JP3045190B2 - クレアチンキナーゼ測定用試薬 - Google Patents
クレアチンキナーゼ測定用試薬Info
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- JP3045190B2 JP3045190B2 JP3075721A JP7572191A JP3045190B2 JP 3045190 B2 JP3045190 B2 JP 3045190B2 JP 3075721 A JP3075721 A JP 3075721A JP 7572191 A JP7572191 A JP 7572191A JP 3045190 B2 JP3045190 B2 JP 3045190B2
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- Japan
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- reagent
- g6pdh
- measurement
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- phosphogluconolactonase
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医学診断上、その他に
有用な、生体液中のクレアチンキナーゼ（以下、ＣＫと
略称する。）の測定用試薬に関するものである。
有用な、生体液中のクレアチンキナーゼ（以下、ＣＫと
略称する。）の測定用試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＣＫは、全身の筋組織及び脳に存在し、
臨床検査の領域においてＣＫ活性は、心筋梗塞などの心
疾患、筋ジストロフィーなどの筋疾患、神経性疾患、中
枢神経系疾患、精神病などの診断に日常的に測定されて
いる重要な項目の一つである。ＣＫは下記反応式１の左
右両方向の反応を触媒する酵素である。
臨床検査の領域においてＣＫ活性は、心筋梗塞などの心
疾患、筋ジストロフィーなどの筋疾患、神経性疾患、中
枢神経系疾患、精神病などの診断に日常的に測定されて
いる重要な項目の一つである。ＣＫは下記反応式１の左
右両方向の反応を触媒する酵素である。
【０００３】
【化１】
【０００４】従来から種々のＣＫ活性測定法が提案され
てきたが、左方向の反応を測定する方法は、低感度、発
色が不安定という理由で近年殆ど使用されていない。ま
た右方向の活性を測定する方法には、生成したクレア
チンを色素と反応させて比色する、あるいは蛍光を測定
する方法、ルシフェラーゼを用いる方法（特開昭５１
−４１５９７号公報、特公昭５８−５６７８号公報、特
開昭５６−２６２００号公報、特開昭５７−１０５１９
９号公報参照）、ホスホグリセリン酸キナーゼとグリ
セルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を用いる方法
（特公昭５９−３４１１９号公報、特開昭５６−１５５
００号公報参照）、ヘキソキナーゼ（以下、ＨＫと略
称する。）とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下、Ｇ６ＰＤＨと略称する。）を用いる方法などであ
る。
てきたが、左方向の反応を測定する方法は、低感度、発
色が不安定という理由で近年殆ど使用されていない。ま
た右方向の活性を測定する方法には、生成したクレア
チンを色素と反応させて比色する、あるいは蛍光を測定
する方法、ルシフェラーゼを用いる方法（特開昭５１
−４１５９７号公報、特公昭５８−５６７８号公報、特
開昭５６−２６２００号公報、特開昭５７−１０５１９
９号公報参照）、ホスホグリセリン酸キナーゼとグリ
セルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を用いる方法
（特公昭５９−３４１１９号公報、特開昭５６−１５５
００号公報参照）、ヘキソキナーゼ（以下、ＨＫと略
称する。）とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下、Ｇ６ＰＤＨと略称する。）を用いる方法などであ
る。
【０００５】これらのうち、のＨＫとＧ６ＰＤＨを用
いる方法は、原理的に最も優れ、感度、再現性も良いこ
と、及び多数検体処理も可能なことから最も多用されて
いる。さらに、このＨＫとＧ６ＰＤＨを用いる方法にお
いても、溶液状態での室温保存安定性が乏しいなどの問
題点があったが、ＨＫの代わりにグルコースに極めて特
異性が高く、かつ安定性に優れたグルコキナーゼ（以
下、ＧｌｃＫと略称する。）を使用する方法が提案され
た（特開昭５６−１６９５９８号公報、特開昭５９−１
５１８９９号公報、特開昭６１−８８８９９号公報、特
開昭６１−２８９９００号公報、特開昭６２−１０４５
９８号公報参照）。このＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨを用いる
方法は、原理的に優れ、感度、再現性も良いことなどか
ら多用されているＨＫとＧ６ＰＤＨを用いる方法に更に
保存安定性と測定の正確性を付与した方法である。
いる方法は、原理的に最も優れ、感度、再現性も良いこ
と、及び多数検体処理も可能なことから最も多用されて
いる。さらに、このＨＫとＧ６ＰＤＨを用いる方法にお
いても、溶液状態での室温保存安定性が乏しいなどの問
題点があったが、ＨＫの代わりにグルコースに極めて特
異性が高く、かつ安定性に優れたグルコキナーゼ（以
下、ＧｌｃＫと略称する。）を使用する方法が提案され
た（特開昭５６−１６９５９８号公報、特開昭５９−１
５１８９９号公報、特開昭６１−８８８９９号公報、特
開昭６１−２８９９００号公報、特開昭６２−１０４５
９８号公報参照）。このＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨを用いる
方法は、原理的に優れ、感度、再現性も良いことなどか
ら多用されているＨＫとＧ６ＰＤＨを用いる方法に更に
保存安定性と測定の正確性を付与した方法である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
これらＣＫ測定用試薬は測定の範囲が比較的狭く、心筋
梗塞や運動後の筋疾患などで血清中ＣＫの急激な上昇が
ある場合に、測定毎に希釈しないと測定できない場合が
しばしば認められていた。このため心筋梗塞などで緊急
検査が要求される場合に不適となり、また、測定の繁雑
さが増し、測定誤差の原因となっていた。
これらＣＫ測定用試薬は測定の範囲が比較的狭く、心筋
梗塞や運動後の筋疾患などで血清中ＣＫの急激な上昇が
ある場合に、測定毎に希釈しないと測定できない場合が
しばしば認められていた。このため心筋梗塞などで緊急
検査が要求される場合に不適となり、また、測定の繁雑
さが増し、測定誤差の原因となっていた。
【０００７】本発明は、上記の如く、高濃度にＣＫを含
む試料でも希釈せずに定量できる測定範囲を有するＣＫ
測定用試薬の提供を目的とするものである。
む試料でも希釈せずに定量できる測定範囲を有するＣＫ
測定用試薬の提供を目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な要求を満足するＣＫ測定用試薬を提供することを目的
として種々検討した結果、６−ホスホグルコノラクトナ
ーゼがＣＫ測定用試薬に含まれていることにより上記の
目的を達成し、本発明によるＣＫ測定用試薬が日常的に
使用するのに充分な性能を有する測定用試薬であること
を見い出し、本発明を完成するに到った。
な要求を満足するＣＫ測定用試薬を提供することを目的
として種々検討した結果、６−ホスホグルコノラクトナ
ーゼがＣＫ測定用試薬に含まれていることにより上記の
目的を達成し、本発明によるＣＫ測定用試薬が日常的に
使用するのに充分な性能を有する測定用試薬であること
を見い出し、本発明を完成するに到った。
【０００９】すなわち、本発明はクレアチンリン酸、ア
デニシン５' −二リン酸（以下、ＡＤＰと略称す
る。）、グルコース、ＨＫ又はＧｌｃＫ、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略称す
る。）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（以下、ＮＡＤＰと略称する。）、Ｇ６ＰＤＨ、マグ
ネシウム塩類、ＳＨ試薬を主要成分とするＣＫ測定用試
薬において、６−ホスホグルコノラクトナーゼが含有さ
れているＣＫ測定用試薬を要旨とするものである。
デニシン５' −二リン酸（以下、ＡＤＰと略称す
る。）、グルコース、ＨＫ又はＧｌｃＫ、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略称す
る。）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（以下、ＮＡＤＰと略称する。）、Ｇ６ＰＤＨ、マグ
ネシウム塩類、ＳＨ試薬を主要成分とするＣＫ測定用試
薬において、６−ホスホグルコノラクトナーゼが含有さ
れているＣＫ測定用試薬を要旨とするものである。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
試薬は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ以外に、クレ
アチンリン酸、ＡＤＰ、グルコース、ＨＫ又はＧｌｃ
Ｋ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、Ｇ６ＰＤＨ、マグネシウム塩
類、ＳＨ試薬の主要成分の他、通常の賦活剤などの添加
剤及び緩衝液が含有されている。
試薬は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ以外に、クレ
アチンリン酸、ＡＤＰ、グルコース、ＨＫ又はＧｌｃ
Ｋ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、Ｇ６ＰＤＨ、マグネシウム塩
類、ＳＨ試薬の主要成分の他、通常の賦活剤などの添加
剤及び緩衝液が含有されている。
【００１１】本発明においては６−ホスホグルコノラク
トナーゼを使用することが必要であるが、ここで言う６
−ホスホグルコノラクトナーゼとは国際生化学連合酵素
委員会による分類番号ＥＣ３. １. １. ３１に分類され
るもので、６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグ
ルコン酸に加水分解する酵素である。その給源は特に限
定されるものではなく、動物、植物、微生物由来のもの
を支障なく使用できる。取り扱いや入手の容易さなどか
ら微生物由来のものが好ましいが、これらにはザイモモ
ナス（Zymomonas ）属、大腸菌、ロイコノストック（Le
uconostoc ）属、ラクトバチルス（Lactobacillus ）
属、シュードモナス（Pseudomonas ）属、バチルス（Ba
cillus）属など種々の起源からの酵素がある。中でも、
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）やザイ
モモナス・アナエロビア（Zymomonas anaerobia ）など
ザイモモナス属細菌に属するものが好ましい。具体的に
はザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ３１８２１株、３１
８２３株、３５０００株、３５００１株、１０９８８
株、２９１９１株、２９１２９株など挙げることができ
る。
トナーゼを使用することが必要であるが、ここで言う６
−ホスホグルコノラクトナーゼとは国際生化学連合酵素
委員会による分類番号ＥＣ３. １. １. ３１に分類され
るもので、６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグ
ルコン酸に加水分解する酵素である。その給源は特に限
定されるものではなく、動物、植物、微生物由来のもの
を支障なく使用できる。取り扱いや入手の容易さなどか
ら微生物由来のものが好ましいが、これらにはザイモモ
ナス（Zymomonas ）属、大腸菌、ロイコノストック（Le
uconostoc ）属、ラクトバチルス（Lactobacillus ）
属、シュードモナス（Pseudomonas ）属、バチルス（Ba
cillus）属など種々の起源からの酵素がある。中でも、
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）やザイ
モモナス・アナエロビア（Zymomonas anaerobia ）など
ザイモモナス属細菌に属するものが好ましい。具体的に
はザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ３１８２１株、３１
８２３株、３５０００株、３５００１株、１０９８８
株、２９１９１株、２９１２９株など挙げることができ
る。
【００１２】上記したような微生物を通常用いられてい
る培地を用いて培養し、得られた菌体から通常用いられ
ている分離・精製方法により本発明で用いられる６−ホ
スホグルコノラクトナーゼを取得することができる。
る培地を用いて培養し、得られた菌体から通常用いられ
ている分離・精製方法により本発明で用いられる６−ホ
スホグルコノラクトナーゼを取得することができる。
【００１３】本発明に用いられるＨＫとしては、その給
源が限定されるものではなく、微生物由来のもの、動物
由来のものなど各種起源のものを使用することができ
る。中でもパン酵母など微生物起源のものが容易に用い
ることができる。またＨＫよりもグルコースに対して基
質特異性が高いＧｌｃＫも使用することができる。Ｇｌ
ｃＫとしても、その給源が限定されるものではなく、微
生物由来のもの、動物由来のものなど各種起源のものを
使用することができる。中でも取り扱い易さ、入手の容
易さからバチルス（Bacillus）属、サーモアクチノマイ
セス（Thermoactinomyces ）属、サーマス（Thermus ）
属、サーモミクロビウム（Thermomicrobium ）属、ザイ
モモナス（Zymomonas ）属などの微生物が好ましく、特
に好ましい微生物としては、バチルス・ステアロサーモ
フィルス（Bacillus stearothermophilus ）やザイモモ
ナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）を挙げることが
できる。
源が限定されるものではなく、微生物由来のもの、動物
由来のものなど各種起源のものを使用することができ
る。中でもパン酵母など微生物起源のものが容易に用い
ることができる。またＨＫよりもグルコースに対して基
質特異性が高いＧｌｃＫも使用することができる。Ｇｌ
ｃＫとしても、その給源が限定されるものではなく、微
生物由来のもの、動物由来のものなど各種起源のものを
使用することができる。中でも取り扱い易さ、入手の容
易さからバチルス（Bacillus）属、サーモアクチノマイ
セス（Thermoactinomyces ）属、サーマス（Thermus ）
属、サーモミクロビウム（Thermomicrobium ）属、ザイ
モモナス（Zymomonas ）属などの微生物が好ましく、特
に好ましい微生物としては、バチルス・ステアロサーモ
フィルス（Bacillus stearothermophilus ）やザイモモ
ナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）を挙げることが
できる。
【００１４】Ｇ６ＰＤＨについても酵母由来など微生物
起源、動物起源などその給源が限定されるものではない
が、好ましくは補酵素としてＮＡＤＰだけでなく、ＮＡ
Ｄにも作用するＧ６ＰＤＨが好ましい。中でも微生物起
源のＧ６ＰＤＨが好ましく、具体的にはロイコノストッ
ク・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）
などのロイコノストック（Leuconostoc ）属、シュード
モナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens
）などのシュードモナス（Pseudomonas ）属、ザイモ
モナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）などのザイモ
モナス（Zymomonas ）属を挙げることができる。より好
ましくはＮＡＤＰ、ＮＡＤとも補酵素として使用でき、
かつ、安定性、保存性に富む好熱性細菌由来のＧ６ＰＤ
Ｈが望ましい。
起源、動物起源などその給源が限定されるものではない
が、好ましくは補酵素としてＮＡＤＰだけでなく、ＮＡ
Ｄにも作用するＧ６ＰＤＨが好ましい。中でも微生物起
源のＧ６ＰＤＨが好ましく、具体的にはロイコノストッ
ク・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）
などのロイコノストック（Leuconostoc ）属、シュード
モナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens
）などのシュードモナス（Pseudomonas ）属、ザイモ
モナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）などのザイモ
モナス（Zymomonas ）属を挙げることができる。より好
ましくはＮＡＤＰ、ＮＡＤとも補酵素として使用でき、
かつ、安定性、保存性に富む好熱性細菌由来のＧ６ＰＤ
Ｈが望ましい。
【００１５】マグネシウム塩類としては、例えば酢酸マ
グネシウム、硫酸マグネシウムなどの塩類を支障なく使
用できる。
グネシウム、硫酸マグネシウムなどの塩類を支障なく使
用できる。
【００１６】ＳＨ保護剤としてはＮ−アセチルシステイ
ン（以下ＮＡＣと略称する）、ジチオスレイトール、ジ
チオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリ
セロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システ
インなどを挙げることができ、中でも安定性の良さや取
り扱いの容易なＮＡＣが好ましい。防腐剤としては、例
えばアジ化ナトリウムなどの公知のものを支障なく使用
することができる。
ン（以下ＮＡＣと略称する）、ジチオスレイトール、ジ
チオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリ
セロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システ
インなどを挙げることができ、中でも安定性の良さや取
り扱いの容易なＮＡＣが好ましい。防腐剤としては、例
えばアジ化ナトリウムなどの公知のものを支障なく使用
することができる。
【００１７】安定剤としては、例えば可溶性デンプン、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの
多糖類とその誘導体、アルブミン、γ- グロブリンなど
のタンパク質、ポリビニルアルコール、ポリエチレング
リコールなどの水溶性高分子化合物を適宜使用すること
ができる。
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの
多糖類とその誘導体、アルブミン、γ- グロブリンなど
のタンパク質、ポリビニルアルコール、ポリエチレング
リコールなどの水溶性高分子化合物を適宜使用すること
ができる。
【００１８】又、クレアチンリン酸、ＡＤＰ、グルコー
ス、ＮＡＤ又はＮＡＤＰについては、従来のクレアチン
キナーゼ測定用試薬に用いられているものが同様に使用
することができる。
ス、ＮＡＤ又はＮＡＤＰについては、従来のクレアチン
キナーゼ測定用試薬に用いられているものが同様に使用
することができる。
【００１９】本発明のＣＫ測定用試薬の各成分の濃度
は、一般には次の濃度が好ましい。例えば、ＨＫ又はＧ
ｌｃＫを０. １〜４０ユニット／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを
０. １〜４０ユニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラク
トナーゼを０. ０１〜２０ユニット／ｍｌ、クレアチン
リン酸を２〜７０ｍＭ、ＡＤＰを０. １〜２０ｍＭ、Ｎ
ＡＤ又はＮＡＤＰを０. ０５〜２０ｍＭ、グルコースを
１〜２００ｍＭ、マグネシウム塩類を０. ５〜３０ｍ
Ｍ、ＳＨ試薬を０. １〜１００ｍＭ、アデノシン５'−
一リン酸（以下ＡＭＰと略称する）を０. ２〜２０ｍ
Ｍ、ジアデノシンペンタホスフェート（以下Ａｐ５Ａと
略称する）を１〜１００μＭ、エチレンジアミン四酢酸
（以下ＥＤＴＡと略称する）を０. １〜２０ｍＭ、アジ
化ナトリウムを０. ５〜５０ｍＭ使用すればよい。より
好ましくは、ＨＫ又はＧｌｃＫを０.２〜２０ユニット
／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを０. ２〜２０ユニット／ｍｌ、６
−ホスホグルコノラクトナーゼを０. ０５〜１５ユニッ
ト／ｍｌ、クレアチンリン酸を５〜４０ｍＭ、ＡＤＰを
０. ２〜１０ｍＭ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを０. １〜１０
ｍＭ、グルコースを２〜１００ｍＭ、マグネシウム塩類
を２〜１５ｍＭ、ＳＨ試薬を０. ５〜５０ｍＭ、ＡＭＰ
を０. ５〜１５ｍＭ、Ａｐ５Ａを２〜５０μＭ、ＥＤＴ
Ａを０. ２〜１０ｍＭ、アジ化ナトリウムを１〜３０ｍ
Ｍ使用すればよい。
は、一般には次の濃度が好ましい。例えば、ＨＫ又はＧ
ｌｃＫを０. １〜４０ユニット／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを
０. １〜４０ユニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラク
トナーゼを０. ０１〜２０ユニット／ｍｌ、クレアチン
リン酸を２〜７０ｍＭ、ＡＤＰを０. １〜２０ｍＭ、Ｎ
ＡＤ又はＮＡＤＰを０. ０５〜２０ｍＭ、グルコースを
１〜２００ｍＭ、マグネシウム塩類を０. ５〜３０ｍ
Ｍ、ＳＨ試薬を０. １〜１００ｍＭ、アデノシン５'−
一リン酸（以下ＡＭＰと略称する）を０. ２〜２０ｍ
Ｍ、ジアデノシンペンタホスフェート（以下Ａｐ５Ａと
略称する）を１〜１００μＭ、エチレンジアミン四酢酸
（以下ＥＤＴＡと略称する）を０. １〜２０ｍＭ、アジ
化ナトリウムを０. ５〜５０ｍＭ使用すればよい。より
好ましくは、ＨＫ又はＧｌｃＫを０.２〜２０ユニット
／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを０. ２〜２０ユニット／ｍｌ、６
−ホスホグルコノラクトナーゼを０. ０５〜１５ユニッ
ト／ｍｌ、クレアチンリン酸を５〜４０ｍＭ、ＡＤＰを
０. ２〜１０ｍＭ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを０. １〜１０
ｍＭ、グルコースを２〜１００ｍＭ、マグネシウム塩類
を２〜１５ｍＭ、ＳＨ試薬を０. ５〜５０ｍＭ、ＡＭＰ
を０. ５〜１５ｍＭ、Ａｐ５Ａを２〜５０μＭ、ＥＤＴ
Ａを０. ２〜１０ｍＭ、アジ化ナトリウムを１〜３０ｍ
Ｍ使用すればよい。
【００２０】本発明の測定用試薬は、全ての成分を１つ
の試薬にした、いわゆる一試薬系でも使用できるが、自
動分析装置などの都合によっては、２つの試薬に分け
た、いわゆる二試薬系にして使用することもできる。
の試薬にした、いわゆる一試薬系でも使用できるが、自
動分析装置などの都合によっては、２つの試薬に分け
た、いわゆる二試薬系にして使用することもできる。
【００２１】本発明のＣＫ測定用試薬の測定原理は、反
応式１の右方向の反応により生成したＡＴＰを下記反応
式２、３に示すように６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の存在下、ＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨの共役作用を利用して
測定するものである。
応式１の右方向の反応により生成したＡＴＰを下記反応
式２、３に示すように６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の存在下、ＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨの共役作用を利用して
測定するものである。
【００２２】
【化２】
【００２３】
【化３】
【００２４】すなわち反応式１〜３の共役反応で生成す
るＮＡＤ( Ｐ)Ｈの３４０ｎｍにおける吸収の増加を測
定して、試料中のＣＫ活性を定量するものである。
るＮＡＤ( Ｐ)Ｈの３４０ｎｍにおける吸収の増加を測
定して、試料中のＣＫ活性を定量するものである。
【００２５】本発明のＣＫ測定用試薬を用いて、試料中
のＣＫ活性を測定するには、例えばセル室が保温された
分光光度計のセルに測定用試薬を入れ、測定温度（２０
〜４５℃の間の任意の温度）に約３分間保温し、その
後、試料を添加混和した後、３４０ｎｍの吸光度上昇を
測定すればよい。また、試料を添加した後の測定の反応
時間としては、３０秒以後で任意の時間を選択すること
ができるが、自動分析装置の場合には、その装置の測定
条件に適応する条件を設定すればよい。
のＣＫ活性を測定するには、例えばセル室が保温された
分光光度計のセルに測定用試薬を入れ、測定温度（２０
〜４５℃の間の任意の温度）に約３分間保温し、その
後、試料を添加混和した後、３４０ｎｍの吸光度上昇を
測定すればよい。また、試料を添加した後の測定の反応
時間としては、３０秒以後で任意の時間を選択すること
ができるが、自動分析装置の場合には、その装置の測定
条件に適応する条件を設定すればよい。
【００２６】
【実施例】次に本発明を実施例によって具体的に説明す
る。 実施例１、比較例１ ６−ホスホグルコノラクトナーゼをフェブス・レターズ
（FEBS Letters）１９３巻、１８５〜１８８頁、１９８
５年に記載の方法に従って培養し、単離精製した。すな
わち、１５％のグルコース、０．５％の酵母エキス、
０．０５％のリン酸一カリウム、０．０５％の硫酸マグ
ネシウムを含む溶液１リットルに１ｍｇのビオチン、２
ｍｇのパントテン酸カルシウム及び２０ｍｇの硫酸鉄ア
ンモニウム（６水和物）を加えた培地で、ザイモモナス
・モビリス（Zymomonas mobilis ）ＡＴＣＣ３１８２１
株を培養した。
る。 実施例１、比較例１ ６−ホスホグルコノラクトナーゼをフェブス・レターズ
（FEBS Letters）１９３巻、１８５〜１８８頁、１９８
５年に記載の方法に従って培養し、単離精製した。すな
わち、１５％のグルコース、０．５％の酵母エキス、
０．０５％のリン酸一カリウム、０．０５％の硫酸マグ
ネシウムを含む溶液１リットルに１ｍｇのビオチン、２
ｍｇのパントテン酸カルシウム及び２０ｍｇの硫酸鉄ア
ンモニウム（６水和物）を加えた培地で、ザイモモナス
・モビリス（Zymomonas mobilis ）ＡＴＣＣ３１８２１
株を培養した。
【００２７】培養後、集めた菌体を破砕後、グリーンＨ
Ｅ−４ＢＤ−セファロースカラムクロマトグラフィー
（グリーンＨＥ−４ＢＤは、商品名プロシオン・グリー
ンＨＥ−４ＢＤとしてＩＣＩジャパンより購入）に吸着
させ、Ｇ６Ｐを含有する緩衝液で溶出し、次いでセルロ
ファインＧＣＬ−２０００カラムクロマトグラフィー
（生化学工業より購入）を用いて精製した。
Ｅ−４ＢＤ−セファロースカラムクロマトグラフィー
（グリーンＨＥ−４ＢＤは、商品名プロシオン・グリー
ンＨＥ−４ＢＤとしてＩＣＩジャパンより購入）に吸着
させ、Ｇ６Ｐを含有する緩衝液で溶出し、次いでセルロ
ファインＧＣＬ−２０００カラムクロマトグラフィー
（生化学工業より購入）を用いて精製した。
【００２８】上記の如く精製した６−ホスホグルコノラ
クトナーゼを用いてＣＫ測定用試薬を調製した。バチル
ス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop
hilus ）由来のＧｌｃＫ［生化学工業( 株) より購入］
３ユニット／ｍｌ、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Leuconostoc mesenteroides ）由来のＧ６ＰＤＨ
［ベーリンガー・マンハイム山之内( 株) より購入］１
ユニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ０.
４ユニット／ｍｌ、ＡＤＰ［ベーリンガー・マンハイム
山之内( 株) より購入］２ｍＭ、ＮＡＤＰ［ベーリンガ
ー・マンハイム山之内( 株) より購入］２ｍＭ、グルコ
ース２０ｍＭ、ＡＭＰ［ベーリンガー・マンハイム山之
内(株) より購入］５ｍＭ、Ａｐ５Ａ［ベーリンガー・
マンハイム山之内( 株) より購入］１０μＭ、ＮＡＣ２
０ｍＭ、硫酸マグネシウム１０ｍＭ、アジ化ナトリウム
０. １％、ＥＤＴＡ２ｍＭ、クレアチンリン酸２５ｍＭ
を含むイミダゾール−酢酸緩衝液（ｐＨ６. ７）８０ｍ
Ｍより成るＣＫ測定用試薬を調製した（実施例１）。別
に実施例１より６−ホスホグルコノラクトナーゼを抜い
たＣＫ測定用試薬を調製した（比較例１）。
クトナーゼを用いてＣＫ測定用試薬を調製した。バチル
ス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop
hilus ）由来のＧｌｃＫ［生化学工業( 株) より購入］
３ユニット／ｍｌ、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Leuconostoc mesenteroides ）由来のＧ６ＰＤＨ
［ベーリンガー・マンハイム山之内( 株) より購入］１
ユニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ０.
４ユニット／ｍｌ、ＡＤＰ［ベーリンガー・マンハイム
山之内( 株) より購入］２ｍＭ、ＮＡＤＰ［ベーリンガ
ー・マンハイム山之内( 株) より購入］２ｍＭ、グルコ
ース２０ｍＭ、ＡＭＰ［ベーリンガー・マンハイム山之
内(株) より購入］５ｍＭ、Ａｐ５Ａ［ベーリンガー・
マンハイム山之内( 株) より購入］１０μＭ、ＮＡＣ２
０ｍＭ、硫酸マグネシウム１０ｍＭ、アジ化ナトリウム
０. １％、ＥＤＴＡ２ｍＭ、クレアチンリン酸２５ｍＭ
を含むイミダゾール−酢酸緩衝液（ｐＨ６. ７）８０ｍ
Ｍより成るＣＫ測定用試薬を調製した（実施例１）。別
に実施例１より６−ホスホグルコノラクトナーゼを抜い
たＣＫ測定用試薬を調製した（比較例１）。
【００２９】次に、試料としてウサギ筋肉由来のＣＫ
［ベーリンガー・マンハイム山之内(株) より購入］を
生理食塩水又は市販標準血清に溶かした試料を調製し
た。上記で調製したＣＫ測定用試薬３. ０ｍｌを光路長
１ｃｍのセルに入れ、約３分間３７℃に保温後、上記で
調製した試料０. ０６ｍｌを添加して反応を開始し、３
４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。各種濃度のＣＫを含
む試料で同様の測定をし、１分間当りの吸光度変化量と
試料中のＣＫ活性との関係を図１に示した。この図か
ら、実施例１では１分間当りの吸光度変化量がＣＫ約４
０００ユニット／ｌまで直線的に変化しているのに対
し、比較例１では約２０００ユニット／ｌまでしか直線
的に変化していないことが判った。このように、６−ホ
スホグルコノラクトナーゼを含有させることにより測定
の範囲が大きく広がることが示された。
［ベーリンガー・マンハイム山之内(株) より購入］を
生理食塩水又は市販標準血清に溶かした試料を調製し
た。上記で調製したＣＫ測定用試薬３. ０ｍｌを光路長
１ｃｍのセルに入れ、約３分間３７℃に保温後、上記で
調製した試料０. ０６ｍｌを添加して反応を開始し、３
４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。各種濃度のＣＫを含
む試料で同様の測定をし、１分間当りの吸光度変化量と
試料中のＣＫ活性との関係を図１に示した。この図か
ら、実施例１では１分間当りの吸光度変化量がＣＫ約４
０００ユニット／ｌまで直線的に変化しているのに対
し、比較例１では約２０００ユニット／ｌまでしか直線
的に変化していないことが判った。このように、６−ホ
スホグルコノラクトナーゼを含有させることにより測定
の範囲が大きく広がることが示された。
【００３０】実施例２ ＧｌｃＫ及びＧ６ＰＤＨをザ・バイオケミカル・ジャー
ナル（The Biochemical Journal ）２２８巻、６２７〜
６３４頁、１９８５年に記載の方法に従って培養し、そ
れぞれ単離精製した。すなわち、１５％のグルコース、
０．５％の酵母エキス、０．０５％のリン酸一カリウ
ム、０．０５％の硫酸マグネシウムを含む溶液１リット
ルに１ｍｇのビオチン、２ｍｇのパントテン酸カルシウ
ム及び２０ｍｇの硫酸鉄アンモニウム（６水和物）を加
えた培地でザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobili
s ）ＡＴＣＣ２９１９１株を培養した。
ナル（The Biochemical Journal ）２２８巻、６２７〜
６３４頁、１９８５年に記載の方法に従って培養し、そ
れぞれ単離精製した。すなわち、１５％のグルコース、
０．５％の酵母エキス、０．０５％のリン酸一カリウ
ム、０．０５％の硫酸マグネシウムを含む溶液１リット
ルに１ｍｇのビオチン、２ｍｇのパントテン酸カルシウ
ム及び２０ｍｇの硫酸鉄アンモニウム（６水和物）を加
えた培地でザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobili
s ）ＡＴＣＣ２９１９１株を培養した。
【００３１】培養後、集めた菌体を破砕後、スカーレッ
トＭＸ−Ｇ−セファロースクロマトグラフィー（スカー
レットＭＸ−Ｇは、商品名プロシオン・スカーレットＭ
Ｘ−ＧとしてＩＣＩジャパンより購入）に吸着させ、Ｇ
ｌｃＫをｐＨ上昇で、又Ｇ６ＰＤＨをＮＡＤＰ添加でそ
れぞれ溶出させ、次いで硫安分画した。さらに両酵素を
セファクリルＳ−２００クロマトグラフィーでゲル濾過
に供し、精製酵素を得た。
トＭＸ−Ｇ−セファロースクロマトグラフィー（スカー
レットＭＸ−Ｇは、商品名プロシオン・スカーレットＭ
Ｘ−ＧとしてＩＣＩジャパンより購入）に吸着させ、Ｇ
ｌｃＫをｐＨ上昇で、又Ｇ６ＰＤＨをＮＡＤＰ添加でそ
れぞれ溶出させ、次いで硫安分画した。さらに両酵素を
セファクリルＳ−２００クロマトグラフィーでゲル濾過
に供し、精製酵素を得た。
【００３２】上記の如く精製したＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨ
を実施例１と同様の濃度で使用してＣＫ測定用試薬を調
製した（実施例２）。別に実施例２から６−ホスホグル
コノラクトナーゼを抜いた試薬を調製した（比較例
２）。これら試薬を用いて実施例１と同様の実験をした
ところ、実施例２では１分間当りの吸光度変化量が試料
中のＣＫ量約４０００ユニット／ｌまで直線関係にあっ
たが、一方比較例２では約２０００ユニット／ｌまでし
か直線関係が認められなかった。
を実施例１と同様の濃度で使用してＣＫ測定用試薬を調
製した（実施例２）。別に実施例２から６−ホスホグル
コノラクトナーゼを抜いた試薬を調製した（比較例
２）。これら試薬を用いて実施例１と同様の実験をした
ところ、実施例２では１分間当りの吸光度変化量が試料
中のＣＫ量約４０００ユニット／ｌまで直線関係にあっ
たが、一方比較例２では約２０００ユニット／ｌまでし
か直線関係が認められなかった。
【００３３】実施例３ 実施例１又は実施例２の試薬において、６−ホスホグル
コノラクトナーゼの濃度を０. ０５ユニット／ｍｌ及び
１５ユニット／ｍｌに変えた以外は実施例１又は実施例
２の試薬と同様の組成の試薬をそれぞれ２種を調製し
た。これらの試薬を用い、１分間当りの吸光度変化量と
試料中のＣＫ量との関係を調べたところ、４種の試薬と
もＣＫ約４０００ユニット／ｌまでの直線関係が認めら
れ、良好な測定の範囲を示すことが判った。
コノラクトナーゼの濃度を０. ０５ユニット／ｍｌ及び
１５ユニット／ｍｌに変えた以外は実施例１又は実施例
２の試薬と同様の組成の試薬をそれぞれ２種を調製し
た。これらの試薬を用い、１分間当りの吸光度変化量と
試料中のＣＫ量との関係を調べたところ、４種の試薬と
もＣＫ約４０００ユニット／ｌまでの直線関係が認めら
れ、良好な測定の範囲を示すことが判った。
【００３４】実施例４、比較例３ ＧｌｃＫの代わりに酵母由来のＨＫ［ベーリンガー・マ
ンハイム山之内( 株)より購入］３. ５ユニット／ｍｌ
と酵母由来Ｇ６ＰＤＨ１. ５ ユニット／ｍｌを使用
し、他は実施例１及び比較例１と同様の試薬を調製した
（実施例４、比較例３）。実施例１及び比較例１と同様
の実験をしたところ、１分間当りの吸光度変化量と試料
中のＣＫ量との直線関係が実施例４では約３５００ユニ
ット／ｌまで、比較例３では約１５００ユニット／ｌま
で得られた。
ンハイム山之内( 株)より購入］３. ５ユニット／ｍｌ
と酵母由来Ｇ６ＰＤＨ１. ５ ユニット／ｍｌを使用
し、他は実施例１及び比較例１と同様の試薬を調製した
（実施例４、比較例３）。実施例１及び比較例１と同様
の実験をしたところ、１分間当りの吸光度変化量と試料
中のＣＫ量との直線関係が実施例４では約３５００ユニ
ット／ｌまで、比較例３では約１５００ユニット／ｌま
で得られた。
【００３５】実施例５ バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus ）由来ＧｌｃＫ３. ７５ユニット／ｍｌ、
ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc me
senteroides ）由来Ｇ６ＰＤＨ１. ２５ユニット／ｍ
ｌ、実施例１で得た６−ホスホグルコノラクトナーゼ
０. ５ユニット／ｍｌ、ＡＤＰ２.５ｍＭ、ＮＡＤＰ２.
５ｍＭ、グルコース２５ｍＭ、ＡＭＰ６. ２５ｍＭ、
Ａｐ５Ａ１２. ５μＭ、ＮＡＣ２５ｍＭ、アジ化ナトリ
ウム０. １％、ＥＤＴＡ２. ５ｍＭを含むイミダゾール
−酢酸緩衝液（ｐＨ６. ７）１００ｍＭよりなる試薬１
と、クレアチンリン酸１２５ｍＭ、酢酸マグネシウム５
０ｍＭからなる試薬２を調製した。
hermophilus ）由来ＧｌｃＫ３. ７５ユニット／ｍｌ、
ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc me
senteroides ）由来Ｇ６ＰＤＨ１. ２５ユニット／ｍ
ｌ、実施例１で得た６−ホスホグルコノラクトナーゼ
０. ５ユニット／ｍｌ、ＡＤＰ２.５ｍＭ、ＮＡＤＰ２.
５ｍＭ、グルコース２５ｍＭ、ＡＭＰ６. ２５ｍＭ、
Ａｐ５Ａ１２. ５μＭ、ＮＡＣ２５ｍＭ、アジ化ナトリ
ウム０. １％、ＥＤＴＡ２. ５ｍＭを含むイミダゾール
−酢酸緩衝液（ｐＨ６. ７）１００ｍＭよりなる試薬１
と、クレアチンリン酸１２５ｍＭ、酢酸マグネシウム５
０ｍＭからなる試薬２を調製した。
【００３６】上記で調製した試薬１、０. ４ｍｌを３７
℃に保温された光路長１ｃｍのセルに入れ、実施例１で
調製した試料０. ０１ｍｌを添加５分後、試薬２を添加
して約５分間にわたって３４０ｎｍの吸光度変化を追跡
した（自動分析装置日立７０５０型使用）。１分間当り
の吸光度変化量と試料中のＣＫ量とはＣＫ約４０００ユ
ニット／ｌまで直線関係にあることが判った。
℃に保温された光路長１ｃｍのセルに入れ、実施例１で
調製した試料０. ０１ｍｌを添加５分後、試薬２を添加
して約５分間にわたって３４０ｎｍの吸光度変化を追跡
した（自動分析装置日立７０５０型使用）。１分間当り
の吸光度変化量と試料中のＣＫ量とはＣＫ約４０００ユ
ニット／ｌまで直線関係にあることが判った。
【００３７】
【発明の効果】本発明のＣＫ測定用試薬は、従来のＨＫ
とＧ６ＰＤＨを共役させる方法やＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨ
を共役させる方法の問題点であった測定の範囲を、６−
ホスホグルコノラクトナーゼを用いることにより大幅に
拡大させたものである。近年増加しつつある心筋梗塞患
者や他の筋肉疾患患者の生体液中のＣＫを日常的に分析
定量するのに充分な性能の測定用試薬となり、信頼性の
高いものとなった。このように、本発明のＣＫ測定用試
薬は臨床検査の分野に多大な寄与がはかれるものとなっ
た。
とＧ６ＰＤＨを共役させる方法やＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨ
を共役させる方法の問題点であった測定の範囲を、６−
ホスホグルコノラクトナーゼを用いることにより大幅に
拡大させたものである。近年増加しつつある心筋梗塞患
者や他の筋肉疾患患者の生体液中のＣＫを日常的に分析
定量するのに充分な性能の測定用試薬となり、信頼性の
高いものとなった。このように、本発明のＣＫ測定用試
薬は臨床検査の分野に多大な寄与がはかれるものとなっ
た。
【図１】本発明のクレアチンキナーゼ測定用試薬（実施
例１）及び従来の測定用試薬（比較例１）を用いたとき
の試料中のＣＫ量（ユニット／ｌ）と３４０ｎｍにおけ
る１分間当りの吸光度変化量を示す説明図である。
例１）及び従来の測定用試薬（比較例１）を用いたとき
の試料中のＣＫ量（ユニット／ｌ）と３４０ｎｍにおけ
る１分間当りの吸光度変化量を示す説明図である。
●印 実施例１ ○印 比較例１
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 クレアチンリン酸、アデノシン５' −二
リン酸、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグルコキナー
ゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グルコース−
６−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類、ＳＨ試薬を
主要成分とするクレアチンキナーゼ測定用試薬におい
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼが含有されている
ことを特徴とするクレアチンキナーゼ測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3075721A JP3045190B2 (ja) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | クレアチンキナーゼ測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3075721A JP3045190B2 (ja) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | クレアチンキナーゼ測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04287698A JPH04287698A (ja) | 1992-10-13 |
| JP3045190B2 true JP3045190B2 (ja) | 2000-05-29 |
Family
ID=13584413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3075721A Expired - Lifetime JP3045190B2 (ja) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | クレアチンキナーゼ測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3045190B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69430305T2 (de) * | 1993-12-20 | 2002-11-21 | Iatron Lab | Reagenz zur bestimmung der kreatinkinase |
| JP2011092113A (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-12 | Oriental Yeast Co Ltd | ポリペプチド及びその製造と利用 |
-
1991
- 1991-03-14 JP JP3075721A patent/JP3045190B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04287698A (ja) | 1992-10-13 |
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