JPS6028279B2 - プリン代謝に関与する酵素活性の測定用試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は皿中、赤血球溶血液中、培養液中のプリン代謝
に関与する酵素活性の測定用試薬に関する。

プリン代謝はピーＪミジン代謝とともに核酸代謝の主要
な経路として知られ、アデノシンから尿酸に至る代謝経
路などが衆知されている。

また、プリン代謝に関与する酵素群としてはアデノシン
からイノシンへの分解を触媒するアデノシンデアミナー
ゼ〔以下ＡＤＡと略す〕、ィノシンからヒポキサンチン
への分解を触媒するプリンヌクレオシドフオスフオリラ
ーゼ〔以下ＰＮＰと略す〕およびヒポキサンチンからキ
サンチン、次いで尿酸への分解を触媒するキサンチンオ
キシダーゼ〔以下ＸＯＤと略す〕が知られている。

しかしながら、今日、プリン代謝に係る上述の各種代謝
産物、酵素群において、日常の臨床診断に利用されてい
るのは、わずかに代謝終末産物の尿酸〔痛風、腎婆員愚
などで高値を示す〕のみである。

しかし、一方で、血中のＡＤＡ活性が蝿疾患、肝疾患で
増大するという報告が散見される。

そして、これら酵素の活性測定法として、ｉ基質の減少
を測定する方法、ｉｉ酵素反応の結果、生成するアンモ
ニアを比色定量するカロリメトリツクまたはスベクトロ
フオトメトリック法、ｉｉｉ共役酵素としてＸＯＤを用
い、生成する尿酸を２９桝ｍにおいて比色定量する方法
などが知られている。しかし、これらの方法は、ｉ法で
は基質として用いるプリン塩基の吸光度が血清成分の影
響を受けやすいこと、‘ｉｉ’法では血中アンモニアの
影響を受けやすく、従ってブランク値が変動すること、
とくにカロリメトリック法では遠沈操作を必要とするの
で操作が煩雑となり、且つ感度も悪いこと、ｉｉｉ法で
は尿酸の吸光度（２９筑ｍ）が血清成分の影響を受けや
すく、また既存の尿酸によりブランク値が変動すること
など幾多の欠点を有し、さらに過酸化水素を測定するの
ではなく、テトラゾリゥム塩を直接還元し測定する方法
は見当らない。

他方、血中のＰＮＰ活性については、その測定法に関す
る報告はとくに見当らない。

そこで、本発明者らは、これら二種の酵素の簡便、かつ
正確な活性測定法を確立すべく種々検討した結果、ゥシ
ミルク起源ＸＯＤを反応の最終段階で共役酵素として用
い、ＸＯＤ反応により共存するテトラゾリウム色素の還
元型色素（ホルマザン）を比色定量する新らしい酵素活
性測定法を見し、出すことに成功した。

そして、この測定法に従い、各種疾病の患者血清を用い
、ＡＤＡおよびＰＮＰ活性を測定したところ、ＡＤＡ活
性は骨髄性白血病、肝炎で、ＰＮＰ活性はリンパ性白血
病、肝炎でそれぞれ高値を示した。従って、これら二種
の酵素の定量は臨床的意義を有し、しかも測定方法が簡
便、かつ正確なので本発明の試薬は日常の臨床診断薬と
して有用である。

本発明の要旨を反応式で示すと 次に本発明の特徴とするところ、また、本願発明の技術
的狙いとするところ、従釆技術では得られなかった点に
ついて述べる。

従来技術において、ＸＯＤをキサンチンに作用せしめ尿
酸を生成させる一方、ニコチンアミドーアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤ）からの還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）の
生成を利用し、テトラゾリウム塩を還元せしめ、ジアホ
ラーゼの存在下、比色定量させてし、た。

しかしながら、本願は、従来技術より簡便で、さらに安
価な試薬を得ることを狙い、それを可能にせしめた。

つまり、比較的入手しやすいヴシミルク起源ＸＯＤを利
用し、それを基質に作用せしめる一方、テトラゾリウム
塩（ＩＮＴ※１あるいはＮＢＴ※２）を直接還元し生成
するホルマザンを可視部領域（５０Ｍｍあるいは５６瓜
ｍ）で比色定量する事を発明した。

※１ｍＴ：３−（Ｐ−ヨードフエニル）一２一（Ｐ−ニ
トロフエニル）−５ーフエニルー２日 テトラゾリウム
クロリド※２ ＮＢＴ：２，２ージ−Ｐーニトロフエ
ニルー５，５′ージフエニル−３，３′−（３，３−ジ
メトキシー４，４′−ジフヱニレン）ジテトラゾリウム
クロリド本発明の試薬は■基質溶液、■発色液、■酵素
液および■反応停止液の組合せからなる。

これらの試薬はそれぞれ別個に調製され、ＡＤＡまたは
ＰＮＰ活性を測定するとき順次混合される。

基質は目的とする酵素に対応し、異なる。

即ちＡＤＡに対しアデノシンが、ＰＮＰに対しィノシン
が用いられる。また、アデノシン、ィノシンの純度は化
学用純度、望ましくは生化学用純度で測定可能である。

これらの基質を溶解する緩衝液としては、各酵素の性質
からＡＤＡおよびＰＮＰのとき、０．０５〜０．２モル
、餌７〜８の範囲、好ましくはｐＨ７．５付近がよく、
例えばリン酸緩衝液、ブリットン・ロビンソン緩衝液な
どが好適である。どちらの場合も、アジ化ナトリウムの
添加はカタラーゼ阻害剤あるいは防腐剤として有利であ
る。

共役酵素として用いるＰＮＰおよびＸＯＯの使用量は、
吸光度の一定となる最小量が前者１．７９ｈＵ、後者１
仇ｈＵであったことから、それ以上、願わくば５倍以上
用いるのが適当である。

なお、ウシミルク起源ＸＯＤの精製方法については、１
硫安分画でけによる、２硫安分画後ハイドロキシアパタ
イトクロマトグラフイーによる、３硫安分画、ハイドロ
キシアパタィトグラフィー後、セフアデツクスＧ２００
による〔以上Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ侭．５２６，
３２８（１９７８）４Ｈａｎらの方法〔ＢｉＭｈｅｍ．
Ｊ．１１６，８５１（１９７０）〕などあげられるが、
いずれの方法に従って得たＸＯＤでも、純度に関係なく
測定できる。ＰＮＰの純度については２瓜／机９ｐｒｏ
畑ｎの硫安懸濁液ｐＨ６．０のもので充分測定可能とな
る。

また、酵素の反応時間は、試料として血清５０山そを用
いて検討した結果、ＡＤＡ、ＰＮＰとも９０分まで原点
を通る直線を認めたことから、２０〜３０分が妥当と判
断した。さらに、直線性を認める最大血清量がそれぞれ
ＡＤＡ１２５山そおよびＰＮＰ１２０一そであったこと
から血清の使用量はＡＤＡ、ＰＮＰのとき５０ムそと定
めた。なお、酵素液は１．５〜４モル、硫酸アンモニウ
ム懸濁液または４０〜６０％グリセリン溶液として保存
すると有利である。

酵素反応の停止液としては、これを反応液に加えたとき
、ＰＨＩ〜４に止まるような酸性の溶液、例えば０．１
〜０．３モルのクエン酸溶液、０．１〜１規定の塩酸溶
液、０．１〜０．５モルの酢酸溶液などが好適である。

また、この場合、０．０２〜０．１％安息香酸ナトリウ
ムなどの防腐剤を添加することができる。反応停止後の
発色は各発色液とも１０分間の放置で安定化し、その後
６技分まで安定である。

発色剤のテトラゾリウム色素としては３−（ｐーヨード
フヱニル）一２−（ｐーニトロフエニル）‐５‐フェニ
ル一畑‐テトラゾリウムクロリド〔以下ｍＴと略す〕ま
たは２，〆−ジーｐーニトロフエニル−５，５′ージフ
エニル−３，３一（３，３−ジメトキシ−４，４′ージ
フエニレン）ジテトラゾリウム クロリド〔以下ＮＢＴ
と略す〕が好適であり、これらを溶解する緩衝液として
は、マクルベィン緩衝液、コハク酸緩衝液、リン酸緩衝
液、ブリットン．ロビンソン緩衝液などが使用できる。
この場合、ＸＯＤ反応により生成するホルマザンの可溶
化剤としてトライトンＸ−１００などの非イオン性界面
活性剤または牛血清アルブミンを添加すると有利である
。また、測定波長はＩＮＴ使用の時、５０皿ｍが、ＮＢ
Ｔ使用の時、５６皿ｎが好適である。なお、本発明の試
薬を用い、各酵素活性を測定する際の血清成分の影響を
検索したところ、アルブミン、グルコース、尿酸、ビリ
ルビン、アスコルビン酸、グルタチオンなどの影響は全
く認められなかった。

また、各酵素活性測定における同時再現性ならびに日差
変動は、これらを変動係数として表わすとき、いずれも
３％以下を示した。次に、本発明試薬の調製法ならびに
血清中ＡＤＡおよびＰＮＰ活性測定の実際例を具体的に
例示する。

実施例 １ 試薬の調製 ■ 基質溶液の調製 ｉ ＰＮＰ活性測定用 ィノシン１００の９を０．１Ｍ、ｐＨ７．５のリン酸緩
衝液にとかして全量５０の‘とする。

２〜８℃で保存。

ｉｉ ＡＤＡ活性測定用 アヂノシン１００の夕を０．１Ｍ、ＰＨ７．５のリン酸
緩衝液にとかして全量５０の‘とする。

２〜８℃で保存。

■ 発色液の調製 ｉ ＰＮＰおよびＡＤＡ活性測定用 １ １ＮＴ１６のｏおよび１０％トライトンＸ−１００
溶液０．２の‘を０．１Ｍ、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液
にとかして全量１００叫とする。

２〜８℃で褐色ビンに保存 ２ 川Ｔ１６雌および牛血清アルブミン１２雌を０．１
Ｍ、ＦＨ７．５のリン酸緩衝液にとかして全量を１００
の‘とする。

２〜８℃で褐色ビンに保存。

３ ＮＢＴ２６の９および１０％トライトンＸ−１００
溶液０．２の‘を０．１Ｍ、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液
にとかして全量を１００の‘とする。

２〜８℃で褐色ビンに保存。

４ ＮＢＴ２６奴９および牛血清アルブミン１２の９を
０．１Ｍ、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液にとかして全量を
１００地とする。

２〜８℃で褐色ビンに保存。

■ 酵素液の調製 ｉ ＰＮＰ活性測定用 Ｉ ＸＯＤＩＯＵを２．３Ｍの硫酸アンモニウム溶液ｌ
ｏｏの‘に懸濁する。

２ ×ＯＤＩＯＵを５０％グリセリン溶液１００叫に溶
解する。

ｉｉ ＡＤＡ活性測定用 Ｉ ＰＮＰＩ．７５ＵおよびＸＯＤＩＯＵを２．３Ｍの
硫酸アンモニウム溶液ｌｏｏの上に懸濁する。

２ ＰＮＰＩ．７５ＵおよびＸＯＤＩＯＵを５０％グリ
セリン溶液１００のとに溶解する。

なお、保存はいずれの場合も０〜４００で褐色ビンに入
れて行う。

■ 反応停止液の調製（各酵素共通） １ クエン酸・１水和物４．２夕および安息香酸ナトリ
ウム５０の９を水にとかして全量を１００の‘とする。

２ 安息香酸ナトリウム５０の２をｐＨ２．０の塩酸溶
液にとかして全量を１００舷とする。実施例 ２ ＰＮＰ活性の定量 実施例１に記載の各調製試薬を用い、次の手順で測定し
た。

但し、■基質溶液は１、■発色液は１の１、■酵素液は
１の１、■反応停止液は２を用いた。■０．２の【およ
び■２．５の‘の混液に■１００仏夕を加え、３７０で
５分間プレインキュベートする。

次に血清５０仏夕を加え、３７０で３０分間反応させる
。のち、■０．５の‘を加え波長５０Ｍｍで比色定量す
る。吸光度からＰＮＰ活性への換算はあらかじめ作製し
た検量線から試料の吸光度に相当する酵素活性（ＩＵ／
夕）を読みとることによりできる。但し、ＰＮＰＩ単位
は上記反応系で１分間に１Ａｍｏｌｅのヒポキサンチン
を生成する酵素活性である。ＡＤＡ活性の定量 実施例１に記載の各調製試薬を用い、次の手順で測定し
た。

但し、■基質溶液はｉｉ、■発色液はｉのｉ、■酵素液
はｉｉの１、■反応停止液は２を用いた。■０．２肌【
および■２．５ｍ‘の混液に■１００山夕を加え、３７
０で５分間プレインキュベートする。

次に血清５０仏夕を加え３７０で３０分反応させる。の
ち、■０．５私を加え波長５０仇ｍで比色定量する。吸
光度からＡＤＡ活性への換算はあらかじめ作製した検量
線から試料の吸光度に相当する酵素活性（ＩＵ／夕）を
読みとることによりできる。但し、ＡＤＡＩ単位は上記
反応系で１分間に１〃ｍｏｌｅのヒポキサンチンを生成
する酵素活性である。次に、本発明の試薬を用い、上記
の方法で定量した各種疾患の血清中ＰＮＰおよびＡＤＡ
活性を表に示す。

表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ （１）３．７４〜１５．０ｍＭのイノシンを基質と
   する溶液、（２）０．１９８〜１．５８Ｍの３−（Ｐ−
   ヨードフエニル）−２−（Ｐ−ニトロフエニル）−５−
   フエニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリドと非イオン界
   面活性剤（または牛血清アルブミン）および０．０５〜
   ０．２ＭｐＨ６〜８の緩衝液からなる発色液、（３）１
   ０〜４０ｍＵのウシミルク起源キサンチンオキシダーゼ
   の１．５〜４Ｍ硫酸アンモニウム懸濁液または４０〜６
   ０％グリセリン溶液、（４）０．１〜０．３Ｍのクエン
   酸溶液、０．１〜１Ｎの塩酸溶液または０．１〜０．５
   Ｍの酢酸溶液である反応停止液の組合せよりなり、ウシ
   ミルク起源キサンチンオキシダーゼを生成したヒボキサ
   ンチンおよびキサンチンに作用せしめる一方、テトラゾ
   リウム塩を直接還元しホルマザンを生成せしめ、これを
   比色定量することを特徴とする血中、赤血球溶血液中、
   培養液中のプリン代謝に関与するプリンヌクレオシドフ
   オスフオリラーゼ活性の測定用試薬。 ２ （１）３．７４〜１５．０ｍＭのアデノシンを基質
   とする溶液、（２）０．１９８〜１．５８Ｍの３−（Ｐ
   −ヨードフエニル）−２−（Ｐ−ニトロフエニル）−５
   −フエニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリドと非イオン
   界面活性剤（または牛血清アルブミン）および０．０５
   〜０．２Ｍ、ｐＨ６〜８の緩衝液からなる発色液、（３
   ）１０〜４０ｍＵのウシミルク起源キサンチンオキシダ
   ーゼおよび１．７５〜５ｍＵのプリンヌクレオシドフオ
   スフオリラーゼの１．５〜４Ｍ硫酸アンモニウム懸濁液
   または４０〜６０％グリセリン溶液、（４）０．１〜０
   ．３Ｍのクエン酸溶液、０．１〜１Ｎの塩酸溶液または
   ０．１〜０．５Ｍの酢酸溶液である反応停止液の組合せ
   よりなり、ウシミルク起源キサンチンオキシダーゼを生
   成したヒボキサンチンおよびキサンチンに作用せしめる
   一方、テトラゾリウム塩を直接還元しホルマザンを生成
   せしめ、これを比色定量することを特徴とする血中、赤
   血球溶血液中、培養液中のプリン代謝に関与するアデノ
   シンデアミナーゼ活性の測定用試薬。 ３ （１）３．７４〜１５．０ｍＭのイノシンを基質と
   する溶液、（２）０．１９８〜１．５８Ｍの２，２′−
   ジ−Ｐ−ニトロフエニル−５，５′−ジフエニル−３，
   ３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ジフエニレ
   ン）ジテトラゾリウムクロリドと非イオン界面活性剤（
   または牛血清アルブミン）および０．０５〜０．２Ｍ、
   ｐＨ６〜８の緩衝液からなる発色液、（３）１０〜４０
   ｍＵのウシミルク起源キサンチンオキシダーゼの１．５
   〜４Ｍ硫酸アンモニウム懸濁液または４０〜６０％グリ
   セリン溶液、（４）０．１〜０．３Ｍのクエン酸溶液、
   ０．１〜１Ｎの塩酸溶液または０．１〜０．５Ｍの酢酸
   溶液である反応停止液の組合せよりなり、ウシミルク起
   源キサンチンオキシダーゼを生成したヒボキサンチンお
   よびキサンチンに作用せしめる一方、テトラゾリウム塩
   を直接還元しホルマザンを生成せしめ、これを比色定量
   することを特徴とする血中、赤血球溶血液中、培養液中
   のプリン代謝に関与するプリンヌクレオシドフオスフオ
   リラーゼ活性の測定用試薬。 ４ （１）３．７４〜１５．０ｍＭのアデノシンを基質
   とする溶液、（２）０．１９８〜１．５８Ｍの２，２′
   −ジ−Ｐ−ニトロフエニル−５，５′−ジフエニル−３
   ，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ジフエニ
   レン）ジテトラゾリウムクロリドと非イオン界面活性剤
   （または牛血清アルブミン）および０．０５〜０．２Ｍ
   、ｐＨ６〜８の緩衝液からなる発色液、（３）１０〜４
   ０ｍＵのウシミルク起源キサンチンオキシダーゼおよび
   １．７５〜５ｍＵのプリンヌクレオシドフオスフオリラ
   ーゼの１．５〜４Ｍ硫酸アンモニウム懸濁液または４０
   〜６０％グリセリン溶液、（４）０．１〜０．３Ｍのク
   エン酸溶液、０．１〜１Ｎの塩酸溶液または０．１〜０
   ．５Ｍの酢酸溶液である反応停止液の組合せよりなり、
   ウシミルク起源キサンチンオキシダーゼを生成したヒポ
   キサンチンおよびキサンチンに作用せしめる一方、テト
   ラゾリウム塩を直接還元しホルマザンを生成せしめ、こ
   れを比色定量することを特徴とする血中、赤血球溶血液
   中、培養液中のプリン代謝に関与するアデノシンデアミ
   ナーゼ活性の測定用試薬。