JP3753942B2 - ５−ピリミジン含有核酸、それを用いた可逆的連結方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピリミジンの５位に置換ビニル基を有するピリミジン塩基の光反応性を利用した可逆的に核酸類を簡便かつ効率的に連結する方法、そのための核酸類、それを用いたＤＮＡの不活性化方法などに関する。本発明の方法により、キャップした核酸類や枝分かれ構造を持つ核酸類を簡便に且つ効率的に合成することができる。
また、本発明は、固相担体に固定化されたピリミジンの５位に置換ビニル基を有するピリミジン塩基を有する核酸類、並びに当該核酸類を用いた特定の塩基配列を有する核酸類の固定化方法、精製、回収方法、及び同定、検出、又は定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＰＮＡ（ペプチド核酸）などの核酸類を連結する方法としては、これらの核酸類の基本となる鎖を連結していた。このような方法によれば、末端をキャップした核酸類や及び枝分かれ構造を持つ核酸類を合成することは困難であった。このような末端をキャップした核酸及び枝分かれ構造を持つ核酸の合成法としては、リンカーを導入してこれらを連結するなどの方法が必要であった。
また、ＤＮＡとＰＮＡのように核酸類の基本となる鎖が異なる場合には、これらを直接連結することができなかった。さらに、従来のこのような方法では、連結後の特異性がなく、連結と開裂を特異的に行うことができなかった。
本発明者らは、先に光照射による核酸類の連結と開裂方法について特許出願してきたが、従来の方法では収率が低く、また処理に長時間を要するという欠点があった。
【０００３】
また、固相上に固定化された核酸は、アフィニティークロマトにより、目的とする核酸選別や試験管内で進化した核酸の選別に利用されており、遺伝子工学のツールとして広範囲に利用されている。核酸を固相上に固定化する方法としては、ビオチンを有する核酸をビオチン−アビジン相互作用により固相担体に固定化する方法、マグネティックビーズを用いて固定化する方法、あらかじめ固定化されている核酸に対して酵素を用いて目的とする核酸を連結させることで固定化する方法などが知られている。また、核酸の精製法としては、上述のビオチンを有する核酸や、マグネティックビーズを用いた固定化核酸によるアフィニティーカラム精製が一般的である。
このように、核酸の精製や同定のために核酸を固定化する各種の方法が知られているが、いずれの方法も標的となる核酸を固定化核酸との水素結合によるアフィニティを利用して固定化するものであり、共有結合により標的となる核酸類を固定化する方法は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、光照射により核酸類同士を可逆的に連結することができる新規な塩基を有する核酸類を提供するものである。
また、本発明は、枝分かれ核酸及びキャップ核酸を簡便に合成することができる新規な方法を提供するものである。
さらに、本発明は、酵素や化学反応試薬を用いずに、光により固相担体上へ核酸類を固定化する方法を提供するものであり、水素結合相互作用に基づくのではなく、共有結合により強固に固相担体上に固定化できる方法、並びにこの方法を用いた核酸類の精製、回収方法、及び同定、検出、定量方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ピリミジンの５位に置換ビニル基を有するピリミジン塩基の光反応性を利用することにより、可逆的に核酸類を連結することができ、これを用いてキャップした核酸類や枝分かれ構造を持つ核酸類を簡便に合成することができることを見出した。
また、本発明者らは、ピリミジンの５位にビニル基を有する置換基を有する核酸類を固相担体上に固定化し、光をトリガーにして目的となる核酸を共有結合により連結させて固定化できることに成功した。また、違う波長の光照射により目的となる核酸の定量的回収が可能になるだけでなく、光連結性核酸含有固相担体の回収・再利用も可能であることがわかった。
即ち、本発明は、塩基部分として次式、
【０００６】
【化２】
【０００７】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有する核酸類、及び当該核酸が固相担体に固定化された核酸類に関する。
また、本発明は、前記した本発明の核酸類と、炭素−炭素二重結合、好ましくは非縮合環系の炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類に光を照射して、核酸類を可逆的に光連結又は開裂させる方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の核酸類と、塩基としてシトシンを有する核酸類に光を照射して塩基同士を連結させ、酸素又は水などの酸素含有物の存在下にシトシンのアミノ基を分解して、次いでより短波長の光を照射して前記塩基同士の連結を開裂させることからなるシトシンを選択的にウラシルに変換する方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、ＤＮＡの特定の塩基を対象として、前記した本発明の核酸類の５’末端及び３’末端が、前記ＤＮＡの特定の塩基の周辺の塩基配列と相補的な塩基配列を有する本発明の核酸類を配置して、これに光を照射してなる前記ＤＮＡの不活性化方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の固定化された核酸類を用いた、標的となる特定の核酸類の固定化方法、標的となる特定の核酸類を精製及び／又は回収する方法、並びに同定及び／又は検出及び／又は定量する方法に関する。
即ち、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の標的とする特定の核酸類を共有結合により光連結させてなる核酸類の固定化する方法に関し、また、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の標的とする特定の核酸類を共有結合により光連結させて核酸混合物中の特定の核酸類を固定化し、固定化された核酸類を分離又は回収することからなる核酸混合物中の特定の核酸類を同定、検出又は定量する方法に関し、さらに、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の目的の特定の核酸類を共有結合により光連結させて核酸混合物中の特定の核酸類を固定化し、固定化された核酸類を精製又は回収した後、さらに光を照射して固定化された核酸類を光開裂させることからなる、特定の核酸類を精製、回収する方法に関する。
【０００９】
このように、本発明の核酸類は、光の照射によりＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類と可逆的に連結し、開裂することができるものであり、ＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類の可逆的光連結剤として有用なものである。また、本発明の核酸類は、２本鎖ＤＮＡをテンプレートとして光反応を行うことが可能であり、このような方法で遺伝子の特定の塩基配列の箇所において本発明の核酸類を連結させることにより、２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列の箇所に本発明の方法により塩基と塩基とが光反応により連結した３本目の核酸類を導入することができる。この結果当該２本鎖ＤＮＡの転写等が抑制され、ＤＮＡを不活性化することから本発明の核酸類はＤＮＡ不活性化剤としても有用である。
【００１０】
ＰＮＡ（ペプチド核酸）は、天然のＤＮＡよりもより強くＤＮＡの相補鎖に結合することができることから、遺伝子治療におけるアンチジーン又はアンチセンスとして使用されている。しかし、ＰＮＡは水への溶解性が低く、細胞内や核内への輸送効率が低いことが課題とされている。これを改善するために、ＤＮＡの親水性と膜親和性を利用したＰＮＡ−ＤＮＡのキメラ複合体が注目されてきているが、ＤＮＡとＰＮＡとでは基本となる鎖が異なるために、その合成法は煩雑なものであった。
本発明者らは、ピリミジンの５位に電子吸引基で置換されたビニル基を有するピリミジン塩基、例えば次式（Ｘ）、
【００１１】
【化３】
【００１２】
で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基とする核酸を末端に有する核酸を用いて、この光反応性を利用することによる可逆的な核酸の連結を行った。
まず、テンプレートとなるＤＮＡ上にその相補鎖となるＰＮＡを配置し、次いでＰＮＡの末端部分に前記した塩基を有する本発明の核酸を配置し、これに３６６ｎｍの光を３時間照射させることにより、塩基部分で連結したＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体を得た。この反応式を次式で示す。
【００１３】
【化４】
【００１４】
テンプレート（ＯＤＮ Ｃ）にＰＮＡ（ＰＮＡ Ａ）及び本発明の核酸（ＯＤＮ Ｂ）を配置し３６６ｎｍの光を照射して、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体（ＰＮＡ−ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄ Ｅ）を得る。このスキームではテンプレート（ＯＤＮ Ｃ）は直接反応には関与しないが、便宜的に生成物のほうのテンプレートをテンプレート（ＯＤＮ Ｄ）としている。
【００１５】
この結果を図１に示す。図１は図面に代わる写真である。図１の右側（−）は光を照射する前のスポットであり、これは３２Ｐで標識化された本発明の核酸である。これに光を照射した後のものが左側（＋）に示されている。光を照射することによりＰＮＡと本発明の核酸が連結されて、より高分子量の位置にスポットが移動していることがわかる。
図２はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図２の横軸はリテンション時間（分）であり、図３の上段は光照射前のチャートであり、図３の下段は光照射後のチャートである。
図３の一番左側のピークはテンプレート（ＯＤＮ Ｃ）のピークであり、光照射前と後で変化は無い。（ａ）の左から２番目及び３番目のピークは本発明の核酸（ＯＤＮ Ｂ）と連結されるＰＮＡ（ＰＮＡ Ａ）のピークである。図２の下段では、原料の２種の核酸のピークはほぼ消失して、より高分子量の生成物のピークが出現してきていることがわかる。
このように、本発明の核酸の塩基であるピリミジンの５位の置換ビニル基の二重結合と、隣接する塩基の炭素−炭素二重結合が光により直接結合するものであり、ＰＮＡとＤＮＡのように基本となる鎖が相違していても、塩基同士により連結することが可能となる。さらに、この光による連結は光可逆反応であり、異なる波長の光を照射することにより、可逆的に開裂させることも可能である。
また、この方法を応用することにより、光によって末端をキャップした核酸を簡便に合成することが可能になる。遺伝子治療においては、遺伝子を核に送り込むためには遺伝子に酵素耐性を付与しなければならず、本発明の核酸の光キャップ化によってこのような酵素耐性を付与することができる。
【００１６】
次に、前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基とする核酸を用いて、シチジン（シトシン塩基）との光反応を行ったところ、３６６ｎｍの紫外線を３０分間照射することにより、９３％の収率で目的の連結ＤＮＡが得られた。比較例として、カルボキシル基が置換していない５−ビニルウラシルを塩基とする核酸を用いた場合には、６時間の照射で８０％の収率であった。
このように、ビニル基の水素原子をカルボキシル基のような電子吸引基で置換することにより、短時間で且つ高収率で反応を行わせることができることがわかった。
【００１７】
本発明の連結反応はＤＮＡやＲＮＡなどをテンプレートとして用いることが好ましい。即ち、前記したＰＮＡとの反応式に示したように、ＤＮＡをテンプレートとして、その上にその相補鎖の連結されるべき核酸を置き、連結部分が隣接するように隣接して本発明の核酸を配置して光を照射するのが好ましい。このようなテンプレートを使用することにより、目的の位置で選択的に連結を行うことができる。
本発明者は、このようなテンプレートとして、２本鎖のＤＮＡを使用することができるかどうかを検討した。２本鎖のＤＮＡにさらに３本目のＤＮＡなどの核酸が塩基対を形成することは、フーゲスティン塩基対（Hoogsteen base pair）として知られているとおりである。
そこで、核酸の一端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基を有し、他端にシトシン塩基（Ｐｙ）を有する核酸を用意し、この核酸の両端が隣接するように両端部分の塩基を２本鎖ＤＮＡの塩基対と対を形成させた。この反応式を次に示す。
【００１８】
【化５】
【００１９】
これに３６６ｎｍの光を照射させることにより、環状のＤＮＡを８９％の収率で得た。
結果を図３に示す。図３は図面に代わる写真である。図３のレーン１はコントロールとして１２ｍｅｒの核酸を示したものであり、レーン２は光照射の無い場合のものであり、環状になっていない核酸のスポットがみられる。レーン３は３６６ｎｍの光を照射したときのものであり、環状の核酸のスポットがみられる。レーン４はこれにさらに３０２ｎｍの光を照射したものであり、環が開環してもとの鎖状のもののスポットが出現していることがわかる。
得られたＤＮＡは、２本鎖ＤＮＡに、塩基部分が光環化反応により環化されたＤＮＡが塩基対を形成しているものであり、この部分にはＲＮＡポリメラーゼなどの酵素や他のタンパク質が結合することができず、その結果この部分の遺伝子の発現が抑制されることになる。したがって、この方法により発現を抑制したい遺伝子の発現を阻害することが可能となり、本発明の核酸を遺伝子治療として使用できる。
また、得られた環状ＤＮＡに、３０２ｎｍの光を照射することにより、可逆的に開環することができ、遺伝子の発現の抑制を解除することも可能である。
【００２０】
次に枝分かれの核酸の製造方法について検討した。
図４にその概要を示す。例えば、ＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡＣの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ Ｉ）に、末端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基（図４中ではＶＣＵ）を有するＵＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有する本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）を配置し、その隣接する位置に・・・ＴＧＴＧＣ・・・の部分配列を有する核酸（ＯＤＮ Ｇ）を配置する。これらの塩基配列はテンプレートに相補的な配列であり、目的核酸の塩基配列に応じてテンプレートの塩基配列を選択することができる。
これに３６６ｎｍの光を１時間照射すると、５−カルボキシビニルウラシルの塩基部分と、隣接するシトシン（Ｃ）が連結して図４に示される枝分かれ状の核酸を得ることができる。
【００２１】
図５はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図５の横軸はリテンション時間（分）であり、図５のａ）（図５の上段）は光照射前のチャートであり、図５のｂ）（図５の下段）は光照射後のチャートである。
図５の一番左側のピークはテンプレートのピークであり、光照射前と後で変化は無い。（ａ）の左から２番目及び３番目のピークは本発明の核酸と連結される核酸のピークである。図５の（ｂ）では、原料の２種の核酸のピークは消失して、より高分子量の生成物の大きなピークが出現してきていることがわかる。このピークの分子量は５２５０．１２で、計算値の５２４９．９０と一致した。
【００２２】
さらに、本発明の方法によれば、対象遺伝子上の任意のシトシンをウラシルへと変異させることが可能になる。
即ち、前記した枝分かれ状の核酸を製造するのと同様にして、対象遺伝子のシトシン（Ｃ）の塩基までをテンプレートに固定化し、当該シトシンに隣接して本発明の核酸を配置して光を照射すると、対象遺伝子と本発明の核酸が連結する。この連結した状態のときに、シトシンの４位のアミノ基を酸素又は水などの酸素含有物の存在下の水酸基に置換することができる。例えば、連結した状態で空気中で穏やかに温度を上げてゆくと空気酸化されて、シトシンのピリミジン環の４位のアミノ基が水酸基に置換される。そして、再度光を照射して、連結を開裂させると、シトシンがウラシルに変換されることになる。
【００２３】
この反応式を図６に示す。枝分かれ構造の核酸を製造するところまでは、前述したのと同様である。即ち、例えば、ＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡＣの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ Ｉ）に、末端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基（図６中ではＶＣＵ（以下の説明ではＣＶＵと標記することもある。））を有するＵＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有する本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）を配置し、その隣接する位置に・・・ＴＧＴＧＣ・・・の部分配列を有する核酸（ＯＤＮ Ｇ）を配置する。これらの塩基配列はテンプレートに相補的な配列であり、目的核酸の塩基配列に応じてテンプレートの塩基配列を選択することができる。
これに３６６ｎｍの光を１時間照射すると、５−カルボキシビニルウラシルの塩基部分と、隣接するシトシン（Ｃ）が連結して図４に示される枝分かれ状の核酸を得る。これを加熱処理した後、３０２ｎｍの光を１時間照射して開裂させるとシトシンがウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）を得ることができる。
【００２４】
図７はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図７の横軸はリテンション時間（分）であり、図７の上段は光照射前のチャートであり、図７の下段は光照射後のチャートである。図７の左から２番目のピークはテンプレートのピークであり、光照射前と後で変化は無い。図７の上段の左から１番目及び３番目のピークは本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）と連結される核酸（ＯＤＮ Ｇ）のピークである。図７の下段では、原料の２種の核酸のピークに加えて、ウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）のピークが出現してきていることがわかる。
【００２５】
シトシンがウラシルに変換されたＤＮＡを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理すると、このウラシルの位置で特異的に切断することができる。したがって、ＤＮＡの任意のシトシンの位置を本発明の方法によりウラシル化することにより、ＤＮＡを任意の位置での特異的に切断することも可能となる。
図８は、前記に示した方法で得られたウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）を酵素処理した結果のＨＰＬＣのチャートを示す。左側にｄＵのピークを確認することができた。
また、同様な方法で、ｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルに変換することができる。本発明の方法によりｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルに特異的に変換することにより、コードされているアミノ酸を特異的に変更することができる。
このように、本発明の核酸類を利用することにより、ａ）光遺伝子治療をすること、ｂ）ミスマッチ検出等の遺伝子診断、ｃ）核酸をキャップ化することにより酵素耐性を付与することができ、ｄ）光変異誘導等を行うことが可能となる。次に本発明の固定化された核酸類について説明する。本発明の固定化された核酸類の代表的な例を次の化学式で示す。
【００２６】
【化６】
【００２７】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。波線はＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡなどの核酸部分を示し、太線はリンカー部分を示し、球状で示された丸は固相担体を示す。）
本発明の固定化された核酸類は、前述してきた光の照射によりＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類と可逆的に共有結合により連結し、開裂することができる本発明の核酸類が、多孔質ガラスビーズやポリスチレンなどの固相担体に結合したものであり、好ましくは核酸やポリエチレングリコール基などのリンカー部分を介して固相担体に結合したものである。
【００２８】
本発明の固定化された核酸類の利用例を模式図により図１０に示す。図１０に示す例は前述してきたテンプレートの役割をする核酸を鋳型用の核酸として使用する例である。図１０中の丸印に点線で結合している核酸が本発明の固定化された核酸類である。この核酸は図１０の右側に示される鋳型ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有している。図１０の最上段に枠で囲って示されている容器の中には種々の塩基配列を有する核酸が存在している。そして、その容器の中には、前記した鋳型ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する核酸がある。
この容器の中に本発明の固定化された核酸類と、前記した鋳型ＤＮＡを入れると、図１０の上から２段目に示されるように、本発明の固定化された核酸類と鋳型ＤＮＡの一部がハイブリダイズし、鋳型ＤＮＡの残りの部分に容器中に存在している特定の塩基配列を有する核酸がハイブリダイズする。このときに前記してきたように、本発明の光の照射により核酸類と可逆的に共有結合により連結することができる塩基と、連結される塩基とが隣り合うように鋳型ＤＮＡを設計しておくと、光の照射により、図１０の上から２段目に示されるように両者の核酸が共有結合により連結される。
【００２９】
次いで、鋳型ＤＮＡを解離させて、固相担体を分離、洗浄すると、図１０の上から３段目に示されるように、本発明の固定化された核酸類に共有結合により連結した特定の塩基配列を有する核酸を固相担体に固定化して、他の核酸とを分離することができる。
このようにして得られた固定化された核酸に、再び光を照射すると本発明の固定化された核酸類と、目的の特定の塩基配列を有する核酸とを可逆的に開裂させることができる。
このようにして、種々の塩基配列を有する核酸の混合物中から、目的とする特定の塩基配列を有する核酸を選択的に分離し、精製することができる。また、このときに使用された本発明の固定化された核酸類は、光による可逆反応により連結し、開裂するのであるから、開裂した後は元の状態の戻るので再利用することができる。
本発明のこの方法によれば、種々の塩基配列を有する核酸の混合物中から、標的とする特定の塩基配列を有する核酸を特異的かつ選択的に分離、精製することができるので、この方法により核酸混合物中の特定の塩基配列を有する核酸を同定したり、検出したり、また定量することができることになる。
【００３０】
図１１に本発明のこの方法による実験結果を示す。図１１はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのチャートであり、図１１の最上段は光を照射する前の核酸の混合物のチャートである。左から核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ａ３、核酸Ａ４の各ピークが示されている（後述する実施例１２参照）。
図１１の上から２段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ０のみが選別できたことを示すものである。同様に、図１１の上から３段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ１のみが選別できたことを示すものである。さらに、図１１の上から４段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ２のみが選別できたことを示すものである。図１１の一番下の段は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ３のみが選別できたことを示すものである。
【００３１】
本発明である固相上に固定化された光連結性核酸は、鋳型ＤＮＡによって目的の核酸のみを固相担体上に光連結させることが可能である。即ち、通常のアフィニティークロマトと違い、目的の核酸のみを共有結合により固相上への固定化が可能である。従って目的核酸の効率よい精製・分離が可能になる。また、違う波長の光照射によって目的核酸を回収することも可能である。このように高効率的な遺伝子の選別、回収が光制御可能であるため、ａ）目的ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白の精製、ｂ）遺伝子診断・遺伝子治療等、ｃ）機能性核酸の選別等への利用のみならず、ｄ）ＤＮＡ−コンピューティング、ｅ）核酸の固相担体への共有結合による固定化、ｆ）核酸の固相担体上での化学修飾等への利用も期待される。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸類は、塩基部分に次式、
【００３３】
【化７】
【００３４】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有することを特徴とするものでる。
置換基Ｘ、Ｙにおける電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ニトロ基などが挙げられるがこれらの例示したものに限定されるものではなく、細胞系への適合を考慮して適宜電子吸引基を選択することができる。好ましい電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基などが挙げられる。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。
置換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一または異なる電子吸引基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。
【００３５】
本発明の核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれであってもよく、天然又は合成のＤＮＡやＲＮＡなどと塩基対を形成し得るものが好ましい。また、本発明の核酸類は、前記した本発明の塩基だけを有するモノヌクレオチドであってもよいが、他の核酸と共にオリゴヌクレオチドになっているものが好ましい。オリゴヌクレオチドにおける塩基数は特に制限はないが、好ましくは１から１５０、より好ましくは１から５０、さらに好ましくは１から２０程度である。
オリゴヌクレオチドの場合には、本発明の前記した塩基を有する核酸を１個、好ましくは片方の末端部分に有していてもよいが、このような塩基を２個以上有していてもよい。
【００３６】
本発明の核酸類は、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。例えば、５−置換ビニルウリジンのＤＭＴｒ体にアミダイド化剤を作用させてアミダイド化し、次いで保護基を切断して、これを通常のＤＮＡ合成法によりオリゴヌクレオチドとすることができる。
５−置換ビニルシトシン誘導体又は５−置換ビニルウラシル誘導体は、以下に示す具体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法によっても製造することができる。
【００３７】
本発明の核酸類を可逆的に光連結又は開裂させる方法における、炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、縮合環を形成している炭素−炭素二重結合は好ましくなく、単環式の炭素−炭素二重結合又は環に置換している炭素−炭素二重結合が好ましい。好ましい炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシン、チミン又はウラシルなどが挙げられる。
炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれのものであってもよい。
【００３８】
炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類は、前記した本発明の核酸類とは異なる核酸であってもよいが、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類が本発明の核酸類であってもよい。後者の場合には、ひとつの核酸の中に本発明の塩基部分を有するものと、炭素−炭素二重結合を有する塩基とが存在することになり、これを連結すると環状の核酸を得ることができる。
本発明の方法における光としては、反応に必要なエネルギーを有する波長のものであればよいが、紫外線が好ましい。一般に、連結させるときは、比較的長波長側でよく、開裂させる場合には比較的短波長側の光が好ましい。より具体的には、連結させるときの波長としては、３３０ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以上、より好ましくは３６０ｎｍ以上の波長が好ましい。また、開裂させるときの波長としては、３２０ｎｍ以下、好ましくは３１０ｎｍ以下の波長が好ましい。好ましい波長としては、連結させるときの波長が３６６ｎｍで、開裂させるときの波長が３０２ｎｍである場合が挙げられる。
【００３９】
本発明の方法は、溶液中のように自由に流動できる状態で行うこともできるが、より選択性を挙げるためにはテンプレートに固定して反応させる方法が好ましい。テンプレートとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの塩基対を形成し得るものであればよい。テンプレートの長さは特に制限はないが、３塩基以上、好ましくは５塩基以上がテンプレート上で塩基対を形成できる長さのものが好ましい。
テンプレートは１本鎖のものであってよいが、前述してきたようにテンプレートとして二本鎖ＤＮＡを使用することもできる。
【００４０】
本発明のシトシンを選択的にウラシルに変換する方法における、塩基としてシトシンを有する核酸類としては、前記したテンプレートに固定化できるものであればどのようなものであってもよい。目的のシトシンの位置から上流又は下流側の３〜１０塩基程度の塩基配列を調べて、それの相補的な塩基配列を有するものをテンプレートとして使用することができる。
また、この方法における、酸素又は水などの酸素含有物としては、空気中の酸素や加水分のための水などを使用することができる。
この方法によって得られたウラシル化されたＤＮＡは、常法によるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理をすることができる。
【００４１】
本発明のＤＮＡの不活性化方法におけるＤＮＡとして、天然のものでも合成のものであってもよいが、遺伝子を対象としてもよい。
この方法により不活性化しようとする塩基の上流及び下流の各３塩基〜３０塩基程度の塩基配列を調べ、５’末端及び３’末端がその塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列となる本発明の核酸を調製する。本発明の核酸の片方の末端は前記した本発明の塩基を有するものであり、他端はこれと連結可能な炭素−炭素二重結合を有する塩基となるように調製する。そして、本発明の核酸を不活性化しようとするＤＮＡに配置して光を照射することにより、環化された本発明の核酸がＤＮＡの目的の位置に固定化される（フォトパドロック（photopadlock）法）。そして、これを解除しようとするときは、より短波長の光を照射して、連結を開裂させることにより、不活性化を解除することができる。
不活性化されるＤＮＡの特定の塩基としては、プロモーター領域が好ましいがこれに限定されるものではない。
【００４２】
以上のように、本発明の核酸類はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸類を光照射により、可逆的の連結することができるものであり、この方法により当該核酸類に枝分かれ構造やキャップ構造を導入することができることから、本発明の核酸類を可逆的光連結剤として使用することができる。
また、本発明の核酸類は、２本鎖に反応してこれを不活性化することができることから、本発明の核酸類をＤＮＡの不活性化剤として使用することができる。
【００４３】
本発明の固定化された核酸類における固相担体としては、生化学分野で使用される固相担体を使用することができる。例えば、多孔質ガラスビーズ（ＰＣＧ）などの無機物質類、ポリスチレン（ＰＳ）などの樹脂類、金などの金属類などが挙げられる。好ましい固相担体としては、アデノシン残基を有する固相担体（オリゴアフィニティーサポート（ＯＡＳ）（商品名）など）が挙げられる。より具体的には後述する実施例１１に記載されているようにアデノシン残基の環に結合しているアミノ基を介してポリスチレン（ＰＳ）（ＯＡＳ−ＰＳ）や多孔質ガラスビーズ（ＯＡＳ−ＣＰＧ）に結合している固相担体が好ましく、当該アミノ基からリンカー部分を結合させて本発明の固定化された核酸類を製造することができる。
本発明の核酸類を前記した固相担体に直接結合させてもよいが、両者をリンカー部分を介して結合させるのが好ましい。リンカー部分としては、核酸類の化学反応に不活性で、５個以上、好ましくは１０個以上の原子を有する、好ましくは直鎖状の分子種であればよい。リンカー部分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸や、次式で示されるようなポリエチレングリコールなどが好ましい。
【００４４】
【化８】
【００４５】
本発明の固定化された核酸類を製造する方法としては、本発明の核酸類の末端のリン酸基をリンカー部分に結合させて製造することができる。リンカー部分と核酸類を結合させて、次いで固相担体に結合してもよいし、逆に先に固相担体とリンカー部分を結合させて、次いでリンカー部分と核酸類とを結合させてもよい。核酸類と結合する位置は、通常は末端のリン酸基を用いるのが好ましいが、これに限定させるものではない。例えば、核酸類の途中の塩基部分の官能基と結合させてもよい。
本発明の固定化された核酸類を使用する方法においては、鋳型となる核酸を併せて使用するのが好ましい。鋳型となる核酸としては一般的にはＤＮＡが好ましいが、ＲＮＡでもＰＮＡでもよい。鋳型となる核酸は、その一部に本発明の固定化された核酸類とハイヅリダイズし得る相補的な塩基配列を含み、かつ標的となる核酸にハイブリダイズし得る相補的な塩基配列を含むものである。そして、本発明の光の照射により可逆的に連結及び開裂し得る塩基と、当該塩基と光反応をし得る塩基とが、隣り合うように鋳型となる核酸を設計する。
本発明のこの方法における鋳型となる核酸としては、前記した実験例におけるテンプレートとなり得る核酸を使用することができる。
【００４６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸の製造例の反応式を次に示す。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００４７】
【化９】
【００４８】
実施例１ ５−シアノビニルデオキシウリジン（４）の製造
（１） 化合物（２）の製造
５−ヨード−デオキシウリジン（ＩＤＵ）（１）をピリジン５ｍＬと３回共沸し、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１．７１７ｇ，１１．４０ｍｍｏｌ）と共に窒素置換し、ピリジン５ｍＬを加え均一溶液とした。これにイミダゾール（０．７７６ｇ，１１．３９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（５ｍＬ）を加え、室温で１２時間攪拌した。薄層クロマト（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、ピリジンを減圧で留去し、残留物を酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）と水（２０ｍＬ）を用いて抽出した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（２）を白色固体（１．６６１ｇ，９６．５％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
0.04-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.93(s,9H,t-BuSi), 1.96 (m,1H,H-2β'), 2.28 (m,1H,H-2α'),
3.74 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.87 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.97 (m,1H,H-4'), 4.38 (m,1H,H-3'), 6.25 (t,1H,H-1'),
8.07 (s,1H,H-6), 8.09(br,1H,NH)
【００４９】
（２） 化合物（３）の製造
Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．０１９ｇ，０．０８５ｍｍｏｌ），ＰＰｈ３（０．０４５ｇ，０．１７０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に加えた後、さらにＮＥｔ３（０．９３ｍＬ，６．６７２ｍｍｏｌ）を加え、６０℃の水浴中で攪拌した。溶液が濃赤色になった後に、前記（１）で得た化合物（２）（０．４９８ｇ，０．８５４ｍｍｏｌ）、アクリルニトリル（０．７ｍＬ，１０．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶液として加え一晩攪拌した。減圧でＤＭＦを除去した後、酢酸エチル（１５ｍＬｘ３）、水（１５ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し再び溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（３）を黄色固体（０．４３４ｇ，５３．７％）として単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
0.03-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.91 (s,9H,t-BuSi), 2.00 (m,1H,H-2'β), 2.39 (m,1H,H-2'α),
3.76 (dd,1H,H-5'), 3.87 (dd,1H,H-5'), 4.00 (m,1H,H-4'),
4.37 (m,1H,H-3'), 6.23 (t,1H,H-1'),
6.67 (dd,J=16.4Hz,1H,vinylic H-1''),
6.85 (dd,J=16.2Hz,1H,vinylic H-2''), 7.96 (s,1H,H-6),
7.98 (br,1H,NH)
【００５０】
（３） 化合物（４）の製造
前記の（２）で得られた化合物（３）（０．２３３ｇ，０．４５９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（in ＴＨＦ，１ｍｍｏｌ／ｌ）２．０ｍＬを加え室温で４５分攪拌した後、溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ５％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）により目的の化合物（４）を淡黄色固体（０．１２８ｇ，７５％）として単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：
2.15 (m,2H,H-2'αβ), 3.57 (m,1H,H-5'), 3.65 (m,1H,H-5'),
3.80 (m,1H,H-4'), 4.23 (m,1H,H-3'), 5.10 (t,1H,OH-5'),
5.26 (d,1H,OH-3'), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
6.50 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-1''),
7.22 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-2''), 8.33 (s,1H,H-6),
11.72 (br,1H,NH)
【００５１】
実施例２ ５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸（７）の製造
（１） 化合物（５）の製造
前記した実施例１で得られた化合物（４）（０．０９６ｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）をピリジン２ｍＬとの供沸操作を３回行った後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．１３３ｇ，０．３９２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０２５ｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）と共に窒素雰囲気下とした。ピリジン（１ｍＬ）を加え攪拌し、均一溶液とした。さらにここへＮＥｔ３（０．０５ｍＬ，０．３５９ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌した。減圧でピリジンを除去した後、クロロホルム（１０ｍＬｘ３）と水（１０ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した。残留物に対しカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒３％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）により目的の化合物（５）を黄色固体（０．０９６ｇ，４７．９％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
2.38 (m,1H,H-2'β), 2.49 (m,1H,H-2'α),
3.43 (dd,J=10.4Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.52 (dd,J=2.4Hz,J=10.4Hz,1H,H-5'), 3.80 (s,6H,OCH3x2),
4.11 (m,1H,H-4'), 4.68 (m,1H,H-3'),
6.50 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-1''), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
7.22 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-2''),
6.84-6.87 (m,4H,H-β to OCH3x4), 7.20-7.33 (m,9H,phenyl),
7.98 (br,1H,NH), 8.00 (s,1H,H-6)
【００５２】
（２） 化合物（７）の製造
前記の（１）で得られた化合物（５）をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移した後、減圧し溶媒を除去し、アルゴン雰囲気下とした。アセトニトリル（１ｍＬ）を加え固体を溶解させた後、アミダイト化剤（５０ｕＬ）、テトラゾール（０．５Ｍ，３６０ｕＬ）を順に加え９０分攪拌した。あらかじめＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した酢酸エチルと、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて抽出操作を行い、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を除去した。得られた固体をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移し、減圧し溶媒を除去した。さらにアセトニトリルとの供沸操作を２回行った。これ以上の精製はせず、このままＤＮＡ合成機へ取り付けオリゴマー合成を行った。
ＤＮＡ合成機を用いてオリゴマー（５’−ＣＮＵＧＣ ＧＴＧ）を合成し、ＨＰＬＣを用いて精製を行った。
【００５３】
前記した実施例２と同様の方法により、次の反応式に示される化合物（９）〜化合物（１１）を製造した。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００５４】
【化１０】
【００５５】
実施例３ 化合物（９）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着しフォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を６５℃、４時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
【００５６】
実施例４ 化合物（１０）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、緩和条件で脱保護可能なアミダイトを用いて、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を３７℃、１時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＭＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
【００５７】
実施例５ 化合物（１１）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体より２Ｎのトリメリレンジアミンのメタノール溶液で密封条件下６５℃、４時間加熱することで、ＤＮＡを修飾、切り出しそして脱保護を行った。１Ｎ酢酸で中和後、メタノール及び水を留去し、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＡＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
【００５８】
実施例６ ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体の製造
２０μＭのペプチド核酸Ｎ−ＴＧＴＧＣＣ−Ｃ（ＰＮＡ Ａ）及び、２０μＭの５’−ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｂ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｃ）の存在下、０℃で３６６ｎｍの光照射を６時間行い、目的のＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドを９０％の収率で得た。ＨＰＬＣによって単離したＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドの分子量を測定することで同定を行った。結果を図１及び図２に示す。
【００５９】
実施例７ ＤＮＡカテナンの製造
環状ＤＮＡの環中をくぐる環状ＤＮＡ（ＤＮＡカテナン）を次に示す反応式にしたがって製造した。
【００６０】
【化１１】
【００６１】
９０μＭのプラスミドＭ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ及び、末端を３２Ｐでラベルされた３０μＭの５’−ＶＣＧＴＧＣＡＧＣＴ−Ｔ４０−ＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴ（ＯＤＮ Ｆ）を、０℃で３６６ｎｍの光照射を３時間行った。光反応後、５％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を用いて電気泳動解析を行い、フォトパドロックされた目的のＤＮＡカテナンを３０％の収率で得ていることを確認した。また、この混合物にさらに３０２ｎｍの光照射を３０分行うことで定量的にＤＮＡカテナンが開裂していることをＰＡＧＥにより確認した。
結果を図９に示す。３６６ｎｍの光照射により、ＤＮＡカテナンのスポットが観察されるが、３０２ｎｍの光を照射することによりこのスポットが消失することが確認された。
【００６２】
実施例８ ２本鎖ＤＮＡをテンプレートとする環化法
次に示す反応式にしたがって２本鎖ＤＮＡをテンプレートとする環化を行った。
【００６３】
【化１２】
【００６４】
なお、反応式中のＳはポリエチレングリコールスペーサーを示している。
２０μＭの５’−ＣＶＵＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＳＳＳＳＳＳＳＳＣＣＴＣＴＴＣ−３’（ＯＤＮ Ｊ）（Ｓはポリエチレングリコールスペーサー）に対して、２０μＭの ＧＴＡＣＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣ−３’（ＯＤＮ Ｋ）及び、２０μＭの５’−ＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＣ−３’（ＯＤＮＬ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を１時間行い、目的の環化したＤＮＡを９７％の収率で得た。ＰＡＧＥ解析によって同定を行った。また３０２ｎｍ光照射を３０分行うことで原料ＯＤＮ Ｊの回復を確認した。
結果を図３に示す。
【００６５】
実施例９ 枝分かれ構造の調製
２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤＮ Ｇ）及び、２０μＭの５’−ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｈ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｉ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を０℃で１時間行い、目的の枝分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。ＨＰＬＣによって単離した枝分かれＤＮＡを測定することで同定を行った。
ＨＰＬＣの結果を図５に示す。
【００６６】
実施例１０ シトシンのウラシルへの変換
図６に示す反応経路にしたがってシトシンからウラシルへの変換を行った。
２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤＮ Ｇ）及び、２０μＭの５’−ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｈ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｉ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を０℃、１時間行い、枝分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。収率はＨＰＬＣによって算出した。次に９０℃で加熱を１時間行い、その後３０２ｎｍの光照射を３０分行ったところシトシンからウラシルへ変換されたＤＮＡ（ＯＤＮ Ｍ）を６０％の収率で得ることができた。変換されたＤＮＡの同定は酵素分解によって行った。
結果を図７及び８に示す。
【００６７】
実施例１１ 固相担体に固定化されたＤＮＡの合成
次式で表される固相担体（Oligo Affinity Support）
【００６８】
【化１３】
【００６９】
２５ｍｇを用い、ＤＮＡ自動合成機により１μｍｏｌスケールで固相担体とＤＮＡの間にリンカーとして、ヘキサエチレングリコールを１分子挿入した配列を合成した。得られたＤＮＡはアンモニア水中、６５℃で４時間加熱することによって脱保護を行った。
【００７０】
実施例１２ 光連結・切断を用いたオリゴマーの配列選択的検出
（１） Ｒｕｎ０
１．５ｍｌエッペンドルフチューブにオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０（５’−ＣＶＵＣＣＡＡＴＴＣＧ−３’）が固定された固相担体を１ｍｇとり、塩化ナトリウム１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）５０ｍＭ、鋳型ＤＮＡ Ｃ０（５’−ＣＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＣ−３’）１２０μＭ、天然ＯＤＮ Ａ０〜Ａ３（Ａ０：５’−ＴＴＧＣＴＴＣＡＡＣＴ−３’、Ａ１：５’−ＧＣＴＴＴＣＴＣＴ−３’、Ａ２：５’−ＧＣＴＴＧＡＡＧＴ−３’、Ａ３：５’−ＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴ−３’）が各１００μＭの濃度で溶液の全量が５μｌになるよう調整した。チューブを０℃で１５分放置した後、トランスイルミネーターで３６６ｎｍの光を３０分照射し、純水１ｍｌを加え、６５℃で加熱してから攪拌、遠心沈降させ、液のみを除去する操作を５回繰り返し、残った少量の水はスピードバックにより除去した。次に純水５μｌを加えて室温中でトランスイルミネーターにより３０２ｎｍの光を３０分照射し、液を１μｌ取ってＴＨＡＰをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる測定を行った。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ０の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７１】
（２） Ｒｕｎ１
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ１（５’−ＣＶＵＡＧＡＧＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ１（５’−ＣＧＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ１の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７２】
（３） Ｒｕｎ２
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ２（５’−ＣＶＵＧＣＡＴＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ２（５’−ＣＧＡＡＴＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ２の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７３】
（４） Ｒｕｎ３
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ３（５’−ＣＶＵＡＴＧＣＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ３（５’−ＣＧＡＡＧＣＡＴＡＡＴＣＣＴＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ３の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７４】
結果を図１１に示す。図１１の最上段は、光を照射する前のものであり、各ピークは左からＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ０のそれぞれの核酸のものである。図１１の上から２段目はラン０（ＲＵＮ０）のものであり、Ａ０の核酸のみのピークが観察され、Ａ０の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から３段目はラン１（ＲＵＮ１）のものであり、Ａ１の核酸のみのピークが観察され、Ａ１の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から４段目はラン２（ＲＵＮ２）のものであり、Ａ２の核酸のみのピークが観察され、Ａ２の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から５段目（一番下）はラン３（ＲＵＮ３）のものであり、Ａ３の核酸のみのピークが観察され、Ａ３の核酸のみが選択されたことを確認することができる。
【００７５】
【発明の効果】
本発明は、短時間で効率よく核酸類を可逆的に連結できる新規な核酸類を提供する。本発明の核酸類を用いることにより、狙った位置で核酸同士を光連結したり、キャップ構造や枝分かれ構造を光を用いて簡便にしかも効率良く構築することができる。核酸を本発明の方法により光キャップ化することにより、分解酵素への耐性を付与することができる。また、光を用いてユニークな構造を持つ核酸を合成するため、環境にもやさしい方法である。
また、本発明の方法を用いれば対象遺伝子上の任意のシトシンをウラシルへと変異させることができる。これをウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理を行うことで任意の位置で特異的に切断することができる。このような変換はＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルへ特異的に変換し、ｍＲＮＡの遺伝情報を特異的に変更することができる。
さらに、本発明の方法により２本鎖ＤＮＡの特定の位置を、可逆的に不活性化することができ、遺伝子治療やミスマッチ検出等の遺伝子診断に応用することができる。
また、本発明の固相上に固定化された光連結性核酸は、鋳型ＤＮＡによって目的の核酸のみを固相担体上に光連結させることが可能である。即ち、通常のアフィニティークロマトと違い、目的の核酸のみを共有結合により固相上への固定化が可能である。従って目的核酸の効率よい精製・分離が可能になる。また、違う波長の光照射によって目的核酸を回収することも可能である。このように高効率的な遺伝子の選別、回収が光制御可能であるため、ａ）目的ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白の精製、ｂ）遺伝子診断・遺伝子治療等、ｃ）機能性核酸の選別等への利用のみならず、ｄ）ＤＮＡ−コンピューティング、ｅ）核酸の固相担体への共有結合による固定化、ｆ）核酸の固相担体上での化学修飾等への利用も期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法によりＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体を製造した結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明の方法により、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を製造した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図３】図３は、本発明の方法により、２本鎖ＤＮＡを不活性化した結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、本発明の核酸に枝分かれ構造を導入する方法を例示したものである。
【図５】図５は、本発明の方法により、枝分かれ構造を有する核酸を製造した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図６】図６は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法を例示したものである。
【図７】図７は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法による結果を示したＨＰＬＣのチャートである。
【図８】図８は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法により製造されたウラシルを含有する核酸を酵素処理した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図９】図９は、本発明の方法により製造されたＤＮＡカテナンの製造結果を示した図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、本発明の固定化された核酸類を用いて核酸混合物中から、目的の核酸のみを特異的に選択する方法を模式図として示したものである。
【図１１】図１１は、本発明の固定化された核酸類を用いて核酸混合物中から、目的の核酸のみを特異的に選択する方法の結果を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのチャートである。図１１の最上段は、光を照射する前のものであり、各ピークは左からＳＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ０のそれぞれの核酸のものである。図１１の上から２段目は実施例１２のラン０のものであり、３段目はラン１のものであり、４段目はラン２のものであり、５段目（一番下）はラン３のものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピリミジンの５位に置換ビニル基を有するピリミジン塩基の光反応性を利用した可逆的に核酸類を簡便かつ効率的に連結する方法、そのための核酸類、それを用いたＤＮＡの不活性化方法などに関する。本発明の方法により、キャップした核酸類や枝分かれ構造を持つ核酸類を簡便に且つ効率的に合成することができる。
また、本発明は、固相担体に固定化されたピリミジンの５位に置換ビニル基を有するピリミジン塩基を有する核酸類、並びに当該核酸類を用いた特定の塩基配列を有する核酸類の固定化方法、精製、回収方法、及び同定、検出、又は定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡやＰＮＡ（ペプチド核酸）などの核酸類を連結する方法としては、これらの核酸類の基本となる鎖を連結していた。このような方法によれば、末端をキャップした核酸類や及び枝分かれ構造を持つ核酸類を合成することは困難であった。このような末端をキャップした核酸及び枝分かれ構造を持つ核酸の合成法としては、リンカーを導入してこれらを連結するなどの方法が必要であった。
また、ＤＮＡとＰＮＡのように核酸類の基本となる鎖が異なる場合には、これらを直接連結することができなかった。さらに、従来のこのような方法では、連結後の特異性がなく、連結と開裂を特異的に行うことができなかった。
本発明者らは、先に光照射による核酸類の連結と開裂方法について特許出願してきたが、従来の方法では収率が低く、また処理に長時間を要するという欠点があった。
【０００３】
また、固相上に固定化された核酸は、アフィニティークロマトにより、目的とする核酸選別や試験管内で進化した核酸の選別に利用されており、遺伝子工学のツールとして広範囲に利用されている。核酸を固相上に固定化する方法としては、ビオチンを有する核酸をビオチン−アビジン相互作用により固相担体に固定化する方法、マグネティックビーズを用いて固定化する方法、あらかじめ固定化されている核酸に対して酵素を用いて目的とする核酸を連結させることで固定化する方法などが知られている。また、核酸の精製法としては、上述のビオチンを有する核酸や、マグネティックビーズを用いた固定化核酸によるアフィニティーカラム精製が一般的である。
このように、核酸の精製や同定のために核酸を固定化する各種の方法が知られているが、いずれの方法も標的となる核酸を固定化核酸との水素結合によるアフィニティを利用して固定化するものであり、共有結合により標的となる核酸類を固定化する方法は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、光照射により核酸類同士を可逆的に連結することができる新規な塩基を有する核酸類を提供するものである。
また、本発明は、枝分かれ核酸及びキャップ核酸を簡便に合成することができる新規な方法を提供するものである。
さらに、本発明は、酵素や化学反応試薬を用いずに、光により固相担体上へ核酸類を固定化する方法を提供するものであり、水素結合相互作用に基づくのではなく、共有結合により強固に固相担体上に固定化できる方法、並びにこの方法を用いた核酸類の精製、回収方法、及び同定、検出、定量方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ピリミジンの５位に置換ビニル基を有するピリミジン塩基の光反応性を利用することにより、可逆的に核酸類を連結することができ、これを用いてキャップした核酸類や枝分かれ構造を持つ核酸類を簡便に合成することができることを見出した。
また、本発明者らは、ピリミジンの５位にビニル基を有する置換基を有する核酸類を固相担体上に固定化し、光をトリガーにして目的となる核酸を共有結合により連結させて固定化できることに成功した。また、違う波長の光照射により目的となる核酸の定量的回収が可能になるだけでなく、光連結性核酸含有固相担体の回収・再利用も可能であることがわかった。
即ち、本発明は、塩基部分として次式、
【０００６】
【化２】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有する核酸類、及び当該核酸が固相担体に固定化された核酸類に関する。
また、本発明は、前記した本発明の核酸類と、炭素−炭素二重結合、好ましくは非縮合環系の炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類に光を照射して、核酸類を可逆的に光連結又は開裂させる方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の核酸類と、塩基としてシトシンを有する核酸類に光を照射して塩基同士を連結させ、酸素又は水などの酸素含有物の存在下にシトシンのアミノ基を分解して、次いでより短波長の光を照射して前記塩基同士の連結を開裂させることからなるシトシンを選択的にウラシルに変換する方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、ＤＮＡの特定の塩基を対象として、前記した本発明の核酸類の５’末端及び３’末端が、前記ＤＮＡの特定の塩基の周辺の塩基配列と相補的な塩基配列を有する本発明の核酸類を配置して、これに光を照射してなる前記ＤＮＡの不活性化方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の固定化された核酸類を用いた、標的となる特定の核酸類の固定化方法、標的となる特定の核酸類を精製及び／又は回収する方法、並びに同定及び／又は検出及び／又は定量する方法に関する。
即ち、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の標的とする特定の核酸類を共有結合により光連結させてなる核酸類の固定化する方法に関し、また、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の標的とする特定の核酸類を共有結合により光連結させて核酸混合物中の特定の核酸類を固定化し、固定化された核酸類を分離又は回収することからなる核酸混合物中の特定の核酸類を同定、検出又は定量する方法に関し、さらに、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の目的の特定の核酸類を共有結合により光連結させて核酸混合物中の特定の核酸類を固定化し、固定化された核酸類を精製又は回収した後、さらに光を照射して固定化された核酸類を光開裂させることからなる、特定の核酸類を精製、回収する方法に関する。
【０００９】
このように、本発明の核酸類は、光の照射によりＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類と可逆的に連結し、開裂することができるものであり、ＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類の可逆的光連結剤として有用なものである。また、本発明の核酸類は、２本鎖ＤＮＡをテンプレートとして光反応を行うことが可能であり、このような方法で遺伝子の特定の塩基配列の箇所において本発明の核酸類を連結させることにより、２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列の箇所に本発明の方法により塩基と塩基とが光反応により連結した３本目の核酸類を導入することができる。この結果当該２本鎖ＤＮＡの転写等が抑制され、ＤＮＡを不活性化することから本発明の核酸類はＤＮＡ不活性化剤としても有用である。
【００１０】
ＰＮＡ（ペプチド核酸）は、天然のＤＮＡよりもより強くＤＮＡの相補鎖に結合することができることから、遺伝子治療におけるアンチジーン又はアンチセンスとして使用されている。しかし、ＰＮＡは水への溶解性が低く、細胞内や核内への輸送効率が低いことが課題とされている。これを改善するために、ＤＮＡの親水性と膜親和性を利用したＰＮＡ−ＤＮＡのキメラ複合体が注目されてきているが、ＤＮＡとＰＮＡとでは基本となる鎖が異なるために、その合成法は煩雑なものであった。
本発明者らは、ピリミジンの５位に電子吸引基で置換されたビニル基を有するピリミジン塩基、例えば次式（Ｘ）、
【００１１】
【化３】
で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基とする核酸を末端に有する核酸を用いて、この光反応性を利用することによる可逆的な核酸の連結を行った。
まず、テンプレートとなるＤＮＡ上にその相補鎖となるＰＮＡを配置し、次いでＰＮＡの末端部分に前記した塩基を有する本発明の核酸を配置し、これに３６６ｎｍの光を３時間照射させることにより、塩基部分で連結したＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体を得た。この反応式を次式で示す。
【００１３】
【化４】
テンプレート（ＯＤＮ Ｃ）にＰＮＡ（ＰＮＡ Ａ）及び本発明の核酸（ＯＤＮ Ｂ）を配置し３６６ｎｍの光を照射して、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体（ＰＮＡ−ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄ Ｅ）を得る。このスキームではテンプレート（ＯＤＮ Ｃ）は直接反応には関与しないが、便宜的に生成物のほうのテンプレートをテンプレート（ＯＤＮ Ｄ）としている。
【００１５】
この結果を図１に示す。図１は図面に代わる写真である。図１の右側（−）は光を照射する前のスポットであり、これは３２Ｐで標識化された本発明の核酸である。これに光を照射した後のものが左側（＋）に示されている。光を照射することによりＰＮＡと本発明の核酸が連結されて、より高分子量の位置にスポットが移動していることがわかる。
図２はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図２の横軸はリテンション時間（分）であり、図３の上段は光照射前のチャートであり、図３の下段は光照射後のチャートである。
図３の一番左側のピークはテンプレート（ＯＤＮ Ｃ）のピークであり、光照射前と後で変化は無い。（ａ）の左から２番目及び３番目のピークは本発明の核酸（ＯＤＮ Ｂ）と連結されるＰＮＡ（ＰＮＡ Ａ）のピークである。図２の下段では、原料の２種の核酸のピークはほぼ消失して、より高分子量の生成物のピークが出現してきていることがわかる。
このように、本発明の核酸の塩基であるピリミジンの５位の置換ビニル基の二重結合と、隣接する塩基の炭素−炭素二重結合が光により直接結合するものであり、ＰＮＡとＤＮＡのように基本となる鎖が相違していても、塩基同士により連結することが可能となる。さらに、この光による連結は光可逆反応であり、異なる波長の光を照射することにより、可逆的に開裂させることも可能である。
また、この方法を応用することにより、光によって末端をキャップした核酸を簡便に合成することが可能になる。遺伝子治療においては、遺伝子を核に送り込むためには遺伝子に酵素耐性を付与しなければならず、本発明の核酸の光キャップ化によってこのような酵素耐性を付与することができる。
【００１６】
次に、前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基とする核酸を用いて、シチジン（シトシン塩基）との光反応を行ったところ、３６６ｎｍの紫外線を３０分間照射することにより、９３％の収率で目的の連結ＤＮＡが得られた。比較例として、カルボキシル基が置換していない５−ビニルウラシルを塩基とする核酸を用いた場合には、６時間の照射で８０％の収率であった。
このように、ビニル基の水素原子をカルボキシル基のような電子吸引基で置換することにより、短時間で且つ高収率で反応を行わせることができることがわかった。
【００１７】
本発明の連結反応はＤＮＡやＲＮＡなどをテンプレートとして用いることが好ましい。即ち、前記したＰＮＡとの反応式に示したように、ＤＮＡをテンプレートとして、その上にその相補鎖の連結されるべき核酸を置き、連結部分が隣接するように隣接して本発明の核酸を配置して光を照射するのが好ましい。このようなテンプレートを使用することにより、目的の位置で選択的に連結を行うことができる。
本発明者は、このようなテンプレートとして、２本鎖のＤＮＡを使用することができるかどうかを検討した。２本鎖のＤＮＡにさらに３本目のＤＮＡなどの核酸が塩基対を形成することは、フーゲスティン塩基対（Hoogsteen base pair）として知られているとおりである。
そこで、核酸の一端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基を有し、他端にシトシン塩基（Ｐｙ）を有する核酸を用意し、この核酸の両端が隣接するように両端部分の塩基を２本鎖ＤＮＡの塩基対と対を形成させた。この反応式を次に示す。
【００１８】
【化５】
これに３６６ｎｍの光を照射させることにより、環状のＤＮＡを８９％の収率で得た。
結果を図３に示す。図３は図面に代わる写真である。図３のレーン１はコントロールとして１２ｍｅｒの核酸を示したものであり、レーン２は光照射の無い場合のものであり、環状になっていない核酸のスポットがみられる。レーン３は３６６ｎｍの光を照射したときのものであり、環状の核酸のスポットがみられる。レーン４はこれにさらに３０２ｎｍの光を照射したものであり、環が開環してもとの鎖状のもののスポットが出現していることがわかる。
得られたＤＮＡは、２本鎖ＤＮＡに、塩基部分が光環化反応により環化されたＤＮＡが塩基対を形成しているものであり、この部分にはＲＮＡポリメラーゼなどの酵素や他のタンパク質が結合することができず、その結果この部分の遺伝子の発現が抑制されることになる。したがって、この方法により発現を抑制したい遺伝子の発現を阻害することが可能となり、本発明の核酸を遺伝子治療として使用できる。
また、得られた環状ＤＮＡに、３０２ｎｍの光を照射することにより、可逆的に開環することができ、遺伝子の発現の抑制を解除することも可能である。
【００２０】
次に枝分かれの核酸の製造方法について検討した。
図４にその概要を示す。例えば、ＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡＣの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ Ｉ）に、末端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基（図４中ではＶＣＵ）を有するＵＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有する本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）を配置し、その隣接する位置に・・・ＴＧＴＧＣ・・・の部分配列を有する核酸（ＯＤＮ Ｇ）を配置する。これらの塩基配列はテンプレートに相補的な配列であり、目的核酸の塩基配列に応じてテンプレートの塩基配列を選択することができる。
これに３６６ｎｍの光を１時間照射すると、５−カルボキシビニルウラシルの塩基部分と、隣接するシトシン（Ｃ）が連結して図４に示される枝分かれ状の核酸を得ることができる。
【００２１】
図５はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図５の横軸はリテンション時間（分）であり、図５のａ）（図５の上段）は光照射前のチャートであり、図５のｂ）（図５の下段）は光照射後のチャートである。
図５の一番左側のピークはテンプレートのピークであり、光照射前と後で変化は無い。（ａ）の左から２番目及び３番目のピークは本発明の核酸と連結される核酸のピークである。図５の（ｂ）では、原料の２種の核酸のピークは消失して、より高分子量の生成物の大きなピークが出現してきていることがわかる。このピークの分子量は５２５０．１２で、計算値の５２４９．９０と一致した。
【００２２】
さらに、本発明の方法によれば、対象遺伝子上の任意のシトシンをウラシルへと変異させることが可能になる。
即ち、前記した枝分かれ状の核酸を製造するのと同様にして、対象遺伝子のシトシン（Ｃ）の塩基までをテンプレートに固定化し、当該シトシンに隣接して本発明の核酸を配置して光を照射すると、対象遺伝子と本発明の核酸が連結する。この連結した状態のときに、シトシンの４位のアミノ基を酸素又は水などの酸素含有物の存在下の水酸基に置換することができる。例えば、連結した状態で空気中で穏やかに温度を上げてゆくと空気酸化されて、シトシンのピリミジン環の４位のアミノ基が水酸基に置換される。そして、再度光を照射して、連結を開裂させると、シトシンがウラシルに変換されることになる。
【００２３】
この反応式を図６に示す。枝分かれ構造の核酸を製造するところまでは、前述したのと同様である。即ち、例えば、ＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡＣの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ Ｉ）に、末端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基（図６中ではＶＣＵ（以下の説明ではＣＶＵと標記することもある。））を有するＵＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有する本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）を配置し、その隣接する位置に・・・ＴＧＴＧＣ・・・の部分配列を有する核酸（ＯＤＮ Ｇ）を配置する。これらの塩基配列はテンプレートに相補的な配列であり、目的核酸の塩基配列に応じてテンプレートの塩基配列を選択することができる。
これに３６６ｎｍの光を１時間照射すると、５−カルボキシビニルウラシルの塩基部分と、隣接するシトシン（Ｃ）が連結して図４に示される枝分かれ状の核酸を得る。これを加熱処理した後、３０２ｎｍの光を１時間照射して開裂させるとシトシンがウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）を得ることができる。
【００２４】
図７はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図７の横軸はリテンション時間（分）であり、図７の上段は光照射前のチャートであり、図７の下段は光照射後のチャートである。図７の左から２番目のピークはテンプレートのピークであり、光照射前と後で変化は無い。図７の上段の左から１番目及び３番目のピークは本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）と連結される核酸（ＯＤＮ Ｇ）のピークである。図７の下段では、原料の２種の核酸のピークに加えて、ウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）のピークが出現してきていることがわかる。
【００２５】
シトシンがウラシルに変換されたＤＮＡを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理すると、このウラシルの位置で特異的に切断することができる。したがって、ＤＮＡの任意のシトシンの位置を本発明の方法によりウラシル化することにより、ＤＮＡを任意の位置での特異的に切断することも可能となる。
図８は、前記に示した方法で得られたウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）を酵素処理した結果のＨＰＬＣのチャートを示す。左側にｄＵのピークを確認することができた。
また、同様な方法で、ｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルに変換することができる。本発明の方法によりｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルに特異的に変換することにより、コードされているアミノ酸を特異的に変更することができる。
このように、本発明の核酸類を利用することにより、ａ）光遺伝子治療をすること、ｂ）ミスマッチ検出等の遺伝子診断、ｃ）核酸をキャップ化することにより酵素耐性を付与することができ、ｄ）光変異誘導等を行うことが可能となる。次に本発明の固定化された核酸類について説明する。本発明の固定化された核酸類の代表的な例を次の化学式で示す。
【００２６】
【化６】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。波線はＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡなどの核酸部分を示し、太線はリンカー部分を示し、球状で示された丸は固相担体を示す。）
本発明の固定化された核酸類は、前述してきた光の照射によりＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類と可逆的に共有結合により連結し、開裂することができる本発明の核酸類が、多孔質ガラスビーズやポリスチレンなどの固相担体に結合したものであり、好ましくは核酸やポリエチレングリコール基などのリンカー部分を介して固相担体に結合したものである。
【００２８】
本発明の固定化された核酸類の利用例を模式図により図１０に示す。図１０に示す例は前述してきたテンプレートの役割をする核酸を鋳型用の核酸として使用する例である。図１０中の丸印に点線で結合している核酸が本発明の固定化された核酸類である。この核酸は図１０の右側に示される鋳型ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有している。図１０の最上段に枠で囲って示されている容器の中には種々の塩基配列を有する核酸が存在している。そして、その容器の中には、前記した鋳型ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する核酸がある。
この容器の中に本発明の固定化された核酸類と、前記した鋳型ＤＮＡを入れると、図１０の上から２段目に示されるように、本発明の固定化された核酸類と鋳型ＤＮＡの一部がハイブリダイズし、鋳型ＤＮＡの残りの部分に容器中に存在している特定の塩基配列を有する核酸がハイブリダイズする。このときに前記してきたように、本発明の光の照射により核酸類と可逆的に共有結合により連結することができる塩基と、連結される塩基とが隣り合うように鋳型ＤＮＡを設計しておくと、光の照射により、図１０の上から２段目に示されるように両者の核酸が共有結合により連結される。
【００２９】
次いで、鋳型ＤＮＡを解離させて、固相担体を分離、洗浄すると、図１０の上から３段目に示されるように、本発明の固定化された核酸類に共有結合により連結した特定の塩基配列を有する核酸を固相担体に固定化して、他の核酸とを分離することができる。
このようにして得られた固定化された核酸に、再び光を照射すると本発明の固定化された核酸類と、目的の特定の塩基配列を有する核酸とを可逆的に開裂させることができる。
このようにして、種々の塩基配列を有する核酸の混合物中から、目的とする特定の塩基配列を有する核酸を選択的に分離し、精製することができる。また、このときに使用された本発明の固定化された核酸類は、光による可逆反応により連結し、開裂するのであるから、開裂した後は元の状態の戻るので再利用することができる。
本発明のこの方法によれば、種々の塩基配列を有する核酸の混合物中から、標的とする特定の塩基配列を有する核酸を特異的かつ選択的に分離、精製することができるので、この方法により核酸混合物中の特定の塩基配列を有する核酸を同定したり、検出したり、また定量することができることになる。
【００３０】
図１１に本発明のこの方法による実験結果を示す。図１１はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのチャートであり、図１１の最上段は光を照射する前の核酸の混合物のチャートである。左から核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ａ３、核酸Ａ４の各ピークが示されている（後述する実施例１２参照）。
図１１の上から２段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ０のみが選別できたことを示すものである。同様に、図１１の上から３段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ１のみが選別できたことを示すものである。さらに、図１１の上から４段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ２のみが選別できたことを示すものである。図１１の一番下の段は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ３のみが選別できたことを示すものである。
【００３１】
本発明である固相上に固定化された光連結性核酸は、鋳型ＤＮＡによって目的の核酸のみを固相担体上に光連結させることが可能である。即ち、通常のアフィニティークロマトと違い、目的の核酸のみを共有結合により固相上への固定化が可能である。従って目的核酸の効率よい精製・分離が可能になる。また、違う波長の光照射によって目的核酸を回収することも可能である。このように高効率的な遺伝子の選別、回収が光制御可能であるため、ａ）目的ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白の精製、ｂ）遺伝子診断・遺伝子治療等、ｃ）機能性核酸の選別等への利用のみならず、ｄ）ＤＮＡ−コンピューティング、ｅ）核酸の固相担体への共有結合による固定化、ｆ）核酸の固相担体上での化学修飾等への利用も期待される。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸類は、塩基部分に次式、
【００３３】
【化７】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有することを特徴とするものでる。
置換基Ｘ、Ｙにおける電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ニトロ基などが挙げられるがこれらの例示したものに限定されるものではなく、細胞系への適合を考慮して適宜電子吸引基を選択することができる。好ましい電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基などが挙げられる。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。
置換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一または異なる電子吸引基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。
【００３５】
本発明の核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれであってもよく、天然又は合成のＤＮＡやＲＮＡなどと塩基対を形成し得るものが好ましい。また、本発明の核酸類は、前記した本発明の塩基だけを有するモノヌクレオチドであってもよいが、他の核酸と共にオリゴヌクレオチドになっているものが好ましい。オリゴヌクレオチドにおける塩基数は特に制限はないが、好ましくは１から１５０、より好ましくは１から５０、さらに好ましくは１から２０程度である。
オリゴヌクレオチドの場合には、本発明の前記した塩基を有する核酸を１個、好ましくは片方の末端部分に有していてもよいが、このような塩基を２個以上有していてもよい。
【００３６】
本発明の核酸類は、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。例えば、５−置換ビニルウリジンのＤＭＴｒ体にアミダイド化剤を作用させてアミダイド化し、次いで保護基を切断して、これを通常のＤＮＡ合成法によりオリゴヌクレオチドとすることができる。
５−置換ビニルシトシン誘導体又は５−置換ビニルウラシル誘導体は、以下に示す具体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法によっても製造することができる。
【００３７】
本発明の核酸類を可逆的に光連結又は開裂させる方法における、炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、縮合環を形成している炭素−炭素二重結合は好ましくなく、単環式の炭素−炭素二重結合又は環に置換している炭素−炭素二重結合が好ましい。好ましい炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシン、チミン又はウラシルなどが挙げられる。
炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれのものであってもよい。
【００３８】
炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類は、前記した本発明の核酸類とは異なる核酸であってもよいが、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類が本発明の核酸類であってもよい。後者の場合には、ひとつの核酸の中に本発明の塩基部分を有するものと、炭素−炭素二重結合を有する塩基とが存在することになり、これを連結すると環状の核酸を得ることができる。
本発明の方法における光としては、反応に必要なエネルギーを有する波長のものであればよいが、紫外線が好ましい。一般に、連結させるときは、比較的長波長側でよく、開裂させる場合には比較的短波長側の光が好ましい。より具体的には、連結させるときの波長としては、３３０ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以上、より好ましくは３６０ｎｍ以上の波長が好ましい。また、開裂させるときの波長としては、３２０ｎｍ以下、好ましくは３１０ｎｍ以下の波長が好ましい。好ましい波長としては、連結させるときの波長が３６６ｎｍで、開裂させるときの波長が３０２ｎｍである場合が挙げられる。
【００３９】
本発明の方法は、溶液中のように自由に流動できる状態で行うこともできるが、より選択性を挙げるためにはテンプレートに固定して反応させる方法が好ましい。テンプレートとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの塩基対を形成し得るものであればよい。テンプレートの長さは特に制限はないが、３塩基以上、好ましくは５塩基以上がテンプレート上で塩基対を形成できる長さのものが好ましい。
テンプレートは１本鎖のものであってよいが、前述してきたようにテンプレートとして二本鎖ＤＮＡを使用することもできる。
【００４０】
本発明のシトシンを選択的にウラシルに変換する方法における、塩基としてシトシンを有する核酸類としては、前記したテンプレートに固定化できるものであればどのようなものであってもよい。目的のシトシンの位置から上流又は下流側の３〜１０塩基程度の塩基配列を調べて、それの相補的な塩基配列を有するものをテンプレートとして使用することができる。
また、この方法における、酸素又は水などの酸素含有物としては、空気中の酸素や加水分のための水などを使用することができる。
この方法によって得られたウラシル化されたＤＮＡは、常法によるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理をすることができる。
【００４１】
本発明のＤＮＡの不活性化方法におけるＤＮＡとして、天然のものでも合成のものであってもよいが、遺伝子を対象としてもよい。
この方法により不活性化しようとする塩基の上流及び下流の各３塩基〜３０塩基程度の塩基配列を調べ、５’末端及び３’末端がその塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列となる本発明の核酸を調製する。本発明の核酸の片方の末端は前記した本発明の塩基を有するものであり、他端はこれと連結可能な炭素−炭素二重結合を有する塩基となるように調製する。そして、本発明の核酸を不活性化しようとするＤＮＡに配置して光を照射することにより、環化された本発明の核酸がＤＮＡの目的の位置に固定化される（フォトパドロック（photopadlock）法）。そして、これを解除しようとするときは、より短波長の光を照射して、連結を開裂させることにより、不活性化を解除することができる。
不活性化されるＤＮＡの特定の塩基としては、プロモーター領域が好ましいがこれに限定されるものではない。
【００４２】
以上のように、本発明の核酸類はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸類を光照射により、可逆的の連結することができるものであり、この方法により当該核酸類に枝分かれ構造やキャップ構造を導入することができることから、本発明の核酸類を可逆的光連結剤として使用することができる。
また、本発明の核酸類は、２本鎖に反応してこれを不活性化することができることから、本発明の核酸類をＤＮＡの不活性化剤として使用することができる。
【００４３】
本発明の固定化された核酸類における固相担体としては、生化学分野で使用される固相担体を使用することができる。例えば、多孔質ガラスビーズ（ＰＣＧ）などの無機物質類、ポリスチレン（ＰＳ）などの樹脂類、金などの金属類などが挙げられる。好ましい固相担体としては、アデノシン残基を有する固相担体（オリゴアフィニティーサポート（ＯＡＳ）（商品名）など）が挙げられる。より具体的には後述する実施例１１に記載されているようにアデノシン残基の環に結合しているアミノ基を介してポリスチレン（ＰＳ）（ＯＡＳ−ＰＳ）や多孔質ガラスビーズ（ＯＡＳ−ＣＰＧ）に結合している固相担体が好ましく、当該アミノ基からリンカー部分を結合させて本発明の固定化された核酸類を製造することができる。
本発明の核酸類を前記した固相担体に直接結合させてもよいが、両者をリンカー部分を介して結合させるのが好ましい。リンカー部分としては、核酸類の化学反応に不活性で、５個以上、好ましくは１０個以上の原子を有する、好ましくは直鎖状の分子種であればよい。リンカー部分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸や、次式で示されるようなポリエチレングリコールなどが好ましい。
【００４４】
【化８】
本発明の固定化された核酸類を製造する方法としては、本発明の核酸類の末端のリン酸基をリンカー部分に結合させて製造することができる。リンカー部分と核酸類を結合させて、次いで固相担体に結合してもよいし、逆に先に固相担体とリンカー部分を結合させて、次いでリンカー部分と核酸類とを結合させてもよい。核酸類と結合する位置は、通常は末端のリン酸基を用いるのが好ましいが、これに限定させるものではない。例えば、核酸類の途中の塩基部分の官能基と結合させてもよい。
本発明の固定化された核酸類を使用する方法においては、鋳型となる核酸を併せて使用するのが好ましい。鋳型となる核酸としては一般的にはＤＮＡが好ましいが、ＲＮＡでもＰＮＡでもよい。鋳型となる核酸は、その一部に本発明の固定化された核酸類とハイヅリダイズし得る相補的な塩基配列を含み、かつ標的となる核酸にハイブリダイズし得る相補的な塩基配列を含むものである。そして、本発明の光の照射により可逆的に連結及び開裂し得る塩基と、当該塩基と光反応をし得る塩基とが、隣り合うように鋳型となる核酸を設計する。
本発明のこの方法における鋳型となる核酸としては、前記した実験例におけるテンプレートとなり得る核酸を使用することができる。
【００４６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸の製造例の反応式を次に示す。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００４７】
【化９】
実施例１ ５−シアノビニルデオキシウリジン（４）の製造
（１） 化合物（２）の製造
５−ヨード−デオキシウリジン（ＩＤＵ）（１）をピリジン５ｍＬと３回共沸し、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１．７１７ｇ，１１．４０ｍｍｏｌ）と共に窒素置換し、ピリジン５ｍＬを加え均一溶液とした。これにイミダゾール（０．７７６ｇ，１１．３９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（５ｍＬ）を加え、室温で１２時間攪拌した。薄層クロマト（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、ピリジンを減圧で留去し、残留物を酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）と水（２０ｍＬ）を用いて抽出した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（２）を白色固体（１．６６１ｇ，９６．５％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
0.04-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.93(s,9H,t-BuSi), 1.96 (m,1H,H-2β'), 2.28 (m,1H,H-2α'),
3.74 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.87 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.97 (m,1H,H-4'), 4.38 (m,1H,H-3'), 6.25 (t,1H,H-1'),
8.07 (s,1H,H-6), 8.09(br,1H,NH)
【００４９】
（２） 化合物（３）の製造
Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．０１９ｇ，０．０８５ｍｍｏｌ），ＰＰｈ３（０．０４５ｇ，０．１７０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に加えた後、さらにＮＥｔ３（０．９３ｍＬ，６．６７２ｍｍｏｌ）を加え、６０℃の水浴中で攪拌した。溶液が濃赤色になった後に、前記（１）で得た化合物（２）（０．４９８ｇ，０．８５４ｍｍｏｌ）、アクリルニトリル（０．７ｍＬ，１０．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶液として加え一晩攪拌した。減圧でＤＭＦを除去した後、酢酸エチル（１５ｍＬｘ３）、水（１５ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し再び溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（３）を黄色固体（０．４３４ｇ，５３．７％）として単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
0.03-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.91 (s,9H,t-BuSi), 2.00 (m,1H,H-2'β), 2.39 (m,1H,H-2'α),
3.76 (dd,1H,H-5'), 3.87 (dd,1H,H-5'), 4.00 (m,1H,H-4'),
4.37 (m,1H,H-3'), 6.23 (t,1H,H-1'),
6.67 (dd,J=16.4Hz,1H,vinylic H-1''),
6.85 (dd,J=16.2Hz,1H,vinylic H-2''), 7.96 (s,1H,H-6),
7.98 (br,1H,NH)
【００５０】
（３） 化合物（４）の製造
前記の（２）で得られた化合物（３）（０．２３３ｇ，０．４５９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（in ＴＨＦ，１ｍｍｏｌ／ｌ）２．０ｍＬを加え室温で４５分攪拌した後、溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ５％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）により目的の化合物（４）を淡黄色固体（０．１２８ｇ，７５％）として単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：
2.15 (m,2H,H-2'αβ), 3.57 (m,1H,H-5'), 3.65 (m,1H,H-5'),
3.80 (m,1H,H-4'), 4.23 (m,1H,H-3'), 5.10 (t,1H,OH-5'),
5.26 (d,1H,OH-3'), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
6.50 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-1''),
7.22 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-2''), 8.33 (s,1H,H-6),
11.72 (br,1H,NH)
【００５１】
実施例２ ５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸（７）の製造
（１） 化合物（５）の製造
前記した実施例１で得られた化合物（４）（０．０９６ｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）をピリジン２ｍＬとの供沸操作を３回行った後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．１３３ｇ，０．３９２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０２５ｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）と共に窒素雰囲気下とした。ピリジン（１ｍＬ）を加え攪拌し、均一溶液とした。さらにここへＮＥｔ３（０．０５ｍＬ，０．３５９ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌した。減圧でピリジンを除去した後、クロロホルム（１０ｍＬｘ３）と水（１０ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した。残留物に対しカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒３％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ３）により目的の化合物（５）を黄色固体（０．０９６ｇ，４７．９％）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
2.38 (m,1H,H-2'β), 2.49 (m,1H,H-2'α),
3.43 (dd,J=10.4Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.52 (dd,J=2.4Hz,J=10.4Hz,1H,H-5'), 3.80 (s,6H,OCH3x2),
4.11 (m,1H,H-4'), 4.68 (m,1H,H-3'),
6.50 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-1''), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
7.22 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-2''),
6.84-6.87 (m,4H,H-β to OCH3x4), 7.20-7.33 (m,9H,phenyl),
7.98 (br,1H,NH), 8.00 (s,1H,H-6)
【００５２】
（２） 化合物（７）の製造
前記の（１）で得られた化合物（５）をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移した後、減圧し溶媒を除去し、アルゴン雰囲気下とした。アセトニトリル（１ｍＬ）を加え固体を溶解させた後、アミダイト化剤（５０ｕＬ）、テトラゾール（０．５Ｍ，３６０ｕＬ）を順に加え９０分攪拌した。あらかじめＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した酢酸エチルと、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて抽出操作を行い、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を除去した。得られた固体をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移し、減圧し溶媒を除去した。さらにアセトニトリルとの供沸操作を２回行った。これ以上の精製はせず、このままＤＮＡ合成機へ取り付けオリゴマー合成を行った。
ＤＮＡ合成機を用いてオリゴマー（５’−ＣＮＵＧＣ ＧＴＧ）を合成し、ＨＰＬＣを用いて精製を行った。
前記した実施例２と同様の方法により、次の反応式に示される化合物（９）〜化合物（１１）を製造した。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００５４】
【化１０】
実施例３ 化合物（９）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着しフォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を６５℃、４時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
実施例４ 化合物（１０）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、緩和条件で脱保護可能なアミダイトを用いて、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を３７℃、１時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＭＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
実施例５ 化合物（１１）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体より２Ｎのトリメリレンジアミンのメタノール溶液で密封条件下６５℃、４時間加熱することで、ＤＮＡを修飾、切り出しそして脱保護を行った。１Ｎ酢酸で中和後、メタノール及び水を留去し、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−ＶＡＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。
実施例６ ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体の製造
２０μＭのペプチド核酸Ｎ−ＴＧＴＧＣＣ−Ｃ（ＰＮＡ Ａ）及び、２０μＭの５’−ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｂ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｃ）の存在下、０℃で３６６ｎｍの光照射を６時間行い、目的のＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドを９０％の収率で得た。ＨＰＬＣによって単離したＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドの分子量を測定することで同定を行った。結果を図１及び図２に示す。
実施例７ ＤＮＡカテナンの製造
環状ＤＮＡの環中をくぐる環状ＤＮＡ（ＤＮＡカテナン）を次に示す反応式にしたがって製造した。
【００６０】
【化１１】
９０μＭのプラスミドＭ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ及び、末端を３２Ｐでラベルされた３０μＭの５’−ＶＣＧＴＧＣＡＧＣＴ−Ｔ４０−ＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴ（ＯＤＮ Ｆ）を、０℃で３６６ｎｍの光照射を３時間行った。光反応後、５％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を用いて電気泳動解析を行い、フォトパドロックされた目的のＤＮＡカテナンを３０％の収率で得ていることを確認した。また、この混合物にさらに３０２ｎｍの光照射を３０分行うことで定量的にＤＮＡカテナンが開裂していることをＰＡＧＥにより確認した。
結果を図９に示す。３６６ｎｍの光照射により、ＤＮＡカテナンのスポットが観察されるが、３０２ｎｍの光を照射することによりこのスポットが消失することが確認された。
【００６２】
実施例８ ２本鎖ＤＮＡをテンプレートとする環化法
次に示す反応式にしたがって２本鎖ＤＮＡをテンプレートとする環化を行った。
【００６３】
【化１２】
なお、反応式中のＳはポリエチレングリコールスペーサーを示している。
２０μＭの５’−ＣＶＵＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＳＳＳＳＳＳＳＳＣＣＴＣＴＴＣ−３’（ＯＤＮ Ｊ）（Ｓはポリエチレングリコールスペーサー）に対して、２０μＭの ＧＴＡＣＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣ−３’（ＯＤＮ Ｋ）及び、２０μＭの５’−ＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＣ−３’（ＯＤＮＬ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を１時間行い、目的の環化したＤＮＡを９７％の収率で得た。ＰＡＧＥ解析によって同定を行った。また３０２ｎｍ光照射を３０分行うことで原料ＯＤＮ Ｊの回復を確認した。
結果を図３に示す。
【００６５】
実施例９ 枝分かれ構造の調製
２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤＮ Ｇ）及び、２０μＭの５’−ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｈ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｉ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を０℃で１時間行い、目的の枝分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。ＨＰＬＣによって単離した枝分かれＤＮＡを測定することで同定を行った。
ＨＰＬＣの結果を図５に示す。
実施例１０ シトシンのウラシルへの変換
図６に示す反応経路にしたがってシトシンからウラシルへの変換を行った。
２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤＮ Ｇ）及び、２０μＭの５’−ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｈ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｉ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を０℃、１時間行い、枝分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。収率はＨＰＬＣによって算出した。次に９０℃で加熱を１時間行い、その後３０２ｎｍの光照射を３０分行ったところシトシンからウラシルへ変換されたＤＮＡ（ＯＤＮ Ｍ）を６０％の収率で得ることができた。変換されたＤＮＡの同定は酵素分解によって行った。
結果を図７及び８に示す。
【００６７】
実施例１１ 固相担体に固定化されたＤＮＡの合成
次式で表される固相担体（Oligo Affinity Support）
【００６８】
【化１３】
２５ｍｇを用い、ＤＮＡ自動合成機により１μｍｏｌスケールで固相担体とＤＮＡの間にリンカーとして、ヘキサエチレングリコールを１分子挿入した配列を合成した。得られたＤＮＡはアンモニア水中、６５℃で４時間加熱することによって脱保護を行った。
【００７０】
実施例１２ 光連結・切断を用いたオリゴマーの配列選択的検出
（１） Ｒｕｎ０
１．５ｍｌエッペンドルフチューブにオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０（５’−ＣＶＵＣＣＡＡＴＴＣＧ−３’）が固定された固相担体を１ｍｇとり、塩化ナトリウム１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）５０ｍＭ、鋳型ＤＮＡ Ｃ０（５’−ＣＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＣ−３’）１２０μＭ、天然ＯＤＮ Ａ０〜Ａ３（Ａ０：５’−ＴＴＧＣＴＴＣＡＡＣＴ−３’、Ａ１：５’−ＧＣＴＴＴＣＴＣＴ−３’、Ａ２：５’−ＧＣＴＴＧＡＡＧＴ−３’、Ａ３：５’−ＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴ−３’）が各１００μＭの濃度で溶液の全量が５μｌになるよう調整した。チューブを０℃で１５分放置した後、トランスイルミネーターで３６６ｎｍの光を３０分照射し、純水１ｍｌを加え、６５℃で加熱してから攪拌、遠心沈降させ、液のみを除去する操作を５回繰り返し、残った少量の水はスピードバックにより除去した。次に純水５μｌを加えて室温中でトランスイルミネーターにより３０２ｎｍの光を３０分照射し、液を１μｌ取ってＴＨＡＰをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる測定を行った。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ０の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７１】
（２） Ｒｕｎ１
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ１（５’−ＣＶＵＡＧＡＧＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ１（５’−ＣＧＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ１の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７２】
（３） Ｒｕｎ２
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ２（５’−ＣＶＵＧＣＡＴＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ２（５’−ＣＧＡＡＴＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ２の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７３】
（４） Ｒｕｎ３
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ３（５’−ＣＶＵＡＴＧＣＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ３（５’−ＣＧＡＡＧＣＡＴＡＡＴＣＣＴＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ３の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７４】
結果を図１１に示す。図１１の最上段は、光を照射する前のものであり、各ピークは左からＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ０のそれぞれの核酸のものである。図１１の上から２段目はラン０（ＲＵＮ０）のものであり、Ａ０の核酸のみのピークが観察され、Ａ０の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から３段目はラン１（ＲＵＮ１）のものであり、Ａ１の核酸のみのピークが観察され、Ａ１の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から４段目はラン２（ＲＵＮ２）のものであり、Ａ２の核酸のみのピークが観察され、Ａ２の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から５段目（一番下）はラン３（ＲＵＮ３）のものであり、Ａ３の核酸のみのピークが観察され、Ａ３の核酸のみが選択されたことを確認することができる。
【発明の効果】
本発明は、短時間で効率よく核酸類を可逆的に連結できる新規な核酸類を提供する。本発明の核酸類を用いることにより、狙った位置で核酸同士を光連結したり、キャップ構造や枝分かれ構造を光を用いて簡便にしかも効率良く構築することができる。核酸を本発明の方法により光キャップ化することにより、分解酵素への耐性を付与することができる。また、光を用いてユニークな構造を持つ核酸を合成するため、環境にもやさしい方法である。
また、本発明の方法を用いれば対象遺伝子上の任意のシトシンをウラシルへと変異させることができる。これをウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理を行うことで任意の位置で特異的に切断することができる。このような変換はＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルへ特異的に変換し、ｍＲＮＡの遺伝情報を特異的に変更することができる。
さらに、本発明の方法により２本鎖ＤＮＡの特定の位置を、可逆的に不活性化することができ、遺伝子治療やミスマッチ検出等の遺伝子診断に応用することができる。
また、本発明の固相上に固定化された光連結性核酸は、鋳型ＤＮＡによって目的の核酸のみを固相担体上に光連結させることが可能である。即ち、通常のアフィニティークロマトと違い、目的の核酸のみを共有結合により固相上への固定化が可能である。従って目的核酸の効率よい精製・分離が可能になる。また、違う波長の光照射によって目的核酸を回収することも可能である。このように高効率的な遺伝子の選別、回収が光制御可能であるため、ａ）目的ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白の精製、ｂ）遺伝子診断・遺伝子治療等、ｃ）機能性核酸の選別等への利用のみならず、ｄ）ＤＮＡ−コンピューティング、ｅ）核酸の固相担体への共有結合による固定化、ｆ）核酸の固相担体上での化学修飾等への利用も期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法によりＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体を製造した結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明の方法により、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を製造した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図３】図３は、本発明の方法により、２本鎖ＤＮＡを不活性化した結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、本発明の核酸に枝分かれ構造を導入する方法を例示したものである。
【図５】図５は、本発明の方法により、枝分かれ構造を有する核酸を製造した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図６】図６は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法を例示したものである。
【図７】図７は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法による結果を示したＨＰＬＣのチャートである。
【図８】図８は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法により製造されたウラシルを含有する核酸を酵素処理した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図９】図９は、本発明の方法により製造されたＤＮＡカテナンの製造結果を示した図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、本発明の固定化された核酸類を用いて核酸混合物中から、目的の核酸のみを特異的に選択する方法を模式図として示したものである。
【図１１】図１１は、本発明の固定化された核酸類を用いて核酸混合物中から、目的の核酸のみを特異的に選択する方法の結果を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのチャートである。図１１の最上段は、光を照射する前のものであり、各ピークは左からＳＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ０のそれぞれの核酸のものである。図１１の上から２段目は実施例１２のラン０のものであり、３段目はラン１のものであり、４段目はラン２のものであり、５段目（一番下）はラン３のものである。
Claims (30)
- 塩基部分として次の式Ｉ：
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド、ペプチド核酸が含まれる）からなる、核酸類用の可逆的光連結剤。 - ＺがＯで、Ｘが水素原子で、Ｙがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である請求項１に記載の可逆的光連結剤。
- 式Ｉで表される基を有する核酸類がモノヌクレオチドである請求項１又は請求項２のいずれかに記載の可逆的光連結剤。
- 式Ｉで表される基を有する核酸類が、オリゴヌクレオチドである請求項１〜３のいずれかに記載の可逆的光連結剤。
- 式Ｉで表される基を有する核酸類がＤＮＡ又はＲＮＡである請求項４に記載の可逆的光連結剤。
- 式Ｉで表される基を有する核酸類がＰＮＡである請求項１又は請求項２のいずれかに記載の可逆的光連結剤。
- 請求項１〜６のいずれかに記載の可逆的光連結剤が、固相担体に固定化されてなる固定化された可逆的光連結剤。
- 固相担体が、多孔質ガラスビーズ（ＣＰＧ）、ポリスチレン（ＰＳ）、又は金である請求項７に記載の固定化された可逆的光連結剤。
- 固相担体と可逆的光連結剤との間に両者の距離を保つためのリンカー部分を有する請求項７又は請求項８に記載の固定化された可逆的光連結剤。
- リンカー部分が、核酸又はその誘導体からなるものである請求項９に記載の可逆的光連結剤。
- リンカー部分が、ポリエチレングリコールからなるものである請求項９に記載の可逆的光連結剤。
- 請求項１〜１１のいずれかに記載の可逆的光連結剤と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類に光を照射して、核酸類と可逆的光連結剤とを、可逆的に光連結又は開裂させる方法。
- 炭素−炭素二重結合を有する塩基が、シトシン、チミン又はウラシルである請求項１２に記載の方法。
- 炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類が、ＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
- 炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類が、ＰＮＡである請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
- 請求項１〜１１のいずれかに記載の可逆的光連結剤の核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類が、同じ核酸類である請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
- 光が紫外線である請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
- 開裂させるときの波長が、連結させるときの波長よりも短波長の光である請求項１２〜１７のいずれかに記載の方法。
- 連結させるときの波長が３６６ｎｍで、開裂させるときの波長が３０２ｎｍである請求項１８に記載の方法。
- 核酸類がテンプレートに固定化されている請求項１２〜１９のいずれかに記載の方法。
- テンプレートが二本鎖ＤＮＡである請求項２０に記載の方法。
- ＤＮＡの特定の塩基を対象として、
５’末端及び３’末端が前記ＤＮＡの特定の塩基の周辺の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、
塩基部分として前記式Ｉで表される基を５’末端又は３’末端のいずれか一方に有し、
塩基部分としてシトシンを５’末端又は３’末端の他の一方に有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の可逆的光連結剤（ただし、核酸類としてモノヌクレオチドを除く）を、
前期ＤＮＡの特定の塩基の周辺の塩基配列に塩基対を形成するように配置して光を照射することによって、前記核酸又はペプチド核酸を可逆的に光連結し、前記ＤＮＡと塩基対をなした環状の核酸又はペプチド核酸を形成することにより、可逆的に不活性化されたＤＮＡを製造する方法。 - ＤＮＡが２本鎖ＤＮＡである請求項２２に記載の方法。
- ＤＮＡの特定の塩基を対象として、
５’末端及び３’末端が前記ＤＮＡの特定の塩基の周辺の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、
塩基部分として前記式Ｉで表される基を５’末端又は３’末端のいずれか一方に有し、
塩基部分としてシトシンを５’末端又は３’末端の他の一方に有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の可逆的光連結剤（ただし、核酸類としてモノヌクレオチドを除く）からなるＤＮＡ不活性化剤。 - 請求項７〜１１のいずれかに記載の固定化された可逆的光連結剤と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、３３０ｎｍ以上の波長の光を照射して当該核酸混合物中の特定の核酸類を光連結させてなる核酸類を固定化する方法。
- 請求項７〜１１のいずれかに記載の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、３３０ｎｍ以上の波長の光を照射して当該核酸混合物中の特定の核酸類を光連結させて核酸混合物中の特定の核酸類を固定化し、固定化された核酸類を分離又は回収することからなる核酸混合物中の特定の核酸類を同定、検出又は定量する方法。
- 固定化された核酸類を分離又は回収した後、さらに３２０ｎｍ以下の波長の光を照射して固定化された核酸類を光開裂させることからなる、請求項２６に記載の核酸混合物中の特定の核酸類を同定、検出又は定量する方法。
- 請求項７〜１１のいずれかに記載の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、３３０ｎｍ以上の波長の光を照射して当該核酸混合物中の特定の核酸類を光連結させて核酸混合物中の特定の核酸類を固定化し、固定化された核酸類を精製又は回収した後、さらに３２０ｎｍ以下の波長の光を照射して固定化された核酸類を光開裂させることからなる、特定の核酸類を精製又は回収する方法。
- 炭素−炭素二重結合を有する塩基が、シトシン、チミン又はウラシルである請求項２５〜２８のいずれかに記載の方法。
- 炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類が、ＤＮＡ又はＲＮＡである請求項２５〜２９のいずれかに記載の方法。
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