JP4714320B2 - アミノ基転移による固相核酸標識化 - Google Patents
アミノ基転移による固相核酸標識化 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸標識化学に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
核酸を検出可能なプローブで標識化することは、ここ十年の間で分子生物学の研究室では周知技術となってきている。近年の核酸ミクロアレー（microarray：バイオチップとも称されることもある）の開発及び商業的成功は、標識化核酸プローブの使用に基づくところが大きかった。
【０００３】
多くの核酸標識化方法では間接的に標識化しなければならない。言い換えれば、特定の結合対の一部分（例えば、ビオチン）で核酸を標識化し、標的の核酸にハイブリッド形成し、次いで検出可能に標識化された特定の結合対の別の部分（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ−標識化ストレプトアビジン）で視覚化する。近年、核酸の直接標識化は、核酸内のシチジン類の重亜硫酸塩−触媒化アミノ基転移（BCT）を使用して成功を収めている（米国特許第5,506,350号及び同第5,491,224号）。しかしながら、核酸を十分に標識化するのに（２日以上もの）時間がかかるため、溶液中で実施するこれらの直接法は制限されている。
【０００４】
今日、オリゴヌクレオチド類は一般的に、成長するオリゴヌクレオチド鎖を固相に結合しておきながらヌクレオシドモノマーを順に繰り返し付着させることによって該オリゴ類を製造する固相法を使用して製造する。オリゴヌクレオチド類は、例えば、Haralambidisら、Nuc.Acids Res.、18：501-505、1990に記載の如く、合成固相に結合したままで単数または複数種類の蛍光染料分子で修飾されてきた。しかしながら、この方法は充実性腫瘍サンプルまたは血液サンプルから抽出したような複合ゲノムDNAには適用できない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、固体支持体上に固定された核酸をアミノ基転移反応（例えば、重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移[BCT]反応）により反応性基で効率的且つ迅速に機能性化することができるという知見に基づくものである。アミノ基転移に続き、官能基（通常、第１アミノ基）を蛍光染料で誘導体化し、種々の化学反応を使用して固相から分離することができる。通常、これらの反応は以下の特徴：(1)染料の蛍光性を弱めないこと；(2)DNAプローブのハイブリッド形成性を損なわないこと；及び(3)蛍光標識化核酸生成物を高収量で与えること；のひとつ以上を備えていなければならない。
【０００６】
本発明の重要な特徴は、付着化学反応（attachment chemistry）の可逆性である。例えば、BCT及び付着化学反応に対して安定なホスホルアミデート結合を使用して核酸を効率的に付着させることができ、DNAの安定性のため高pH条件下で固体支持体から核酸を効率的に分離することもできる。RNAは高pH条件下で加水分解されてしまうので、RNA標識化での分離段階には熱ホルムアミド処理などの別の分離化学反応が必要であろう。
【０００７】
従って、本発明は、(1)固体支持体（例えば、ビーズまたはクロムメッキガラススライド）に（例えば、共有結合）結合した、シチジン塩基を含む核酸を提供し；(2)反応性基でシチジン塩基を（例えば、重亜硫酸塩触媒化反応により）アミノ基転移して該シチジン塩基と反応性基との間に共有結合を形成し；次いで(3)検出可能な標識を該反応性基に結合することにより、検出可能な基を核酸に結合する方法に関する。
【０００８】
反応性基は、式：
【０００９】
【化７】
【００１０】
（式中、Rは炭素原子2〜14個を含有するアルキレン基であり；
Xは
【００１１】
【化８】
【００１２】
または
【００１３】
【化９】
【００１４】
であり；及び
R1及びR2はそれぞれ独立して、水素及び低級アルキルからなる群から選択される）
であってもよい。さらに前記反応性基は、H2N(CH2CH2X)nCH2CH2NH2[式中、n=1−4、XはO、SO、SO2、Si、またはNR3（式中、R3は低級アルキルである）である]であってもよい。反応性基の一例としては、エチレンジアミンがある。
【００１５】
本発明の方法では、反応性基をトリハロアセテートカオトロープアニオン（例えば、トリフルオロアセテート）を含む溶媒に溶解することができ、検出可能な標識は蛍光分子であってもよく、核酸は約1〜2キロベースの長さであってもよい。
【００１６】
本発明の方法は、場合により固体支持体から核酸を分離することを含む。
核酸は、核酸の末端ホスフェート及びアミノ活性化固体支持体と1-エチル-3-(ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミドとを反応させることにより固体支持体に結合することができる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、(1)固体支持体（例えば、ビーズまたはクロムメッキガラススライド）；(2)固体支持体に結合した、シチジン塩基を含む核酸；(3)該シチジン塩基に共有結合した反応性基；及び(4)該反応性基に結合した検出可能な標識を有する組成物（composition）を含む。
【００１８】
反応性基としては、式：
【００１９】
【化１０】
【００２０】
（式中、Rは炭素原子2〜14個を含有するアルキレン基であり；
Xは
【００２１】
【化１１】
【００２２】
または
【００２３】
【化１２】
【００２４】
であり；及び
R1及びR2はそれぞれ独立して、水素及び低級アルキルからなる群から選択される）
が挙げられる。さらに前記反応性基は、H2N(CH2CH2X)nCH2CH2NH2[式中、n=1−4、XはO、SO、SO2、Si、またはNR3（式中、R3は低級アルキルである）である]であってもよい。反応性基の一例としては、エチレンジアミンがある。
【００２５】
さらに、検出可能な標識は蛍光分子であってもよく、核酸は約1〜2キロベースの長さであってもよく、該核酸は固体支持体に共有結合していてもよい。核酸は、核酸の末端ホスフェート及びアミノ活性化固体支持体と1-エチル-3-(ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミドとを反応させることにより固体支持体に結合することができる。
【００２６】
別の態様では、本発明は、(1)固体支持体に結合した、そのそれぞれがシチジン塩基を含む複数の核酸を提供し；(2)反応性基でそれぞれのシチジン塩基をアミノ基転移してそれぞれのシチジン塩基と反応性基との間に共有結合を形成し；次いで(3)検出可能な標識を該反応性基に結合することにより、そのそれぞれが特徴的な配列を有する複数の核酸に検出可能な標識を結合する方法に関する。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、(1)固体支持体（例えば、ビーズ）；(2)重亜硫酸塩；(3)反応性基；及び(4)検出可能な標識を含有するキットを含む。
本明細書中に記載する固相BCT標識化法は、溶液BCT標識化に必要な時間よりも驚くほど短い時間枠で実施することができる。本発明の新規標識化方法は、多量のDNAサンプルの自動またはロボットによる標識化に特に有用である。さらに、DNAの固相BCT標識化は、固体支持体、検出可能な標識、及び標識化に必要なBCT試薬を含むキットにより容易に実施することができる。
【００２８】
バイオチップの開発によって数千もの遺伝子の発現を同時に測定できるようになり、DNAサンプルの包括的分析に必要な時間が短縮された。しかしながら、多くの場合、全分析時間はサンプルDNAを直接標識化するのに必要な時間によって限定されている。かくして、本発明の方法及びキットは、核酸の効率的且つ迅速な直接標識化を可能とすることにより、包括的DNA分析に必要な時間をさらに短縮する。
【００２９】
さらに、本発明の組成物はDNAサンプルを分析する新規手段を提供する。例えば、固体支持体上に固定化された蛍光標識化DNAサンプルに種々の蛍光標識を含有するプローブDNAをハイブリッド形成させることができる。次いで、プローブにハイブリッド形成する配列の存在を蛍光色の変化により検出する。
【００３０】
他に記載しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同一の意味を有する。本発明の実施または試験のための好適な方法及び材料を以下に記載するが、当業者に公知の本明細書中に記載するものと同等または等価な他の方法及び材料も使用することができる。本明細書中で記載する全ての刊行物、特許出願、特許及び他の文献はその全体を参照として含むものとする。一致しない場合には、定義を含めて本明細書が参照される。さらに、材料、方法及び例は説明のためのものであり、限定するものではない。
【００３１】
本発明の他の特徴及び好都合な点は以下の詳細な説明及び請求の範囲から明らかであろう。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明は、アミノ基転移反応（例えば、重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移反応）による固定化核酸の標識化方法、固体支持体に結合したBCT標識化核酸を含む組成物、及び該標識化反応を実施するのに十分なキットとに関する。
一般的方法論
一般的に、本発明の新規方法は少なくとも３つの段階を含む。第１段階では、標識化すべき核酸を単離し、固体支持体に結合する。第２段階では、固定化核酸の中のシトシンをアミノ基転移反応（例えば、BCT反応）により反応性基に結合する。他の核酸アミノ基転移標識化方法としては、臭素化／アミノ化（Kellerら、Anal.Biochem. 170：441-450、1998）及びプラチナ配位化合物を含む化学反応（欧州特許第0539466B1号）が挙げられる。第３段階では、検出可能な標識を反応性基に結合し、これによって核酸に検出可能な標識を結合する。
【００３３】
第２及び第３段階は、核酸の固定化後は何時でも実施することができる。例えば、第２及び第３段階は固定化核酸、重亜硫酸塩触媒、及び反応性基を含有する蛍光体（fluorophore）コンジュゲートを含有する１回のBCT／標識化反応で同時に実施することができる。反応性基を蛍光体に付着してから、得られたコンジュゲートを固定化DNAに付着することもできる。
核酸の固体支持体への結合
通常、核酸は、標識化に好適にするために生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）から精製または単離する。例えば、末梢血単核細胞を血液サンプルから単離する。次いでmRNAをこれらの細胞から単離し、mRNAからcDNAを合成する。次いで、エタノール沈澱または他の標準方法によりcDNAを精製した後、固体支持体に付着することができる。あるいは、ゲノムDNAを細胞から単離し、所望の範囲のDNAフラグメント長（例えば、0.5〜5キロベース、特に1〜2キロベース）を得るために場合により超音波処理またはエンドヌクレアーゼで消化することによって切断することができる。ゲノムDNAは、Iversonら、Nucl.Acid Res., 15:7823,1987；及びProudnikovら、Anal.Biochem., 259:34-41, 1998に記載の如く化学反応により断片化することもできる。細胞からの核酸の単離及びcDNA合成は、当業者に公知の標準的な方法により実施することができる。さらにこれらの方法を実施するための市販のキットも容易に利用可能である。
【００３４】
サンプルの核酸を単離し、必要により精製したら、核酸を固体支持体に結合する。固体支持体の例としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンまたは架橋アガロース製）及びスライド（例えば、ガラスまたはプラスチック製）が挙げられる。ビーズは続くBCT反応で核酸が存在する表面積が最大となるため、特に好ましい。さらに、アミノ活性化ビーズ[例えば、EAHセファロース（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）、酸化鉄のアミノ機能性化磁気ビーズ（Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, MA）及びアミノ機能性化ポリスチレンミクロスフィア（Polysciences, Inc., Warrington, PA）]は、利用し易く、核酸の付着及び続く分離に使用し易い。
【００３５】
他方、固体支持体に結合させたままでBCT標識化核酸を別の核酸にハイブリッド形成する際には、ガラススライドが特に好適である。ハイブリッド形成後に蛍光標識を検出する場合、クロムメッキガラススライドであれば、サンプル核酸と固体支持体との間の非共有結合が強くバックグラウンド蛍光が低いという点で好都合である。核酸用の固体支持体としてクロムメッキガラス支持体の使用に関する詳細は、米国特許出願第09/085,625号に知見することができる。
【００３６】
固体支持体に核酸を共有結合するためには、当業界で公知の任意の多数の化学反応を使用することができる。例えば、BCTは核酸の標識化だけでなく、固体支持体に核酸を付着するのにも使用することができる（米国特許第5,082,935号）。さらに、1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDAC）を使用してアミノ機能性化固体支持体[例えば、ポリスチレン（Zammatteoら、Anal.Biochem., 236:85-94, 1996）]にカルボジイミド縮合反応により核酸の末端ホスフェートを結合することができる。
核酸の重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移
核酸の重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移は反応性基をシチジンのN4原子に結合する特異的な反応である。BCT反応の前、その間またはその後に検出可能な標識を反応性基に結合し、これによって核酸を標識化する。BCT化学反応については、Schulmanら、Nucl. Acids Res., 9:1203-1216(1981)；Gilliamら、Anal. Biochem., 157:199-207(1986)；Hayatsu、Prog. Nucl. Acid Res. Mol.Biol.、16:75-124(1976)；及びDraper、Nucl. Acids Res., 12:989-1002(1984)により詳細に記載されている。
【００３７】
BCTで使用する出発反応性基は少なくとも２個の置換基を有する有機化合物であってもよい。第１の置換基は、核酸中のシチジンヌクレオチドと反応することができる。第１の置換基の例としては、（第１及び第２）アルキルアミノ、ヒドラジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、及びアシルヒドラジド部分が挙げられる。
【００３８】
反応性基の第２の置換基は検出可能な標識分子と反応することができる。第１の置換基により反応性基にシチジンを結合する間、第２の置換基は無差別的な反応性から保護するためにブロックされていてもブロックされていなくてもよい。ブロックされていてもブロックされていなくても、第２の置換基はシチジンに反応性基を結合するアミノ基転移反応において他の分子とは実質的に非反応性でなければならない。第２の置換基の例としては、アミノ、カルボキシル、ホスフェート、スルホネート、スルフヒドリル、ヒドロキシル、ヒドラジド、セミカルバジド、及びチオセミカルバジドが挙げられる。カルボキシル基は塩、酸またはエステル形であってもよい。塩の形である場合、カチオンはアルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）であってもよい。
【００３９】
有機反応性基において、第１及び第２の置換基は隣接する炭素原子上であっても、またはかなり離れていてもよい。反応性基は直鎖、分岐または環式炭化水素であってもよく、エーテルまたはチオエーテル結合を含む。
【００４０】
好適な反応性基の別の例としてはジアミンがある。ジアミンとしては、反応性基はプロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、及びノニレン基、例えば、CH3NH(CH2)2NH2及びCH3NH(CH2)2NHCH3が挙げられる。ヒドロキシル化炭化水素類を含むジアミン類も好適な反応性基であり、1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン；1,4-ジアミノ-2,3-ジヒドロキシブタン；1,5-ジアミノ-2,3,4-トリヒドロキシペンタン；1,6-ジアミノ-1,6-ジヒドロキシ-D-マンニトール；1,6-ジアミノ-2,3,4,5-テトラヒドロキシヘキサン；トランス-1,2-ジアミノ-3,4,5,6-テトラヒドロキシシクロヘキサンが挙げられる。
【００４１】
他の好適な反応性基としては特定のアミノ酸、イソピペコリン酸、グルコサミン酸、及び6-アミノヘキサン酸が挙げられる。反応性基は1000ダルトン未満（例えば、500、250、100または50ダルトン未満）の分子量を有することができる。幾つかはBCT反応で損なわれる官能基を含むため、全てのアミノ酸が好適ではない。例えば、硫黄含有アミノ酸（例えば、シスチンまたはシステイン）は不適当である。他方、硫黄がスルフィドの形態であるため、メチオニンは好適である。勿論幾つかのアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン、及びイソバリン）はさらなる合成ができない側鎖を有する。リシンまたはオルニチンは特に有用なアミノ酸である。
【００４２】
その蛍光が結合ペプチドにより得られる化学的環境により増強される予め付着させた染料分子をペプチド鎖に含ませることができるため、ペプチド類は特に好適な反応性基である。これらの染料分子は、500〜10,000ダルトンの範囲の分子量を有することができる。BCTが実質的な速度で起きるためには、比較的高濃度（0.02〜2M、特に0.2〜2M）の反応性リガンドが必要なので、溶解性は束縛因子である。
【００４３】
化学反応の効率を高めるために、BCT反応は、カオトロープアニオン溶媒（例えば、トリハロアセテート）中で実施することができる。二次構造を形成する核酸はBCTに対して感受性が低いことが知られている。カオトロープは変性または一本鎖構造に核酸を保持し易いので、BCT反応混合物中にカオトロープが含まれるのは望ましい。トリフルオロ酢酸（TFA）は核酸アミノ基転移反応に特に好適であることが知見された。
検出可能な標識の反応性基への結合化
本発明の実施で使用する出発原料の検出可能な標識分子は、反応性基の第２の置換基と反応し得る少なくとも１個の標識部分を含む。標識部分はアミノ、カルボキシル、アルデヒド基、イソチオシアネート、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルハライド、またはカルボン酸基であってもよい。所望の特定の標識部分は反応性基の第２の置換基の性質に依存し、同様に第２の置換基の選択は、使用する標識部分に依存する。サンプル核酸の標的へのハイブリッド形成の妨害を最小化するために、標識分子は5000ダルトン未満（例えば、2500、1000、または500ダルトン未満）でなければならない。
【００４４】
検出可能な標識分子が蛍光体である場合、該蛍光体は励起波長で少なくとも約6,000M-1cm-1（例えば、少なくとも10,000M-1cm-1）の吸光係数、及び少なくとも約0.02の量子収量を有することができる。検出可能な標識分子の例としては、アミノ機能性化蛍光体（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR製）、例えば、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸、スクシンイミジルエステル（AMCA）；スルホローダミン101スルホニルクロリド（Texas Red：商標）；5-(及び6-)カルボキシルローダミン101、スクシンイミジルエステル；リッサミン（lissamine）ローダミンBスルホニルクロリド；5-（及び6-）カルボキシルフルオロセイン、スクシンイミジルエステル；7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸、スクシンイミジルエステル；テトラメチルローダミン-5-（及び6-）イソチオシアネート；N-（4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-3-インダセンプリオピオニン酸）、スクシンイミジルエステル；活性化フルオロセイン誘導体（FAP）；エオシン-5-イソチオシアネート；エリトロシン-5-イソチオシアネート、及び1-ヒドロキシ-3,6,8-ピレントリスルホン酸のO-アセチルアジド誘導体（Cascade Blue（商標）アセチルアジド）が挙げられる。
【００４５】
検出可能な標識に反応性基を結合する反応条件は、公知である（例えば、米国特許第5,506,250号参照）。
使用
本発明の方法は、生化学または分子生物学で通常の能力を有する研究者によって実施することができる。例えば、研究者らは、例えば、5.0μg〜1.0mgスケールで任意の幾つかの蛍光体で核酸を化学的に標識するために、固体支持体（例えば、アミノ活性化セファロースビーズ）、重亜硫酸塩溶液、反応性基（例えば、エチレンジアミン）、及び検出可能な標識（例えば、アミノ活性化蛍光体）を含む本発明のキットを使用することができる。標識すべき核酸サンプルを精製及び／または単離したら、上記の如く核酸をビーズに結合し標識化する。反応の各段階はビーズを使用すると容易であり、これにより遠心分離を使用して迅速に洗浄段階を実施することができる。
【００４６】
あるいは、本発明のキットは、それぞれのウエルを標準法によりアミノ機能性化することができるポリスチレン製の96-ウエルマイクロタイタープレートを含むことができる。複数の核酸サンプルをウエルに結合し、それぞれの核酸サンプルを他のサンプルとは別に保持しながら(同時に標識化することができる。
【００４７】
さらに、研究者が反応段階を実施するよりもむしろ、自動化またはロボット制御化装置を使用して同時に及び／または連続して多量の（例えば、数百から数千の）核酸サンプルを処理及び標識化することができる。本発明の方法を自動化するための好適な装置及びシステムとしては、Biomek 2000システム（Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA）及びBioRobot 9600システム（Qiagen, N.V., Venlo, オランダ製）が挙げられる。Biomek 2000及びBioRobot 9600製品はいずれも、本発明の方法を実施するために必要な集積コンピューター制御及びモニタリングを使用する。
【００４８】
本発明の組成物及びキットは、本発明の方法で使用し得るミクロチップも含む。本明細書中で使用するミクロチップまたは「チップ」とは、DNA分析で使用するミクロアレーデバイスを記載するために使用する。これらのミクロデバイスは好適なガラスまたはクロムコートガラス面に固定化した遺伝子座特異的DNA配列の二次元アレーからなる。この試験DNAを例えば、赤蛍光標識化した参照DNAと共にチップ表面で同時ハイブリッド形成する際に、表面結合DNAフラグメントのアレーを使用してハイブリッド形成により（通常、緑の蛍光で標識化した）数百の試験片の遺伝子座を同時分析することができる。次いで緑／赤の蛍光比を測定すると、点在するDNAの表面アレーにより表された特定の遺伝子座での相対的コピー数の尺度が得られる。
【００４９】
しかしながら、MEMS（小型化電気機械システム）分野では、通常、ミクロチップなる用語は、種々の機械的または化学的検出操作[例えば、動作検出（エアバッグ配備センサー）、インクジェットプリントヘッドまたは生化学センサー（ポータブル血液アナライザ）]を実施し得る任意の小型化装置について記載するためにずっと広い意味で使用される。これらのMEMS装置は、当業者により日常的に実施される高解像度表面エッチング法によりシリコンウエハ中に通常、微細機械加工されている。ガラスまたはプラスチックから構成されたMEMS装置も製造することができる。多くの化学的検出用途では、チャネルに電圧を適用することにより生じた電気浸透圧流（EOF）によりガラスチャネルに、または小型化ダイアフラムポンプによりシリコンエッチング化チャネル中に流体が移動する。ミクロチャネルに沿って流体が流れる装置は、ミクロ流体装置（microfluidics devices）と称される。ミクロ流体系の開発の現状の時宜的な総説(については、Chemical & Engineering News, 1999年2月22日、27-36頁（American Chemical Society, Wachington DC, 米国）に知見することができる。
【００５０】
自動直接標識化は、Cepheid Inc., Suunyvale, CA（www.Cepheid.com）により製造され、Petersenら、IVD Technol. 4:43-49,1998に記載されたミクロ流体装置または「ピラーチップ（pillar chip）」でも実施することができる。これらのピラーチップ（約5×5mm2）はシリコンウエハ上にエッチングされた小さなチャンバ（3.5mm2、全内表面積36mm2）内に突出する数千の珪素フィンガー（200μm高さ及び34μm中心）から形成(されている。ウエハに結合したガラスカバープレートによりチャンバをシールする。対向する対角線のチップに機械加工された入口及び出口により流体がチップ内に導入される。
【００５１】
最初に製造したままでは、チップは生物学的リガンドが付着しにくい純粋珪素である。しかしながら、表面を酸化して二酸化珪素の薄層を製造すると、種々の表面修飾化学反応を利用することができる。例えば、シラン活性化剤を使用することにより、続いて表面に生化学リガンドを付着するのに使用し得る、例えば、アミノ、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたはエポキシド反応性基で表面の酸化珪素を機能性化することができる。例えば、二酸化珪素チップ表面の3-アミノプロピルトリメトキシシランとの反応によりアミノ基で修飾した表面が得られ、これに、本明細書に記載のポリマービーズにこれらの核酸を付着するのに使用するEDACカルボジイミド結合手段により、末端ホスホモノエステル基を含有する二本鎖または一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを共有結合することができる。また、Joosら、Anal. Biochem. 247:96-101, 1997は、アミノプロピルシラン修飾ガラス固相へのカルボキシル化オリゴヌクレオチドのカルボジイミド活性化結合について記載する。
【００５２】
アミノ機能性化チップ表面は、米国特許第5,091,519号に記載のBCT反応により核酸とも反応することができる。エポキシド修飾ガラス顕微鏡スライド面上でのオリゴのインサイチオ合成に関しては、本明細書中参照として含まれるMaskosら、Nuc. Acids Res. 20:1679-1684、1992を参照されたい。エポキシド機能性化ガラス表面を上記Maskosらに示されるようにヒドロキシル面に転化すると、臭化シアン活性化によって核酸を付着させることができる。スルフヒドリル修飾ガラススライド面へのオリゴの付着に関しては、例えば、Rogersら、Anal. Biochem. 266:23-30、1999を参照されたい。
【００５３】
DNAの可逆性付着は、上記EDAC/ホスホルアミデート法で実施することができる。スルフヒドリル固相およびDNAと支持体との間のジスルフィド結合は還元剤で切断可能であるが、ジスルフィド結合はBCT条件では安定ではない。
【００５４】
全内部表面積が約0.3cm2で、理論最大結合能が1014分子/cm2（約5×10-11モル/チップ）であると、チップは約8μgの500bp二本鎖ゲノムDNAフラグメントを結合することができる。実際の充填能が理論量の1〜5％の場合であっても、チップはDNAミクロアレー上での分析に関し十分なゲノムDNAを標識できるはずである。
【００５５】
ピラーチップ（またはビーズ）を使用する別のアプローチとしては、例えば、DNAを固相に結合させたままで蛍光ヌクレオチドを用いるニックトランスレーションによりDNAを酵素的に標識化することがある。DNAを固相から分離し、参照DNAと混合し、ミクロアレー上に流すことができる。将来的には、ミクロアレーは、DNA単離、標識化、ハイブリッド形成、及び分析をすることができる統合された(ミクロ流体分析システムの一成分となるだろう。
【００５６】
【実施例】
本発明を以下の実施例により詳細に記載する。本実施例は、請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：固体支持体上での核酸の重亜硫酸塩仲介蛍光標識化
市販のアミノ化ジアミノジプロピルアミン（DADPA）ビーズ（Pierce Catalog No.53147）50マイクロリットルを、0.2M 1-エチル-3-（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDAC)及び0.1M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES, pH6.0）の存在下、超音波処理し熱変性させたヒト胎盤ゲノムDNA 50μgと混合した。この混合物を50℃で1時間インキュベートした。別の実験で、室温で一晩インキュベートしたものでもDNAをビーズに結合させるのに十分であった。
【００５７】
固相結合法により、50μgの出発材料DNAのうち約35μgが強く結合したことが知見された。結合は、0.2M MOPS（pH7.4）中または50mM NaCl中で65℃で310分までのインキュベーションに安定であった。50μgの出発材料DNAのうち約10μgはビーズに弱く結合しており、62.5mM硼酸ナトリウム及び1.25M NaCl（pH8.5）中、65℃で6分以上DNA/ビーズ混合物をインキュベートすることにより除去することができた。
【００５８】
次いでビーズを二回蒸留した水（ddH2O）で1分ずつ5回洗浄した。遠心分離し、上清を分離し、次いで水中に再懸濁することにより洗浄を実施した。DNAを95℃で5分間変性し、続いて氷浴中に浸漬することにより急冷した。変性及び冷却後も、50μgの出発材料DNAのうち約33μgはビーズに結合していたことが知見された。
【００５９】
トリフルオロ酢酸（TFA）1.53mlを脱イオン水2.5mlに添加することによりアミノ基転移緩衝液を製造した。この緩衝液を10分間放冷した。次いで、エチレンジアミン0.87ml（遊離塩基；Sigma Catalog. No.E4379）を氷上でゆっくりと緩衝液に添加した。エチレンジアミンが溶解した後、緩衝液を室温に温めた。メタ重亜硫酸ナトリウム0.475g（Aldrich Catalog. No.25,555-6）を緩衝液に添加し、緩衝液を45℃に温めて重亜硫酸塩を溶解させた。緩衝液のpHをTFAを添加して7.0に調整し、緩衝液の容積を5mlに調整した。次いで、ヒドロキノン100mg/ml溶液の50μlを緩衝液に添加した。
【００６０】
固定化DNAをアミノ基転移するために、重亜硫酸塩アミノ基転移緩衝液125μlをDNA/ビーズ混合物に添加し、この混合物を65℃で20分インキュベートしてDNA中のシトシンにエチレンジアミンを付着させた。別の実験で、室温で一晩DNAをアミノ基転移するのも許容可能であることが知見された。ビーズを再びddH2Oで5回洗浄して、過剰の緩衝液を除去した。
【００６１】
次いでビーズをカルボキシXローダミンNHSエステル標識用緩衝液（62.5mM硼酸ナトリウム、1M NaCl［pH8.5］、及び15%[v/v]DMF中、2〜5mM蛍光体）550μl中に懸濁させた。ビーズを標識用緩衝液中、50℃で1時間インキュベートし、次いでddH2Oで5回洗浄して標識用緩衝液を除去した。別の実験では、室温で16時間で標識化を実施した。
【００６２】
標識化DNAを分離するために、ビーズを50mM NaOH 0.1ml中、65℃で1時間インキュベートした。（時間がかかるが、ホルムアミド中、75℃で72時間インキュベートすることによってもDNAをビーズから分離することができた。ホルムアミド変性溶液は、ホルムアミド49ml、20×SSC 7ml、水14mlを混合することにより製造し、pH7.5で70%ホルムアミド溶液となった。）標識化DNA約15μgをこの最初のインキュベーション液から回収した。別のDNA約10μgを50mM NaCl中65℃でさらに1時間処理することによって回収した。通常DNAの分離効率は、時間、温度、pHを変えたり、または触媒を添加することによって最適化することができる。標識化DNA溶液を3M酢酸ナトリウム0.1容積で中和してpHを6.0とした。次いで、DNAをエタノール沈澱により単離した。
【００６３】
上記方法を繰り返してヒト胎盤ゲノムDNAを6-(フルオロセイン-5-(及び-6)-カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル及び5,6-カルボキシテトラメチルローダミンNHSエステルで標識化した。
実施例２：中期染色体を視覚化するための蛍光標識化核酸の使用
上記実施例１で製造した5,6-カルボキシXローダミンNHSエステル、6-(フルオロセイン-5-(及び5-)-カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル、及び5,6-カルボキシテトラメチルローダミンNHSエステル標識化DNAをそれぞれ、米国特許第5,776,688号に記載の通りヒト一次リンパ球中期染色体にインサイチオハイブリッド形成した。標識は染色体構造に特異的であり、シグナル強度は全３種類の標識に対して中−良であった。
実施例３：AmpliOnc （登録商標）バイオチップ上での蛍光標識化核酸の使用
ヒト大腸ガン細胞(colo 320)由来の6-(フルオロセイン-5-(及び6-)カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル標識化試験DNA及び5,6-カルボキシXローダミンNHSエステル標識化正常ヒト参照DNAを以下の如く製造した。
【００６４】
超音波処理したcolo 320DNA(50μl中50μg、平均フラグメントサイズ300〜3000bp)を95℃で5分間加熱変性し、氷上で急冷した。DADPAビーズ懸濁液(Pierce)50μlを水中で繰り返し洗浄し、水中で懸濁して、ビーズの終容積＋上清を25μlとした。このビーズ懸濁液にDNA溶液、続いて、0.5M MES緩衝液25μl及び0.5M EDAC25μlを添加した。混合物を50℃で1時間加熱した。ビーズを濾別し、水250μlで5回洗浄した。最終的にビーズを100μl水中に懸濁した。50mM NaOH、65℃で1時間処理すると、このビーズ懸濁液のアリコート10μlからDNA 3.1μgが分離した。
【００６５】
ビーズ懸濁液10マイクロリットル（DNA 5μgと名目的に等価であり、全ての投入したDNAが結合したことを確認した）を取り出し、水50μl中に懸濁した。混合物を95℃で5分間加熱し、氷上で急冷した。ビーズを遠心分離により単離し、上清を取り除き、予め65℃に温めておいた新しく製造したTFAアミノ化混合物(125μl)を添加した。混合物を65℃で10分間加熱した。アミノ化反応物を氷上で迅速に冷却し、ビーズを水中で繰り返し洗浄した。
【００６６】
ビーズを標識用緩衝液(0.1M 硼酸ナトリウム；1Mクエン酸ナトリウム、pH8.2)110μl中に懸濁した。次いで、6-(フルオロセイン-5-(及び-6-)-カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル(FCHA-NHS、DMF中20mM)22μlを添加した。混合物を50℃で1時間加熱した。ビーズを遠心分離により単離し、水で繰り返し洗浄した。
【００６７】
ビーズを50mM NaOH100μl中に懸濁し、65℃で1時間加熱した。ビーズを遠心分離フィルターを介して遠心分離により単離し、完成した標識化プローブを含む濾液を集めた。
【００６８】
濾液に酢酸ナトリウム0.1容積及びエタノール2.0容積を添加した。混合物を-20℃で15分冷却し、遠心分離してDNAペレットとして回収した。このペレットを70%エタノール水溶液で洗浄し、60μl水中に溶解し、続いてBiospin30カラム(BioRad, Hercules, CA)を通すことによりさらに精製した。プローブ溶液の終容積は65μlであった。
【００６９】
プローブ溶液15マイクロリットルをCot 1 DNA(ブロック用DNA；以下参照)100μgと5,6-カルボキシXローダミン標識化男性参照DNA200ngと混合した。次いでDNA混合物を上記の如くエタノール沈澱させた。標準プロトコルを使用してヒトリンパ球でコートした顕微鏡スライド上でCot-ブロック化colo 320DNAをハイブリッド形成した(実施例２参照)。Colo 320細胞株中に存在する第8番染色体の増幅c-myc遺伝子座は、よいシグナル強度とバックグラウンドのもと、中期核中に2個の緑色の蛍光点として現れた。
【００７０】
FCHA標識化colo 320プローブ15マイクロリットルと5,6-カルボキシXローダミン標識化男性参照DNA 5μl(500ng)をSpeedVac濃縮器中で蒸発乾涸させた。水5.4μlに、Cot 1 DNA 5.4μl(100μg)及びハイブリダイゼーション緩衝液(50%ホルムアミド、2×SSC、10%硫酸デキストラン)16.2μlを添加した。プローブDNA混合物を80℃で10分間熱変性し、37℃で2時間プレハイブリッド形成し、AmpliOnc(商標)ミクロアレーに適用し、次いで37℃で一晩ハイブリッド形成した。37℃のインキュベータからチップを取り出して洗浄した。チップを室温で1×SSCで2分間3回洗浄し、続いて50%ホルムアミド/2×SSC中40℃で10分間3回洗浄し、最終的に室温で1×SSCで2分間3回洗浄した。ミクロアレーを数分間風乾した。DAPI対比染色剤含有ゲルマウントを添加し、緑/赤蛍光比を自社製蛍光画像化装置(以下参照)で定量化した。
【００７１】
ガン細胞DNAは増幅c-myc遺伝子を持つことが知られている。標識化DNAを使用してAmpliOnc(商標)(Vysis, Inc.)DNAバイオチップにハイブリッド形成させた。
【００７２】
AmpliOnc(商標)チップはヒトガンに関与することが知られている遺伝子を表す核酸のミクロアレーを含む。例えば、ラムダファージDNAを含有する負の対照点も含まれる。それぞれのガン遺伝子はミクロアレー上で5個の個別の点として表される。使用時には、AmpliOnc(商標)チップを、ひとつの色の蛍光体で標識化した正常参照DNAサンプルおよび別の色の蛍光体で標識化した試験DNAサンプルとハイブリッド形成させる。増幅ガン遺伝子を検出するためには、ガン遺伝子を表す全ての点は試験DNAと結合した蛍光体により不均衡に着色するだろう。未増幅遺伝子を表す点は双方の蛍光体のほぼ等量を有するはずである。
【００７３】
AmpliOnc(商標)チップをハイブリッド形成緩衝液25μlで37℃で16時間ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成緩衝液は、50%(v/v)ホルムアミド、Cot 1 DNA 4μg/μl、6-(フルオロセイン-5-(及び-6-)-カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル標識化Colo 320DNA 500ng、及びSpectrumRedヒト参照DNA500ngを追加した2×SSCであった。Cot 1 DNAは、反復要素が豊富なヒトゲノムDNA画分であり、これを使用して、ヒト試験標本から単離した標識化DNAプローブ中に常に存在する反復要素のハイブリッド形成を抑制またはブロックした。反復要素からのシグナルは特徴的な配列DNA由来のシグナルと混同して不明瞭とするであろう。次いでチップを洗浄し、標準プロトコルを使用して画像化した。
【００７４】
チップから発生したシグナルの定量測定をVysis, Inc.(Downers Grove, IL)で開発したラージフィールド蛍光画像化システムで実施した。画像システムは、450W キセノンアークランプ(SLM Instruments Inc., Champaign Urbana, IL)、帯電結合装置検出器(charge coupled device detector：CH200, Photometrics, Tucson, AR)、及び3種類の通常使用される蛍光染料（青に関してはDAPI、緑に関してはフルオロセインイソチオシアネート(FITC)、及び赤に関してはテキサスレッド(TRED)）用のフィルターセット(Chroma Technology, Brattleboro, VT)からなっていた。画像化システムは、画像取得/分析ソフトウエア(IpLab, Signal Analytics, Corp., Vienna, VA)でPower Macintosh 7100/80で制御した。
【００７５】
ハイブリッド形成したチップのバックグラウンド蛍光は低く、ニックトランスレーション標識化DNAと同等であった。それぞれの点に関して緑及び赤の蛍光を定量し、データを表１にまとめた。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
表１のそれぞれの値はその標準偏差と共に報告される。青い蛍光はDAPI、すなわちスポット位置におけるDNAの存在を確認するのに必要な一般的なDNA対比染色剤による。Colo 320DNAのc-myc腫瘍遺伝子の予想された増幅は、Colo 320 DNAに関して強い緑の蛍光(755カウント)により示され、正常ヒトDNAの比較的低い赤い蛍光(39カウント)と比較して24倍の増幅であった(表１の標的17)。さらに、ラムダファージ点に結合した標識化DNAが低レベルであったことは、非特異的結合が殆どなかったことを示していた。
他の態様
本発明を詳細な記載と共に記載してきたが、上記記載は本発明を単に説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は請求の範囲に定義されることが理解されよう。他の態様、好都合な点及び変形は、請求の範囲内に含まれる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸標識化学に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
核酸を検出可能なプローブで標識化することは、ここ十年の間で分子生物学の研究室では周知技術となってきている。近年の核酸ミクロアレー（microarray：バイオチップとも称されることもある）の開発及び商業的成功は、標識化核酸プローブの使用に基づくところが大きかった。
【０００３】
多くの核酸標識化方法では間接的に標識化しなければならない。言い換えれば、特定の結合対の一部分（例えば、ビオチン）で核酸を標識化し、標的の核酸にハイブリッド形成し、次いで検出可能に標識化された特定の結合対の別の部分（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ−標識化ストレプトアビジン）で視覚化する。近年、核酸の直接標識化は、核酸内のシチジン類の重亜硫酸塩−触媒化アミノ基転移（BCT）を使用して成功を収めている（米国特許第5,506,350号及び同第5,491,224号）。しかしながら、核酸を十分に標識化するのに（２日以上もの）時間がかかるため、溶液中で実施するこれらの直接法は制限されている。
【０００４】
今日、オリゴヌクレオチド類は一般的に、成長するオリゴヌクレオチド鎖を固相に結合しておきながらヌクレオシドモノマーを順に繰り返し付着させることによって該オリゴ類を製造する固相法を使用して製造する。オリゴヌクレオチド類は、例えば、Haralambidisら、Nuc.Acids Res.、18：501-505、1990に記載の如く、合成固相に結合したままで単数または複数種類の蛍光染料分子で修飾されてきた。しかしながら、この方法は充実性腫瘍サンプルまたは血液サンプルから抽出したような複合ゲノムDNAには適用できない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、固体支持体上に固定された核酸をアミノ基転移反応（例えば、重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移[BCT]反応）により反応性基で効率的且つ迅速に機能性化することができるという知見に基づくものである。アミノ基転移に続き、官能基（通常、第１アミノ基）を蛍光染料で誘導体化し、種々の化学反応を使用して固相から分離することができる。通常、これらの反応は以下の特徴：(1)染料の蛍光性を弱めないこと；(2)DNAプローブのハイブリッド形成性を損なわないこと；及び(3)蛍光標識化核酸生成物を高収量で与えること；のひとつ以上を備えていなければならない。
【０００６】
本発明の重要な特徴は、付着化学反応（attachment chemistry）の可逆性である。例えば、BCT及び付着化学反応に対して安定なホスホルアミデート結合を使用して核酸を効率的に付着させることができ、DNAの安定性のため高pH条件下で固体支持体から核酸を効率的に分離することもできる。RNAは高pH条件下で加水分解されてしまうので、RNA標識化での分離段階には熱ホルムアミド処理などの別の分離化学反応が必要であろう。
【０００７】
従って、本発明は、(1)固体支持体（例えば、ビーズまたはクロムメッキガラススライド）に（例えば、共有結合）結合した、シチジン塩基を含む核酸を提供し；(2)反応性基でシチジン塩基を（例えば、重亜硫酸塩触媒化反応により）アミノ基転移して該シチジン塩基と反応性基との間に共有結合を形成し；次いで(3)検出可能な標識を該反応性基に結合することにより、検出可能な基を核酸に結合する方法に関する。
【０００８】
反応性基は、式：
【０００９】
【化７】
（式中、Rは炭素原子2〜14個を含有するアルキレン基であり；
Xは
【００１１】
【化８】
または
【００１３】
【化９】
であり；及び
R1及びR2はそれぞれ独立して、水素及び低級アルキルからなる群から選択される）
であってもよい。さらに前記反応性基は、H2N(CH2CH2X)nCH2CH2NH2[式中、n=1−4、XはO、SO、SO2、Si、またはNR3（式中、R3は低級アルキルである）である]であってもよい。反応性基の一例としては、エチレンジアミンがある。
【００１５】
本発明の方法では、反応性基をトリハロアセテートカオトロープアニオン（例えば、トリフルオロアセテート）を含む溶媒に溶解することができ、検出可能な標識は蛍光分子であってもよく、核酸は約1〜2キロベースの長さであってもよい。
【００１６】
本発明の方法は、場合により固体支持体から核酸を分離することを含む。
核酸は、核酸の末端ホスフェート及びアミノ活性化固体支持体と1-エチル-3-(ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミドとを反応させることにより固体支持体に結合することができる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、(1)固体支持体（例えば、ビーズまたはクロムメッキガラススライド）；(2)固体支持体に結合した、シチジン塩基を含む核酸；(3)該シチジン塩基に共有結合した反応性基；及び(4)該反応性基に結合した検出可能な標識を有する組成物（composition）を含む。
【００１８】
反応性基としては、式：
【００１９】
【化１０】
（式中、Rは炭素原子2〜14個を含有するアルキレン基であり；
Xは
【００２１】
【化１１】
または
【００２３】
【化１２】
であり；及び
R1及びR2はそれぞれ独立して、水素及び低級アルキルからなる群から選択される）
が挙げられる。さらに前記反応性基は、H2N(CH2CH2X)nCH2CH2NH2[式中、n=1−4、XはO、SO、SO2、Si、またはNR3（式中、R3は低級アルキルである）である]であってもよい。反応性基の一例としては、エチレンジアミンがある。
【００２５】
さらに、検出可能な標識は蛍光分子であってもよく、核酸は約1〜2キロベースの長さであってもよく、該核酸は固体支持体に共有結合していてもよい。核酸は、核酸の末端ホスフェート及びアミノ活性化固体支持体と1-エチル-3-(ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミドとを反応させることにより固体支持体に結合することができる。
【００２６】
別の態様では、本発明は、(1)固体支持体に結合した、そのそれぞれがシチジン塩基を含む複数の核酸を提供し；(2)反応性基でそれぞれのシチジン塩基をアミノ基転移してそれぞれのシチジン塩基と反応性基との間に共有結合を形成し；次いで(3)検出可能な標識を該反応性基に結合することにより、そのそれぞれが特徴的な配列を有する複数の核酸に検出可能な標識を結合する方法に関する。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、(1)固体支持体（例えば、ビーズ）；(2)重亜硫酸塩；(3)反応性基；及び(4)検出可能な標識を含有するキットを含む。
本明細書中に記載する固相BCT標識化法は、溶液BCT標識化に必要な時間よりも驚くほど短い時間枠で実施することができる。本発明の新規標識化方法は、多量のDNAサンプルの自動またはロボットによる標識化に特に有用である。さらに、DNAの固相BCT標識化は、固体支持体、検出可能な標識、及び標識化に必要なBCT試薬を含むキットにより容易に実施することができる。
【００２８】
バイオチップの開発によって数千もの遺伝子の発現を同時に測定できるようになり、DNAサンプルの包括的分析に必要な時間が短縮された。しかしながら、多くの場合、全分析時間はサンプルDNAを直接標識化するのに必要な時間によって限定されている。かくして、本発明の方法及びキットは、核酸の効率的且つ迅速な直接標識化を可能とすることにより、包括的DNA分析に必要な時間をさらに短縮する。
【００２９】
さらに、本発明の組成物はDNAサンプルを分析する新規手段を提供する。例えば、固体支持体上に固定化された蛍光標識化DNAサンプルに種々の蛍光標識を含有するプローブDNAをハイブリッド形成させることができる。次いで、プローブにハイブリッド形成する配列の存在を蛍光色の変化により検出する。
【００３０】
他に記載しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同一の意味を有する。本発明の実施または試験のための好適な方法及び材料を以下に記載するが、当業者に公知の本明細書中に記載するものと同等または等価な他の方法及び材料も使用することができる。本明細書中で記載する全ての刊行物、特許出願、特許及び他の文献はその全体を参照として含むものとする。一致しない場合には、定義を含めて本明細書が参照される。さらに、材料、方法及び例は説明のためのものであり、限定するものではない。
【００３１】
本発明の他の特徴及び好都合な点は以下の詳細な説明及び請求の範囲から明らかであろう。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明は、アミノ基転移反応（例えば、重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移反応）による固定化核酸の標識化方法、固体支持体に結合したBCT標識化核酸を含む組成物、及び該標識化反応を実施するのに十分なキットとに関する。
一般的方法論
一般的に、本発明の新規方法は少なくとも３つの段階を含む。第１段階では、標識化すべき核酸を単離し、固体支持体に結合する。第２段階では、固定化核酸の中のシトシンをアミノ基転移反応（例えば、BCT反応）により反応性基に結合する。他の核酸アミノ基転移標識化方法としては、臭素化／アミノ化（Kellerら、Anal.Biochem. 170：441-450、1998）及びプラチナ配位化合物を含む化学反応（欧州特許第0539466B1号）が挙げられる。第３段階では、検出可能な標識を反応性基に結合し、これによって核酸に検出可能な標識を結合する。
【００３３】
第２及び第３段階は、核酸の固定化後は何時でも実施することができる。例えば、第２及び第３段階は固定化核酸、重亜硫酸塩触媒、及び反応性基を含有する蛍光体（fluorophore）コンジュゲートを含有する１回のBCT／標識化反応で同時に実施することができる。反応性基を蛍光体に付着してから、得られたコンジュゲートを固定化DNAに付着することもできる。
核酸の固体支持体への結合
通常、核酸は、標識化に好適にするために生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）から精製または単離する。例えば、末梢血単核細胞を血液サンプルから単離する。次いでmRNAをこれらの細胞から単離し、mRNAからcDNAを合成する。次いで、エタノール沈澱または他の標準方法によりcDNAを精製した後、固体支持体に付着することができる。あるいは、ゲノムDNAを細胞から単離し、所望の範囲のDNAフラグメント長（例えば、0.5〜5キロベース、特に1〜2キロベース）を得るために場合により超音波処理またはエンドヌクレアーゼで消化することによって切断することができる。ゲノムDNAは、Iversonら、Nucl.Acid Res., 15:7823,1987；及びProudnikovら、Anal.Biochem., 259:34-41, 1998に記載の如く化学反応により断片化することもできる。細胞からの核酸の単離及びcDNA合成は、当業者に公知の標準的な方法により実施することができる。さらにこれらの方法を実施するための市販のキットも容易に利用可能である。
【００３４】
サンプルの核酸を単離し、必要により精製したら、核酸を固体支持体に結合する。固体支持体の例としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンまたは架橋アガロース製）及びスライド（例えば、ガラスまたはプラスチック製）が挙げられる。ビーズは続くBCT反応で核酸が存在する表面積が最大となるため、特に好ましい。さらに、アミノ活性化ビーズ[例えば、EAHセファロース（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）、酸化鉄のアミノ機能性化磁気ビーズ（Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, MA）及びアミノ機能性化ポリスチレンミクロスフィア（Polysciences, Inc., Warrington, PA）]は、利用し易く、核酸の付着及び続く分離に使用し易い。
【００３５】
他方、固体支持体に結合させたままでBCT標識化核酸を別の核酸にハイブリッド形成する際には、ガラススライドが特に好適である。ハイブリッド形成後に蛍光標識を検出する場合、クロムメッキガラススライドであれば、サンプル核酸と固体支持体との間の非共有結合が強くバックグラウンド蛍光が低いという点で好都合である。核酸用の固体支持体としてクロムメッキガラス支持体の使用に関する詳細は、米国特許出願第09/085,625号に知見することができる。
【００３６】
固体支持体に核酸を共有結合するためには、当業界で公知の任意の多数の化学反応を使用することができる。例えば、BCTは核酸の標識化だけでなく、固体支持体に核酸を付着するのにも使用することができる（米国特許第5,082,935号）。さらに、1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDAC）を使用してアミノ機能性化固体支持体[例えば、ポリスチレン（Zammatteoら、Anal.Biochem., 236:85-94, 1996）]にカルボジイミド縮合反応により核酸の末端ホスフェートを結合することができる。
核酸の重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移
核酸の重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移は反応性基をシチジンのN4原子に結合する特異的な反応である。BCT反応の前、その間またはその後に検出可能な標識を反応性基に結合し、これによって核酸を標識化する。BCT化学反応については、Schulmanら、Nucl. Acids Res., 9:1203-1216(1981)；Gilliamら、Anal. Biochem., 157:199-207(1986)；Hayatsu、Prog. Nucl. Acid Res. Mol.Biol.、16:75-124(1976)；及びDraper、Nucl. Acids Res., 12:989-1002(1984)により詳細に記載されている。
【００３７】
BCTで使用する出発反応性基は少なくとも２個の置換基を有する有機化合物であってもよい。第１の置換基は、核酸中のシチジンヌクレオチドと反応することができる。第１の置換基の例としては、（第１及び第２）アルキルアミノ、ヒドラジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、及びアシルヒドラジド部分が挙げられる。
【００３８】
反応性基の第２の置換基は検出可能な標識分子と反応することができる。第１の置換基により反応性基にシチジンを結合する間、第２の置換基は無差別的な反応性から保護するためにブロックされていてもブロックされていなくてもよい。ブロックされていてもブロックされていなくても、第２の置換基はシチジンに反応性基を結合するアミノ基転移反応において他の分子とは実質的に非反応性でなければならない。第２の置換基の例としては、アミノ、カルボキシル、ホスフェート、スルホネート、スルフヒドリル、ヒドロキシル、ヒドラジド、セミカルバジド、及びチオセミカルバジドが挙げられる。カルボキシル基は塩、酸またはエステル形であってもよい。塩の形である場合、カチオンはアルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）であってもよい。
【００３９】
有機反応性基において、第１及び第２の置換基は隣接する炭素原子上であっても、またはかなり離れていてもよい。反応性基は直鎖、分岐または環式炭化水素であってもよく、エーテルまたはチオエーテル結合を含む。
【００４０】
好適な反応性基の別の例としてはジアミンがある。ジアミンとしては、反応性基はプロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、及びノニレン基、例えば、CH3NH(CH2)2NH2及びCH3NH(CH2)2NHCH3が挙げられる。ヒドロキシル化炭化水素類を含むジアミン類も好適な反応性基であり、1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン；1,4-ジアミノ-2,3-ジヒドロキシブタン；1,5-ジアミノ-2,3,4-トリヒドロキシペンタン；1,6-ジアミノ-1,6-ジヒドロキシ-D-マンニトール；1,6-ジアミノ-2,3,4,5-テトラヒドロキシヘキサン；トランス-1,2-ジアミノ-3,4,5,6-テトラヒドロキシシクロヘキサンが挙げられる。
【００４１】
他の好適な反応性基としては特定のアミノ酸、イソピペコリン酸、グルコサミン酸、及び6-アミノヘキサン酸が挙げられる。反応性基は1000ダルトン未満（例えば、500、250、100または50ダルトン未満）の分子量を有することができる。幾つかはBCT反応で損なわれる官能基を含むため、全てのアミノ酸が好適ではない。例えば、硫黄含有アミノ酸（例えば、シスチンまたはシステイン）は不適当である。他方、硫黄がスルフィドの形態であるため、メチオニンは好適である。勿論幾つかのアミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン、及びイソバリン）はさらなる合成ができない側鎖を有する。リシンまたはオルニチンは特に有用なアミノ酸である。
【００４２】
その蛍光が結合ペプチドにより得られる化学的環境により増強される予め付着させた染料分子をペプチド鎖に含ませることができるため、ペプチド類は特に好適な反応性基である。これらの染料分子は、500〜10,000ダルトンの範囲の分子量を有することができる。BCTが実質的な速度で起きるためには、比較的高濃度（0.02〜2M、特に0.2〜2M）の反応性リガンドが必要なので、溶解性は束縛因子である。
【００４３】
化学反応の効率を高めるために、BCT反応は、カオトロープアニオン溶媒（例えば、トリハロアセテート）中で実施することができる。二次構造を形成する核酸はBCTに対して感受性が低いことが知られている。カオトロープは変性または一本鎖構造に核酸を保持し易いので、BCT反応混合物中にカオトロープが含まれるのは望ましい。トリフルオロ酢酸（TFA）は核酸アミノ基転移反応に特に好適であることが知見された。
検出可能な標識の反応性基への結合化
本発明の実施で使用する出発原料の検出可能な標識分子は、反応性基の第２の置換基と反応し得る少なくとも１個の標識部分を含む。標識部分はアミノ、カルボキシル、アルデヒド基、イソチオシアネート、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルハライド、またはカルボン酸基であってもよい。所望の特定の標識部分は反応性基の第２の置換基の性質に依存し、同様に第２の置換基の選択は、使用する標識部分に依存する。サンプル核酸の標的へのハイブリッド形成の妨害を最小化するために、標識分子は5000ダルトン未満（例えば、2500、1000、または500ダルトン未満）でなければならない。
【００４４】
検出可能な標識分子が蛍光体である場合、該蛍光体は励起波長で少なくとも約6,000M-1cm-1（例えば、少なくとも10,000M-1cm-1）の吸光係数、及び少なくとも約0.02の量子収量を有することができる。検出可能な標識分子の例としては、アミノ機能性化蛍光体（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR製）、例えば、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸、スクシンイミジルエステル（AMCA）；スルホローダミン101スルホニルクロリド（Texas Red：商標）；5-(及び6-)カルボキシルローダミン101、スクシンイミジルエステル；リッサミン（lissamine）ローダミンBスルホニルクロリド；5-（及び6-）カルボキシルフルオロセイン、スクシンイミジルエステル；7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸、スクシンイミジルエステル；テトラメチルローダミン-5-（及び6-）イソチオシアネート；N-（4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-3-インダセンプリオピオニン酸）、スクシンイミジルエステル；活性化フルオロセイン誘導体（FAP）；エオシン-5-イソチオシアネート；エリトロシン-5-イソチオシアネート、及び1-ヒドロキシ-3,6,8-ピレントリスルホン酸のO-アセチルアジド誘導体（Cascade Blue（商標）アセチルアジド）が挙げられる。
【００４５】
検出可能な標識に反応性基を結合する反応条件は、公知である（例えば、米国特許第5,506,250号参照）。
使用
本発明の方法は、生化学または分子生物学で通常の能力を有する研究者によって実施することができる。例えば、研究者らは、例えば、5.0μg〜1.0mgスケールで任意の幾つかの蛍光体で核酸を化学的に標識するために、固体支持体（例えば、アミノ活性化セファロースビーズ）、重亜硫酸塩溶液、反応性基（例えば、エチレンジアミン）、及び検出可能な標識（例えば、アミノ活性化蛍光体）を含む本発明のキットを使用することができる。標識すべき核酸サンプルを精製及び／または単離したら、上記の如く核酸をビーズに結合し標識化する。反応の各段階はビーズを使用すると容易であり、これにより遠心分離を使用して迅速に洗浄段階を実施することができる。
【００４６】
あるいは、本発明のキットは、それぞれのウエルを標準法によりアミノ機能性化することができるポリスチレン製の96-ウエルマイクロタイタープレートを含むことができる。複数の核酸サンプルをウエルに結合し、それぞれの核酸サンプルを他のサンプルとは別に保持しながら(同時に標識化することができる。
【００４７】
さらに、研究者が反応段階を実施するよりもむしろ、自動化またはロボット制御化装置を使用して同時に及び／または連続して多量の（例えば、数百から数千の）核酸サンプルを処理及び標識化することができる。本発明の方法を自動化するための好適な装置及びシステムとしては、Biomek 2000システム（Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA）及びBioRobot 9600システム（Qiagen, N.V., Venlo, オランダ製）が挙げられる。Biomek 2000及びBioRobot 9600製品はいずれも、本発明の方法を実施するために必要な集積コンピューター制御及びモニタリングを使用する。
【００４８】
本発明の組成物及びキットは、本発明の方法で使用し得るミクロチップも含む。本明細書中で使用するミクロチップまたは「チップ」とは、DNA分析で使用するミクロアレーデバイスを記載するために使用する。これらのミクロデバイスは好適なガラスまたはクロムコートガラス面に固定化した遺伝子座特異的DNA配列の二次元アレーからなる。この試験DNAを例えば、赤蛍光標識化した参照DNAと共にチップ表面で同時ハイブリッド形成する際に、表面結合DNAフラグメントのアレーを使用してハイブリッド形成により（通常、緑の蛍光で標識化した）数百の試験片の遺伝子座を同時分析することができる。次いで緑／赤の蛍光比を測定すると、点在するDNAの表面アレーにより表された特定の遺伝子座での相対的コピー数の尺度が得られる。
【００４９】
しかしながら、MEMS（小型化電気機械システム）分野では、通常、ミクロチップなる用語は、種々の機械的または化学的検出操作[例えば、動作検出（エアバッグ配備センサー）、インクジェットプリントヘッドまたは生化学センサー（ポータブル血液アナライザ）]を実施し得る任意の小型化装置について記載するためにずっと広い意味で使用される。これらのMEMS装置は、当業者により日常的に実施される高解像度表面エッチング法によりシリコンウエハ中に通常、微細機械加工されている。ガラスまたはプラスチックから構成されたMEMS装置も製造することができる。多くの化学的検出用途では、チャネルに電圧を適用することにより生じた電気浸透圧流（EOF）によりガラスチャネルに、または小型化ダイアフラムポンプによりシリコンエッチング化チャネル中に流体が移動する。ミクロチャネルに沿って流体が流れる装置は、ミクロ流体装置（microfluidics devices）と称される。ミクロ流体系の開発の現状の時宜的な総説(については、Chemical & Engineering News, 1999年2月22日、27-36頁（American Chemical Society, Wachington DC, 米国）に知見することができる。
【００５０】
自動直接標識化は、Cepheid Inc., Suunyvale, CA（www.Cepheid.com）により製造され、Petersenら、IVD Technol. 4:43-49,1998に記載されたミクロ流体装置または「ピラーチップ（pillar chip）」でも実施することができる。これらのピラーチップ（約5×5mm2）はシリコンウエハ上にエッチングされた小さなチャンバ（3.5mm2、全内表面積36mm2）内に突出する数千の珪素フィンガー（200μm高さ及び34μm中心）から形成(されている。ウエハに結合したガラスカバープレートによりチャンバをシールする。対向する対角線のチップに機械加工された入口及び出口により流体がチップ内に導入される。
【００５１】
最初に製造したままでは、チップは生物学的リガンドが付着しにくい純粋珪素である。しかしながら、表面を酸化して二酸化珪素の薄層を製造すると、種々の表面修飾化学反応を利用することができる。例えば、シラン活性化剤を使用することにより、続いて表面に生化学リガンドを付着するのに使用し得る、例えば、アミノ、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたはエポキシド反応性基で表面の酸化珪素を機能性化することができる。例えば、二酸化珪素チップ表面の3-アミノプロピルトリメトキシシランとの反応によりアミノ基で修飾した表面が得られ、これに、本明細書に記載のポリマービーズにこれらの核酸を付着するのに使用するEDACカルボジイミド結合手段により、末端ホスホモノエステル基を含有する二本鎖または一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを共有結合することができる。また、Joosら、Anal. Biochem. 247:96-101, 1997は、アミノプロピルシラン修飾ガラス固相へのカルボキシル化オリゴヌクレオチドのカルボジイミド活性化結合について記載する。
【００５２】
アミノ機能性化チップ表面は、米国特許第5,091,519号に記載のBCT反応により核酸とも反応することができる。エポキシド修飾ガラス顕微鏡スライド面上でのオリゴのインサイチオ合成に関しては、本明細書中参照として含まれるMaskosら、Nuc. Acids Res. 20:1679-1684、1992を参照されたい。エポキシド機能性化ガラス表面を上記Maskosらに示されるようにヒドロキシル面に転化すると、臭化シアン活性化によって核酸を付着させることができる。スルフヒドリル修飾ガラススライド面へのオリゴの付着に関しては、例えば、Rogersら、Anal. Biochem. 266:23-30、1999を参照されたい。
【００５３】
DNAの可逆性付着は、上記EDAC/ホスホルアミデート法で実施することができる。スルフヒドリル固相およびDNAと支持体との間のジスルフィド結合は還元剤で切断可能であるが、ジスルフィド結合はBCT条件では安定ではない。
【００５４】
全内部表面積が約0.3cm2で、理論最大結合能が1014分子/cm2（約5×10-11モル/チップ）であると、チップは約8μgの500bp二本鎖ゲノムDNAフラグメントを結合することができる。実際の充填能が理論量の1〜5％の場合であっても、チップはDNAミクロアレー上での分析に関し十分なゲノムDNAを標識できるはずである。
【００５５】
ピラーチップ（またはビーズ）を使用する別のアプローチとしては、例えば、DNAを固相に結合させたままで蛍光ヌクレオチドを用いるニックトランスレーションによりDNAを酵素的に標識化することがある。DNAを固相から分離し、参照DNAと混合し、ミクロアレー上に流すことができる。将来的には、ミクロアレーは、DNA単離、標識化、ハイブリッド形成、及び分析をすることができる統合された(ミクロ流体分析システムの一成分となるだろう。
【００５６】
【実施例】
本発明を以下の実施例により詳細に記載する。本実施例は、請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：固体支持体上での核酸の重亜硫酸塩仲介蛍光標識化
市販のアミノ化ジアミノジプロピルアミン（DADPA）ビーズ（Pierce Catalog No.53147）50マイクロリットルを、0.2M 1-エチル-3-（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDAC)及び0.1M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES, pH6.0）の存在下、超音波処理し熱変性させたヒト胎盤ゲノムDNA 50μgと混合した。この混合物を50℃で1時間インキュベートした。別の実験で、室温で一晩インキュベートしたものでもDNAをビーズに結合させるのに十分であった。
【００５７】
固相結合法により、50μgの出発材料DNAのうち約35μgが強く結合したことが知見された。結合は、0.2M MOPS（pH7.4）中または50mM NaCl中で65℃で310分までのインキュベーションに安定であった。50μgの出発材料DNAのうち約10μgはビーズに弱く結合しており、62.5mM硼酸ナトリウム及び1.25M NaCl（pH8.5）中、65℃で6分以上DNA/ビーズ混合物をインキュベートすることにより除去することができた。
【００５８】
次いでビーズを二回蒸留した水（ddH2O）で1分ずつ5回洗浄した。遠心分離し、上清を分離し、次いで水中に再懸濁することにより洗浄を実施した。DNAを95℃で5分間変性し、続いて氷浴中に浸漬することにより急冷した。変性及び冷却後も、50μgの出発材料DNAのうち約33μgはビーズに結合していたことが知見された。
【００５９】
トリフルオロ酢酸（TFA）1.53mlを脱イオン水2.5mlに添加することによりアミノ基転移緩衝液を製造した。この緩衝液を10分間放冷した。次いで、エチレンジアミン0.87ml（遊離塩基；Sigma Catalog. No.E4379）を氷上でゆっくりと緩衝液に添加した。エチレンジアミンが溶解した後、緩衝液を室温に温めた。メタ重亜硫酸ナトリウム0.475g（Aldrich Catalog. No.25,555-6）を緩衝液に添加し、緩衝液を45℃に温めて重亜硫酸塩を溶解させた。緩衝液のpHをTFAを添加して7.0に調整し、緩衝液の容積を5mlに調整した。次いで、ヒドロキノン100mg/ml溶液の50μlを緩衝液に添加した。
【００６０】
固定化DNAをアミノ基転移するために、重亜硫酸塩アミノ基転移緩衝液125μlをDNA/ビーズ混合物に添加し、この混合物を65℃で20分インキュベートしてDNA中のシトシンにエチレンジアミンを付着させた。別の実験で、室温で一晩DNAをアミノ基転移するのも許容可能であることが知見された。ビーズを再びddH2Oで5回洗浄して、過剰の緩衝液を除去した。
【００６１】
次いでビーズをカルボキシXローダミンNHSエステル標識用緩衝液（62.5mM硼酸ナトリウム、1M NaCl［pH8.5］、及び15%[v/v]DMF中、2〜5mM蛍光体）550μl中に懸濁させた。ビーズを標識用緩衝液中、50℃で1時間インキュベートし、次いでddH2Oで5回洗浄して標識用緩衝液を除去した。別の実験では、室温で16時間で標識化を実施した。
【００６２】
標識化DNAを分離するために、ビーズを50mM NaOH 0.1ml中、65℃で1時間インキュベートした。（時間がかかるが、ホルムアミド中、75℃で72時間インキュベートすることによってもDNAをビーズから分離することができた。ホルムアミド変性溶液は、ホルムアミド49ml、20×SSC 7ml、水14mlを混合することにより製造し、pH7.5で70%ホルムアミド溶液となった。）標識化DNA約15μgをこの最初のインキュベーション液から回収した。別のDNA約10μgを50mM NaCl中65℃でさらに1時間処理することによって回収した。通常DNAの分離効率は、時間、温度、pHを変えたり、または触媒を添加することによって最適化することができる。標識化DNA溶液を3M酢酸ナトリウム0.1容積で中和してpHを6.0とした。次いで、DNAをエタノール沈澱により単離した。
【００６３】
上記方法を繰り返してヒト胎盤ゲノムDNAを6-(フルオロセイン-5-(及び-6)-カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル及び5,6-カルボキシテトラメチルローダミンNHSエステルで標識化した。
実施例２：中期染色体を視覚化するための蛍光標識化核酸の使用
上記実施例１で製造した5,6-カルボキシXローダミンNHSエステル、6-(フルオロセイン-5-(及び5-)-カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル、及び5,6-カルボキシテトラメチルローダミンNHSエステル標識化DNAをそれぞれ、米国特許第5,776,688号に記載の通りヒト一次リンパ球中期染色体にインサイチオハイブリッド形成した。標識は染色体構造に特異的であり、シグナル強度は全３種類の標識に対して中−良であった。
実施例３：AmpliOnc （登録商標）バイオチップ上での蛍光標識化核酸の使用
ヒト大腸ガン細胞(colo 320)由来の6-(フルオロセイン-5-(及び6-)カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル標識化試験DNA及び5,6-カルボキシXローダミンNHSエステル標識化正常ヒト参照DNAを以下の如く製造した。
【００６４】
超音波処理したcolo 320DNA(50μl中50μg、平均フラグメントサイズ300〜3000bp)を95℃で5分間加熱変性し、氷上で急冷した。DADPAビーズ懸濁液(Pierce)50μlを水中で繰り返し洗浄し、水中で懸濁して、ビーズの終容積＋上清を25μlとした。このビーズ懸濁液にDNA溶液、続いて、0.5M MES緩衝液25μl及び0.5M EDAC25μlを添加した。混合物を50℃で1時間加熱した。ビーズを濾別し、水250μlで5回洗浄した。最終的にビーズを100μl水中に懸濁した。50mM NaOH、65℃で1時間処理すると、このビーズ懸濁液のアリコート10μlからDNA 3.1μgが分離した。
【００６５】
ビーズ懸濁液10マイクロリットル（DNA 5μgと名目的に等価であり、全ての投入したDNAが結合したことを確認した）を取り出し、水50μl中に懸濁した。混合物を95℃で5分間加熱し、氷上で急冷した。ビーズを遠心分離により単離し、上清を取り除き、予め65℃に温めておいた新しく製造したTFAアミノ化混合物(125μl)を添加した。混合物を65℃で10分間加熱した。アミノ化反応物を氷上で迅速に冷却し、ビーズを水中で繰り返し洗浄した。
【００６６】
ビーズを標識用緩衝液(0.1M 硼酸ナトリウム；1Mクエン酸ナトリウム、pH8.2)110μl中に懸濁した。次いで、6-(フルオロセイン-5-(及び-6-)-カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル(FCHA-NHS、DMF中20mM)22μlを添加した。混合物を50℃で1時間加熱した。ビーズを遠心分離により単離し、水で繰り返し洗浄した。
【００６７】
ビーズを50mM NaOH100μl中に懸濁し、65℃で1時間加熱した。ビーズを遠心分離フィルターを介して遠心分離により単離し、完成した標識化プローブを含む濾液を集めた。
【００６８】
濾液に酢酸ナトリウム0.1容積及びエタノール2.0容積を添加した。混合物を-20℃で15分冷却し、遠心分離してDNAペレットとして回収した。このペレットを70%エタノール水溶液で洗浄し、60μl水中に溶解し、続いてBiospin30カラム(BioRad, Hercules, CA)を通すことによりさらに精製した。プローブ溶液の終容積は65μlであった。
【００６９】
プローブ溶液15マイクロリットルをCot 1 DNA(ブロック用DNA；以下参照)100μgと5,6-カルボキシXローダミン標識化男性参照DNA200ngと混合した。次いでDNA混合物を上記の如くエタノール沈澱させた。標準プロトコルを使用してヒトリンパ球でコートした顕微鏡スライド上でCot-ブロック化colo 320DNAをハイブリッド形成した(実施例２参照)。Colo 320細胞株中に存在する第8番染色体の増幅c-myc遺伝子座は、よいシグナル強度とバックグラウンドのもと、中期核中に2個の緑色の蛍光点として現れた。
【００７０】
FCHA標識化colo 320プローブ15マイクロリットルと5,6-カルボキシXローダミン標識化男性参照DNA 5μl(500ng)をSpeedVac濃縮器中で蒸発乾涸させた。水5.4μlに、Cot 1 DNA 5.4μl(100μg)及びハイブリダイゼーション緩衝液(50%ホルムアミド、2×SSC、10%硫酸デキストラン)16.2μlを添加した。プローブDNA混合物を80℃で10分間熱変性し、37℃で2時間プレハイブリッド形成し、AmpliOnc(商標)ミクロアレーに適用し、次いで37℃で一晩ハイブリッド形成した。37℃のインキュベータからチップを取り出して洗浄した。チップを室温で1×SSCで2分間3回洗浄し、続いて50%ホルムアミド/2×SSC中40℃で10分間3回洗浄し、最終的に室温で1×SSCで2分間3回洗浄した。ミクロアレーを数分間風乾した。DAPI対比染色剤含有ゲルマウントを添加し、緑/赤蛍光比を自社製蛍光画像化装置(以下参照)で定量化した。
【００７１】
ガン細胞DNAは増幅c-myc遺伝子を持つことが知られている。標識化DNAを使用してAmpliOnc(商標)(Vysis, Inc.)DNAバイオチップにハイブリッド形成させた。
【００７２】
AmpliOnc(商標)チップはヒトガンに関与することが知られている遺伝子を表す核酸のミクロアレーを含む。例えば、ラムダファージDNAを含有する負の対照点も含まれる。それぞれのガン遺伝子はミクロアレー上で5個の個別の点として表される。使用時には、AmpliOnc(商標)チップを、ひとつの色の蛍光体で標識化した正常参照DNAサンプルおよび別の色の蛍光体で標識化した試験DNAサンプルとハイブリッド形成させる。増幅ガン遺伝子を検出するためには、ガン遺伝子を表す全ての点は試験DNAと結合した蛍光体により不均衡に着色するだろう。未増幅遺伝子を表す点は双方の蛍光体のほぼ等量を有するはずである。
【００７３】
AmpliOnc(商標)チップをハイブリッド形成緩衝液25μlで37℃で16時間ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成緩衝液は、50%(v/v)ホルムアミド、Cot 1 DNA 4μg/μl、6-(フルオロセイン-5-(及び-6-)-カルボキサミド)ヘキサン酸NHSエステル標識化Colo 320DNA 500ng、及びSpectrumRedヒト参照DNA500ngを追加した2×SSCであった。Cot 1 DNAは、反復要素が豊富なヒトゲノムDNA画分であり、これを使用して、ヒト試験標本から単離した標識化DNAプローブ中に常に存在する反復要素のハイブリッド形成を抑制またはブロックした。反復要素からのシグナルは特徴的な配列DNA由来のシグナルと混同して不明瞭とするであろう。次いでチップを洗浄し、標準プロトコルを使用して画像化した。
【００７４】
チップから発生したシグナルの定量測定をVysis, Inc.(Downers Grove, IL)で開発したラージフィールド蛍光画像化システムで実施した。画像システムは、450W キセノンアークランプ(SLM Instruments Inc., Champaign Urbana, IL)、帯電結合装置検出器(charge coupled device detector：CH200, Photometrics, Tucson, AR)、及び3種類の通常使用される蛍光染料（青に関してはDAPI、緑に関してはフルオロセインイソチオシアネート(FITC)、及び赤に関してはテキサスレッド(TRED)）用のフィルターセット(Chroma Technology, Brattleboro, VT)からなっていた。画像化システムは、画像取得/分析ソフトウエア(IpLab, Signal Analytics, Corp., Vienna, VA)でPower Macintosh 7100/80で制御した。
【００７５】
ハイブリッド形成したチップのバックグラウンド蛍光は低く、ニックトランスレーション標識化DNAと同等であった。それぞれの点に関して緑及び赤の蛍光を定量し、データを表１にまとめた。
【００７６】
【表１】
【表２】
表１のそれぞれの値はその標準偏差と共に報告される。青い蛍光はDAPI、すなわちスポット位置におけるDNAの存在を確認するのに必要な一般的なDNA対比染色剤による。Colo 320DNAのc-myc腫瘍遺伝子の予想された増幅は、Colo 320 DNAに関して強い緑の蛍光(755カウント)により示され、正常ヒトDNAの比較的低い赤い蛍光(39カウント)と比較して24倍の増幅であった(表１の標的17)。さらに、ラムダファージ点に結合した標識化DNAが低レベルであったことは、非特異的結合が殆どなかったことを示していた。
他の態様
本発明を詳細な記載と共に記載してきたが、上記記載は本発明を単に説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は請求の範囲に定義されることが理解されよう。他の態様、好都合な点及び変形は、請求の範囲内に含まれる。
Claims (27)
- 核酸に検出可能な標識を結合する方法であって、
シチジン塩基を含む核酸を固体支持体に結合し；
前記シチジン塩基を反応性基でアミノ基転移してシチジン塩基と反応性基との間に共有結合を形成し；次いで
検出可能な標識を前記反応性基に結合する、
各段階を含み、
アミノ基転移段階が、重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移反応、臭素化／アミノ化、またはプラチナ配位化合物によるアミノ基転移反応である、前記方法。 - 前記固体支持体がビーズである、請求項１に記載の方法。
- 前記固体支持体がクロムメッキガラススライドである、請求項１に記載の方法。
- 前記反応性基がジアミンである、請求項１に記載の方法。
- 前記反応性基が、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、エチレン、及びノニレン ジアミン、またはヒドロキシル化炭化水素を含むジアミンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記反応性基がエチレンジアミンである、請求項５に記載の方法。
- トリハロアセテートカオトロープアニオンを含む溶媒中に前記反応性基を溶解する、請求項１に記載の方法。
- 前記トリハロアセテートカオトロープアニオンがトリフルオロアセテートである、請求項７に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が蛍光分子である、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸が約1〜2キロベースの長さである、請求項１に記載の方法。
- 固体支持体から核酸を分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸が固体支持体に共有結合している、請求項１に記載の方法。
- 核酸の末端ホスフェート及びアミノ活性化固体支持体と1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドとを反応させることにより核酸を固体支持体に結合する、請求項１２に記載の方法。
- 固体支持体；
固体支持体に結合したシチジン塩基を含む核酸；
前記シチジン塩基に共有結合した反応性基であって、
（ａ）ジアミン；または
（ｂ）イソピペコリン酸、グルコサミン酸、若しくは6-アミノヘキサン酸；または
（ｃ）50〜1000ダルトンの間の分子量を有するペプチド；
の一つである、前記反応性基；及び
前記反応性基に結合した検出可能な標識
を含む組成物。 - 前記固体支持体がビーズである、請求項１４に記載の組成物。
- 前記固体支持体がクロムメッキガラススライドである、請求項１４に記載の組成物。
- 前記反応性基であるジアミンが、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、エチレン、及びノニレン ジアミン、またはヒドロキシル化炭化水素を含むジアミンからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
- 前記反応性基がエチレンジアミンである、請求項１７に記載の組成物。
- 前記検出可能な標識が蛍光分子である、請求項１４に記載の組成物。
- 前記核酸が約1〜2キロベースの長さである、請求項１４に記載の組成物。
- 前記核酸が固体支持体に共有結合している、請求項１４に記載の組成物。
- 核酸の末端ホスフェート及びアミノ活性化固体支持体と1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドとを反応させることにより前記核酸を固体支持体に結合する、請求項２１に記載の組成物。
- 複数の核酸に検出可能な標識を結合する方法であって、複数の核酸のそれぞれは特徴的な配列を有し、
そのそれぞれがシチジン塩基を含む複数の核酸を固体支持体に結合し；
前記シチジン塩基を反応性基でアミノ基転移してそれぞれのシチジン塩基と反応性基との間に共有結合を形成し；そして
検出可能な標識を前記反応性基に結合する、
各段階を含み、
アミノ基転移段階が、重亜硫酸塩触媒化アミノ基転移反応、臭素化／アミノ化、またはプラチナ配位化合物によるアミノ基転移反応である、前記方法。 - 前記反応性基がH2N(CH2CH2X)nCH2CH2NH2[式中、n=1−4、XはO、SO、SO2、Si、またはNR3（式中、R3は低級アルキルである）である]を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記反応性基がH2N(CH2CH2X)nCH2CH2NH2[式中、n=1−4、XはO、SO、SO2、Si、またはNR3（式中、R3は低級アルキルである）である]を含む、請求項１４に記載の組成物。
- 固体支持体；
重亜硫酸塩；
反応性基であって、
（ａ）ジアミン；または
（ｂ）イソピペコリン酸、グルコサミン酸、若しくは6-アミノヘキサン酸；または
（ｃ）50〜1000ダルトンの間の分子量を有するペプチド；
の一つである、前記反応性基；及び
検出可能な標識
を含むキット。 - 前記固体支持体がビーズである、請求項２６に記載のキット。
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