JPH06211892A - オリゴヌクレオチドの高分子支持体系 - Google Patents

オリゴヌクレオチドの高分子支持体系

Info

Publication number
JPH06211892A
JPH06211892A JP5070586A JP7058693A JPH06211892A JP H06211892 A JPH06211892 A JP H06211892A JP 5070586 A JP5070586 A JP 5070586A JP 7058693 A JP7058693 A JP 7058693A JP H06211892 A JPH06211892 A JP H06211892A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
primer
oligonucleotide
support
synthesis
polymeric support
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP5070586A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2502257B2 (ja
Inventor
Lyle J Arnold Jr
ジェイ． アーノルド，ジュニア ライル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Molecular Biosystems Inc
Original Assignee
Molecular Biosystems Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Molecular Biosystems Inc filed Critical Molecular Biosystems Inc
Publication of JPH06211892A publication Critical patent/JPH06211892A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2502257B2 publication Critical patent/JP2502257B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高分子支持体系を用いて特別の有用性を有す
るオリゴヌクレオチドハイブリッド形成アフィニティー
生成物を合成する方法を提供する。 【構成】 下記の（ａ）から（ｆ）の工程を包含する方
法： （ａ）１個以上の酸化性置換基を有する分子状プライマ
ーを高分子支持体に結合させる方法； （ｂ）オリゴヌクレオチド合成に悪影響を及ぼし得るか
あるいは関与し得る、該高分子支持体系のいずれの基を
も保護する工程； （ｃ）必要に応じて、該プライマー上の酸化性置換基を
保護する工程； （ｄ）該プライマー上にヌクレオチドを縮合してオリゴ
ヌクレオチドを合成する工程； （ｅ）必要に応じて、合成オリゴヌクレオチド、および
保護された酸化性のプライマー置換基のいずれをも脱保
護する工程；および （ｆ）得られた該脱保護されたオリゴヌクレオチドを相
補的にポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、それに
よって二重鎖を形成する工程。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】本発明は、一般的にオリゴヌクレオチド
合成に関し、より詳細にはオリゴヌクレオチド類を固体
支持体上においてより容易に且つより効率的に合成する
ことを可能にする新規な改良されたプライマー系に関す
る。
【０００２】オリゴヌクレオチド類は、3〜100個の塩基
単位の鎖長を有するDNA（デオキシボヌクレオチド類）
或いはRNA（リボヌクレオチド類）のいずれかの比較的
短い小片である。デオキシリボヌクレオチド類及びリボ
ヌクレオチド類の両者はそれらの細胞過程及び細胞成長
における鍵的役割のために特別の生物学的意義を有す
る。成長及び蛋白質発現のための主たる情報を含む細胞
の成分はDNAである。現在DNAの新たに合成された小片を
細胞のDNA中に導入することが可能であるという事実の
ためにオリゴデオキシリボヌクレオチド類の化学的合成
を容易にする方法は特別の意義を帯びる。
【０００３】その様な方法は、欠陥のある遺伝情報の修
正を助けるために或いは生物体が発現する蛋白質を実質
的に変成するために使用することができる。例えば、細
菌にヒトグルカゴンの合成の遺伝情報を含有するポリデ
オキシリボヌクレオチドを備えさせることができる。適
当な条件下においては、この生物は次いでヒトグルカゴ
を産生するようになる。
【０００４】加えて、オリゴヌクレオチド類のその他の
薬理学的、診断及び研究用途の範囲が存在する。しかし
ながら、オリゴヌクレオチドの完全な有用性はそれらを
高収率及びより高純度に有効に合成する方法を待つもの
である。
【０００５】1970年代の中期までは、オリゴヌクレオチ
ド合成は液相中において行われていた。液相技術に伴う
分離及び精製の問題がオリゴヌクレオチド合成の実際的
な自動化系を妨げていた。これらの分離及び精製の問題
を解決するために高分子支持体が開発された。これまで
のところ、これらの高分子支持体の使用は支持体と第1
ヌクレオチド間の切断の操作によるオリゴヌクレオチド
の固体支持体へのカップリングを含むものであった。し
かしながら、第1ヌクレオチドは４個の塩基の任意のも
のであり得るので、目的オリゴヌクレオチドを合成する
ためには、これらの操作は8個の異なった開始支持体即
ちDNAについて4個、及びRNAについて4個を備える必要が
あった。従って、全ての目的オリゴヌクレオチド類が1
つのタイプの高分子支持体から合成することができるよ
うな汎用性の大きなプライマー（鎖開始剤）を有する支
持体系が利用可能であれば有意義な進歩であると云え
る。
【０００６】実際に役立つためには、高分子支持体及び
プライマーは合成が完結するまで成長するオリゴヌクレ
オチドを保持しなければならない。又、一度合成が完結
すればプライマーは切断されてオリゴヌクレオチドを高
分子支持体から放出することができなければならない。
文献に記載されているプライマーの多くは極めて酸又は
塩基に不安定な結合を有する。即ち、オリゴヌクレオチ
ドは酸性或いは塩基性試薬で処理することにより望まし
くない時点において、構造的再構成の結果と共に高分子
支持体から放出される可能性がある。例えば、Ｍ．Ｄ．
マテウッチ及びＭ．Ｈ．カルザース(M.D.Matteucci and
M.H.Caruthers)、「高分子支持体上におけるデオキシ
オリゴヌクレオチド類の合成(Synthesis of Deoxyoligo
nucleotides on a Polymer Support)」(Journal of the
American Chemical Society, Vol.103, No.11, 1981
年、3185-3191頁)、及びＨ．ソマー及びＦ．クラマー
(H.Sommer and F. Cramer)「高分子支持体上における5-
ホスフェート基を有するデオキシオリゴヌクレオチド類
の化学的合成(Chemische Systhese von Desoxyoligonuc
leotides mit 5-Phasphat-gruppe am Polymeren Trage
r; Chemical Synthesis of Deoxyoligonucleotides wit
h 5-Phasphate Group on a Polymer Support)」(Chem.R
ev.,Vol.107,1974年 24-33頁)参照、しかしながら、酸
に不安定なプライマーの使用はオリゴヌクレオチド合成
の際に軽度に酸性な試薬或いは条件の使用を妨げる。
【０００７】同様に、塩基性に不安定なプライマーは軽
度に塩基性の試薬或いは条件の使用を妨げる。その結
果、酸性或いは塩基性に不安定なプライマーを使用する
ことは高分子支持体系の汎用性を大きく制限することに
なる。
【０００８】極めて酸或いは塩基に不安定なプライマー
は又、高分子支持体系の汎用性をその他の面で制限す
る。例えば、多くの保護基が通常ヌクレオチドの各種官
能基即ち塩基のアミン或いはヒドロキシル官能基、リボ
ヌクレオチドの2'ヒドロキシル基、デオキシリボヌクレ
オチドの3'及び5'ヒドロキシル基及びホスフェート基な
どを保護するために通常使用される。好ましくは、高分
子支持体系はこれらの保護基の除去をオリゴヌクレオチ
ドが高分子支持体から放出される前に可能にするように
十分汎用性であるか、或いは又、保護基が除去される前
にオリゴヌクレオチドが高分子重合体から放出されるこ
とが可能であるべきである。しかしながら、極めて酸或
いは塩基に不安定であるプライマーは、この汎用性を相
当に制限する。
【０００９】従って、必要であるのは完全に汎用性の高
分子支持体系即ち軽度の塩基性及び軽度の酸性反応条件
に耐えることができ、なお単一の高分子支持体からあら
ゆるタイプの合成オリゴヌクレオチドを所望の時点にお
いて便利に且つ定量的に放出することのできるオリゴヌ
クレオチド合成の高分子支持体構成及びそれに対応する
方法である。本発明は、この要求を満たすものである。
【００１０】
【発明の概要】本発明は特にオリゴヌクレオチド類の合
成に有用である独特な高分子支持体系を提供するもので
ある。具体的には、本発明の系は独特の支持体及びプラ
イマーの立体配置及びその立体配置に対応するオリゴヌ
クレオチド合成方法により特徴付けられる。本発明の最
も好ましい高分子支持体系は軽度に酸性或いは塩基性の
条件及び試薬に耐えることができるものである。その結
果、本発明の最も好ましいプライマーは従来公知の高分
子支持体系よりもはるかに多くの汎用性を与えるもので
ある。本発明の高分子支持体系は又DNA及びRNAの両者を
合成するために使用される条件及び試薬のタイプにおい
て大きな柔軟性を許容するものである。
【００１１】本発明の系は現在利用可能なオリゴヌクレ
オチド合成方法により3'或いは5'方法のいずれにおいて
も鎖伸長を可能にし、又、オリゴヌクレオチドを高分子
支持体から放出前に完全に脱保護することを可能にし、
或いはオリゴヌクレオチドを全ての保護基が除去される
前に高分子支持体から放出されることを可能にする。加
えて、この独特な高分子支持体系はDNA或いはRNAのいず
れを合成することを目的とするかに応じて異なる8つの
開始支持体を合成する必要性を除去する万能プライマー
を特徴とするものである。目的オリゴヌクレオチドの切
断は実質的に定量的な結果をもって達成することができ
る。
【００１２】本発明の高分子支持体系は高分子支持体及
び該高分子支持体に共有結合したプライマーよりなる高
分子支持体系においてプライマーが選択的酸化即ちプラ
イマー或いはオリゴヌクレオチドのその他の如何なる結
合も酸化することなくプライマーの１以上の酸化可能な
置換基を酸化することにより切断されることを特徴とす
るものである。この選択的酸化はプライマーを直接に切
断するか、或いはプライマーの間接的な切断を行うもの
である。直接切断においては有効な酸化剤自体がオリゴ
マーを支持体から放出するプライマー骨格の切断を引き
おこす。間接的切断においては、有効な酸化剤が結合オ
リゴヌクレオチドのホスフェートに隣接する電子引き抜
き中心を活性化させ、それは更に有効な塩基で処理され
た際に加水分解或いは脱離を起こし、目的オリゴヌクレ
オチドの放出が生ずる。
【００１３】本発明に従えば、各種酸化可能な置換基を
使用することができる。好ましい実施態様においては、
互に隣接した或いはホスフェート電子引き抜き基の近傍
に位置した酸化可能な基の対を有するプライマーの部分
が本発明の酸化性置換基よりなるものである。酸化性基
の対は、又より好ましい実施態様においては、酸化性基
がホスフェートに対してγ位である線状或いは環状プラ
イマーにおけるアルケニル結合であってもよい。最も好
ましい実施態様においては、酸化可能な置換基は未保護
cis-ヒドロキシル基を有するリボースである。
【００１４】本発明のオリゴヌクレオチド合成方法は、
(a)ある高分子支持体の選択、(b)プライマーの一部が１
以上の酸化性置換基を有するプライマーの工程(a)の高
分子支持体への結合、(c)工程(b)の酸化性置換基の保護
基による保護、(d)高分子支持体上の反応性基の保護基
による保護、(e)ヌクレオチドをプライマー上に縮合さ
せてオリゴヌクレオチドを構成すること、(f)オリゴヌ
クレオチドの合成完結後酸化性置換基の脱保護、(g)工
程(f)の酸化性置換基の有効な酸化剤による選択的酸
化、(h)工程(g)と同時に或いは引き続き有効な塩基によ
るオリゴヌクレオチドの処理、及び(i)オリゴヌクレオ
チドの回収、を含んでなるものである。
【００１５】本発明の最も好ましい支持体系上に構成さ
れるオリゴヌクレオチドは軽度の塩基性或いは軽度の酸
性条件下においては高分子支持体から放出されないこと
は有意義である。その代りに合成されたオリゴヌクレオ
チドは酸化性置換基が先ず脱保護され、次いで同時又は
引き続きの有効な塩基による処理を伴う有効な酸化剤に
より選択的に酸化された場合にのみ高分子支持体から放
出される。この様に、本発明の高分子支持体は大きな汎
用性を与える。合成オリゴヌクレオチドは有効な酸化剤
が使用される際にのみ放出されるので各種ヌクレオチド
官能基を保護するために使用される酸及び塩基不安定性
キャッピング（保護）基はオリゴヌクレオチドが高分子
支持体系から放出される前或いは後に除去することがで
きる。又、オリゴヌクレオチド合成の際に、オリゴヌク
レオチドを支持体から放出することなく軽度に酸性或い
は軽度に塩基性の条件或いは試薬を使用することができ
る。
【００１６】高分子支持体系が酸性或いは塩基性のいず
れかの条件に不安定であるが、なお有意義な有用性を有
する本発明のその他の態様がある。オリゴヌクレオチド
を支持体から切断する前に保護基を除去する必要がない
状況においては、支持体系の酸及び塩基条件に対する安
定性は必須要件でないことがあり得る。例えば、酸化性
プライマーと共に用いられるシリカ支持体は有用である
が、しかし塩基性条件には安定ではない。
【００１７】本発明の有効な酸化剤としては各種のおだ
やかな酸化剤を使用することができる。これらの酸化剤
は目的切断部位と反応性でなければならないがオリゴマ
ー上に反応性基を含ませないようにおだやかなものでな
ければならない。好ましい実施態様において、過ヨウ素
酸塩、過マンガン酸塩、重クロム酸塩、二酸化マンガン
或いは四酢酸鉛が本発明の有効な酸化剤を構成するもの
である。本発明の最も好ましい実施態様においては有効
な酸化剤は過ヨウ素酸塩である。
【００１８】本発明の有効な塩基は２つの代替的な機能
の一方を行うものである。プライマーの間接的切断のた
めには有効な塩基はプライマーの加水分解或いはオリゴ
マーの第１ヌクレオチドの電子引き抜きホスフェートの
除去を行うために選択的酸化と同時に或いは引き続いて
使用され、よって重合体支持体系からオリゴマーを放出
する。アニリン、ピペリジン、ピリジン、モルホリン、
トリエチルアミン、水酸化アンモニウム或いは水酸化ナ
トリウムなどの塩基が本発明の有効な塩基として使用さ
れる。好ましい実施態様においては、アニリン、メチル
アミン、エチルアミン及びアンモニアなどのアルデヒド
とシッフ塩基を形成する塩基が本発明の間接切断のため
の有効な塩基を構成する。最も好ましい実施態様におい
ては、アニリン或いは水酸化アンモニウムが本発明の間
接切断のための有効な塩基である。
【００１９】直接切断のためには、酸化性置換基の選択
的酸化のみがプライマーの切断を引きおこす。しかしな
がら、多くの直接切断において、プライマーの部分はオ
リゴヌクレオチドが高分子支持体から放出された後にも
オリゴヌクレオチドに付着して残る。これらの場合に
は、有効な塩基を使用してプライマーの残存部分を放出
オリゴヌクレオチドから除去することが出来る。これら
のプライマーの残存部分を放出オリゴヌクレオチドから
除去するためには幾つかのおだやかな塩基を使用するこ
とができる。好ましい実施態様においては、稀水酸化ナ
トリウム、稀水酸化アンモニウム或いはピペリジンがこ
れらのプライマーの残存部分を放出オリゴヌクレオチド
から除去するために有効に使用される。最も好ましい実
施態様においては、ピペリジンが放出オリゴヌクレオチ
ドから残存プライマー部分を除去するために使用される
有効な塩基である。
【００２０】本発明の高分子支持体系はオリゴヌクレオ
チドハイブリッド形成アフィニティ系として特別の有用
性を有する。オリゴヌクレオチド上の保護基の除去後、
合成オリゴヌクレオチドは相補的ポリ核酸とハイブリッ
ド形成される。最も好ましい実施態様において、ハイブ
リッド形成されたDNA或いはRNAは溶出して定量的に回収
するのが便利である。或いは又、二重鎖を本発明の酸化
的切断操作に従って回収することができる。オリゴヌク
レオチド及びプライマーの酸化性置換基上の保護基が先
ず除去され、合成されたオリゴヌクレオチドを次いで相
補的核酸とハイブリッド形成させる。プライマーの酸化
的切断に引き続き、おだやかな塩基で処理することによ
り二重鎖を高分子支持体から放出させる。
【００２１】加えて、その様なオリゴヌクレオチドハイ
ブリッド形成アフィニティ系を固定化された相補的ポリ
核酸の検出のために便利に使用することができる。一度
固定化されると、相補的ポリ核酸は検出方法の認識部位
が相補的ポリ核酸の支持体への固定化に含まれるものか
ら区別される限り各種方法を用いて検出することが可能
である。その様な検出方法としては比色法、蛍光法、リ
ン光法、放射性標識ベースの方法、その他の任意の便利
に使用され十分に感度の高い方法が挙げられる。
【００２２】本発明のその他の面及び利点は以下の本発
明の原理を例示する現在好ましい実施態様の詳細な説明
から明らかとなるであろう。
【００２３】
【好ましい実施態様の具体的な説明】本発明は、オリゴ
ヌクレオチド類の便利で汎用的な合成を可能にする独特
の高分子支持体系を提供する。本発明の高分子支持体系
は高分子支持体と１以上の酸化性置換基を有するプライ
マーとを含んでなるものである。これらの酸化性置換基
の選択的酸化によりプライマーの直接切断が生ずるか、
或いは又高分子支持体から合成されたオリゴヌクレオチ
ドの放出を生ずるプライマーの間接切断を可能にする。
【００２４】この高分子支持体系の発見は特別な意義を
有する。本発明の高分子支持体系は、更に精製を殆んど
必要としないオリゴヌクレオチド類の合成を可能にす
る。加えて、この高分子支持体系は支持体上に合成され
たオリゴヌクレオチドに相補的な領域を有するオリゴヌ
クレオチド類或いはポリ核酸のいずれかの固定化を容易
に行うために使用することができる。この様にして固定
化されたオリゴヌクレオチド或いはポリ核酸は各種の特
別の検出方法を用いて検出されるか或いは更に研究する
ために回収することができる。本発明の多くの応用は当
業者には明らかであろう。
【００２５】広範囲の高分子支持体を本発明の高分子支
持体として使用することができる。好ましい高分子支持
体としては、ポリスチレン類、架橋ポリスチレン類、架
橋ポリアミノ酸類、ポリエチレングリコール、酢酸ビニ
ルとＮ−ビニルピロリドンとのコポリマー、並びにその
他のポリオレフィン類、ポリエステル類、ポリアミド
類、ポリアクリレート類、ポリメタクリレート類、金属
酸化物、クレー、各種ガラス類及びこれらの支持体のい
ずれかの組み合わせを使用するグラフト化物などが挙げ
られる。
【００２６】本発明の高分子支持体は、可溶性或いは不
溶性のいずれであってもよいが、好ましくは不溶性のも
のがよい。更に、それらは使用される反応性条件下にお
いて安定であり、プライマーの支持体への共有結合を行
うために必要な反応性基をそれらの表面に有する。多く
の支持体は本明細書中に開示される発明を実施する目的
のために満足できるものであるが、重量に比例して多く
の結合部位よりなる大表面積を有する高分子重合体が最
も好ましい。
【００２７】高分子の表面上の反応性基はプライマーが
高分子支持体に共有的に結合することを可能にする。そ
の様な目的のために、通常使用される反応性基はヒドロ
キシル基、カルボキシル基、及びアミノ基である。例え
ば、高分子支持体に末端カルボキシル官能基を付与する
とそれは次いでプライマーのヒドロキシル基或いはアミ
ノ基と反応する。或いは又、高分子支持体にアミノ基或
いはヒドロキシル基を付与すると、それは次いでプライ
マーのカルボキシル基と反応する。例えば、カルボキシ
レート官能基を含有する基はジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）などの適当な、縮合剤の存在下におい
て固体支持体上のアミノ基に結合させることができる。
一級或いはアリールアミンを含有するプライマーはアミ
ンとカルボキシレート官能基との縮合により支持体に共
有結合され、アミドを形成する。同様にして、酸ハロゲ
ン化物をアミン含有プライマーと反応させてアミドを形
成することができる。或いは又、プライマーは酸ハロゲ
ン化物を有し、支持体がアミン官能基を含有することも
可能である。
【００２８】プライマーの支持体への結合方法は数多く
存在する。例えば、グリニヤール(Grignard)縮合、エー
テル結合形成、フリーデル−クラフト(Freidel-Craft)
アルキル化、二級アミン形成、水銀塩及びオレフイン縮
合などがある。しかしながら、同業者は特別の合成のた
めの適当な高分子支持体並びにプライマーの高分子支持
体への適当な結合手段を容易に決定することが可能であ
る［Ｐ．ホッジ及びＤ．Ｃ．シエリングトン(P.Hodge a
nd D.C.Sherrington)、「有機合成における高分子支持
反応(Polymer Supported Reactions in Organic Synthe
sis)」、John Wiley & Sons, New York, 1980］。
【００２９】プライマーの結合された支持体系をオリゴ
ヌクレオチド合成のために使用する前に、支持体及びプ
ライマーの両者の反応基をオリゴヌクレオチドの収率を
減少させる副反応を防止するために保護されなければな
らない。プライマーの場合には、これは反応性アミンを
アミドに転換し、アルコールを連鎖開始に参加する場合
を除いて、エステル化することにより最も容易に達成さ
れる。これらの反応はいずれも酸無水物（例えばピリジ
ン中の無水酢酸）並びに酸塩化物及びその他のアシル化
剤を用いて生ずる。支持体上の反応性基の保護は用いら
れる支持体の種類に応じて異なる。保護される反応性基
は当業者には明らかであろう［Ｃ．Ｂ．リース(C.B.Ree
se)、「テトラヒドロン(Tetrahedron)」34 : 3143-3179
(1978年)及びT.W.グリーン(T.W.Greene)、「有機合成
における保護基(Protective Groups in Organic Synthe
sis)」、John Wiley & Sons, New York, 1981年］。
【００３０】本発明のプライマーは多くの別々の形態に
おいて実施され得る。これらの別々の実施態様の全て
は、しかしながら、一つの共通の特徴を有する。各実施
態様において、プライマーは１個以上の酸化性置換基を
有する。これらの置換基をプライマー或いはオリゴヌク
レオチドの他の如何なる結合も破裂することなく選択的
に酸化することにより目的オリゴヌクレオチドを高分子
支持体から直接或いは間接に放出させる。１個以上の酸
化性置換基を利用することにより、本発明は従来技術の
現状における九つの異った開始点を有する支持体を作成
する必要性を無くすものである。
【００３１】本発明の好ましい酸化性置換基はヒドロキ
シル基、アルケニル基、一級アミン基、及び二級アミン
基である。好ましい実施態様に対応する図１、図２、図
４、図５及び図６は特別の結合部位において、いずれの
酸化性基が好ましいものであるかを示している。しかし
ながら、これらの図面は単に本発明に従った各種プライ
マー構造を図解することを目的とするにすぎない。当業
者は図示された構造特に環状構造は本発明の趣旨及び範
囲から離れることなく、いくつかの異った実施態様を有
するように柔軟性のあるものであることを理解するであ
ろう。
【００３２】現在、最も好ましい実施態様において酸化
性置換基はリボヌクレオシドである。リボヌクレオシド
は高分子支持体にその塩基を介して結合されている。合
成されるべきオリゴヌクレオチドの最初のヌクレオチド
は、リボヌクレオシドに縮合され、リボヌクレオシドの
５’位及び第１のヌクレオチドの３’位の間のホスフェ
ートブリッジによりリボヌクレオシドに結合される。
【００３３】合成オリゴヌクレオチドの高分子支持体か
らの酸化的切断を容易に行うためにプライマーの酸化性
置換基の保護及び脱保護を行う必要のない本発明のその
他の好ましい実施態様が存在する。図３及び図７は酸化
性置換基がアルケニル基である本発明のそれらの実施態
様を例示するものである。本発明のこの酸化剤はアルケ
ニル結合の部位においてプライマー分子を切断する。即
ち、これらの実施態様においては、オリゴヌクレオチド
合成工程中に副反応を生ずる酸化性置換基が存在しない
ので、本発明のオリゴヌクレオチド合成方法の工程
（ｃ）及び（ｆ）を行う必要がない。ここでも又、当業
者は図３及び図７はそれ自体柔軟性のあるものであり、
本発明の好ましい実施態様を例示することを目的とする
ものであることを了解するであろう。
【００３４】この独特な支持体系のプライマーは３’或
いは５’のいずれかの方向の鎖伸長を可能にし、あらゆ
る目的オリゴヌクレオチドの合成に適したものである。
合成はホスフアイト及びホスホトリエステル法を含む多
くの手法により行うことができる。例えば、オリゴヌク
レオチド類は、Ｍ．Ｄ．マテウッチ(M.D.Matteucci)及
びＭ．Ｈ．カルザス(M.H.Caruthers)、「高分子支持体
上におけるデオキシオリゴヌクレオチド類の合成(Synth
esis of Deoxyoligonucleotides on a PolymerSuppor
t)」Journal of the American Chemical Society, Vol.
03, No.11, 1981年)及びＭ．Ｊ．ガイト等(M.J.Gait
et al.)、「オリゴデオキシリボヌクレオチド類の迅速
合成ＩＶ．ホスホトリエステル中間体を介してのオリゴ
デオキシリボヌクレオチド類の改良された固相合成(Rap
id Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides IV. Impr
oved Solid Phase Synthesis of Oligodeoxyribonucleo
tides through Phosphotriester Intermediates)」(Nuc
leic Acids Research, Vol.8, No.5, 1980年)などに記
載される応応に従って合成することができる。
【００３５】本発明のプライマーはそれらの構造におい
て線状或いは環状のいずれかであり得る。更に、これら
のプライマーは直接或いは間接のいずれかの方法におい
て切断される。直接切断においては酸化は合成オリゴヌ
クレオチドが一つの化学反応において支持体から放出さ
れるようにプライマーを切断するのに役立つ。しかしな
がら、場合に応じてプライマーの一部がオリゴヌクレオ
チドに結合して残ることがある。この時点において、オ
リゴヌクレオチドを有効な塩基で処理することにより残
存プライマー部分をオリゴヌクレオチドから除去するこ
とができる。間接切断においては、有効な塩基による処
理と組み合わされた酸化が合成オリゴヌクレオチドの支
持体からの除去を行う。
【００３６】本発明の好ましい実施態様においては、環
状プライマーは形成されたオリゴヌクレチドのホスフエ
ートに隣接した１個以上の酸化性基を含有する。酸化後
適当な塩基を用いての処理によりオリゴマーを支持体か
ら除去する。図１、図２及び図３は、本発明のこの実施
態様を例示するものである。
【００３７】本発明のもう一つの好ましい実施態様にお
いては、環状プライマーは支持体との結合点に位置する
酸化性基を含有する。この場合において、酸化はオリゴ
マー及びプライマーの一部を支持体から切断する。適当
な塩基による処理により、プライマーの残存部分をオリ
ゴマーから除去することができる。図４は、本発明のこ
の実施態様を例示するものである。
【００３８】図３の実施態様においては、線状プライマ
ーは合成オリゴマーのホスフエートに隣接した単一の酸
化性基を含有する。酸化と同時或いは酸化に引き続き適
当な塩基で処理するとオリゴマーが支持体から切断され
る。図５は、本発明のこの実施態様を例示するものであ
る。
【００３９】本発明の第４の実施態様においては、線状
プライマーは２個以上の隣接した酸化性基を含有するこ
とができる。酸化時に、この配列はオリゴマーの支持体
からの直接の切断を可能にする。図６及び図７は、この
実施態様を例示するものである。ここでも又、適当な塩
基を用いてプライマーの残存部分をオリゴマーから切断
することができる。
【００４０】任意の特別のプライマーに関して酸化性官
能基とオリゴヌクレオチド合成の開始部位の間には、幾
つかの位置的関係が存在するが、高分子支持体からの切
断に引き続く合成オリゴヌクレオチドからのプライマー
部分の除去のためにはホスフエートに対してγ位の酸化
性官能基の配置が好ましい。当業者は本発明のオリゴヌ
クレオチド合成法が、酸化性官能基がホスフエートに対
してγ位以外の位置にある場合にもなお有効であること
を理解するだろう。しかしながら、本発明の好ましい態
様は目的オリゴヌクレオチドのより便利な合成を可能に
するものである。
【００４１】酸化性置換基上の保護基の除去は合成され
たオリゴヌクレオチドの高分子支持体からの切断前に必
要な場合がある。図１、図２、図４、図５及び図６は本
発明のこの実施態様を例示するものである。脱保護は当
業者に公知の方法により達成される。Ｔ．Ｗ．グリーン
(T.W.Greene)、「有機合成における保護基(Protective
Groups in Organic Synthesis)」(John Wiley & Sons,
New York, 1981年)。
【００４２】合成されたオリゴヌクレオチドは、プライ
マーの酸化性置換基の選択的酸化により高分子支持体か
ら直接或いは間接に放出される。この切断の結果、実質
的に定量的なオリゴヌクレオチドの収率が得られる。直
接切断のためには、選択的酸化はオリゴヌクレオチドを
有効な酸化剤で処理することよりなる。オリゴヌクレオ
チドにその高分子支持体からの放出後、プライマーの一
部が結合して残る場合には、これらの残存部分は有効な
塩基で処理することにより除去することができる。直接
切断においては、酸化から生ずるカルボニル基が合成さ
れたオリゴマーのホスフエート基に対してγ位にあるの
が好ましい。この実施態様は塩基の適用がプライマーの
残存部分を合成されたオリゴヌクレオチドから切断する
のに有効であるのを確実にする。その他、有効な塩基に
よる処理が残存プライマーのオリゴマーからの完全な除
去を行わない本発明の実施態様がある。しかしながら、
当業者はこれらのプライマーの残存部分は多くの場合残
存プライマー部分の特別の化学に応じて代替法により除
去することが可能であることを理解するであろう［Ｔ．
Ｗ．グリーン(T.W.Greene)、「有機合成における保護基
(Protective Groupsin Organic Synthesis)」、John Wi
ley & sons New York, 1981年］。間接切断のために
は、選択的酸化は有効な塩基による同時又は引き続きの
処理を伴う有効な酸化剤によるオリゴヌクレオチドの処
理を含んでなるものである。
【００４３】直接切断及び間接切断の両者のための有効
な酸化剤は目的切断部位を選択するがオリゴマー上のそ
の他の反応基は選択しない温和な酸化剤によりなるもの
である。現在好ましい実施態様においては、有効な酸化
剤は過ヨウ素酸塩、過マンガン酸塩、重クロム酸塩、二
酸化マンガン及び四酢酸鉛よりなる群から選ばれる。最
も好ましくは過ヨウ素酸塩が有効な酸化剤である。
【００４４】間接切断については、有効な塩基は有効な
酸化剤と共働してプライマーを切断する。間接切断のた
めの有効な塩基はピペリジン、ピリジン、モルホリン、
水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム及びアルデヒド
類とシッフ(Schiff)塩基を形成する塩基などの塩基を含
んでなる。好ましくは、間接切断に有効な塩基は例えば
アニリン、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピル
アミン、及びアンモニアなどのアルデヒド類とシッフ(S
chiff)塩基を形成する塩基である。最も好ましくは、間
接切断の有効な塩基はアニリン、水酸化アンモニウム、
或いはｎ−プロピルアミンである。
【００４５】直接切断について、放出されたオリゴヌク
レオチドに結合して残存する任意のプライマーの部分を
除去するために使用される有効な塩基は温和な塩基を含
んでなるものである。好ましい実施態様において直接切
断の有効な塩基は稀水酸化ナトリウム、水酸化アンモニ
ウム、ピペリジン或いはｎ−プロピルアミンである。最
も好ましくは、直接切断について使用される有効な塩基
はピペリジンである。本発明の最も好ましい実施態様に
おいてはプライマーの酸化性置換基はリボヌクレオシド
であり、合成されるオリゴヌクレオチドの第１ヌクレオ
チドはリボヌクレオシドの５’を介して結合している。
図１（ａ）は本発明のこの実施態様を図解する反応式で
ある。Ｒ1及びＲ2＝ＯＨ，及びＲ3及びＲ4＝Ｈの場合に
はＲ1及びＲ2は図１（ａ）のリボース環の２’及び３’
ヒドロキシル基に対応する。
【００４６】オリゴヌクレオチド合成の際にリボヌクレ
オシドの２’及び３’ヒドロキシル基を脱保護すること
により高分子支持体から切断される。このオリゴヌクレ
オチドは次いでプライマーを間接的に切断する選択的酸
化により高分子支持体から放出される。有効な酸化剤は
過ヨウ素酸塩であり、有効な塩基はアニリン、水酸化ア
ンモニウム或いはｎ−プロピルアミンである。或いは
又、オリゴヌクレオチドを先ず過ヨウ素酸塩で処理し、
次いでアニリン、水酸化アンモニウム、或いはｎ−プロ
ピルアミンで処理するか或いはオリゴヌクレオチドを同
時に過ヨウ素酸塩及びアニリンで処理することができ
る。合成されたオリゴヌクレオチドを次いで標準的技術
を用いて回収する。
【００４７】オリゴマー上の保護基の除去は合成された
オリゴヌクレオチドの支持体からの酸化切断の前或いは
後のいずれにおいても行うことができる。切断前に保護
基を除去したい場合には、水酸化ナトリウム或いは水酸
化アンモニウムを用いて塩基上の保護基を除去すること
ができる。メチル或いはトリクロロメチルがリン上の保
護基である場合には、脱保護のための好ましい試薬は水
酸化アンモニウム、或いはチオフエノキシドである。ト
リブチルホスフィンがリン上の保護基としての2,2,2-ト
リクロロ-1,1-ジメチルエチルの除去のための好ましい
試薬である。O-クロロフェノール及びp-クロロフェノー
ルがリン上の保護基である場合には、ベンジルオキシメ
ート及びピリジンアルドキシメートなどのオキシメート
類をＭ．Ｊ．ガイト等（M.J.Gait et al.）、「オリゴ
デオキシリボヌクレオチド類の迅速合成ＩＶ．ホスホト
リエステル中間体を介してのオリゴデオキシリボヌクレ
オチド類の改良された固相合成(Rapid Synthesis of Ol
igodeoxyribonucleotidesIV. Improved Solid Phase Sy
nthesis of Oligodeoxyribonucleotides throughPhosph
otriester Intermediates)」(Nucleic Acids Research,
Vol.8, No.5, 1980年)に説明される方法に従って、好
ましい脱保護剤として使用することができる。 合成さ
れたオリゴマーの高分子支持体からの切断をオリゴマー
上の保護基の除去の前に行うのが望ましい場合が存在す
る。保護基はＴ．Ｗ．グリーン(T.W.Greene)、「有機合
成における保護基(Protective Groups in Organic Synt
hesis)」(John Wiley & sons, New York, 1981年)に記
載される方法に従って除去することができる。本発明の
この面は、プライマーが酸化的切断のための予備的脱保
護を必要としない場合、或いは保護基が極めて温和な条
件で除去することのできる場合において有用性を有する
ものである。
【００４８】本発明の高分子支持体及びオリゴヌクレオ
チド合成方法は、オリゴヌクレオチドハイブリッド形成
技術を容易にすることにおいて特別の有用性を有するも
のである。本発明の支持体は、合成されたオリゴヌクレ
オチドの脱保護（工程ｆ）後に、それが相補的なポリ核
酸とハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドハイブ
リッド形成アフィニティ系として、使用することができ
る。
【００４９】或る場合において、合成されたオリゴヌク
レオチドにハイブリッド形成された相補的なポリ核酸を
回収することが望ましい場合がある。本発明の最も好ま
しい実施態様においては、相補的ハイブリッド形成され
たDNA或いはRNAは溶出して便利に且つ定量的に回収され
る。もう一つの好ましい実施態様は、本発明の方法に従
って、プライマーの高分子支持体からの酸化的切断によ
り全二重鎖の定量回収を可能にする。この実施態様にお
いて、合成されたオリゴヌクレオチド上及びプライマー
の酸化性置換基上の保護基はハイブリッド形成前に除去
される。一度ハイブリッド形成が達成されると、プライ
マーの酸化性置換基の有効な酸化剤による処理後温和な
塩基による処理により二重鎖の高分子支持体からの放出
が行われる。当業者は本発明において説明される技術を
用いてハイブリッド形成された生成物が回収されること
の便利さを了承するであろう。
【００５０】その他の場合において、ハイブリッド合成
された相補的ポリ核酸の存在をそれを支持体から実際に
除去することなく単に検出することが望まれる場合があ
る。この場合においては、幾つかの検出方法が可能であ
り、それらの全ては公知のものである。その様な検出方
法の一つは既にハイブリッド形成されたポリ核酸の部分
に相補的なハイブリッド形成プローブを用いるものであ
る。このハイブリッド形成プローブは定義によりオリゴ
ヌクレオチド或いはポリ核酸である。もし、相補的ポリ
核酸が実際に合成されたオリゴヌクレオチドにハイブリ
ッド形成する場合には、このハイブリッド形成プローブ
は、支持体上のポリ核酸にハイブリッド形成する。この
ハイブリッド形成プローブは、既にハイブリッド形成さ
れたポリ核酸上の２回目のハイブリッド形成後のその存
在が検出されるように何等かの方法により標識される。
標識技術としては通常放射性標識、蛍光性標識、蛋白質
仲介検出系との相互作用のための環境支持基、発色及び
発光などが含まれる。蛋白質仲介検出系はまた直接に使
用することもできる。当業者は、ハイブリッド形成プロ
ーブが第２回目のハイブリッド形成後に観察されるため
に標識されるその他の方法或いはハイブリッド形成され
た相補的ポリ核酸が例えば特異性抗体を用いる検出など
により検出される方法を了解するであろう。
【００５１】本発明を以下の実施例により、例示するが
これらは本発明を限定するものではない。
【００５２】
【実施例】
（実施例１） メタクリレートポリマーに結合した３デノシン−Ｎ6−
ドデシルアミンの合成 ５−ジメトキシトリチル−６−クロロプリンリボシド
（Ｉ） 無水ピリジン(１ml)中の６−クロロプリンリボシド(287
mg)及びジメトキシトリチルクロライド(350mg)を室温に
保った。1.5時間後、シリカ上のTLC分析によりチェック
されたアリコートは反応が95％よりも良好に完結したこ
とを示した。反応液を次いで氷−Nacl上に注ぎCH2Cl2で
抽出した。有機層を繰り返しNacl水溶液で洗浄し、次い
でNa2SO4上で乾燥し、真空留去した。残存泡状物を最終
的にベンゼンに溶解し、凍結乾燥した。
【００５３】〈５’−ジメトキシトリチル−Ｎ6−［12
−アミノドデシルアミン］−アデノシン(II)〉無水トル
エン(14ml)中の(I)及び1,12-ジアミノドデカン(2g)の混
合物を100℃で20分間保ち、その後激しく攪拌しながら
ヘキサン(150ml)に適加した。ヘキサン中で生じた沈澱
を遠心分離により集めた後CH2Cl2に溶解し、有機溶液を
手短かにKOH水溶液(0.05M)で抽出した。有機層をNa2SO4
上で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。引き続き固体残
渣を温かいトルエンに溶解した。少量の不溶性物質を除
去後溶解物質を過剰ヘキサンの適加により沈澱させた。
形成した白色沈澱を遠心分離により集め、ヘキサンで洗
浄し、真空乾燥した。収量は微細粉末として524mgであ
った。
【００５４】支持体への結合 Amberlite CG50(100〜200湿潤メッシュ)を0.1M HCl水溶
液で十分に洗浄後、30％水性メタノール中の0.15M HCl
で洗浄し、次いでメタノール、アセトン、クロロホルム
及びエーテルで洗浄した。得られた粉末をP2O5上で真空
乾燥した。
【００５５】ジメチルホルムアミド(DMF)(5ml)中の予備
処理されたアンバーライト(1g)及びカルボニルジイミダ
ゾール(660mg)の混合物を、室温で４時間振盪した。こ
の活性化されたアンバーライトをDMFで洗浄して過剰の
カルボニルジイミダゾールを除去してから、それをDMF
(6ml)及びトリエチルアミン(0.5ml)中の(II)の溶液中に
懸濁させた。混合物を次いで攪拌しながら80℃に１時間
加熱させた。未反応カルボキシル基は、それらをDMF(3.
5ml)中のカルボニルジミダゾール及びジメチルアミンで
活性化させることにより保護し、次いで室温で１時間振
盪した。樹脂を炉別し、次いでアセトン、エーテルで洗
浄した。乾燥粉末を無水酢酸(4ml)及び無水ピリジン(10
ml)の混合物に懸濁させた。24時間後樹脂を炉別し、注
意深くアセトンで洗浄した後、エーテルで洗浄し乾燥さ
せた。
【００５６】ジメトキシトリチル放出は、プライマー密
度がg当り50〜100マイクロ当量であることを示した。
【００５７】（実施例２） スチレン−ジビニルベンゼンポリマーに結合したウリジ
ンの合成 〈ウリジン−スチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂
の調製〉ヌクレオシド５−（３−アミノ−プロペニル）
−ウリジンをルース等(Ruth etal.) J.Org. Chem. 43:2
870 (1978年) により記載された方法に従って合成し、
1:1 メタノール／ジオキサン(200ml)中に溶解した。3.6
gのクロロメチルスチレンビーズ(BIOBEADS XS-1、1.25
ミリモルの塩素／ビーズのg)を添加した後、回転シエー
カー内において200rpmで65℃において30分間攪拌した。
支持体を次いで濾過し、逐次テトラヒドロフラン、水、
メタノール及びテトラヒドロフランで洗浄してから高真
空下に１時間乾燥させた。次いで、テトラヒドロフラン
(40ml)及びトリエチルアミン(15ml)を添加後200rpmで50
℃において１時間攪拌させた。次いで、支持体を濾過
し、逐次水、メタノール、クロロホルム及びエーテルで
洗浄し、室温において高真空下に８〜18時間乾燥した。
【００５８】ピリジン中の10％無水酢酸(1:9、20ml／樹
脂のg)及びジメチルアミノピリジン(2mg／樹脂のg)を乾
燥樹脂に添加した後40℃で１時間攪拌した。冷却後液相
を傾瀉分離し、樹脂を逐次ピリジンクロロホルム及びメ
タノールで洗浄してから８〜18時間凍結乾燥させた。次
いで濃水酸化アンモニウム中のピリジン(1:1、200ml／
樹脂のg)を37℃で４時間攪拌させながら添加した。減圧
下に蒸発乾固させて少量のピリジンを添加し、樹脂をも
う一度蒸発乾固させた。樹脂のg当り15mlの樹脂を、次
いで樹脂のg当り80mgのジメトキシトリチルクロライド
と共に添加し、混合物を70℃で３時間攪拌した。樹脂を
次いで濾過し、逐次クロロホルム、メタノール、エーテ
ルで洗浄し、手短かに真空乾燥した。ピリジン中の10％
無水酢酸(10ml／樹脂のg)を次いで添加し、37℃で８〜1
8時間攪拌した。最後に樹脂を濾過し逐次ピリジン、ク
ロロホルム及びエーテルで洗浄し、室温で８〜18時間真
空乾燥した。
【００５９】ジメトキシトリチル放出はプライマー密度
が10〜50μ当量／gであることを示した。
【００６０】（実施例３） ポリアクリルモルホライド上のアデノシン−Ｎ6−ドデ
シルアミンの合成 12.5mlの新たに蒸留されたグリコール中のポリアクリル
モルホライド樹脂(Vega Biochemicals-カタログ番号 N
o.18964)(1.95g)及び1,12-ジアミノドデカン(2g)の混合
物を窒素下において180℃で攪拌しながら20時間加熱し
た。樹脂を遠心分離により集め、次いで順次メタノー
ル、10％酢酸−メタノール(1:1)、メタノール−トリエ
チルアミン、メタノール及び最後にエーテルで十分に洗
浄した。樹脂を真空乾燥して1.61gの黄色微粉末を得
た。ホウ酸緩衝液(pH9.7)中でピクリルスルホネートで
試験されたアリコートは強い橙色に変色し、モルホリン
のジアミンによる良好な置換を示した。
【００６１】上記樹脂(860mg)、5'−ジメトキシトリチ
ル−6−クロロプリンリボシド(470mg)、無水トルエン(5
ml)及びトリエチルアミン(300μl)を60〜70℃で攪拌し
ながら20時間加熱した。樹脂を遠心分離で集めた後順次
トルエン、メタノール−トリエチルアミン、メタノール
及びエーテルで洗浄した。樹脂を真空乾燥後それをピリ
ジン(6ml)及び無水酢酸(1.5ml)中に懸濁し、8〜18時間
振盪した。樹脂を次いでピリジン、ピリジン−水、メタ
ノール、アセトン及びエーテルで洗浄した。
【００６２】クロロホルム中の2.6％トリクロロ酢酸を
用いたジメトキシトリチル除去の定量はプライマー密度
が20μ当量／gであることを示した。
【００６３】（実施例４） オリゴマーの支持体からの酸化除去 オリゴマーが標準的技術を利用して一度プライマー−支
持体系上に合成されると、それらは過ヨウ素酸塩及び水
酸化アンモニウム、或いは過ヨウ素酸塩及びアニリンの
いずれかの組み合わせを用いて、容易に除去することが
できる。メチル基がホスフエート保護基として使用され
る場合には、支持体結合オリゴマー−プライマーは先ず
濃水酸化アンモニウム中において50℃で8〜18時間イン
キュベートされる。この操作はcis−ジオール上のもの
も含めて全ての保護基を除去する。支持体結合オリゴマ
ー−プライマーを水、アセトン、及びジクロロメタンな
どの適当な溶媒で洗浄した後、オリゴマーを0.05M 過ヨ
ウ素酸ナトリウム／0.05M酢酸ナトリウム(pH5.0〜7.3)
中におけるインキュベーション(30分〜数時間)により酸
化される。水で洗浄後、濃水酸化ナトリウムを添加し、
混合物を次いで室温で数時間インキュベートさせる。得
られたオリゴマーは濾過、及び水及び50％エタノールで
洗浄することにより汚染種がほぼ除去される。凍結乾燥
により水、水酸化アンモニウム及びエタノールを除去後
目的オリゴマーを更に標準的操作により精製する。
【００６４】或いはまた過ヨウ素酸ナトリウム／酢酸塩
中におけるインキュベーション後、オリゴマーをアニリ
ン(pH5.0)で数時間インキュベーション後除去すること
もできる。合成されたオリゴヌクレオチドの支持体から
の酸化除去はオリゴマー及び支持体上の反応性基の脱保
護前或いは後のいずれにおいても行うことができる。切
断操作の試験として、5'−ジメトキシトリチル−N−ベ
ンゾイル−2'−デオキシシチジンのモノマー単位を本発
明のポリメタクリレート支持体（実施例１）にカップリ
ングさせた。標準的なホスホモノクロロダイト化学
［Ｍ．Ｄ．マテウッチ(M.D.Mateucci)及びＭ．Ｈ．カル
ザース(M.H.Caruthers)、"Tetrahedron Letters" 21:71
9-722 (1980年)］を用いてアセトニトリル／4％ 2,6−
ルチジン中の活性化されたヌクレオシドの20mM溶液12ml
を533mgの支持体に添加した。酸化工程の完結後、支持
体を逐次アセトン、ジクロロメタン、水、アセトン、ジ
クロロメタン及びエーテルで洗浄後風乾した。
【００６５】モノマーを支持体から回収するために次の
操作に従った。先ずモノマーを濃水酸化アンモニウムで
50℃において8〜18時間処理した。水酸化アンモニウ
ム、アセトン及びジクロロメタンで洗浄後、窒素流下に
乾燥を行い次いで .05Mの酢酸ナトリウム及び .05M過
ヨウ素酸ナトリウム(10ml、pH7.2）を添加し、全混合物
を室温で24時間インキュベートした。水、アセトン、及
びジクロロメタンで洗浄後、窒素下に乾燥させ、濃水酸
化アンモニウム(10ml)を添加し、混合物をもう一度室温
で24時間インキュベートした。最後に水酸化アンモニウ
ムで洗浄後、モノマーを支持体から良好な収率で回収し
た。
【００６６】この特別な操作のためには定量のために使
用されたジメトキシトリチル基の損失を防ぐために過ヨ
ウ素酸塩酸化のために僅かに高められたpHが使用され
た。
【００６７】（実施例５） テフロン／コポリマーグラフトに結合された5'−ジメト
キシトリチル−2',3'ジアセチルアデノシンの合成 次の実施例は本発明の最も好ましい実施態様を表すもの
である。
【００６８】5'−ジメトキシトリチル−6−クロロプリ
ンリボシドを実施例１と同様にして調製した。5'−ジメ
トキシトリチル−6−クロロプリンリボシド(3.0g、5ミ
リモル)を次いでアセトニトリル(30ml)、N−エチルジイ
ソプロピルアミン(8ml)及びH2O(25ml)中の6.75g(52ミリ
モル)の6−アミノカプロン酸と反応させて5'−ジメトキ
シトリチルアデノシン−N6−カプロン酸塩を製造した。
この生成物をシリカカラム上のクロマトグラフィーによ
り精製し、2％トリエチルアミンを含有するクロロホル
ム中のメタノールの線状勾配(0〜20％)で溶出した。
【００６９】溶媒を留去後少量のピリジンから蒸発させ
た後、シロップ状5'−ジメトキシトリチルアデノシン−
N6−カプロン酸塩を無水ピリジン(50ml)中において、無
水酢酸(10ml)を用いて暗所において室温で24時間アセチ
ル化させた。生成物5'−ジメトキシトリチル−2',3'−
ジアセチルアデノシン−N6−カプロン酸トリエチルアミ
ン塩を反応液を氷上に注ぎ、有機相をジクロロメタンで
抽出し、ジクロロメタン相を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、次いで溶媒をローター蒸発させて単離した。残留シ
ロップを80mlのトルエンに溶解し、目的化合物を420ml
のヘキサンを添加して沈澱させた。濾過及び風乾後生成
物の収量は2.62g(2.4ミリモル)であった。 カプロン酸
部位における活性エステルを形成するために5'−ジメト
キシトリチル−2',3'−ジアセチルアデノシン−N6−カ
プロン酸トリエチルアミン塩(0.62g、0.56ミリモル)を
アセトニトリル(20ml)及び無水ピリジン(4ml)中の1.04g
(5ミリモル)のジシクロヘキシルカルボジイミド及び0.5
4g(4ミリモル)の1−ヒドロキシベンゾトリアゾールと20
℃で4時間反応させた。アルキルアミン基を8原子の長さ
で含有したテフロンウール／コポリマーグラフト化支持
体(9.18g)を添加し、混合物を20℃で19時間インキュベ
ートした。
【００７０】この支持体を未結合ヌクレオシド類を除去
するためにアセトニトリル、2％トリエチルアミンを含
有するメタノール、メタノール及びエーテルで洗浄し
た。支持体上の未反応アミン基を次いで50mlのピリジン
中の過剰の無水酢酸(5ml)及びN−エチルジイソプロピル
アミン(2ml)で振盪しながら、20℃で2時間保護した。ア
セトニトリル、メタノール及びエーテルで洗浄後支持体
のジメトキシトリチル含量は、プライマー密度がg当り
約30μ当量であることを示した。
【００７１】（実施例６） 5'−ジメトキシトリチル2',3'−ジアセチル−N6−カプ
ロン酸テフロン／コポリマーグラフト支持体(TEF I)を
用いた(dTp)15の合成 15チミジンの長さのオリゴマーをエフィモフ(Efimov)の
修正されたトリエステル化学［V.A.エフィモフ(V.A.Efi
mov)、Nuc. Acid Res. 10. 6675(1982年)］を用いてバ
イオサーチサム・ワン・DNA・シンセサイザ−(Biosearc
h Sam One DNASynthesizer)により0.105gのTEF I支持体
上に合成した。合成が完了後ホスフェート保護基を標準
的操作［Ｃ．Ｂ．リース(C.B.Reese)及びＹ．Ｔ．ヤン
クイ(Y.T.Yan Kui)、Chem.Comm. 802(1977年)］に従
ってアセトニトリル中のテトラメチルグアニジン及びピ
リジンアルドキシムを用いて除去した。塩基保護基を次
いで濃NH4OHを用いて55℃で5時間インキュベートさせて
除去した。これらの脱保護操作はアデノシン上の2'及び
3'保護基も除去した。
【００７２】支持体結合オリゴマーを次いで暗所におい
て20％のアセトニトリルを含有する0.02M Na2HPO4中の
0.05M NaIO4(pH=7.2)で処理した。H2Oにおいて洗浄後、
オリゴマーを1Mトリエチルアンモニウムバイカーボネー
ト中の5％n−プロピルアミン及び10％アセトニトリルの
混合物を用いて支持体から切断した(2〜3時間)。支持体
を濾過、及び水及びエタノールの混合物を洗浄後、オリ
ゴマー含有上澄液を少量のトリブチルアミンの存在下に
おいて蒸発乾固させた。
【００７３】0.025M酢酸アンモニウム、pH7.1中の3〜30
％のアセトニトリルの線状勾配で溶出した(60分に亘
り）Unimetrics RP-8カラムによるHPLC分析は5'−ジメ
トキシトリチル(dTp)15と一致するほぼ54分における主
たるピークを与えた。
【００７４】この物質の真正さをジメトキシトリチル基
を80％酢酸で除去し、オリゴマーを標準的操作により32
PATPでキナーゼ化し［R.A.ジョンソン(R.A.Johnson)及
びT.F.ウォルセット(T.F.Walset)、Adv.in Cyclic Nucl
eotide Res.,Volume 10. G.ブルッカー(G.Brooker)、P.
グリーンガード(P.Greengard)及びG.A.ロビソン(G.A.Ro
bison)編、Raven Press, New York, 1979年］、及び放
射線標識されたオリゴマーを20％ポリアクリルアミドゲ
ル上で標準的操作により電気泳動させる［Ｔ．マニアテ
イス(T.Maniatis, E.F.フリッツ(E.F.Fritsch)及びJ.サ
ンブルック(J.Sambrook)、Molecuar Cloning, Cold Spr
ing Harbor Laboratory 1982年］ことにより確認した。
オートラジオグラフィー後、オリゴマーは(dTp)15の移
動度を有する実質的な単一スポットであることを示し
た。
【００７５】（実施例７） テフロン／コポリマーグラフト支持体(TEF II)に結合し
たアデノシン−N6−ドデシルアミンの合成 その表面上にカルボキシル基を含有するテフロンウール
／コポリマーグラフトを使用した。15原子の長さである
支持体上のリンカー−アームカルボキシル部分を2.5gの
支持体をアセトニトリル(50ml)及びピリジン(10ml)の混
合物中の675mg(5ミリモル)の1−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール及び1.13g(5.4ミリモル)のジシクロヘキシル−
カルボジイミドでインキュベートすることにより活性化
させた。
【００７６】3時間インキュベート後実施例１において
調製した1.2gの5'−ジメトキシトリチルアデノシン−N6
−ドデシルアミンを添加し、混合物を室温で18時間振盪
した。次いで10mlのジメチルホルムアミド中のジメチル
アミン(1.5g, 33ミリモル)を添加し、未反応活性エステ
ルをジメチルアミドを添加するために室温で1時間イン
キュベートした。
【００７７】支持体をアセトニトリル、メタノール及び
エーテルで洗浄後、アデノシン上の2'及び3'ヒドロキシ
ル基を40mlの無水ピリジン中の6ml(64ミリモル)の無水
酢酸及び750mg(6ミリモル)のジメチルアミノピリジンの
混合物で保護した後室温で3時間インキュベートした。
次いで、アセチルクロライド(2ml、28ミリモル)を添加
し、インキュベーションを1時間継続した。
【００７８】支持体をアセトニトリル、メタノール及び
エーテルで洗浄した。収量は2.6gであり、ジメトキシト
リチル放出はTEF II支持体がg当り85μ当量でプライマ
ー密度を有することを示した。
【００７９】（実施例８） TEF II 支持体への5'−ジメトキシトリチル−3'−(p−
クロロフエニルホスフェート)−5−(メチル−14C)チミ
ジンの付加及びその支持体からの切断 適当な放射線標識チミジンヌクレオチドを得、実施例７
のTEF II支持体上に縮合させ、支持体から選択的に切断
した。この操作は、支持体の選択的切断の面を立証し
た。
【００８０】5'−ジメトキシトリチル−3'−(p−クロロ
フェニルホスフェート)−5−(メチル−14C)チミジンは
次のようにして調製した。冷チミジン(122mg、0.5ミリ
モル)を5-(メチル−14C)チミジン(ほぼ95μCi/μモル)
と合わせ、水に溶解し、凍結乾燥し、五酸化リン上で乾
燥させた。この14C−チミジン混合物を次いで4mlの無水
ピリジン中に溶解し、2mlまで蒸発させた。次いで、ジ
メトキシトリチルクロライド(170mg、0.5ミリモル)を添
加し、室温で1時間インキュベートさせた。反応液を次
いで氷中に注ぎ、ジクロロメタン中に抽出させた。ジク
ロロメタン相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、ロ
ト蒸発させてゴム状物にした。このゴム状物を0℃にお
いて2.5％のトリエチルアミンを含有する沸騰ベンゼン
から再結晶させた。結晶を冷ベンゼン／シクロヘキサン
(2:1)で洗浄し、真空乾燥した。収量は270mg(約0.5ミリ
モル)であり、放射線標識は267nmにおいて、16100cpm/
O.D.を与えた。14C−標識5'−ジメトキシトリチルチミ
ジンは1mlの無水ピリジン中の貯蔵液として貯蔵させ
た。
【００８１】14C−標識チミジン類似体を次いで1.2mlの
無水ピリジン中の245mg(1ミリモル)のp−クロロフェニ
ルジクロロホスフエート、18.5μl H2Oを合わせ、及び
ピリジン中に溶解された400μlの5'−ジメトキシトリチ
ル−5−(メチル−14C)チミジン貯蔵液を添加することに
よりホスホリル化した。室温において30分後、約10mlの
1Mトリエチルアンモニウムバイカーボネートを添加し、
有機相を酢酸エチルで3回抽出した。有機相をNaCl水溶
液で戻し抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。次い
で有機相を濾過し、蒸発乾固し、微量のトリエチルアミ
ンを含有するジオキサンから凍結乾燥した。凍結乾燥物
質を3mlの無水ピリジン中に溶解し、4℃で貯蔵した。2
％トリエチルアミンを含有するクロロホルム中の10％メ
タノールを溶出溶媒として用いるシリカゲルプレート上
の薄層クロマトグラフィーは生成物がクロマトグラフ的
に純粋であることを示した。シンチレーション計数は1
1.5μCiの物質が存在することを示した。
【００８２】41μモルの14C標識チミジン類似体をエフ
ィモフの修正されたトリエステル方法［Ｖ．Ａ．エフィ
モフ(V.A.Efimov)、Nuc.Acid.Res., 10、6675(1982
年)］を用いて50mgのTEF IIと縮合させた。次いで実施
例５に開示された脱保護及び節だ工程を行い、ヌクレオ
チド放出を各工程において14Cの放出により追跡した。
結果を以下にまとめて示す。
【００８３】
【表１】
【００８４】この実施例は酸化後に塩基処理を行うこと
により、選択的切断部位が所望通りに***することを立
証している。
【００８５】（実施例９） DNAハイブリッド形成アフィニティカラムを合成するた
めのポリメタクリレート支持体系の利用 本発明の実際的な応用を例示するためにポリメタクリレ
ート支持体系を核酸分離のための配列特異性アフィニテ
ィ支持体として有効に利用した。
【００８６】ポリメタクリレート支持体は、実施例１に
記載した操作に従って構成した。この支持体はジメトキ
シトリチル放出により求めたところ、78μ当量／gのヌ
クレオシドプライマーを含有した。乾燥樹脂(350mg)を6
mm×30mmの寸法のカラムに充填した。カラムは全ての工
程がプログラム可能なように修正されたBIOLOGICALSDNA
/RNA シンセサイザーにはめ込まれた。ヌクレオシド類
は標準的ホスホモノクロリダイト化学の修正方法を用い
て逐次添加された［Ｍ．Ｄ．マテウッチ(M.D.Matteucc
i)及びＭ．Ｈ．カルザース(M.H.Caruthers)、Tetrahedr
on Letters 21:719-722(1980年)］。この標準的操作へ
の修正は、1)未反応5'ヒドロキシル基の5％N,N−ジメチ
ルアミノピリジン、17.5％無水酢酸、28.2％テトラヒド
ロフラン及び49.3％2,6−ルチジンの混合物による保
護、及び2)クロロホルム中4％のジクロロ酢酸によるジ
メトキシトリチル基の除去、を含んだ。
【００８７】この修正方法を用いて、適当なモノホスホ
クロロダイトの30mM溶液を各ヌクレオチド添加のための
支持体と反応させた。合成された配列はポリメタクリレ
ートプライマー−3'd(TTTTGAAATAGGTA)5'であった。オ
リゴヌクレオチド合成の完結後、塩基保護基と支持体結
合DNAを濃水酸化アンモニウムと50℃で8〜18時間反応さ
せることにより除去した。水及び1M塩化ナトリウムで十
分に洗浄後樹脂を乾燥し、末端ジメトキシトリチル基を
樹脂のg当り2.3μモルの結合オリゴヌクレオチドにて定
量した。
【００８８】アフィニティハイブリッド形成支持体の有
用性を評価するために同一のホスファイト化学を用いて
二つのDNA配列を構成した。しかしながら、標準的な塩
基切断性シリカ支持体を使用した［Ｍ．Ｄ．マテウッチ
及びＭ．Ｈ．カルザース(M.D.Matteucci and M.H.Carut
hers)、Tetrahedron Letters 21:719 - 722(1980
年)］。これらの配列の一方は、アフィニティハイブリ
ッド形成支持体に相補的な14mer即ち5'-d(AAACTTTATCCA
TC)3'であった。他方の配列はアフィニティハイブリッ
ド形成支持体には相補的ではない17mer即ち5'−d(GGAAT
ATTCCCCCAGGC)3'であった。これらのDNA配列の両者は標
準的な操作により、5'末端において32P−ATPで標識し、
ポリアクリルアミドゲル上で精製した［Ｃ．Ｃ．リチャ
ードソン(C.C.Richardson)、Proc. Nat'l. Acad. Sci.,
54:158(1965年)、及びＡ．マキサム及びＷ．ギルバー
ト(A.Maxam and W.Gilbert)、Methods of Enzymology 6
5:449(1979年)］。
【００８９】これらの14mer及び17mer配列について、そ
れらのアフィニティ支持体とハイブリッド形成する能力
を試験した。これはDNA配列をアフィニティ支持体と1M
塩化ナトリウム、10mM Tris緩衝液、及び1mM EDTAより
なるpH7.6の緩衝液の存在下において25℃で2時間インキ
ュベートさせて行われた。ハイブリッド形成しない配列
は上記緩衝液の15の1.5mlのアリコートを用いて洗浄除
去された。ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチド
配列は次いで水で溶出した。
【００９０】この比較操作の評価に当り、30％の14mer
配列及び5％未満の17mer配列がアフィニティカラムに結
合していることが判明した。
【００９１】本発明によるオリゴヌクレオチドの合成の
ための新規且つ改良された高分子支持体系は、おだやか
に酸性な及びおだやかに塩基性な反応条件に対する許容
性を保持しながら、単一種類の高分子支持体から全ての
合成オリゴマーの便利な且つ定量的な放出を可能にする
当分野において長く待望されていた汎用性高分子支持体
系の要求を満足させるものである。
【００９２】以上の説明から、本発明の特別の形態が例
示され説明されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から離
れることなく各種修正がなされることがあきらかであろ
う。従って、本発明は以下に掲げる請求の範囲以外から
は制限されないものである。
【００９３】
【発明の効果】本発明の高分子支持体系を用いて得られ
たオリゴヌクレオチドハイブリッド形成アフィニティー
生成物は、簡単な操作で定量的に回収することが可能で
ある。さらに、本発明の方法で得られたオリゴヌクレオ
チドハイブリッド形成アフィニティー生成物は、固定化
された相補的ポリ核酸の検出に便利に使用することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応
式を図解し、酸化性置換基の対が合成オリゴマーのホス
フェートに隣接している場合の環状のプライマーの切断
を示す。（ｂ）オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を
図解し、単一の酸化性置換基が合成オリゴマーのホスフ
ェートに隣接している場合の環状のプライマーの切断を
示す。
【図２】（ａ）は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応
式を図解し、酸化性置換基の対が合成オリゴマーのホス
フェートに隣接している場合の環状のプライマーの切断
を示す。（ｂ）オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を
図解し、単一の酸化性置換基が合成オリゴマーのホスフ
ェートに隣接している場合の環状のプライマーの切断を
示す。
【図３】オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解
し、酸化性置換基の対がアルケニル結合である場合の環
状のプライマーの切断を示す。
【図４】オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解
し、酸化性置換基が高分子支持体の付着点に位置する場
合の環状のプライマーの切断を示す。
【図５】オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解
し、単一酸化性置換基である場合の線状プライマーの切
断を示す。
【図６】オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解
し、二対の酸化性基が相互に隣接関係にある線状プライ
マーの切断を示す。
【図７】オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図解
し、一対の酸化性置換基がアルケニル結合である線状プ
ライマーの切断を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 30/48 8310−2Ｊ 33/58 7055−2Ｊ

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ハイブリッド形成アフィニティー生成物を
    合成する方法であって、下記の（ａ）から（ｆ）の工程
    を包含する方法： （ａ）１個以上の酸化性置換基を有する分子状プライマ
    ーを高分子支持体に結合させる工程； （ｂ）オリゴヌクレオチド合成に悪影響を及ぼし得るか
    あるいは関与し得る、該高分子支持体のいずれの基をも
    保護する工程； （ｃ）必要に応じて、該プライマー上の酸化性置換基を
    保護する工程； （ｄ）該プライマー上にヌクレオチドを縮合してオリゴ
    ヌクレオチドを合成する工程； （ｅ）必要に応じて、合成オリゴヌクレオチド、および
    保護された酸化性のプライマー置換基のいずれをも脱保
    護する工程；および （ｆ）得られた該脱保護されたオリゴヌクレオチドを相
    補的にポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、それに
    よって二重鎖を形成する工程。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の方法であって、さらに下
    記の（ｇ）から（ｉ）の工程を包含する方法： （ｇ）前記酸化性置換基を有効な酸化剤で選択的に酸化
    する工程； （ｈ）前記工程（ｇ）と同時に、あるいは工程（ｇ）に
    引き続いて、前記二重鎖を有効な塩基で処理する工程；
    および （ｉ）二重鎖のハイブリッド形成アフィニティー生成物
    を回収する工程。
  3. 【請求項３】さらに前記二重鎖の存在を検出する工程を
    包含する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】ハイブリッド形成アフィニティー生成物を
    合成する方法であって、下記の工程を包含する方法： （ａ）分子状プライマーを高分子支持体に結合する工
    程； （ｂ）オリゴヌクレオチド合成に悪影響を及ぼし得るか
    あるいは関与し得る、該高分子支持体のいずれの基をも
    保護する工程； （ｃ）該プライマー上にヌクレオチドを縮合してオリゴ
    ヌクレオチドを合成する工程； （ｄ）該高分子支持体から切断することなく、該合成オ
    リゴヌクレオチドを脱保護する工程；および （ｅ）得られた該脱保護されたオリゴヌクレオチドを相
    補的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、それによ
    って二重鎖を形成する工程。
  5. 【請求項５】さらに前記二重鎖の存在を検出する工程を
    包含する、請求項４に記載の方法。
JP5070586A 1983-09-02 1993-03-29 オリゴヌクレオチドの高分子支持体系 Expired - Lifetime JP2502257B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52885683A 1983-09-02 1983-09-02
US528,856 1983-09-02

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59503327A Division JP2548112B2 (ja) 1983-09-02 1984-08-21 担体およびオリゴヌクレオチドの合成

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06211892A true JPH06211892A (ja) 1994-08-02
JP2502257B2 JP2502257B2 (ja) 1996-05-29

Family

ID=24107474

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59503327A Expired - Lifetime JP2548112B2 (ja) 1983-09-02 1984-08-21 担体およびオリゴヌクレオチドの合成
JP5070586A Expired - Lifetime JP2502257B2 (ja) 1983-09-02 1993-03-29 オリゴヌクレオチドの高分子支持体系
JP8043879A Pending JPH08253496A (ja) 1983-09-02 1996-02-29 オリゴヌクレオチド合成用担体
JP11198214A Expired - Lifetime JP3073735B2 (ja) 1983-09-02 1999-07-12 オリゴヌクレオチド合成用担体
JP19821399A Expired - Lifetime JP3379064B2 (ja) 1983-09-02 1999-07-12 オリゴヌクレオチドの合成用担体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59503327A Expired - Lifetime JP2548112B2 (ja) 1983-09-02 1984-08-21 担体およびオリゴヌクレオチドの合成

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8043879A Pending JPH08253496A (ja) 1983-09-02 1996-02-29 オリゴヌクレオチド合成用担体
JP11198214A Expired - Lifetime JP3073735B2 (ja) 1983-09-02 1999-07-12 オリゴヌクレオチド合成用担体
JP19821399A Expired - Lifetime JP3379064B2 (ja) 1983-09-02 1999-07-12 オリゴヌクレオチドの合成用担体

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0155950B1 (ja)
JP (5) JP2548112B2 (ja)
AU (1) AU575586B2 (ja)
CA (1) CA1339010C (ja)
DE (1) DE3481060D1 (ja)
DK (1) DK195285D0 (ja)
IL (1) IL72794A (ja)
IT (1) IT1175861B (ja)
WO (1) WO1985001051A1 (ja)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2567523B1 (fr) * 1984-07-12 1987-11-13 Pasteur Institut Polynucleotides lies de facon covalente a un support solide, et procede pour leur obtention
US4734363A (en) * 1984-11-27 1988-03-29 Molecular Diagnostics, Inc. Large scale production of DNA probes
JPS61152695A (ja) * 1984-12-26 1986-07-11 Nippon Shinyaku Co Ltd 長鎖ｄｎａの合成法
US4818681A (en) * 1985-02-22 1989-04-04 Molecular Diagnostics, Inc. Fast and specific immobilization of nucleic acids to solid supports
DE3568583D1 (en) * 1985-08-29 1989-04-13 Berol Kemi Ab A carrier with an immobilised, biologically active substance, a method for its preparation, and the use thereof
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
GB8810400D0 (en) † 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US7811751B2 (en) 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
GB8822228D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5559221A (en) * 1989-02-15 1996-09-24 Worcester Foundation For Experimental Biology Method of separating oligonucleotides from a mixture
US5352578A (en) * 1989-02-15 1994-10-04 Worcester Foundation For Experimental Biology Method of separating oligonucleotides from a mixture
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5204455A (en) * 1989-06-15 1993-04-20 Froehler Brian C Monomethoxytrityl protected oligonucleotides bound to a solid support
US6300486B1 (en) 1989-06-15 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Large scale synthesis of oligonucleotides and their associated analogs
US5164491A (en) * 1989-06-15 1992-11-17 Gilead Sciences Large scale synthesis of oligonucleotides and their associated analogs
FR2682112B1 (fr) * 1991-10-08 1993-12-10 Commissariat A Energie Atomique Procede de synthese d'acide ribonucleique (arn) utilisant un nouveau reactif de deprotection.
EP0624059A4 (en) * 1991-11-22 1994-12-21 Affymax Technologies N.V. Combinatorial strategies for polymer synthesis.
US6943034B1 (en) 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
GB9207380D0 (en) * 1992-04-03 1992-05-13 Ici Plc Compounds
WO1994001446A2 (en) * 1992-07-09 1994-01-20 Beckman Instruments, Inc. Derivatized organic solid support for nucleic acid synthesis
US5554501A (en) * 1992-10-29 1996-09-10 Beckman Instruments, Inc. Biopolymer synthesis using surface activated biaxially oriented polypropylene
FR2707296B1 (fr) * 1993-07-09 1995-09-29 Genset Sa Procédé de synthèse d'acides nucléiques sur support solide et composés utiles notamment comme support solide dans ledit procédé.
US5922534A (en) 1995-03-28 1999-07-13 Hewlett-Packard Company Dry biochemical assay plate and method for making the same
US5869696A (en) * 1996-04-22 1999-02-09 Beckman Instruments, Inc. Universal solid supports and methods for their use
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US20020042048A1 (en) 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6355419B1 (en) 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
AU767509B2 (en) * 1999-02-05 2003-11-13 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Method for deprotecting oligonucleotides
US7211654B2 (en) 2001-03-14 2007-05-01 Regents Of The University Of Michigan Linkers and co-coupling agents for optimization of oligonucleotide synthesis and purification on solid supports
US20080213891A1 (en) * 2004-07-21 2008-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi Agents Comprising Universal Nucleobases
AU2007215218B2 (en) 2006-02-13 2013-09-19 National Institutes Of Health Variants in complement regulatory genes predict age-related macular degeneration
WO2007120975A2 (en) 2006-02-13 2007-10-25 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Variants in complement regulatory genes predict age-related macular degeneration
EP2687609B1 (en) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method for treating solid tumor
US8715928B2 (en) 2009-02-13 2014-05-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Molecular-based method of cancer diagnosis and prognosis
US20120004133A1 (en) 2009-02-20 2012-01-05 The Johns Hopkins University Method for the diagnosis of age-associated vascular disorders
CN102713629B (zh) 2009-11-20 2016-02-24 俄勒冈健康科学大学 用于检测结核分枝杆菌感染的方法
CN102782156A (zh) 2009-12-31 2012-11-14 文塔纳医疗***公司 用于生成独特特异性核酸探针的方法
WO2011109224A1 (en) 2010-03-01 2011-09-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary,Department Of Health & Human Services Gene sets for detection ultraviolet a exposure and methods of use thereof
US9150926B2 (en) 2010-12-06 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483
EA201391074A1 (ru) 2011-01-25 2013-12-30 Олмак Дайэгностикс Лимитед Профили экспрессии генов рака толстой кишки и способы применения
US9435812B2 (en) 2011-08-31 2016-09-06 Ventana Medical Systems, Inc. Expression of ETS related gene (ERG) and phosphatase and tensin homolog (PTEN) correlates with prostate cancer capsular penetration
WO2013148147A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 The U.S.A., As Represented By The Secretary Dept. Of Health And Human Services Dna methylation analysis for the diagnosis, prognosis and treatment of adrenal neoplasms
WO2013192616A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Molecular malignancy in melanocytic lesions
WO2015073709A2 (en) 2013-11-14 2015-05-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Detection of atherosclerotic cardiovascular disease risk and heart failure risk
US10851423B2 (en) 2015-06-22 2020-12-01 Proteovista Llc SNP arrays
EP3414344A1 (en) 2016-02-08 2018-12-19 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Gene signature predictive of hepatocellular carcinoma response to transcatheter arterial chemoembolization (tace)
WO2018005284A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The United State Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for influenza a virus subtyping
EP3918096A1 (en) 2019-01-31 2021-12-08 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Methods and compositions for detecting transfusion-transmitted pathogens
JP7453171B2 (ja) * 2021-03-09 2024-03-19 日本電子株式会社 固相混合物、充填剤及びカラム
CN114671921A (zh) * 2022-05-06 2022-06-28 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 一种大规模寡聚核苷酸氨解方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
IL69196A0 (en) * 1982-08-20 1983-11-30 Genex Corp Solid phase synthesis of oligonucleotides
DE4108044A1 (de) * 1991-03-13 1992-09-17 Basf Ag Verfahren zur herstellung von polyoxyalkylenglykolen

Also Published As

Publication number Publication date
AU575586B2 (en) 1988-08-04
JPS60502155A (ja) 1985-12-12
CA1339010C (en) 1997-03-25
EP0155950A1 (en) 1985-10-02
JP2548112B2 (ja) 1996-10-30
JP2000053693A (ja) 2000-02-22
DE3481060D1 (de) 1990-02-22
JPH08253496A (ja) 1996-10-01
JP2000044590A (ja) 2000-02-15
IL72794A (en) 1989-01-31
IL72794A0 (en) 1984-11-30
EP0155950B1 (en) 1990-01-17
JP3379064B2 (ja) 2003-02-17
JP2502257B2 (ja) 1996-05-29
IT8422488A0 (it) 1984-08-31
AU3319684A (en) 1985-03-29
WO1985001051A1 (en) 1985-03-14
IT1175861B (it) 1987-07-15
JP3073735B2 (ja) 2000-08-07
DK195285A (da) 1985-05-01
DK195285D0 (da) 1985-05-01
EP0155950A4 (en) 1986-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2502257B2 (ja) オリゴヌクレオチドの高分子支持体系
US4739044A (en) Method for derivitization of polynucleotides
US5077196A (en) Arabinonucleic acid segment-containing probes for DNA/RNA assays
JP2528107B2 (ja) ポリヌクレオチド測定試薬と方法
US5362866A (en) Oligonucleotide polymeric support system with an oxidation cleavable link
US4948882A (en) Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
JP4714320B2 (ja) アミノ基転移による固相核酸標識化
JP2701092B2 (ja) 異なるｄｎａシーケンスを検出するためのプローブ方法と構成物
JP3566255B2 (ja) Ｔａｇライブラリー化合物、組成物、キットおよび使用の方法
US20030144231A1 (en) Oligonucleotide analogues
JP4791043B2 (ja) 同一固体支持体上で、２以上のオリゴヌクレオチドをタンデムに合成するための方法および組成物
US20070196828A1 (en) Process for detecting or quantifying more than one nucleic acid in library via terminal attachment of non-inherent universal detection targets to nucleic acid copies produced thereby
JP2001505543A (ja) 固相合成法
US5539097A (en) Oligonucleotide polymeric support system
US7098326B2 (en) Methods for the integrated synthesis and purification of oligonucleotides
US5688940A (en) Linker for immobilization, modification and subsequent release of oligomers with a terminal hydroxyl group
US20030105056A1 (en) Protected linker compounds
JP3001919B2 (ja) 蛍光標識ｄｎａの調製方法及びキット
JPH0374239B2 (ja)
JPH01500003A (ja) 光不安定結合による固形支持体上のポリヌクレオチド・プローブ
WO2007105623A1 (ja) オリゴヌクレオチド固定化固相担体

Legal Events

Date Code Title Description
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 19960125