JPH01151596A - 結合オリゴヌクレオチド及びペプチドを有する膜 - Google Patents

結合オリゴヌクレオチド及びペプチドを有する膜

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JPH01151596A
JPH01151596A JP63220577A JP22057788A JPH01151596A JP H01151596 A JPH01151596 A JP H01151596A JP 63220577 A JP63220577 A JP 63220577A JP 22057788 A JP22057788 A JP 22057788A JP H01151596 A JPH01151596 A JP H01151596A
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Hubert Koester
ヒューバート・ケスター
James M Coull
ジェイムズ・エム・クール
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Millipore Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は結合されたオリゴヌクレオチド及びペプチドを
有する膜に間する。
疋米至退浦 近年、固相バイオケミストリー（例えば、ソリッドフェ
ースバイオケミストリーーアナリチカルアンドシンセチ
ツクアスベクツ、ダプリュ、エッチ、スカウテン（Ｗ、
１．５ｃｏｕｔｅｎ）、編集者、ジョーンウィリーアン
ドサンズ、ニヨーヨーク、１９８３年）は、バイオテク
ノロジーにおいて広い用途を見出してきている。主要な
関心はアフイニテイクロマトグラフィー（例えば、アフ
イニテイクロマトグラフィーーアブラクチカルアブロー
チ１編集者、ビー、デイ、ジー、ゾーン（Ｐ、　Ｄ、　
Ｇ、　Ｄｅａｎ）　。
ダブリュ、ニス、ジョンソン（Ｗ、Ｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ
）　、エフ、ニー、ミドル（Ｆ、Ａ、Ｍｉｄｄｌｅ）、
　ＩＲＬプレスリミテッド、オックスホード、１９８６
年）、ニュークリイクアシッドハイブリダイゼーション
ーアブラクチカルアブローチ１編集者、ビー、デイ、ヘ
イムズ（Ｂ、　Ｄ、　Ｈａｍｅｓ）及びニス、ジエー、
ヒツギンズ（Ｓ、Ｊ、）Ｉｉｇｇｉｎｓ）　、　ＩＲＬ
ブレスリミテッド、オツクスホード、１９８７年）、固
定化酵素及び細胞（例えば、イモウビライズドセルズア
ンドエンジメズーアブラクチカルアブローチ１編集者ジ
エー、ウラドウオード（Ｊ、Ｗｏｏｄｗａｒｄ）、　Ｉ
ＲＬプレス、オツクスホード、１９８５年）、固相ペプ
チド（例えば、ジー、バラニー　（Ｇ、　Ｂａｒａｎｙ
）及びアール、ビー、マリフィールド（Ｒ，Ｂ、　Ｍａ
ｒｒ　ｉｆ　ｔｅ　ｌｄ）　。
「ザ　ペブチズ」、２巻１編集者：イー、クロス（Ｅ、
　Ｇ？ｏｓｓ）及びジエー、マイエンホファー゛（Ｊ。
Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）　、アカデミツクプレス、ニュ
ーヨーク、１９７９年）及びオリゴヌクレオチド合成（
例えばオリゴヌクレオチドシンセシスーアブラクチカル
アブローチ１編集者エム、ジュー。ゲイト（Ｍ、Ｊ、Ｇ
ａ１ｔ）、　ＩＲＬブレスリミテッド、オツクスホード
、１９８４年）に集中してきた。上記参考文献に示され
ている通りに、はとんど全ての場合において、核酸或は
ペプチド／タンパク質なビード物質、例えばセルロース
、ガラスピーズ、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
　、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、アガロース
、ポリアクリルアミド、多孔質粒状アルミナ、ヒドロキ
シアルキルメタクリレートゲル、ジオール結合シリカ或
は多孔質セラミックに吸着させるか或は非特異的に結合
させている。
吸着によるハイブリダイゼーション実験のために、ナイ
ロン及びニトロセルロースのフィルターディスクのよう
な平坦な物質を用いて核酸を固定化させることは極めて
よく行われている。この領域におけるいくつかの用途で
は、化学的に改質した紙が用いられており、セルロース
をジアゾベンジルオキシメチルで機能化する（ジュー。
シー。
アルワイン（Ａｌｗｉｎｅ）等、メソッズインエンジモ
ロジー、６８巻１編集者二アール、ウー（Ｒ，Ｗｕ）、
アカデミツクプレス、ニューヨーク及びロンドン。
２２０頁、１９７９年）か或はＯ−アミノフェニルチオ
エーテル（ビー、シード　（Ｂ、５ｅｅｄ）　。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０巻、１７
９９頁。
１９８２年）誘導体で機能化し、両方の場合において、
核酸を紙に非特異的に共有結合させるに至る。別の試み
では、ビニルアセテート−エチレンコポリマー製のチュ
ーブの表面を化学的に活性にしてチューブ表面にタンパ
ク質の非特異的共有結合を与えた（ジー、マネック（Ｇ
、　Ｍａｎｅｃｋｅ）及びエッチ、ジー、ボウグド（Ｈ
，Ｇ、Ｖｏｇｔ）、　Ｊ、５ｏｌｉｄ　−ｐｈａｓｅ　
Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　４巻、２３３頁、１９７９年）。
後者の場合、結合させるべき有意の量の分子をキャリヤ
ーに供給するのに多孔質構造が利用できないことに注意
すべきである。
最近の注意は固体支持体への生体分子の部位特異的共有
結合法を開発することに集中してきた。
セルロースのようなビーズ物質に共有結合させた合成り
ＮＡ分子（ビー、ティ、ギルハム　（Ｐ、Ｔ。
Ｇｉｌｈａｍ）　、メソッズインエンジモロジー１編集
者エル、グロスマン（Ｌ、　Ｇｒｏｓｓｍａｎ）及びク
ー３モルデイプ（Ｋ、Ｍｏ１ｄａｖｅ）　、　２１巻、
パートＤ、１９１頁、アカデミツクプレス、ニューヨー
ク及びロンドン、１９７１年及びジュー。ティ、コダナ
ガ及びアール、トジアン　（Ｒ，Ｔｊｉａｎ　）、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　’８３巻、５８８９頁、
１９８６年）、調節多孔度のガラスピーズ（ティ、ミズ
タニ及びワイ、タチバナ、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
、　、　３５６巻、２０２頁、１９８６年）及びラテッ
クス微小球（ジェー、エヌ、クレムスキー（Ｊ、Ｎ、に
ｒｅｍｓｋｙ）等Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、　１５巻、２８９１頁。
１９８７年）が相補的核酸を親和（ａｆｆｉｎｉｔｙ）
精製するのに及びタンパク質を配列特異的結合させるの
に及び酵素結合反応における反応体として用いられてき
た。同様に、セファローズ及びアガロースを含む種々の
ビードキャリヤーに結合した合成ペプチドは、酵素（ビ
ー、クアトレカサス　（Ｐ。
Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）　、エム、ウィルチェク（Ｍ
、　Ｗｉ　１ｃｈｅｋ）及びシー、ビー、アンフィンセ
ン（ｃ、Ｂ、　Ａｎｆｉｎｓｅｎ）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　６１巻、６３６頁
。
１９６８年）、抗体（イー、ハーウィッ　（Ｅ。
Ｈｕｒｗｉｔｚ等、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、
、　１７巻、２７３頁、１９７０年）及びその他のタン
パク質（ビー、ペンテ（Ｂ、　Ｐｅｎｋｅ）等、　Ｊ、
　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　、　３７６巻、３巻７頁、
１９８６年）を親和単離するのに広く用いられてきた。
親和マトリックスの合成は、オリゴヌクレオチド内で或
はペプチド内で支持体結合求電子機能と求核基とを反応
させることを含むのが普通である。逆に言えば、求電子
機能は生体分子に付くことができ及びポリマー支持体上
の求核基との反応を受ける。
ペプチドを固体キャリヤーにアミノ酸側鎖の種々の反応
性官能基を経て、並びにバイオポリマーのアミノ及びカ
ルボキシル末端を通して結合させることは一層しばしば
である。オリゴヌクレオチドは、強い求核或は求電子中
心を何ら含有しないため、固体支持体に結合させるのが
比較的に一層難かしい。その結果、反応性官能価を分子
中の規定の位置、好ましくはバイオポリマーの末端の一
つに含有するオリゴマーの化学合成を可能にする方法及
び試薬が数多く記載されてきた（例えば、ジュー。エム
、コウル（Ｊ、Ｍ、Ｃｏｕｌｌ）等、テトラヘドロンレ
ターズ、２７巻、３９９１頁、１９８６年；ニス、アグ
ラワル（Ｓ、　Ａｇｒａｗａｌ）等、ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１４巻、６２２７頁、１９８６年
；ビー、ニー、コナツ（Ｂ、Ａ、Ｃｏｎｏｌｌｙ）　、
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１５巻、
３１３１頁、１９８７年；ビー、ニー、コナツ及びビー
、ライダー（Ｐ、　Ｒｉｄｅｒ）　。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　１２巻、
４４８５頁、１９８５年参照）。
両方のアプローチはオリゴヌクレオチド或はペプチドを
合成し及び単離した後に固体マトリックスに結合させる
ことを必要とするので、支持体への生体分子の直接固相
合成は相当の向上になる。
このようにして、親和支持体を直接生成することができ
る。このアプローチの前の２つの例はポリＡテイル含有
ｍＲＮＡを親和単離するためセルロースビーズ上にオリ
ゴ−ｄＴを化学合成すること（ビー、ティ、グラハム、
上記参照）及び抗原と強く及び特異的に反応する抗体に
関し所定のアミノ酸配列の特異的親和力を用いることに
よって抗体エピトープマツピングに有用なポリエチレン
ベグ上に短いペプチドを合成することを含む（エッッチ
、エム、ガイセン　（Ｈ，Ｍ、Ｇｅｙｓｅｎ等、　Ｐｒ
ｏｃＮａｔ’１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２巻
、３９９８頁。
１９８４年））。ポリエチレンベグは極めて特定の目的
について有用にすぎず及び非多孔質構造により固定化生
体分子のローディングが極めて低い悩みがある。いくつ
かのオリゴヌクレオチドを同時に化学合成するプロセス
の説明において、紙デイスクが用いられてきた（ＤＥ３
３０１８３３及びＥＰ　１１４５９９）、この物質は、
明らかに技術の現状のホスホアミダイト化学を配列にお
いて１００より多いヌクレオチド単位を有する長いオリ
ゴヌクレオチドを構築するのに用いることができないこ
とから、親和支持体としての働きをさせることを勧める
ことができない（エフ。デイ、シンハ（Ｎ、　Ｄ、　５
ｉｎｈ２）ｍ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、、　　１２巻、４５３９頁、（１９８４年））、ホ
スフェートトリエステル法（例えば、上に挙げた通りの
エム、ゲイトを参照）の場合、比較的短いオリゴヌクレ
オチド（２０のヌクレオチド単位含有配列の範囲）のみ
を紙デイスク法によって得ることができる。その上、異
なる試薬による必要な処理及び洗浄工程を採用するいく
つかの合成サイクルの後に、紙は非常にもろくなって機
械的安定性を失う。ペプチドはこれまで紙の上で合成さ
れていない。ペプチドを合成するのに過酷な条件が必要
なことにより、セルロースマトリックスが崩壊されるこ
とは極めてありうることである。これより、親和支持体
はオリゴヌクレオチド或はペプチドを固体支持体として
の紙に化学合成させることによって得ることができない
。
核酸及びペプチド或はタンパク質はビード及び平均なポ
リマー支持体に吸着によるか或は非特異的共有結合によ
るかのいずれかによって固定化されてきた。ハイブリダ
イゼーション或は親和技法を用いて可溶性生体分子と固
定化生体分子との間の効率的及び特異的相互作用を成就
させるためには、１つの末端機能のみを含む生体分子を
特異的に共有結合させることが最適になる。これは、固
定化生体分子の全配列を溶解している相補的分子と相互
作用するのに利用可能にさせる。しかし、吸着或は非特
異的共有結合は生体分子内にいくつかの機能を入れ、こ
れらの機能は、次いで所望の分子間相互作用に利用し得
ないものにさせる。吸着は、その上、固定化された生体
分子の内のいくつかがハイブリダイゼーション或はアフ
ィニティプロセスの間に洗い落とされ（脱着され）得る
という不利を有する。これは、親和支持体を何回か再使
用する場合には、特に考慮しなければならない。
段階合成アプローチを用いた固体支持体へのオリゴヌク
レオチド或はペプチドの末端特異的共有結合は、ビード
支持体或は紙デイスク（オリゴヌクレオチドの場合）或
はビード支持体及びポリエチレンベグ（オリゴペプチド
の場合）を用いて行われてきたが、膜タイプの支持体を
用いたこれらの生体分子の合成は報告されていない。
平坦な、高多孔質の機械的安定な材料の膜は、容易に取
り扱い、種々の寸法に切断し、拡する目的で互いの上面
上に積み重ね及び何回か再使用することができるため、
親和支持体として最も有利である。その上、支持体はオ
リゴヌクレオチド及びペプチド合成の条件下で化学的に
安定であるべきであり及び核酸か或はタンパク質のいず
れかの非特異的結合を示すべきではない、というのは、
これは感応性低下バックグラウンド相互作用を生じるか
らである。これらの異る要求を満足させる親和支持体を
開発することは軽微な仕事ではない。オリゴヌクレオチ
ド或はペプチドの直接の化学合成がかかる不溶性支持体
上で可能であるかどうかも、また、予測することができ
ない。上述した通りに、ホスホトリエステルアプローチ
を採用した場合に、紙は固相オリゴヌクレオチド合成用
支持体として働き得るにすぎなかった。依然不明確な理
由で、多孔質ガラスピーズ上に用いて極めて良好な結果
を得るずっと効率的で現状の技術のホスホアミダイト化
学は紙に効か松かった。
本発明は膜に共有に及び特異的に結合させたオリゴヌク
レオチド（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ断片）或はペプチド
の合成方法に関する０発明は、また、オリゴヌクレオチ
ド及びペプチドの合成用改質膜及びオリゴヌクレオチド
及びペプチドを末端特異的結合によって結合させた膜（
生体分子をその末端の１つに共有結合させた）に関する
。
本発明の方法に従えば、下記式によって表わされる改質
膜を用いる： Ｐ−Ｘ−Ｙ−Ｎ−Ｚ−Ｓ” ここで、Ｐは保護されたヌクレオシド或はアミノ酸ＳＷ
にリンカ−Ｙ−Ｎ−Ｚ　　を通して結合されたポリマー
膜支持体を表わし、Ｗは保護基を表わし、Ｎはスペイサ
−基を表わし、Ｙ及びＺは同一或は異なる官能基を表わ
し、リンカ−は膜に付いた官能基Ｘを通して膜に結合さ
れる。
膜を化学的に機能化して第１のヌクレオチド或はペプチ
ドビルディングブロックを固定する。膜バックボーンか
ら立体障害を最小にするために、ポリマーバックボーン
と第１の固定化ビルディングブロックとの間に適したス
ペイサ−機能を置く。特異なバイオポリマー配列の合成
は手動か或は自動化合成によるかのいずれかで行う。オ
リゴヌクレオチドか或はペプチドのいずれかを段階的に
構築する標準の化学的プロトコルを用いることができる
。所望の特異的配列を組立てた後に、保護基を取り去っ
て生物学的に機能的な分子を生成することができる。
合成したバイオポリマーは、膜への結合に応じて、分離
し１次いで特性表示及び／又は同定するか或は未保護の
形で膜上に残すことができる。後者を用いて他の分子と
ハイブリダイゼーション或は特異的親和力の他の反応を
経て相互作用させることができる。これは、例えばｍＲ
ＮＡのような核酸、ゲノムＤＮＡ配列及びｒＲＮＡを精
製及び検出するために及び生物、ウィルス並びに酵素、
抗体を検出するために重要である。
ｌ肚匹１狐立且旦 オリゴヌクレオチド或はペプチド配列の合成用出発原料
である固体支持体は下記の一般式（１）を有する： Ｐ−Ｘ−Ｙ−Ｎ−Ｚ−３’　　　（Ｉ）式中、Ｐは多孔
質膜構造を含む下層にあるポリマー物質であり、Ｘはポ
リマー物質に付いた官能基であり、第１合成ピルディン
グブロックＳ（適当に保護されたヌクレオシド或はアミ
ノ酸）をスペイサ−Ｎを経て膜に固定させ、スペイサ−
Ｎは２つの等しい或は異なる官能基Ｙ及びＺを有する。
Ｗはヌクレオシド或はアミノ酸成分、についての保護基
を表わす。Ｓを単一の初期ビルディングブロックとして
示すが、Ｓはダイマー、トリマー或はオリゴマー出発原
料を表わし得ることを理解すべきである。例えば、Ｓは
保護されたヌクレオシドーヌクレオチドニ量体を含むこ
とができる。この初発鎖を次いで本発明の方法によって
伸張させることができる。いくつかの実施態様では、第
２のリンカ−を官能基を有するＳに結合させることがで
き、それからバイオポリマーを合成することができる。
本発明の方法において用いることができる膜は、第１ヌ
クレオチド或はペプチドビルディングブロックを結合さ
せるための官能基Ｘ（構成ポリマーにそなわっているか
或は下記に説明する通りにして膜状ポリマーに導入する
）を有する多孔質構造の平らな透過性ポリマー物質であ
る。下記の４つのタイプのポリマーが本発明の目的のた
めの親和膜を生成するのに役立つことができる：Ａ、エ
ステル機能のアルコール部分においてフリーの官能価を
有するアクリル（或いはメタクリル）酸エステル、例え
ば−（ＣＨ２）　、、ＣＨｉ−ＯＨ１−（ＣＨ２）ｍ　
Ｉ、−ＣＨ（ＣＨ３）　−０）＋　（ｎ□２−１０）或
いは−ＣＯＯＲ（Ｒは、例えばペンタフルオロフェニル
、ｐ−ニトロフェニル、メトキシメチレン或はラクトン
機能である）のような活性エステル機能等のそれぞれの
モノマー中に官能基の存在することにより官能基を含有
するコポリマー、該コポリマーは求核試薬と直接反応す
ることができる。同様のタイプのポリマーは、ジアルキ
ルシランジオール或はポリジアルキルシロキサン、ポリ
ビニルアルコール、ポリオキシメチレン或はポリオキシ
エチレンを適当な架橋剤、例えばテレフタルデヒド、カ
ルボン酸ジクロリド或はビスイソチオシアネートで架橋
させて得ることができる。
Ｂ、官能基を化学的改質によって導入することができる
ポリマー、例えば架橋ポリスチレン、芳香族残基を含有
するポリスルホン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカ
ーボネート、ポリビニルアセテート。芳香族残基な有す
るポリマーを、例えばフリーデル−クラフッアシル化に
次いで還元或はグリニヤール反応によって改質すること
ができる。その他のタイプのポリマーは部分加水分解反
応によってフリーの官能基を生じることができる。ポリ
ビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）は脱ハロゲン化水
素によって官能基（二重結合）を生じることができる。
Ｃ９化学的に不活性なポリマー、例えばポリスルホン、
ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（商標））、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンジフルオ
リド（ＰＶＤＦ）は、例えば高エネルギーＵＶ或はコバ
ルト−６０を照射して活性にすることができ及び生成し
たイオン或はラジカルを用いてポリマーの表面、Ａ及び
／又はＢに従う官能基を有する千ツマ−を含有する鎖に
グラフトさせることができる。
Ｄ、化学的に不活性なポリマー、例えばポリスルホン、
ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（商標））、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンジフルオ
リド（ＰＶＤＦ）にすでにフリーの官能基（Ａ）を含有
するコポリマーを被覆するか或は該ポリマーを慣用の化
学的或は物理化学的プロセス（Ｂ、Ｃ）を用いて容易に
変えて官能基を生成することができる。別のサブタイプ
は前述したポリマーの表面に、例えばポリビニルアルコ
ールを架橋させ、シス−ジオール構造と硝酸セリウム（
ｒＶ）とを反応させてジラジカルを生成し、ラジカルを
用いてＡ及び／又はＢに従うモノマーを含むグラフトプ
ロセスを開始させて得ることができる。
Ｙ−Ｎ−Ｚは二官能価基であり、Ｙはポリマーについた
官能基Ｘと反応し及び２結合を経て第１合成ビルディン
グブロック、適当に保護されたヌクレオシドか或はアミ
ノ酸誘導体のいずれかに連結する。Ｎはスペイサ−基で
ある。任意の適当なスペイサ−基を用いることができる
。置換された或は未置換のアルキル、アリール、アリー
ルアルキル基が適している０例えばＮはｎｃＨｉ基（ｎ
は１〜２０の範囲である）から成る可変スペイサ−にな
ることができる、スペイシングは、また、鎖、例えばオ
リゴグリシン或は−ＮＨ−（ＣＬ）−ＮＨＣＯ−（ＣＨ
２）ｍ　−−ＣＯ（ｍは、例えば１〜６である）によっ
て達成することができる。Ｙ及びＺは同一であり或は異
なり及び種々の標準の官能基、例えば、下記： ｓ　　　ｓ　　　ｏ　　　ｏ。
Ｉｔ　　　　　　ＩＩ　　　　　　ＩＩ　　　　　　Ｉ
ｔ　　　　ｌｔ−Ｎ−１−Ｎ−、−５−１−〇−１−Ｎ
−Ｃ−、−０−Ｃ−１−Ｎ−Ｃ−、−０−３−１−Ｓ−
１＋　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１１　　　　ＩＩＨＲ００ ｏ　　　ｏ　　　ｏ　　　ｏｏｏ　　　ｏ　　　。
Ｉｔ　　　ＩＩ　　　ＩＩ　　　ＩＩ　　Ｉｔ　　ＩＩ
　　　Ｉｔ　　　ｌｌ−Ｃ−１−Ｏ−Ｃ−１−Ｎ−Ｃ−
１−Ｎ−Ｃ−１−ｐ−１−ｐ−１−ｏ−ｐ−、−ｏ−ｐ
−１＋　　　　　　＋　　　　　　ＩＩ　　　　　　Ｉ
　　　　　　１ＨＲ０ＲＯ−ＯＲＯ− −ｏ−ｐ−ｏ−，及び−ｏ＝ｐ−。
０Ｒ〇− （ここで、Ｒはアルキル、アリール、アラルキル或はシ
クロアルキルである） から選ぶことができる。
Ｓは膜支持体Ｐに固定する適当に保護された第１ビルデ
イングブロツク、例えばヌクレオシド或はアミノ酸を表
わす、ヌクレオシドは下記式によって表わされる： Ｗ・・ ここで、Ｗ”はＨ或は適したヒドロキシ保護基、例えば
トリチル基、アシル基或はシリル基である。Ｂはヌクレ
オシド塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チ
ミン、ウラシル或はこれらの塩基の類似体である０例え
ば、Ｗｏは複素環式ヌクレオシド塩基上の環外（エキソ
サイクリック）アミノ基を保護するために通常用いられ
る塩基不安定性アシル基を表わすことができる。ヌクレ
オシドは３°位を経て膜に結合させるのが普通であるが
、５°位で結合させることができる。膜に３°位で結合
させる場合、５°炭素は保護されたヒドロキシ基を含有
することができる。５°ヒドロキシ基についての好まし
い保護基は４．４゜−ジメチオキシトリチル或は４．４
°、４”−トリメチオキシトリチル基である。
アミノ酸ビルディングブロックは下記式：ＵＷ’ Ｈ によって表わされ、カルボキシ或はアミノ機能を経てリ
ンカ−官能基Ｚに結合させる。Ｕはアミノ酸側鎖、例え
ば天然産のアミノ酸側鎖或はそれらの改質変種を表わす
。アミノ酸ビルディングブロックとして、Ｌ−或はまれ
なり一或は改質アミノ酸、例えばベーター或はＮ−メチ
ルアミノ酸のいずれかを膜に結合させることができる。
Ｗｏは側鎖保護基を表わす。アミノ酸をスペイサ−にカ
ルボキシ機能を経て結合させる場合、Ｗ”は第一アミノ
機能フルオレニルメトキシカルボニル或はｔ−ブチルオ
キシカルボニルについての保護基を表わす。Ｗ′″はカ
ルボキシ基、例えばペンタフルオロフェニル基について
の保護基を表わす。
（１）式の親和膜を特異的及び生物学的関連オリゴヌク
レオチド或はペプチド配列を合成するための固体支持体
として用いる０本発明の方法はバイオポリマーを末端特
異的結合によって結合させた（バイオポリマーの末端の
１つを通して結合させた）膜を生じる。結合したバイオ
ポリマーを有する膜は一般的に下記式によって表わされ
る：Ｐ−Ｘ−Ｙ−Ｎ−Ｚ−（ジ）。
［式中、ｎはポリマー中のヌクレオチド或はアミノ酸単
位の数を表わす（数は採用する合成化学の能力によって
のみ限定される）］。
下記に一石完全に検討する通りに、バイオポリマーを膜
上に保護された或は一部保護された形で残すことができ
或は完全に脱保護してポリマーの本来の形を生じること
ができる。脱保護されたバイオポリマーを含有する膜は
下記式によって表わすことができる： Ｐ−Ｘ−Ｙ−Ｎ−Ｚ−（Ｓ）ｎ （式中、Ｐ、Ｘ、Ｎ％Ｚ及びｎは先に規定した通りであ
り、Ｓはポリマーの脱保護されたヌクレオチド或はアミ
ノ酸単位を表わす）。
（１）式の改質膜上でのバイオポリマーの合成は手動か
或は自動化合成装置で行うことができる。
第１図に示すような装置を手動或は自動化合成用膜ホル
ダーとして使用することができる。該装置は溶媒及び試
薬が迅速に貫流するのを可能にし及び高い拡散速度によ
り、迅速及び定量的な反応を生じる。この装置は、また
、膜タイプ物質を取扱う容易性、親和支持体を生成し、
また次いで親和支持体として用いるための本合成方法の
利点を立証する。
本発明の方法を例示するために、反応性求電子官能基を
含有するイモウビリン（Ｉｍｍｏｂｉ　ｆｉｎ）親和膜
（ＩＡＭ％ｌ；ミリボアコーポレーション、アメリカ合
衆国、マサチューセッツ、ベツドホード）を、スキーム
エに示す通りにして１，２−ジアミノエタン（且、ｎ＝
２）或は１．６−ジアミツヘキサン（旦、ｎ＝６）で処
理してアミノアルキル−ｒ　ＡＭ４　（ｎ＝２．）を生
じた。
オリゴヌクレオチドの合成： 第１ヌクレオシドビルデイングブロツクをその３−ＯＨ
機能を経て膜に結合させるのが普通であるが、また５°
−ＯＨ機能を経る結合を採用してもよい。スキームＩＩ
は、当分野で知られている方法を用いてデオキシヌクレ
オシドビルディングブロック旦をアミノアルキル−ＩＡ
Ｍ４に３°−ＯＨ機能を経て結合させてヌクレオシドビ
ルディングブロックを特異的及び共有に結合させた膜上
を形成することを示す、適当に保護されたりボヌクレオ
シドビルディングブロックを本質的に同じ方法で膜に結
合させることができる。当分野で知られている他の方法
を採用してヌクレオシドを固体支持体に共有的に固定さ
せ及びオリゴヌクレオシドを構築することを行うことが
できる。
膜支持体上にオリゴヌクレオチドを合成するホ　・スホ
アミダイト法を下記に概説する。該方法は下記の工程を
含む： ２）ｍプロトン或はルュイス酸を用いて４．４−ジメト
キシトリチル（ＤＭＴ）保護基を取り去る；ｂ）５°−
ＤＭＴ−及びＮ−保護された３′ホスホアミダイトを適
当な活性剤、例えばテトラゾール或いは４−ニトロフェ
ニルテトラゾールで活性にした後に膜結合されたデオキ
シヌクレオシドのフリーの５−ＯＨ基に結合させる ；Ｃ）固定化したデオキシヌクレオシド（或はオリゴヌ
クレオチド）の無反応５°−ＯＨ基に酢酸無水物／Ｎ、
Ｎ−ジメチルアミノピリジン等の試薬をキャップし、そ
れにより破損配列の発生を低減させる； ｄ）三価のホスファイトトリエステル結合をヨウ素／２
，６−ルチジン／水等の試薬で酸化して三価のホスフェ
ートトリエステル結合にする。
伸張サイクルの異なる反応工程の間に、適当な洗浄工程
を用いる。工程ｂ）において正確なビルディングブロッ
クを用いて、所望のオリゴヌクレオチド配列を生成する
まで工程２）ｍ〜ｄ）を繰り返す。
好ましい様式において、ベータ−シアノエチルホスホル
アミダイト化学を用いる。シンハ等のＮｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２巻、４５３９頁（１９８４
年）を参照。また、１９８５年６月１８日に出願した米
国特許出願第７５２．１７８号を参照。同米国特許出願
の教示内容を本明細書中に援用する。この技法はヌクレ
オシドベータ−シアノエチル保護されたホスホルアミダ
イトを膜結合したヌクレオシドに結合させてホスファイ
トトリエステルを有する膜結合したヌクレオシド−ヌク
レオチドを生成し、ホスファイトトリエステルを酸化し
てホスフェートトリエステル結合を形成し、追加のヌク
レオシドベータ−シアノエチル保護されたホスホルアミ
ダイトを逐次膜結合されたヌクレオシド−ヌクレオチド
に結合させ、各々の結合工程の後に、生成したホスファ
イトトリエステル結合を酸化して膜結合したポリヌクレ
オチドとすることを含む。
オリゴヌクレオチド−膜をパイプリダイゼーション実験
用親和支持体として用いるためにはヌクレオシド塩基の
Ｎ−保護基を取り去ってワトソンークリック塩基対合を
可能にしなければならない。ホスフェート保護基（例え
ば、ベータ−シアノエチル）をも取り去って天然産のイ
ンターヌクレオチジック結合ホスホジエステル結合）を
生成するのが普通である。しかし、ホスフェート保護基
を保つことが有利かもしれない、いくつかの場合では（
例えば、普通でない（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）オリゴメチ
ル−ホスホネートジエステルを合成する場合）、インタ
ーヌクレオチジック結合は「保護された」ままである。
また、合成したオリゴヌクレオチドを膜から***させる
ことができる。オリゴヌクレオチドを膜に結合させたま
まにする（膜が親和支持体として働くならば必要な通り
に）か或は脱保護する間或は脱保護した後にキャリヤー
から***させるかどうかは、Ｘ−Ｙ−Ｎ−２機能（１式
）の選択及びホスフェート及びＮ−保護基（及びオリゴ
リボヌクレオチド合成の場合、２”−ＯＨ保護基）の選
択に依存する。当分野において知られている大きい保護
基の選択から、（異なる条件の組を用いることによって
）オリゴヌクレオチドを膜から***させるか或は適当に
脱保護した後に膜上に残して膜上でパイプリダイゼーシ
ョン可能にさせる選択をなし得ることは本発明の有利な
特徴である。いくつかの場合では、配列特異的最適化プ
ロセスを達成して高い収率及び均質な生成物を生じ、こ
の最適プロセスについてオリゴマー生成物を同定し及び
特性表示することが必要である。−旦最適な条件を達成
したら、親和プロセスを起きさせるのに必要なそれらの
保護基のみを取り去ることによって親和支持体を生成す
る。
ペプチド合成： 現状の技術のペプチド合成では、第１のアミノ酸ビルデ
ィングブロックを固体支持体に固定する前に、普通でな
いアミノ酸ノルロイシン及び特異的リンカ−分子を固体
支持体に結合する。ノルロイシン残基は合成したオリゴ
ペプチドを後にアミノ酸分析するための内部標準として
働き、リンカ−分子は第１アミノ酸ビルデイングブロツ
クをエステル化するためのベンジルアルコール機能を固
体支持体に与える。エステル結合の反応性が異なる種々
のリンカ−分子が用いられている（例えば、アール、エ
ル、シェパード（Ｒ，Ｌ、　５ｈｅｐｐａｒｄ）及びビ
ー、ジェー、ウィリアムス（Ｂ、　Ｊ、　Ｗｉ　１１　
ｊａｍｓ）、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　＆　Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、　２０巻、４５１頁、１９８２年
参照）。
スキーム■はペプチドを合成するためのイモウピロン親
和膜ＩＡＭ４　（ｎ＝２）の調製について説明する。前
者丘と第一アミノ酸機能をフルオレニルメトキシカルボ
ニル（Ｆｍｏｃ）基で保護したノルロイシンヱの活性な
ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）エステルとを反応さ
せて旦を供給する。丘の残留アミノ基に酢酸無水物をキ
ャップしくスキーム■の工程２）ｍだ後に、Ｎ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド中２０％のピペリジンで処理して（
スキーム■の工程ｂ）Ｆｍｏｃ基を取り去って旦を生成
するに至る。次いで、旦の第一アミノ基とリンカ−分子
１旦のペンタフルオロフェニルエステルとを反応させて
膜誘導体よユを生じ、カルホキ末端を経て第１アミノ酸
ビルデイングブロツクにエステル化する準備ができた。
ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸を結合剤として選
んで合成したペプチド配列に酸不安定な結合を付与する
。第１アミノ酸ビルデイングブロツク上ｌを触媒として
のＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンの存在において対称
の無水物を経て上止に結合させて膜誘導体且を生成する
。該膜誘導体−１３，は今、共有に及び特異的に結合し
た保護されたアミノ酸誘導体を持っている。
本発明の方法の一実施態様では、１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール（ＨＯＢＴ）を活性剤として採用してＦｍ
ｏｃ保護されたアミノ酸ペンタフルオロフェニルエステ
ルを用いる。１つの伸張サイクルは下記の工程で構成さ
れる： ２）ｍＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０
％ピペリジンで処理して１旦のＦｍｏｃ保護基を取り去
る； ｂＨ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を活
性剤として用いてＦｍｏｃ保護されたアミノ酸Ｐｆｐエ
ステルを膜上の第一アミノ機能に結合させて第１ペプチ
ド結合を生じる； Ｃ）未反応の第一アミノ機能を酢酸無水物で処理してキ
ャップする。
正確な保護されたアミノ酸誘導体を選ぶことにより、最
後のビルディングブロックを鎖に結合させて所望の配列
を生じるまで工程２）ｍ〜Ｃ）を繰り返す。工程Ｃ）は
随意である。
親和実験用の膜を調製するには、保護基、特に側鎖保護
基を取り去らなければならない。側鎖保護基及び結合剤
の選定に応じて、ペプチドは膜上に残ることができるか
或は同定及び特性表示のために膜から取り去ることがで
きる。方法のこの特徴は、ペプチド配列を有する親和膜
を生成するために特に重要である。合成において配列特
異的問題が起き、個々の最適化プロセスを必要にさせ得
ることは当業者に知られている。
当業者に知られている膜に結合するための他の結合機能
を選択することによって、その他のペプチド合成法を採
用することができる（例えば、上に挙げた通りのバラニ
ー及びメリフィールド参′　　照）。かかる他の化学は
第一アミノ機能について異なる保護基（例えば、ｔ−ブ
チルオキシカルボニル、（ＢＯＣ）　、異なる側鎖保護
基及び異なる結合手順、例えば対称アミノ酸無水物或は
その他の活性なエステル機能或は活性剤を用いることを
含む。
発明を更に下記の例によって説明する。
アルキルジアミンによるイモウビロン親和膜の機能化 アメリカ合衆国マサチューセッツ、ベツドホード、ミリ
ボアコーポレーションから入手しつる通りのイモウビロ
ン親和膜（スキームエにおけるｒＡＭ、２）５シート（
１２，５Ｘ１０ｃｍ）を皿に入れてＮ、Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド（ＤＭ、Ｆ）中０．２Ｍの１．２−ジアミノ
エタン或は１．６−ジアミツヘキサンＬｏｏｍβでおお
った。時折攪拌しながら反応を室温で２．０時間進行さ
せた。無水メタノールで洗浄した後に、膜シートを真空
下で乾燥した。ピクリン酸結合アセイは、４　（ｎ＝２
）及び４（ｎ＝６）がそれぞれ乾燥膜１グラム当り０．
１０９ミリモル及び０．０４０ミリモルのアミン基を含
有することを示した。ピクリン酸結合アセイは、膜の片
（５ｍｇ）を精確に計り分は及びジクロロメタン中０．
２　Ｍのピクリン酸溶液で処理して行った。膜断片をジ
クロロメタンで洗浄し及び新しく調製したジクロロメタ
ン中４％のトリエチルアミン１０．Ｏｍρ中で吸収させ
た。トリエチルアンモニウムとクレートの吸光度を直ち
に３５８ｎｍ　（Ｃｓｓａ　＝１４，５００）において
記録した。
外ｌ 保護されたヌクレオシドのＩＡＭ４への結合機能化され
たＩＡＭ４　（ｎ＝６）　、０．９８ｇ（０，０３９ミ
リモルのアミン基）を０．４　ｍ　Ｌの乾燥ＤＭＦ中Ｎ
−４−ベンゾイル−３′−〇−スクシニルー５°　Ｏ−
ジメトキシトリチルデオキシシチジンのｐ−ニトロフェ
ニルエステル（０，２ミリモル）、トリエチルアミン（
０，２ミリモル）及び４−ジメチルアミノピリジン（０
，５ｍｇ）で処理した。２０℃で１６時間した後に、膜
をメタノールで洗浄し及び真空下で乾燥した。物質を４
．ｏｍＬのピリジン／酢酸無水物（３／１　（Ｖ／Ｖ）
）に２０℃で２．０時間暴露して過剰のアミノ基をアシ
ル化した。膜をメタノールで洗浄し及び乾燥した。小部
分（５ｍｇ）の支持体旦（スキームＩＩ　）をジメトキ
シトリチル基の存在について検定した（７０％の過塩素
酸／エタ／　−／ｌ／　（１／１（Ｖ／Ｖ））中の８４
９８＝７４，５００）。アセイは乾燥膜旦ｌグラム当り
の結合したヌクレオシド０．０３２ミリモル、収率８０
％を示した。
［ ｄ　（Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ）の合成膜６　（Ｂ＝シトシン、Ｗ
＝ベンゾイル）の０．８ｃｍ”ディスクを特別にデザイ
ンしたホルダー（第１図）に入れ及びミリゲン（Ｍｉｌ
ｌｉ　Ｇｅｎ　）６５００自動化ＤＮＡ合成装置に取り
付けた。β−シアノエチルホスホアミダイト（上に挙げ
た通りのエフ。デイ、シン八等）及び標準合成プロトコ
ルを用いて上記の配列を自動的に組立てた。最後の添加
サイクルに次いで、膜ディスクを封管中で濃アンモニア
水０．３　ｍ　Ｌによって５５℃において１２時間処理
した。アンモニア性溶液を濃縮し及び逆相ｈｐｌｃによ
るクロマトグラフィーにかけた。ｈｐｌｃクロマトグラ
ムを第２図に示す。ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって生成物ピークを分析した（エフ。デイ、シン八等
に記載されている通り）。結果を第３ａ図に示す。マキ
サムアンドギルバート手順（上に挙げたエフ。デイ。
シン八等に記載されている通り）を用いて、主バンドに
おける物質に配列分析を行った。結果を第３ｂ図に示し
、合成したヘキサデカマー配列が正しいことを立証する
。
五Ａ ＩＡＭ４へのノルロイシンの結合 イモウビロン親和膜４（ｎ＝２、スキームＩ）、３．２
０ｇ（アミノ基０．３４９ミリモル）にＮ−Ｆｍｏｃ−
Ｎｌｅ−０−Ｐｆｐ　（６，０ミリモル）を、乾燥ＤＭ
Ｆ２ＯｍＬ中１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６，
０ミリモル）の存在において室温で２．０時間反応させ
た。支持体をメタノールで洗浄し、乾燥し、次いで４０
ｍＬのピリジン／酢酸無水物（３／Ｉ（Ｖ／Ｖ））で室
温において更に２．０時間処理した。膜をメタノールで
洗浄してアシル化反応を停止させた。加入したノルロイ
シンの量は、フルオレニルメチルオキシカルボニル成分
の量を計って求めて０．０９３ミリモル／膜ｇであった
６膜旦５．Ｏｍｇ（スキーム■）を注意深く検量し及び
ピペリジンと０．４　ｍ　Ｌのジクロロメタンとの混合
物０．４ｍＬで室温において３０分間処理してアセイを
行う。
溶液をジクロロメタンでｌｏ、ｏｍＬに希釈し及び３０
１ｎｍにおける吸光度を求めた（ジクロロメタン中のＮ
−フルオレニルメチルピペリジンについてｔｓｏ＋　＝
７，８００）。
匠ニ リンカー成分上旦のＨ−Ｎｌｅ−ＩＡＭ　９への結合ジ
メチルホルムアミド中２０％のピペリジン５０ｍｊ２を
収容すル皿ニ、膜旦、３．２ｇ（０，３０ミリモルのア
ミノ基）を入れた。２０’Ｃで１０分した後に、膜を小
部分の乾燥ジメチルホルムアミドで１０回洗浄した。湿
潤した物質を、次いで、ジメチルホルムアミド２０ｍβ
中６．０ミリモルの４−ヒドロキシメチルフェニル酢酸
ペンタフルオロフェニルエステル及び６．０ミリモルの
１−ヒドロキシベンゾトリゾールで２０℃において２時
間処理した。支持体をジメチルホルムアミド、ジクロロ
メタン及びメタノールで逐次洗浄して反応な停止させた
。乾燥した後に、ピクリン酸結合アセイは膜１グラム当
り０．００２ミリモルの残留アミノ酸基を示した。これ
は収率９８％を示す。
匠五 ＩＡＭ誘導上ユへのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｖａ　ｌの結合Ｎ−
フルオレニルメトキシカルボニルバリン（０，４６ミリ
モル）をジクロロメタン１５ｍＬに溶解し及びジシクロ
へキシルカルボジイミド（０，２３ミリモル）を加えた
。室温で１５分した後に、濾過してジシクロヘキシル尿
素を取り去り及び溶液を濃縮した。残分を、４−ジメチ
ルアミノピリジン（０，０７ミリモル）を含有する乾燥
Ｄ　Ｍ　Ｆ　４．　Ｏｍ　Ｌに溶解し及び混合物をＩＡ
Ｍ誘導１１（スキームＩＩＩ）０．７ｇ、すなわち、支
持体結合ベンジルアルコール０．０８５ミリモルに適用
した。反応を室温において一晩保った。膜をＤＭＦ１ジ
クロロメタンで洗浄し及び乾燥した。Ｎ−フルオレニル
メチルピペリジンの開放によって判断して、支持体は乾
燥膜１グラム当り０．０７ミリモルのバリンを含有した
（ＩＡＭ上土上止する収率７５％）。
皿ニー Ｈ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＯＨの合成 バリンエステル化支持体（例６）の８．０ｃｍ２デイス
クを焼結ガラス漏斗の底部に入れた。膜をＤＭＦで洗浄
し及びＤＭＦ中２０％のピペリジンで５分間処理してＮ
−Ｆｍｏｃ基を取り去った。膜をＤＭＦで洗浄した後に
、乾燥ＤＭＦ中０．３　Ｍの側鎖保護されたＮ−Ｆｍｏ
ｃ−Ｇｌｕ−０−Ｐｆｐ、０．３ＭのＨＯＢＴ２、　Ｏ
ｍ　Ｌに室温で３０分間暴露した。次いで、膜をＤＭＦ
で洗浄した。種々のＮ−Ｆｍｏｃ−０−Ｐｆｐエステル
化アミノ酸を用い、洗浄、脱保護、洗浄、カップリング
のサイクルを、所望の配列Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ａ　１ａ−Ａ
ｓｎ−Ｌｙｓ　（Ｂｏ２）ｍ　−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ　（ＯＢｕｔ）　−Ｇｌｕ　（０−Ｂｕｔ
）−Ｖａｌ　（プロトロンビン前駆物質）を達成し得る
ように、繰り返した。トルフルオロ酢酸で物質を支持体
から分離させるに先立って、最終のＮ−末端Ｆｍｏｃ基
を取り去った。物質を、酢酸溶液を濃縮した後に、逆相
ｈｐｌｃによって分析した。結果を第４図に示す。主ピ
ークにおける物質がカラムからキーゼルグール（Ｋ　１
ｅｓｅ　Ｉｇｕｈｒ）−ポリアクリルアミド支持体上で
合成した同一のペプチド（イー、アタートン（Ｅ、　Ａ
ｔｈｅｒｔｏｎ）　、イー、ブラウン（Ｅ。
Ｂｒｏｗｎ）、アール、シー、シェパード及びニー、ロ
ーズビアー（Ａ、Ｒｏｓｅｖｅａｒ）　、Ｊ、Ｃｈｅｍ
、Ｓｏｃ、Ｃｈｅｍ。
Ｃｏｍｍ、　、　３７頁、１９８１年）と同じ位置で溶
出した。
第５図はペプチドを加水分解し、次いで標準の手順に従
ってフェニルチオイソシアネートで誘導体合成した後に
得たＰＴＣアミノ酸のｈｐｌｃクロマトグラムを示し、
正しいアミノ酸組成を示す。アミノ酸配列を固相エドマ
ン分解法によって確認した。
上澄 ポリプロピレン膜上のオリゴヌクレオチド合成ポリエト
キシエチルアクリレートをグラフトしたポリプロピレン
膜（０，１８０ｇ）をＤ　Ｍ　Ｆ−２，０ｍβ中２．０
ミリモルのＯ−ジメトキシトリチルアミノエタノールで
８０℃において１９時間処理した。膜をメタノールで洗
浄し及び乾燥した。小部分の物質をジメトキシトリチル
基の存在について検定した（例２参照）、アセイは、ポ
リマーがポリマー１グラム当り０．００２２ミリモルの
保護されたアルコール官能基を含有することを示した。
膜の０．８　ｃｍ”ディスクを、ミリケン６５００ＤＮ
Ａ合成装置内に取り付けた第１図の特別にデザインした
ホルダーの中に入れた。下記：ｄ　（Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−
Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ）の合成を、標準
のホスホルアミダイト合成プロトコル（上記シン八等）
を用いて行った０合成の終りにあたって、ディスクを濃
アンモニア水０．３ｍρで５５℃において１２時間処理
した。５°末端ジメトキシトリチル基の酸加水分解して
、乾燥膜１グラム当りＯ，’０Ｏ０３ミリモルのオリゴ
ヌクレオチドを示した。これは総括段階収率８８％を示
した。
スキーム■ ｐ−ｃ＼ＯＣＨ，ＣＨ，ＯＣＨ，ＣＨ，ＯＣＨ，ＣＨ３
＋　ＤＭＴ−ＯＣＲ，ＣＨ，ＮＩ（。
ｐ−ｃ＼ＮＣＨ２ＣＨ，Ｏ−ＤＭＴ 口 聾 当業者ならば、本明細書中に記載した発明の特定の実施
態様の多くの均等物を認識し或はわずかに日常の実験に
よって確認することができよう。
これらの均等物は特許請求の範囲に含まれるつもりであ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図はオリゴヌクレオチド或はオリゴペプチドを合成
する膜用に特別にデザインしたホルダーを示す。 第２図はヘキサデカマーオリゴヌクレオチドのｈｐｌｃ
クロマトグラムを示す。 第３Ａ図は発明の方法によって合成したヘキサデカマー
オリゴヌクレオチドのＰＡＧＥ分析を示す。 第３Ｂ図はヘキサデカマーオリゴヌクレオチドについて
の配列決定ゲルを示す。 第４図は発明の方法によって合成したノナペプチドのｈ
ｐｌｃクロマトグラムを示す。 第５図はＰＴＣ誘導体合成したアミノ酸の形の加水分解
ノナペプチドのｈｐｌｃクロマトグラムを示す。 ＦＩＧＵＲＥ　　１ ＦＩＧＵＲＥ　　２ 保持時間（分） ＦＩＧＵＲＥ　　４ 保持時間（分）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、保護されたヌクレオシド或はアミノ酸を結合させた
    ポリマー膜を含む改質膜。 ２、下記式によって表わされる改質膜： Ｐ−−Ｘ−−Ｙ−Ｎ−Ｚ−−Ｓ＾Ｗ ここで、Ｐはポリマー膜であり； Ｘは膜についた官能基であり； Ｙ−Ｎ−Ｚはリンカーであり、Ｎはスペイサー分子であ
    り、Ｙ及びＺは同一或は異なる官能基であり、リンカー
    は官能基Ｙが官能基Ｘに付くことによって膜に結合され
    ； Ｓ＾Ｗは保護されたヌクレオシド或はアミノ酸であり、
    Ｓ＾Ｗはリンカーの官能基Ｚを通してリンカーに結合さ
    れる。 ３、膜Ｐがスペイサー基を結合するために構成モノマー
    ユニット内に官能基を含有する多孔質構造の平坦な透過
    性ポリマー膜を含む特許請求の範囲第２項記載の改質膜
    。 ４、モノマーがスペイサー基を結合するためのフリーの
    アルコール或はエステル機能を有するアクリル或はメタ
    クリル酸エステルである特許請求の範囲第３項記載の改
    質膜。 ５、ポリマー物質がポリジアルキルシランジオール、ポ
    リジアルキルシロキサン、ポリビニルアルコール、ポリ
    オキシメチレン及びポリオキシエチレンから成る群より
    選ぶ架橋ポリマーである特許請求の範囲第３項記載の改
    質膜。 ６、膜が、スペイサーを結合するための官能基を導入し
    た多孔質構造を有する平坦な透過性ポリマー物質である
    特許請求の範囲第２項記載の改質膜。 ７、ポリマー物質がポリスチレン、芳香族残基を含有す
    るポリスルン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボ
    ネート、ポリビニリデンジフルオリド及びポリビニルア
    セテートを含む特許請求の範囲第６項記載の改質膜。 ８、膜が官能基を含有する成分をグラフトした多孔質構
    造を有する平坦な透過性ポリマー物質である特許請求の
    範囲第２記載の改質膜。 ９、ポリマー物質がポリスルホン、ポリテトラフルオロ
    エチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン或はポリビニ
    リデンジフルオリドを含む特許請求の範囲第８記載の改
    質膜。 １０、膜がスペイサーを結合するためのフリーの官能基
    を含有する第２のポリマー物質を被覆した多孔質構造を
    有する平坦な透過性ポリマー物質である特許請求の範囲
    第２項記載の改質膜。 １１、ポリマー物質がポリスルホン、ポリテトラフルオ
    ロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン或はポリビ
    ニリデンジフルオリドを含む特許請求の範囲第１０項記
    載の改質膜。 １２、第２のポリマー物質がスペイサー基を結合するた
    めのフリーのアルコール或はエステル機能を有するアク
    リル或はメタクリル酸エステルを含む特許請求の範囲第
    １０項記載の改質膜。 １３、Ｎが−（ＣＨ＿２）＿ｎ−（ｎは１〜２０である
    ）である特許請求の範囲第２項記載の改質膜。 １４、Ｎが−ＮＨ−（ＣＨ＿２）＿ｍ−ＮＨＣＯ−（Ｃ
    Ｈ＿２）＿ｍ−ＣＯ−（ｍは１〜６である）である特許
    請求の範囲第２項記載の改質膜。 １５、Ｎがオリゴグリシンである特許請求の範囲第２項
    記載の改質膜。 １６、Ｙ及びＺを個々に下記： ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
    表等があります▼、−Ｓ−、−Ｏ−、▲数式、化学式、
    表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼
    、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式
    、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります
    ▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学
    式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等がありま
    す▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化
    学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり
    ます▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、
    化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があ
    ります▼、及び▲数式、化学式、表等があります▼ から成る群より選ぶ特許請求の範囲第２項記載の改質膜
    。 １７、Ｓ＾Ｗが下記式のヌクレオシド： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｂ＾Ｗ’は保護されたヌクレオ塩基であり；Ｗ
    ”はＨ或はヒドロキシ保護基である） を表わす特許請求の範囲第２項記載の改質膜。 １８、Ｗ”がトリチル基、アシル基或はシリル基である
    特許請求の範囲第１７項記載の改質膜。 １９、Ｓが下記式のアミノ酸： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｕはアミノ酸側鎖を表わし； Ｗ’は側鎖保護基を表わし； Ｗ”はアミノ保護基を表わし； Ｗ”’はカルボキシ保護基を表わす） を表わす特許請求の範囲第２項記載の改質膜。 ２０、Ｓ＾Ｗがカルボキシル基を通してリンカーに結合
    したノルロイシンである特許請求の範囲第１９項記載の
    改質膜。 ２１、ノルロイシンの第一アミノ基をＦ＿ｍ＿ｏ＿ｃフ
    ルオロエニルメチルオキシカルボニルで保護した特許請
    求の範囲第２０項記載の改質膜。 ２２、逐次ヌクレオチドを特許請求の範囲第１７項記載
    の改質膜に結合させることを含むオリゴヌクレオチドの
    合成方法。 ２３、逐次アミノ酸を特許請求の範囲第１９項記載の改
    質膜に結合させることを含むペプチドの合成方法。 ２４、ａ、下記式によって表わされる改質膜： Ｐ−−Ｘ−−Ｙ−Ｎ−Ｚ−−Ｓ＾Ｗ （ここで、Ｐはポリマー膜であり； Ｘは膜についた官能基であり； Ｙ−Ｎ−Ｚはリンカーであり、Ｎはスペイサー分子であ
    り、Ｙ及びＺは同一或は異なる官能基であり、リンカー
    は官能基Ｘを通して膜に結合されており； Ｓ＾Ｗは保護されたヌクレオシドであり、Ｓ＾Ｗはリン
    カーの官能基Ｚを通してリンカーに結合されている） を準備し、 ｂ、保護されたヌクレオシドホスホルアミダイトをヌク
    レオシドＳ＾Ｗに結合させてホスファイトトリエステル
    結合を有する膜結合したヌクレオシド−ヌクレオチドを
    生成し、 ｃ、ホスファイトトリエステルを酸化してホスフェート
    トリエステル結合を形成し、 ｄ、追加の保護されたヌクレオシドホスホルアミダイト
    を膜結合したヌクレオシド−ヌクレオチドに逐次結合さ
    せ、各々の結合工程の後に、生成したホスファイトトリ
    エステル結合をホスフェートトリエステルに酸化して膜
    結合したポリヌクレオチドとする 工程を含むオリゴヌクレオチドの合成方法。 ２５、ヌクレオシドホスホルアミダイトがベータ−シア
    ノエチル保護されたホスフェートを含有する特許請求の
    範囲第２４項記載の方法。 ２６、更に、膜結合したポリヌクレオチドから保護基を
    取り去ることを含む特許請求の範囲第２４項記載の方法
    。 ２７、合成したポリヌクレオチドを膜から***させる特
    許請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８、特許請求の範囲第２４項記載の方法によって製造
    された膜結合されたポリヌクレオチド。 ２９、ａ、下記式によって表わされる改質膜： Ｐ−−Ｘ−−Ｙ−Ｎ−Ｚ−−Ｓ＾Ｗ （ここで、Ｐはポリマー膜であり； Ｘは膜についた官能基であり； Ｙ−Ｎ−Ｚはリンカーであり、Ｎはスペイサー分子であ
    り、Ｙ及びＺは同一或は異なる官能基であり、リンカー
    は官能基Ｘを通して膜に結合されており； Ｓ＾Ｗは保護されたアミノ酸であり、Ｓ＾Ｗはリンカー
    の官能基Ｚを通してリンカーに結合されている） を準備し、 ｂ、保護されたアミノ酸をＳ＾Ｗに逐次結合させて膜結
    合されたペプチドを製造する 工程を含むペプチドの合成方法。 ３０、更に膜結合したペプチドから保護基を取り去る工
    程を含む特許請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１、合成したペプチドを膜から***させる特許請求の
    範囲第２９項記載の方法。 ３２、特許請求の範囲第２９項記載の方法によって製造
    された膜−ペプチド。 ３３、Ｓ＾Ｗが側鎖保護されたノルロイシンを表わす特
    許請求の範囲第２９項記載の方法。 ３４、第２のリンカー基をＳ＾Ｗに結合させ、リンカー
    基が次の保護されたアミノ酸を結合させるための官能基
    を与える特許請求の範囲第２９項記載の方法。 ３５、リンカーがｐ−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸
    である特許請求の範囲第３４項記載の方法。 ３６、オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの末端
    を通して結合させた膜。 ３７、ペプチドをペプチドの末端を通して結合させた膜
    。 ３８、下記式： Ｐ−−Ｘ−−Ｙ−Ｎ−Ｚ−（−Ｓ＾Ｗ）＿ｎ ここで、Ｐはポリマー膜であり； Ｘは膜についた官能基であり； Ｙ−Ｎ−Ｚはリンカーであり、Ｎはスペイサー分子であ
    り、Ｙ及びＺは同一或は異なる官能基であり、リンカー
    は官能基Ｘを通して膜に結合されており； （Ｓ＾Ｗ）＿ｎは保護された或は一部保護されたヌクレ
    オチド或はアミノ酸で構成されるオリゴヌクレオチド或
    はペプチドを表わし、ｎはオリゴヌクレオチドのヌクレ
    オチド或はアミノ酸単位の数であり、（Ｓ＾Ｗ）＿ｎは
    リンカーの官能基Ｚを通してリンカーに結合されている によって表わされる結合されたオリゴヌクレオチド或は
    ペプチドを有する膜。 ３９、下記式： Ｐ−−Ｘ−−Ｙ−Ｎ−Ｚ−（−Ｓ）＿ｎ ここで、Ｐはポリマー膜であり； Ｘは膜についた官能基であり； Ｙ−Ｎ−Ｚはリンカーであり、Ｎはスペイサー分子であ
    り、Ｙ及びＺは同一或は異なる官能基であり、リンカー
    は官能基Ｘを通して膜に結合されており； （Ｓ）＿ｎはオリゴヌクレオチド或はペプチドを表わし
    、ｎはオリゴヌクレオチド或はペプチドのヌクレオチド
    或はアミノ酸単位の数であり、（Ｓ）＿ｎはリンカーの
    官能基Ｚを通してリンカーに結合される によって表わされる結合されたオリゴヌクレオチド或は
    ペプチドを有する膜。
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