JPS60502155A - オリゴヌクレオチドの高分子支持体系 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチドの高分子支持体系 発明の背景 本発明は一般的にオリゴヌクレオチド合成に関し、よシ詳細にはオリゴヌクレオ チド類を固体支持体上においてよシ容易に且つよシ効率的に合成することを可オ リゴヌクレオチド類は３〜１００個の塩基単位の鎖長を有するＤＮＡ　（デオキ シボスクレオチド類）或いはＲＮＡ　（リボヌクレオチド類）のいずれかの比較 的短い小片でおる。デオキシリボヌクレオチド類及びリボヌクレオチド類の両者 はそれらの細胞過程及び細胞成長における鍵的役割のために特別の生物学的意義 を有する。成長及び蛋白質発現のだめの主たる情報を含む細胞の成分はＤＮＡで ある。現在ＤＮＡの新たに合成された小片を細胞のＤＮＡ中に導入することが可 能であるという事実のためにオリゴデオキシリボヌクレオチド類の化学的合成を 容易にする方法は特別の意義？帯びる。

その様な方法は、欠陥のある遺伝情報の修正を助けるために或いは生吻体が発現 する蛋白質を実質的に変成するために使用することができる口例えば、細ｌにヒ トグルカゴンの合成の遺伝情報を含有するポリデオキシリボヌクレオチド１ｋ１ ｍえさせることができる。適当な条件下においては、この生ｍは次いでヒトグル カゴを産生するようになる。

加えて、オリゴヌクレオチド類のその他の薬理学的、診断及び研究用途の範囲が 存在する。しかしながら、オリゴヌクレオチドの完全な有用性はそれらを高収率 及びよ）高純度に有効に合成する方法を待つものである。

１９７０年代の中期１では、万すゴヌクレオチド合成は液相中において行われて いた。液相夜前に伴う分離及びｆｆ製の問題がオリゴヌクレオチド合成の実際的 な自動化系？妨げていた。これらの分離及び積装の問題を解決するために高分子 支持体が開発された。これまでのところ、これらの高分子支持体の使用は支持体 と第１ヌクレオチド間の切断の操作によるオリゴヌクレオチドの固体支持体への カップリングをよむものであった。しかしながら、第１ヌクレオチドは４個の塩 基の任意のものであり得るので、目的オリゴヌクレオチドを合成するためには、 これらの操作は８個の異った開始支持体即ちＤＮＡについて４個、及びＲＮＡに ついて４個ｋ　Ｉｆ４える必要があった。従って、全ての目的オリゴヌクレオチ ド類が１つのタイプの高分子支持体から合成することができるような汎用性の大 きなプライマー（鎖開始剤）を有する支狩体系が利用可能であれば有意義な進歩 であると云える。

実際に役立つためには、筒分子支付体及びプライマーは合成が完結するまで成長 するオリゴヌクレオチドを保持しなければならない。又、−亜合成が完結すれば プライマーは切断されてオリゴヌクレオチドを高分子支持体から放出することが できなければならない。

文献に記載されているプライマーの多くは極めて酸又は塩基に不安定な結合を有 する。即ち、オリゴヌクレオチドは酸性或いは塩基性試薬で処理することによシ 望ましくない時点において、構造的再構成の結果と共に高分子支持体から放出さ れる可能性がある。例えばＭ、　Ｄ、　ｆｆテウツチ及びＭ、　Ｈ，カルザース （Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉａｎｄ　Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、ｒ高 分子支持体上に９けるデオキシオリゴヌクレオチド類の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉ ｓ　ｏｆＤｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｏｎ　ａ　Ｐｏｌｙｍ ｅｒ　５ｕｐｐｏｒｔ月（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｖｏｌ。

１０３、　Ｎｏ、１１．１９８１年、３１８５−３１９１頁）、及びＨ，７マー 及びＦ、クラ？　−（Ｈ，Ｓｏｒｎｍｅｒ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｃｒａｍｅｒ）　［ 高分子支持体上における５−ホスフェート基金有するデオキシオリゴヌクレオチ ド類の化学的合成（ＣｈｅｍｌｓｃｈｅＳｙｎｔｈｅｓａ　ｖｏｎ　Ｄｓｓｏｘ ｙｏｌｌｇｏｎｕｃｌｅｏｔｌｄｅｓ　ｍｉｔ　５−　Ｐｈａｓｐｈａｔ−ｇｒ ｕｐｐｅ　ａｍ　Ｐｏｌｙｍｅｒｅｎ　Ｔｒａｇｅｒ　；　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｗｉ ｔｈ　５−　ＰｈａｓｐｈａｔｅＧｒｏｕｐ　ｏｎ　ａ　Ｐｏ１ｙｒｎｅｒ　５ ｕｐｐｏｒｔ）　ｊ　（Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｖ、、　Ｖｏｌ。

１０７、１９７４年　２４−３３頁）参照、しかしながら、酸に不安定なプライ マーの使用はオリゴヌクレオチド合成の際に＠度に酸性な試薬或いは条件の使用 を妨げる。

同僚に、塩基性に不安定なプライマーは軽度に塩基性の試薬或いは条件の使用を 妨げる。その結果、酸性或いは塩基性に不安定なプライマーと使用することは高 分子支持体系の汎用性を大きく制限することになる。

極めて酸或いは塩基に不安定なプライマーは父、高分子支持体系の汎用性をその 他の面で制限する。例えば、多くの保護基が通常ヌクレオチドの各種官能基部ち 塩基のアミン或いはヒドロキシル官能基、リボヌクレオチドの２′ヒドロキシル 基、デオキシリボヌクレオチドの３′及び５′ヒドロキシル基及びホスフェート 基などを保護するために進常使用される。好ましくは、高分子支持体系はこれら の保護基の除去をオリゴヌクレオチドが高分子支持体から放出される前に可能に するように十分汎用性であるか、或いは父、保護基が除云される前にオリゴヌク レオチドが高分子重合体から放出されることが可能であるべきである。しかしな がら、極めて酸或いは塩基に不安定であるプライマーは、この汎用性を相当に制 限する。

従って、必要であるのは完全に汎用性の高分子支持体系即ち軽度の塩基性及び＠ 度の敵性反応条件に耐えることができ、なお単一の高分子支持体からあらゆるタ イプの合成オリゴヌクレオチドを所望の時点において便利に且つ定量的に放出す ることのできるオリゴヌクレオチド合成の尚分子支持体構成及びそれに対応する 方法である。本発明は、この要求を満たすものである。

発明の概要 本発明は特にオリゴヌクレオチド類の合成に有用である独特な篩分千支１１体系 を提供するものである。具体的には、本発明の系は独特の支持体及びプライマー の立体配置及びその立体配置に対応するオリゴヌクレオチド合成方法により特徴 付けられる。本発明の最も好ましい高分子支持体系は杉皮に酸性或いは塩基性の 条件及び試薬に耐えることができるものである。その結果、本発明の最も好まし いプライマーは従来公知の高分子支持体系よりもはるかに多くの汎用性を与える ものでおる。本発明の高分子支持体系は又ＤＮＡ及びＲＮＡの両者？合成するた めに使用される条件及び試薬のタイプにおいて大きな柔軟性を許容するものであ る。

本発明の糸は現在洒用町叱なオリゴヌクレオチド合成方法により３′或いは５′ 方法のいすね、に２いても鎖伸長金町籠にし、父、オリゴヌクレオチドを高分子 支持体から放出前に完全に脱泳謹することを可能にし、或いはオリゴヌクレオチ ド全全ての保護基が除去される前に鍋分子支持体から放出されることを可能にす る。加えて、この独特な高分子支持体系はＤＮＡ或いｉｊ　ＲＮＡのいずれを合 成することを目的とするかに応じて異る８つの開始支持体を合成する必要性を除 云する万能プライマーを％徴とするものである。目的オリゴヌクレオチドの切断 は実質的に定量的な結果をもって達成することができる。

本発明の高分子支持体系は浦分子支持体及びよ高分子支持体に共有結合し之グラ イマーよりなる高分子支持体系に２いてプライマーが選択的酸化即ちプライマー 双いはオリゴヌクレオチドのその他の如何なる結合も酸化することなくプライマ ーの１以上の酸化可能な置換基を酸化することによ多切断されることを特徴とす るものでめる。この選択的酸化はプライマー全直接に切断するか、或いはプライ マーの間接的な切断と行うものである。直接切断においては有効な酸化剤自体が オリゴマー（ｉ−支持体から放出するプライマー骨格の切断を引きおこす。間接 的切断においては、有効な酸化剤が結合オリゴヌクレオチドのホスフェートニ隣 接する電子引き抜き中心を活性化させ、それは更に有効な塩基で処理された際に 加水分解或いは脱４を起こし、目的オリゴヌクレオチドの放出が生ずる。

本究明に促えは、各ａ酸化可自巳な置換基金使用することができる。好ましい実 施悪球においては、互に隣接した或いはホスフェート電子引き抜き基の近傍に位 置した酸比町１註な基の対を有するプライマーの部分が本発明の酸化性置換基よ すなるものである。酸化性基の対は、父より好ましい実施感様においては、酸化 性基がホスフェートに対してγ位であるｌ１ｉｌＪｔ状或いは環状プライマーに おけるアルケニル結合でめってもよい。

最も好ましい実施態様においては、酸化可能な置換基は未保ｄ　ｃ’　ａ−ヒド ロキシル基金有するリボースであ本発明のオリゴヌクレオチド合成方法は、（ａ ）ある高分子支持体の選択、（ｂ）プライマーの一部が１以上の酸化ａ置俣基を 有するプライマーの工程（ａ）の高分子支持体への結合、（Ｃ）工程（ｂ）の酸 化性置換基の保護基による保護、（ｄ）高分子支持体上の反応性基の保護基によ る保護、（ｅ）ヌクレオチドをプライマー上に縮合させてオリゴヌクレオチドを 構成すること、（ｆ）オリゴヌクレオチドの合成完結後酸化性置換基の脱保護、 （ｇ）工程（ｆ）の酸化性置換基の有効な酸化剤による選択的酸化、Φ）工程（ ｇ）と同時に或いは引き続き有効な塩基によるオリゴヌクレオチドの処理、及び （１）オリゴヌクレオチドの回収、を含んでなるものである。

本発明の最も好ましい支持体系上に構成されるオリゴヌクレオチドは軽度の塩基 性或いは＠度の酸性条件下においては高分子支持体から放出されないことは有意 義である。その代シに合成されたオリゴヌクレオチドは酸化性置換基が先ず脱保 護され、次いで同時又は引き続きの有効な塩基による処理を伴う有効なば化剤に より選択的に酸化された場合にのみ高分子支持体から放出される。この様に、本 発明の尚分子支持体は大きな汎用性を与える。合成オリゴヌクレオチドは有効な 酸化剤が使用される際にのみ放出されるので各種ヌクレオチド官能基１に保護す るために使用される酸及び塩基不安定性キャッピング（保護）基はオリゴヌクレ オチドが高分子支持体系から放出される前或いは後に除去することができる。又 、オリゴヌクレオチド合成の際に、オリゴヌクレオチドを支持体から放出するこ となく軽度に酸性或いは軽度に塩基性の条件或いは試薬を使用することができる 。

高分子支持体系が酸性或いは塩基性のいずれかの条件に不安定であるが、なお有 意義な有用性分有する本発明のその他の態様がある。オリゴヌク、レオテドを支 持体から切断する前に保護基を除去する必要がない状況においては、支持体系の 酸及び塩基条件に対する安定性は必須要件でないことがちシ得る。例えば、酸化 性プライマーと共に用いられるシリカ支持体は有用であるが、しかし塩基性条件 には安定ではない。

本発明の有効な酸化剤としては各種のおだやかな酸化剤を使用することができる 。これらの酸化剤は目的切断部位と反応性でなければならないがオリゴマー上に 反応性基を含ませないようにおだやかなものでなければならない。好ましい実施 態様において、過ヨウ素酸塩、過マンガン酸塩、重クロム酸塩、二酸化マンガン 或いは１酢酸鉛が本発明の有効な酸化剤を構成するものである。本発明の最も好 ましい実施態様においては有効な酸化剤は過ヨウ素酸塩である。

本発明の有効な塩基は２つの代替的な機能の一方を行うものである。プライマー の間接的切断のためには有効な塩基はプライマーの加水分解或いはオリゴマーの 第１ヌクレオチドの電子引き抜きホスフェートの愉去を行うために選択的酸化と 同時に或いは引き就いて使用され、よって重合体支持体系から１リゴマーを放出 する。アニリン、ピペリジン、ピリジン、モルホリン、トリエチルアミン、水酸 化アンモニウム或いは水酸化ナトリウムなどの塩基が本発明の有効な塩基として 使用される。好ましい実施態様においては、アニリン、メチルアミン、エチルア ミン及びアンモニアなとのアルデヒドとシップ塩基を形成する塩基が本発明の間 接切断のための有効な塩基に！成する。最も好ｌしい実施態様においては、アニ リン或いは水酸化アンモニウムが本発明の間接切断のだめの有効な塩基である。

直接切断のためには、酸化性置換基の選択的酸化のみがプライマーの切断を引き おこす。しかしながら多くの直接切断において、プライマーの部分はオリゴヌク レオチドが高分子支持体から放出された後にもオリゴヌクレオチドに付着して残 る。これらの場合には、有効な塩基を使用してプライマーの残存部分を放出オリ ゴヌクレオチドから除去することが小米る。これらのプライマーの残存部分を放 出オリゴヌクレオチドから除去するためには幾つかのおだやかな塩基を使用する ことができる。好ましい実施態様においては、補水酸化ナトリウム、補水酸化ア ンモニウム或いはピペリジンがこれらのプライマーの残存部分を放出オリゴヌク レオチドから除去するために有効に使用される。最も好ましい実施態様に２いて は、ピペリジンが放出オリゴヌクレオチドから残存プライマ一部分を除去するた めに使用される有効な塩基である。

本発明の高分子支持体系はオリゴヌクレオチドハイブリッド形成アフイニテイ系 として特別の有用性ｅ！する。オリゴヌクレオチド上の保護基の除去後、合成オ リゴヌクレオチドは相補的ポリ核酸とハイブリッド形成される。最も好ましい実 施態様において、ハイブリッド形成されたＤＮＡ或いはＲＮＡは溶出して定量的 に回収するのが便利である。或いは又、二重鎖を本発明の酸化的切断操作に従っ て回収することができる。オリゴヌク”レオチド及びプライマーの酸化性置換基 上の保護基が先ず除去され、合成されたオリゴヌクレオチドを次いで相補的核酸 とハイブリッド形成させる。プライマーの酸化的切断に引き続き、おだやかな塩 基で処理することによシニ恵鎖ｋａ分子支持体から放出させる。

加えて、その様なオリゴヌクレオチドハイブリッド形成アフイニテイ系を固定化 された相補的ポリ核酸の検出のために便利に使用することができる。一度固定化 されると、相補的ポリ核酸は検出方法の認識部位が相補的ポリ核酸の支持体への 固定化に＠筐れるものから区別される限シ各撞方ｆＥ：を用いて検出することが 可能である。その様な検出方法としては比色法、螢光法、リン光法、放射性標識 ベースの方法、その他の任意の便利に使用され十分に感度の高い方法が挙げられ る。

本発明のその他の而及び利点は以下の本発明の原理を例示する現在好ましい実施 態様の詳細な説明から明らかとなるで必ろう。

図面の説明 第１ａ図及びＩＥ２１図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解し、酸 化性置換基の対が合成オリゴマーのホスフェートに隣接している場合の環状プラ イマーの切断を示す。

第ｉｂ図及び第２ｂ図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解し、単一 の酸化性置換基が合成オリゴマーのホスフェートに隣接している場合の環状プラ イマーの切断を示す。

第３図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解し、酸化性置換基の対が アルケニル結合である場合の環状プライマーの切断を示す。

第４図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解し、酸化性置換基が高分 子支持体の付着点に位置する場合の環状プライマーの切断を示す。

第５図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解し、単一酸化性置換基で ある場合の線状プライマーの切断を示す。

第６図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解し、二対の酸化性基が相 互に隣接関係にある線状プライマーの切断を示す。

第７図は、オリゴヌクレオチド類の合ル１の反応式を図解し、一対の酸化性置換 基がアルケニル結合でわる線状プライマーの切断を示す。

好ましい実施態様の具体的な説明 本発明はオリゴヌクレオチド類の便利で汎用的な合成を可能にする独特の高分子 支持体系？提供する。不発明の高分子支持体系はｉ慧分子支持体と１以上の酸化 性置換基を有するプライマーこτまんでなるものでるる。これらの酸化ｍ＋ｄ換 基の選択的酸化によりプライマーの直接切断が生ずる刀・、蜆いぽ又高分子支持 体から合成されたオリゴヌクレオチドの放出と生ずるプライマーの間接切断を可 能に下る。

この歯分子叉待体系の発見は特別な意義を有する。

本発明の高分子支持体系は更に精製を殆んど必懐としないオリゴヌクレオチド類 の合成乞可艷にする。加えて、この誦分子叉持体系は支持体上に合成されたオリ ゴヌクレオチドに相補的な鎖酸２有するオリゴヌクレオチド類或いはポリ核酸の いずれかの固定化を容易に行うために使用することができる。この樟にして固定 化されたオリゴヌクレオチド或いはポリ核酸は各種の特別の検出力ｂｅ用いて検 出されるか或いは更に研究するために回収することができる。本発明の多くの応 用は当業者には明らかでろろう。

広範囲の高分子支持不全本発明の高分子支持体として使用することができる。好 ましい高分子支持体としては、ポリスチレン類、架舗ポリスチレン類、呆檎ポ。

リアミノ酸類、ポリエチレングリコール、酢酸ビニルとＮ−ビニルピロリドンと のコポリマー、並びにその他のポリオレフィン類、ポリエステル類、ポリアミド 類、ポリアクリレート類、ポリメタクリレート類、金属酸化物、クレー、各種ガ ラス類及びこれらの支持体のいずれかの組み合わせを使用するグラフト化物など が挙げられる。

本発明の高分子支持体は、可溶性或いは不溶性のいずれであってもよいが、好ま しくは不溶性のものがよい。更に、それらは使用される反応性条件下において安 定であシ、プライマーの支持体への共有結合を行うために必要な反応性基をそれ らの表面に有する。多くの支持体は本明細曹中に開示される発明を実施する目的 のために満足できるものであるが、車菫に比例して多くの結合部位よりなる大表 面積を有する尚分子重合体が最も好ましい。

篩分子の表面上の反応性基はプライマーが高分子支持体に共有的に結合すること を可能にする。その株な目的のために、通常使用される反応性基はヒドロキシル 基、カルボキシル基、及びアミン基である。例えば、高分子支持体に末端カルボ キシル官能基を付与するとそれは次いでプライマーのヒドロキシル基或いはアミ ン基と反応する。或いは父、高分子支持体にアミ７基或いはヒドロキシル基を付 与すると、それは次いでプライマーのカルボキシル基と反応する。例えば、カル ボキシレート官能基を含有する基はジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ） などの適当な縮合剤の存在下において固体支持体上のアミン基に結合させること ができる。−級或いはアリールアミンを含有するグライマーｌｄアミンとカルボ キシレート官能基との縮合によシ支持体に共有結合され、アミドを形成する。同 様にして、酸ハロゲン化物をアミン含有プライマーと反応させてアミドを形成す ることができる。或いは又、プライマーは酸ハロゲン化Ｗを有し、支持体がアミ ン官能基を含有することも可能である。

プライマーの支持体への結合方法は数多く存在する。

例えばグリニヤール（Ｇｒｌｇｎａｒｄ）　縮合、エーテル結合形成、フリーデ ル−クラフト（Ｆｒｅｉｄｅｌ　−Ｃｒａｆｔ）アルキル化、二級アミン形成、 水銀塩及びオンフィン縮合などがある。しかしながら、同業者は特別の合成のた めの適当な高分子支持体並びにプライマーの高分子支持体への適当な結合手段を 容易に決定することが可能である（　ｐ、ホツジ及びり、、Ｃ，シエリングトン （Ｐ、　Ｈｏｄｇｅａｎｄ　Ｄ、Ｃ，Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ）　、ｒ有機合成 におけル高分子支持反応（Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｕｐｐｏｒｔｅｄ　Ｒｅａｃｔｉ ｏｎｓ　ｉｎ　ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）　Ｊ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ ｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８０１゜プライマーの結合された 支持体系をオリゴヌクレオチド合成のために使用する前に、支持体及びプライマ ーの両者の反応基とオリゴヌクレオチドの収率を峨少させる副反応を防止するた めに保護されなければならない。プライマーの場合には、これは反応性アミンを アミドに転換し、アルコールを連鎖開始に参加する場合を除いてエステル化する ことによシ最も容易に達成される。これらの反応−はいずれも酸無水物（例えば ピリジン中の無水酢酸）並びに酸塩化吻及びその他のアシル化剤？用いて生ずる 。支持体上の反応性基の保護は用いられる支持体の種類に応じて異る。保護され る反応性基は当業者には明らかであろう［Ｃ，Ｂ、リース（Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅ＠ｅ ）　、ｒテトラヒドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）　Ｊ　３４：３１４３−３ １７９　（１９７８年）及びＴ　、Ｗ、グリーン（Ｔ、Ｗ、Ｇｒｅｅｎｅ）、［ 有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎＯｒｇａ ｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　Ｊ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　 ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８１年〕。

本発明のプライマーは多くの別々の形態において実施され得る。これらの別々の 実施態様の全ては、しかしながら、一つの共通の特徴を有する。各実施態様にお いてプライマーは１個以上の酸化性置換基を有する。

これらの置換基をプライマー或いはオリゴヌクレオチドの他の如何なる結合も破 壊することなく選択的に酸化することにより目的オリゴヌクレオチドを高分子支 持体から直接或いは間接に放出させる。１個以上の酸化性置換基？利用すること により、本発明は従来技術の現状における九つの異った開始点を有する支持体を 作成する必要性を無くすものである。

本発明の好ましい酸化性置換基はヒドロキシル基、アルケニル基、−級アミン基 、及び二級アミン基である。好ましい実施態様に対応する第１図、第２図、第４ 図、第５図及び第６図は特別の結合部位において、いずれの酸化性基が好ましい ものであるかを示している。しかしながら、これらの図面は単に本発明に従った 各種プライマー構造を図解することを目的とするにすぎない。当業者は図示され た構造特に環状構造は本発明の趣旨及び範囲から離れることなく、いくつかの異 った実施態１に有するように柔軟性のあるものであることを理解するであろう。

現在、最も好ましい実施態様において酸化性置換基はりボヌクレオシドである。

リボヌクレオシドは高分子支持体にその塩基を介して結合されている。合成され るべきオリゴヌクレオチドの最初のヌクレオチドはりボヌクレオシドに縮合され 、リボヌクレオシドの５′位及び第１のヌクレオチドの３′位の間のホスフェー トブリッジによシリボヌクレオシドに結合される。

合成オリゴヌクレオチドの高分子支持体からの酸化的切断を容易に行うためにプ ライマーの酸化性置換基の保護及び脱保護を行う必要のない本発明のその他の好 ましい実施態様が存在する。第３図及び第７図は酸化性置換基がアルケニル基で ある本発明のそれらの実施態様を例示するものである。本発明のこの酸化剤はア ルケニル結合の部位において７ライマ一分子を切断する。即ち、これらの実施態 様においては、オリゴヌクレオチド合成工程中に副反応を生ずる酸化性置換基が 存在しないので本発明のオリゴヌクレオチド合成方法の工程（ｅ）及び（ｆ）ｔ −行う必要がない。ここでも父、当業者は第３図及び第７図はそれ自体柔軟性の あるものであシ、本発明の好ましい実施態様を例示することを目的とするもので あることを了解するであろう。

この独特な支持体系のプライマーは３′或いは５′のいずれかの方向の鎖伸長を 可能にし、あらゆる目的オリゴヌクレオチドの合成に適したものである。合成は ホスファイト及びホスホトリエステル法を含む多くの手段によシ行うことができ る。例えは、オリゴヌクレオチド類はＭ、Ｄ、−７テウツチ（Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔ ｅｕｃｃ　ｉ　）及びＭ、　Ｈ，カルザス（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、［ 高分子支持体上におけるデオキシオリゴヌクレオチド類の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓ ｉｓ　ｏｆＤｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｏｎ　ａ　Ｐｏｌｙ ｍｅｒ　５ｕｐｐｏｒｔ）　Ｊ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｖｏｌ。

１０３、　Ｎｏ、ｌｌ　、１９８１　年）及びＭ、Ｊ、ガイド等（Ｍ、Ｊ、Ｇａ １ｔａｔ　ａｌ、）、［オリゴデオキシリボヌクレオチド類の迅速合ｄＩＶ、ホ スホトリエステル中間体を介してのオリゴデオキシリボヌクレオチド類の改良さ れた固相合成（Ｒａｐｉｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＩＶ、　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　５ｏｌｉｄ　Ｐｈ ａｓｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉａ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌ ｅｏｔｉｄｅｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ　Ｉｎｔｅ ｒｍｅ−ｄｉａｔｅｓ）　Ｊ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、　Ｖｏｌ、　８．　Ｎｏ、５゜１９８０年）などに記載される方法に従って 合成することができる。

本発明のプライマーはそれらの信這に２いて巌状或いは環状のいずれかでめり得 る。更に、これらのプライマーは直接或いは間接のいずれかの方法において切断 される。直接切断においては酸化は合成オリゴヌクレオチドが一つの化学反応に おいて支持体から放出されるようにプライマーを切断するのに投置つ。しかしな がら、場合に応じてプライマーの一部が第１〕ゴヌクレオチドに結合して残るこ とがある。この時点においてオリゴヌクレオチドを有効な塩基で処理することに より残存プライマ一部分をオリゴヌクレオチドから除去することができる。間接 切断においては、有効な塩基による処理と組み合わされた酸化が合成オリゴヌク レオチドの支持体からの除去を行う。

本発明の好ましい笑施慇・泳においては、環状プライマーは形成されたオリゴヌ クレオチドのホスフェートに隣接した１個以上の酸化性基を官有する。敵化後適 当な塩基ｒ用いての処理によシオリゴマー乞支持体から除去する。ｉｆ図、第２ 図及び第３図は、本発明のこの実施態ａｔ例示するものでおる。

本発明のもう一つの好ましい実施内様においては、環状プライマーは支持体との 結合点に位置するば化注基を官有する。この場合において、酸化はオリゴマー及 びプライマーの一部を支持体から切断する。適当な塩基による処理によシ、プラ イマーの残存部分をオリゴマーから除去することができる。第４図は、本発明の この実施態様を汐１」示するものである。

第３の実施態様においては、線状プライマーは合成オリゴマーのホスフェートに 隣接した単一の酸化性基を含有する。酸化と同時或いは酸化に引き絖き適当な塩 基で処理するとオリゴマーが支持体から切断される。

第５図は、本発明のこの実施態様を例示するものである。

本発明の第４の実施態様においては、線状プライマーは２個以上の隣接した酸化 性基を含有することができる。酸化時に、この配列はオリゴマーの支持体からの 直接の切断を可能にする。第６図及び第７図はこの実施態様を例示するものであ る。ここでも父、適当な塩基を用いてプライマーの残存部分をオリゴマーから切 断することができる。

任意の特別のプライマーに関して酸化性官能基とオリゴヌク、レオチド合成の開 始部１立の間には幾つかの位置的関係が存在するが、高分子支持体からの切断に 引き続く合成オリゴヌクレオチドからのプライマ一部分の除去のためにはホスフ ェートに対してγ位の酸化性官能基の配置が好ましい。当業者は本発明のオリゴ ヌクレオチド合成法が酸化性官能基がホスフェートに対してγ位以外の位置にお る場合にもなお有効でらることを理解するであろう。しかしながら、不発明の好 ましい態様は目的オリゴヌクレオチドのよシ便利な合成？可能にするものである 。

酸化性置換基上の保護基の除去は合成されたオリゴヌクレオチドの高分子支持体 からの切断前に必要な場合がある。第１図、第２図、第４図、第５図及び第６図 は本発明のこの実施態様を例示するものである。脱保護は当業者に公知の方法に よシ達成される。Ｔ　、Ｗ、グリーン（Ｔ、Ｗ、Ｇｒａｅｎｅ　）、［有機合成 における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ 　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　Ｊ　（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋｔ　１９８１年）。

合成されたオリゴヌクレオチドは、プライマーの酸化性置換基の選択的岐化によ り高分子支持体から直接或いは間接に放出される。この切断の結果、実質的に定 量的なオリゴヌクレオチドの収率が得られる。直接切断のためには、選択的酸化 はオリゴヌクレオチドを有効な酸化剤で処理することよりなる。オリゴヌクレオ チドにその高分子支持体からの放出後、プライマーの一部が結合して残る場合に はこれらの残存部分は有効な塩基で処理することにより除去することができる。

直接切断においては、酸化から生ずるカルボニル基が合成されたオリゴマーのホ スフェート基に対してγ位にあるのが好ましい。この実施態様は塩基の適用がプ ライマーの残存部分を合成されたオリゴヌクレオチドから切断するのに有効であ るのｔｉ実にする。その他、有効な塩基による処理が残存プライマーのオリゴマ ーからの完全な除去を行わない本発明の実泥態珠がある。

しかしながら、当業者はこれらのプライマーの残存部分は多くの場合残存プライ マ一部分の特別の化学に応じて代書法により除去することが可能であることを理 解するであろう［Ｔ、Ｗ、グリーン（Ｔ、Ｗ、Ｇｒｅｅｎｅ　）、［有機合成に おける保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　ＯｒｇａｎｉｃＳ ｙｎｔｈｅ＋＋ｉｓ）　Ｊ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌａｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｎａｗ　Ｙ ｏｒｋ、１９８１年］。

間接切断のためには、選択的酸化は有効な塩基による同時又は引き続きの処理？ 伴う有効な酸化剤によるオリゴスクレオチドの処理？含んでなるものである。

直接切断及び間接切断の両者のだめの有効な酸化剤は目的切断部位を選択するが オリゴマー上のその他の反応性基は選択しない温和な酸化剤よシなるものである 。現在好ましい実施態様においては、有効な酸化剤は過ヨウ素酸塩、過マンガン 酸塩、重クロム酸塩、二酸化マンガン及び１酢酸鉛よシなる群から選ばれる。

最も好ましくは過ヨウ素岐塩が有効な乏化剤である。

間接切断については、・■効な塩基は有効な酸化剤と共働してフライマーを切断 する。間接切断のための有効な塩基はピペリジン、ピリジン、モルホリン、水酸 化アンモニウム、水酸化ナトリウム及びアルデヒド類とンツフ（Ｓｃｈｉｆｆ） 　塩基を形成する塩基などの塩基を含んでなる。好ましくは、間接切断に有効な 塩基は例えばアニリン、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プシッフ（Ｓｃｈｉ ｆｆ）　塩基を形成する塩基である。最も好ましくは、間接切断の有効な塩基は アニリン、水酸化アンモニウム、或いはｎ−プロピルアミンである。

直接切断について、放出されたオリゴヌクレオチドに結合して残存゛する任意の プライマーの部分分除去するために使用される有効な塩基は温和な塩基と含んで なるものである。好ましい実施態様において直接切断の有効な塩基は補水酸化ナ トリウム、水酸化アンモニウム、ピペリジン或いはｎ−プロピルアミンである。

最も好ましくは、直接切断について使用される有効な塩基はピペリジンである。

本発明の最も好ましい実施態様においてはプライマーの酸化性置換基はリボヌク レオシドであシ、合成されるオリゴヌクレオチドの第１ヌクレオチドはりボヌク レオシドの５′を介して結合している。第１ａ図は不発明のこの実施態様全図解 する反応式である。Ｒ１及びＲ２＝　ＯＨ、及びＲ５及びＲ，＝　Ｈの場合には Ｒ１及びＲ２は第１＆図のリボース環の２′及び３′ヒドロキシル基に対応する 。オリゴヌクレオチド合成の際にリボヌクレオシドの２′及び３′位は保護され る。このオリゴヌクレオチドは先ず２′及び３′ζドロキシル基を脱保護するこ とにより高分子支持体から切断される。このオリゴヌクレオチドは次いでプライ マーを間接的に切断する選択的酸化によシ高分子支持体から放出される。有効な 水酸化アンモニウム或いはｎ−プロピルアミンである。

或いは父、オリゴヌクレオチドを先ず過ヨウ素酸塩で処理し、次いでアニリン、 水収化アンモニウム、或いはｎ−プロピルアミンで処理するか或いはオリゴヌク レオチドを同時に過ヨウ素酸塩及びアニリンで処理することができる。合成され たオリゴヌクレオチドを次いで標準的技術を用いて回収する。

オリゴマー上の保護基の除去は合成されたオリゴヌクレオチドの支持体からの酸 化切断の前或いは後のいずれにおいても行うことができる。切断前、に保護基を 除去したい場合には水酸化す）　ＩＪウム或いは水酸化アンモニウムを用いて塩 基上の保護基を除去することができる。メチル或いはトリクロロメチルがリン上 の保護基である場合には、脱保護のための好ましい試薬は水酸化アンモニウム、 或いはチオフェノキシトである。

トリブチルホスフィンがリン上の保護基としての２，２゜２−トリクロロ−１， １−ジメチルエチルの除去のための好ましい試薬である。０−クロロフェノール 及びｐ−クロロフェノールがリン上の保護基である場合にはベンジルオキシメー ト及びピリジンアルドキシメートなどのオキシメート類をＭ、Ｊ、ガイド等（Ｍ 、Ｊ、Ｇａ１ｔ　ｅｔａｌ、）、ｒオリゴデオキシリボヌクレオチド類の迅速合 成■、ホスホトリエステル中間体を介してのオリゴデオキシリボヌクレオチド類 の改良された固相合成（ＲａｐｉｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｄｅ ｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＩＩＩＶ、ＩｍｐｒｏｖｅｄＳｏｌｉｄ　 Ｐｈａｓｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅａｔｈｒｏｕｇｈ　Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ　Ｉｎｔｅ ｒｍｅｄｉａｔｅａ）　ｊ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　 Ｖｏｌ、８．　Ｎｏ、５．１９８０年）に説明される方法に従って、好ましい脱 保護剤として使用することができる。

合成されたオリゴマーの高分子支持体からの切断をオリゴマー上の保護基の除去 の前に行うのが望ましい場合が存在する。保護基はＴ　、Ｗ、グリーン（：ｌ’ 　、Ｗ、Ｇｒｅｓ＋ｎｅ　）、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖ ｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎＯｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　ｊ　（Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８１年）に記載される方法に従って除去することができる。本発明のこの面 はプライマーが酸化的切断のための予備的脱保護を必要としない場合、或いは保 護基が極めて温和な条件で除去することのできる場合において有用性を有するも のである。

本発明の高分子支持体及びオリゴヌクレオチド合成方法はオリゴヌクレオチドバ イグリッド形成技術を容易にすることにおいて特別の有用性を有するものである 。本発明の支持体は、合成されたオリゴヌクレオチドの脱保護（工程ｆ）後にそ れが相補的なポリ核酸とハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチド上・イブリ ッド形成アフイニテイ系として使用することができる。

成る場合において、合成されたオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成された相 補的なポリ核酸を回収することが望ましい場合がちる。本発明の最も好ましい実 施態様においては、相補的ハイブリッド形成されたＤＮＡ或いはＲＮＡは溶出し て便利に且つ定量的に回収される。もう一つの好ましい実施態様は、本発明の方 法に従ってプライマーの高分子支持体からの酸化的切断によシ全二重鎖の定量的 回収を可能にする。この実施態様において、合成されたオリゴヌクレオチド上及 びプライマーの酸化性置換基上の保護基は−・イブリッド形成前に除去される。

一度ハイブリッド形成が達成されると、プライマーの酸化性置換基の有効な酸化 剤による処理後温和な塩基による処理によシニ重鎖の高分子支持体からの放出が 行われる。当業者は本発明において説明される技術を用いてハイブリッド形成さ れた生成物が回収されることの便利さを了解するであろう。

その他の場合において、ハイブリッド合成された相補的ポリ核酸の存在をそれを 支持体から実際に除去することなく単に検出することが望まれる場合がある。

この場合においては、幾つかの検出方法が可能であり、それらの全ては公知のも のである。その様な検出方法の一つは既にハイブリッド形成されたポリ核酸の部 分に相補的な−・イブリッド形成グローブを用いるものである。このハイブリッ ド形成グローブは定義によシオリゴヌクレオチド或いはポリ核酸である。もし、 相補的ポリ核酸が実際に合成されたオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成する 場合には、このハイブリッド形成プローブは支持体上のポリ核酸にハイブリッド 形成する。このハイブリッド形成プローブは既にハイブリッド形成されたポリ核 酸上の２回目のハイブリッド形成後のその存在が検出されるように例等かの方法 によシ漂識される。標識技術としては通常放射性標識、螢光性標識、蛋白質仲介 検出系との相互作用のだめの環境指示基、発色及び発光などが含まれる。蛋白質 仲介検出系は又直接に使用することもできる。当業者はハイブリッド形成プロー ブが第２回目のハイブリッド形成後に観察されるために標識されるその他の方法 或いはハイブリッド形成された相補的ポリ核酸が例えば特異性抗体を用いる検出 などによシ検出される方法を了解するであろう。

本発明を以下の実施例によシ、例示するがこれらは本発明を限定するものではな い。

５−ジメトキシトリチル−６−クロロプリンリボシド無水ピリジン（ｌｄ）中の ６−クロロプリンリボシド（２８７ｑ）及びジメトキシトリチルクロライド（３ ５０η）？室温に保った。１．５時間後シリカ上のＴＬＣ分析によシチェックさ れたアリコートは反応が９５チよりも良好に完結したこと？示した。反応液を次 いで氷−ＮｈＣＬ上に庄ぎｃａ２ｃｔ２で抽出した。有機層を礫シ返しＮａＣ４ 水溶液で洗浄し、次いでＮａｚＳＯｑ上で乾燥し、真′ｇ！、留去した。残存泡 状捌を最終的にベンゼンに溶解し、凍結乾燥した。

５′−ジメトキシトリチル−Ｎら−［１２−アミノドデノルアミン〕−アデンン ン（Ｉ［） 無水ト／ｌ／　ｘ　ン（１４ｍｌ　）中の（Ｉ）及び１，１２−ジアミノドデカ ン（２２）の混合物を１００℃で２０分間保ち、その後激しく撹拌しながらヘキ サン（１５０ｍ１．）に制別゛した。ヘキサン中で生じた沈ｍを遠心分離により 集めた後ＣＨ２Ｃ６２に浴解し、Ｍ磯溶液を手短かにＫＯＨ水溶液（０，０５Ｍ ）で抽出した。有機層をＮ１１ＺＳＯ１ｌ上で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた 。引き続き固体残渣を温かいトルエンに＠解した。少量の不溶性物質を除去後溶 解物質を過剰ヘキサンの制別により沈澱させた。

形成した白色沈澱を遠心分離により集め、ヘキサンで洗浄し、真空乾燥しｌこ。

収ｉは微細粉末として５２４■であった。

支持体への結合 Ａｒｎｂｓｒｌｉｔｅ　ＣＧ５０（１００−２００湿潤メツシユ）を０、１　Ｍ 　ＨＣ１水浴欣で十分に洗浄後３０％水性メタノール中の０．１５ＭＨＣｔで洗 浄し、次いでメタノール、アセトン、クロロホルム及びエーテルで洗浄した。侍 られた粉末をＰ２Ｏ５上で真空乾燥した。

ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　（５ｍｔ　）中の予圃処理されたアンバーラ イト（１１）及びカルボニルジイミダゾール（６６０Ｗ）の混合物を室温で４時 間振盪した。この活性化されたアンバーライト１ｔＤＭＦ′で洗浄して過剰のカ ルボニルジイミダゾールを除去してからそれ２　ＤＭＦ　（６ｍｔ　）及びトリ エチルアミン（０，５ｒｎｌ）中の（ｎ）の溶液中に懸濁させた。混合物ｆｔ次 いで撹拌しながら８０℃に１時間加熱させた。未反応カルボキシル基は、それら ２　ｏｙｒｐ　（３，５ｍｔ　）中のカルボニルジイミダゾール及びジメチルア ミンで活性化させることにより保護し、次いで室温で１時間振盪した。樹脂ｅＦ 別し、次いでアセトン、エーテルで洗浄した。乾燥粉末を無水酢酸（４ｒ！Ｌｔ ）及び無水ピリジン（１（１−）の混合物に懸ＰＡさせた。２４時間ｆ＆樹脂２ 炉別し、注意深くアセトンで洗浄した懐、エーテルで洗浄し乾燥させた。

ジメトキシトリチル放出はプライマー密度が？当り５０〜１００マイクロ当童で あること？示した。

実施例２ スチレンージピニルペンゼンホリマー に結合したウリジンの合成 の調製 ヌクレオシ）”５−（３−アミノ−プロベニ＃）−ウリジンをルース等（Ｒｕｔ ｈ　ａｔ　ａｌ、）Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、　４３：２８７０（１９７８年）に よシ記載された方法に従って合成し、１：１　メタノール／ジオキサン（２００ ｄ）中に浴ｈ・￥シ之。３．６２のクロロメチルスチレンビーズ（ＢＩＯＢＥ’ ＡＤＳＭＳ−１、１，２５４１７モルの塩素／ビーズの？）全添加した後、回転 ンエーカー内において２００　ｒｐｍで６５℃において３０分間撹拌した。支持 体を次いで濾過し、逐次テトラヒドロフラン、水、メタノール及びテトラヒドロ フランで洗浄してから高真空下に１時間乾燥させた。次いで、テトラヒドロフラ ン（４０ｍ）及びトリエチルアミン（１５ｍｊ）を添加後２００　ｒｐｍで５０ ℃において１時間撹拌させた。次いで、支持体を濾過し２、逐次水、メタノール 、クロロホルム及ヒエ−チルで洗浄し、室温において高真空下に８〜１８時間乾 燥した。

ピリジン中の１０％無水酢酸（１：　９．２０ｄ／樹月旨の１）及びジメチルア ミノピリジン（２η／樹月ｄの？）全乾燥樹脂に添加した後４０℃で１時間撹拌 した。

冷却後液相金傾瀉分離し、樹脂を逐次ピリジンクロロホルム及びメタノールで洗 浄してから８〜１８時間凍結乾燥させた。次いで濃水酸化アンモニウム中のピリ ジン（１：　ｌ、２００ｒｎ！、／樹脂のｊ）ｋａ７℃で４時間撹拌させながら 添加した。減圧下に蒸発乾固させて少量のピリジン金添加し、樹脂をもう一度蒸 発乾固させた。棗脂のｉ当シ１５−の樹脂と、次いで樹脂のｔ当シ８０ηのジメ トキシトリチルクロライドと共に添加し、混合？！ｌを７０℃で３時間撹拌した 。樹脂を次いｆ濾過し、逐ｉｄクロロホルム、メタノール、エーテルで洗浄し、 手短かに真空乾燥した。ピリジン中のｌＯチ無水酢酸（１０ｍｌ！／ｆＩｆ脂の ？）を次いで麻加し、３７℃で８〜１８時間撹拌した。最後に樹脂を濾過し逐次 ピリジン、クロロホルム及びエーテルで洗浄し、室温で８〜１８時間真空乾燥し た。

ジメトキシトリチル放出はプライマー密度がｌＯ〜５０μ当蓋／２であることを 示した。

実施例３ ポリアクリルモルホライド上の １２．５−の新たに蒸留されたグリコール甲のポリアクリルモルホライド樹脂（ Ｖｅｇａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ−カタログ番号ＮＯ，１８９６４Ｘ１．９ ５　ｔ　）及びｌ、１２−ジアミノドデカン（２？）の混合物を窒業下において １８０℃で撹拌しながら２０時間加熱した。樹脂を遠心分離によシ集め、次いで 順次メタノール、１０％酢ｍ−メタ／−ル（１：　１　）、メタノール−トリエ チルアミン、メタノール及びＴｉ仮にエーテルで十分に洗浄した。樹脂を真空乾 燥して１．６ＬＰの黄色微粉末を得た。ホウ酸緩衝液（ｐＨ９，７）中でビクリ ルスルホネートで試験すれたアリコートは強い橙色に変色し、モルホリンのジア ミンによる良好な置換を示した。

上記ｍＵ＆（８６ｏη）、５′−ジメトキシトリチル−６−クロロプリンリボシ ド（４７０■）、無水トルエン（５−）及びトリエチルアミン（３００μｔ）を ６０〜７０℃で撹拌しながら２０時間加熱した。樹脂を遠心分離で集めた後順次 トルエン、メタノール−トリエチルアミン、メタノール及びエーテルで洗浄した 。樹脂を真空乾燥後それをピリジン（６−）及び無水酢酸（１，５ｍ／）中に懸 濁し、８〜１８時間振盪した。樹脂を次いでピリジン、ピリジン−水、メタノー ル、アセトン及びエーテルで洗浄した。

クロロホルム中の２．６％トリクロロ酢酸を用いたジメトキシトリチル除去の定 量はプライマー密度が２０μ当蓋／ｌであることを示した。

実施例４ オリゴマーの支持体からの酸化除去 オリゴマーが標準的技術を利用して一度プライマーー支持体系上に合成されると 、それらは過ヨウ素酸塩及び水酸化アンモニウム、或いは過ヨウ素酸塩及びアニ リンのいずれかの組み合わせを用いて容易に除去することができる。メチル基が ホスフェート保護基として使用される場合には、支持体結合オリゴマー−プライ マーは先ず濃水酸化アンモニウム中において５０℃で８〜１８時間インキュベー トされる。この操作はｅｉｓ−ジオール上のものも含めて全ての保護基を除去す る。支持体結合オリゴマー−プライマーを水、アセトン、及びジクロロメタンな どの適当な溶媒で洗浄した後、オリゴマーを０．０５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム７ ０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０〜７．３）中におけるインキュベーショ ン（３０分〜数時間）によシ酸化される。水で洗浄後、濃水酸化ナトリウムと添 加し、混合物を次いで室温で数時間インキュベートさせる。得られたオリゴマー は濾過、及び水及び５０チエタノールで洗浄することによシ汚染種がほぼ除去さ れる。凍結乾燥によシ水、水酸化アンモニウム及びエタノールを除去後目的オリ ゴマーを更に憚卓的操作によりｍ製する。

或いは又過ヨウ素酸ナトリウム／酢酸塩中におけるインキュベーション後、オリ ゴマーをアニＩＪ　ｙ　（ｐＨ５，０）で数時間インキュベーション後除去する こともできる。合成されたオリゴヌクレオチドの支持体からの酸化除去はオリゴ マー及び支持体上の反応性基の脱保護前或いは後のいずれにおいても行うことが できる。

切断操作の試験として、５′−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２′−チ オキシシチジンの七ツマ一単位を本発明のポリメタクリレート支持体（実施例１ ）にカップリングさせた。標準的なホスホモノクロロダイト化学［Ｍ、Ｄ、マチ ラッチ（Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｅｕｃａｉ　）　及びＭ、Ｈ。

カルザース（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈ＊ｒｓ）、“Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ ｔｔｅｒｓ”２１　ニア１９−７２２（１９８０年）〕ｔ−用いてアセトニトリ ル／４％２．６−ルチジン中の活性化されたヌクレオシドの２０−溶液１２−を ５３３岬の支持体に添加した。酸化工程の完結後、支持体を逐次アセトン、ジク ロロメタン、水、アセトン、ジクロロメタン及びエーテルで洗浄後風乾した。

モノマーを支持体から回収するために次の操作に従った。先ず七ツマ−を濃水酸 化アンモニウムで５０℃において８〜１８時間処理した。水酸化アンモニウム、 アセト／及びジクロロメタンで洗浄後、窒素流下に乾燥を行い次いで、０５Ｍの 酢酸ナトリウム及び、０５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム（ｉ　０　ｄ、　ｐＨ７，２ ）を冷加し、全混合物を室温で２４時間インキュベートした。水、アセトン、及 びジクロロメタンで洗浄後、窒素下に乾燥させ、濃水酸化アンモニウム（ｉ　ｏ ｙ）を添加し、混合物をもう一度室温で２４時間インキュベートした。

最後に水酸化アンモニウムで洗浄後、モノマーと支持体から良好な収率で回収し た。

この特別の操作のためには定量の７ｂめに使用さ九たジメトキシトリチル基の損 失を防ぐためしこ過ヨヮ累准塩酸化のために備かに高めら几たｐＨが使用さルた 。

実施例５ テフロン／コポリマーグラフトに結合 された５′−ジメトキシトリチル−２’、３’ジアセチルアデノシンの合成 次の実施例は本発明の最も好ましい実施態様を表わすものでおる。

５′−ジメトキシトリチル−６−クロロプリンリボシドを実施例１と同様にして 副層した。５′−ジメトキシトリチル−６−クロロプリンリボシド（３，Ｏｆ、 ５ミリモル）ヲ次いでアセトニトリル（３０ｍｌ）、Ｎ−エチルジイソプロピル アミン（８−）及びＨ２Ｏ（２５ｍｇ）中（Ｄ６．７５ｔ（５２ミリモル）の６ −アミノカプロン酸と反応させて５′−ジメトキシトリチルアデノシン−Ｎ６− カプロン酸塩全製造した。この生成切をシリカカラム上のクロマトグラフィーに よシ精製し、２％トリエチルアミンを含有するクロロホルム中のメタノールの線 状勾配（０〜２０チ）で溶出した。

溶媒を留去後少量のピリジンから蒸発させた後、シロップ状５′−ジメトキシト リチルアデノシン−Ｎ６−カプロン酸塩を無水ピリジン（５０ｒｎｔ）中におい て無水酢酸（１０−）を用いて暗所において室温で２４時間アセチル化させた。

生成物５′−ジメトキシトリチル−２’、３’−ジアセチルアデノシン−Ｎら一 カプロン酸トリエチルアミン塩を反応液を氷上に注ぎ、有愼相をジクロロメタン で抽出し、ジクロロメタン相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで溶媒をロー ター蒸発させて単離した。残留シロップを８０−のトルエンに溶解し、目的化合 ＠’１５２０−のへキサンを添加して沈澱させた。濾過及び風乾後生酸物の収量 は２．６２ｒ（２，４ミリモル）であった。

カプロン酸部位における活性エステルを形成するために５′−ジメトキシトリチ ル−２’　、　３’−ジアセチルアデノシン−Ｎも一カグロン酸トリエチルアミ ン塩（０，６２２，０，５６ミリモル）をアセトニトリル（２０ｍ７り及び無水 ビリジｙ　（４ｍｌ　）中の１．０４ｒ（５ミリモル）のシンクロヘキシルカル ボジイミド及び０．５４９（４ミリモル）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール と２０℃で４時間反応させた。アルキルアミン基を８原子の長さで含有したテフ ロンウール／コポリマーグラフト化支持体（９，１８Ｆ）を添加し、混合物と２ ０℃で１９時間インキュベートした。

この支持体を未結合ヌクレオチド類を除去するためにアセトニトリル、２チドリ エチルアミンを含有するメタノール、メタノール及びエーテルで洗浄した。支持 体上の未反応アミン基と次いで５０−のピリジン中の過剰の無水酢酸（５ｉ３及 びＮ−エチルジイソプロピルアミン（２ｍ１．）で振盪しながら２０℃で２時間 保護した。アセトニトリル、メタノール及びエーテルで洗浄後支持体のジメトキ シトリチル含量はグライア　−密度が１当シ約３０μ当童であることを示しだ。

実施例６ １５チミジンの長さのオリゴマーをエフィモフ（Ｅｆｉｍｏｖ）の修正されたト リエステル化学ＣＶ、Ａ、エフィモフ（Ｖ、Ａ、Ｅｆｌｍｏｖ）、Ｎｕｃ、Ａｃ １ｄ　Ｒａｓ、　１０．６６７５（１９８２年）〕を用いてバイオサーチサム・ ワン・ＤＮＡ−シンセサイザー　（Ｂｌｏｓｅａｒｃｈ　Ｓａｍ　Ｏｎａ　ＤＮ Ａ　５ｙｎｔｈｅａｉｚｅｒ）によ、９０．１０５２のＴＥＦ　Ｉ支持体上に合 成した。合成が完了後ホスフェート保護基ｔｍ準的操作［Ｃ，Ｂ、リース（Ｃ， Ｂ、Ｒａａｓｅ）及びＹ、Ｔ、ヤン　クイ（Ｙ、Ｔ、Ｙａｎ　ＫｕＬ）、Ｃｈｅ ｍ、Ｃｏｍｍ、　８０２（１９７７年）〕に従ってアセトニトリル中のナト２メ チルクアニジン及びピリジンアルドキシムを用いて除去した。塩基保護基２次い で＠　ＮＨ，ＯＨを用いて５５℃で５時間インキュベートさせて除去した。これ らの脱保護操作はアデノシン上の２′及び３′保護基も除去した。

支持体結合オリゴマーを次いで暗所において２０％のアセトニトリルを含有する ０、　０２　Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４中の０、０５　Ｍ　Ｎａｌ０１ｌ（ｐＨ＝　７ −２　）で処理した。Ｈ２Ｏにおいて洗浄後、オリゴマー（ｉ−１Ｍトリエチル アンモニウムバイカーボネート中の５％ｎ−プロピルアミン及び１０チアセトニ トリルの混合物を用いて支持体から切断した（２〜３時間）。支持体全濾過、及 び水及びエタノールの混合物で洗浄後、オリゴマー含有上澄液を少量のトリブチ ルアミンの存在下において蒸発乾固させた。

０．０２５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ７，１中の３〜３０チのアセトニトリルの 線状勾配で溶出した（６０分に亘Ｆ）　）　Ｕｎｉｍｅｔｒｉｃｓ　ＲＰ　−８ カラムによるＨＰＬＣ分析は５′−ジメトキシトリチル（ｄＴｐ）ｔ５と一致す るほぼ５４分における主たるピークを与えた。

この物質の真正さをジメトキシトリチル基を８０係酢酸で除去し、オリゴマーを 標準的操作によ１）３２ｐＡＴＰでキナーゼ化しく：Ｒ，Ａ、ジョンンン（Ｒ， Ａ、Ｊｏｈｎｓｏｎ）及びＴ、Ｆ、ウオルセット（Ｔ、Ｆ、Ｗａｌｓｅｔ）、Ａ ｄｖ、ｉｎ　ＣｙｃｌｉｃＮｕｃｌｅｏｔｉｄ＠Ｒｅｓ、、Ｖｏｌｕｍｅ　１０ ．　Ｇ、プルツカ−（Ｇ、Ｂｒａｏｋｅｒ）、Ｐ、グリーンガード（Ｐ、Ｇｒｅ ｅｎｇａｒｄ）及びＧ、Ａ、ロビソン（Ｇ。

Ａ、Ｒｏｂｉｓｏｎ）編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７ ９年〕、及び放射ＭｍＨされたオリゴマーを２０％ポリアクリルアミドゲル上で 標準的操作により電気泳動させる［Ｔ。

マニアテイス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、フリッノ（Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔ ｓｃｈ）及びＪ、サンプルツク（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２年〕 ことによシ確認した。オートラジオグラフィー後、オリゴマーは（ｄＴｐ　）　 １５の移動度を有する実質的な単一スポットでおることを示した。

実施例７ その表面上にカルボキシル基企含有するテフロンウール／コポリマーグラフトに 使用した。１５原子の長さである支持体上のリンカー−アームカルボキシル部分 に２．５ｔの支持体をアセトニトリル（５０ｄ）及びピリジン（１０ｒｎｔ）の 混合物中の６７５〜（５ミリモル）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び１ ．１３Ｆ（５，４ミリモル）のジシクロへキシル−カルボジイミドでインキュベ ートすることにより活性化させた。

３時間インキュベート後実施例１において調製した１、２グの５１−ジメトキシ トリチルアデノシ７−Ｎ６−ドゾシルアミンを添加し、混合物を室温で１８時間 振盪した。

次いで１ｏｒｎｔのジメチルホルムアミド中のジメチルアミ／（１，５ｆ、３３ ミ！Ｊモル）を添加し、未反応活性エステルをジメチルアミドに添加するために 室温で１時間インキュベートした。

支持体をアセトニ）　ＩＪル、メタノール及びエーテルで洗浄後、アデノシン上 の２′及び゛３′ヒドロキシル基を４０−の無水ピリジン中の６ｍ／（６４ミ！ ｊモル）の無水酢酸及び７５０Ｈｉ（６ミリモル）のジメチルアミノピリジンの 混合物で保護した俊室温で３時間インキュベートした。次いで、アセチルクロラ イ）”（２−１２８ミリモル）を添加し、インキュベーションを１時間継続した 。

支持体をアセトニトリル、メタノール及びエーテルで洗浄した。収量は２．６１ であシ、ジメトキシトリチル放出はＴＥＦ　ＩＩｎ支持体？当り８５μ当量のプ ライマー密度と有することを示した。

実施例８ ＴＥＦ　ｎ支持体への５′−ジメトキシトリミジンの付加及びその支持体からの 切断適当な放射線標識チミジンヌクレオチドを得、実施例７のＴＦＦ　ｎ支持体 上に縮合させ、支持体から選択的に切断した。この操作は、支持体の選択的切断 の面を立証した。

５′−ジメトキシトリチル−３’−（ｐ−クロロフェニルホスフェート）−５− （メチル−１１１Ｃ）チミジンは次のようにして調製した。冷チミジン（１２２ Ｑ、　０．５ミリモル）ｉ５−（メチル−１１１Ｃ）チミジン（はぼ９５μＣｉ ／μモル）と合わせ、水に溶解し、凍結乾燥し、五酸化リン上で乾燥させた。こ の１１ＩＣ−チミジン混合物を次いで４ｄの無水ピリジン中に溶解し、２ゴまで 蒸発させた。次いで、ジメトキシトリチルクロライド（１７０ｍｇ、０．５ミリ モル）を添加し、室温で１時間インキュベートさせた。反応液を仄いて水中に注 ぎ、ジクロロメタン中に抽出させた。ジクロロメタン相を硫酸ナトリウム上で乾 燥し、濾過し、ロト蒸発させてゴム状物にした。このゴム状物を０℃において２ ．５％のトリエチルアミンを含有する沸騰ベンゼンから再結晶させた。結晶を冷 ベンゼン／シクロヘキサン（２：ｌ）で洗浄し、真空乾燥した。収量は２７０７ η（約Ｏ，Ｓミリモル）でおシ、放射−標識は２６７ｎｍにおいて１６　Ｌ　Ｏ Ｏｃｐｒａｌｏ、Ｄ、　ｆｉ（与えた。１１１ｃ−標識５′−ジメトキシトリチ ルチミジンは１ｄの無水ピリジン中の貯蔵液として貯蔵された。

１１１（−４１ｉＪチミジン類似体を次いで１．２ｄの無水ピリジン中の２４５ ＋＋ｖ（１ミリモル）のｐ−クロロフェニルジクロロホスフェ−）、１８．５μ ＬＨ２０ｋ合りセ、及びピリジン中に溶解された４００μｔの５′−ジメトキシ トリチル−５−（メチル−１１１Ｃ）チミジン貯蔵液を添加することによシホス ホリル化した。室温において３０分後、約ｌＯ艷の１Ｍトリエチルアンモニウム ノくイカ−ボネートを添加し、有機相を酢酸エチルで３回抽出した。有機相をＮ ａＣｔ水溶液で戻し抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。次いで有機相を濾 過し、蒸発乾固し、＃量のトリエチルアミンを含有するジオキサンから凍結乾燥 した。凍結乾燥＊質を３ｒｎｌの無水ピリジン中に溶解し、４℃で貯蔵した。２ ％トリエチルアミンを含有するクロロホルム中の１０％メタノールを溶出溶媒と して用いるシリカゲルプレート上の薄層クロマトグラフィーは生成吻がクロマト グラフ的に純粋であることを示した。シンチレーション計数は１１．５μＣ１の 物質が存在することを示した。

４１μモルの１１１Ｃ標識チミジン類似体をエフイモフの修正されたトリエステ ル方法（Ｖ、Ａ、エフイモフ（Ｖ、Ａ。

Ｅｆ　ｉｍｏｖ　）、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒａｓ、、　１０．６６７５（１９８ ２年）〕を用いて５０＋１９のＴＥＦ　ＩＩと縮合させた。次いで実施例５に開 示された脱保護及び切断工程を行い、ヌクレオチド放出を各工程において１１１ Ｃの放出によシ追跡した。

結果を以下にまとめて示す。

工　程　支持体上の１４（％　溶液中の１４ｃ係ＮＨ１ｌＯＨ脱保ｊ前　１００ 　０ 過ヨウ素酸塩酸化後　９６　１ 選択的塩基切断後　１８　７８ この実施例は酸化後に塩基処理を行うことによシ選択的切断部位が所望通シに分 裂することを立証しているＯ 実施例９ 本発明の実際的な応用を例示するためにポリメタクリレート支持体系を核酸分離 のための配列特異性アフイニテイ支持体として有効に利用した。

ポリメタクリレート支持体は実施例１に記載した操作に従って構成した。この支 持体はジメトキシトリチル放出によ請求めたところ、７８μ当量／１のヌクレオ シドプライマーを含有した。乾燥樹脂（３５０■）’（６ＩＩＩＩＩＩＸ　３０ ■の寸法のカラムに充填した。カラムは全ての工程がプログラム可能なように修 正されたＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ　ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーに嵌め込まれ た。

ヌクレオシド類は標準的ホスホモノクロリダイト化学の修正方法を用いて逐次添 加された（Ｍ、Ｄ、マチラッチ（Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｅｃｉ　）及びＭ、Ｈ， カルザース（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈａｒｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ　２Ｇ７１９−７２２（１９８０年）〕。この標準的操作への修正は、 ｌ）未反応５′ヒドロキシル基の５　％　Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン、１ ７．５％無水酢酸、２８．２４テトラヒドロフラン及び４９．３係２．６−ルチ ジンの混合物による保ｄ１及び２）クロロホルム中４係のジクロロ酢酸によるジ メトキシトリチル基の除去、を含んだ＠ この修正方法を用いて、適当なモノホスホクロロダイトの３０ｍＭ溶液を各ヌク レオチド添加のための支持体と反応させた。合成された配列はポリメタクリレー トプライマー−３’ｄ（ＴＴＴＴＧＡＡＡＴＡＧＧＴＡ）　５’でめった。

オリゴヌクレオチド合成の完＃ｉ、塩基保護基と支持体結合ＤＮＡヲ濃水酸化ア ンモニウムと５０℃で８〜１８時間反応させることにより除去した。水及び１Ｍ 塩化す）　ＩＪウムで十分に洗浄後へ（脂を乾燥じ、末端ジメトキシトリチル基 ヲ樹脂の２当シ２．３μモルの結合オリゴヌクレオチドにて定量した。

アフィニティー・イブリッド形成支持体の有用性を評価するために同一のホスフ ァイト化学？用いて二つのＤＮＡ配列金構成した。しかしながら、ａ準的な塩基 切断性シリカ支持体ｋ１２用した［：Ｍ、Ｄ、マチラッチ及びＭ。

Ｈ，カルザース（Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈ ｅｒｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ３２１ニア１９−７２２（１ ９８０年）〕。これらの配列の一方は、アフィニティー）イブリッド形成支持体 に相補的な１４ｍｅｒ即ち５’　−ｄ　（ＡＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣ−ＡＴＣ）３ ’であった。他方の配列はアフィニティハイブリッド形成支持体には相補的では ない１７ｍａｒ即ち５′−ｄ（ＧＧＡＡＴＡＴＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣ）３’であ った。これらのＤＮＡ配列の両者は標準的な操作により５′末端において”’Ｐ 　−ＡＴＰで愕識し、ポリアクリルアミドゲル上で絹製した［Ｃ，Ｃ，リチャー ドソ７　（Ｃ，Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’　ｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、５４：１５８（１９６５年）、及びＡ 、マキサム及びＷ、ギルバート（Ａ、Ｍａｘａｒｎ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ目ｂｅｒｔ ）、Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５：４４９（１９７９年） 〕。

これらの１４ｍａｒ及び１７ｍｅｒ配タリについて、それらのアフイニテイ支持 体とハイブリッド形成する能力と試験した。これはＤＮＡ配列をマフィニティ支 持体と１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭＴｒｉｓ　’ｆＪ衝液、及び１酷ＩＥＤＴ ＡよりなるｐＨ７，６の緩ｇＪ液の存在下において２５℃で２時間インキュベー トさせて行われた。ハイブリッド形成しない配列は上記緩衝液の１５の１．５コ のアリコートに用いて洗浄除去された。ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオ チド配列は次いで水で溶出した。

この比較操作の評価に当シ、３０％の１４ｍａｒ配列及び５チ未満の１７　ｍａ ｒ配列がアフイニテイカラムに結合していることが判明した。

本発明によるオリゴヌクレオチドの合成のための新規且つ改良された高分子支持 体系は、おだやかに酸性な及びおだやかに塩基性な反応条件に対する許容ａを維 持しながら単一種類の高分子支持体から全ての合成オリゴマーの便利な且つ定着 的な放出を可能にする当該分野において長く待望されていた汎用性高分子支持体 系の要求？満足させるものである。

以上の説明から、本発明の特別の形態が例示され説明されてきたが、本発明の趣 旨及び範囲から離れることなく各種修正がなされることが明らかであろう。従っ て、本発明は以下に掲げる請求の範囲以外からは制限されないものである。

浄書（内容に変更なし） 手続補正書動式） 昭和６０年ＩＣ月ノ日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ、、／ＵＳ　８４１０１３５１ 、発明の名称 オリゴヌクレオチドの高分子支持体系 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　モレキュラー　バイオシ又デ４でＡ−コー禾０しＸテｌト′ ４、代理人 〒１０７　東京都港区赤坂２丁目２番２１号５、補正命令の日付　昭和６０年９ 月２４ＥＩ（発送日）６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の発明者の氏名の欄及び特 許出願人の代表者の欄（２）明細書全文及び請求の範囲の翻訳文の浄書（但し、 内容についての変更はない） （３）図面全部の翻訳文の浄書（但し、内容についての変更はない）（４）委任 状及び訳文 （５）国籍証明書及び訳文 ７、補正の内容 別紙の通り ８、添付書類 （１）訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通（２）浄書 した明細書全文及び請求の範囲の翻訳文　１通（３）浄書した図面全部の翻訳文 　１通（４）委任状及び訳文　各１通 （５）国籍証明書及び訳文　各１通 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記工程を含んでなるオリゴヌクレオチド類を高分子支持体上に合成する方 法： ＆）高分子支持体を選択する工程、 ｂ）　１以上の酸化性置換基を有する分子状プライマーを該高分子支持体に結合 する工程、 Ｃ）オリゴヌクレオチド合成に悪影！＃を及ぼすか或いは酸化する可能性のある 該高分子支持体上の基金保護する工程、 ｄ）必要に応じて該プライマー上の酸化性置換基を保護する工程、 ｅ）該プライマー上にヌクレオチドを縮合してオリゴヌクレオチドを合成する工 程、 ｆ）合成の完結後任意の保護された畝化注置換丞を脱保護する工程、 ｇ）酸化性置換基を有効な酸化剤で選択的に酸化する工程、 ｈ）工程（２））と同時に或いは引き続いてオリゴヌクレオチド？有効な塩基で 処理する工程、及びｌ）オリゴヌクレオチドを回収する工程。 ２、該合成オリゴヌクレオチドが該酸化性置換基全選択的に酸化する前に脱保護 される請求の範囲第１項記載の方法０ ３、下記工程ヲ浮んでなるノルイブリッド形がとアフイニテイ生成物の合成方法 ： ａ）高分子支持体ヲ選択する工程、 ｂ）　１以上の酸化性置換基？有する分子状ブライ、−金談高分子支持体に結合 する工程、 Ｃ）オリゴヌクレオチド合成に悪影響を及ばすが或いは酸化する可能性のある該 高分子支持体上の基を保護する工程、 保護する工程、 ｅ）該プライマー上にヌクレオチドを縮合してオリゴヌクレオチドを合成する工 程、 ｆ）工程（６）の合成オリゴヌクレオチドと脱保護し、及び ｇ）脱保護された合成オリゴヌクレオチドを相補的ヌクレオチド鎖とハイブリッ ド形成して二重鎖を形成する工程。 ４、更に下記工程を含んでなる請求の範囲第３項記載の方法： ｈ）該相補的ヌクレオチド鎖を溶出する工程、及び１）核相補的ヌクレオチド鎖 を回収する工程。 ５、更に該相補的ヌクレオチド鎖の存在を検出する工程を含んでなる請求の範囲 第３項記載の方法。 ６、該相補的ヌクレオチド鎖が検出可能なハイブリッド形成プローブを用いて検 出される請求の範囲第５項記載の方法。 ７、　（ａ）　高分子支持体、及び （ｂ）１以上の酸化性置換基を有する分子状プライマーを含んでなシ、該プライ マーが該高分子支持体に結合され、よって該酸化性置換基が該酸化性置換基の選 択的酸化によ）該合成オリゴヌクレオチド或いはその誘導体の切断を可能にする ことを特徴とするオリゴヌクレオチド合成用系。 ８、　（ａ）　高分子支持体、 （ｂ）　’１以上の酸化性置換基を有する分子上プライマーであって、該プライ マーが該高分子支持体に結合され、該酸化性置換基が必要に応じて合成オリゴヌ クレオチドの切断を可能にするように配列されている分子状プライマー、及び （ｃ）　始めに該プライマー上に合成されておシ、よって相補的ヌクレオチドが 該合成オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成されることのできるオリゴヌクレ オチド、 を含んでなるオリゴヌクレオチド−・イブリッド形成アフイニテイ系。 ９、該高分子支持体がポリスチレン類、架橋ポリスチレン類、架橋ポリアミノ酸 、ポリエチレングリコール、酢酸ビニルとＮ−ビニルピロリドンのコポリマー、 ポリオレフィン類、ポリエステル類、ポリアミド類、ポリアクリレート類、ポリ メタクリレート類、金属酸化物、クレー類、ガラス類、或いはこれらの基の任意 の組み合わせを用いるグラフト化物よりなる群から選ばれる請求の範囲第７項又 は第８項記載の系。 １０、該酸化性置換基がアルケニル結合、ヒドロキシル基、−級アミン基、二級 アミン基、リボヌクレオシド或いはこれらの基の１種以上の組み合わせよ）なる 鮮から選ばれる請求の範囲第７項又は第８項記載の系。 １１、該酸化性置換基が有効な酸化剤に上り酸化され、該酸化剤が過ヨウ素酸塩 、過マンガン酸塩、重クロム酸塩、二酸化マンガン或いは四酢酸鉛よりなる群か ら選ばれる請求の範囲第７項又は第８項記載の系。 １２、おだやかな有効な塩基が直接切断に使用され、該有効な塩基が稀水酸化ナ トリウム、水酸化アンモニウム、ピペリジン或いはｎ−プロピルアミンよりなる 群から選ばれる請求の範囲第７項又は第８項記載の系。 １３、有効な塩基が間接切断に使用され、該有効な塩基がアニリン、ピペリジン 、ピリジン、モルホリン、水酸化アンモニウム、ｎ−プロピルアミン、水酸化ナ トリウム、及びアルデヒド類とシッフ塩基を形成する塩基よシなる塩基から選ば れる請求の範囲第７項又は第８項記載の系・ １４、該プライマーがＤＮＡ及びＲＮＡ合成の両者に汎用性であシ、３′及び５ ′の両方向における鎖伸長を特徴とする請求の範囲第７項又は第８項記載の糸。 浄書（内容に変更なし）