JP2548112B2 - 担体およびオリゴヌクレオチドの合成 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一般的にオリゴヌクレオチド合成に関し、よ
り詳細にはオリゴヌクレオチド類を固体支持体上におい
てより容易に且つより効率的に合成することを可能にす
る新規な改良されたプライマー系に関する。

オリゴヌクレオチド類は３〜100個の塩基単位の鎖長
を有するDNA（デオキシボヌクレオチド類）或いはRNA
（リボヌクレオチド類）のいずれかの比較的短い小片で
ある。デオキシボヌクレオチド類及びリボヌクレオチド
類の両者はそれらの細胞過程及び細胞成長における鍵的
役割のために特別の生物学的意義を有する。成長及び蛋
白質発現のための主たる情報を含む細胞の成分はDNAで
ある。現在DNAの新たに合成された小片を細胞のDNA中に
導入することが可能であるという事実のためにオリゴデ
オキシリボヌクレオチド類の化学的合成を容易にする方
法は特別の意義を帯びる。その様な方法は、欠陥のある
遺伝情報の修正を助けるために或いは生物体が発現する
蛋白質を実質的に変成するために使用することができ
る。例えば、細菌にヒトグルカゴンの合成の遺伝情報を
含有するポリデオキシリボヌクレオチドを備えさせるこ
とができる。適当な条件下においては、この生物は次い
でヒトグルカゴを産生するようになる。

加えて、オリゴヌクレオチド類のその他の薬理学的、
診断及び研究用途の範囲が存在する。しかしながら、オ
リゴヌクレオチドの完全な有用性はそれらを高収率及び
より高純度に有効に合成する方法を持つものである。

1970年代の中期までは、オリゴヌクレオチド合成は液
相中において行われていた。液相技術に伴う分離及び精
製の問題がオリゴヌクレオチド合成の実際的な自動化系
を妨げていた。これらの分離及び精製の問題を解決する
ために高分子支持体が開発された。これまでのところ、
これらの高分子支持体の使用は支持体と第１ヌクレオチ
ド間の切断の操作によるオリゴヌクレオチドの固体支持
体へのカツプリングを含むものであつた。しかしなが
ら、第１ヌクレオチドは４個の塩基の任意のものであり
得るので、目的オリゴヌクレオチドを合成するために
は、これらの操作は８個の異つた開始支持体即ちDNAに
ついて４個、及びRNAについて４個を備える必要があつ
た。従つて、全ての目的オリゴヌクレオチド類が１つの
タイプの高分子支持体から合成することができるような
汎用性の大きなプライマー（鎖開始剤）を有する支持体
系が利用可能であれば有意義な進歩であると云える。

実際に役立つためには、高分子支持体及びプライマー
は合成が完結するまで成長するオリゴヌクレオチドを保
持しなければならない。又、一度合成が完結すればプラ
イマーは切断されてオリゴヌクレオチドを高分子支持体
から放出することができなければならない。文献に記載
されているプライマーの多くは極めて酸又は塩基に不安
定な結合を有する。即ち、オリゴヌクレオチドは酸性或
いは塩基性試薬で処理することにより望ましくない時点
において、構造的再構成の結果と共に高分子支持体から
放出される可能性がある。例えばM.D.マテウツチ及びM.
H.カルザース（M.D.Matteucci and M.H.Caruthers）、
「高分子支持体上におけるデオキシオリゴヌクレオチド
類の合成（Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a
Polymer Support）」（Journal of the American Chemi
cal Society,Vol.103,No.11,1981年、3185−3191頁）、
及びH.ソマー及びF.クラマー（H.Sommer and F.Crame
r）「高分子支持体上における５−ホスフエート基を有
するデオキシオリゴヌクレオチド類の化学的合成（Chem
ische Synthese von Desoxyoligonucleotides mit5−Ph
asphatgruppe am Polymeren Trager;Chemical Synthesi
s of Deoxyoligonucleotides with 5−Phasphate Group
on a Polymer Support）」（Chem.Rev.,Vol.107,1974
年 24−33頁）参照、しかしながら、酸に不安定なプラ
イマーの使用はオリゴヌクレオチド合成の際に軽度に酸
性な試薬或いは条件の使用を妨げる。同様に、塩基性に
不安定なプライマーは軽度に塩基性の試薬或いは条件の
使用を妨げる。その結果、酸性或いは塩基性に不安定な
プライマーを使用することは高分子支持体系の汎用性を
大きく制限することになる。

極めて酸或いは塩基に不安定なプライマーは又、高分
子支持体系の汎用性をその他の面で制限する。例えば、
多くの保護基が通常ヌクレオチドの各種官能基即ち塩基
のアミン或いはヒドロキシル官能基、リボヌクレオチド
の２′ヒドロキシル基、デオキシリボヌクレオチドの
３′及び５′ヒドロキシル基及びホスフエート基などを
保護するために通常使用される。好ましくは、高分子支
持体系はこれらの保護基の除去をオリゴヌクレオチドが
高分子支持体から放出される前に可能にするように十分
汎用性であるか、或いは又、保護基が除去される前にオ
リゴヌクレオチドが高分子重合体から放出されることが
可能であるべきである。しかしながら、極めて酸或いは
塩基に不安定であるプライマーは、この汎用性を相当に
制限する。

従つて、必要であるのは完全に汎用性の高分子支持体
系即ち軽度の塩基性及び軽度の酸性反応条件に耐えるこ
とができ、なお単一の高分子支持体からあらゆるタイプ
の合成オリゴヌクレオチドを所望の時点において便利に
且つ定量的に放出することのできるオリゴヌクレオチド
合成の高分子支持体構成及びそれに対応する方法であ
る。本発明は、この要求を満たすものである。

発明の概要 本発明は特にオリゴヌクレオチド類の合成に有用であ
る独特な高分子支持体系を提供するものである。具体的
には、本発明の系は独特の支持体及びプライマーの立体
配置及びその立体配置に対応するオリゴヌクレオチド合
成方法により特徴付けられる。本発明の最も好ましい高
分子支持体系は軽度に酸性或いは塩基性の条件及び試薬
に耐えることができるものである。その結果、本発明の
最も好ましいプライマーは従来公知の高分子支持体系よ
りもはるかに多くの汎用性を与えるものである。本発明
の高分子支持体系は又DNA及びRNAの両者を合成するため
に使用される条件及び試薬のタイプにおいて大きな柔軟
性を許容するものである。本発明の系は現在利用可能な
オリゴヌクレオチド合成方法により３′或いは５′方法
のいずれにおいても鎖伸長を可能にし、又、オリゴヌク
レオチドを高分子支持体から放出前に完全に脱保護する
ことを可能にし、或いはオリゴヌクレオチドを全ての保
護基が除去される前に高分子支持体から放出されること
を可能にする。加えて、この独特な高分子支持体系はDN
A或いはRNAのいずれを合成することを目的とするかに応
じて異る８つの開始支持体を合成する必要性を除去する
万能プライマーを特徴とするものである。目的オリゴヌ
クレオチドの切断は実質的に定量的な結果をもつて達成
することができる。

本発明の高分子支持体系は高分子支持体及び該高分子
支持体に共有結合したプライマーよりなる化合物であ
る。本発明の高分子支持体系においてプライマーが選択
的酸化即ちプライマー或いはオリゴヌクレオチドのその
他の如何なる結合も酸化することなくプライマーの１以
上の酸化可能な置換基を酸化することにより切断される
ことを特徴とするものである。この選択的酸化はプライ
マーを直接に切断するか、或いはプライマーの間接的な
切断を行うものである。直接切断においては有効な酸化
剤自体がオリゴマーを支持体から放出するプライマー骨
格の切断を引きおこす。間接的切断においては、有効な
酸化剤が結合オリゴヌクレオチドのホスフエートに隣接
する電子引き抜き中心を活性化させ、それは更に有効な
塩基で処理された際に加水分解或いは脱離を起こし、目
的オリゴヌクレオチドの放出が生ずる。高分子支持体系
である、高分子支持体とプライマーからなるオリゴヌク
レオチド合成用担体の具体的な例としては、以下の構
造： を有するオリゴヌクレオチド合成用担体： ここで、は、固体の高分子支持体であり、は、プ
リン塩基またはピリミジン塩基、またはそれらの誘導体
であり、 はオリゴヌクレオチド合成における酸性または塩基性の
脱保護条件下で開裂されず、該固体の高分子支持体に結
合している、１から50原子のスペーサーであり、R₈は酸
化性置換基の保護基であり、R₇は−OHの保護基であり、
R₉はＨ、アルキル、アルコキシ、およびアリールからな
る群から独立に選ばれる基である、を挙げることができ
る。

本発明に従えば、各種酸化可能な置換基を使用するこ
とができる。好ましい実施態様においては、互に隣接し
た或いはホスフエート電子引き抜き基の近傍に位置した
酸化可能な基の対を有するプライマーの部分が本発明の
酸化性置換基よりなるものである。酸化性基の対は、又
より好ましい実施態様においては、酸化性基がホスフエ
ートに対してγ位である線状或いは環状プライマーにお
けるアルケニル結合であつてもよい。最も好ましい実施
態様においては、酸化可能な置換基は未保護cis−ヒド
ロキシル基を有するリボースである。

本発明のオリゴヌクレオチドの合成方法は、 （ａ）本質的に高分子支持体とプライマーからなる化合
物を提供する工程、 （ｂ）塩基に不安定な保護基を有するオリゴヌクレオチ
ドを合成する工程、 （ｃ）該保護基を塩基で脱保護する工程、 （ｄ）該オリゴヌクレオチドを相補的なオリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせて２本鎖を形成させる工程、 （ｅ）該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした該相
補的オリゴヌクレオチドを検出する工程、 （ｆ）オリゴヌクレオチド結合部位に対してガンマ位に
ある、少なくとも一つの酸化性置換基を酸化する工程、 （ｇ）該オリゴヌクレオチドを、第２の塩基で、プライ
マーから開裂する工程、 および、 （ｈ）該オリゴヌクレオチドを回収する工程を含むこと
ができる。

（ｄ）および（ｅ）の工程は、必要に応じて行い得
る。

本発明の最も好ましい支持体系上に構成されるオリゴ
ヌクレオチドは軽度の塩基性或いは軽度の酸性条件下に
おいては高分子支持体から放出されないことは有意義で
ある。その代りに合成されたオリゴヌクレオチドは酸化
性置換基が先ず脱保護され、次いで同時又は引き続きの
有効な塩基による処理を伴う有効な酸化剤により選択的
に酸化された場合にのみ高分子支持体から放出される。
この様に、本発明の高分子支持体は大きな汎用性を与え
る。合成オリゴヌクレオチドは有効な酸化剤が使用され
る際にのみ放出されるので各種ヌクレオチド官能基を保
護するために使用される酸及び塩基不安定性キヤツピン
グ（保護）基はオリゴヌクレオチドが高分子支持体系か
ら放出される前或いは後に除去することができる。又、
オリゴヌクレオチド合成の際に、オリゴヌクレオチドを
支持体から放出することなく軽度に酸性或いは軽度に塩
基性の条件或いは試薬を使用することができる。

高分子支持体系が酸性或いは塩基性のいずれかの条件
に不安定であるが、なお有意義な有用性を有する本発明
のその他の態様がある。オリゴヌクレオチドを支持体か
ら切断する前に保護基を除去する必要がない状況におい
ては、支持体系の酸及び塩基条件に対する安定性は必須
要件でないことがあり得る。例えば、酸化性プライマー
と共に用いられるシリカ支持体は有用であるが、しかし
塩基性条件には安定ではない。

本発明の有効な酸化剤としては各種のおだやかな酸化
剤を使用することができる。これらの酸化剤は目的切断
部位と反応性でなければならないがオリゴマー上に反応
性基を含ませないようにおだやかなものでなければなら
ない。好ましい実施態様において、過ヨウ素酸塩、過マ
ンガン酸塩、重クロム酸塩、二酸化マンガン或いは四酢
酸鉛が本発明の有効な酸化剤を構成するものである。本
発明の最も好ましい実施態様においては有効な酸化剤は
過ヨウ素酸塩である。

本発明の有効な塩基は２つの代替的な機能の一方を行
うものである。プライマーの間接的切断のためには有効
な塩基はプライマーの加水分解或いはオリゴマーの第１
ヌクレオチドの電子引き抜きホスフエートの除去を行う
ために選択的酸化と同時に或いは引き続いて使用され、
よつて重合体支持体系からオリゴマーを放出する。アニ
リン、ピペリジン、ピリジン、モルホリン、トリエチル
アミン、水酸化アンモニウム或いは水酸化ナトリウムな
どの塩基が本発明の有効な塩基として使用される。好ま
しい実施態様においては、アニリン、メチルアミン、エ
チルアミン及びアンモニアなどのアルデヒドとシツフ塩
基を形成する塩基が本発明の間接切断のための有効な塩
基を構成する。最も好ましい実施態様においては、アニ
リン或いは水酸化アンモニウムが本発明の間接切断のた
めの有効な塩基である。

直接切断のためには、酸化性置換基の選択的酸化のみ
がプライマーの切断を引きおこす。しかしながら多くの
直接切断において、プライマーの部分はオリゴヌクレオ
チドが高分子支持体から放出された後にもオリゴヌクレ
オチドに付着して残る。これらの場合には、有効な塩基
を使用してプライマーの残存部分を放出オリゴヌクレオ
チドから除去することが出来る。これらのプライマーの
残存部分を放出オリゴヌクレオチドから除去するために
は幾つかのおだやかな塩基を使用することができる。好
ましい実施態様においては、稀水酸化ナトリウム、稀水
酸化アンモニウム或いはピペリジンがこれらのプライマ
ーの残存部分を放出オリゴヌクレオチドから除去するた
めに有効に使用される。最も好ましい実施態様において
は、ピペリジンが放出オリゴヌクレオチドから残存プラ
イマー部分を除去するために使用される有効な塩基であ
る。

本発明の高分子支持体系はオリゴヌクレオチドハイブ
リツド形成アフイニテイ系として特別の有用性を有す
る。オリゴヌクレオチド上の保護基の除去後、合成オリ
ゴヌクレオチドは相補的ポリ核酸とハイブリツド形成さ
れる。最も好ましい実施態様において、ハイブリツド形
成されたDNA或いはRNAは溶出して定量的に回収するのが
便利である。或いは又、二重鎖を本発明の酸化的切断操
作に従つて回収することができる。オリゴヌクレオチド
及びプライマーの酸化性置換基上の保護基が先ず除去さ
れ、合成されたオリゴヌクレオチドを次いで相補的核酸
とハイブリツド形成される。プライマーの酸化的切断に
引き抜き、おだやかな塩基で処理することにより二重鎖
を高分子支持体から放出させる。

加えて、その様なオリゴヌクレオチドハイブリツド形
成アフイニテイ系を固定化された相補的ポリ核酸の検出
のために便利に使用することができる。一度固定化され
ると、相補的ポリ核酸は検出方法の認識部位が相補的ポ
リ核酸の支持体への固定化に含まれるものから区別され
る限り各種方法を用いて検出することが可能である。そ
の様な検出方法としては比色法、螢光法、リン光法、放
射性標識ベースの方法、その他の任意の便利に使用され
十分に感度の高い方法が挙げられる。

本発明のその他の面及び利点は以下の本発明の原理を
例示する現在好ましい実施態様の詳細な説明から明らか
となるであろう。

図面の説明 第1a図及び第2a図は、オリゴヌクレオチド類の合成の
反応式を図解し、酸化性置換基の対が合成オリゴマーの
ホスフエートに隣接している場合の環状プライマーの切
断を示す。

第1b図及び第2b図は、オリゴヌクレオチド類の合成の
反応式を図解し、単一の酸化性置換基が合成オリゴマー
のホスフエートに隣接している場合の環状プライマーの
切断を示す。

第３図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図
解し、酸化性置換基の対がアルケニル結合である場合の
環状プライマーの切断を示す。

第４図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図
解し、酸化性置換基が高分子支持体の付着点に位置する
場合の環状プライマーの切断を示す。

第５図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図
解し、単一酸化性置換基である場合の線状プライマーの
切断を示す。

第６図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図
解し、二対の酸化性基が相互に隣接関係にある線状プラ
イマーの切断を示す。

第７図は、オリゴヌクレオチド類の合成の反応式を図
解し、一対の酸化性置換基がアルケニル結合である線状
プライマーの切断を示す。

好ましい実施態様の具体的な説明 本発明はオリゴヌクレオチド類の便利で汎用性な合成
を可能にする独特の高分子支持体系を提供する。本発明
の高分子支持体系は高分子支持体と１以上の酸化性置換
基を有するプライマーとを含んでなるものである。これ
らの酸化性置換基の選択的酸化によりプライマーの直接
切断が生ずるか、或いは又高分子支持体から合成された
オリゴヌクレオチドの放出を生ずるプライマーの間接切
断を可能にする。

この高分子支持体系の発見は特別な意義を有する。本
発明の高分子支持体系は更に精製を殆んど必要としない
オリゴヌクレオチド類の合成を可能にする。加えて、こ
の高分子支持体系は支持体上に合成されたオリゴヌクレ
オチドに相補的な領域を有するオリゴヌクレオチド類或
いはポリ核酸のいずれかの固定化を容易に行うために使
用することができる。この様にして固定化されたオリゴ
ヌクレオチド或いはポリ核酸は各種の特別の検出方法を
用いて検出されるか或いは更に研究するために回収する
ことができる。本発明の多くの応用は当業者には明らか
であろう。

広範囲の高分子支持体を本発明の高分子支持体として
使用することができる。好ましい高分子支持体として
は、ポリスチレン類、架橋ポリスチレン類、架橋ポリア
ミノ酸類、ポリエチレングリコール、酢酸ビニルとＮ−
ビニルピロリドンとのコポリマー、並びにその他のポリ
オレフイン類、ポリエステル類、ポリアミド類、ポリア
クリレート類、ポリメタクリレート類、金属酸化物、ク
レー、各種ガラス類及びこれらの支持体のいずれかの組
み合わせを使用するグラフト化物などが挙げられる。

本発明の高分子支持体は、可溶性或いは不溶性のいず
れであつてもよいが、好ましくは不溶性のものがよい。
更に、それらは使用される反応性条件下において安定で
あり、プライマーの支持体への共有結合を行うために必
要な反応性基をそれらの表面に有する。多くの支持体は
本明細書中に開示される発明を実施する目的のために満
足できるものであるが、重量に比例して多くの結合部位
よりなる大表面積を有する高分子重合体が最も好まし
い。

高分子の表面上の反応性基はプライマーが高分子支持
体に共有的に結合することを可能にする。その様な目的
のために、通常使用される反応性基はヒドロキシル基、
カルボキシル基、及びアミノ基である。例えば、高分子
支持体に末端カルボキシル官能基を付与するとそれは次
いでプライマーのヒドロキシル基或いはアミノ基と反応
する。或いは又、高分子支持体にアミノ基或いはヒドロ
キシル基を付与すると、それは次いでプライマーのカル
ボキシル基と反応する。例えば、カルボキシレート官能
基を含有する基はジシクロヘキシルカルボジイミド（DC
C）などの適当な縮合剤の存在下において固体支持体上
のアミノ基に結合させることができる。一般或いはアリ
ールアミンを含有するプライマーはアミンとカルボキシ
レート官能基との縮合により支持体に共有結合され、ア
ミドを形成する。同様にして、酸ハロゲン化物をアミン
含有プライマーと反応させてアミドを形成することがで
きる。或いは又、プライマーは酸ハロゲン化物を有し、
支持体がアミン官能基を含有することも可能である。

プライマーの支持体への結合方法は数多く存在する。
例えばグリニヤール（Grignard）縮合、エーテル結合形
成、フリーデル−クラフト（Freidel−Craft）アルキル
化、二級アミン形成、水銀塩及びオレフイン縮合などが
ある。しかしながら、同業者は特別の合成のための適当
な高分子支持体並びにプライマーの高分子支持体への適
当な結合手段を容易に決定することが可能である〔P.ホ
ツジ及びD.C.シエリングトン（P.Hodge and D.C.Sherri
ngton）、「有機合成における高分子支持反応（Polymer
Supported Reactions in Organic Synthesis）」、Joh
n Wiley ＆ Sons,New York,1980〕。

プライマーの結合された支持体系をオリゴヌクレオチ
ド合成のために使用する前に、支持体及びプライマーの
両者の反応基をオリゴヌクレオチドの収率を減少させる
副反応を防止するために保護されなければならない。プ
ライマーの場合には、これは反応性アミンをアミドに転
換し、アルコールを連鎖開始に参加する場合を除いてエ
ステル化することにより最も容易に達成される。これら
の反応はいずれも酸無水物（例えばピリジン中の無水酢
酸）並びに酸塩化物及びその他のアシル化剤を用いて生
ずる。支持体上の反応性基の保護は用いられる支持体の
種類に応じて異る。保護される反応性基は当業者には明
らかであろう〔C.B.リース（C.B.Reese）、「テトラヒ
ドロン（Tetrahedron）」34:3143−3179（1978年）及び
T.W.グリーン（T.W.Greene）、「有機合成における保護
基（Protective Grcups in Organic Synthesisi）」、J
ohn Wiley ＆ Sons,New York,1981年〕。

本発明のプライマーは多くの別々の形態において実施
され得る。これらの別々の実施態様の全ては、しかしな
がら、一つの共通の特徴を有する。各実施態様において
プライマーは１個以上の酸化性置換基を有する。これら
の置換基をプライマー或いはオリゴヌクレオチドの他の
如何なる結合も破壊することなく選択的に酸化すること
により目的オリゴヌクレオチドを高分子支持体から直接
或いは間接に放出させる。１個以上の酸化性置換基を利
用することにより、本発明は従来技術の現状における九
つの異つた開始点を有する支持体を作成する必要性を無
くすものである。

本発明の好ましい酸化性置換基はヒドロキシル基、ア
ルケニル基、一級アミン基、及び二級アミン基である。
好ましい実施態様に対応する第１図，第２図，第４図，
第５図及び第６図は特別の結合部位において、いずれの
酸化性基が好ましいものであるかを示している。しかし
ながら、これらの図面は単に本発明に従つた各種プライ
マー構造を図解することを目的とするにすぎない。当業
者は図示された構造特に環状構造は本発明の趣旨及び範
囲から離れることなく、いくつかの異つた実施態様を有
するように柔軟性のあるものであることを理解するであ
ろう。

現在、最も好ましい実施態様において酸化性置換基は
リボヌクレオシドである。リボヌクレオシドは高分子支
持体にその塩基を介して結合されている。合成されるべ
きオリゴヌクレオチドの最初のヌクレオチドはリボヌク
レオシドに縮合され、リボヌクレオシドの５′位及び第
１のヌクレオチドの３′位の間のホスフエートブリツジ
によりリボヌクレオシドに結合される。

合成オリゴヌクレオチドの高分子支持体からの酸化的
切断を容易に行うためにプライマーの酸化性置換基の保
護及び脱保護を行う必要のない本発明のその他の好まし
い実施態様が存在する。第３図及び第７図は酸化性置換
基がアルケニル基である本発明のそれらの実施態様を例
示するものである。本発明のこの酸化剤はアルケニル結
合の部位においてプライマー分子を切断する。即ち、こ
れらの実施態様においては、オリゴヌクレオチド合成工
程中に副反応を生ずる酸化性置換基が存在しないので本
発明のオリゴヌクレオチド合成方法の工程（ｃ）及び
（ｆ）を行う必要がない。ここでも又、当業者は第３図
及び第７図はそれ自体柔軟性のあるものであり、本発明
の好ましい実施態様を例示することを目的とするもので
あることを了解するであろう。

この独特な支持体系のプライマーは３′或いは５′の
いずれかの方向の鎖伸長を可能にし、あらゆる目的オリ
ゴヌクレオチドの合成に適したものである。合成はホス
フアイト及びホスホトリエステル法を含む多くの手段に
より行うことができる。例えば、オリゴヌクレオチド類
はM.D.マテウツチ（M.D.Matteucci）及びM.H.カルザス
（M.H.Caruthers）、「高分子支持体上におけるデオキ
シオリゴヌクレオチド類の合成（Synthesis of Deoxyol
igonucleotides on a Polymer Support）」（Journal o
f the American Chemical Society,Vol.103,No.11、198
1年）及びM.J.ガイト等（M.J.Gait et al.）、「オリゴ
デオキシリボヌクレオチド類の迅速合成IV.ホスホトリ
エステル中間体を介してのオリゴデオキシリボヌクレオ
チド類の改良された固相合成（Rapid Synthesis of Oli
godeoxyribonucleotides IV.Improved Solid Phase Syn
thesis of Oilgodeoxyribonucleotides through Phosph
otriester Intermediates）」（Nuclic Acids Researc
h,Vol.8,No.5,1980年）などに記載される方法に従つて
合成することができる。

本発明のプライマーはそれらの構造において線状或い
は環状のいずれかであり得る。更に、これらのプライマ
ーは直接或いは間接のいずれかの方法において切断され
る。直接切断においては酸化は合成オリゴヌクレオチド
が一つの化学反応において支持体から放出されるように
プライマーを切断するのに役立つ。しかしながら、場合
に応じてプライマーの一部がオリゴヌクレオチドに結合
して残ることがある。この時点においてオリゴヌクレオ
チドを有効な塩基で処理することにより残存プライマー
部分をオリゴヌクレオチドから除去することができる。
間接切断においては、有効な塩基による処理と組み合わ
された酸化が合成オリゴヌクレオチドの支持体からの除
去を行う。

本発明の好ましい雑誌態様においては、環状プライマ
ーは形成されたオリゴヌクレオチドのホスフエートに隣
接した１個以上の酸化性基を含有する。酸化後適当な塩
基を用いての処理によりオリゴマーを支持体から除去す
る。第１図，第２図及び第３図は、本発明のこの実施態
様を例示するものである。

本発明のもう一つの好ましい実施態様においては、環
状プライマーは支持体との結合点に位置する酸化性基を
含有する。この場合において、酸化はオリゴマー及びプ
ライマーの一部を支持体から切断する。適当な塩基によ
る処理により、プライマーの残存部分をオリゴマーから
除去することができる。第４図は、本発明のこの実施態
様を例示するものである。

第３の実施態様においては、線状プライマーは合成オ
リゴマーのホスフエートに隣接した単一の酸化性基を含
有する。酸化と同時或いは酸化に引き続き適当な塩基で
処理するとオリゴマーが支持体から切断される。第５図
は、本発明のこの実施態様を例示するものである。

本発明の第４の実施態様においては、線状プライマー
は２個以上の隣接した酸化性基を含有することができ
る。酸化時は、この配列はオリゴマーの支持体からの直
接の切断を可能にする。第６図及び第７図はこの実施態
様を例示するものである。ここでも又、適当な塩基を用
いてプライマーの残存部分をオリゴマーから切断するこ
とができる。

任意の特別のプライマーに関して酸化性官能基とオリ
ゴヌクレオチド合成の開始部位の間には幾つかの位置的
関係が存在するが、高分子支持体からの切断に引き続く
合成オリゴヌクレオチドからのプライマー部分の除去の
ためにはホスフエートに対してγ位の酸化性官能基の配
置が好ましい。当業者は本発明のオリゴヌクレオチド合
成法が酸化性官能基がホスフエートに対してγ位以外の
位置にある場合にもなお有効であることを理解するであ
ろう。しかしながら、本発明の好ましい態様は目的オリ
ゴヌクレオチドのより便利な合成を可能にするものであ
る。

酸化性置換基上の保護基の除去は合成されたオリゴヌ
クレオチドの高分子支持体からの切断前に必要な場合が
ある。第１図，第２図，第４図，第５図及び第６図は本
発明のこの実施態様を例示するものである。脱保護は当
業者に公知の方法により達成される。T.W.グリーン（T.
W.Greene）、「有機合成における保護基（Protective G
roups in Organic Synthesis）」（John Wiley ＆ Son
s,New York,1981年）。

合成されたオリゴヌクレオチドは、プライマーの酸化
性置換基の選択的酸化により高分子支持体から直接或い
は間接に放出される。この切断の結果、実質的に定量的
なオリゴヌクレオチドの収率が得られる。直接切断のた
めには、選択的酸化はオリゴヌクレオチドを有効な酸化
剤で処理することよりなる。オリゴヌクレオチドにその
高分子支持体からの放出後、プライマーの一部が結合し
て残る場合にはこれらの残存部分は有効な塩基で処理す
ることにより除去することができる。直接切断において
は、酸化から生ずるカルボニル基が合成されたオリゴマ
ーのホスフエート基に対してγ位にあるのが好ましい。
この実施態様は塩基の適用がプライマーの残存部分を合
成されたオリゴヌクレオチドから切断するのに有効であ
るのを確実にする。その他、有効な塩基による処理が残
存プライマーのオリゴマーからの完全な除去を行わない
本発明の実施態様がある。しかしながら、当業者はこれ
らのプライマーの残存部分は多くの場合残存プライマー
部分の特別の化学に応じて代替法により除去することが
可能であることを理解するであろう〔T.W.グリーン（T.
W.Greene）、「有機合成における保護基（Protective G
roups in Organic Synthesis）」、John Wiley ＆ Son
s,New York,1981年〕。間接切断のためには、選択的酸
化は有効な塩基による同時又は引き続きの処理を伴う有
効な酸化剤によるオリゴヌクレオチドの処理を含んでな
るものである。

直接切断及び間接切断の両者のための有効な酸化剤は
目的切断部位を選択するがオリゴマー上のその他の反応
性基は選択しない温和な酸化剤よりなるものである。現
在好ましい実施態様においては、有効な酸化剤は過ヨウ
素酸塩、過マンガン酸塩、重クロム酸塩、二酸化マンガ
ン及び四酢酸鉛よりなる群から選ばれる。最も好ましく
は過ヨウ素酸塩が有効な酸化剤である。

間接切断については、有効な塩基は有効な酸化剤と共
働してプライマーを切断する。間接切断のための有効な
塩基はピペリジン、ピリジン、モルホリン、水酸化アン
モニウム、水酸化ナトリウム及びアルデヒド類とシツフ
（Schiff）塩基を形成する塩基などの塩基を含んでな
る。好ましくは、間接切断に有効な塩基は例えばアニリ
ン、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミ
ン、及びアンモニアなどのアルデヒド類とシツフ（Schi
ff）塩基を形成する塩基である。最も好ましくは、間接
切断の有効な塩基はアニリン、水酸化アンモニウム、或
いはｎ−プロピルアミンである。

直接切断について、放出されたオリゴヌクレオチドに
結合して残存する任意のプライマーの部分を除去するた
めに使用される有効な塩基は温和な塩基を含んでなるも
のである。好ましい実施態様において直接切断の有効な
塩基は稀水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、ピペ
リジン或いはｎ−プロピルアミンである。最も好ましく
は、直接切断について使用される有効な塩基はピペリジ
ンである。

本発明の最も好ましい実施態様においてはプライマー
の酸化性置換基はリボヌクレオシドであり、合成される
オリゴヌクレオチドの第１ヌクレオチドはリボヌクレオ
シドの５′を介して結合している。第1a図は本発明のこ
の実施態様を図解する反応式である。R₁及びR₂＝OH、及
びR₃及びR₄＝Ｈの場合にはR₁及びR₂は第1a図のリボース
環の２′及び３′ヒドロキシル基に対応する。オリゴヌ
クレオチド合成の際にリボヌクレオシドの２′及び３′
位は保護される。このオリゴヌクレオチドは先ず２′及
び３′ヒドロキシル基を脱保護することにより高分子支
持体から切断される。このオリゴヌクレオチドは次いで
プライマーを間接的に切断する選択的酸化により高分子
支持体から放出される。有効な酸化剤は過ヨウ素酸塩で
あり、有効な塩基はアニリン、水酸化アンモニウム或い
はｎ−プロピルアミンである。或いは又、オリゴヌクレ
オチドを先ず過ヨウ素酸塩で処理し、次いでアニリン、
水酸化アンモニウム、或いはｎ−プロピルアミンで処理
するか或いはオリゴヌクレオチドを同時に過ヨウ素酸塩
及びアニリンで処理することができる。合成されたオリ
ゴヌクレオチドを次いで標準的技術を用いて回収する。

オリゴマー上の保護基の除去は合成されたオリゴヌク
レオチドの支持体からの酸化切断の前或いは後のいずれ
においても行うことができる。切断前に保護基を除去し
たい場合には水酸化ナトリウム或いは水酸化アンモニウ
ムを用いて塩基上の保護基を除去することができる。メ
チル或いはトリクロロメチルがリン上の保護基である場
合には、脱保護のための好ましい試薬は水酸化アンモニ
ウム、或いはチオフエノキシドである。トリブチルホス
フインがリン上の保護基としての2,2,2−トリクロロ−
1,1−ジメチルエチルの除去のための好ましい試薬であ
る。Ｏ−クロロフエノール及びｐ−クロロフエノールが
リン上の保護基である場合にはベンジルオキシメート及
びピリジンアルドキシメートなどのオキシメート類をM.
J.ガイト等（M.J.Gait et al.）、「オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド類の迅速合成IV.ホスホトリエステル中
間体を介してのオリゴデオキシリボヌクレオチド類の改
良された固相合成（Rapid Synthesis of Oligodeoxyrib
onucleotides IV.Improved Solid Phase Synthesis of
Oligodeoxyribonucleotides through Phosphotriester
Intermediates）」（Nucleic Acids Research,Vol.8,N
o.5、1980年）に説明される方法に従つて、好ましい脱
保護剤として使用することができる。

合成されたオリゴマーの高分子支持体からの切断をオ
リゴマー上の保護基の除去の前に行うのが望ましい場合
が存在する。保護基はT.W.グリーン（T.W.Greene）、
「有機合成における保護基（Protective Groups in Org
anic Synthesis）」（John Wiley ＆ Sons,New York,19
81年）に記載される方法に従つて除去することができ
る。本発明のこの面はプライマーが酸化的切断のための
予備的脱保護を必要としない場合、或いは保護基が極め
て温和な条件で除去することのできる場合において有用
性を有するものである。

本発明の高分子支持体及びオリゴヌクレオチド合成方
法はオリゴヌクレオチドバイブリツド形成技術を容易に
することにおいて特別の有用性を有するものである。本
発明の支持体は、合成されたオリゴヌクレオチドの脱保
護（工程ｆ）後にそれが相補的なポリ核酸とハイブリツ
ド形成されるオリゴヌクレオチドハイブリツド形成アフ
イニテイ系として使用することができる。

或る場合において、合成されたオリゴヌクレオチドに
ハイブリツド形成された相補的なポリ核酸を回収するこ
とが望ましい場合がある。本発明の最も好ましい実施態
様においては、相補的ハイブリツド形成されたDNA或い
はRNAは溶出して便利に且つ定量的に回収される。もう
一つの好ましい実施態様は、本発明の方法に従つてプラ
イマーの高分子支持体からの酸化的切断により全二重鎖
の定量的回収を可能にする。この実施態様において、合
成されたオリゴヌクレオチド上及びプライマーの酸化性
置換基上の保護基はハイブリツド形成前に除去される。
一度ハイブリツド形成が達成されると、プライマーの酸
化性置換基の有効な酸化剤による処理後温和な塩基によ
る処理により二重鎖の高分子支持体からの放出が行われ
る。当業者は本発明において説明される技術を用いてハ
イブリツド形成された生成物が回収されることの便利さ
を了解するであろう。

その他の場合において、ハイブリツド合成された相補
的ポリ核酸の存在をそれを支持体から実際に除去するこ
となく単に検出することが望まれる場合がある。この場
合においては、幾つかの検出方法が可能であり、それら
の全ては公知のものである。その様な検出方法の一つは
既にハイブリツド形成されたポリ核酸の部分に相補的な
ハイブリツド形成プローブを用いるものである。このハ
イブリツド形成プローブは定義によりオリゴヌクレオチ
ド或いはポリ核酸である。もし、相補的ポリ核酸が実際
に合成されたオリゴヌクレオチドにハイブリツド形成す
る場合には、このハイブリツド形成プローブは支持体上
のポリ核酸にハイブリツド形成する。このハイブリツド
形成プローブは既にハイブリツド形成されたポリ核酸上
の２回目のハイブリツド形成後のその存在が検出される
ように何等かの方法により標識される。標識技術として
は通常放射性標識、螢光性標識、蛋白質仲介検出系との
相互作用のための環境指示基、発色及び発光などが含ま
れる。蛋白質仲介検出系は又直接に使用することもでき
る。当業者はハイブリツド形成プローブが第２回目のハ
イブリツド形成後に観察されるために標識されるその他
の方法或いはハイブリツド形成された相補的ポリ核酸が
例えば特異性抗体を用いる検出などにより検出される方
法を了解するであろう。

本発明を以下の実施例により、例示するがこれらは本
発明を限定するものではない。

実施例 １ メタクリレートポリマーに結合した３デノシン−N⁶−ド
デシルアミンの合成 ５−ジメトキシトリチル−６−クロロプリンリボシド
（Ｉ） 無水ピリジン（1ml）中の６−クロロプリンリボシド
（287mg）及びジメトキシトリチルクロライド（350mg）
を室温に保つた。1.5時間後シリカ上のTLC分析によりチ
エツクされたアリコートは反応が95％よりも良好に完結
したことを示した。反応液を次いで氷−NaCl上に注ぎCH
₂Cl₂で抽出した。有機層を繰り返しNaCl水溶液で洗浄
し、次いでNa₂SO₄上で乾燥し、真空留去した。残存泡状
物を最終的にベンゼンに溶解し、凍結乾燥した。

５′−ジメトキシトリチル−N⁶−〔12−アミノドデシル
アミン〕−アデノシン（II） 無水トルエン（14ml）中の（Ｉ）及び1,12−ジアミノ
ドデカン（2g）の混合物を100℃で20分間保ち、その後
激しく攪拌しながらヘキサン（150ml）に滴加した。ヘ
キサン中で生じた沈澱を遠心分離により集めた後CH₂Cl₂
に溶解し、有機溶液を手短かにKOH水溶液（0.05M）で抽
出した。有機層をNa₂SO₄上で乾燥し、乾燥するまで蒸発
させた。引き続き固体残渣を温かいトルエンに溶解し
た。少量の不溶性物質を除去後溶解物質を過剰ヘキサン
の滴加により沈澱させた。形成した白色沈澱を遠心分離
により集め、ヘキサンで洗浄し、真空乾燥した。収量は
微細粉末として524mgであつた。

支持体への結合 Amberlite CG50（100〜200湿潤メツシユ）を0.1M HCl
水溶液で十分に洗浄後30％水性メタノール中の0.15M HC
lで洗浄し、次いでメタノール、アセトン、クロロホル
ム及びエーテルで洗浄した。得られた粉末をP₂O₅上で真
空乾燥した。

ジメチルホルムアミド（DMF）（5ml）中の予備処理さ
れたアンバーライト（1g）及びカルボニルジイミダゾー
ル（660mg）の混合物を室温で４時間振盪した。この活
性加されたアンバーライトをDMFで洗浄して過剰のカル
ボニルジイミダゾールを除去してからそれをDMF（6ml）
及びトリエチルアミン（0.5ml）中の（II）の溶液中に
懸濁させた。混合物を次いで攪拌しながら80℃に１時間
加熱させた。未反応カルボキシル基は、それらをDMF
（3.5ml）中のカルボニルジイミダゾール及びジメチル
アミンで活性加させることにより保護し、次いで室温で
１時間振盪した。樹脂を別し、次いでアセトン、エー
テルで洗浄した。乾燥粉末を無水酢酸（4ml）及び無水
ピリジン（10ml）の混合物に懸濁させた。24時間後樹脂
を別し、注意深くアセトンで洗浄した後、エーテルで
洗浄し乾燥させた。

ジメトキシトリチル放出はプライマー密度がｇ当り50
〜100マイクロ当量であることを示した。

実施例 ２ スチレン−ジビニルベンゼンポリマーに結合したウリジ
ンの合成 ウリジン−スチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂の
調製 ヌクレオシド５−（３−アミノ−プロペニル）−ウリ
ジンをルース等（Ruth et al.）J.Org.Chem.43:2870（1
978年）により記載された方法に従つて合成し、1:1 メ
タノール／ジオキサン（200ml）中に溶解した。3.6gの
クロロメチルスチレンビーズ（BIOBEADSXS−１、1.25ミ
リモルの塩素／ビーズのｇ）を添加した後、回転シエー
カー内において200rpmで65℃において30分間攪拌した。
支持体を次いで過し、逐次テトラヒドロフラン、水、
メタノール及びテトラヒドロフランで洗浄してから高真
空下に１時間乾燥させた。次いで、テトラヒドロフラン
（40ml）及びトリエチルアミン（15ml）を添加後200rpm
で50℃において１時間攪拌させた。次いで、支持体を
過し、逐次水、メタノール、クロロホルム及びエーテル
で洗浄し、室温において高真空下に８〜18時間乾燥し
た。

ピリジン中の10％無水酢酸（1:9、20ml/樹脂のｇ）及
びジメチルアミノピリジン（2mg/樹脂のｇ）を乾燥樹脂
に添加した後40℃で１時間攪拌した。冷却後液相を傾瀉
分離し、樹脂を逐次ピリジンスロロホルム及びメタノー
ルで洗浄してから８〜18時間凍結乾燥させた。次いで濃
水酸化アンモニウム中のピリジン（1:1、200ml/樹脂の
ｇ）を37℃で４時間攪拌させながら添加した。減圧下に
蒸発乾固させて少量のピリジンを添加し、樹脂のもう一
度蒸発乾固させた。樹脂のｇ当り15mlの樹脂を、次いで
樹脂のｇ当り80mgのジメトキシトリチルクロライドと共
に添加し、混合物を70℃で３時間攪拌した。樹脂を次い
で過し、逐次クロロホルム、メタノール、エーテルで
洗浄し、手短かに真空環装した。ピリジン中の10％無水
酢酸（10ml/樹脂のｇ）を次いで添加し、37℃で８〜18
時間攪拌した。最後に樹脂を過し逐次ピリジン、クロ
ロホルム及びエーテルで洗浄し、室温で８〜18時間真空
乾燥した。

ジメトキシトリチル放出はプライマー密度が10〜50μ
当量/gであることを示した。

実施例 ３ ポリアクリルモルホライド上のアデノシン−N⁶−ドデシ
ルアミンの合成 12.5mlの新たに蒸留されたグリコール中のポリアクリ
ルモルホライド樹脂（Vega Biochemicals−カタログ番
号No.18964）（1.95g）及び1,12−ジアミノドデカン（2
g）の混合物を窒素下において180℃で攪拌しながら20時
間加熱した。樹脂を遠心分離により集め、次いで順次メ
タノール、10％酢酸−メタノール（1:1）、メタノール
−トリエチルアミン、メタノール及び最後にエーテルで
十分に洗浄した。樹脂を真空乾燥して1.61gの黄色微粉
末を得た。ホウ酸緩衝液（pH9.7）中でピクリルスルホ
ネートで試験されたアリコートは強い橙色に変色し、モ
ルホリンのジアミンによる良好な置換を示した。

上記樹脂（860mg）、５′−ジメトキシトリチル−６
−クロロプリンリボシド（470mg）、無水トルエン（5m
l）及びトリエチルアミン（300μ）を60〜70℃で攪拌
しながら20時間加熱した。樹脂を遠心分離で集めた後順
次トルエン、メタノール−トリエチルアミン、メタノー
ル及びエーテルで洗浄した。樹脂を真空乾燥後それをピ
リジン（6ml）及び無水酢酸（1.5ml）中に懸濁し、８〜
18時間振盪した。樹脂を次いでピリジン、ピリジン−
水、メタノール、アセトン及びエーテルで洗浄した。

クロロホルム中の2.6％トリクロロ酢酸を用いたジメ
トキシトリチル除去の定量はプライマー密度が20μ当量
/gであることを示した。

実施例 ４ オリゴマーの支持体からの酸化除去 オリゴマーが標準的技術を利用して一度プライマー−
支持体系上に合成されると、それらは過ヨウ素酸塩及び
水酸化アンモニウム、或いは過ヨウ素酸塩及びアニリン
のいずれかの組み合わせを用いて容易に除去することが
できる。メチル基がホスフエート保護基として使用され
る場合には、支持体結合オリゴマー−プライマーは先ず
濃水酸化アンモニウム中において50℃で８〜18時間イン
キユベートされる。その操作はcis−ジオール上のもの
も含めて全ての保護基を除去する。支持体結合オリゴマ
ー−プライマーを水、アセトン、及びジクロロメタンな
どの適当な溶媒で洗浄した後、オリゴマーを0.05M過ヨ
ウ素酸ナトリウム/0.05M酢酸ナトリウム（pH5.0〜7.3）
中におけるインキユベーシヨン（30分〜数時間）により
酸化される。水で洗浄後、濃水酸化ナトリウムを添加
し、混合物を次いで室温で数時間インキユベートさせ
る。得られたオリゴマーは過、及び水及び50％エタノ
ールで洗浄することにより汚染種がほぼ除去される。凍
結乾燥により水、水酸化アンモニウム及びエタノールを
除去後目的オリゴマーを更に標準的操作により精製す
る。

或いは又過ヨウ素酸ナトリウム／酢酸塩中におけるイ
ンキユベーシヨン後、オリゴマーをアニリン（pH5.0）
で数時間インキユベーシヨン後除去することもできる。
合成されたオリゴヌクレオチドの支持体からの酸化除去
はオリゴマー及び支持体上の反応性基の脱保護前或いは
後のいずれにおいても行うことができる。

切断操作の試験として、５′−ジメトキシトリチル−
Ｎ−ベンゾイル−２′−デオキシシチジンのモノマー単
位を本発明のポリメタクリレート支持体（実施例１）に
カツプリングさせた。標準的なホスホモノクロロダイト
化学〔M.D.マテウツチ（M.D.Mateucci）及びM.H.カルザ
ース（M.H.Caruthers）、“Tetrahedron Letters"21:71
9−722（1980年）〕を用いてアセトニトリル/4％2,6−
ルチジン中の活性化されたヌクレオシドの20mM溶液12ml
を533mgの支持体に添加した。酸化工程の完結後、支持
体の逐次アセトン、ジクロロメタン、水、アセトン、ジ
クロロメタン及びエーテルで洗浄後風乾した。

モノマーを支持体から回収するために次の操作に従つ
た。先ずモノマーを濃水酸化アンモニウムで50℃におい
て８〜18時間処理した。水酸化アンモニウム、アセトン
及びジクロロメタンで洗浄後、窒素流下に乾燥を行い次
いで.05Mの酢酸ナトリウム及び.05M過ヨウ素酸ナトリウ
ム（10ml、pH7.2）を添加し、全混合物を室温で24時間
インキユベートした。水、アセトン、及びジクロロメタ
ンで洗浄後、窒素下に乾燥させ、濃水酸化アンモニウム
（10ml）を添加し、混合物をもう一度室温で24時間イン
キユベートした。最後に水酸化アンモニウムで洗浄後、
モノマーを支持体から良好な収率で回収した。

この特別の操作のためには定量のために使用されたジ
メトキシトリチル基の損失を防ぐために過ヨウ素酸塩酸
化のために僅かに高められたpHが使用された。

実施例 ５ テフロン／コポリマーグラフトに結合された５′−ジメ
トキシトリチル−２′,3′ジアセチルアデノシンの合成 次に実施例は本発明の最も好ましい実施態様を表わす
ものである。

５′−ジメトキシトリチル−６−クロロプリンリボシ
ドを実施例１と同様にして調製した。５′−ジメトキシ
トリチル−６−クロロプリンリボシド（3.0g、５ミリモ
ル）を次いでアセトニトリル（30ml）、Ｎ−エチルジイ
ソプロピルアミン（8ml）及びH₂O（25ml）中の6.75g（5
2ミリモル）の６−アミノカプロン酸と反応させて５′
−ジメトキシトリチルアデノシン−N⁶−カプロン酸塩を
製造した。この生成物をシリカカラム上のクロマトグラ
フイーにより精製し、２％トリエチルアミンを含有する
クロロホルム中のメタノールの線状勾配（０〜20％）で
溶出した。

溶媒を留去後少量のピリジンから蒸発させた後、シロ
ツプ状５′−ジメトキシトリチルアデノシン−N⁶−カプ
ロン酸塩を無水ピリジン（50ml）中において無水酢酸
（10ml）を用いて暗所において室温で24時間アセチル化
させた。生成物５′−ジメトキシトリチル−２′,3′−
ジアセチルアデノシン−N⁶−カプロン酸トリエチルアミ
ン塩を反応液を氷上に注ぎ、有機相をジクロロメタンで
抽出し、ジクロロメタン相を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、次いで溶媒をローター蒸発させて単離した。残留シ
ロツプを80mlのトルエンに溶解し、目的化合物を420ml
のヘキサンを添加して沈澱させた。過及び風乾後生成
物の収量は2.62g（2.4ミリモル）であつた。

カプロン酸部位における活性エステルを形成するため
に５′−ジメトキシトリチル−２′,3′−ジアセチルア
デノシン−N⁶−カプロン酸トリエチルアミン塩（0.62
g、0.56ミリモル）をアセトニトリル（20ml）及び無水
ピリジン（4ml）中の1.04g（５ミリモル）のジシクロヘ
キシルカルボジイミド及び0.54g（４ミリモル）の１−
ヒドロキシベンゾトリアゾールと20℃で４時間反応させ
た。アルキルアミン基を８原子の長さで含有したテフロ
ンウール／コポリマーグラフト化支持体（9.18g）を添
加し、混合物を20℃で19時間インキユベートした。

この支持体を未結合ヌクレオシド類を除去するために
アセトニトリル、２％トリエチルアミンを含有するメタ
ノール、メタノール及びエーテルで洗浄した。支持体上
の未反応アミン基を次いで50mlのピリジン中の過剰の無
水酢酸（5ml）及びＮ−エチルジイソプロピルアミン（2
ml）で振盪しながら20℃で２時間保護した。アセトニト
リル、メタノール及びエーテルで洗浄後支持体のジメト
キシトリチル含量はプライマー密度がｇ当り約30μ当量
であることを示した。

実施例 ６ ５′−ジメトキシトリチル２′,3′−ジアセチル−N⁶カ
プロン酸テフロン／コポリマーグラフト支持体（TEF
I）を用いた（dTp）₁₅の合成 15チミジンの長さのオリゴマーをエフイモフ（Efimo
v）の修正されたトリエステル化学〔V.A.エフイモフ
（V.A.Efimov）、Nuc.Acid Res.10,6675（1982年）〕を
用いてバイオサーチサム・ワン・DNA・シンセサイザー
（Biosearch Sam One DNA Synthesizer）により0.105g
のTEF I支持体上に合成した。合成が完了後ホスフエー
ト保護基を標準的操作〔C.B.リース（C.B.Reese）及び
Y.T.セン クイ（Y.T.Yan Kui）、Chem.Comm.802（1977
年）〕に従つてアセトニトリル中のテトラメチルグラニ
ジン及びピリジンアルドキシムを用いて除去した。塩基
保護基を時いで濃NH₄OHを用いて55℃で５時間インキユ
ベートさせて除去した。これらの脱保護操作はアデノシ
ン上の２′及び３′保護基も除去した。

支持体結合オリゴマーを次いで暗所において20％のア
セトニトリルを含有する0.02M Na₂HPO₄中の0.05M NaIO₄
（pH＝7.2）で処理した。H₂Oにおいて洗浄後、オリゴマ
ーを1Mトリエチルアンモニウムバイカーボネート中の５
％ｎ−プロピルアミン及び10％アセトニトリルの混合物
を用いて支持体から切断した（２〜３時間）。支持体を
過、及び水及びエタノールの混合物で洗浄後、オリゴ
マー含有上澄液を少量のトリブチルアミンの存在下にお
いて蒸発乾固させた。

0.025M酢酸アンモニウム、p7.1中の３〜30％６のアセ
トニトリルの線状勾配で溶出した（60分に亘り）Unimet
rics RP−８カラムによるHPLC分析は５′−ジメトキシ
トリチル（dTp）₁₅と一致するほぼ54分における主たる
ピークを与えた。

この物質の真正さをジメトキシトリチル基を80％酢酸
で除去し、オリゴマーを標準的操作により³²P ATPでキ
ナーゼ化し〔R.A.ジヨンソン（Y.A.Johnson）及びT.F.
ウオルセツト（T.F.Walset）、Adv.in Cyclic Nuclotid
e Res.,Volume10,G.ブルツカー（G.Brccker）、P.グリ
ーンガード（P.Greengard）及びG.A.ロビソン（G.A.Rob
ison）編、Raven Press,New York,1979年〕、及び放射
線標識されたオリゴマーを20％ポリアクリルアミドゲル
上で標準的操作により電気泳動させる〔T.マニアテイス
（T.Maniatis,E.F.フリツツ（E.F.Fritach）及びJ.サン
ブルツク（J.Sambrook）、Molecular Cloning,Cold Spr
ing Habor Laboratorayu.1982年〕ことにより確認し
た。オートライジオグラフイー後、オリゴマーは（dT
p）₁₅の移動度を有する実質的な単一スポツトであるこ
とを示した。

実施例 ７ テフロン／コポリマーグラフト支持体（TEF II）に結合
したアデノシン−N⁶−ドデシルアミンの合成 その表面上にカルボキシル基を含有するテフロンウー
ル／コポリマーグラフトを使用した。15原子の長さであ
る支持体上のリンカー−アームカルボキシル部分を2.5g
の支持体をアセトニトリル（50ml）及びピリジン（10m
l）の混合物中の675mg（５ミリモル）の１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール及び1.13g（5.4ミリモル）のジシク
ロヘキシル−カルボジイミドでインキユベートすること
により活性化させた。３時間インキユベート後実施例１
において調製した1.2gの５′−ジメトキシトリチルアデ
ノシン−N⁶−ドデシルアミンを添加し、混合物を室温で
18時間振盪した。次いで10mlのジメチルホルムアミド中
のジメチルアミン（1.5g、33ミリモル）を添加し、未反
応活性エステルをジメチルアミドに添加するために室温
で１時間インキユベートした。

支持体をアセトニトリル、メタノール及びエーテルで
洗浄後、アデノシン上の２′及び３′ヒドロキシル基を
40mlの無水ピリジン中の6ml（64ミリモル）の無水酢酸
及び750mg（６ミリモル）のジメチルアミノピリジンの
混合物で保護した後室温で３時間インキユベートした。
次いで、アセチルクロライド（2ml、28ミリモル）を添
加し、インキユベーシヨンを１時間継続した。

支持体をアセトニトリル、メタノール及びエーテルで
洗浄した。収量は2.6gであり、ジメトキシトリチル放出
はTEF II支持体がｇ当り85μ当量のプライマー密度を有
することを示した。

実施例 ８ TEF II支持体への５′−ジメトキシトリチル−３′−
（ｐ−クロロフエニルホスフエート）−５−（メチル−
¹⁴C）チミジンの付加及びその支持体からの切断 適当な放射線標識チミジンヌクレオチドを得、実施例
７のTFF II支持体上に縮合させ、支持体から選択的に切
断した。この操作は、支持体の選択的切断の面を立証し
た。

５′−ジメトキシトリチル−３′−（ｐ−クロロフエ
ニルホスフエート）−５−（メチル−¹⁴C）チミジンは
次のようにして調製した。冷チミジン（122mg、0.5ミリ
モル）を５−（メチル−¹⁴C）チミジン（ほぼ95μCi/μ
モル）と合わせ、水に溶解し、凍結乾燥し、五酸化リン
上で乾燥させた。この¹⁴C−チミジン混合物を次いで4ml
の無水ピリジン中に溶解し、2mlまで蒸発させた。次い
で、ジメトキシトリチルクロライド（170mg、0.5ミリモ
ル）を添加し、室温で１時間インキユベートさせた。反
応液を次いで氷中に注ぎ、ジクロロメタン中に抽出させ
た。ジクロロメタン相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、
過し、ロト蒸発させてゴム状物にした。このゴム状物を
０℃において2.5％のトリエチルアミンを含有する沸騰
ベンゼンから再結晶させた。結晶を冷ベンゼン／シクロ
ヘキサン（2:1）で洗浄し、真空乾燥した。収量は270mg
（約0.5ミリモル）であり、放射線標識は267nmにおいて
16100cpm/O.D.を与えた。¹⁴C−標識５′−ジメトキシト
リチルチミジンは1mlの無水ピリジン中の貯蔵液として
貯蔵された。

¹⁴C−標識チミジン類似体を次いで1.2mlの無水ピリジ
ン中の245mg（１ミリモル）のｐ−クロロフエニルジク
ロロホスフエート、18.5μ H₂Oを合わせ、及びピリジ
ン中に溶解された400μの５′−ジメトキシトリチル
−５−（メチル−¹⁴C）チミジン貯蔵液を添加すること
によりホスホリル化した。室温において30分後、約10ml
の1Mトリエチルアンモニウムバイカーボネートを添加
し、有機相を酢酸エチルで３回抽出した。有機相をNaCl
水溶液で戻し抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。
次いで有機相を過し、蒸発乾固し、微量のトリエチル
アミンを含有するジオキサンから凍結乾燥した。凍結乾
燥物質を3mlの無水ピリジン中に溶解し、４℃で貯蔵し
た。２％トリエチルアミンを含有するクロロホルム中の
10％メタノールを溶出溶媒として用いるシリカゲルプレ
ート上の薄層クロマトグラフイーは生成物がクロマトグ
ラフ的に純粋であることを示した。シンチレーシヨン計
数は11.5μCiの物質が存在することを示した。

41μモルの¹⁴C標識チミジン類似体をエフイモフの修
正されたトリエステル方法〔V.A.エフイモフ（V.A.Efim
ov）、Nuc.Acid.Res.,10、6675（1982年）〕を用いて50
mgのTEF IIと縮合させた。次いで実施例５に開示された
脱保護及び切断工程を行い、ヌクレオチド放出を各工程
において¹⁴Cの放出により追跡した。結果を以下にまと
めて示す。

この実施例は酸化後に塩基処理を行うことにより選択
的部位が所望通りに***することを立証している。

実施例 ９ DNAハイブリツド形成アフイニテイカラムを合成するた
めのポリメタクリレート支持体系の利用 本発明の実際的な応用を例示するためにポリメタクリ
レート支持体系を核酸分離のための配列特異性アフイニ
テイ支持体として有効に利用した。

ポリメタクリレート支持体は実施例１に記載した操作
に従つて構成した。この支持体はジメトキシトリチル放
出により求めたところ、78μ当量/gのヌクレオシドプラ
イマーを含有した。乾燥樹脂（350mg）を6mm×30mmの寸
法のカラムに充填した。カラムは全ての工程がプログラ
ム可能なように修正されたBIO LOGICALS DNA/RNAシンセ
サイザーに嵌め込まれた。ヌクレオシド類は標準的ホス
ホモノクロリダイト化学の修正方法を用いて逐次添加さ
れた〔M.D.マテウツチ（M.D.Matteucci）及びM.H.カル
ザース（M.H.Caruthers）、Tetrahedron Letters 21:71
9−722（1980年）〕。この標準的操作への修正は、１）
未反応５′ヒドロキシル基の５％N,N−ジメチルアミノ
ピリジン、17.5％無水酢酸、28.2％テトラヒドロフラン
及び49.3％2,6−ルチジンの混合物による保護、及び
２）クロロホルム中４％のジクロロ酢酸によるジメトキ
シトリチル基の除去、を含んだ。

この修正方法を用いて、適当なモノホスホクロロダイ
トの30mM溶液を各ヌクレオチド添加のための支持体と反
応させた。合成された配列はポリメタクリレートプライ
マー−３′ｄ（TTTTGAAATAGGTA）５′であつた。オリゴ
ヌクレオチド合成の完結後、塩基保護基と支持体結合DN
Aを濃水酸化アンモニウムと50℃で８〜18時間反応させ
ることにより除去した。水及び1M塩化ナトリウムで十分
に洗浄後樹脂を乾燥し、末端ジメトキシトリチル基を樹
脂のｇ当り2.30μモルの結合オリゴヌクレオチドにて定
量した。

アフイニテイハイブリツド形成支持体の有用性を評価
するために同一のホスフアイト化学を用いて二つのDNA
配列を構成した。しかしながら、標準的な塩基切断性シ
リカ支持体を使用した〔M.D.マテウツチ及びM.H.カルザ
ース（（M.D.Matteucci and M.H.Caruthers）、Tetrahe
dron Letters 21:719−722（1980年）〕。これらの配列
の一方は、アフイニテイハイブリツド形成支持体に相補
的な14mer即ち５′−ｄ（AAACTTTATCCATC）３′であつ
た。他方の配列なアフイニテイハイブリツド形成支持体
には相補的ではない17mer即ち５′−ｄ（GGAATATTCCCCC
AGGC）３′であつた。これらのDNA配列の両者は標準的
な操作により５′末端において³²P−ATPで標識し、ポリ
アクリルアミドゲル上で精製した〔C.C.リチヤートソン
（C.C.Richardson）、Proc.Nat′1.Acad.Sci.,54:158
（1965年）、及びA.マキサム及びW.ギルバート（A.Maxa
m and W.Gilbert）、Methods of Enzymology,65:449（1
979年）〕。

これらの14mer及び17mer配列について、それらのアフ
イニテイ支持体とハイブリツド形成する能力を試験し
た。これはDNA配列をマフイニテイ支持体と1M塩化ナト
リウム、10mM Tris緩衝液、及び1mM EDTAよりなるpH7.6
の緩衝液の存在下において25℃で２時間インキユベート
させて行われた。ハイブリツド形成しない配列は上記緩
衝液の15の1.5mlのアリコートを用いて洗浄除去され
た。ハイブリツド形成されたオリゴヌクレオチド配列は
次いで水で溶出した。

この比較操作の評価に当り、30％の14mer配列及び５
％未満の17mer配列がアフイチテイカラムに結合してい
ることが判明した。

本発明によるオリゴヌクレオチドの合成のための新規
且つ改良された高分子支持体系は、おだやかに酸性な及
びおだやかに塩基性な反応条件に対する許容性を維持し
ながら単一種類の高分子支持体から全ての合成オリゴマ
ーの便利な且つ定量的な放出を可能にする当該分野にお
いて長く待望されていた汎用性高分子支持体系の要求を
満足させるものである。

以上の説明から、本発明の特別の形態が例示され説明
されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から離れることな
く各種修正がなされることが明らかであろう。従つて、
本発明は以下に掲げる請求の範囲以外からは制限されな
いものである。

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】本質的に高分子支持体とプライマーからな
   るオリゴヌクレオチド合成用担体であって、以下の構
   造： を有するオリゴヌクレオチド合成用担体： ここで、は、固体の高分子支持体であり、は、プリ
   ン塩基またはピリミジン塩基、またはそれらの誘導体で
   あり、 はオリゴヌクレオチド合成における酸性または塩基性の
   脱保護条件下で開裂されず、該固体の高分子支持体に結
   合している、１から50原子のスペーサーであり、R₈は酸
   化性置換基の保護基であり、R₇は−OHの保護基であり、
   R₉はＨ、アルキル、アルコキシ、およびアリールからな
   る群から独立に選ばれる基である。
2. 【請求項２】オリゴヌクレオチドの合成方法であって、
   該方法は、以下の工程： （ａ）本質的に高分子支持体とプライマーからなるオリ
   ゴヌクレオチド合成用担体であって、以下の構造： を有するオリゴヌクレオチド合成用担体： ここで、は、固体の高分子支持体であり、は、プリ
   ン塩基またはピリミジン塩基、またはそれらの誘導体で
   あり、 はオリゴヌクレオチド合成における酸性または塩基性の
   脱保護条件下で開裂されず、該固体の高分子支持体に結
   合している、１から50原子のスペーサーであり、R₈は酸
   化性置換基の保護基であり、R₇は−OHの保護基であり、
   R₉はＨ、アルキル、アルコキシ、およびアリールからな
   る群から独立に選ばれる基である、 を有するオリゴヌクレオチド合成用担体を提供する工
   程、 （ｂ）OR₇のＯの上に、塩基に不安定な保護基を有する
   オリゴヌクレオチドを合成する工程、および （ｃ）該保護基を塩基で脱保護する工程、 を包含する、オリゴヌクレオチドの合成方法。
3. 【請求項３】前記方法が、さらに以下の工程： （ｄ）オリゴヌクレオチド結合部位に対して、ガンマ位
   にある、少なくとも一つの酸化性置換基OR₈を酸化する
   工程、 （ｅ）該オリゴヌクレオチドを、第２の塩基でプライマ
   ーから開裂する工程、および、 （ｆ）該オリゴヌクレオチドを回収する工程、 を包含する、請求の範囲第２項に記載の方法。
4. 【請求項４】前記方法が、さらに以下の工程： （ｄ）該オリゴヌクレオチドを相補的なオリゴヌクレオ
   チドとハイブリダイズさせて２本鎖を形成させる工程、 を包含する、請求の範囲第２項に記載の方法。
5. 【請求項５】前記方法が、さらに以下の工程： （ｅ）オリゴヌクレオチド結合部位に対して、ガンマ位
   にある、少なくとも一つの酸化性置換基OR₈を酸化する
   工程、 （ｆ）該オリゴヌクレオチドを、第２の塩基でプライマ
   ーから開裂する工程、および、 （ｇ）該オリゴヌクレオチドを回収する工程、 を包含する、請求の範囲第４項に記載の方法。