微鏡的観察
に基く各種培地上における培養の特徴は、次に記載する
通りである。

Ａ肉眼的観察 ２６℃、１８〜４７！ｆ！ｆ！ｆ間培養の結果、次の通
りである。

１肉汁寒天板培養 発育は良好、円形で周囲はなめらかであり、光沢を有
するコンベツクス（ＣＯｎｖｅｘ）状となる。

集落の色は灰白色（Ｈｕｅｌ）ａ）から淡黄色（Ｈｕｅ
ｌト）に変化する。拡散性色素は産生しない。２肉汁寒
天斜面培養 発育は良好で、線状に生育し光沢を有する。

集落の色は灰白色（Ｈｕｅｌ）ａ）から淡黄色（Ｈｕｅ
ｌシ？）に変化する。拡散性色素は産生しない。３肉汁
液体培養 表面発育において、菌膜を形成しないか、もしくは形
成しても非常にうすい。

その培養液は一様に混濁後沈澱を生じるが透明にはなら
ない。４肉汁ゼラチン穿刺培養 表面のみ発育し、その発育は良好である。

ゼラチンを液化しない。５リトマス●ミルク 発育は弱く、２週間位でベプトン化する。

軟かい凝固またはアルカリ化する場合もある。

リトマスは還元しない。４色の表示記載は１９５師コン
テイナー●コ−ポレイシヨン オブ アメリカ（ＣＯｎ
ｔａｉｎｅｒＣＯｒｐＯｒａｔｉＯｎＯｆＡｍｅｒｉｃ
ａ）発行「カラー●ハーモニ●マニュアル（ＣＯｌＯｒ
ＨａｒｍＯｎｙＭａｎｕａり」の表示法に従つた。

Ｂ顕微鏡的観察１細胞の形、大きさ 肉汁寒天平板培養による、若い細胞（６時間）は桿状
で、大きさは０．５〜０．８×１．５〜２．０μで、古
い細胞（比時間）は球状（０．５〜０．８μ）も存在す
る。

２多形性 肉汁液体培養において、Ｔ字型、Ｙ字型の細胞を観察
することがある。

３運動性 なし（軟寒天培地にて観察）。

４胞子 なし。

５グラム染色 若い細胞は陽性、古い細胞は陰性である。

６抗酸性染色 陰性 Ｃ次に生理学的性質を記載する。

硝酸塩の還元 陰性脱窒反応
陰性■テスト
陰性■Ｐテスト
陰性インドールの生成
陰性硫化水素の生成 弱
陽性スターチの加水分解 弱陽性クエ
ン酸の利用コーザー（ＫＯｓｅｒ）培地
陰性クリステンゼン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）培地
陽性硝酸塩の利用 陰性アン
モニウム塩の利用 陰性色素の生成
陰性！ウレアーゼ
陽性オキシダーゼ
弱陽性カタラーゼ
陽性生育ＰＨ範囲 ４．０〜１１
．０生育温度範囲 ５〜３ｒＣｔ酸
素に対する態度 好気性セルロースの
加水分解 陰性力ティンの加水分解
陰性０−Ｆテスト（注１） ０（酸
化的分解）糖より酸の産生（ガスは産生しない）（注２
）１週間以内グルコース、イノシトール ２週間以内 セロビオース、エリスリトール、フラクトー ス、マ
ルトース、マンニトール、マンノー ス、ソルビトール
、シユクロース、トレハロ ース、スターチ、酸を作ら
ないもの ） Ｌ−アラビノース、ヅルシトール、エスクリ ン、
ガラクトース、グリセリン、ラクトー ス、メレジトー
ス、メリビオース、サリシ ン、ソルボース、キシロー
ス、注１；Ｏ−Ｆテスト用培地 本細菌Ｂ−０５ｎ菌株は、ペプトンを含む培地では酸
を産生しないため、変法培地（組成：ＮＨｌＨ２ＰＯ４
ｌｆｌイーストエキス粉末１ｙ１ＫＣ１０．２ｆ，，Ｍ
ｇＳ０４・７Ｈ２００．２ｇ、グルコース１０ｆ１細菌
用寒天末２ｆ１蒸留水１ｅ．．ＰＨ７．２）を用いた。

注２； 基礎培地（組成：ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４ｌｙｌイー
ストエキス粉末１ｙ．．ＫＣ１０．２ｆ，．ＭｇＳ０４
７Ｈ２００．２ｙ１細菌用寒天末２ｙ１蒸留水１ｅ１Ｐ
Ｈ７．２）を用いた。

以上の諸性質、特にグラム陽性菌、非抗酸性、非運動性
の桿菌または球菌で、分枝することがあるが、線維状に
はならず、糖を酸化的に分解し、カタラーゼ陽性、オキ
シダーゼ弱陽性でセルロースを分解しない性質を示す本
細菌Ｂ−０５７爛株は、バージース●マニュアル●オブ
●デイタミネイテイブ●バクテリオロジー（Ｂａｒｇｅ
ｙ３ｓｍａｎｕａｌＯｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢ
ａｃｔｅｒｉＯｌＯｇｙ）１９７４によればコリネホー
ム・グループ●バクテリア（ＣＯｒｙｎｅｆＯｒｍｇｒ
ＯｕｐＢａｃｔｅｒｉａ）のアースロバクター属に属す
るものと認められた。

なお、アースロバクター属と他のコリネホーム・グルー
プ・バクテリアとを比較すれば、明らかに次の点で大別
される。

コリネバクテリウム（ＣＯｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
） ：糖を発酵的に分解するロチア（ＲＯｔｈｉａ）：
線維状となり、糖を発酵的に分解するクルチア（Ｋｕｒ
ｔｈｉａ）：糖より酸を発生しないセルロモナス（Ｃｅ
ｌｌｕｌＯｍＯｒｌａｓ） ：セルロース分解能を有す
るブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ拍Ｒｉｊ）：
糖を発酵的に分解するミクロバクテリウム（ＭｉｃｒＯ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ：糖を発酵的に分解するプロピ
オニバクテリウム （ＰｒＯｐｉＯｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｒｒｌ）：嫌気的
細菌フバクテリウム（Ｆｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ：嫌
気的細菌アースロバクター（Ａｒ′ＴｈｒＯｂａｃｔｅ
ｒ）：糖を酸化的に分解する以上の通り、本細菌Ｂ−０
５７漕株はアースロバクター属に属する菌と認められ、
またバージース●マニュアル●オブ●デイタミネイテイ
ブ●バクテリオロジー１９７４によれば、アースロバク
ター属は７種に分けられることが報告されており、これ
らの種についてその標準菌株を併行試験および文献記載
の事項に基き、次の通りの結果を得た。

なお、培養温度は２６℃であり、使用菌株およびその略
号は次の通りである。アースロバクター シンプレツク
ス （．ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）ＩＦＯ
ｌ２Ｏ６９（以下Ｓと略÷２す）アースロバクター●グ
ロビフオーミス （ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｇｌＯｂｉｆＯｒｍｉｓ）
ＩＦＯｌ２ｌ３７（以下Ｇと略す）アースロバクター●
シテレウス（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ
）ＩＦＯｌ２９５７（以下Ｃと略す）アースロバクター
ツメツセンス（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｔｕｒｎｅ
ｓｃｅｒｌｓ）ＩＦ′０１２９６０（以下Ｔｕと略す）
アースロバクター ターレゲンス （ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｔｅｒｒ′ｅ？Ｎｓ）ＩＦ
Ｏｌ２９６ｌ（以下Ｔｅと略す）アースロバクター・゛
ゾユオデカデイス （Ａｒ′ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒｄｕＯｄｅｃａｄｉｓ）
ＩＦＯｌ２９５９（以下Ｄと略す）アースロバクター
フラベツセンス （ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｆｌａｖｅｓｃｅｒｌｓ）
（以下Ｆと略す）なお、ＤおよびＦの菌については、バ
ージース・マニュアル・オブ●デイタミネイテイブ●バ
クテリオロジイー１９７４に記載の事項のみによるもの
である。

またＤ菌株は、普通寒天培地では生育せず。

以上の比較実験の結果において、本細菌Ｂ一０５７７菌
株は、集落の色、スターチ分解能、一部の糖よりの酸の
産生能を除いてアースロバクター・グロビフオーミスＩ
Ｆ′０１２１３７に一致している。またアースロバクタ
ー・グロビフオーミスは普通寒天培地などでは特有の色
素は産生しない菌株が多いが、非水溶性のレモン様の黄
色の色素を産生する菌株もある点、さらに本細菌Ｂ−０
５ｎ菌株およびアースロバクター・グロビフオーミスＩ
ＦＯｌ２ｌ３７の両菌株ともスターチより酸を産生する
スターチ分解能の点、さらにまたアースロバクター●グ
ロビフオーミスＩＦＯｌ２ｌ３７は、本細菌Ｂ一０５７
痛株が酸を産生する糖のうち、エリスリトールを除く全
部の糖から酸を産生する酸産生能の点より、本細菌Ｂ−
０５７７菌株をアースロバクター・グロビフオーミスに
属するものと同定し、アースロバクター◆グロビフオー
ミスＢ−０５７７（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｇｌＯｂ
ｉｆＯｎＴｌｌｓＢ−０５７７）と命名した。

また本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受
託番号「ＦＥＲＭ−ＰＮＯ．３５ｌ８］とし，て寄託さ
れている。またこの新規な酵素コリンオキシダーゼはコ
リ木をコリンまたはベタインアルデヒドを含有する液体
に作用せしめ、次いで反応によつて生成する過酸化水素
、ベタインまたは消費される酸素を測定してなるコリン
またはベタインアルデヒドを含有する液体の分析に係る
発明である。

本発明におけるコリンオキシダーゼとしては、上記の基
質特異性、酵素作用を有するものであればよく、その元
素分析値、添加物による阻害、活性化など多少の相異を
示すものであつても上記の性状、作用を有するものは本
発明のそれに包含されるものであり、このコリンオキシ
ダーゼを得るための使用菌としては上記の菌はその一例
である。また本発明の製法における使用菌としては、上
ｒ土ＰＬｊ射ＩｌｌＯ／．；ヤ」λ久ツおよびベタイン
アルデヒドをその基質とする酵素であるため、種々の確
認試験などの定量手段などを用いることにより、コリン
またはベタインアルデヒドを含有する液体にコリンオキ
シダーゼを作用せしめ、次いて生成する過酸化水素の定
量、生成するベタインの定量、消費された酸素の定量を
行なうことによりコリンまたはベタインアルデヒドを含
有してなる液体の分析をなし得るものであることを見い
出した。

本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、少なく
とも下記の１基質特異性、２酵素作用を有してなるコリ
ンオキシダーゼ１基質特異性：ー般式 （式中、Ｒ１は−ＣＨ２ＯＨ基または−ＣＨＯ基を示す
。

）で表わされる化合物 ２酵素作用：反応式〔１〕および／または〔■〕 記の菌はその一例であつて、アースロバクター属に属す
るコリンオキシダーゼ生産能力を有するものであればす
べて本発明において使用できる。

もちろん微生物は、自然的、人工的に変異を起こしやす
く、本菌も例外ではないが、これらの変異株であつても
コリンオキシダーゼの生産能力を失わない限り本発明に
使用し得ることはいうまでもないことである。まず本酵
素を得るに当つて、アースロバクター属に属するコリン
オキシダーゼ生産・菌此よる製法について例示すれば、
次の如くである。即ちアスロバクター属に属するコリン
オキシダーゼ生産菌を、抗生物質、酵素などを生産する
通常の方法で培養する。培養の形態は液体培養でも固体
培養でもよいが、工業的にはコリンオキシターゼ生産菌
の細胞をその生産用培地に接種し、深部通気攪拌培養を
行なうのが有利である。培地の栄養源としては、微生物
の培養に通常用いられるものが広く使用される。窒素源
としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコ
ーン●スチープ●りカー、大豆粉、ペプトン、種々の肉
工キズ、酵母工キズ、硫安、塩化アンモニウムなどが使
用される。炭素源としては、同化可能な炭素化合物であ
ればよく、例えば糖蜜、ブドウ糖、スターチ加水分解物
などが使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸
マグネシウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウ
ムなどの種々の無機塩やディスホームＢＣ−５１Ｙ１同
ＣＡ一２００、同ＣＡ−３３０（商品名：日産油脂社製
）などの消泡剤が必要に応じて使用される。また、培地
中にコリンを添加せしめることによつて、培養時コリン
オキシターゼの生産能を上昇せしめることが好ましい。
このコリンの添加量としては約０．５〜１％程度であり
、この添加によりコリンオキシダーゼの生産性は少なく
とも１皓以上上昇する。培養温度は菌が発育し、コリン
オキシダーゼを生産する範囲内て適宜変更し得るが、特
に好ましくは２５〜３０′Ｃである。培養時間は条件に
よつて異なるが、通常１５〜（４）時間程度であつて、
コリンオキシダーゼが最高力価に達する時期をみはから
つて適当な時期に培養を終了すればよい。かくして得ら
れた培養物中において、コリンオキシダーゼはその菌体
内に含有、蓄積されている。

この様にして得られた培養物中よりコリンオキシダーゼ
を抽出し、粗製のコリンオキシダーゼ含有液を得るため
に、例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿
菌体を、必要に応じてトリスー塩酸緩衝液などの溶液に
懸濁せしめ、次いで、リゾチーム処理、超音波処理、フ
レンチプレス処理などの種々の菌体処理手段を適宜選択
組合せればよい。

特に、リゾチーム処理により、その収率およびその比活
性は良好となる。次いでこの粗製のコリンオキシダーゼ
含有液を、さらに公知の、蛋白質、酵素などの単離、精
製手段を用いて処理することにより精製されたコリンオ
キシダーゼを得ることができる。

例えば、粗製のコリンオキシダーゼ含有液に、アセトン
、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの有
機溶媒による分別沈澱法、硫安などによる塩析法などを
用いて水溶液から沈澱せしめ、回収すればよい。さらに
この沈澱物を、例えば電気泳動法などにて単一の帯を示
すまで精製すればよく、その精製手段としては目的とす
るコリンオキシターゼの性質を利用した手段を用いれば
よく、例えば上記の沈澱物をトリスー塩酸緩衝液などの
媒体に溶解し、これをジエチルアミノエチル−セルロー
ス、−デキストランゲル架橋体などの陰イオン交換体、
デキストランゲル、ポリアクリルアマイドゲルなどのゲ
ルろ過剤によるクロマトグラフ法を行なえばよい。また
これらの手段を適宜組合せて、精製すればよく、次いで
これを真空凍結乾燥手段などにより乾燥してコリンオキ
シダーゼの精製粉末を得る。このアースロバクター●グ
ロビフオーミスＢ−０５７７より得られるコリンオキシ
ダーゼは次下に述べる理化学的性質を有するものである
。

（１）作用 コリンを酸化してベタインアルデヒドとなし、ベタイン
アルデヒドを酸化してベタインとする。

コリンの場合には、１モルのコリンより１モルのベタイ
ンアルデヒドおよび１モルの過酸化水素を生成し、さら
にこのベタインアルデヒドより１モルのベタインおよび
１モルの過酸化水素を生成する。

即ち、１モルのコリンより１モルのベタインおよび２モ
ルの過酸化水素を生成する。またベタインアルデヒドの
場合には、１モルのベタインアルデヒドより１モルのベ
タインおよび１モルの過酸化水素を生成する。

（２）力価の測定法 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ＆０）０．０５ｍ１
、３匂１ｍ１の４−アミノアンチピリン０．０５ＴｆＬ
ｔ１０．１％フェノール０．０１ｍ１、２ｕ．１Ｔｎ９
パーオキシダーゼ（ＰｅｒＯｘｉｄａｓｅ）０．１へ０
．１Ｍ塩化コリン０．１０ｍｔ１および蒸留水０．１０
ｍ１よりなる反応液０．５０ｍ１に、酵素溶液５μｅ加
え、３ｒＣにて５分間反応させた後これに２．５ＴｆＬ
１のエタノールを加えて反応を止める。

比色は４８０ｒ１ｒｎ，で行い、酵素活性は、１分間に
１μＭＯＩｅの過酸化水素を生成する活２性を１単位（
１Ｕｒ１Ｉｔ１１Ｕ．）とする。また力価の算出は次式
に従う。酵素活性（Ｕ．Ｉｍｌ）＝ΔＡ４８Ｖｍｉｎ×
１４（なお、ΔＡ４８Ｏは４８０ｎｍの波長における１
分間の吸光度変化を示す） ２
（３）基質特異性上記の力価の測定法における測定法を
利用して、その反応液中の塩化コリンの代りに、種々の
基質（ベタインアルデヒド、Ｎ−メチルアミノエタノー
ル、Ｎ−Ｎ−ジメチルエタノールア；ミン、モノエタノ
ールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミ
ン）を用いて、コリンに対する相対活性を求めた。

アア
』Ｊ１シＩｊｉ巴．！ムその結果、この酵
素は、少なくともコリン、ベタインアルデヒドに高い活
性を示すものと認められる。

（４）至適ＰＨ トリスー塩酸緩衝液を用いて、コリンオキシダーゼのコ
リンに対する酵素活性を測定した結果、第１図に示す通
りであつて、その至適ＰＨは８付近と認められる。

（５）至適温度 上記の力価の測定法における測定法を利用して、その温
度条件を変えて酵素反応を行ない、コリンオキシダーゼ
のコリンに対する酵素活性を測定した結果、第２図に示
す通りであつて、その至適温度は４０℃付近と認められ
る。

（６）ＰＨ安定性 ＰＨ６〜７はジメチルグルタル酸緩衝液、ＰＨ７〜８は
トリスー塩酸緩衝液、ＰＨ９〜１０はグリシンー水酸化
ナトリウム緩衝液を用いた。

２５ｗｉ，Ｍの各ＰＨの緩衝液０．１Ｔｎ１に、酵素溶
液（酵素蛋白質濃度１０μＹｈｌ）５μ′を加え、３７
℃にて３０分間放置する。

次いでこれに、０．５Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．
Ｏ）０．０５ｍ１を加えてＰＨを調節した後、反応液を
加えて、上記の力価の測定法に従つて、コリンオキシダ
ーゼのコリンに対する酵素活性を測定した結果、第３図
に示す通りであつて、そのＰＨ安定性は８付近と認めら
れる。（７）熱安定性 酵素蛋白質１０ｐｙ１ｍ１を含有してなる１０７７ＬＭ
トリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１ｍ１を各温度にて
１吟間放置し、次いで上記の力価の測定法に従つて、コ
リンオキシダーゼのコリンに対する酵素活性（残存活性
）を測定した結果、第４図に示す通りであつて、酵素は
、４０℃付近では安定であり、４０℃付近を超える温度
では急速に低下するものと認められる。

（８）種々の物質に対する影響 上記の力価の測定法において、種々の添加物を加えて、
コリンオキシダーゼのコリンに対する酵素活性を測定し
た結果、次の通りである。

なお、添加物の内、金属塩の添加量は５ｒｒｔ，Ｍであ
り、界面活性剤の添加量は０．１％ＷＩＶである。トリ
トン（ＴｒｌｔＯｎ）Ｘ−１００（界面活性剤：商，品
名：和光純薬工業社製） ９５．５アデカト
ール（ＡｄｅｋａｔＯｌ）ＳＯ−１２０（界面活性剤：
商品名：旭電化工業社製） １０５．７ラウリル
硫酸ナトリウム ９４．３デオキシコール
酸ナトリウム ９４．３；ツウイーン（Ｔｗｅ
ｅｎ）２０（界面活性剤：商品名：和光純薬工業社製）
９６．６ラウリルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム９１．０カチオンＤＴ２Ｏ５（界面活性剤：商
品名：日産油脂社製） ６
５．９ζ（添加物なし） １００
．０（９）分子量８４００±２１００〔セフアデツクス
Ｇ−１５０（商品名：フアルマシア社製）ゲルろ過法に
より測定〕（１０）等電点 ４・６（キャリア・アンホライトを用いる電気泳動法に
より測定）（１１）電気泳動 ポリアクリルアミドゲル（ＰＨ８．３）を用い、タデイ
スク電気泳動法を用いた。

まず、コリンオキシダーゼを電気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルをアミドブラックにて染色した結果、第５
図の１に示す通り、濃青色の一本の帯のみ認められた。

また、コリンオキシダーゼを電気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルを、下記組成よりなる反応液反応液組成０
．２Ｍトリスー塩酸緩衝液 １．０７７！Ｌ
呈色試液 ２．０ｍ１０．１
Ｍ基質溶液 １．０ＴｎＬ蒸留水
６．０ｍ１１０．０ｍ１
（ただし、上記反応液組成中、呈色試液とは０．１Ｍト
リスー塩酸緩衝液１０ｍ１、５ｍ９１ＴｎＬ０−ジアニ
ジン●エタノール溶液０．３ｍ１、パーオキシダーゼ１
０Ｕ．よりなる組成の試液を示し、基質溶液とは基質で
ある塩化コリンまたはベタインアルデヒドの水溶液を示
す。

）に浸し、３ｒｃ１２０〜３紛間放置して、現われる帯
を確認した。その結果、基質溶液として塩化コリンを用
いた酵素反応生成物による染色は、第５図の２に示す通
りであつて、赤色の一本の帯が認められ、また基質溶液
としてベタインアルデヒドを用いた酵素反応生成物によ
る染色は、第５図の３に示す通りであつて、赤色の一本
の帯が認められた。さらに、これらの染色されたゲルは
水洗後７％酢酸に浸し固定する。さらにまた、この第５
図の１，２，３よ６り明らかな通り、ゲル上に示された
泳動度は全て同一であり、単一の帯を認めることにより
、このコリンオキシダーゼは単一の蛋白質であることが
確認された。

１２）作用順序の確認試験 コリンあるいはベタインアルデヒドを０．０１〜０．０
５μＭＯｌｅｌトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１０
μＭＯｌｅｌ４−アミノアンチピリン１５０ｐｙ１フェ
ノール１００μｙ１パーオキシダーゼ０．２Ｌ１．、コ
リンオキシダーゼ０．２５Ｕ．を含有する反応液０．５
ｍｔを、３７℃、２紛間反応せしめ、しかる後２．５ｍ
１のエタノールを加えて４８０ｒ１ｍにて吸光度を測定
した。

また、コリン、ベタインアルデヒドの代りに、定量の過
酸化水素を加えて同様に行なつて、検量線を求めた。

その結果は第６図に示す通りであつて、図中、Ｏ−０は
基質としてコリンを用いた場合の測定結果であり、●−
●は基質としてベタインアルデヒドを用いた測定結果で
あり、さらにΔ一Δは基質の代りに過酸化水素を用いた
検量線を示す測定結果であり、これらの図は酵素がコリ
ン１モルより過酸化水素２モルを生成する反応およびベ
タインアルデヒド１モルより過酸化水素１モルを生成す
る反応を触媒することを示すものである。

また上記試料にて、酸素電極を用いて酸素の消費量を測
定した結果、コリン１モルが酸化されるとき酸素２モル
が消費され、ベタインアルデヒド１モルが酸化されると
き酸素１モルが消費されることを確認した。さらに上記
試料の反応終了物より生成したベタインの定量は、該反
応終了物をまずＰＨｌに調節し、次いでこれを活性炭処
理した後１６＠濃縮して、これをライネツケ塩（Ｒｅｉ
ｎｅｃｋｅＳａＩｔ）法により定量して行つた、コリン
１モルよりベタイン１モル、ベタインアルデヒド１モル
よりベタイン１モルが生成されることを確認一した。

以上の通り、このコリンオキシダーゼは、コリンおよび
ベタインアルデヒドに作用して酸化せしめる際、補酵素
を必要とせず、直接酸素と反応せしめ、過酸化水素を生
成せしめること、またその分子量が８４０００±２１０
へその等電点が４．６であることなどの理化学的性質よ
り、公知のコリンデヒドロゲナーゼやベタインアルデヒ
ドロゲナーゼと異なつたものと認められ、このコリンオ
キシダーゼは新規な酵素と認められる。

また上記の理化学的性質の酵素の作用機序の確認試験に
使用した定量手段はその一例であるが、以下に述べる通
り、このコリンオキシダーゼは上記の確認試験と同様な
定量手段、例えば過酸化水素の定量、生成するベタイン
の定量、消費された酸素の定量などの手段を用いること
により、コリンまたはベタインアルデヒドを含有してな
る液体の分析を可能ならしめたものである。

またこの酵素はコリンやベタインアルデヒドの試薬の純
度測定、コリンやベタインアルデヒドの誘導体を分解せ
しめて生成するコリンやベタインアルデヒドを測定して
なるコリンやベタインアルデヒドの誘導体の定量、コリ
ンやベタインアルデヒドの誘導体を分解してコリンやベ
タインアルデヒドを生成せしめる酵素の活性測定などの
酵素的定量の方法を提供するものである。

本発明に使用されるコリンまたはベタインアルデヒドを
含有してなる液体とは、コリンまたはベタインアルデヒ
ドそのものの水または水性媒体の溶液であつてもよく、
またコリンまたはベタインアルデヒドの誘導体であつて
、この誘導体よりコリンまたはベタインアルデヒドを遊
離せしめたものであつてもよい。

また上記水性媒体として、好ましくは、コリンオキシダ
ーゼに対し阻害効果を及ぼさない、例えばトリスー塩酸
緩衝液が挙げられる。さらにコリンの誘導体としては、
例えば生体内においてリン脂質として知られている、リ
ゾレシチン、レシチン、スフィンゴミエリンさらにアセ
チルコリン、シチジンリン酸コリン、ホスホリルコリン
などの生体内成分や、ベンゾイルコリン、プロピオニル
コリン、ブチリルコリン、サクシニルコリンなどの合成
物であつて、要は化学的または酵素的手段にてコリンを
遊離し得るそれらの誘導体であればよい。またこれらの
誘導体よりコリンを遊離せしめる手段としては、例えば
アルカリ分解又は酸分解などの化学的手段が挙られ、ま
たクロストリジウム●ウエルチ（ＣｌＯｓｔｒｉｄｉｕ
ｒｒｌｗｅＩｃｈｉｉ）、バチルス セレウス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）などのホスホリパーゼＣ（Ｐ
ｈＯｓｐｈＯｌｌｐａｓｅＣ）と牛、プタ、ニワトリの
小腸粘膜、牛の肝蔵、エシエリシア・コリー（ＥｓＯｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃＯｌｉ）などのアルカリホスファター
ゼ（ＡｌｋａｌｌｒｌｅｐｈＯｓｐａｔａｓｅ）との組
合せ、キヤベノツ、ストレプトマイセス●ハチジヨウエ
ンシス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｈａｃｈｉｊＯｅｒ
ｌｓｉｓ）Ａｌｌ４３ｓストレプトマイセス●クロモフ
スカス（Ｓｔｒ′ＥｐｔＯｍｙｃｅｓｃｈｒＯｍＯｆｕ
ｓｃｕｓ）Ａ−０８４８などのホスホリパーゼＤ（Ｐｈ
ＯｓｐｈＯｌｌｐａｓｅＤ）、牛血球、電気ウナギ、７
馬血清、人血清などのコリンエステラーゼ（ＣｈＯＩｉ
ｎｅｅｓｔｅｒａｓｅ）などの酵素的手段が挙られる。

なお上記の酵素およびその由来は何んら限定されるもの
でなく、各々ホスホリパーゼＣ１アルカリホスファター
ゼ、ホスホリパーゼＤ１コリンエステラーゼの活性を有
しているものであればよい。さらに詳しく述べれば、例
えばホスホリパーゼＣとアルカリホスフターゼによるレ
シチンに対する反応は、次式に示す通りであつて、レシ
チンはホスホリパーゼＣにより、ジグリセリドとホスホ
リルコリンに加水分解され、さらにこのホスホリルコリ
ンはアルカリホスファターゼにより無機リン酸とコリン
に分解されるものである。

またホスホリパーゼＤによるレシチンに対する反応は次
式に示す通りであり、レシチンはホスホリパーゼＤによ
りホスフアチジン酸とコリンに加水分解されるものであ
る。

さらにコリンエステラーゼによるベンゾイルコリンに対
する反応は、次式に示す通りであり、ベンゾイルコリン
はコリンエステラーゼにより安息香酸とコリンとに分解
されるものである。

上記の酵素は一例であつて、さらにコリンまたはベタイ
ンアルデヒドの誘導体よりコリンまたはベタインアルデ
ヒドを遊離し得る手段であれば、如何なる手段であつて
もよい。なお、これらの前処理を必要とするコリンまた
はベタインアルデヒドの誘導体を用いて対応する酵素を
作用せしめるに当つて、その処理は別の工程として先に
行なつてコリンまたはベタインアルデヒドを遊離せしめ
、これをコリンまたはベタインアルデヒドを含有する液
体としてもよく、または上記の酸素反応が短時間である
ため、別工程とすることなく、対応する酵素および目的
とするコリンオキシダーゼとを同時に加えて、以下に述
べる操作を行なう。この様にして用意された、コリンま
たはベタインアルデヒドを含有する液体に、コリンオキ
シダーゼを作用せしめるのであるが、このコリンオキシ
ダーゼは、緩衝液に溶解した溶液であつてもよく、さら
にその酵素活性を劣化せしめない状態にて、マイクロカ
プセル化手段、樹脂または多糖類などとの共有結合手段
、吸着手段などの公知の酵素固定化手段を施したもので
あつてもよい。

またこのコリンオキシダーゼの添加量としては、試料の
量などによつて異なるが、酵素による反応時間を好適な
短時間とせしめるに、１単位以上であればよく、好まし
くは１．５〜５単位程度である。また用いるコリンオキ
シダーゼの比活性は高いものほど反応にとつて良好であ
ることは言うまでもないことであるが必すしも最高純度
のものを要求するものではない。このようにして、該液
体にコリンオキシダーゼを添加して、一定時間インキユ
ベイトした該液体中には、過酸化水素およびベタインが
生成され、対応した酸素の減少が起きる。

次いで、これらの過酸化水素、ベタイン、酸素の測定を
行なうのであるが、酸素の測定については、上記した通
り、酸素電極を用いる方法が最も簡便であり、ベタイン
についても一例として上記したライネツケ塩法が好まし
く、またベタインをエステル化してガスクロマトグラフ
ィーなどによる測定方法もある。また過酸化水素の測定
法としては好ましくは過酸化水素と反応してその色調に
変化を生する１種もしくは２種以上の呈色剤からなるシ
ステムによつて、比色測定によつて測定することが好ま
しい。測定する方法としては、例えば、生成する過酸化
水素と反応して安定した赤色を形成する４価のチタン化
合物とキシレノールオレンジによる反応、或はフェノー
ル、４−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼに
よる反応などを利用する方法などが挙られる。このフェ
ノール、４−アミノアンチピリン、パーオキシダーゼに
よる反応を利用する過酸化水素の測定において、フェノ
ールはコ．リンオキシダーゼの活性を阻害するため、最
小限の濃度とすることが好ましく、また４−アミノアン
チピリンは生成する過酸化水素量に対し１１２モル以上
、好ましくは２モル以上、さらにパーオキシダーゼは０
．１Ｕ以上、好ましくは０．２〜０．５Ｕ程度一使用す
ることが望ましい。さらにまた４−アミノアンチピリン
の代りに４−アミノフエナゾーンを用いてもよく、これ
らの各試薬は溶液としてあらかじめ混合、調製すればよ
い。このようにして呈色せしめられた色調を適当な波長
にて測定し、その検量線より存在する過酸化水素を定量
し、存在するコリンまたはベタインアルデヒドもしくは
コリンの誘導体またはベタインアルデヒドの誘導体の定
量、またはコリンの誘導体を加水分解する酵素活性など
の定量を行なう。また上記の方法以外に、２●６ージク
ロルフェノールインドフェノールとパーオキシダーゼの
組合せによる過酸化水素の定量測定、グアヤク脂とパー
オキシダーゼの組・合せによる過酸化水素の定量測定、
ホモバニリン酸とパーオキシダーゼの組合せによる過酸
化水素の定量測定など種々の方法が挙げられる。上記の
過酸化水素、ベタイン、酸素の定量において、特に過酸
化水素の定量、さらに過酸化水素をパーオキシダーゼお
よび呈色剤によつて定量する方法が簡便かつ正確である
ため好ましい。

従つて、この過酸化水素、ベタイン、酸素の測定値、お
よびそれらの検量線より、使用した液体中のコリンまた
はベタインアルデヒドの量的関係を求めればよく、コリ
ンまたはベタインアルデヒドそのものである試薬などの
純度測定においてはそのままの値から容易に求められ、
コリンなどの誘導体を用いて酵素などにて処理した場合
においては、測定値からコリン誘導体の量的関係を求め
るか、測定値から使用した酵素活性の関係を求めること
によつて分析されるものである。また上記分析法は、コ
リンオキシダーゼによるコリンのベタインアルデヒドを
経由したベタインへの酸化反応を利用した分析手段を挙
けたものであるが、またこの酸化反応過程の中間生成物
たるベタインアルデヒドまたはその生成量に対応する過
酸化水素を定量してコリンの定量を行つてもよい。しか
しこの生成したベタインアルデヒドはさらにコリンオキ
シダーゼにより酸化され過酸化水素を生じるため、測定
誤差を生じる欠点を有しており、そのため生成したベタ
インアルデヒドがコリンオキシダーゼによつて次工程の
酸化作用を受けないような反応阻害剤、例えばベタイン
アルデヒドと容易にシッフ塩基などを形成する阻害剤や
ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼとＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰとによる反応系路を変更せしめるコリンオキシダ
ーゼのベタインへの阻害剤を添加するなどの方法が推定
される。さらに、これらの分析法において使用される種
々の組成は適宜選択変更されるものであつて、またこの
分析法はその分析の目的に応じて、それぞれ適宜選択さ
れた組成を有するキットとして組立てられるものである
。

また上記の分析法において使用する、リン脂質よりコリ
ンを遊離せしめるホスホリパーゼＤについて詳しく述べ
る。使用するホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマ
イセス●ハチジヨウエンシスＡｌｌ４３菌株やストレプ
トマイセス●クロモフスカスＡ−０８４８菌株由来の酵
素が挙られ、これらの菌株は、工業技術院微生物工業技
術研究所に各々微生物受託番号「ＦＥＲＭ一ＰＮＯ．ｌ
３２９Ｊ′（特開昭４８−９９３８６号）、「ＦＥＲＭ
−ＰＮＯ．３５ｌ９」として寄託されている。特にスト
レプトマイセス・クロモフスカスＡ−０８４８菌株「Ｆ
ＥＲＭ−ＰＮＯ．３５ｌ９」の菌学的性状、培養手段、
精製手段、さらに得られるホスホリパーゼＤの理化学性
質などを述べれば、次の通りである。菌学的性状（ａ）
形態 肉眼的観察によれば、胞子を形成した気菌糸は灰色を呈
し、基生菌系は黄褐色ないし黄橙色を呈し、可溶性色素
は通常生成しない。

スターチ、無機塩寒天培地上で、３０℃、１０〜１５Ｅ
Ｉ間培養観察し、顕微鏡観察した所見は次の通りである
。

気菌糸は直径０．６〜０．８μ、波状で単純分枝をなし
て伸長し、多数の胞子の連鎖を形成する。

胞子の連鎖は通常ゆるく１〜３回巻いた螺旋を形成（Ｓ
ｐｉｒａｌｅｓ）し、まれに４〜５回巻いた螺旋もみら
れ、またときには波状または直状で螺−旋を形成しない
もの（ＲＦ）もみられる。胞子は球形ないし楕円形で、
大きさは０．６〜０．８×０．７〜０．９μてあり、表
面にとげ状の突起を形成している。基生菌糸は分枝をも
つて屈曲状に伸長し、直径０．４〜０．６μで、菌糸の
***や胞子の着．生は認められない。鞭毛胞子や胞子の
うの着生も認められない。（ｂ）全菌体分析によるジア
ミノピメリン酸の分析ベネツツ（Ｂｅｎｎｅｔｔ′ｓ）
培地で６日間振盪培養した菌体をベツカー（Ｂｅｃｋｅ
ｒ）らの方法一「アプライド マイクロバイオロジー（
ＡｐｐｌｌｅｄＭｌｃｒＯｂｌＯｌＯｇｙ）？（５）４
２１−４２３（１９６４）〕で分析した結果、ＬＬ−ジ
アミノピメリン酸が検出され、メソ（ＭｅｓＯ）一型は
検出されなかつた。

・）培養的性状 下記の培地を用い、３０℃、２０日間培養観察した性状
は、次に示す通りであつて、色の表示は「カラー●ハー
モニ●マニュアル」に従つた。

（１）シユクロース・削酸塩寒天培地生育：僅少、無色
。

気菌糸：僅少。

可溶性色素：生じない。

（２）グリセリン・硝酸塩寒天培地 生育：中程度ないし良好、パステル・オレンジ（Ｐａｓ
ｔｅＩＯｒａｎｇｅ；４１ｃ）。

気菌糸：生じない、ないし僅少。可溶性色素；ヌード●
タン（ＮｕｄｅＴａｎ；４ｇＣ）、僅かに生じる。

（３） グルコース●アスパラギン寒天培地生育：中程
度、バンプー（ＢａｍｂＯＯ；２ｆｂ）ないしアンパー
（Ａｍｂｅｒ；３ｐｅ）。

気菌糸：貧弱ないし中程度、ホワイト （Ｗｈｉｔｅ；ａ）。

可溶性色素：生じない。

（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：中程度
、ゴールデン・ブラウン （ＧＯｌｄｅｎＢｒＯｗｎ；３ｐｇ−３ｐｉ）。

気菌糸：中程度、シルバー・グレイ（ＳｉｌｖｅｒＧｒ
ａｙ；３ｆｅ）ないしナチユラル（Ｎａｔｕｒａｌ；３
ｄｃ）。

可溶性色素：生じない。

（５）スターチ・無機塩寒天培地 生育；中程度ないし良好、ゴールデン・ブラウン（３ｐ
ｉ）ないしクロブ・ブラウン（ＣｌＯｖｅＢｒＯｗｎ：
３ｐ１）。

気菌糸：中程度ないし良好、シルバー・グレイ（３ｆｅ
）ないしナチユラル（３ｃ１ｃ）、一部ホワイト（ａ）
。

可溶性色素：生じない。

（６）チロシン寒天培地 生育：中程度ないし良好、ゴールデン・ブラウン（３ｐ
ｇ−３ｐｉ）。

気菌糸：中程度ないし良好、シルバーグレイ（３ｆｅ）
ないしナチユラル（３ｄｃ）。

可溶性色素：生じない。（７） グリセリン・スターチ
・グルタメイト寒天培地生育：中程度ないし良好、ルス
ト・タン（ＲＬ］ＳｔＴａｎ５ｇｃ）ないしメイプル（
Ｍａｐｌｅ；４１ｅ）。

気菌糸：中程度、オイスター・ホワイト （０ｙｓｔｅｒＷｈｉｔｅ；ｂ）ないしライト グレイ
（Ｌｔ．Ｇｒａｙ；Ｃ）。

可溶性色素：生じない。

（８）オート●ミル寒天培地 生育：中程度ないし良好、マスタード・コールド（Ｍｕ
ｓｔａｒｄＧＯｌｄ；２ｒ１ｅ）ないしゴールデン・ブ
ラウン（３ｐｇ）。

気菌糸：中程度ないし良好、ナチユラル （３ｄｃ）ないしベイジ・ブラウン（ＢｅｉｇｅＢｒＯ
ｗｒｌ；３１ｇ）。

可溶性色素：生じない。

（９）イースト・麦芽寒天培地 生育：中程度ないし良好、アンパー（３ Ｉｃ）ないしイエロー●メイプル（ＹｅｌｌＯｗＭａｐ
ｌｅ；３ｎｇ）。

気菌糸：中程度、シルバー・グレイ （３ｆｅ）ないしベイジ・ブラウン（３１ｇ）ないしベ
イジ（３ｇｃ）。

可溶性色素：生じない。

（１０栄養寒天培地 生育：中程度、アンパー（３ｐｅ）。

気菌糸：僅少ないし貧弱、ホワイト （ａ）。

可溶性色素：生じない。

（１１）ペプトン・イースト・鉄寒天培地生育：中程度
ないし良好、無色、裏面；ゴールデン・ブラウン（３ｐ
ｇ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：ゴールデン・ブラウン（３ｐｇ一３ｐｉ）
。

（１２）トリプトン・イーストエキス培地生育：良好、
アンパー０ｘ−３ｐＣ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：生じない、ないしゴールデ ン・ブラウン（３ｐｇ）。

（１３）グルコース・ペプトン・ゼラチン培地生育：貧
弱、ゴールデン●ブラウン（３ｐｇ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：ゴールデン・ブラウン （３ｐｉ）。

（１４）脱脂乳培地 生育：良好ないし極めて良好、ライト・アンパー（Ｌ
ｔＡｍｂｅｒ；３１ｃ）ないしライト●タン（ＬｔｌＴ
ａｎ；３ｇｃ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：メイブル（４１ｅ）ないしパステル●オ
レンジ（４１ｃ）。

（ｄ）生理的性状 （１）メラニン様色素の生成：ペプトン◆イースト・鉄
寒天培地で陽性、トリプトン・イーストエキス培地で凝
陽性、チロシン寒天培地で陰性。

（２）ゼラチンの液化：グルコース●ペプトン●ゼラチ
ン培地で陽性。

（３）スターチの加水分解：スターチ・無機塩寒天培地
で陽性。

（４）脱脂乳：凝固；陰性、ペプトン化；陽性（５）炭
素源の同化性：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−マンニット、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロースは陽性
、イノシトール、ラフィノースは凝陽性、シユクロース
は陰性。

（６）生育温度：１０〜４７クＣ 以上の通り、本菌株は***を生じない真性の基生菌糸よ
り、多数の胞子の連鎖をもつ気菌糸を生じ、また菌糸の
直径および胞子の大きさ、さらに細胞壁にＬＬ−ジアミ
ノピメリン酸を含有することなどよりストレプトマイセ
ス属に属するものと認められる。

また本菌株の特徴として、気菌糸は灰色を呈し、胞子の
連鎖は主として螺旋を形成し、胞子の表面はとげ状を呈
し、基生菌糸は黄褐色ないし黄橙色で、通常可溶性色素
を生成せず、メラニン様色素はペプトン・イースト・鉄
寒天培地で生成し、チロシ７寒天培地では生成しないこ
と、および炭素源の同化能は比較的広範囲に及んでいる
ことなどが挙られ、このような特徴を有する菌種を種々
の文献より検索すれば、ストレプトマイセス●クロモフ
スカス〔プロブレムス●オブ●クラシフイケイシヨン●
オブ●アクチノマイセテスーアンタゴニスツ（ＰｒＯｂ
ｌｅｍｓＯｆｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉＯｎＯｆａｃｔ
ｉｎＯｍｙｃｅｔｅｓ−ＡｎｔａｇＯｎｉｓｔｓ）１７
６−１７７（１９５７）、インターナショナル●ジャー
ナル・オブ●システマテイク●バクテリオロジー（Ｉｎ
ｔｅｍａｔｉＯｒｌａｌＪＯｕｍａｌＯｆＳｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃＢａｃｔｅｒｌＯｌＯｇｙ）川（４）３０７−
３０９（１９６８）、アプライド●マイクロバィオロジ
ー（ＡｐｐｌｌｅｄＭｉｃｒＯｂｌＯｌＯｇｙ）五５２
−７９（１９５８）〕が類似菌として挙られ、さらに本
菌株とストレプトマイセス・クロモフスカスとを詳細に
比較すれば、形態的にはストレプトマイセス●クロモフ
スカスの方が螺旋の形成がやや良好なこと、培養的性状
においてグリセリン●スターチ●グルタメイト寒天培地
およびグリセリン・硝酸塩培地上で可溶性色素の生成の
有無などの相違が両菌株の比較実験にて認められたもの
の、これらの多少の相違は菌株間の相違と認め、他の諸
性状においてはよく一致していることより、本菌株をス
トレプトマイセス・クロモフスカス（プレオブラソエン
スカラ●エト●オル）プリダム●エト●オル〔Ｓｔｒ′
ＥｐｔＯｍｙｃｅｓＣｈｒＯｍＯｆＬ］ＳＣＵＳ（Ｐｒ
ｅＯｂｒａｚｈｅｎｓｋａｙａｅｔａｌ）Ｐｒｉｄｈａ
ｍｅｔａＩ〕に属するものと同定し、本菌株をストレプ
トマイセス●クロモフスカスＡ−０８４８と命名した。
次いで、本菌株を培養してホスホリパーゼＤを得るに当
つて、本菌株を、酵素を生産する通常の方法で培養すれ
ばよく、その培養の形態は通常液体培養を行なうが、工
業的には深部通気攪拌培養を行なうのが有利である。培
地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用され得る。炭素源としては同化可能な炭素
化合物であればよく、例えばブドウ糖、シヨ糖、乳糖、
スターチ、デキストリン、糖蜜、グリセリンなどが使用
される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばコーン・スチープ・りカー、大豆粉、綿
実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉工キズ、酵母工キズ
、乾燥酵母、力ティン加水分解物などが使用される。そ
の他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム
、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に応じて使用さ
れる。培養温度は本菌が発育し、ホスホリパーゼＤを生
産する範囲内で適宜変更し得るが、特に好ましくは２５
〜３０℃であり、また培養時間は条件によつて異なるが
、ホスホリパーゼＤが最高力価に達する時期をみはから
つて適当な時期に培養を終了すればよく、通常、２〜４
日程度である。このようにして得られた培養物からホス
ホリパーゼＤを採取するのであるが、本酵素は水に易溶
性であつて、主として培養液中に存在する。培養液中に
存在するホスホリパーゼＤは、培養戸液を濃縮するか、
もしくは濃縮することなく可溶性塩類、例えば硫安など
で半飽和または飽和沈澱させるか、または親水性有機溶
媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどを添
加することにより沈澱させることができる。沈澱物は水
または緩衝液に溶解し、半透膜で透析することにより低
分子不純物を除去することができる。また吸着剤、イオ
ン交換体あるいはゲル淵過剤などを用いて不純物を除去
してもよい。これらの手段により得られる酵素溶液を、
減圧濃縮、凍結乾燥などの操作により処理して固形の粗
製ホスホリパーゼＤを得ることができる。さらにこの粗
製ホスホリパーゼＤは、蛋白質、酵素などの精製に通常
用いられる手段、例えば吸着剤、イオン交換体、ゲルろ
過剤などを用いて精製され、さらにジエチルアミノエチ
ルセルロースおよびデキストランゲル架橋体（商品名：
セフアデツクスＧ−５０）カラムクロマトグラフィーに
より精製される。次にホスホリパーゼＤの理化学性質に
ついて述べる。（１）作用 リン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結合に作
用してリン化合物と相当する含窒素塩基と遊離する。

レシチンについての作用を例示すれば次式の通りである
。（２）力価の測定法０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（Ｐ
Ｈ８．Ｏ）０．１ｍ１、１０ｍＭレシチンエマルジョン
０．１ｍ１１０．１Ｍ塩化カルシウム０．０５ｍｔ１１
％トリトンＸ−１０００．１ｍｌ、水０．１ｍ１よりな
る反応液に、酵素溶液０．０５ｍ１を加え３ＴＣ１１紛
間反応させた後、５分間煮沸して反応を停止した。

次いで反応液を３ｒＣまで冷却し、これに、４−アミノ
アンチピリン（３ｍ９１ｍ１）０．１ｍ１、２Ｕ．Ｉｍ
１パーオキシダーゼ０．１ｍ１．．０．１％フェノール
０．１ｍｔ１１２ｕ．ＩＴｒＬ１コリンオキシダーゼ０
．１ｍ１１水０．１ｍ１を加えて３ｒｃ１２０分間反応
せしめた後１％トリトンＸ−１００２ｍ１を加え、５０
０１１ｍの吸光度を求めた。ホスホリパーゼＤｌｌ単位
（Ｕｎｉｔ．Ｕ．）は１分間に１μｍＭＯｌｅのコリン
を生成せしめる酵素活性と定めた。また力価の算出は次
式に従つた。Ｕ．ｌＴｎｔ＝ΔＡ５ＯＯＸＯ．５５ （式中、ΔＡ５ＯＯは５００ｎ７７１，における吸光度
を示す）（３） 基質特異性 上記の力価の測定の反応液において、基質としてレシチ
ン、リゾレシチン、スフィンゴミエリンのエマルジョン
（１０ｒｒＬＭ，．０．１ｍ１）を用い、同様の操作を
行ない、コリンの定量をし，て、リゾレシチンに対する
酵素作用を１００として相対活性を求めた。

基質 相対活性レシチン
５１％スフィンゴミエリ
ン １９％Ｚリゾレシチン
１００％（４）ＰＨ安定性ＰＨ５：酢酸
緩衝液、ＰＨ６〜７：ジメチルグルタル酸一水酸化ナト
リウム緩衝剤、ＰＨ８〜９：トリスー塩酸緩衝液、ＰＨ
ｌＯ：グリシンー水酸化．ナトリウム緩衝液（各々１０
７ｎＭ）の各ＰＨで、酵素溶液（１ｍｇ１ｍ１）を、３
７℃、６０分間インキユベイトした後、上記の力価の測
定法に従つてホスホリパーゼＤの活性を求めた結果、第
７図に示す通り、酵素はＰＨ７〜９で比較的安定である
．と認められる。

（５）至適ＰＨ ＰＨ６〜７．５：ジメチルグルタール酸一水酸化ナトリ
ウム緩衝液、ＰＨ７〜９：トリスー塩酸緩衝液、ＰＨ９
〜１０：グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液の各々の緩
衝液を用い、上記の力価の測定法に従つてホスホリパー
ゼＤの活性を求めた結果、第８図に示す通りであつて、
その至適ＰＨは７．５〜８付近と認められる。

−）熱安定性 １０７ｎＭトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、酵素溶
液濃度（１ｍ９１ｍ１）の条件で、４０１５０、６０、
７０、８０℃の各々の温度にて１Ｃ＠間インキユベイト
した後、上記の力価の測定法に従つてホスホリパーゼＤ
の活性を求めた結果、第９図に示す通りであつて、酵素
は７０℃まで安定である。

″）血清リン脂質への作用条件１の試料 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．２ｎ
Ｌ市販品血清 ０．５ｎｔ０．１
ＭＣａＣ１２０．１ｍ１６０Ｕ．Ｉｍ１ホスホリパーゼ
ＤＯ．ｌｍＬ蒸留水 ０．１
ｍ１条件２の試料０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８
．Ｏ） ０．２ｍ１市販品血清
０．５ｍＬ０．１ＭＣａＣ１２０．１ｎＬ６０ｕ．Ｉｍ
ＬホスホリパーゼＤＯ．ｌｍｔホスホフアチジン酸ホス
ファターゼ 加，蒸留水
０．１ｍ１条件３の試料０．２ｒ！４トリスー塩酸緩衝
液（ＰＨ８．Ｏ） ０．２ｍ１市販品血清
０．５ｍ１０．１ＭＣａＣ１２０．１ｎＬ蒸
留水 ０．２ｍ１なお、上記
各条件における試料に用いた、市販品血清はハイランド
（Ｈｙｌａｎｄ）社製の製品であり、ホスフアチジン酸
ホスファターゼはストレプトマイセス ミラビリス（Ｓ
ｔｒ″ＥｐｔＯｍｙｃｅｓｍｉｒａｂｉｌｌｓ）Ａ−２
３１３菌株より得られたホスフアチジン酸ホスファター
ゼ（特開昭５０−１４２７冊号）である。

上記の条件で、１、２および３の試料を３７℃、３紛間
反応せしめた後、各々にクロａホルムニメタノール（２
：ｌ）６ｍ１１次いで水１ｍ１を加えて充分混合し、３
０００ｒ′Ｐｍｌｌ紛間遠心分離し、そのクロロホルム
層を回収した。

このクロロホルム層を減圧乾固し、シリカゲルＧ（東京
化成工業社製）にて薄層クロマトグラフィーを行ない（
展開溶媒；クロロホルムニメタノールニ水＝６５：２５
：３）、プレート乾燥後、モリブデンブルー試薬により
、リン脂質の確認を行なつた。また、標準リン脂質とし
て、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
コリン、スフィンゴミエリン、リゾホスフアチジルクリ
ン、ホスフアチジン酸を用いて、上記と同一の条件で薄
層クロマトグラフィーを行なつた。その結果は、第１０
図に示す通りであつて、１は条件１の試料のスポット、
２は条件２の試料のスポット、３は条件３の試料のスポ
ット、４はホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルコリン、スフィンゴミエリンおよびリソホスフア
チジルコリンよりなる標準リン脂質のスポット、５はホ
スフアチジン酸である標準リン脂質のスポットを示し、
Ａは標準リン脂質より判明したホスファチジルエタノー
ルアミンのスポット、Ｂは同様ホスファチジルコリン、
Ｃは同様スフィンゴミエリン、Ｄは同様ホスフアチジン
酸、Ｅは同様リゾホスフアチジルコリンを示す。

第１０図より、血清（条件３の試料）中にはホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィ
ンゴミエリンおよびリゾホスフアチジルコリンが存在す
ることが明らかである。この血清にホスホリパーゼＤを
作用せしめる（条件１の試料）とホスフアチジン酸のみ
存在する。さらにこの血清にホスホリパーゼＤおよびホ
スフアチジン酸ホスファターゼを作用せしめる（条件２
の試料）と全くスポットが見られないことより、血清中
のリン脂質はホスホリパーゼＤによりホスフアチジン酸
にまで分解され、さらにこのホスフアチジン酸がホスフ
アチジン酸ホスファターゼにより無機リン酸とジグリセ
リドに分解されたと推定される。またこの結果は、この
ホスホリパーゼＤが、血清中のホスファチジルエタノー
ルアミンをも基質とし得る酵素であることを示している
。このホスホリパーゼＤ即ちストレプトマイセス・クロ
モフスカスＡ−０８４８菌株より得られるホスホリパー
ゼＤは、ストレプトマイセス●ハチジヨウエンシスＡｌ
ｌ４３菌株より得られるホスホリパーゼＤ（特開昭４８
−９９３８６号）よりも至−適ＰＨ．．ＰＨ安定性、熱
安定性においてより優れており、さらにストレプトマイ
セス・ハチジヨウエンシスＡｌｌ４３菌株はホスホリパ
ーゼＤのほかにホスホリパーゼＣをも生産する（特開昭
４９一５５８９３号）ため、ほぼ完全な精製を行なわな
い限り、その最終標品にホスホリパーゼＣの混入を伴い
、これによる副反応を生じる欠点を有している。

従つて、本発明に使用されるリン脂質の分析定量用のホ
スホリパーゼＤとしてはストレプトマイセス●クロモフ
スカスＡ−０８５８菌株より得られるホスホリパーゼＤ
が好ましい。次に、本発明におけるコリンオキシダーゼ
の製法およびその酵素を用いてなる種々の分析法、分”
析用組成物について具体的に述べるが、本発明はこれら
によつて何んら限定されるものではない。実施例１コリ
ン１．０％、ＫＣｌＯ．５％、Ｋ２ＨＰＯ４Ｏ．ｌ％、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００．０５％、酵母工キズ０．２５
％、フイシユ●ソルブル（ＦｉｓｈｓＯｌｕｂｌｅ）１
．０％、デスホームＣＡ−２２００．１％よりなる培地
１００ｍ１（ＰＨ７．２）を５００ｍ１容三角フラスコ
に加え、１２０℃、２紛間滅菌処理し、次いでこれにア
ースロバクター・グロビフオーミスＢ−０５７爛株を接
種し、３０℃、１日間培養して種菌を得た。

次いで、この種菌を、上記と同一組成を有す培養液１０
ｅを有してなる滅菌後の３０ｅ容シャー・フアメンター
に移植し、３０℃、２日間、２００ｒ′Ｐｍｌ２ＯｅＩ
ｍｉｎの滅菌空気の条件下通気攪拌培養し、得られる培
養液を遠心分離して集菌し、この菌体を１０７ｒｔ，Ｍ
トリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、２ＴｒＬ，ＭＥＤ
ＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテイクアシド）、１
％ＫＣｌよりなる溶液１１にて洗浄した。この洗浄菌体
を１ｅの１０ＷＬＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）、２７
ＴＬＭＥＤＴＡ、１％ＫＣｌよりなる溶液に懸濁し、こ
れにリゾチーム（長瀬産業社製、塩化リゾチーム）２０
０ｍ９を加え、３７℃、３吟間攪拌した。リゾチーム処
理後、溶液を５０００ｒ′Ｐｍｌｌ紛間遠心分離し、得
られた上清液にアセトン１′を加えて析出する不純物を
遠心にて除去し、さらにこれにアセトンを加えて６５％
アセトン濃度とし、次いで５０００ｒｐｍ１１紛間遠心
分離して沈澱物を回収し、これを４０ｍ１の１０７ＴＬ
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、２ｍＭＥＤＴＡ
１１％ＫＣｌよりなる溶液に溶解し、不溶部分は遠心し
て除去した。次いでこれに６０ｍ１の飽和硫安溶液を加
えて１５分間攪拌した後、１２０００ｒ′Ｐｍにて１紛
間遠心分離を行い、得られた沈澱物を１５ｍ１の１０Ｔ
ｒＬ，Ｍ１Ｊン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）、２ｒｎ．〜１
ＥＤＴＡよりなる溶液に溶解し、これを流速３０ｍ１１
ｈｒにてセフアデツクスＧ−２５（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ
−２５）のカラムに通じて脱塩した後、得られた溶液を
、ＰＨ７．Ｏで緩衝化したＤＥＡＥ−セルロースカラム
（カラム径２．０×７．０ｃｍ）に通じて酵素を吸着せ
しめ、さらに０．２Ｍ〜０．５ＭのＫＣｌのイオン強度
勾配を用いて溶出せしめた。約０．．４ＭＫＣ１濃度で
の溶出画分を回収して活性画分１７２ｍ１を得た（流速
；１．４ｍ１１ｍｉｎ１１フラクシヨン；６ｍ１）。さ
らにこの活性画分１７２ｍ１を透析膜（セルロースアセ
テート）にて７時間透析せしめ（外液：５ｍＭリン酸緩
衝液、２ＷＬ，ＭＥＤＴＡよりなる溶液）、次いでこの
透析液を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を、１０ｍ
１の１０７ＴＬＭトリスー塩配緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、
２Ｔｒ１，ＭＥＤＴＡ１１％ＫＣｌよりなる溶液に溶解
せしめた後、セフアデツクスＧ−２００を用いたカラム
クロマトグラフィーを行ない（カラム径：２．８×９．
５０１流速；０．１８ｍ１１ｍｉｎ１１フラクシヨンニ
６ｍ１）、そのフラクシヨンＮＯ．４２〜４８の活性画
分を回収し、凍結乾燥した。次いで同様のセフアデツク
ス操作を行つた。この得られた凍結乾燥物は、先の電気
泳動の結果において述べた通り、唯一の蛋白質の帯を示
すものであつた。また各採取工程における、コリンオキ
シダーゼの全活性、全蛋白質量、比活性は上記表に示す
通りである。

実施例２ （コリンの定量） 過酸化水素０．０１〜０．０５μＭＯｌｅｌトリスー塩
酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１０μＭＯｌｅｌ４−アミノア
ンチピリン１５０μ′、フェノール２００μｙ１パーオ
キシダーゼ０．２Ｌ１、コリンオキシダーゼ０．２５Ｕ
．を含有する反応液０．５ｍ１を、３７℃にて２紛間反
応せしめた後エタノール２．５ｍ１を加えて４８０ｒ１
７ｎにおける吸光度を測定して、過酸化水素の検量線を
得た。

次いで、上記の反応液中の過酸緩水素の代りに塩化コリ
ンを加え、同様に行なつてその吸光度を測定し、過酸化
水素の検量線よりコリンを定量した。

実施例３ （ベタインアルデヒドの定量） 上記実施例２のコリンの代りにベタインアルデヒドを用
いて同様に行なうことにより、ベタインアルデヒド試薬
のベタインアルデヒド純度を測定した。

実施例４ （リン脂質の定量） 下記組成を有する反応液に、 反応液組成 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．１
５ｍ１３ｍ９１Ｔ！Ｌｌ４−アミノアンチピリン ０
．５０ｍ１０．１％フェノール ０
．３０ｎ１１％トリトンＸ−１０００．３０ｍ１１０ｒ
ｒｔ．ＭＣａＣ１２０．３０ｍ１１５ｕＩｎｔコリンオ
キシダーゼ ０．１０ｍ１２ｕＩｍ１パーオキ
シダーゼ ０．１０ｍ１１２ｕＩｍ１ホスホ
リパーゼＤＯ．ｌＯｍｌ蒸留水
１．１５ｍ１３．００ｍ１シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより精製した卵黄レシチン或は市販品
血清（ハイランド社製）を各々添加し、３ｒＣ１２０分
間反応せしめた後、５００ｒ１ＷＬ，にて比色測定した
結果、第１１図および第１２図に示す通りである。

（第１１図は卵黄レシチンに対する測定結果を示し、第
１２図は市販品血清に対する測定結果を示す。この第１
１図（卵黄レシチンの測定結果）と先の過酸化水素の検
量線とより、卵黄レシチン中の遊離されたコリン量が算
出され、さらにこのコリン量より卵黄レシチンのモル数
が求められる。同様に、この第１２図（血清の測定結果
）と先の過酸化水素の検量線とより血清中のリン脂質が
定量される。なお、上記方法に用いたホスホリパーゼＤ
は、ストレプトマイセス・クロモフスカスＡ−０８４８
菌株より得られたホスホリパーゼＤであつて、その使用
量は一般に０．５Ｕ．以上、好ましくは１〜５Ｕ．程度
である。実施例５ （コリンエステラーゼの測定） 下記組成を有する反応に、 反応液組成 ０．′りＡＦ−リスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０
．０５Ｔｎ１３Ｔｎ９１ｍ１４−アミノアンチピリン
０．０５ｍＬ０．１％フェノール
０．１０ｍＬ２ｕ．１ｍｔパーオキシダーゼ
０．１０ｍｔ２０Ｕ．Ｉｍ１コリンオキシダーゼ
０．２０ｍｔ５０ｍＭベンゾイルコリン
０．０２ｎｔ０．５２ｍ１生理食塩水にて１嗟
希釈したヒト血清（健康人より採取）を加え、３ＴＣ１
３紛間反応せしめ、次いでこれに０．２ｒ！１．Ｍネオ
スチグミン溶液（コリンエステラーゼ阻害剤）３．０７
７！ｔ加えた後さらに室温下１紛間放置して５０（９）
ｍにて比色測定した結果、第１３図に示す通りであつて
、血清中コリンエステラーゼ活性は、反応液中のベンゾ
イルコリンより遊離されたコリンの量より（コリンはコ
リンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、４−アミノアン
チピリン、フェノール系により定量）測定されたもので
あつて、この吸光度より血清中コリンエステラーゼの活
性が求められる。

またコリンエステラーゼの活性は、血清１．０ｍ１中の
酵素が３７℃で１分間に２μＭＯＩｅの過酸化水素を生
じたとき、世として表わすことができる。活性Ｕ．Ｉ７
ＴＬｌ＝ΔＡ５ＯＯ／Ｍｊｎ×４．８上記コリンエステ
ラーゼ、ベンゾイルコリンの組合せの代りに他のコリン
誘導体の加水分解酵素および他のコリン誘導体を組合せ
て用いることにより種々の酵素活性の測定や、コリン誘
導体の定量に使用し得る反応系を設定し得る。

参考例１ ペプトン２％、ラクトース２％、ＮａＣｌＯ．ｌ％、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４Ｏ．Ｏ５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００．０５
％、デスホー」℃−５１Ｙ０．５％よりなる組成の培地
１００ｍ１を−有する５００ｍ１容三角フラスコ（１２
０゜Ｃ１２吟間滅菌処理）にストレプトマイセス●クロ
モフスカスー０８４８菌株を接種し、２６℃、３日間培
養して種菌を得、これを上記と同一組成よりなる培地２
０ｅを有する３０ｅ容シャー・フアーメンターに移植し
、２６℃、２日間、３００ｒｐｍ１２０ｅ１ｍｉｎの条
件下通気攪拌培養した。

この培養液は０．５ｕ１ｎｔの活性を示す。この培養物
を遠心分離して得た培養淵液１８ｅを３′になるまで減
圧濃縮し、この濃縮液にアセント２．４ｆを加え、生じ
た沈澱物を遠心分離して除去した。得られた上清液にさ
らにアセトン２ｅ”を加えて生じた沈澱物を遠心分離に
て回収し、これを５００ｍ１の精製水に溶解せしめた後
、これにアセトン３５０ｍ１加えて沈澱する不純物を遠
心分離により除去し、その上清液にアセトン３３０ｍ１
を加えて生じた沈澱物を遠心分離により回収し、これを
２００７７！ｔの精製水に溶解した。これに、飽和硫安
溶液２００ｍ１を加えて生じた沈澱物を遠心分離により
回収した後、これを５０ｍ１の精製水に溶解し、セフア
デツクスＧ−２５により脱塩した後凍結乾燥して５ｕ．
Ｉｍｇの活性を有する粗製ホスホリパーゼＤの粉末７０
０ｍ９を得た。本発明においては、この粗製ホスホリパ
ーゼＤをそのまま利用したものであつて、必ずしも完全
に精製したものを必要とするものではなく、またこの粗
製ホスホリパーゼＤは上記記載の一般的手段にて精製し
、この精製ホスホリパーゼＤを用いてもよい。

【図面の簡単な説明】

第１図はコリンオキシダーゼの至適ＰＨを示し、第２図
はコリンオキシダーゼの至適温度を示し、第３図はコリ
ンオキシダーゼのＰＨ安定性を示し、第４図はコリンオ
キシダーゼの熱安定性を示し、第５図はコリンオキシダ
ーゼの電気泳動図を示し、第６図はコリン・ベタインア
ルデヒドおよび過酸化水素の検量線を示し、第７図はホ
スホリパーゼＤ（７）ＰＨ安定性を示し、第８図はホス
ホリパーゼＤの至適ＰＨを示し、第９図はホスホリパー
ゼＤの熱安定性を示し、第１０図はホスホリパーゼＤの
血清リン脂質の分解作用を示す薄層クロマトグラムを示
し、第１１図は卵黄レシチンの定量結果を示し、第１２
図は血清リン脂質の定量結果を示し、第１３図はヒト血
清コリンエステラーゼ活性の測定結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも、コリンオキシダーゼを含有してなるコ
   リンまたはベタインアルデヒドの分析用組成物。 ２ コリンまたはベタインアルデヒドがコリンまたはベ
   タインアルデヒド、またはコリンの誘導体またはベタイ
   ンアルデヒドの誘導体とそれらを遊離せしめる物質から
   選ばれるものである特許請求の範囲第１項記載の分析用
   組成物。 ３ コリンの誘導体がリン脂質である特許請求の範囲第
   ２項記載の分析用組成物。 ４ リン脂質がレシチン、リゾレシチンまたはスフィン
   ゴミエリンである特許請求の範囲第３項記載の分析用組
   成物。 ５ 遊離せしめる物質がホスホリパーゼＤである特許請
   求の範囲第２項記載の分析用組成物。 ６ 少なくとも、コリンオキシダーゼと生成した過酸化
   水素の量を測定するのに使用する呈色剤との組合せから
   なる特許請求の範囲第１項または第２項記載の分析用組
   成物。 ７ 呈色剤が、少なくともパーオキシダーゼを含有して
   いる特許請求の範囲第６項記載の分析用組成物。 ８ 呈色剤が生成した過酸化水素１モルに対して２モル
   以上である特許請求の範囲第６項または第７項記載の分
   析用組成物。 ９ 呈色剤が、少なくとも４−アミノアンチピリン、フ
   ェノール、パーオキシダーゼからなる特許請求の範囲第
   ６項、第７項または第８項記載の分析用組成物。 １０ 少なくとも、コリンオキシダーゼ、ホスホリパー
   ゼＤ、４−アミノアンチピリン、フェノールおよびパー
   オキシダーゼよりなる特許請求の範囲第１項から第９項
   までのいずれかの項に記載の分析用組成物。